JPH04506510A - リポ多糖関連グラム陰性細菌感染を治療するための殺菌性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性な類縁体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リボ多糖関連グラム陰性細菌感染を治療するための殺菌性／透過性増強タンパク 質またはその生物学的に活性な類縁体の使用 ｌ呪ゑ１遣 グラム陰性側菌感染は、特に入院患者及び免疫力弱体化患者（ｉｅ＋ｍｕｎｏｃ ｏｅＩｐｒｏｍｉｓｅｄ　ｐａｔｉｅｎｔｓｌおける罹患及び死亡の主因である （　Ｄｕｍａ、　Ｒ，Ｊ、、＾−，Ｊ、ｏｆ　Ｗｅｄ、、〕８（Ｓｕｐｐｌ　、 ６＾）：１５４−１６４（１９８５）　；並びにＫｒｅｇｅｒ　Ｂ、Ｅ、、　Ｄ 、Ｅ、Ｃｒａｖｅｎ及び賛、ＲｏＭｅＣａｂｅ　、＾ｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、、６８： ３４４−３５５（１９８０））　。 入手可能な抗生物質は上記感染を阻止する場合に有効であるが、それらは、リポ 多糖（ＬＰＳ）に関連する病態生理学的作用を中和するためには何ら効果的でな い、ＬＰＳ即ち内毒素はグ、ラム陰性細菌の外膜の主成分であり、その細菌が溶 解されたときに放出される〔＾ｈｅｎｅｐ、　Ｊ、Ｌ、及びＫ。 ＾、Ｍｏｒｇａｎ、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、［ｌｉｓ、、　１５０（３）：３８０ −３８８（１９８４））　。 抗生物質療法の際に放出されるＬＰＳは炎症応答の強力な刺激物質である。ＬＰ Ｓの多くのｉｎ　ｖｉｖｏでの有害作用は、炎症細胞によって放出される可溶性 媒介物質によって引き起こされる〔Ｎｏｒｒｉｓｏｎ　Ｄ、Ｃ，及びＲ，Ｊ、　 Ｕｌｅｖｉｅｈ、＾ｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、、　９３（Ｚ）：５２フー６１７（ １９７８）　：］　、　Ｌ　Ｐ　Ｓは宿主炎症細胞による媒介物質の放出を誘発 し、これは最終的に散在住血管内凝固（ＤＩＣ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ 　Ｓ　）、腎不全及び不可逆性ショックをもたらし得る。 単球及び好中性顆粒球は、細菌感染に対する宿主の防御において重要な役割を果 たし、内毒素血症の病理にも関与する。これらの細胞は微生物を細胞内に摂取し て殺し、更に、殺菌性、タンパク質分解性、オプソニン性、発熱性、補体活性化 及び組織損傷作用を有する可溶性タンパク質を放出することによりｉｎ　ｖｉｖ ｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏでＬＰＳに応答する。ＬＰＳに刺激された単球によって 放出されるサイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はｉｎ　ｖｉｖｏで、Ｌ ＰＳのもつ毒作用のうち幾らかの作用を模倣的に有する。動物にＴＮＦを注入す ると、発熱、ショック及びグルコース代謝の変化がもたらされる。ＴＮＦは強力 な好中球刺激因子でもある。 可溶性ＬＰＳは好中球の走化性を低下させ、付着性を増大し、ヘキソースモノホ スフェート封鎖活性及び０２ラジカル産生を上昇させ、補体の命森ミ表面レセプ ターのアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ＞を行い、顆粒タン パク質を周囲の媒質中に放出する［：　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及び旧ｅｖｉｅｈ（１ ９７８））。 特異的なコンパートメント及びアズール好性コンパートメントはともにＬＰＳに 応答して脱顆粒反応を起こすＣＢＩＬｏｎａｔｙｎｅ、Ｒ，Ｍ、、　Ｎ、Ｍ、Ｈ ａｒｎｅｔｔ、　Ｋ、Ｙ、Ｌｅｅ及び−、Ｄ、ＲｉＦｉｇｅｒ、　Ｊ。 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、　１５６（４）：４６９−４７４（１９７７））　、 　Ｌ　Ｐ　Ｓに応答して放出されたアズール好性タンパク質は宿主にとって有害 でも有益でもあり得る。好中球エラスターゼは、凝固カスケードの抑制に関わる プロテアーゼ阻害物質の分解をもたらす、これにより、内毒素血症の潜在的に致 命的な結果である散在住血管内凝固のような凝固障害を引き起こす、アズール好 性顆粒は更に、ミエロペルオキシダーゼ及び殺菌／透過性増強因子（Ｂａｅｔｅ ｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔ ｏｒ、　Ｂ　Ｐ　ｒ　）のような殺菌性分子をも含む。 まず１９７５年にウサギＢＰＩが発見された（Ｗｅｉｓｓ。 Ｊ、、　Ｒ，Ｃ，Ｆｒａｎｓｏｎ、　Ｓ、Ｂｅｃｈｅｒｄｉｔｅ、　Ｋ、Ｓｃｈ ｍｅｉｄｌｅｒ及びＰ、Ｅｌｓｂａｃｈ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　 ５５：３３（１９７５））　、　１９７８年にはＢＰＩがヒト好中球から単離さ れた（　Ｗｅｉｓｓ、　Ｊ、、Ｐ、Ｅｌｓｂａｃｈ、　１．０Ｉｓｏｎ及びＨ， Ｏｄｅｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５３（８）：２６６４−２ ６７２（１９７８）　）。 １９８４年には類似の特性を有する５７ｋＤのタンパク質がヒト好中球から単離 された（　５ｈａｆｅｒ、　ｌ１１．Ｍ、、　Ｃ，Ｅ、Ｍａｒｔｉｎ及びＪ、に 、Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、ｌｍ５ｕｎ、、　４５：２９（１９ ８４））　。 このタンパク質は、Ｎ末端配列のアミノ酸組成、分子量及び起源においてＢＰＩ と同一である。しかしながら上記文献の著者は、Ｅｌｓｂａｅｈら及び−ｅｉｓ ｓらによって使用されたクロマトグラフィー単離手順を再現することはできなか った。 ヒトＢＰＩは、感受性グラム陰性細菌の外膜に結合する５７ｋＤのタンパク質で あるＩ：１１ｅｉｓｓら、　（１９７８））　、　Ｂ　Ｐ工がリボ多糖結合タン パク質であるという事実は、（１）に対しより多くの感受性を示すこと（Ｍｅｉ ｓｓ、　Ｊ、、　Ｍ、Ｈｕｔｚｌｅｒ及びり、Ｋａｏ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｓｍ ｕｎ、、　５１：５９４（１９８６））　：　（２）リビドＡにおける突然変異 は、結合を低下させ且つポリミキシンＢ及びＢＰＩ両方の殺菌活性に対する抵抗 性を増大させること［：Ｆａｒｌｅｙ、　Ｍ、Ｍ、、　Ｗ、Ｍ、５ｈａｆｅｒ及 びＪ、に、Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌ　。 Ｉ＋ｄｅｃｔ、Ｉｗｓｕｎ、、　５６：１５８９（１９８８））　：　（３）　 Ｂ　Ｐ　Ｉ　は、　シュ１１７への結合においてポリミキシンＢと拮抗すること ＣＦａｒｅｌｙ、　１９８８）　：　（４）　Ｂ　Ｐ　Ｉは、別のＬＰＳ結合タ ンパク質であるリボ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）と配列相同及び免疫交差反応 性を有することによって立証されている。ＬＢＰ−ＬＰＳ複合体は、ホルミル化 ペプチドに応答して好中球において酸化的破裂を刺激することが判っている。ヒ ト血清中に認められたＬＰＳと複合体を形成している別のＬＰＳ結合タンパク質 即ち高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、好中球に対し刺激作用を示さない、Ｂ ＰＩ結合はＬＰＳ構造を破壊し、微生物透過性を変え且つ小さな疎水性分子と為 し、細胞死を惹起する（　Ｗｅｉｓｓら、　１９７８）、ＢＰ’ｒは、生理学的 ｐｉ（及びイオン強度条件下にｉｎ　ｖｉｔｒｏで細菌を殺すが、このことはＢ ＰＩが、低ｐＨ環境のファゴリソソームの外でｉｎ　ｖｉｖｏで活性であり得る ことを示唆する。ＢＰＩの殺菌性及び透過性増強活性の全ては、該タンパク質の Ｎ末端の２５ｋＤの断片に存在するＣ０ｏｉ、　Ｃ，Ｅ。 、　Ｊ、１ｌｅｉｓｓ、　Ｐ、Ｅｌｓｂａｃｈ、　Ｂ、Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ及び Ｂ、Ｍａｒｒｉｏｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、　２６２：１４８９１（１ ９８７）］　、　シかしながら本発明以前には、ＢＰＩの有益性はその殺菌効果 に限定されると考えられていた。 抗生物質療法における改良にも拘らず、内毒素血症に関連する罹患率及び死亡率 は依然として高い。ＬＰＳの毒作用を中和する上で、抗生物質単独では有効でな い、従って、直接的なＬＰＳ中和活性をもつ補助剤療法の必要性が生じる。内毒 素血症を治療する現在の方法は抗生物質を使用し、支持介護を要する。最も実施 可能な補助剤療法は、低血圧及び発熱のような内毒素ショックの症状を治療する ものであるが、内毒素を失活させることはない、他の療法は、ＬＰＳに対する宿 主の炎症応答を阻害するものである。以下に記載するように、現在の療法は、毒 性、免疫原性または動物モデルとヒト試験との間での再現不可能な効能のために 多くの制限を有する。 ポリミキシンＢは、内毒素の最高の毒性及び生物学的活性をもつ成分リビドＡに 結合し、それを構造的に破壊することが判っている塩基性ポリペプチド抗生物質 である。ポリミキシンＢは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで好中球顆粒を放出するＬＰＳ活 性化を阻害することが判っており、ヒトにおけるグラム陰性細菌敗血症に対する 有効な治療手段である。しかしながらその全身性毒性の故に、この薬剤は局所適 用薬剤として以外の使用は制限されている。 抗生物質と高い投与量のメチルプレドニソロンナトリウムスクシネート（ＭＰＳ Ｓ＞とを使用するコンビネーション療法は、イヌを使用したグラム陰性細菌敗血 症の実験モデルにおいて死を回避することが示された。全身性敗血症の臨床兆候 が見られる２２３人の患者に行なった二重重点方式（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ） 　、二重盲検法、プラシーボ制御の臨床研究において抗生物質と一緒にＭＰＳＳ を使用した別の研究では、治療グループとプラシーボグループとの間で死亡率に 有意な差はないと結論された。更に、調査の結果、１４日以内の二次感染の消散 はプラシーボグループにおいて有意に高いことが判った。 内毒素血症を治療する比較的新しい方法は、内毒素中和抗体を用いた受動免疫感 作である。Ｅ、Ｃｏ１１Ｊ５に対する高度免疫ヒト免疫グロブリンは、グラム陰 性菌血症及びショックを有する患者の死亡率を５０％低下させることが判ってい る。他のグループは、マウス、キメラ動物及びヒトのモノクローナル抗体を使用 しての動物モデルにおいて有望な結果を示した。モノクローナル抗体は、例えば 薬剤の効能がより一貫しているとかヒト病原体の伝染を低下させるなど高度免疫 血清よりも有効であるが、ＬＰＳを中和するために免疫グロブリンを投与するこ とに関連する問題は尚多く存する。免疫グロブリン自体に対する宿主の応答は過 敏症をもたらし得る。免疫複合体の補体活性化及び沈着に続く組織損傷は、敗血 症患者に杭内毒素抗体を含む療法を使用する上での別の懸念事項である。また免 疫グロブリンは大きな分子、特に最近の臨床試験におけるペンタマー１ｇＭであ り、細網内皮系によって迅速に一掃され、そのような薬剤の半減期を小さくする 。 内毒素は、宿主に有益である共に損傷をも与える応答を誘発する。内毒素血症は 肝臓からＬＰＳ結合タンパク質の生成を誘導し、白血球から殺菌性タンパク質の 放出を惹起する。宿主の防御に関与する好中球タンパク質の本出願人らの研究に おいて、これらのタンパク質の１つＢＰＩは１ｎｖｉｔｒｏで強力な殺菌物質で あるだけでなく、ＬＰＳの好中球を刺激する能力も妨害すると判断された。特に 、ＢＰＩは可溶性ＬＰＳに結合し、その好中球を活性化する能力を中和すること が示された。従って本発明は、グラム陰性細菌敗血症におけるＬＰＳ毒性を治療 する方法を提供する。 １豊五１力 本発明は、細胞のリボ多糖（ＬＰＳ、）媒介刺激を阻害する方法を提供する。こ の方法は、細胞刺激量のリボ多糖の存在下に細胞を、細胞刺激を阻害するのに有 効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）と接触させることからなる。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染を治療する方法をも提供する。この方法は、 細菌感染体を、細胞のＬＰＳ媒介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療す るのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と 接触させすることからなる。 更に本発明は、グラム陰性細菌感染を治療するための組成物を提供する。この組 成物は、細胞のＬＰＳ媒介刺激を阻害するのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその 生物学的に活性なポリペプチド想縁体と適当な担体とを含有する。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連ショックを患った 被検体を治療する方法であって、該被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内 毒素関連ショックを緩和するように被検体を治療するのに有効な量のＢＰＩを投 与することからなる方法を提供する。 更に本発明は、散在住血管内凝固を伴なう疾患を有する被検体を治療する方法を も提供する。この方法は、被検体に、散在住血管内凝固の症状を緩和し、それに よって被検体を治療するのに有効な量のＢＰ、Ｉを投与することからな更に本発 明は、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素血症を患った被検体を治療する 方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素血症の被検体を 治療するのに有効な量のＢＰＩを投与することからなる方法をも提供する。 本明細書中、内毒素血症（ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ）とは、血液が体細胞によっ て産生されるかまたは微生物即ちグラム陰性細菌から生じる毒性産物を含む状態 を意味する。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連貧血を患った被検 体を治療する方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関 連貧血を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のＢＰＩを投与すること からなる方法を提供する。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連白血球減少症を患 った被検体をも治療する方法を提供する。この方法は、被検体に、グラム陰性細 菌感染を撲滅し、内毒素関連白血球減少症を緩和するように被検体な治療するの に有効な量のＢＰＩを投与することからなる。 更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連血小板減少症を患 った被検体を治療する方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、 内毒素関連血小板減少症を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のＢＰ Ｉを投与することからなる方法をも提供する。 本発明は更に、発熱物質を阻害する方法であって、発熱物質を阻害するようなＩ のＢＰｒを発熱物質に接触させることからなる方法をも提供する。 更に本発明は、細胞によるリボ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害する方法であっ て、細胞刺激量のリボ多糖の存在下で細胞を、細胞にょろりボ多糖媒介腫瘍壊死 因子産土を阻害するのに有効な量のＢＰＩと接触させることからなる方法をも含 む。 本発明は更に、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産土を阻害する方法 であって、グラム陰性細菌を、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子細菌 を阻害するのに有効な量のＢＰＩと接触させることからなる方法をも含む。 更に本発明は、内毒素関連ショックを患った被検体を治療するための組成物をも 含む。この組成物は、内毒素関連ショックの被検体を治療するのに有効な量の精 製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有 する。 更に本発明は、散在住血管内凝固を患った被検体を治療するための組成物をも含 む、この組成物は、散在住血管内凝固を患った被検体を治療するのに有効な量の 精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含 有する。 呆発明は更に、内毒素血症を患った被検体を治療するのに有効な量の精製ＢＰＩ またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内 毒素血症の被検体を治療するための組成物をも含む。 本発明は更に、内毒間連貧血を患った被検体を治療するのに有効な量の精製ＢＰ Ｉまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、 内毒素関連貧血の被検体を治療するための組成物をも提供する。 更に本発明は、内毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療するための組成物 を提供する。この組成物は、内毒素関連白血球減少症の被検体を治療するのに有 効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担 体とを含有する。更に、内毒素関連血小板減少症の被検体を治療するための組成 物も提供する。この組成物は、内毒素関連血小板減少症の被検体を治療するのに 有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な 担体とを含有する。 本明細書中、内毒素関連白血球減少症とは、その兆候が末梢血液中の白血球が正 常値以下に減少することに現れるグラム陰性細菌惑染に伴なう状態である。更に 本明細書中、内毒素関連血小板減少症とは、その兆候が血小板が正常値以下に低 下することに現れるグラム陰性細菌感染に関連する状態である。 更に本発明は、細胞にょろりボ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するのに有効な 量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体と を含有する、細胞によるリボ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するための組成物 をも提供する。更に本発明は、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生 を阻害するのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド 類縁体と適当な担体とを含有する、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子 産生を阻害するための組成物をも提供する。 更に本発明は、発熱物質を阻害するための組成物をも提供する。この組成物は、 発熱物質を阻害するのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリ ペプチド類縁体を含有する。 更に本発明は、被検体におけるグラム陰性細菌感染に伴なう症状を予防する方法 であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を予防し、それによって該症状を予防 するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法 を提供する。 更に、被検体における散在住血管内凝固を伴なう疾患を予防する方法であって、 被検体に、散在住血管内凝固の症状を予防するのに有効な量の殺菌性／透過性増 強タンパク質を投与し、それによって疾患を予防することからなる方法も提供す る。 最後に本発明は、精製殺菌性／透過性増強タンパク質を単離及び回収する方法で あって、（ａ）殺菌性／透過性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）その粗 試料を、脱発熱物質溶液（ｃｌｅ−ｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ　５ｏｌｕｔｉｏｎ ）を使用するカラムクロマトグラフィーによって分離し、精製殺菌性／透過性増 強タンパク質を単離及び回収することからなる方法をも提供する。 ４１ユ１皇ｌ且泗 図１ａ：新鮮に単離した好中球におけるＣＲＩの平均蛍光強度をＦＡＣ３分析に よって測定した。材料及び方法のセクションに記載したように細胞を種々の量の Ｅ、Ｃｏ１１０１１１：Ｂ４　ＬＰＳで刺激した。平均蛍光強度は個体間で変化 するので、データは、認められた最大一応答の百分率（％）で表わした０図のデ ータは３回の実験の平均＋／−標準誤差を表わしている。 図１ｂ：好中球刺激を試験する前に、０１１１：Ｂ４　ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ ）を、種々の量の粗アズール好・性抽出物と一緒に３７℃で３０分間ブレインキ ュベートした。 図のデータは、代表実験の二重反復試験の平均＋／−標準誤差を表わしている。 値は、ＬＰＳのみに対する応答の％阻害で表されている。 図２：粗アズール好性抽出物を逆相ＨＰＬＣによって分離した。各ピークを手作 業で回収し、アミノ酸分析によってタンパク質濃度を決定した。各ピークのアリ コート（１μｇ）を低内毒素ＢＳＡの存在下に乾燥し、発熱物質非含有０．１％ 酢酸の存在下に再度乾燥した０図のデータは、代表実験の二重反復試験の平均＋ ／−標準誤差を表わしている。 図３ａ：まず分子ふるいにかけ、次いでカチオン交換ＨＰＬＣによって精製した ＢＰＩを逆相ＨＰＬＣにかけ、フラクションをＬＰＳ阻害活性について試験した 。 図３ｂ：データは、フラクション２０．２１及び２２の阻害活性についての２Ｘ 精製材料のＲＰＬＣプロフィールと５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析とを示す。 図４：０１１１：Ｂ４　ＬＰＳ（Ｌｏｎｇ／ｍｌ）を種々の量の（Ａ）精製ＢＰ Ｉ及び（Ｂ）ポリミキシンＢと一緒にブレインキュベートし、好中球刺激活性に ついて試験した。２つの実験の結果は、好中球における補体レセプター発現の阻 害を複製試料の標準誤差で示す。 図５：（ａ）棒グラフは、ＦＭＬＰ、ＴＮＦ及びＬＰＳで刺激した好中球の表面 におけるＢＰＩ発現を示す。（ｂ）棒グラフは、ヒト好中球細胞表面の発現の最 大ＣＲ３アップレギュレーションを示す。 図６・ＢＰＩ及びポリミキシンＢが、ＬＰＳに対する好中球応答を時間−〇にお いて７０％以上阻害したことを示す棒グラフ。 図７　：　ＬＡＬアッセイにおいてＢＰＩがＬＰＳ活性を阻害することを示すグ ラフ。 図８＝カチオン交換ＨＰＬＣ（ステップ１）によって分画されたアズール好性顆 粒抽出物を示すクロマトグラム、点線はＬＰＳ阻害活性を示し、実線はタンパク 質吸収を示す。 図９＝カチオン交換ＨＰＬＣ（ステップ）によって分画されたアズール好性顆粒 抽出物を示すクロマトグラム、点線はＬＰＳ阻害活性を示し、実線はタンパク質 吸収を示す。 図１０＝分子ふるいＨＰＬＣ（ステップ３）によって分画されたアズール好性顆 粒抽出物を示すクロマトグラム、点線はＬ−ＰＳ阻害活性を示し、実線はタンパ ク質吸収を示す。 図１１：アズール好性顆粒抽出物、沈澱抽出物及び上記３つのクロマトグラフィ ーステップから得られたフラクションプールの５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル。 図１２：総タンパク質の９７％を占める単−主ピークを同定する微細孔逆相ＨＰ ＬＣによる精製ＢＰＩの分析。 図１３：１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに対する好中球応答のＢＰＩによる阻害を示す 折れ線グラフ。 図１４：ＢＰＩがＬＰＳに直接結合することを示す折れ線グラフ。 図１５：固定されたＬＰＳへのＢＰＩの結合がポリミキシンＢによって阻害され たことを示す折れ線グラフ。 図１６：血漿の存在下にＢＰＩがＬＰＳに結合することを示す折れ線グラフ。 図１７：血清の存在下にＢＰＩがＬＰＳに結合することを示す折れ線グラフ。 図１８・ＢＰＩが、ＬＰＳに対する発熱物質の応答を調節することを示す棒グラ フ。 １吋立川１ 本発明は、細胞のリボ多１１（ＬＰＳ）媒介刺激を阻害する方法を提供する。こ の方法は、細胞刺激量のリボ多糖の存在下に細胞を、細胞刺激を阻害するのに有 効な量のＢＰＩと接触させることからなる。 細胞刺激を阻害するのに有効なりＰＩの量は、存在する条件に従って変化する。 細胞刺激を阻害するのに有効な量は好ましくは約１１００ｎ〜約１００ｍｇであ り、最も好ましい量は約１０μｇ〜約１０ｍｇである。 好中球及び単球は、本発明の適用に関して最も重要な細胞である。しかしながら 、内皮細胞のような他の細胞もＬＰＳによって影響を受け、本発明に使用するこ とができる。 好ましい実施態様においては精製ＢＰＩを使用する。またＢＰＩは組換えＢＰＩ 及びその生物学的に活性なポリペプチド類縁体でもよい。１つの適当なりＰＩの 類縁体は、分子量約２５ｋＤを有し、ＢＰＩのＮ末端アミノ酸に対応するポリペ プチドからなる。 本明細書中、殺菌性／透過性増強タンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類 縁体とは、無傷の又は天然の殺菌性／透過性増強タンパク質と実質的に同じアミ ノ酸配列を有し、従って同じ生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染を治療する方法をも提供する。この方法は、 細菌感染体を、細胞のＬＰＳ媒介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療す るのに十分な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と 接触させることからなる。 グラム陰性細菌惑染として、死を招く最も一般的な院内感染であるグラム陰性細 菌敗血症が挙げられることは当業者には明らかであろう。一般にグラム陰性細菌 敗血症は、敗血症を伴なうまたは伴わない発熱原性微生物による感染から生じる 重症の毒性有熱状態である。 グラム陰性細菌感染は、内毒素ショックまたは炎症状態を伴ない得る。炎症状態 は例えば、散在住血管内凝固（ＤＩＣ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）また は腎不全を伴ない得る。 好ましい実施態様においてはグラム陰性細菌感染は被検体、最も好ましくはヒト に存在する。 更に本発明は、グラム陰性細菌感染を治療するための組成物をも提供する。この 組成物は、細胞のＬＰＳ媒介刺激を阻害するのに有効な量の精製ＢＰＩまたはそ の生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する。 好ましい実施態様においては、ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド 類縁体は医薬的に許容可能な担体中 冒こ含有させて投与される。医薬的に許容可能な担体は、無菌溶液、錠剤、被膜 錠剤及びカプセルのような任意の標準的な医薬担体を包含する。典型的にはこの ような担体は、澱粉、ミルク、糖、所定のタイプのクレー、ゼラチン、５ｔｅｎ ｓｉｃ　ａｃｉｄ、タルク、植物脂肪もしくは油、ゴム、グリコールといった賦 形剤または他の公知の賦形剤を含む、かかる担体は更に香料及び着色剤または他 の成分を含むこともできる。このような担体を含有する組成物は、よく知られた 通常の方法で処方される。しかしながら、好中球または単球のＬＰＳ媒介刺激を 抑制するのに有効な量のＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体 を含有する組成物はこれまで知られていない。 上記方法において組成物の投与は、これらに限定はされないが、経口、静脈内、 筋肉内及び皮下投与を含む任意の公知の方法によって行なうことができる。 本発明の方法の実施に際しては、該組成物に配合されるＢＰＩまたはその生物学 的に活性なポリペプチド類縁体の量は広範囲に変えることができる。正確な量を 決定する方法は当業者には公知であり、特に治療される被検体、特定の医薬層、 使用する投与経路及び組成物を投与する頻度に従う。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内を緩和するように被検体を 治療するのに有効な量のＢＰＩを投与することからなる方法を提供する。本明細 書中、内毒素とは、微生物、主にグラム陰性細菌の細胞壁に認められるリポ多糖 複合体を含む物質である。 更に本発明は、散在住血管内凝固を伴なう疾患の被検体を治療する方法をも提供 する。この方法は、被検体に、散在住血管内凝固の症状をｌＩ′！ａｌ、、それ によって被検体を治療するのに有効な量のＢＰＩを投与することからなる。本明 細書中、散在住血管内凝固なる用語は、全身性フィブリン沈着及び血栓症、出血 、更には凝固因子の喪失を伴って凝固因子が加速度的に消費される血液凝固機構 の合併症である。更に、散在住血管内凝固は急性または慢性であり得る。 更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素血症を患った被検体を 治療する方法であって、被検体に、グラム陰性細菌惑染を撲滅し、内毒素血症の 被検体を治療するのに有効な量のＢＰＩを投与することからなる方法をも提供す る。 本明細書中、内毒素血症とは、血液が、体細胞によって産生されるかまたは微生 物即ちグラム陰性細菌から生じる毒性産物を含む状態を意味する。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連貧血を患った被検 体を治療する方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関 連貧血を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のＢＰＩを投与すること から・なる方法をも提供する。 本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連白血球減少症を患 った被検体を治療する方法をも提供する。この方法は、被検体に、グラム陰性細 菌感染を撲滅し、内毒素関連白血球減少症を緩和するように被検体を治療するの に有効な量のＢＰＩを投与することからなる。 更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連血小板減少症を患 った被検体を治療する方法であって６、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し 、内毒素関連血小板減少症を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のＢ ＰＩを投与することからなる方法をも含む。 本発明は更に、発熱物質を阻害する方法であって、発熱物質を阻害するような量 のＢＰＩを発熱物質に接触させることからなる方法をも提供する０本明細書中、 発熱物質とは全ての熱生成物質であり、外因性発熱物質は細菌特にグラム陰性細 菌の内毒素を含み、内因性発熱物質は、発熱を生起するために脳中枢に作用する 単核白血球のような細胞から誘導される熱不安定性タンパク質である。 更に本発明は、細胞によるリボ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害する方法であっ て、細胞刺激量のリボ多糖の存在下で細胞を、細胞にょろりボ多糖媒介腫瘍壊死 因子を阻害するのに有効な量のＢＰＩと接触させることからなる方法をも含む。 本発明は更に、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産土を阻害する方法 であって、グラム陰性細菌を、細胞によるグラム陰性細面媒介腫瘍壊死因子産生 を阻害するのに有効な量のＢＰＩと接触させることからなる方法をも含む。 細胞刺激を阻害するのに有効な量のＢＰｒは存在する条件に従って変化する。細 胞刺激を阻害するのに有効な量は好ましくは約１１００ｎ〜約１００ｍｇであり 、最も好ましい量は約１０μｇから約１０ｍｇである。 上記方法においては、ＢＰＩは組換えＢまたはその生物学的に活性なポリペプチ ド類縁体からなる。更にＢＰＩの生物学的に活性なポリペプチド類縁体は、分子 量約２５ｋＤを有し、ＢＰＩのＮ末端アミノ酸配列に対応するポリペプチドから なる。 更に本発明は、内毒素関連ショックを患った被検体を治療するための組成物をも 含む、この組成物は、内毒素関連ショックを患った被検体を治療するのに有効な 量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体と を含有する。 更に本発明は、散在住血管内凝固を患った被検体を治療するための組成物をも含 む。この組成物は、散在住血管内凝固を患った被検体を治療するのに有効な量の 精製ＢＰＩｔたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含 有する。 本発明は更に、内毒素血症を患った被検体を治療するのに有効な量の精製ＢＰＩ またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内 毒素血症の被検体を治療するための組成物をも含む。 本発明は更に、内毒素関連貧血を患った被検体を治療するのに有効な量の精製Ｂ ＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する 、内毒素関連貧血の被検体を治療するための組成物を提供する。 更に本発明は、内毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療するための組成物 をも提供する。この組成物は、内Ｓ素関連白血球減少症を患った被検体を治療す るのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なボリペブチこの組成物 は、内毒素関連血小板減少症の被検体を治療するのに有効な量の精製ＢＰｒまた はその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する６更に本 発明は、細胞にょろりボ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するのに有効な量の精 製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有 する、細胞によるリボ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するための組成物をも提 供する。更に本発明は、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産土を阻害 するのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体 と適当な担体とを含有する、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を 阻害するための組成物をも提供する。 本発明は、発熱物質を阻害するための組成物をも提供する。この組成物は、発熱 物質を阻害するのに有効な量の精製ＢＰＩまたはその生物学的に活性なポリペプ チド類縁体を含有する。 更に本発明は、被検体におけるグラム陰性細菌怒染に伴なう症状を予防する方法 であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を予防し、それによって該症状を予防 するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法 を提供する。前述の方法においては、症状は、内毒素関連ショック、内毒素血症 、内毒素関連貧血、内毒素関連白血球減少症または内毒素関連血小板減少症から なる群から選択されるいずれかの症状である。 更に、被検体における散在性血管内凝固を伴なう疾患を予防する方法であって、 被検体に、散在性血管内凝固の症状を予防し、それによって疾患を予防するのに 有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法も提供さ れる。 最後に本発明は、精製殺菌性／透過性増強タンパク質を単離及び回収する方法で あって、（ａ＞殺菌性／透過性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）その粗 試料を、脱発熱物質溶液を使用するカラムクロマトグラフィーによって分離し、 精製殺菌性／透過性増強タンパク質を単離及び回収することからなる方法をも提 供する。更にこの方法においては殺菌性／透過性増強タンパク質は、天然の殺菌 性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体から なる。更に殺菌性／透過性増強タンノ（り質の生物学的に活性なポリペプチド類 縁体は、分子量約２５ｋＤを有し、殺菌性／透過性増強タンノ（り質のＮ末端ア ミノ酸配列に対応するポリペプチドからなる。本発明者らは、ＢＰｒの生物学的 活性レベルが、ＢＰＩを得るのに使用した方法に従って変化することを見い出し た。脱発熱物質化されたＢＰＩ、即ち脱発熱物質溶液を使用して上記方法によっ て単離及び回収されたＢＰＩは、発熱物質含有のＢＰＩよりはるかに窩い生物学 的活性レベルを示すようである（表５及び図４Ａ）。 以下、実験の詳細及び結果のセクションにおいて本発明を説明する。これらのセ クションは本発明の理解を助けるために記載するものであって、請求の範囲に記 載した本発明をいかようにも制限するのでもないし、また制限されるべきではな い。 犬１日１ 犬１」ＬＬ 扛１」Ｕε１ｊＬ− 試」Ｌ リボ多糖−−−Ｅ、Ｃｏ１１０１１１：Ｂ４．　Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ野生 型由来； 糖脂質・・・・・乳」Ｌ１土５」カリーＲＥ変異株由来；ＬｉｐｉｃｌＡ・・・ ・・ジ」ｌ且贋」且二ハｒｍ　ＲＥ変異株由来；ＬＰＳ・・・　・・Ｐ、ａｅｒ ｕ　１ｎｏｓａ由来（ＲＩＢＩ　Ｉｉｉｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 Ｉｎｃ、、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ製）。 Ｆ僧ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＬＰ）及びポリミキシンＢサルフェート・・・ −５１ｇ＋＊ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ製：Ｈａ ｎｋ’　ｓ平衡塩類溶Ｈ（Ｈｅｓｓ）［カルシウム、マグネシウム及びフェノー ルレッドを含まない］・・・・・Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｄ ｕｃｔｓ、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｐ＾製：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ 及びＭａｒｃｏｄｅｘ＝−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、。 Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　、ＮＪ製： ＴＮＦ及び抗ＴＮＦ・４ｎｄｏｇｅｎ、Ｂｏｓｔｏｎ　Ｍ＾製：フルオレセイン 結合ヤギ抗マウスＩｇＧ・・・・・ＴＡＧＯＩｎｃ、。 ８ｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ製； ＩｇＧ１対照抗体−−−−Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｉｓｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｈｉａｌｅ ａｈ、ＦＬ製；フィコエリトリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）を結合 した抗ＣＲ３（Ｌｅｕ−１５）及びＩＨＧ２ａ対照−Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃ＾製： 抗ＣＲＩモノクロナール抗体、Ｙｚ−１＝−Ｄｒ、Ｒｉｃｋ　Ｊａｃｋ（Ｈａｒ ｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から供与。 ズーｌ　Ｉの 顆粒球を地方の血液銀行から得たバフィーコートから単離した。バフィーコート をＨＢＳＳで３〜４倍に希釈し、顆粒球を単核細胞から６４１パーコールで遠心 分離した。ベレ・ントをジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）にさら し、洗浄し、次いで水冷した溶解緩衝液［１０５Ｍ　ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６，８゜ １００ｍＭ　ＫＣＩ、３ｍＭ　ＮａＣｌ、３．５＋ｍＭ　ＭｇＣｌ２コに再び懸 濁させ、窒素空洞現象によって破砕した（Ｐａｒｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃ ｏ、、Ｍｏ１ｉｎｅ。 ＩＬ）　、アズール好性顆粒をＢｏｒｒｅｇａａｒｄ［Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ、 Ｎ、　、Ｊ、Ｍ、Ｈｅ１ｐｌｅ、Ｅ、Ｒ，Ｓｉｍｏｎｓ及びＲ１＾、ＣＩａｒｋ 、Ｊ、Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ　、　、９７：５２−６１（１９８３）］により記 載された不連続パーコール勾配上で単離した。アズール好性顆粒を集め、パーコ ールを遠心分離（−１８０，０００ｘ　Ｇ、２時間凡て除去した。顆粒を４サイ クルの凍結−融解、次いで超音波に１分かけて溶解させた。溶解させた顆粒を、 等容量の１００ｍＭグリシン（ｐＨ２）で室温にて１時間断続的に緩やかに撹拌 することによって抽出した。酸抽出物を遠心分離（３０，０００ｘ　Ｇ　、２０ 分間、次いで２００，０ＯＯＸ　に、３０分間）して透明にした。 Ｌも１１１ 健康なドナーボランティアから静脈血を酸クエン酸デキストロース抗凝固物質中 に採取し、直ちに氷の上に置いた。 血液を５部、冷Ｎａｃｒｏｄｅｘ　１部と混合し、次いで４℃で１．５〜２時閏 時宜放置、白血球に富む血漿を冷ＨＢＳＳ中で１回洗浄し、次いでＨＢＳＳ中に 再び懸濁させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ上に層形成した。赤血球による汚染が 顕著であれば、顆粒球ペレットを低張溶解に掛けた。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄 し、ＨＢＳＳ＋２＄岡原血漿に再び懸濁させると、培養混合物中でＩ　Ｘ　１０ ＠／ｊｔ’の最終顆粒球濃度となった。 肚ｍ 粗アズール好性顆粒抽出物はぼ２ｍｇを、Ｂｉｏｓｉｌ（ＴＳＫ−２５０）（７ ，８ｚｚｘ６００ｚｚ）高速分子ふるいカラムで、５０−Ｍグリシンと１００ｍ Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ２）を用いて、流速ｌＲ１７分の一定条件下で分子ふ るい分離した。最も強いＬＰＳ阻害活性を持つカラム画分は、ＳＤＳ　ＰＡにＥ に示されるように多量の５４　ＫＤ蛋白質を含んでいた。これらのＴＳＫ画分を プールし、５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５，５）を用いて＾ｑｕａｐｏｒｅ弱カチ オン交換（ＷＣＸ）カラム（２，１１１Ｘ　３０ｚｚ）にかけ、次いで５０ｍＭ クエン酸塩とＩＭ緩衝液Ｂ（５分）で、流速２００ｚ１／分で溶出した。５７　 ＫＤの材料を、カチオン交換で回収すると、ＳＯＳ　ｐａｇｅでは１本のノくン ドとして現れた。幾つかの実験に於いては、ＢＰＩを、ＶｙｄａｃＣ４カラム逆 相ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ　Ｔｎｓｔｒｕｎ＋ｅｎｔｓ、Ｅｎ＋ｅｒｙｖｉｌｌ ｅ、Ｃ＾）に、０．１＄ＣＨｚＣＮ＋　０．１＄ＴＦ＾中１２紮込み、流速２０ ０ｘ１７分で３０分間かけて溶出、精製した。 Ｌ東１糺ｌ 単離した好中球を氷上に保持した後、３７℃で３０分間刺激する場合と刺激しな い場合に分けて培養した。培養後、細胞を多量の冷ＰＢＳ＋　０．０５＄アジ化 ナトリウム＋２ｚ同原血漿で洗浄した。ベレットを２つに分け、一方を対照１ｇ Ｇ　１抗体（２０μｇ／１ｘｌＯ’細胞）５０μｍで、もう一方を抗ＣＲＩ　（ ２０μｇ／ｌ　ｘ　１０６細胞）５０μｌで０°Ｃ１３０分間染色した。培養後 、細胞をＰＢＳ＋同原血漿で２回洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦｒＴＣ で染色した。幾つかの実験に於いては、対照ウェル中でＩｇＧ２ａ−ｐｈｙｃｏ ｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）２０μｍ、試験ウェル中でＬｅｕ−１５ＰＥ　２０μ ｌを用いた。０℃で３０分間培養後、さらに２回洗浄し、細胞をＢｅｃｋｏｎ　 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｔａｒフロー血球計算器（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋ ｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、Ｃ＾）で、フロー血球計算によって 分析した。好中球刺激を、ＨＢＳＳ十０．２＄岡原血漿単独（対照）中で培養し たサンプルと、ＢＰＩ若しくはポリミキシンＢと３７℃で３０分間前培養したＬ ＰＳまたはＬＰＳと一緒に培養したサンプルの平均蛍光強度を比較して測定した 。データは、２刺激または２阻害で表示し、 ２刺激＝［（実験値一対照値）バ最大値一対照値）］　ｘ　１００及び２阻害＝ １−［（＋阻害剤）−（対照）］／［（−阻害剤）−（対照）コ×１００ に従って、対数目盛りで、平均蛍光強度（ＦＴ）を用いて計算した。 乙ｊノＪＬ３ＪＬ ＢＰＩの気相加水分解及びアミノ酸誘導化を、Ｐｉｃｏ−ｔａｇワークステーシ ョン（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ　Ｍ＾）で実施し、次いでフェニルチオカ ルバミルアミノ酸のクロマトグラフィー分析を、製造業者によって提供されたプ ロトコルを用いて＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　１３０＾ＭＰＬＣで 実施した。 【乳た１ ＢＰＩ　Ｎ−末端配列を、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７＾パ ルス液相アミノ酸配列分析装置（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏ ｓｔｅｒｃｉｔｙ、Ｃ＾）を用いて自動エドマン分解で分析した。フェニルチオ ヒダントインアミノ酸分析を、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ編ｓＭｏｄｅ ｌ　１２０＾液体クロマトグラフを用いてオンラインで実施した。 ヒト好中球を、リボ多糖によってｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒ。 の両方で刺激した。活性化の際に、Ｃ３ｂ及びＣ３ｂ　ｉ　（各々ＣＲＩ及びＣ Ｒ３）レセプターの表面発現が増加する。　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ＾ｃｔｉ ｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）を用いて、新たに単離したヒ ト好中球の蛍光強度を測定し、０１１１：８４　ＬＰＳの用量を増加させて刺激 したく図１ａ）０通常観察された最大刺激は１゜ｎｇ／ｚ１以上であったが、刺 激用量として１０ｎｙ／ｌｌを使用して、０１１１：Ｂ４　ＬＰＳの阻害を試験 した。総ての実験を、対で実施した。多くの実験に於いては、データはＣＲＩに 関してしが示していない、これは、我々が好中球刺激がＣＲＩまたはＣＲ３単独 のアップレギュレーションを引き起こす条件を知見しなかったからである［Ｍ、 Ｍａｒｒａら（１９９０）　、Ｊ、Ｉｎｍｕｎｏｌ、１４４（２）：６６２−６ ６す。 好中球アズール好性顆粒中に見出した蛋白質がＬＰＳに対する好中球応答を妨害 し得るかどうかを決定するために、アズール好性顆粒の粗絞抽出物をＬＰＳと共 に３７℃で３０分間前培養した１次いで混合物を好中球を刺激する能力に関して 試験した。アズール好性蛋白質（１μｇ／＊１）は、ＬＰＳ１０ｎｇ／１１によ る多形核白血球（ＰＭＮ）　Ｉ　Ｘ　１０’／ｚｌの刺激を効果的にブロックし 得たく図１ｂ）。この効果は、ＬＰＳと共に前培養したグリシン抽出ｖＬ衝液を 用いても観察されなかったし、粗抽出物または対照グリシン緩衝液を用いても好 中球を刺激できなかった（データは示されていない）。 抽出物中のどの蛋白質が、阻害作用の原因となっているのかをさらに研究するた めに、粗絞抽出物を逆相１（ＰＬＣによって分離した。各ピークを、ＬＰＳ阻害 活性に関して別個に分析した。各ピークの同定を、−次元での微少細孔（ｍｉｃ ｒｏ−ｂｏｒｅ）逆相）ＩＰＬＣにかけ、次いでＳＯＳ　ＰＡＧＥ、エレクトロ ブロッティングそしてマイクロシーフェンシングを含む二次元精製アプローチを 用いて予め決定した。アズール好性蛋白質は、１０本の別々のピークに分かれた 。各々を表１に示す。 示されているアミノ酸配列は、Ｎ−末端の最初の１５アミノ酸である。 紅 アズール　〜　の ピーク　同定　１　５　１０　１５ １　Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ　ＣＹＣＲＩ　ＰＡＣｒ　ＡＧＥＲＲＹ（ＩＩＮＰ−２ ） ２　Ｃｒａｎｕｌｏｃｉｄｉｎ　ＶＣＳＣＲＬＶＦＣＲＲＴＧＬＲ（ＨＮＰ−４ ） ３　Ｅｏｓ　１ｎｏｐｈ　ｉ　Ｉカチオン性蛋白質（ＥＣＰ）　ＸＰＰＱＦＴＲ ＡＱＷＦＡＩＱＨ４ａ　Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔ ｏｘｉｎ（ＥＤＮ）　ＫＰＰＱＦＴＸＡＱＸＦＥＴＱＸ４ｂ　Ｃａｔｈｅｐｓｉ ｎＧ　ＩＩＧＧＲＥＳＲＰＨ８ＲＰＹＭ５　ａ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｋ　Ｖ　Ｆ 　Ｅ　ＲＸ　Ｅ　Ｌ　Ａ　ＲＴ　Ｌ　Ｋ　ＲＬ５　ｂ　Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ主 蛋白質（ＭＢＰ）　ＴＣＲＹＬＬＶＲ５ＬＱＴＦＳＱ６　未定　ＩＶＧＧＲＫＡ ＲＰＸＱＦＰＦＬ７　未定　ＩＶＧＧＨＥＡＱＰＨ９ＲＰＹＭ８ａ　Ｍｙｅｌｏ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅＶＮＣＥＴＳＣＶＱＱＰＰＣＦＰ８ｂ　Ｅｌａｓｔａｓｅ 　ＩＶＧＧＲＲＡＲＰＨＡＸＰＦＭ９　Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｃｌａｌ／Ｐｅｒｍ ｅａｂｉｌｔｙ　ＩｎｃｒｅａｓｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ（ＢＰＩ）　ＶＮＰＧＶ ＶＶＲＩ　５ＱＫＧＬＤ図２には、各ピークの１μｇのＬＰＳ阻害活性が示され ている。ピーク９は、最高のＬＰＳ中和活性を有していた。このと−クに於ける 主蛋白質種は、既述の殺菌性／透過性増強蛋白質（ＢＰＩ）［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、 、Ｐ、Ｅｌｓｂａｃｈ、１．０１ｓｓｏｎ及びＨ，Ｏｄｅｂｅｒｇ、Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３（８）　：２６６４−２６７２（１９７８）］とＮ −末端が一致した。 ＢＰＩは、アズール好性顆粒蛋白質抽出物中リグラム陰性殺菌活性の大部分を有 していることが示された。カテプシンＧは、ＬＰＳの阻害を幾らか示したが、実 験間のデータでは、ピーク９のような再現性はなかった。カテプシンＧは、Ｌｖ ｉｔｒｏでＬＰＳと結合してグラム陰性細菌を殺すが、ＢＰＩよりは少ない量で あることが示された。グラム陰性細菌に対して殺菌活性を示した他の蛋白質は、 エラスターゼとデフェンスニスである。しかしながら、これらの蛋白質（１μｇ ／ｗｌ）は、好中球上でＬＰＳの刺激活性を阻害しなかった。 粗アズール好性抽出物のＬＰＳ阻害活性をさらに特徴付け、分子ふるい及びイオ ン交換、次いで逆相クロマトグラフィーによって精製した。ＬＰＳ阻害活性は、 ＳＤＳ　ＰＡ［；Ｅに見られと る純粋な５７　ＫＤバンドに一緒に移動（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）　した（図３ｂ ）。 ＲＰＬＣ分離に使用した緩衝液［ＣＨ，ＣＮ及び０．１＄）リフオロ酢酸（ＴＦ ＾）］は、ＢＰＩのＬＰＳ阻害活性をかなり減らしてしまうため（データは示さ れていない）、且つイオン交換クロマトグラフィーで精製した材料はＳＯＳ　Ｐ ＡＧＥから判断して高純度であったため、分子ふるい／イオン交換材料を使用し て用量応答曲線を画いたく図４ａ）　、データは、各々対で実施した２つの実験 に基づいて示されている。この分子ふる％）／イオン交換で精製した材料は、Ｎ −末端配列分析からＢＰＩであることが確認された。蛋白質濃度は、アミノ酸分 析によって測定した。 図４ａに示されているように、ＢＰＩ約９０ｎｇ／ｘ１が、０１１１／８４ＬＰ Ｓ　Ｌｏｎｇ／ｘ１に対する好中球応答の最大阻害に必要である。 処方したペプチド（１０−’Ｍ　ＦＮＬＰ）に対する好中球応答は、ＢＰＩによ り阻害されなかった（データは示されていない）。 図４ｂは、ポリペプチド抗生物質ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）に対する同様の用量 応答曲線を示している。ポリミキシンＢは、ＬＰＳのリビド＾部分に結合して、 　ｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏの両方でその毒性作用をいくらか中和す る。ポリミキシンＢはＬＰＳに化学量論的に結合することが実証されている［Ｍ ｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ、Ｃ，及びり、Ｍ、Ｊａｃｏｂｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ 、１３：８１３−８１８（１９７６）］。スムース型細菌由来ＬＰＳ　１０ｎｇ ／ｍｌを阻害するのに必要なＰＭＢの計算量は、はぼ０．６７ｎＭである。本実 験に於いては、ＬＰＳ　１０ｎｙ／ｚ１を用いる好中球刺激を完全に阻害するの には、ポリミキシンＢ　０．４ｎｇ／ｍｌまたは０．３６ｎＭが必要である。　 ＬＰＳ　１０ｎｇ／ｚ１！の１０ｏｚ阻害には、８ＰＩ　９０ｎｇ／ｍｌまたは １．５８ｎＭが必要である。 従って、モルベースでｉｎ　ｖｉｔｒｏで好中球のＬＰＳ刺激を阻害するのに必 要なりＰＩ量は、ポリミキシンＢに必要な量のほぼ４倍であった。 ＢＰＩが他のグラム陰性細菌からのＬＰＳを阻害し得るかどうかを試験するため に、種々の鎖長のポリ多糖及びリビド＾をもつＬＰＳ分子を、２×精製ＢＰＩ　 ９０ｎｇ＃１に対する実験系で試験した０表２に示されているデータは、刺激用 量がこれらの分子間で様々であるが、スムース型及びラフ型クモタイプ（ｃｈｅ ｍｏｔｙｐｅ）の両方に由来するＬＰＳ並びにリビド＾が総てＢＰＩによって阻 害されたことを示している。 宍じし 野生型　１０３　１１３ Ｓ、ＴＹＰＨＩＭＵＲＩＵＭ ＲＥ変異株　１１３　１０９ Ｓ、ＴＹＰＨＩＭＵＲＩＵＭ ＲＥ変異株　３３９９ ＊　この内毒素濃度では低すぎて刺激がなかったＢＰＩの　六 既に議論したように、殺菌性／透過性−増強蛋白質（ＢＰＩ）は、ｌｅｅ　ｉｓ ｓらによりヒト好中球顆粒から最初に精製されたカチオン性の５０−６０，００ ０ｍ、ｕ＋、の蛋白質である（Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、、Ｐ。 Ｅｌｓｂａｃｈ、１．０Ｉｓｓｏｎ及びＨ，Ｏｄｅｇｅｒｇ、１９７８．Ｊ、Ｂ ｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、２５３：２６８４　、　）。ＢＰＩは、細菌細胞膜の透過 性を変化させ、グラム陰性細菌に対し特に殺菌作用を有する。今日まで、ＢＰＩ に関する文献は、もっばらその殺菌作用に注目してきた。 我々は、ＢＰＩがＬＰＳに結合し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで可溶性ＬＰＳに対し好中 球及び単球応答の両方を阻害することを報告する。 ＢＰＩは、カブトガニ変形細胞溶解物分析（Ｌｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏ−ｃｙ ｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　ａｓｓａｙ）に於いてＬＰＳ活性も阻害する。我々の研究 から、ＤＰＩを内毒素ショックに対する新規治療の開発の為の主要な分子として 同定した。 ＬＰＳに対する応答に於いて、ヒト好中球は補体レセプターＣＰＩ及びＣＦ２の 細胞表面発現をアップレギュレートする（図１ａ及び図５ｂ）。ＬＰＳに対する この好中球応答を測定するために、我々は、新鮮に単離したヒト好中球をＥ、Ｃ ｏ１１０１１１：Ｂ４ＬＰＳと共に培養しく図４ａ）、ＬＰＳ　１０ｎｇ＃ｌを 用いると、最大ＣＲＩアッ７レギュレーションが観察されることを示した（図４ ）、　ＬＰＳによる好中球の刺激は、外因性の抗ＴＮＦ抗体によっては阻害され ず、ＬＰＳがこの系で直接好中球に作用したことと示唆している。 ＢＰＩは、ＬＰＳに対する好中球応答を阻害する（図４ａ）。ＣＲアップレギュ レーションの阻害は、はぼ１．８〜３．６ｎＭ（１０（１−２００ｎｇ／ｘ１） の用量では完全である。０．４ｎＭのポリミキシンＢと比較した、スムース型細 菌由来ＬＰＳ　１０ｎｙ／ｘｉ（はぼｍ、ｗ、１５，０００）を阻害するのに必 要なりＰＩは、約０　、７　ｎ　Ｍであり、実測値０．４ｎＭと非常に近似して いる０モルベースでのＬＰＳを阻害するのに必要なりＰＩ量は、ポリミキシンＢ に必要な量のほぼ５倍以上であった。 ＢＰＩはＬＰＳ媒介好中球刺激を阻害するが、ＦＭＬＰまたはＴＮＦのいずれか の刺激は阻害しない（表３）、これらのデータは、ＢＰＩがＬＰＳを直接阻害し て、ＣＲアンプレギュレーションに含まれる好中球メカニズムを破壊しないこと を示している。 ＢＰＩによるＬＰＳの中和は、迅速に起こる。前培養なしでも、ＢＰＩ（及びポ リミキシンＢ）は両方とも、ＬＰＳに対する好中球応答の７０ｚ以上を阻害する （図６〉。最大阻害は、たった５分の前項ｇ！後に見られた。 ＢＰＩは、スムース型及びラフ型細菌株由来のＬＰＳ並びにリビド＾によって刺 激されるＣＲアップレギュレーションを阻害する（表４）、これらのＬＰＳの異 なる型に対するＢＰＩ活性は広範囲であるため、これらの中でもリビド＾と２− ケト−３−デオキシ−オクトネートだけが抗原決定基を共有しており、ＢＰＩに よるＬＰＳ阻害はリビド＾を介して作用するようである。 ＢＰＩは、池のＬＰＳ媒介活性を阻害する。はぼ９ｎＭまたは５００ｎｇ／ｍｌ 濃度で、ＢＰｒはＬＡＬ分析に於いてＬＰＳ活性をかなり阻害した（図７）、［ 、ＰＳとＥＩＰＩを前培養なしに一緒に添加すると、阻害は全く観察されなかっ た（データは示されていない）、このことは、ＢＰＩがＬＰＳに作用し、ＬＡＬ 分析系には作用しなかったことを示している。　ＢＰＩはまた、ヒト付着性単核 細胞によりＬＰＳ媒介ＴＮＦ生成を阻害する（表５）。 衣」Ｌ 々の試薬に　る　に・　るＢＰＩの ・に　けるＣＲア７ブレ　ニレ−ジョンのＰ！Ｌ！ＬＩＪｉＬ　柵ｆ比　■ロＬ ユＬＰＳ　ｆ（ｌｒＢ）＃１１０９　１０１０２Ｆ、Ｐ　１０−７Ｍ　９　１１ ｒＴＮＦ　５０Ｕ／ｚＮ　ＯＯ 好中球を、２．７ｎＭ　ＢＰＩの存在下または非存在下で前培養したＥ、Ｃｏ１ １０１１１：Ｂ４　ＬＰＳ、　ＦＭＬＰまたはＴＮＦと共に培養した。 ［新液のみ音用いて前培養した各刺激に対して、応答に於けるＣＲ発現の２阻害 としてデータを報告した。 宍」Ｌ ＬＰＳ　びリピドＡ；　の１３ＰＩによるに　けるＣＲアップレ　ニレ−ジョン の０１１１：Ｂ４　ＬＰＳ　１０　１００　９９Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ 野生型ＬＰＳ　１０　１０４　１００ Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕ＋ｅ ＲＥ変異株ＬＰＳ　１　９７　９５ Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ ＲＥ変異株 リピド＾　１　１１１　１０４ 好中球を、精製ＢＰＩ　２．７ｎＭを加えてまたは加えないで前培養しなＬＰＳ 及びリピド＾で刺激した。結果は、冬型のＬＰＳ単独で観察された蛍光強度の２ 阻害として表示した。 艮Σ ＢＰＩＪヒト　・に　ＬＰＳ＝ＴＮＦ １ｐｆ−ＬＰＳに・　’　ｒ−ＴＮＦ　ｓｌ＊ｏｏ　ｏｏｏ　。 Ｏ，１６１０００８１ ＊Ｌ蝕１ｉ　０１１１：Ｂ４　ＬＰＳをＢＰＩまたはポリミキシンＢ（ＰＭＢ） と共に前培養し、次いで付着性末梢血単核細胞に添加した。　ＴＮＦ生成を、Ｅ ＩＪＳ＾によって分析した。 ＢＰＩは、１９７８年にＥｌｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓによって最初に精製され た。初期研究に於いて、我々は、ＢＰＩをアズール好性顆粒抽出物から逆相ＩＨ ’Ｌｃで一段階で単離した。逆相からのＢＰＩ活性の回収は僅かであったが、こ れは多分変性条件によるものであろう０本明細書中では、我々は非変性段階のみ を用いるＬＰＳ阻害活性の精製を示し、好中球からの活性の大部分がＢＰＩと重 なって移動することを示す、精製法を改良すると、以下のセクションにも示され ているような非常に高い比活性をもつ材料を得ることができる。 図８〜１０は、我々の研究室に於いて現在使用している３つのクロマトグラフィ 一段階を示している。吸収を実線で、ＬＰＳ阻害活性を点線で示す０表６は、恣 意的なＬＰＳ中相単位（ＮＵ）で測定した、活性及び蛋白質の回収率並びに比活 性を示している。１中和単位とは、ＬＡＬ試験に於いて０．５Ｅ、Ｕ、ＬＰＳを ５０１だけ阻害するＢＰＩ量である。これらのプールのＣｏｎｍａｓｓｉｅ染色 した５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１１に示す。精製したＢＰＴの微少細孔逆相Ｆ ＩＰＬＣによる分析（図１２）から、積算により総蛋白質量の９７１に相当する 単−主ピークを確認した。 ＢＰＩのトリプシン分解マツピングにより、我々は蛋白質の同定をより確実にす る幾つかの主要なフラグメントを配列決定することができた。　ＢＰＩの全長配 列は、公知である［Ｐ。 ＬＣｒａｙら、（１９８９）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４（１６）　：９５ ０５］。 飢　の　・　ｔ　に　番　るＢＰＩの 材」１１しび」乞ｉ 試ｊ［ ＵＳＰグレード滅菌洗浄水＝＝−Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 　Ｉｎｃ。 、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ　ＴＬ製； Ｐｙｒｏｓａｒｔ　フィルター−５ａｒｔｏｒｉｕｓ　ＧｍｂＨ，Ｗ、Ｇｅｒｍ ａｎｙ製；ＣＭ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦｏ−−−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐ ｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ製：ポリアスパルトアミド弱カチオン交換ＨＰＬＣカラ ム（１００ｘ４．６ｚｚ）・・−Ｎｅｓｔ　Ｇｒｏｕｐ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕ ｇｈ　Ｍ＾製；グリシン及びＢｌｏ−５ｉｌ　に２５０分子ふるいＨＰＬＣカラ ム（６００ｘ７．５ｔｙ戸−Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉ ｃｈｍｏｎｄ　Ｃ＾製；ポリアクリルアミド電気泳動ゲル・・・Ｎｏｖｅｘ、Ｅ ｎｃｉｔａｓ　ＣＡ製配列決定及びアミノ酸分析試薬及び緩衝液・・・・・＾ｐ ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｒｎｃ、、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、Ｃ＾製 ；トリフルオロ酢酸、一定沸騰ＨＣＬ、水解物アミノ！！！２１！準及びＢＣ八 へ白質アッセイ試薬・・−Ｐｅｉｒｃｅ　Ｃｈｅ＋ａｉｅａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃ ｋ−ｆｏｒｄ、ＩＬ製。 カブトガニ変形細胞溶解物分析・・・・・・Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏ　−ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ、、Ｗａｌｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ製；リボ多糖−−− −・−ＲＩＢＩ　ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、、Ｈａｍ ｉｌｔｏｎ。 ＭＴ製； １１ＰＬＣグレードアセトニトリル・・・・・弓、Ｔ、Ｂａｋｅｒ、Ｐｈ１ｌｌ ｉｐｓ　−ｂｕｒｇ、ＮＪ製； 他の緩衝液及び塩は試薬グレードのものを使用した。１８メガオームの純度の水 を、Ｌａｂ　Ｆｉｖｅ超純水システム（Ｔｅｃｈｎｉｃ、５ｅａｔｔｌｅ、−＾ ）で製造した。消毒用の０．５Ｎ　ＮａＯＨは、試薬グレードのＮａＯＨペレッ トとＵＳＰ水から調製した。 ・　）　の　１の アズール好性顆粒のパーコール分離を省略した以外には、文献記載通りに好中球 から顆粒を抽出した（米国特許出願第１９９，２０６号、１９８８年５月２６日 出願）。そのかわり、ポスト核上清を遠心分離（１７，０００ｇ、　２０分間） して全顆粒画分を得た。 次いで顆粒ベレットを、各４Ｘ１０Ｅ８個の細胞が溶解している５０−Ｍグリシ ン（ｐｉｆ２）　１　ｚｌに懸濁させた。再び懸濁させた顆粒をドライアイス／ エタノール上で、５回の凍結／融解サイクルで溶解させ、次いで４℃で１時間激 しく撹拌した。可溶性抽出物を、遠心分離（３０，０００ｇ、　３０分間）して 得た。 カブトガニ　影線　溶解物アッセイ カブトガニ変形細胞溶解物アッセイを、製造業者の指示通り実施した。必要によ り、サンプルのｐＨを発熱物質非含有の０．５Ｍリン酸Ｍ衝液（ｐＨ７，４）を 添加して中性に調整し、塩分をＵＳＰ水で希釈することによって＜１５０ｍＭに 減少させた。 は盈虫１１ニム±コー ＬＰＳ中和アッセイを、前述の通りに実施した［Ｍ、Ｍａｒｒａら（１９９０） Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１４４（２）　：６６２４６６］。 寥ｔ　′　の。　画゛− 抽出した蛋白質２００Ｂを、種々の調製物からプールし、氷上に１いた。滅菌し た５８８ａＣＩ　１容を、抽出物各４容に添加した６得られた沈澱を、４℃で遠 心分離（２０，０００ｇ、２０分間）してペレット化した。この上清をＩＪＳＰ 洗浄水４容で希釈し、次いでｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４の充分量でｐＨをｉ １１整し、ＣＭｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー用に調製して、最終濃度 ５０ｍＭとした。新鮮な滅菌した発熱物質非含有のストンク塩及び緩衝液のみを 使用した。 ＣＭ　５ｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラ入エニーＸＫ−１６カラｌｚ　（Ｐｈａ ｒｍａｃ　ｉａ）に好適な樹脂を装填して、ベッド容積５ｚｌとした。サンプル を仕込むために、Ｐ１ボシブと備えたグラジェントＦＰＬＣにカラムを取り付け た。使用前に移動相と接触している全表面を０．５Ｍ　ＮａＯＨで手広く洗浄Ｌ 　タ、　ｈ　ラムヲ０．５ＨＮａＯＨテ０．２ｔｌ／分で４時間洗浄し、きれい にした。カラムを再び平衡させて、ブランクを実施した。ブランクからと溶離液 がらの両分を発熱性（ｐｙｒｏｇｅｎ　１ｃｉｔｙ）に関してＬＡＬアッセイで 試験した。調製した抽出物を流速４００ｚｌ／時間で仕込んだ、仕込み終えてか ら、カラムを２〜３倍のカラム容積の出発緩衝液で洗浄した。顆粒抽出物は、仕 込みの間、氷上に保持した。カラムを室温で操作した。 ン　ＨＰＬＣ 弱カチオン交換ＨＰＬＣをＰｈｅｏｄｙｎｅインジェクター及びＧ１１ｓｏｎモ デル１１１Ｂυ、■、検出器を備えたＥｌｄｅｘ三元グラジェントポンプを使用 して実施した。湿潤表面を０．５８　Ｎａ０）！で洗浄し、次いで多量のＵＳＰ 水で潔ぎ、カラムに仕込む前に塩基の全痕跡を除去した。ブランク画分及び溶離 液を上記の通り発熱性に関し試験をした。 ゲルパミエーションＨＰ　Ｌ　Ｃ ゲルパミエーションＨＰＬＣを１弱カチオン交換ＨＰＬＣで略述したのと同一の 予備操作及び装置で実施した。 ポリアクリルアミドゲル　゛ ８〜１６％アクリルアミドグラジェントゲル（Ｎｏｖｅｘ）を入手し、業者の使 用嘗に従って実施した。 ゲ ーＶ−／ ｓｙｓｔｅｍｓ　４４７Δパルス液相シー≠嘔ンサーを、自動エドマン分解に使 用した。 蛋白質シーフェンシング用に材料を＾ｑｕａｐｏｒｅブチルカラム（３０ｘ　２ ．１ｚｚ）で脱塩して調製した。勾配液は３０へ一１００ｚＢ（３０分）で流速 ２００ｚＮ／分で使用した。検出器は、フルスケ−ニー辷ノ」した哲− 上記システムでは、ＰＴＣカラム、ｙｌｌ液液び八ＢＩにより提供された分離条 件を用いてアミ２ノ酸分析と実施した。サンプルの加水分解及びＰＴＣ誘導体を 、業者のプロｌ−コルを用いて、Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＰｉｃｏ−Ｔａ８ワークステーシヨンで調製した３ 近迫」した量− 蛋白質濃度を、Ｃ＾方法の使用説明書２３２３０．２３２２５（Ｐｅｉｒｃｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を用いて測定した。緩衝液の妨害を最小とするため に、サンプルを１０倍に希釈し、微量試薬プロトコルを使用した。 債−ｌ アズール好性顆粒から精製しなりＰＩは、ＬＰＳによる好中球活性化を阻害し、 ＬＡＬアッセイで直接ＬＰＳを阻害することを前述に於いて示した。さらにＢＰ Ｔの役割を明確にし、アズール好性顆粒及び特異顆粒の両方に他に同様の分子が 存在するかどうかを調べるために、我々は、酸性ｐＨで抽出した全顆粒からのＬ ＰＳ阻害活性の精製に着手した。予備研究から粗抽出物中にＬＰＳ阻害活性の存 在が証明された。 内毒素中和活性を同定するために、我々は、全顆粒抽出物からそのｆｌＩ製を試 みた。　ＬＰＳ中和活性のＷＩ製は、ＮａＣＩ（１Ｍ）という高濃度のため顆粒 抽出物中に存在する蛋白質の約９０２が可逆的に沈澱したのを観察したことによ り非常に促進された。本質的に、ＬＰＳ阻害活性の総てが可溶性上清中に残存し た。イオン強度３下げるために、可溶性画分を希釈し、さらに精製し、ＣＭ　５ ｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換クロマ１−グラフィ〜で濃縮した。溶離した活性 のブロードなピークをボリアスバルトアミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａ■１ｄｅ ）高速カチオン交換カラムを使用してさらに精製した。活性の幾らか鋭いピーク の部分を回収し、この活性は５ＯＳ−ＰＡＧＥにより約５５．０００の分子量の 主蛋白質と一緒に移動した。このとき、数個のより低い分子量の蛋白質の移動も 伴った。最終精製段階として、ゲルバミエーションＨＰＬＣを使用し、活性のピ ークを同定し、これを溶離すると、蛋白質の単一の鋭いピークとなった。精製し た蛋白質は、５ＯＳ−ＰＡＧＥ上の５５，０００の分子量のところに近接した２ 本のバンドとして移動した。 全内毒素中和活性の２５１を、２５０倍の精製率で回収した。 精製した内毒素中和蛋白質を、逆相ＨＰＬＣにかけ、次いで自動エドマン分解に よりＮ末端配列分析した。図６に示されている配列は、３９残基が完全に相同で あることから細菌性透過性増強蛋白質であると同定した。加えて、精製した分子 のアミノ酸組成はＢＰＩと実質的に同一であった（データは示されていない）。 近接したバンドの両方がＢＰＩであるかどうかを調べるために、我々は精製した 蛋白質を、ＢＰＩのアミノ酸１〜２０からなる合成ペプチドに対するＢＰＩ特異 的ウサギポリクロナール抗血清を用いてウェスタンブロッティング分析にかけた ０両方のバンド共、免疫反応性であった。両者の違いは、グリコジル化に由来す るようである。 、　ＩＮ　ＶＩＴＲＯｔ’ノＢＰＩノＬＰＳ　’■で述べたように、厳密な発熱 物質非含有条件でＢＰＩの精製を実施すると、図１３中の用量応答曲線によって 示されるように、より効果的にＢＰＩを調製できた。 抽出物　１００＄　１００＄　０．１１ＮＵ／μｇ沈澱物　１４１　１７．３＄ 　０．９３ＮＵ／μｇ段階１　３５＄　１．５０　２．５１ＮＵ／μｆ段Ｒ１２ １４＄　０．７５　１．９７ＮＵ／μｇ段階３　１８１　０．１０＄　１８．９ ＮＵ／、ｕ　ｇＬＰＳ媒介ＣＲアップレギュレーションの阻害は、ＢＰＩ　２５ ｎｇ／ｘ１で完全に行われ、セクションＩで使用した材料と比較して活性が４倍 増加したことを示している。モルベースでは、ＢＰＩ調製物は、ＬＰＳをほぼ化 学量論量の割合で阻害し、ポリミキシンＢのモル阻害濃度と等しい。ＤＰＩは、 発熱物質非含有条件で精製後、低濃度でヒト付着性単核細胞によるＬＰＳ媒介Ｔ ＮＦ生成も阻害する（表７及び８）。 ＢＰＩはＬＰＳと結合する（図１４）。これらの実験に於いては、４　ｕ　ｇ　 ＬＰＳ／ウェルを９６穴プラスチツクプレート上に固定し、次いでＤＰＩの濃度 を種々変えてインキュベートし、抗ＢＰＩポリクロナール抗血清と反応させた。 ＬＰＳのＢＰＩの結合は、ポリミキシンＢで阻害され（図１５）、ＢＰＩ結合の 特異性を実証している。血漿の存在下（図１６）及び血清の存在下（図１７）の 両方で、ＢＰＩがＬＰＳと結合し、このことは、ＢＰＩの潜在的なＬ表二 ＤＰＩはヒト単球によるＬＰＳ誘発ＴＮＦ生成を阻害する１声　したＬＰＳに・ 　る　・“に　いて　しｆＴＮＦ　ｘｉ　＊ｏｏｏｏｏｏ　。 ０．１　９８　７９　０　０　０　２６９１　１１５０’１２０７　０　０　０ 　１２９２＊・・・・・・Ｅ、Ｃｏ１１０１１１：Ｂ４をＢＰＩまたはポリミキ シンＢ　（ＰＭＢ）で前培養し、次いで付着性末梢血単核細胞に添加した。 ＴＮＦ生成をＥＬｒＳ＾で分析した。 人足 ヒト単球によるＬＰＳ誘発ＴＮＦ生成の阻害１土立　しｔ−ＬＰＳニル応　に　 イテ　しｆ”ＴＮＦ　ｍｅ　＊］０　３３３±１８　６０１±２５７　２７０± ２３　２７０±６７　４３６±３８　６９７±３７１００　７６９±１０１　１ １４０±７３　８３４±３０　６８６±８４　１００５±５０　８９２±４７１ ０００　８４４±１４４　１０１６±２０　１１３０±１０　７７８±１８９１ ０２５±７１　７２３±８８＊ＢＰｌまたはポリミキシンＢサルフェートを、０ 〜１０ｎｇ／ｘｉＥ、Ｃｏ１１０１１１　：　Ｂ４　ＬＰＳまたはｏ、１ｓｗ／ ｖ＃死滅化Ｓ、ａｕｒｅｕｓで前培養し、次いで付着性末梢血単核細胞を添加し た。 ＴＮＦ生成は、ＥＬＩＳ＾で分析した。 衷ｍと ａ襄１」１ｔ ステージＩＡ・・・・・・グリシン　の　類グリシン緩衝液対照（Ｒｅｄｗｏｏ ｄ　Ｃ１ｔｙ）３０５μｍを、ＰＢＳ（Ｒｅｄ−ｗｏｏｄ　Ｃ１ｔｙ）中で７ｚ １に希釈し、ポリプロピレンチューブ（発熱物質非含有）内で混合した。チュー ブをノートブック＃１９９０でラベルし、３匹のウサギのＵＳＰウサギ発熱物質 アッセイで、用量２１１／ウサギで試験したく正確な注射用量はＺ、１ｘｌ／ウ サギであった）。 生成物は非発熱性であった。これは３匹の総てのウサギで全部で０．４℃温度が 上昇した。 スーージ　Ｂ・・・・・ＢＰＩ２１の　弧ＢＰＩ　（Ｌｏｔ　７８０３８．８／ １９／８９製造）３０４μｍをＰＢＳ　（ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ）で７ｘ１に 希釈し、プロピレンチューブ（発熱物質非含有）内で混合した。チューブをノー トブック＃　２０１７０でラベルし、用量２．Ｏｘ１／ウサギで３匹のウサギの ０８２発熱物質アッセイで試験した。 生成物は、全温度上昇が０．２℃であることから示されるように非発熱性であっ た。 ステージ　・・・・　１、と−　に１坪　したＢＰＩの　気Ｅ、Ｃｏ１１０５５ ．Ｂ５（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）由来の内！素を、ＰＥＩＳ（Ｒｅｄ ｗｏｏｄ　Ｃ１ｔｙ）で４０９６ＥＵ／ｚＮに希釈した。この濃度をＬＡＬアッ セイで確認した。 ＢＰＩ（Ｌｏｔ　７８０３８．８／１９／８９製造）３０４μｌを、ボップロと レンチューブを用いて、上述したＰＢＳで希釈した内毒素（４０９６ＥＵ＃ｉ’ ）で７ｗｌに希釈した６チユーブを、効果的に混合するために、渦巻ｌが生じる ように混合した。ＰＢＳ中のＢＰＩ＋内毒素及び内毒素を、３７℃の水浴で３０ 分間培インキュベートした。３７℃でインキュベーション後、ＢＰＩ＋内毒素は 、内毒素濃度１２２ＥＵ／ｚ１となった。内毒素をＰＢＳで希釈しても、終点の ４０９６ＥＵ／ｚｆに変化は生じなかった。 ＰＢＳ中のＢＰＩ＋内毒素及び内毒素を、３匹のウサギのＵＳＰ発熱発熱物質ア ンセパ験し、各々全部で４．６℃及び７，５°Ｃの温度上昇が知見された。 至ヱニｉ」−」虹１Ｌ以し 内毒素調製の操作と共に結果を改善するために、我々は、Ｅ、Ｃｏ１１０５５： Ｂ５（Ｓｉｇｍａ）から公認ＦＤ＾文献に変えた。 ＥＣ−５のバイアルを、ＰＢＳ（Ｒｅｄｗｏｏｄ　Ｃ１ｔｙ）で２Ｒ１に再び潤 し、濃度５０００ＥＵ／ｚＮとした。我々は、この濃度をＬＡＬアッセイによる １０，０ＯＯＥｔｌ／ｚ！Ｖのラベルクレームによって確認した。 ＢＰＩ＋内毒素サンプルを、ＰＢＳ　７．３ｘｌ＋ＥＣ−５内毒素５０００ＥＵ ／ｘ１３２０μｌにＰＢＩ（Ｌｏｔ　７８０３８）３８μｌを添加して調製した 。 この調製物をポリプロとレンチューブ（発熱物質非含有）中で混合し、よく撹拌 した。ＥＣ−５内毒素８．０ｔ１サンプルを、ＰＢＳ（Ｒｅｃｌｗｏｏｄ　Ｃ１ ｔｙ）中て調製し、ＢＰＩを添加せずに同一濃度にした０両方のサンプルを、水 浴中、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。 ２つのサンプルを、ＬΔＬアッセイを使用して内毒素活性に関して試験をした。 ＢＰＩ＋内毒素は陰性であった。内毒素サンプルは、ターゲット２００ευ１１ Ｎで陽性であった（図１８）。 両方のサンプルを、３匹のウサギの０８２発熱物質アッセイで、用量２．（ｈｉ ！／ウサギで試験した。 ＢＰＴ＋内毒素は、非発熱性であり、全部で１．１°Ｃの温度上昇であった。Ｐ ＢＳ中のＥＣ−５内毒素は発熱性であり、全部で３．９°Ｃの温度上昇であった 。 Ａ、　ＱＪｉ、＊　ＣＲＬ　ノＬＰｒ刺奴ｗ　ＮＣ７Ｍし ２１６５１話 Ｂ、　ＩｆＮス゛−／し乃ヂＬル列Ｚ１中肛ヂυｊコｉ令（ＪＳｅｔ中矛口χ民 了ス−／し？　）　’ｆ’Ｌ　Ｉｎ月乙（由出慴（／ＪＧ／ＭＬ）ＦＸＧＵＲＥ 　ＩＢ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＲＰＬＣ料性ア入°−ル分付独叔刊り広物３．よるＬＰＳＦ’ＪＬ告１　２　３ ４４　５６７　６ｇ １１？、ＰＬｃヒ’−７（＋　／）ＧんＬ）１ＦＩＧＵＲＥ　３Ａ ３×社最ＢＰＩ−ＩＬＰＳ胆誉沼廷 ＦＸＧＵＲＥ　３Ｂ Ａ、Ｂｐｔ　ＶＳ　Ｉ□ＮＧ／ＭＬ　ｏｍ　：　ｅ４ｔｐｓっ＋ｎ＋に苓ｏ　ｔ ｏｏ　２り０　コ００　４０Ｃ Ｐｉ嘆］１龜　ツｘ（’国／姐） Ｌ　１％　：バ午ン／ト：よ！ＬＰＳ　＋木１フ０、ロ　１．ロ　２．Ｏ Ｆｉｇｕｒｍ藺　Ｐ邑Ｓ（■／ｍｌ］ とＲχＦＳ５ 車り損５Ｄｓ綻表６０ＬγっＦ３ＰＬ　、９シ１マＪ鳴り、虻（す長ヤ封（上【 ゛っ　ＣＲ３肩シ現ＯｒＮＬＰ　ＴＮＦ’　ＬＰＳ 刺乏試物ア ？ταｍ６ ＢＰ　Ｉ　Ｉ）−（’　ｒｔ、”）　ＺキＺ／；／Ｂｌ：ＪりＬＰＳ　Ｍ９ｅ＞ ＨヨＦＪｆｆＬ時　トシ「）（）茫） ＦＫ；ＵＲε　７ ０．０．４０５吻 ＦｌαスＥ８ 一一一一一十一 ２ｇｏ　？１１７１１：δ’ｌ７６ＡυＦＳＯ，０，４０５ｎｍ　−−−−−− − 一−−−−−− Ｅ”ＸＧＪＦｔＥ　９ 一一一一→− ２’１ｌｏｎ川Ｅ　６＋７６ハＩＪＦＳ　−０、Ｄ、　４０５　ｎｍ　−−−− −−−嘴を一一一一− ＦＸα爪Ｅ　１０ 一−−−→− ｚｇｏ　ｌ’ｌｒｎ　ＩＪ）−＋グうｐＵＦｓＯ，０，４０５ｎｍ　−−−−− −− 一１−一一一− Ｆ工α爪ε　１１ ＦＩＧｔ爪ε　１２ ＰＩＱｍε　１３ ＩＱ−１／ＪＬｔヒＳ＋：ｉｍＴ７るｙ−＞申ｍ）Ｑ６のＢｐｌ　Ｌｏ−（ｒ： Ａ　８　：Ａ８ Ｆ’工ＧＵＲＥ　１４ １３ＰＬは　７°ラス今）７上１２凹定＝訊Δ−ＬＰＳ　ヒ凡・δ・ヲう０．０ ．４０５　ｙ＊□ ＦＩＧＵＲＥ　１５ Ｆ１定、イｃ　ＬＰＳ　ヒ耽４≦し’Ｔ　ｌｌウ　ＢＰ工＋Ｊ　ＰＭ８’＋：Ｊ 、て千り宅工へろ ０．０．　４０５　ｎｘｎ Ｆ’工ＧＵＲＥ　１６ Ｂｐｌｔａ　＊＊ｔ＞　ｎ（ｚ’ｒ　ｔｌｒｓ　ｔ　狡＃ｑｂＢＰＸ　（−φ吐 ） ＦＸａ五ε　１７ １３ＰＩ＋Ｊ皇す嘴の４仕市てしＰく乙局、イト、ＴもジＸ　ｕｇ／ｍｌ Ｆ’ＩＧＵＲε　１８ 国際調査報告 ””””−’　””酎”　”　ＰＣＴＡＩＳ９０／（Ｘ）８３７

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞のリポ多糖媒介刺激を阻害する方法であって、細胞刺激量のリポ多糖の 存在下で細胞を、細胞刺激を阻害するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパ ク質と接触させることからなる方法。
2. ２．前記細胞が好中球または単球である請求項１に記載の方法。
3. ３．前記細胞刺激を阻害するのに有効な量が、約１００ｎｇ〜約１００ｍｇの量 からなる請求項１に記載の方法。
4. ４．前記細胞刺激を阻害するのに有効な量が、約１０μｇ〜約１０ｍｇの量から なる請求項３に記載の方法。
5. ５．前記殺菌性／透過性増強タンパク質が、精製殺菌性／透過性増強タンパク質 からなる請求項１に記載の方法。
6. ６．前記殺菌性／透過性増強タンパク質が、組換え殺菌性／透過性増強タンパク 質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体からなる請求項１に記載の方 法。
7. ７．前記殺菌性／透過性増強タンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類縁体 が、分子量約２５ｋＤを有し、殺菌性／透過性増強タンパク質のＮ末端アミノ酸 配列に対応するポリペプチドからなる請求項６に記載の方法。
8. ８．グラム陰性細菌感染を治療する方法であって、細菌感染体を、細胞のポリ多 糖媒介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療するのに有効な量の精製殺菌 性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と接 触させることからなる方法。
9. ９．前記細胞が好中球または単球である請求項８に記載の方法。
10. １０．前記グラム陰性細菌感染が内毒素ショックを伴なう請求項８に記載の方法 。
11. １１．前記グラム陰性細菌感染が炎症症状を伴なう請求項８に記載の方法。
12. １２．前記炎症症状が、散在性血管内凝固、成人呼吸窮迫症候群または腎不全を 伴なう請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記グラム陰性細菌感染が被検体内に存在する請求項８に記載の方法。
14. １４．前記被検体がヒトである請求項１３に記載の方法。
15. １５．細胞のリポ多糖媒介刺激を阻害するのに有効な量の精製殺菌性／透過性増 強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを 含有する、グラム陰性細菌感染を治療するための組成物。
16. １６．前記適当な担体が医薬的に許容可能な担体からなる請求項１５に記載の医 薬組成物。
17. １７．グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連ショックを患った被検体を 治療する方法であって、前記被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関 連ショックを緩和するように被検体を治療するのに有効な量の殺菌性／透過性増 強タンパク質を投与することからなる方法。
18. １８．散在性血管内凝固を伴なう疾患を患った被検体を治療する方法であって、 前記被検体に、散在性血管内凝固の症状を緩和し、それによって該被検体を治療 するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法 。
19. １９．グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連貧血を患った被検体を治療 する方法であって、前記被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関連貧 血を緩和するように該被検体を治療するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タン パク質を投与することからなる方法。
20. ２０．グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連白血球減少症を患った被検 体を治療する方法であって、前記被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒 素関連白血球減少症を緩和するように該被検体を治療するのに有効な量の殺菌性 ／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法。
21. ２１．グラム陰性細菌感染によって生じた内毒素関連血小板減少症を患った被検 体を治療する方法であって、前記被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒 素関連血小板減少症を緩和するように該被検体を治療するのに有効な量の殺菌性 ／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法。
22. ２２．発熱物質を阻害する方法であって、発熱物質を阻害するのに有効な量の殺 菌性／透過性増強タンパク質を発熱物質に接触させることからなる方法。
23. ２３．細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害する方法であって、細胞 刺激量のリポ多糖の存在下で前記細胞を、細胞によるりポ多糖媒介腫瘍壊死因子 産生を阻害するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質と接触させること からなる方法。
24. ２４．細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害する方法であって 、グラム陰性細菌を、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害す るのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質と接触させることからなる方法 。
25. ２５．前記殺菌性／透過性増強タンパク質の有効量が、約１００ｎｇ〜約１００ ｍｇの量からなる請求項１７から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ２６．前記殺菌性／透過性増強タンパク質の有効量が、約１０μｇ〜約１０ｍｇ の量からなる請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記殺菌性／透過性増強タンパク質が、天然の殺菌性／透過性増強タンパ ク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体からなる請求項１７から２ ４のいずれか一項に記載の方法。
28. ２８．前記殺菌性／透過性増強タンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類縁 体が、分子量約２５ｋＤを有し、殺菌性／透過性増強タンパク質のＮ末端アミノ 酸配列に対応するポリペプチドからなる請求項２７に記載の方法。
29. ２９．内毒素関連ショックを患った被検体を治療するための組成物であって、内 毒素関連ショックを患った被検体を治療するのに有効な量の精製殺菌性／透過性 増強タンパク質と適当な担体とを含有する組成物。
30. ３０．散在性血管内凝固を伴なう疾患を患った被検体を治療するための組成物で あって、前記被検体を治療するのに有効な量の精製殺菌性／透過性増強タンパク 質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する組 成物。
31. ３１．内毒関連貧血を患った被検体を治療するのに有効な量の精製殺菌性／透過 性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体 とを含有する、内毒素関連貧血の被検体を治療するための組成物。
32. ３２．内毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療するのに有効な量の精製殺 菌性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と 適当な担体とを含有する、内毒素関連白血球減少症の被検体を治療するための組 成物。
33. ３３．内毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療するのに有効な量の精製殺 菌性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と 適当な担体とを含有する、内毒素関連血小板減少症の被検体を治療するための組 成物。
34. ３４．細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するのに有効な量の精製 殺歯性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体 と適当な担体とを含有する、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害す るための組成物。
35. ３５．細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するのに有効な量 の精製殺歯性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性なポリペプチド 類縁体と適当な担体とを含有する、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子 産生を阻害するための組成物。
36. ３６．発熱物質を阻害するのに有効な量の精製殺菌性／透過性増強タンパク質ま たはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、発熱 物質を阻害するための組成物。
37. ３７．被検体におけるグラム陰性細菌感染に伴なう症状を予防する方法であって 、前記被検体に、グラム陰性細菌感染を予防し、それによって前記症状を予防す るのに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することからなる方法。
38. ３８．前記症状が、内毒素関連ショック、内毒素血症、内毒素関連貧血、内毒素 関連白血球減少症または内毒素関連血小板減少症からなる群から選択されるいず れかの症状である請求項３７に記載の方法。
39. ３９．被検体における散在性血管内凝固を伴なう疾患を予防する方法であって、 前記被検体に、散在性血管内凝固の症状を予防するのに有効な量の殺菌性／透過 性増強タンパク質を投与し、それによって疾患を予防することからなる方法。
40. ４０．精製殺菌性／透過性増強タンパク質を単離及び回収する方法であって、 （ａ）殺菌性／透過性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）前記粗試料を、 脱発熱物質溶液を使用するカラムクロマトグラフィーによって分離し、精製殺菌 性／透過性増強タンパク質を単離及び回収する ことからなる方法。
41. ４１．前記殺菌性／透過性増強タンパク質が、天然の殺菌性／透過性増強タンパ ク質からなる請求項４０に記載の方法。
42. ４２．前記殺菌性／透過性増強タンパク質が、その生物学的に活性なポリペプチ ド類縁体からなる請求項４０に記載の方法。
43. ４３．前記殺菌性／透過性増強タンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類縁 体が、分子量約２５ｋＤを有し、殺菌性／透過性増強タンパク質のＮ末端アミノ 酸配列に対応するポリペプチドからなる請求項４１に記載の方法。