JPH04503607A - 固定化サイトカイン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固　定　化　サ　イ　ト　カ　イ　ン　類技術分野 本発明は、固体支持体に固定化されたサイトカイン類に関するものである。

発明の背景 総括的にサイトカインと呼ばれる若干の生物活性伝達物質は、様々な細胞により 産生される。サイトカイン類は、正常なホメオスタンスを維持するため、並びに 病的刺激、例えば免疫学的、感染および炎症プロセスに応じて偏性的に産生され る。リンパ球の産物として最初に報告されたサイトカインは、「リンホカイン」 と称されることが多く、単核白血球の産物として最初に報告されたサイトカイン は、「モノカイン」と呼ばれている。また、ある種のサイトカイン類は、細胞生 長に対するそれらの作用に基づき、成長因子またはコロニー刺激因子と称される 。

サイトカイン類の例としては、リンホカイン類インターロイキン−１（ＩＬ−１ ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン（ＩＬ−３）、 モノカイン・ガンマ・インターフェロン並ヒに成長因子か数球−マクロファージ ・コロニー刺激因子（ＧＭＣ５Ｆ）およびエリトロポエチン（ＥＰＯ）がある。

様々なサイトカインは、内在性調節物質（オートタリン）および／または細胞間 シグナルとして機能する。単一生物活性によって最初に認識されｔ；これらのサ イトカイン類の多くは、相互依存的に作用して生物学的応答を増幅させることが 多い、多数の部分的に重複する生物活性を有することが示された。標的細胞に対 する最終的な作用には、成長、移動性、分化および／または蛋白質合成の調節が ある。

リンパ球活性化因子としても知られているインターロイキン−１（ＩＬ−１）は 、ヒト単核白血球、リンパ球、内皮細胞および線維芽細胞により産生される。Ｉ Ｌ−１は、表現型細胞表面マーカーにおける変化が示す通り、リンパ球の分化を 促す。さらに、ＩＬ−１は、Ｔ−リンパ球機能を刺激し、リンホカイン類、例え ばＩ　Ｌ−２、コロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ）、Ｂ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）、ガ ンマ・インターフェロン（γ−ＩＦＮ）８よびりンパ球誘導走化性因子（ＬＤＣ ＦＸ各々それら自体の生物学的作用を有する）の産生を増加させる。またＩＬ− １は、８９７３球のインビトロ増殖、分化および抗体産生機能を増大させる。こ れらおよび他の生物学的活性を有することから、ＩＬ−１は、多様なインビボお よびインビトロ用途における貴重なリンホカインである。

インターロイキン−２ＣＩＬ−２）は、最初、１９２３球の増殖を誘導し得、正 常な１９２３球を培養中で連続的に維持し得ることからＴ細胞成長因子（ＴＣＧ Ｆ）と呼ばれた。ＩＬ−１と同様、ＩＬ−２は、多様なインビボおよびインビト ロ適用において有用であることが見出されｔ；。Ｉ　Ｌ−２は、ワクチンのアジ ュバントとして使用されｔ；場合、マラリア種虫ペプチドに対する遺伝学的非反 応性を克服し、単純性はう疹および狂犬病ウィルスに対する防御力を向上させる 。Ｍ、Ｆ　、グツド等、「ジャーナル・オブ・イムノロジーＪ、１４】、９７２ （１９８８）およびＡ、バインバーブ等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」 、１４０．２９４（１９８８）参照。

インビトロＩＬ−２は、その生物学的活性の中で、薬剤として使用された場合、 リンホカイン活性化キラー細胞、腫よう浸潤性リンパ球および細胞毒性Ｔ細胞と して知られている一群のさらに選択性の高いＴ細胞集団の増殖および分化を誘発 する。それらの細胞は、異聾的正常標的細胞並びに免疫原性および非免疫原性の ？ｌｌ１ｌｌよう細胞に対して細胞毒性を示すことがインビトロで立証された。

Ｓ、Ａ。

ローゼンバーグ、「ジャーナル・オブ・ナシ璽ナル・キャンサー・インスティテ ユート」、７５．５９５（１９８５）、Ｓ、Ａ、ローゼンバーグ、「ジャーナル ・オブ・イムノロジー」、１２１％　１９５１（１９７８）およびＳ、Ａ、ロー ゼンバーグ等、「サイエンス」、２３３．１３１８（１９８６）参照。

インビトロ・リンホカイン活性化キラー細胞をインターロイキン−２のインビボ 投与と組み合わせて使用することにより、抗腫よう作用の改良が達成された。イ ンビトロＩ　Ｌ−２活性化キラー細胞の注入およびＩ　Ｌ−２の同時投与は、動 物およびヒ□トの両方で抗腫よう活性を立証した。上記活性は、一般にＩ　Ｌ− ２またはりンホカイン活性化キラー細胞を個々に使用した場合に観察される活性 を凌ぐ。

Ｊ、Ｊ、ムール等、「サイエンス」、２２５．１４８７（１９８４）、Ｒ，ラフ レニアおよびＳ、Ａ、ローゼンバーグ、「キャンサー・リサーチ」、４５．３７ ３５（１９８５）、Ｓ、Ａ、ローゼンバーグ等、「ニューイングランド・ジャー ナル・オブ・メディシン」、３１６．８８９（１９８７）、Ｊ、Ｊ、ムール等、 「ジャーナル・オプ・イムノロジー」、１３６．３８９９（１９８６）、Ｈ，Ｗ 、ウェスト等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メデイシン」、３１ ６．８９８（１９８７）、Ｓ、Ａ、ローゼンバーグ等、「ニューイングランド・ −ジャーナル・オブ・メデイシン」、３１３．１４８５（１９８５）参照。

ヒト悪性腫ようから得られた腫よう浸潤性リンパ球の生長は、インビトロで６０ 日以下の期間インターロイキン−２により誘導されｔ；。これらのリンパ球は、 肺癌患者においてインターロイキン−２の同時静脈内投与を伴わずに投与した場 合にヒト抗腫よう活性を示した。Ｒ，Ｌ、クラディン等、Ｃａｎ、’１ｍｍｕｎ ｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、、２４．７６（１９８７）参照。

Ｔｍ胞ｌこより合成される追加的サイトカインｌＩ４二は、遊走阻止因子（マク ロファージのランダムな移動を阻止する）、白血球阻止因子（好中球のランダム な移動を阻止する）、マクロファージ活性化因子（マクロファージの細胞溶解活 性を増強する）、繊維芽細胞活性化因子（繊維芽細胞の増殖を刺激する）および インターロイキン−３（ＩＬ−３Ｘコロニー刺激因子と似た活性）がある。

サイトカイン活性に関する機構的詳細は確実には知られていないが、活性の全般 的機構は、１）特異的細胞表面レセプターへのサイトカインの結合、２）ある種 の「細胞表面活性化」事象の開始、および３）内部相互作用の結果、増殖、生長 、分化および／または特殊細胞機能の発現が行なわれるサイトカインーレセプタ ー複合体の内面化という段階を含むものと考えられている。

＾体的には、ＩＬ−２の場合、Ｉ　Ｌ−２とＴ細胞の相互作用では、低親和力レ セプター、ＩＬ２Ｒｂとの最初の相互作用の結果、ＩＬ−２との高親和力複合体 を形成する第２レセプター分子、ＩＬ２Ｒａが誘導されるものと考えられている 。高親和力複合体と！Ｌ−２の会合の結果、増殖が行なわれる。活性化および増 殖のこのプロセスでは、ＩＬ−２レセプター複合体の内面化および後続の表面Ｉ Ｌ−２レセプターの数の減少が存在する。Ｋ、Ａ、スミス、「サイエンス」、２ ４０、ｌ　１６９（１９８８）参照。

細胞表面会合事象は活性に充分なものであり、レセプター−リガンド複合体の内 面化は少なくともある種の場合には要求されないことが示唆されている。臭化シ アン活性化によりセファロースに結合させたブタインシュリンおよびネズミ・ア ルファ／ベータ・インターフェロンは、細胞表面会合事象を通して生物学的活性 を有することが報告されている。Ｐ、クアトレカセス、「プロシーディンゲス・ オブ・ザ・ナシ」ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ユナイ テッド・ファージ・オブ・アメリカＪ、６３．４５０（１９６９）、）ｆ、アン ケル等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ画ナル・アカデミ−・オプ・サ イエンシーズ・オプ・ザ・ユナイテツド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７０， ２３６０（１９７３）およびＣ，チャニー等、「プロシーデインダス・オブ・ザ ・ソサエティー・７オー・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディ シン」、１４７．２９３（１９７４）。

特に形成された特定共有結合の不安定さが知られていることから、これらの報告 の正確さは当業界では疑われている。Ｗ、Ｈ，スコウテン、「メソッズ・イン・ エンザイモロジー」、クラウス・モスバッハ編、アカデミツク・プレス・バプリ ッシャー、１３５．３１（１９８７）参照。内面化の必要性の問題は、依然とし て論争点のままである。Ｅ、トメイヤーおよびＪ、ドメイヤー−ギブナンド、「 インターフェロン・アンド・アザ−・レギュレイトリー・サイトカインズ」、ジ ョン・ウィリー・アンド・サンズ・パブリッシャー、６７６７−９０（１９８参 照。

サイトカイン類、例えばＩＬ−２のコスト、利用能および毒性は、生物活性剤と してのサイトカインの有用性における制限因子であり得る。従って、可能な限り 毒性の低いサイトカインを再使用および／まｔ；はより少ない量を使用し、かつ それらの生物学的活性のかなりの量を保持できることが望ましい。

従って、対応する可溶性または遊離サイトカイン類と比べて同等または場合によ っては改曹されｔ；生物学的活性を保持している修飾サイトカイン、すなわち再 使用されても生物活性を刺激し得る、および／または著しく少量で使用され得る 生物活性サイトカインの提供が永続的に要望されている。

発明の簡単な記載 本発明は、固体、好ましくは生物学的融和性で不溶性の固定化支持体に堅固に結 合させたサイトカインを含む固定化サイトカインを提供する。結合サイトカイン は、支持体に結合されたとき遊離サイトカインの活性を実質的に保持している。

従って、結合したサイトカインは、生物活性の刺激に対して反復的に利用（再使 用）および／または対応する可溶性または遊離サイトカインよりも著しく少ない 総量で使用され得る。

本発明で有用なサイトカイン類には、ＩＬ−１％　ＩＬ−２、ＩＬ＝３、Ｉ　Ｌ −４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、腫よつ壊死因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ 　）、ガンマ−インターフェロン、アルファーインターフェロン、ベーターイン ターフェロン、ユリトロボエチン（ＥＰＯ）、か数球コロニー刺激因子（ＧＣＳ Ｆ）、ネズミか数球コロニー刺激因子（ＭｕＧ　ＣＳ　Ｆ　）、か数球−マクロ ファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳ　Ｆ）、ネズミか数球−マクロファージ ・コロニー刺激因子（ＭｕＧＭＣ３Ｆ）、インシュリン様成長因子Ｉ（Ｉ　ＬＧ Ｆ−１）、インシュリン様成長因子１１（ＩＬＧＦ−１１）、腫よう増殖因子ベ ータ（ＴＧＦ−β）、類表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板誘導成長因子（Ｐ ＤＧＦ）および線維芽細胞成長因子−ベーシック（ＦＧＦｂ）があるが、これら に限定されるわけではない。好ましいサイトカイン類には、実施例記載のもの、 およびさらに好ましくはＩＬ−２、ＧＭＣ５Ｆ。

ＧＣＳＦ、ＥＰＯ％ＴＮＦ、ＦＧＦｂ、ＴＧＦｂ、ＥＧＦおよびＰＤＧＦがある 。

サイトカインは、好ましくは共有結合、好ましくは結合アームにより生物学的融 和性の粒子支持体に結合している。サイトカインは、好ましくは固定化によりサ イトカインの活性を安定させ得る形で支持体へ堅固に結合している。すなわち、 活性は耐久性があり再使用可能である。

この明細書で使用されている「実質的遊離サイトカインの活性」は、サイトカイ ンの１つまたはそれ以上の活性部位の少なくとも１つが活性を保持しＩ；状態で あり、結合サイトカインとして顕著な生物活性を生じることを意味する。言い替 えれば、サイトカインは多数の部分的に重複することが多い生物学的または調節 作用を有するため、本発明の結合サイトカインは、遊離サイトカインの活性と同 一まｔ；は類似した１つまたはそれ以上の活性を示し得る。すなわち、本発明の 固定化サイトカインの有効性を立証する場合、１つまたはそれ以上の生物活性は 固定化により安定化され得る。すなわち、少なくとも１つの活性は結合状態で保 存されており、場合によっては支持体へのサイトカインの結合により高められ得 る。

結合アームの構造まｔ；は長さは、結合サイトカインの生物活性を最適化すべく 変化し得る。好ましい結合アームは、（ａ）一般式ＮＨＩ−Ｒ’−ＮＨ，（式中 、Ｒ１はｃ、−ｃ、。アルキル基である）を有するジアミン類、（ｂ）一般式Ｎ 　Ｈ！　−Ｒ”　ＣＯ＊　Ｈ（式中、Ｒ１はＣｒ−Ｃｘ。

アルキル基である）を有するアミノ酸および（Ｃ）一般式０ＨＣ−Ｒ”−ＣＨｏ （式中　Ｒ１はＣｒ　−Ｃｔ。アルキル基である）を有するジアルデヒド類から 成る群から選ばれた１つまｔ；はそれ以上の結合基を含む。

有用な支持体には、繊維、ミクロスフイア、ビーズ、粒子、膜、シートなどがあ るが、これらに限定されるわけではない。

この明細書で使用されている「サイトカイン」は、サイトカインの天然または組 換え形態、並びにサイトカインの修飾配列、生物活性７ラグメントまたは部分、 サイトカインの遺伝学的または化学的修飾形態、生物学的に均等な合成リガンド またはそれらの混合物（これらは、対生物活性の実質的に均等なプロフィールま たは対生物活性の原プロフィールの一部分を呈する）を包含する。

また、本発明は、サイトカイン依存セルライン、例えばＩＬ−２依存セルライン を本発明の固定化サイトカインの有効量と接触させることによりその成長を誘導 することを含む、増殖、生長、分化および／または特殊細胞機能の発現を目的と するインビトロおよびインビボの両方での固定化サイトカイン類の使用方法を提 供する。

図面の要約 図１は、ＩＬ−２のアミノ基により固定化したｒＬ−２の場合と比べた。ＩＬ− ２のカルボキシル基により固定化したＩＬ−２を用いた場合のＣＴＬＬ−２細胞 （ＤＰＭＸＩＯ一つの生長をグラフで示しｔ二図である。

図２は、［”Ｈ］チミジン取り込みにより測定された（ＤＰＭＸＩＯ一つ、ＣＴ ＬＬ−２細胞、細胞毒性１９７３球セルラインの成長に、対する固定化ＩＬ−２ の濃度依存性（初期カップリング反応におけるＩＬ−２のμｇ）をグラフで示し た図である。

図３は、可溶性ＩＬ−２を用いた場合のＣＴＬＬ−２細胞の成長」；対する時間 （時）の関数として、固定化ＩＬ−２を用いた場合のＣＴＬＬ−２細胞（ＤＭＰ ｘｌＯ−”）の生長をグラフで示した図である。

図４は、可溶性ＩＬ−２を用いた場合のＰＢＬの成長に対する時間（時）の関数 として、固定化！Ｌ−２を用いた場合のヒト末梢血リンパ球ＣＤＰＭ中ＰＢＬＸ ＩＯ−”）の成長をグラフで示した図である。

図５Ａ８よび５Ｂは、可溶性（５Ａ）または固定化（５Ｂ）ＭｕＧＭＣ５Ｆを与 えたマウスの白血球数の増加により測定された、か数球生成の刺激をグラフで示 した図である。

図６は、可溶性または固定化組換えネズミＧ　Ｍ　ＣＳ　Ｆ　（ｒＭｕＧ　ＭＣ ５Ｆ）を与えたシクロホスファミド装置マウスの白血球数の増加により測定され た、か数球生成の刺激をグラフで示した図である。

図７は、ＳＤＳ洗浄後の吸着ｒＭｕＧＭＣＳＦと対比させｔ；その保持状態によ り測定された、共有結合ｒＭｕＧＭＣ５Ｆの安定性をグラフで示した図である。

発明の詳細な記載 サイトカイン類 インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ミズーリ、セントルイスのシグマ・ケミ カル・カンパニーにより培養ラットひ臓細胞（ＴＤ８９２）から誘導され、Ｔ細 胞成長因子（ヒト・インターロイキン−２組換え体、Ｔ３２６７）として市販さ れている。また、組換えＩＬ−２（、ａｌａ　−１２５類縁体および天然配列） は、カリフォルニア、サウザンド・オークスのアムゲンにより市販されている。

天然配列組換えインターロイキン−３（ＩＬ−３）、天然配列組換えインターロ イキン−４（ＩＬ−４）および天然配列組換えインターロイキン−６（Ｉ　Ｌ− ６）は、カリフォルニア、サウザンド・オークスのアムゲンにより市販されてい る。

組換えヒトか数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ｒＨｕＧＭＣ３Ｆ）、 組換えヒトか数球コロニー刺激因子（ｒＨｕＧ　ＣＳ　Ｆ　）、組換えヒト・ユ リトロボエチン（ｒＨｕＥＰＯ）、組換えネズミか数球−マクロファージ・コロ ニー刺激因子（ｒＭｕＧ　Ｍ　ＣＳ　Ｆ　）、組換えヒト・ガンマ・インターフ ェロン（ｒＨｕｌＦＮ−ガンマ）および組換えヒト類表皮成長因子（ｒＨｕＥ　 Ｇ　Ｆ　）および繊維芽細胞成長因子−べ−シック（ＦＧＦｂ）は全て、カリフ ォルニア、サウザンド・オークスのアムゲンから入手され得る。組換えヒト血小 板誘導成長因子（ｒＨｕＰＤＧＦ）、組換えヒトインシュリン様成長因子１（ｒ ＨｕｌＬＧＦ−１）、組換えヒトインシュリン様成長因子ＩＩ（ｒＨｕ　Ｉ　Ｌ 　Ｇ　Ｆ　−ＩＩ）および腫よう増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）は、カ リフォルニア、トランスのベイケムにより市販されている。ブタ腫よう増殖因子 ベータ（ｐＴ　Ｇ　Ｆ−ベータ）は、ミネソタ、ミネアポリスのアール・アンド ・ディー・システムにより市販されている。また、腫よう増殖因子ベータは、マ サチューセッツ、ベッド７オードのコラポラティブ・リサーチにより市販されて いる。組換えインターフェロン・アルファは、ロンユ・ラボラトリーズから口７ エロン（商標）として市販されている。

また、ある種のサイトカインの生物活性部分も単離された。本発明はま！；、適 当な支持体へのサイトカインの生物活性部分の結合を含む。

ＩＬ−１は、多くのＴ細胞クローンに関するオートタリン成長因子としてのその 機能を含め、リンパ球集団に対する多数の作用を有−１゜また１Ｌ−１は、胸腺 細胞増殖、およびミトゲン、名目抗厚十抗厚１ａｖｃ厚またはアロ抗原刺激ヘル パーＴ細胞の強力な刺激物質である。ＩＬ−１は、インターロイキン−２レセプ ター発現および抗原−レセプター複合体に対するモノクローナル抗体の存在下に おけるヒト末梢子細胞の！Ｌ−２分泌を高める。さらに、ＩＬ−１は、休止Ｔ細 胞のＣｏｎＡ活性化に関するコファクターとして作用し、ＩＬ−１に対する高親 和カレセプターを発現するリンパ球の増殖に必要とされる。ＩＬ−１は、炎症浸 潤物の発生において機能すると考えられているヒト肺内皮により産生される。

゛まだ、ＩＬ−１は造血活性の調節物質である。ＩＬ−１は、内皮細胞によるか 粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣ５Ｆ）およびか数球コロニー 刺激因子（ＧＣ３Ｆ）の放出を誘導し、すなわちＩＬ−１が炎症中にか数球生産 および機能を変調する機構を提供する。ＩＬ−１はまた、単核白血球からＧＭＣ ５Ｆを放出させ、ヒト造血前駆体の成長因子依存性増殖を促進する。

ＩＬ−１は、その抗腫よう活性により、進行中のＴ細胞応答を増すことによる比 較的大きな免疫原性ネズミ肉腫の完全な退行を誘発することを示した。ＩＬ−１ は、ヒトＡ３７５メラノーマ細胞に対するインビトロ直接細胞毒性作用を有する 。ＩＬ−１はまた、リンホカイン活性化キラー細胞の生産においてインターロイ キン−２（ＩＬ−２）との相乗作用を示した。

リンパ球機能、造血の調節物質としてのＩＬ−１のこの広い範囲の活性およびリ ンパ球抗腫よう活性故に、ＩＬ−１は、多様なインビボおよびインビトロ用途に おける貴重なサイトカインである。例えば、Ｔ、ホアング等、「ジャーナル・オ ブ・エクスベリメンタル・メディシン」、１６８．４’６３（１９８８）、Ｒ， Ｊ、　ノース等、「ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メデイシンＪ、１ ６８．２０３１（１９８８）、Ｂ、タルタコフスキー等、「ジャーナル・才ブ・ イムノロジー」、１４１，３８６３（１９８８）、Ａ、Ｈ，リヒトマン等、［プ ロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．９６９９（１ ９８８）、Ｂ、Ｓ、ポホナー等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１３９ ．２２９７（１９８７）およびＶ、Ｃ，プラウディ等、「ジャーナル・オブ・イ ムノロジー」、１３９．４６４（１９８７）参照。

マルチコロニー幹細胞活性化因子またはマルチコロニー刺激因子としても知られ ているインターロイキン−３（ＩＬ−３）は、糖蛋白造血成長因子である。ＩＬ −３は、多くのを髄細胞系統に共通した初期幹細胞および始動細胞の両方を刺激 し得るため、広い範囲の活性を有する。ＩＬ−３は、１４０キロダルトンの細胞 表面燐蛋白質に結合する。霊長類では、ＩＬ−３の連続注入の結果、白血球数の 遅延した適度な増加が生じる。しかしながら、ＩＬ−３は、低用量のか粗球−マ クロファージ・コロニー刺激因子による後続の処置に対する応答に対して著しい 相乗作用を有し、これは、ＩＬ−３が、完全な発生に対して後続第２因子を必要 とする初期系統細胞に対して作用することを示唆している。この仮定は、Ｉ　Ｌ −３が芽細胞によるコロニー形成の促進においてより有効であることを示す組織 培養試験と矛盾しない。さらに、ＩＬ−３自体は、インビトロ・コロニー形成を 助けないが、後期作用因子、例えば６ＭＣ５Ｆを必要とする。ｒＬ−３は、ＩＬ −６と相乗作用して初期弁ｍ胞コａニー形成を助け、か数球コロニー刺激因子（ ｃｃｓＦ）と相乗作用して好中球形成を促進し、６ＭＣ５Ｆと相乗作用してか粗 球およびマクロファージ・コロニー形成を促進する。造血性サイトカインとして のこの広い範囲の活性故に、ＩＬ−３は造血性サイトカイン療法にとって貴重な アジュバントとなっている。

他のサイトカイン類と同様、ＩＬ−３はまた、リンホカイン活性化キラー細胞の 阻止により立証されている通り、員の調節作用を有する。現在まで、ＩＬ−３は 、ＢＪａ胞前駆体の特徴を示すネズミ胎児肝臓または成熟骨髄由来のＩＬ−３依 存性クローンにより立証されている通り、初期Ｂ細胞発生の調節に関与する唯一 のサイトカインであった。例えば、Ｒ，Ｅ、ドナヒユー等、「サイエンス」、２ ４１％　ｌ　８２０（１９８Ｂ）、Ｒ，Ｊ　、イスフォート等、「プロシーディ ンゲス・オブ・ザ・ナシ１ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オブ・ザ ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．７９８２（１９８８）、 Ｄ、レニツク等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４２．１８１（２９ ８９）およびＧ、ギヤラファー等、「クリニカル・アンド・エクスペリメンタル ・イムノロジー」、７４．１６６（１９８８）参照。

インターロイキン−４（Ｉ　Ｌ−４）は、Ｂ細胞刺激因子−１（Ｂ　５Ｆ−１） 、Ｂ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）およびＢ細胞成長因子１（ＢＣＧＦ−１）として も知られている。ネズミ系では、ＩＬ−４は、リポ多糖類活性化細胞において免 疫グロブリンＩｇＧ１およびＩｇＥ生産を促進し、Ｂ細胞における組織適合性抗 原の発現を増加させ、抗’　ＩｇＭ活性活性化脳細胞殖に必要とされる。

ヒトに関する試験では、リンパ球機能に対してネズミ系で観察された作用と似た 作用が報告されている。高親和カレセプターは、１Ｌ−４に関してヒト造血性お よび非造血性細胞の両方に存在する。

Ｉ　Ｌ−４は、非刺激胸腺細胞における増殖を誘導し得、応答はミトゲンにより 強力に高められる。また、ｆＬ−４は、ＩＬ−２生産を阻止するデクサメタゾン の存在下でヒト末梢子細胞のミトゲン誘発刺激を増加させる。またＩＬ−４は、 Ｉ　Ｌ−２誘発ヒトＢ細胞増殖をダウン変調し、ＩＬ−２１１ＪｉＮＫＪＩｍ！ 活性化および増殖を阻止する。しかしながら、ＩＬ−４はζ　Ｉ　Ｌ−２と共に 、オートロガス・ヒト悪性メラノーマに対して腫よう浸潤性リンパ球の成長を増 加させる。リンパ様細胞に対するその作用に加えて、ＩＬ−４は、６ＭＣ５Ｆお よびＥＰＯと相互作用することにより、か数球−マクロ７アージおよび赤血球形 成単位を増加させる。例えば、Ｈ，スピッツ等、「ジャーナル・オブ・イムノロ ジー」、１３９．１１４２（１９８７）、Ｙ、カワカミ等、「ジャーナル・オブ ・エクスペリメンタル・メデイシン」、１６８．２１８３（１９８８）、Ａ、ナ グラー等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４１，２３４９（１９８８ ）、Ａ、バスケス等、「ジャーナル・オプ・イムノロジーＪ、１４４２，９４（ １９８９）、Ｔ、ドフランス等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ ディシン」、１６８．１３２１（１９８８）並びにＢ、ブルツクスおよびＲ，Ｃ ，リーズ、「クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー」、７４ ．１６２（１９８８）参照。

インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞刺激因子−２、インターフェロン ・ベーター２およびハイプリドーマ−プラズマサイトーマ成長因子としても知ら れている。ＩＬ−６は、最初抗ウィルス活性を有するＴ細胞リンホカインとして 報告された多機能サイトカインである。ＩＬ−６は、単核白血球、繊維芽細胞、 肝細胞、心臓粘液腫、脳こう細胞および血管内皮を含む様々な細胞により産生さ れることが立証された。ＩＬ−８活性は、繊維芽細胞活性の調節、肝細胞による 急性相蛋白質生成、ミトゲンの存在下におけるヒト胸腺細胞およびＴりンバ球の 刺激、ネズミＴリンパ球の増殖および細胞毒性細胞への分化、骨髄腫誘導セルラ インの維持、ヒト多発骨髄瞳に関するオートロガス・シグナル発生、並びに癌腫 および白血病／リンパ腫セルラインの成長の阻止を含むものと考えられている。

例えば、Ｐ、Ｂ、セーガル等、「サイエンス」、２３５．７３１（１９８７）、 Ｓ、シミズ等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」、１６ ９．３３９（１９８９）、Ｊ、Ｌ、チュツベンス勢、「ジャーナル・オブ・イム ノロジー」、１４１．３８６８（１９８ｇ）、Ｇ、）サトおよびＳ、Ｅ、バイツ 、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４１．１５５６（１９８８）、Ｍ、 ロツツ等、「ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシンＪ、１６７． １２５３（１９８８）、およびり、チェン等、「プロシーデインダス・オブ・ザ ・ナシ２ナル・、アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド ・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．８０３７（１９８８）参照。

か数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣ５Ｆ）、か数球コロニー刺 ｆｆｉ因子（Ｇ　ＣＳ　Ｆ　）、マクロファージ・コロニー刺激因子（ＭＣ３Ｆ ）およびマルチコロニー刺激因子（ＩＬ−３）は、インビボおよびインビトロの 両方での造血細胞の増殖および分化プロセスの刺激および調節能力により認識さ れた一群の糖蛋白質を構成する。

これらの個々のサイトカインは、細胞供給源として１９２３球、単核白血球、繊 維芽細胞、上皮細胞まｔ；は内皮細胞の１つまたはそれ以上により産生される。

さらに、ヘモポエチン−１としても知られているＩＬ−１は、ＩＬ−３、ＭＣ３ Ｆ、ＧＣ５ＦおよびＧＭＣＳＦの作用を高めることによりこの調節網に関与する 。

動物試験は、ＧＭＣ５Ｆ、ＧＣ３ＦおよびＩ　Ｌ−３が機能的白血球の数を増加 させること、およびこの作用はＩＬ−１により促進されることを示した。ＩＬ− ３およびＧＭＣ５Ｆを連続投与すると、同じく血小板の数も増加する。ヒト以外 の霊長類においてサイトカインのこの群の構成員を使用すると、ウィルス誘発再 生不良性貧血、化学療法および放射線療法誘発骨髄抑制、全身照射または高用量 細胞毒性化学療法後の白血球減少およびオートロガス骨髄移植において有益であ ることが示された。

一ヒトにおいて、ＧＣ３Ｆおよび０ＭＣ３Ｆの両方を投与すると、好中球および 好中球−好酸球が各々顕著に増加し、かつ骨髄細胞質が増加し、未成熟細胞が血 液中に現れる。ヒトにおけるＧＭＣＳ　Ｆ使用後の臨床副作用には、発熱、発疹 、筋肉痛、疲労感、胃腸痛、血栓静脈炎、骨癌、胸膜炎、胸膜しん出、心膜炎お よび肺塞栓が挙げられる。ＧＣ３Ｆについて注目される唯一の副作用は骨癌であ つヒトにおいて立証されたＧＣ５Ｆおよび０ＭＣ３Ｆの利点には、骨髄抑制的細 胞毒性化学療法後の造血の回復、オートロガス骨髄移植患者におけるか粗球の回 復の加速および感染症の発生減少、並びに骨髄形成異常症候群および再生不良性 貧血患者において循環している白血球、ヘモグロビンおよび血小板数の改善があ る。エイズ関連白血球減少症患者にＧＭＣ５Ｆを投与すると、ウィルス生産の増 加を伴わずにか粗球および単核白血球が顕著に増加した。

上記造血作用に加えて、ＧＭＣ５Ｆは、インビボで単核白血球を膜種よう状態に 活性化することが立証されており、これはこのサイトカインについて別の潜在的 臨床適用性を示唆している。ＧＭＣ５Ｆはまた、骨肉腫セルライン、胸部癌セル ライン、さるウィルス５Ｖ−４０形質転換骨髄ストロマ・セルラインおよび正常 骨髄繊維芽細胞前駆体のインビトロ増殖を刺激することが立証された。例えば、 Ｓ、バドハンーラード等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシ ン」、３１９．１６２８（１９８８）、Ｊ、Ｅ、グループマン等、「ニューイン グランド・ジャーナル・オブ・メディシン」、３１７．５９３（１９８７）、Ｋ 、Ｈ，グラブスタイン等、「サイエンス」、２３２．５０６（１９８６）、Ｓ、 デドハー等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８ ５．９２５３（１９８８）、およびＡ、Ａ、ヤクボフスキー等、「ニューイング ランド・ジャーナル・オブ・メディシンＪ、３２０．３８（１９８９）参照。

エリトロポエチン（ＥＰＯ）は、成熟赤血球を生産する造血細胞の連続分化に必 要とされる単一サイトカインである。インビトロ試験において、Ｉ　Ｌ−３、Ｇ ＭＣ５ＦまたはＧＣ５ＦとＥＰＯの組み合わせは、赤血球生産に必要とされてお り、これらのサイトカインが赤血球前駆体の維持に関与し、ＥＰＯが末端分化お よび成熟に必要とされることを示唆している１例えば、Ｊ、スープ等、「ブラッ ド」、６７．１００２（１９８６）参照。

単核白血球−マクロ７アージにより生産される多機能サイトカインとしても知ら れている腫よう壊死因子（ＴＮＦ）は、炎症応答の特に重要な伝達物質である。

２形態、ＴＮＦ−アルファ（カケクチン）およびＴＮＦ−ベータが存在する。そ の作用の中でも、ＴＮＦは、グラム陰性エンドトキシン・シ厘ツクにおける主要 因子であり、癌および慢性疾患患者において根深い衰弱（悪液質）症候群を誘発 する。

活性範囲には、繊維芽細胞成長の刺激、遺骨細胞活性および骨再吸収の刺激、血 管形成の促進、滑液細胞におけるコラゲナーゼおよびグロスタグランジンＥ、の 刺激並びに内皮組織における凝血原および血小板活性化因子の刺激がある。

ＴＮＦは、マクロファージにより生産されるオートクリンである。

それは、マクロファージを活性化し、悪性細胞を特異的に認識し、殺す能力を高 める免疫変調物質として機能する。ＴＮＦはマクロファージに対して走化的であ り、炎症部位でのその生産がマクロファージを補充かつ活性化することを示す。

ＴＮＦは、サイトカイン網に参与し、ＩＬ−１，ＧＭＣ５Ｆ、血小板誘導成長因 子およびベーター２インターフエロンの放出を誘導する。

ＴＮＦの主たる潜在的治療効果は、その抗腫よう活性である。ＴＮＦはエンドト キシン誘発腫よう退行の伝達物質である。Ｉ　Ｌ−２はヒト末梢血単被白血球に おいてＴＮＦを誘導するため、ＴＮＦは！Ｌ−２の抗腫よう活性に関与し得る。

ＴＮＦを全身的に与えると、マウスにおいて腫ようの退行が誘発される。ＴＮＦ およびＩＬ−１の直接的抗増殖性および踵よう細胞毒性作用は相乗的であると考 えられている。

ヒトにおける最初の臨床試験は、静脈内および筋肉内注射を含ん・　だ。毒性に は、発熱、悪寒、疲労、食欲不振、低血圧および頻脈が含まれた。幾つかの小さ な踵よう応答は、現在までに注目されている。例えば、Ｂ、シェリーおよびＡ、 セラミ、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、１０７．１２６９（１９ ８８）、１．Ｊ、ムール等、Ｃａｎｃｅｒ　ｌｅ＋ａｕｎｏ１．　Ｉ＋ｎｍｕｎ ｏｔｈｅｒ、、２６．２０２（１９８８）。

Ｙ、−ノ瀬等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ＋、２７ ．７（１９８８）、Ｐｌ、チャプマン等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・オ ンコロジー」、５．１９４２（１９８７）、Ｈ，Ｈ，ノ（ルチュ等、「モレキュ ラー・バイオセラビー」、１．２１（１９８８）およびＴ、スタインメツツ等、 Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｍｏｄ、、７．４１７（１９８８）参照。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、本来、抗ウィルス活性を有する１９５０年代後 期に発見された化合物の種類に割り当てられた語である。最初、３種類のインタ ーフェロンは、アルファ、ベータおよびガンマとして呼ばれ、それらが各々白血 球、繊維芽細胞およびリンパ様細胞から最初に同定および単離されたことを示し た。１９８８年現在、アルファ・インターフェロンの構造的に関連した形態をコ ードする少な（とも２４の非対立遺伝子が報告されてし＼る。これらは、１６５ −１６６アミノ酸の蛋白質をコードするＩＦＮ−アルファｌ遺伝子、および１７ ２アミノ酸の蛋白質をコードするＩＦＮ−アルファｌ遺伝子と呼ばれる２つの亜 群に分割された。「繊維芽細胞インターフェロン」と一般に呼ばれているものを コードする単一遺伝子は、ヒトにおいて充分に特性確認されている。しかしなが ら、繊維芽細胞は複数形態のインター７エａンを生産し得るｔ；め、繊維芽細胞 インターフェロンに対するより正確な用語はヒト・インターフェロン・ベータ（ ＨｕｌＦＮ−ベータ）である。ＨｕｌＦＮ−ベータは、Ｈ＋ｒｌＦＮ−アルファ と約４０％のアミノ酸相同性を有する。

ヒト・インターフェロン・ガンマ遺伝子は、単一アミノ酸において何等かの個体 間対立性または差異を伴う単一コピーとして存在する。

ガンマ−インターフェロンは、アルファまたはベーターインターフェロンに対す る相同性をもたない。

インターフェロンまたは抗ウィルス活性を有するウィルス誘導蛋白質は、両性類 以外の全を椎動物種の代表的なものから同定された。

様々なＩＦＮ−アルファ・サブタイプの生物活性は比較的類似している。ＩＦＮ −アルファおよびベータの生物活性もまた類似してし）るが、両方ともＩＦＮ− ガンマとは異なる。Ｅ、ドマイヤーおよびＪ、ドマイヤーーギグナード、「イン ターフェロン・アンド・アザ−・レギュレイトリー・サイトカインズ」、ジーン ・ウィリー・アンド・サンプ、パブリッシャー、５−３８頁（１９８８）参照。

アルファおよびベータ・インターフェロンの主たる生物活性は、抗ウィルス作用 、単核白血球による主たる組織適合性、複合体クラスＩ＋抗原およびインターロ イキン−１の発現の誘導、抗増殖作用並びにヒト天然キラー細胞活性の調節であ る。

インターフェロン・アルファおよびベータは、特に抗増殖作用、分化の誘導、腫 よう遺伝子発現の調節および免疫応答の刺激を含め、若干の機構を伴う抗腫よう 作用を有する。

正確な生物学的作用は、アルファーインターフェロンの特定構造形態および検定 セルラインの感受性により変化し得る。また、例えばヒト・インターフェロン・ アルファまたはベータは単核白血球からマクロファージへの成熟を阻止し得るた め、陽性および陰性の両方の調節を観察することが可能である。Ｅ、トメイヤー およびＪ。

ドメイヤーーギドナンド、「インターフェロン・アンド・アザ−・レギュレイト リー・サイトカインズ」、ジョン・ウィリー・アンド・サンプ、パブリッシャー 、１３４４−１５３頁（１９８８）参照。

成長因子とも呼ばれる一群のサイトカインは、それらの生物活性の中でも、走化 的活性、上皮細胞および繊維芽細胞の増殖、成長および分化、マトリックス形成 および軟骨形成の刺激並びに管形成（血管形成）を含む創傷治癒および組織修復 に対する陽性または陰性調節作用を有する。多数の生物活性蛋白質がこの領域内 で報告され、分類原則に従ってそれらの生物学的作用およびアミノ酸配列相同性 に基づき群および種類に分類されている（下記表１に示されている通り）。この 群のサイトカインは組織修復に関与するが、それらは他の生物学的作用を有する 。さらに、他のサイトカイン類、例えば免疫応答を調節するインターロイキン− １およびインターロイキン−３もまた組織修復に対する作用を有する。

表皮成長因子（ＥＧＦ）は、Ｉよう増殖因子（ＴＧＦ）アルファ、アンフィレグ リンおよびワタシニア成長因子を含む一群の構造的に関連した蛋白質の重要な代 表的構成員である。ヒ）ＥＧＦは最初尿から単離され、それが胃液分泌を阻止し 得ることからウロガストロンと命名された（Ｈ，グレゴリ−１「ネイチャー」、 ２５７．３２４（１９７５））。唾液腺から単離された不ズＥＥＧＦは、上皮細 胞、繊維芽細胞および内皮細胞を含む多数の細胞型に対して細胞分裂誘起性を示 す（Ｓ、中耕等、「ディフエレンシエーションＪ、２９．２８４（１９８５）） 。それは、新生マウスにおいて早発的まぶた開眼および歯牙はう出を刺激しくＳ 、コーエン、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２３７． １５５５（１９６２））、上皮細胞に対して走化的である（Ｊ、プレイおよびに 、Ｄ、ブラウン、「ジャーナル・オブ・セルラー・フイジオロジー」、１２４． １０７（１９８５））。ＥＧＦは、５３アミノ酸活性蛋白質ヘブロセツシングさ れる前駆体蛋白質として合成される。

腫よう増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）は、ＥＧＦと同じレセプターに結 合し、似た生物活性を共有する。Ｇ、Ｊ、トダロ等、「プロシーデインダス・オ ブ・ザ・ナショナル・アクデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテ ッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７７．５２５８（１９８０）参照。ＥＧＦ と同様ＴＧＦ−アルファは、１６０アミノ酸前駆体として合成され、これは５０ アミノ酸生物活性残基へ蛋白質分解的にプロ七ツシングされる。Ｒ，プリンク等 、「セル」、３８．２８７（１，９８４）参照。ＴＧＦ−アルファは、最初、Ｔ ＧＦ−ベータと相助して正常ラット腎臓線維芽細胞の固定依存性成長を誘導し得 ることにより認識されＩ；。Ｍ、Ａ、アザノ等、「プロシーデインダス・オブ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド ・ステーツ・オブ・アメリカ」、８０．６２６４（１９８３）参照。

血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）は、ヒト血液血小板から精製される。Ｒ，ロス およびＡ、フォーゲル、「セル」、１４．２０３（１９７８）参照。それは、２ つのポリペプチド鋼、すなわちＡ鎖（１２４アミノ酸残基）およびＢ鎖（１４０ アミノ酸残基）により構成される。

ＰＤＧＦは、間充組織由来の細胞（例、平滑筋および繊維芽細胞）にとっては強 力なミトゲンであるが、ＰＤＧＦレセプターを欠く上皮または内皮細胞に対する 作用はもたない。Ｒ，ロス、Ｅ、Ｗ、ライネスおよびり、Ｆ、ボーエン−ホープ 、「セル」、４５、ｌ　５５（１９８６）参照。また、血小板誘導成長因子はブ タ細胞から入手され得る。

腫よう増殖因子ベータ（複数もあり得る）は、最初、ＥＧＦまたはＴＧＦ−アル ファと相乗作用してＮＲＫｍ胞の固定依存性成長を誘導と得ることｌこより同定 された。Ｍ、Ａ、アンザノ等、「プロシーデインダス・オプ・ザ・ナシ厘ナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ユナイテッドφステーツ・オブ ・アメリカＪ、８０゜６２６４（１９８３）参照。続いて、それらは、存在する 他の成長因子によって異なる化学走性、細胞分裂促進、成長阻害および分化の誘 導または阻止を含む多数の生物学的作用を有することが示された。

Ｍ、Ｂ　、スポーフおよびＡ、Ｂ、ロバーツ等、「ジャーナル・オブ・セル・バ イオロジー」、１０５．１０３９（１９８７）参照。それらの成熟形態では、Ｔ ＧＦ−ベータ類は、７０％の相同性を共有する１１２アミノ酸残基の酸および熱 安定性ジスルフィド結合ホモ２量体蛋白質である。Ｒ，プリンクおよびＪ、Ａ、 ７アレツト等、「ネイチャー」、３１６．７０１（１９８５）参照。この群の別 の構成員、ベーター３は、最近報告されている。Ｊ、Ｍ、つオズネイおよびＶ。

ローゼン等、「サイエンス」、２４２．１５８２（１９８８）参照。

それらは様々な生物活性を共有するが、ＴＧＦの異なる形態もまた選ばれた標的 細胞に対して特有の生物活性を有する。Ｆ、ローザ［およびＡ、Ｂ、ロバーツ等 、「サイエンス」、２３９．７８３（１９８−８）参照。ＴＧＦ−ベータ■は創 傷治癒において主要な活性を示した。ＴＧＦ−ベータ群に含まれる他の生物活性 蛋白質には、卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌をｌｌ４ｊ！ｉｙするインヒビンお よびアクチビンと呼ばれる性腺蛋白質、雄性胚芽の発生において雌性ミュラー菅 の退行を誘発するミュラー阻止物質、並びに軟骨および硬骨形成の誘導に関与す る一群のポリペプチドである骨形態形成蛋白質といった形態がある。Ｊ、Ｍ、ウ ォズネイおよびＶ、ローゼン等、「サイエンス」、２４２．１５２８（１９８８ ）参照。

繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、１４−１８キロダルトンの単鎖蛋白質である 。２種の充分に特性確認された形態は、脳および下垂体から単離された塩基性Ｆ ＧＦ、並びに脳および網膜から単離された酸性ＦＧＦである。塩基性ＦＧＦは、 大部分の系において、酸性ＦＧＦよりも安定し、１０倍の効力を有する。ＦＧＦ の両形態は、同じレセプターに結合し、中胚業起源の細胞、例えば繊維芽細胞、 血管内皮ｗｉ胞、血管平滑筋、筋芽細胞、軟骨ｍ胞および骨芽細胞１；対して細 胞分裂促進性を示す。Ｆ、エシュおよびＡ、ベアド等、ｒグロシーデインダス・ オブ・ザ・ナシ−ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ テッド・ステーク・オブ・アメリカ」、８５．６５０７（１９８５）参照。１ｎ ｔ２およびｈｓｔプロト−腫よう遺伝子の生成物もまた、ＦＢＦ群の構成員とし て含まれる。

（Ｃ，ディクソンおよびＰ、Ｅ、ゴートン、「ネイチャー」、３２６．８３３（ １９８７）参照）。

ソマトメディアＣとしても知られているインシュリン様成長因子１（ＩＬＧ−Ｉ ）およびインシュリン様成長因子＋１（ＩＬ、Ｇ−１１）は、血清から最初に精 製され、軟骨へのスルフェート取り込みの刺激、インシュリン様活性および増殖 刺激活性の３つの生物活性を共有する若干の因子に関する現行の名称を代表する 。肝臓および繊維芽細胞は循環性インシュリン様成長因子の主たる供給源である が、本質的に全ての組織がそれらを生産することが示された。

また、インシュリン様成長因子は、それらの生物活性の中でも、グルコース代謝 を刺激し、繊維芽細胞、セルトリ細胞、胎児脳細胞、筋芽細胞、レンズ上皮、す い臓ベータ細胞、レクチン刺激リンパ球、および血小板誘導成長因子と「反応能 をもつ」状態になった後密度阻止されたＢａ１ｂ／ｃ　３　Ｔ　３細胞のＤＮＡ 合成および細胞増殖を刺激することが示された。（Ｒ，Ｃ，バクスター、Ａｄｖ 、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、、２５．５０（１９８６）参照）。

サイトカイン類は、それら自体複合体であり、サブユニットを構成し得る細胞表 面レセプターと反応する。サイトカインの一部分は、レセプターの様々なサブユ ニットへ優先的ｌ；結合することにより、相異なる生物学的／調節作用を生じ得 る。本発明はまた、レセプターの特定サブユニットを指向し得る上記サイトカイ ン・フラグメントの固定化方法を提供する。

固定化支持体 本発明に、おいて有用な支持体材料は、好ましくは生物学的適合性であり、所望 に応じて非生物分解性または生物分解性であり得る。

結合したサイトカインがインビボで使用されるとき、支持体は生物分解性である ことが望ましい場合もあり得るが、例えばバイオリアクターといった適用例では 不溶性支持体材料が有用である。

適当な支持体には、繊維、シート、ミクロスフイア、粒子、ビーズ、膜などがあ る。

支持体は、好ましくはサイトカインの共有結合と化学的に融和性である表面を含 む。従って、支持体は、好ましくはサイトカイン上の部位（例、アミンまたはカ ルボキシル部位）、またはサイトカモン上の部位に結合し得る適当な結合アーム に共有結合し得る適当な官能基を有する表面を含む。意図した支持体がサイトカ イン結合に適しｔ；官能基をもたない場合、上記基は、支持体表面の適当な化学 的修飾により提供され得る。例えば、非官能化ポリスチレン支持体は、芳香族環 の適当な官能化により（例、臭素化により）官能化された表面に提供され得る。

必ずしも全ての結合化学作用が、多くの様々なサイトカインの各々と等しく良好 に働くとは限らない。使用される特定の結合化学作用の適合性は、部分的に、反 応部位の利用能およびサイトカインの活性部位へのそれらの近さにより異なり得 る。しかしながら、当業界の熟練者であれば、当然アミノ酸配列、反応性基の存 在および活性部位から適当な方法を予測できるはずである。また、本発明を適用 する場合、当業界の熟練者であれば、アミノ酸を非反応性アミノ酸と置き換える かまたはその逆により、固定化部位の結合を標的とする遺伝子修飾サイトカイン を作製し得ると考えられる。また、当業界の熟練者であれば、サイトカインのコ ドンを修飾して末端及応性基を有するものを生成することにより、高い確率で固 定化部位の結合を指向させることができると考えられる。

官能化された表面は、（ａ）直接サイトカモン上の部位へ、または（ｂ）適当な 結合アームへ結合する部位を提供する反応性官能基を含む。

上記官能基には、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−Ｎ　ＨＫまたは−Ｎ ＨＲ（式中、Ｒはアルキルまたはアリールである））、カルボキシル基（−ＣＯ ２Ｈ）、水硫基（−３Ｈ）およびハロゲン類（−Ｆ、−〇Ｌ−Ｂｒ、−１）があ る。官能化された表面は、表面の化学的処理に加えて若干の手段により提供され 得る。例えば、ポリサイエンシーズから得られる青色に染めたポリスチレン・ビ ーズは、ポリスチレン自体は反応に利用され得る官能基をもたないにも拘わらず 、官能化された表面を提供する。青色色素は、ポリスチレンへ結合されか、吸着 されるか、またはそれとコポリマー化され、遊離アミン基を提供する。適当な官 能基を提供する広範な種類の他の方法も知られている。

適当な粒子支持体には、無機支持体、例えばガラス、石英、セラミック、沸石、 金属および金属酸化物、ポリマー材料、例えば、明確な単位を含むモノマー単位 、例えばスチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジェン、アクリロニトリ ル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のエステル、酢 酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから誘導 された、ホモポリマー、コポリマーおよびオリゴポリマー、炭水化物支持体、例 えばアガロース、架橋アガロース、デキストラン、架橋デキストラン、イヌリン 、ヒアルロン酸、セルロース、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセル ロース（ＣＭＣ）、澱粉および澱粉誘導体（例、澱粉ミクロスフイア）および不 溶性蛋白質材料、例えばゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンがある。

本発明の固定化支持体の表面は好ましくは非多孔質である。非多孔質表面を有す る材料、例えば実質的に球形のポリマー・ビーズまたはミクロスフイアを用いる と、支持体の外部表面へサイトカインを結合させることにより、サイトカインは 生物学的に利用可能な非立体障害位置に配置され得る。材料における孔のサイズ が充分に小さいため、球体内部へのサイトカインの移動が遮断または実質的に妨 害される場合、表面は非多孔質であると考えられる。持続放出製生物分解性製剤 として使用する場合、高い薬剤ローディングを可能にし、支持体が分解するに従 い新しい活性部位を露出させるには、多孔質表面が好まれ得る。

支持体のサイズおよび形状は、特定サイトカインおよびその意図する用途により 広範に変化し得る。約ｏ、５−ｓｏｏμｍ１特に約１−７５μｍの直径を有する ポリマー球体は好ましい支持体である。

上記支持体は、例えば！Ｌ−２依存性リンパ球のインビトロ成長に好ましい。他 の好ましい支持体は、約５−２００μｍの直径を有する短繊維がある。

サイトカイン結合基 本発明の固定化サイトカインは、好ましくは直接または結合アームを介して支持 体材料へ共有結合したサイトカインを含む。結合アームの長さは結合サイトカイ ンの生物活性に関連し得ると考えられている。適当な結合アームは、１個または それ以上の２官能性結合基、例えば（１）式Ｎ　Ｈｘ　Ｒ’　−Ｎ　Ｈｓ　（式 中、Ｒ１はＣｚＣｘ。アルキル基である）を有するジアミン類、（２）一般式Ｎ 　Ｈ！　Ｒ”　−ＣＯ２Ｈ（式中　ＨｚはＣＩ−Ｃ！＊アルキル基である）を有 するアミノ酸、および（３）弐〇ＨＣ−Ｒ”−ＣＨｏ（式中、Ｒ１はＣ，−Ｃ， 。アルキル基である）を有するジアルデヒドを含む。２個またはそれ以上の結合 基を結合させることにより、長さを追加することができる。適当な結合基の例と しては、６−アミノカプロン酸、１．６−ジアミツヘキサン、１．１２−ジアミ ノドデカン、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物がある。

本発明の好ましい実施態様において、固体支持体は、複数の反応性の露出した官 能基を有する官能化表面を含む。すなわち、サイトーカインは、表面上の官能基 、または官能基へ共有結合した適当な長さの結合アームへ直接共有結合している 。官能化表面を有する支持体を充分に洗浄後、生物活性部分（サイトカイン）は 露出した官能基したアミド結合を形成すると考えられる、ポリマー支持体の官能 化表面上のカルボキシル基およびサイトカモン上の遊離接近性アミノ基の反応に おける水溶性カルボジイミドの使用、（２）ポリマー支持体の表面上のアミノ基 およびサイトカモン上の遊離接近性アミ７基を結合させ得る、結合アームとして の２官能性アルデヒド（例、グルタルアルデヒド）の使用、および（３）固体支 持体上のヒドロキシル基と結合アームまたはサイトカモン上のアミノ基との反応 における臭化シアンの使用がある。

固定化サイトカインの安定性は、固定化表面へ直接または結合アーム（存在する 場合）を介したサイトーイン間の共有結合（複数もあり得る）の性質により異な る。安定した、堅固に結合したサイトカインは、反復的に使用しても終始所望の 生物活性を示す・蛋白質を不溶性マトリックスに結合させる下記の結合の安定性 はこの結合は、蛋白質上のアミノ基（主としてリジル側鎖アミン）と臭化シアン （ＣＮＢｒ）、ｌ−シアノ−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン・ピリジニウム・テト ラフルオロボラートなどといった試薬により活性化されたポリヒドロキシ性マト リックス（例、アガロース、セルこの結合もまた、上記イソ尿素と同様に、蛋白 質上のアミノ基（主としてリジル側鎖）と上記要領で活性化されたポリヒドロキ シ性マトリックスとの反応から形成される。

下記の蛋白質−不溶性マトリックス結合の安定性は比較的強いと考えられる。

この結合は、蛋白質上のアミノ基と、４−ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート・、カルボニルジイミダゾール などといった試薬により活性化されたポリヒドロキシ性マトリックスとの反応か ら構成される装この結合は、蛋白質アミン基と、シアヌール酸塩化物といった試 薬により活性化されたポリヒドロキシ性マトリックスとの反応から形成される。

下記の蛋白質−不溶性マトリックス結合の安定性は非常に強いと考えられている 。

１、アミン（ポリマー−ＮＲ−蛋白質）この結合は、蛋白質アミノ基と、（１） トレシルクロリド、スルホニルクロリドなどといった試薬、オキシラン類（エポ キシド類）、例えばビスオキシランおよびエビクロロヒドリンにより活性化され たポリヒドロキシ性マトリックス、および（２）グルタルアルデヒドといった試 薬により活性化されたポリアミノマトリックスとの反応ｔ−含む様々な方法で形 成される。

■ ２、アミド（ポリマー−Ｃ−ＮＨ−蛋白質またはポリマー−ＮＨ○ 薯 −Ｃ−蛋白質） この結合は、蛋白質アミノ基と不溶性マトリックス上の活性化カルボキシル基と の反応を含む様々な方法で形成され得る。これらのカルボキシル基の活性化は、 「活性」エステル（例、ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ｐ−二トロフェノー ルまたはペンタクロロフェノール）の形成まｔ；はカルボジイミドとの反応によ り達成され得る。

逆に、アミド結合はまｔ；、不溶性マトリックス上のアミノ基と、蛋白質上の適 当に活性化された（例、水溶性カルボジイミド）カルボキシル基、特にアスパラ ギン酸およびグルタミン酸側鎖カルボキシル基との反応により形成され得る。

共有結合は、サイトカモン上の単一部位、好ましくは生物活性部位からの適当な 距離を指向するのが好ましい。この考えにより、生−物活性を最適化するための 結合アームの好ましい選択、および結合アーム、支持体およびサイトカインの結 合において選択される特異的化学作用が指示され得る。

結合サイトカインの用途 本発明の結合サイトカインを用いることにより、例えば（１）幹細胞および様々 な分化段階での細胞、例えば赤血球、リンパ球、マクロ７アージおよび／または 好中球を含む細胞血液成分のインビトロ成長および生産、（２）リンホカイン活 性化キラー（Ｌ　Ａ　Ｋ）細胞、中性キラー細胞、リンホカイン活性化キラー細 胞の亜集団、騰よう浸潤性リンパ球および／または細胞毒性Ｔ細胞を含む特殊エ フェクター細胞のインビトロ成長および生産、（３）結合サイトカインのインビ ボ腹腔内および／または胸膜内投与による悪性疾患の処置、（４）結合サイトカ インのインビボ静脈内投与による悪性疾患の処置、（５）好ましくは結合サイト カインの静脈内投与または体内設置による、難治性貧血、血小板減少症、および 例えば腎臓透析患者での慢性腎不全および／または腎不全におけるエリトロポエ チンの欠乏に起因する一次骨髄機能不全または二次骨髄機能不全に伴う好中球減 少症の処置、（６）結合サイトカインの表面適用または結合サイトカインの体内 設置による硬および軟組織損傷の処置、並びに（７）結合サイトカインのインビ ボ静脈内投与によるオステオポローシスの処置を含む様々な生物学的反応を誘導 および調節することができる。Ｓ。

牛用およびＳ、書出等、「ディフェレンシェーク２ン」、２９．２８４（１９８ ５）並びにＪ、プレイおよびに、Ｄ、ブラウン、「ジャーナル・オブ・セルラー ・フイジオロジー」、１２４．１０７（１９８５）参照。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 青色色素で染めｔ；ポリスチレン・ビーズ（９，６４μｍ）へのＩＬ−２の結合 組換え体ＩＬ−２（アムジェン、サウザンド・オークス、ＣＡ。

ａｌａ−１２５類似体）を、青色色素で染めた９、６４μｍのポリスチレン・ビ ーズ（ポリサイエンシズ、ウォリントン、ＰＡ）へ下記の方法で２価性アルデヒ ドを使用して固定化しＩ；。青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μ ｍ）の２．５％水性懸濁液の０．２５ｍ１−アリコートを、リン酸塩で緩衝化し た食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐ　Ｈ７，４０）１．Ｏｍｌで希釈し、微量遠心機で ５分間遠心した。上溝を注意深く除いて捨てた。ビーズをＰＢＳｌ、Ｏｍｌずつ で懸濁、遠心を繰り返して２ｒＭ洗浄した。ついでビーズを８％グルタルアルデ ヒドのＰＢＳ溶液０．７５ｍ１に懸濁した。緩やかな断続的な混合により活性化 を室温で５時間進行させた。反応混合物を遠心し、上溝を捨てた。ペレット、即 ち凝集したビーズをＰＢＳ　１．Ｏｍｌずつで２回洗浄した。ついでペレットを ＰＢＳ　０．４ｍｌに懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２１００ｇｇ＝活性６ ０００００単位）Ｏ，１ｍｌで処理した。反応混合物を室温で１夜混合し、遠心 し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し 、混合物を這心した。上溝を取り、これを最初の上溝へ追加した。その後のＩＬ −２の残存活性測定のために、プールしたこの上溝液（約ｌ。

Ｏｍｌ）を４℃で保存した。

ついでビーズを次の方法で処理した。ビーズを０．５ＭエタノールアミンのＰＢ Ｓ溶液Ｑ、５ｍｌに懸濁し、室温で３０分間混合した。

混合物を遠心して上溝を捨て、ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌで１回洗浄した。

ビーズを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ、セン、トルイス、Ｍ　ｏ　 ）のＰＢＳｏ、５ｍｌ溶液に懸濁し、室温で３０分間混合し、這心した。上滑を 捨てた。ついでペレットをＢ　Ｓ　Ａ／Ｐ　ＢＳ溶液０．５ｍｌずつで２回洗浄 し、最後に貯蔵用緩衝液［塩化ナトリウム（０，８８％）、ＢＳＡ（１％）、グ リセリン（５％）、およびアジ化ナトリウム（０，１％）の０．０２Ｍリン酸ナ トリウム溶液（ｐＨ７，４０）３０．５＋ｍｌに懸濁した。ビーズは使用時まで ４℃で貯蔵した。

上溝液の！Ｌ−２活性検定で５０４００単位の活性（もとの溶液の活性の８．４ ％）が認められたので、ＩＬ−２の９１．６％がビーズに結合したことが判明し た。

実施例２ 青色色素で染めたポリスチレンビーズ（０，９３μｍ）へのＩＬ−２の結合 実施例１で報告した方法に従い、２価性アルデヒドを使用して、組換え体ＩＬ− ２（アムジエン、ａｌａ−１２５類似体、ＩＬ−２１ＯＯμｇ、活性６６０００ ０単位）を青色色素で染めたポリスチレン・ビーズ（ポリサイエンシズ、０．９ ３μｌ１１）へ固定化した。ただしビーズのサイズが小さかったため、ビーズを 上清から完全分離するのに一層長い遠心時間を要した（１０分間）。最終洗浄の のち、ビーズを実施例１で使用した貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍｌに懸濁し、使用時ま で４℃で保った。上清液のＩ　Ｌ−２活性検定で１８０００単位の活性（もとの 溶液の活性の２．７％）が認められたので、ＩＬ−２の９７．３％がビーズに結 合したことが判明した。

実施例３ 青色色素で染めたポリスチレン粒子（４２１μｍ）へのＩＬ−２の結合 組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を青色色素で染めたポ リスチレン粒子（ポリサイエンシズ、４２１μｍ）へ下記の方法で２価性アルデ ヒドを使用して固定化した。青色色素で染めたポリスチレン粒子（１０ｍｇ）を ＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）１．０ｍｌずつで３回洗浄した。ついで実施例１で報 告した方法に従い、粒子をグルタルアルデヒドで活性化し、組換え体ＩＬ−２（ ＩＬ−２水溶液０．２１１１１％　Ｉ　Ｌ　−２２００％ｇ−活性１．５Ｘ１０ ’単位）へ結合させた。実施例１で報告したように結合し、処理したのち、実施 例１で使用した貯蔵用緩衝液１．Ｏｎ＋１で４℃で貯蔵した。上滑液のＩＬ−２ 活性検定で１７６０００単位の活性（もとの溶液の活性の１１．７％）が認めら れたので、ＩＬ−２の８８．３％が粒子に結合したことが判明した。

実施例４ 青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）　ヘノＩ　Ｌ　−２の結 合：ＩＬ−２溶液濃度の効果 固定化処理におけるＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）濃度の効果 を下記の方法で検討した。青色色素で染めたビーズ（９，６４μＩＩ）の２，５ ％水性懸濁液の８個の０−２５ｍ１−アリツー）・から得られたベレットをＰＢ Ｓで洗浄し、実施例１で報告したように、ｔ：だし反応を２分の１の規模で実施 して、グルタルアルデヒドで活性化しｔ＝。ついで活性化したビーズを第２表に 示したようにＰＢＳおよびＩＬ−２の量を種々に変えて懸濁し、室温で１夜反応 を進行させｌ：。この結合反応のあと、実施例１で報告した方法に従ってビーズ を処理し、貯蔵用緩衝液の０．２５ｍ１ずつに懸濁し、使用時まで４℃で保った 。種々の結合反応から得られた上溝液に存在するＩＬ−２の残存活性を検定した 。得られた成績を第２表に示す。

結合反応に使用したＩＬ−２溶液（結合前）および得られた上清から回収したＩ 　Ｌ−２溶液（結合後）間の各活性の差から、組み込まれたＩＬ〜２の％値が得 られた。

実施例５ 青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）へのＩＬ−２（組換え体 ：天然配列）の結合 実施例１で報告した方法と同様の方法により、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、 天然配列）を９．６４μｍの青色色素で染めたポリスチレンビーズへ固定化した 。青色色素で染めたポリスチレンビーズの２．５％水性懸濁液の０−１２５＋ｌ １ｌ−アリコートから得られたベレットをＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄し 、８％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ　Ｏ，５ｍｌで活性化し、組換え体ＩＬ−２ 溶液（ＩＬ−２の水−溶液０．０３２ｍＬ　Ｉ　Ｌ−２３２μｇ、活性６０００ ０単位）のＰＢＳ（０，４ｍ１）溶液に懸濁した。室温で１夜混合することによ って反応を進行させたのち、反応混合物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存し た。ベレットをＰＢＳ　０．５＋ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心しｌ；。上溝を 取り、最初の上溝へ追加しＩ；。実施例１で報告した方法に従ってビーズを処理 し、貯蔵用緩衝液０−２５ｍ１に懸濁し、使用時まで４℃で保った。上溝液のＩ Ｌ−２活性検定で５７００単位の活性（もとの溶液の活性の９．５％）が認めら れたので、ＩＬ−２の９−０．５％がビーズに結合したことが判明しｊ；。

実施例６ ポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へのＩＬ −２の結合 組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を水溶性カルボジイミ ドを使用する下記の方法でポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア （ポリサイエンシズ、カルボキシレート処理したポリスチレン）９．６７μｍへ 固定化した。ポリビード・カルボキシレートミクロスフェアの２．５％水性懸濁 液の０．２５ｍ１−アリコートから得られたベレットをＰＢＳ　１．ｏｍｌずつ で３回洗浄した。ビーズをＰＢＳ　０．４ｍｌに懸濁し、１−エチル−３−（３ −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ　ＣＥＤＣＩ。

ピアス・ケミカルズ、ロック７オード、ＩＬ）３．Ｑａ＋ｇを加えて、これを溶 解した。ついで組換え体Ｉ　Ｌ−２の水溶液（０，０５ｎ＋１、＋Ｌ−２５０μ ｇ１活性３７５０００単位）を加えた。室温で１夜混合しｌ；のち、反応混合物 を遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ベレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再 懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついで実施例 １で報告した方法に従ってビーズを処理し、貯蔵用緩衝液０−２５ｍ１に懸濁し 、使用時まで４°Ｃで貯蔵しｌ；。上溝液のＩＬ−２活性検定で５７０単位の活 性（もとの溶液の活性の０．２％）が認められたので、ＩＬ−２の９９．８％が ビーズに結合したことが判明した。

実施例７ ローアミノカプロン酸連結アームによるポリビード（商標）カルボキンレートミ クロスフェア（９，６７μｍ）へのＩＬ−２の結合下記の方法により、６−アミ ノカプロン酸連結アームで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（ アムジエン、ａｌａ−１２５類似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミ クロスフェア９．６７μｍへ固定化した。実施例６で報告したように、カルボキ シレートミクロスフェアの０．２５ｃａｌ−アリツー・トから得られたべレフト ラ洗浄し、ＰＢＳ　０．５ｍｌに懸濁し、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド （スルホ−ＮＨ５，ピアスーケミヵルズ、ロックフォード、ＩＬ）３．０ｍｇお よびＨＤＣＩ　３．０ｍｇで処理した。撹拌して試薬を溶解したのち、反応混合 物を室温で緩やかに３０分間混合した。ついでスラリーを遠心し、上溝を捨てた 。ペレットを０．５Ｍ６−アミノカプロン酸のＰＢＳ溶液０　、５　＋ｎｌに懸 濁した。生じＩ；スラリーを室温で２０時間混合し、遠心した。上清を捨てた。

ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄し、ＰＢＳ　０．３５ｍ１に再懸 濁し、ＩＬ−２の水溶液０．０５ａ＋１（ＩＬ−２５０ｊ１ｇ、活性３７５００ ０単位）およびＨＤＣＩ　２−０ｍｇで処理した。混合して試薬を溶解したのち 、反応混合物を室温で緩やかに１夜混合しｔ；。ついでスラリーを遠心し、上溝 を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．６ｍｌに再懸濁し、混合物 を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを実施例１で報 告したように処理し、貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵 した。上清に存在するＩＬ−２活性の測定で４６０単位の活性（もとの溶液の活 性の０．１％）が認められｔ；ので、Ｉ　Ｌ−２の９９．９％がビーズに結合し たことが判明した。

実施例８ １．６−シアミツヘキサン／グルタルアルデヒド連結アームによるポリビード（ 商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へのＩＬ−２の結合 下記の方法により、１．６−シアミツヘキサン／グルタルアルデヒド連結アーム で水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１ ２５１１似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６ ７μｍ）へ固定化した。カルボキシレートミクロスフェアの０．２５ｍ１−アリ コートから得られたペレットを、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）１．Ｏｍｌずつで３ 回洗浄し、１．６−ジアミツヘキサンの０．５Ｍ　ＰＢＳ　（ｐＨ９，５０）溶 液０．５＋ｏｌに懸濁し、ＥＤＣＩ　３．Ｑｍｇで処理した。スラリーを撹拌し て試薬を溶解し、室温で２０時間混合した。この反応混合物を遠心し、上滑を捨 て、ペレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）０．５ｗ＋１ずつで３回洗浄した。つ いでペレットを８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液０．５ｍｌに懸濁し、室温 で４時間混合した。スラリーを遠心し、上清を捨て、ペレットをもう一度ＰＢ５ 　０．５ｍｌずつで３回洗浄した。ついで得られたペレットをＰＢＳ　０．３５ ｍ１に懸濁し、ＩＬ−２１７）水溶液（ＩＬ−２５０ｇｇ、活性３７５０００単 位）０．０５ｍ１で処理した。スラリーを室温で１夜混合し、遠心し、上清を注 意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．６ｍｌに再懸濁し、混合物を遠 心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを実施例１と同様に 処理して、貯蔵用緩衝液０．５ａ＋１に懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上 滑に存在するＩ　Ｌ−２活性の測定で５００００単位の活性（もとの活性の１３ ．３％）が認められたので、ｒＬ−２の８６．７％がビーズに結合したことが判 明した。

実施例９ １．１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アームによるポリビード （商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μ＋ｍ）へのＩ　Ｌ−２の 結合 下記の方法により、１．１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アー ムで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ− １２５類似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６ ７μｍ）へ固定化した。カルボキシレートミクロスフェアの０−２５ｍ１から得 られたペレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．Ｏ＋ｍｌ）で洗浄し、０． ２Ｍ　１．１２−ジアミノドデカンのＰＢＳ　（ｐＨ７−０）溶液０．７５■ｌ に懸濁し、ＨＤＣＩ　５．０ｍｇで処理した。室温で１８時間混合したのち、反 応混合物を遠心し、上清を捨てた。ペレットをＰＢＳ　（ｐ）１７゜４０．３　 Ｘ　ｌ　、０ｍ１）で洗浄し、実施例８で報告したように８％グルタルアルデヒ ドのＰＢＳ溶液１．０＋ａｌで活性化した。活性化ののち、スラリーを遠心し、 上滑を捨て、もう一度ベレットをＰＢＳｏ、５ｍｌずつで３回洗浄した。ついで 得られたペレットをＰＢＳ　０゜４ｍｌに懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２ １００１１ｇ、活性７５００００単位）０．１ｍｌで処理した。混合物を室温で １夜反応させた。スラリーを遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレット をＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上清 へ追加した。ついで実施例１で報告したようにビーズを処理し、貯蔵用緩衝液Ｑ 、５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。

上溝液に存在するＩ　Ｌ−２活性の測定で４２０００単位の活性（もとの活性の ５，６％）が認められＩ；ので、ＩＬ−２の９４．４％がビーズに結合したこと が判明した。

実施例１０ １．１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アームによるポリビード （商標）カルボキシレートミクロスフェア（６５±２５μｍ）へのＩ　Ｌ−２の 結合 下記の方法により、１，１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アー ムで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ− １２５類似体）をポリビード（商１）カルボキシレートミクロスフェア（６５± ２５μｍ）　（ポリサイエンシズ）へ固定化した。６５±２５μｍのカルボキシ レートポリビーズの２．５％懸濁液０．５０ｍ１から得られたベレットを、ＰＢ Ｓ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ　ｌ　、０ｍ１）　テ洗浄シ、０．２Ｍ　１．１２− ジアミノドデカンのＰＢＳ溶液（ｐＨ６，ｏＯ）１．Ｏｍｌに懸濁し、ＥＤＣ１ １０＋ａｇで処理しｔ；。室温で２４時間混合したのち、反応混合物を遠心し、 上清を捨てｔ；。ベレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄 し、実施例８で報告したように８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液１．Ｏｍｌ １で活性化しＩ；。活性化ののち、スラリーを遠心し、上溝を捨て、ベレットを もう一度ＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄した。ついで得られたベレットをＰ ＢＳ　０．７５ｍ１に懸濁し、１Ｌ−２の水溶液（ＩＬ−２０，１０２５ｍｇ、 活性９０００００単位）０．２５ｍ１で処理した。混合物を室温で１夜混合する ことによって反応させた。ビーズを実施例１と同様に処理し、貯蔵用緩衝液０゜ ５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ−２活性の測 定で１４４４５０単位の活性（もとの活性の１６．０％）が認められたので、Ｉ Ｌ−２の８４％がビーズに結合しｌ；ことが判明しｌ；。

実施例１１ サイトカインの遊離カルボキシル基を介する１、１２−ジアミノドデカン連結ア ームによるポリビード（商標）カルボキシレートミクロスクエア（９，６７μｍ ）へのＩＬ−２の結合下記の方法により、サイトカインの遊離カルボキシル基を 介する１、１２−ジアミノドデカン連結アームにより、水溶性カルボジイミドを 使用して、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｈａ−１２５類似体）をポリビー ド（商標）カルボキシレートミクロスクエア（９，６７μｍ）へ固定化しｔ；。

カルボキシレートミクロスフェア（９，６７ａｍ＞の０．２５ｍ１から得られた ベレットを、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、実施例９で 報告したように１．１２−ジアミノドデカン／ＥＤＣＩと反応した。室温で１８ 時間混合したのち、反応混合物を遠心し、上溝を捨てた。修飾したビーズをＰＢ Ｓ（ｐＨ７，４０，３Ｘ　１．０ｍ１）で完全に洗浄し、ＰＢＳ　０．４ｍｌに 再懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２４１μｇ１活性３６００００単位）０． １ｍｌ、ついでＥＤＣＩ　５．０ｍｇで処理し、１夜室温で混合した。反応混合 物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。

ベレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最 初の上溝へ追加した。ついでビーズを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ１、ｏ＋ｎｌに懸濁し 、室温で３０分間混合した。混合物を遠心し、上溝を捨てた。ベレットをＢＳＡ ／ＰＢＳ溶液（３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、最後に貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍｌに懸 濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上溝に存在するＩＬ−２活性の測定で８３４ 単位の活性（もとの活性の０．２％）が認められたので、ＩＬ−２の９９．８％ がビーズに結合したことが判明した。

実施例１２ １．１２−ジアミノドデカン連結アームによるポリエチレングリコールで修飾し たＩＬ−２のポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μ ｍ）への結合組換え体ＩＬ−２（アムジエン、ａｌａ１２５類似体）をメトキン ポリエチレングリコール−Ｎ−スクシンイミジルグルタレート（分子量４８００ ）［アブコアスキーら、キャンサー・）くイオケミストリー・アンド・バイオフ ィジックス、１巻、１７５頁（１９８４年）〕の！θ倍モル過剰と、説明のため 本明細書に包含させたカトレおよびナウフｌ二よって報告された方法ｌｆｆ１際 特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１２５２号（ｌ際特許公報番号ＷＯ８７１０ ＯＯ５６号）］に従って反応した。修飾したＩＬ−２は、溶出液としてＰＢＳ　 （ｐＨ７，４０）　を使用ｔ６ｚ＜イオー’ｆルＰ−１ｏカラＡ＋＝よるサイズ 排除クロマトグラフィーにより精製した。この実験に使用した精製カラム画分は 緩衝液１ｍｌ当たり７６４０００単位のＩＬ−２活性を含有していた。

１．１２−ジアミノドデカン速結アームを使用して、下記の方法によりて、修飾 したｒＬ−２をポリビード（商ＩＩ）カルボキシレートミクロスフェア（９，６ ７μｍ）へ固定化した。カルボキシレートミクロスクエアの０．１５ｍ１から得 られたペレットを、実施例９で報告した方法に従いＥＤＣＩの存在で１．１２− ジアミノドデカンと反応させた。室温で１８時間混合したのち、反応混合物を遠 心し、上溝を捨てた。ついで修飾したビーズをＰＢＳ　（ｐ）（７，４０，３Ｘ １．０ｍ１）で完全に洗浄し、ＰＢＳ　０．３ｍｌに再懸濁し、修飾したＩＬ− ２の溶液（活性２２９０００単位）　０．３ｍｌ、　ツい”ｃ’ｉ：Ｉ）Ｃ１０ ，０ｍｇで処理し、１夜室温で混合した。スラリーを遠心し、上滑を注意深く取 り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心しｔ； 。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ　１ ．ＯｍＨ：：懸濁し、室温で３０分間混合した。混合物を遠心し、上溝を捨てた 。ペレットをＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、最後に貯蔵用緩 衝液０．５ｍｌに懸濁して、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ− ２活性の測定で５０９単位の活性（もとの活性の０．２％）が認められたので、 ＩＬ−２の９９．８％がビーズ！＝結合したことが判明し−た。

実施例１３ ポリビード（商標）アミノミクロスフェアへのＩ　Ｌ−２の結合組換え体ＩＬ− ２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を２価性アルデヒドを使用して、下記 の方法により、５，２９μｍポリビード（商ＩＩ）アミノミクロスフェア（ポリ サイエンシズ、アミノ官能化したポリスチレン）へ固定化した。ポリビードアミ ノミクロスフェアの０．２５ｍ１−アリコートから得られたペレットをＰＢＳ　 （３ＸＯ、５ｍｌ）で洗浄し、実施例１で報告した方法に従い、８％グルタルア ルデヒドのＰＢＳ溶液０．７ｍｌで活性化した。ビーズをＰＢＳ（３Ｘ０．５ｍ １）で洗浄したのち、ＰＢＳ　０．４ｍＪＪ二懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ −２１００μｇ、活性７５００００単位）０．１１１１１で処理した。混合物を 室温で１夜温合した。ついで反応混合物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存し た。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り 、最初の上清へ追加した。実施例１で報告したようにビーズを処理し、貯蔵用緩 衝液０゜５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上溝に存在するＩＬ−２ 活性の測定で４４５０００単位の活性（もとの溶液の５．９％）が認められたの で、ＩＬ−２の９４．１％がビーズに結合したことが判明した。

実施４Ｒ１４ ６−アミノカプロン酸スペーサーアームによるセファデックス（商標）−Ｇ−１ ０粒子（４０−１２０μ１ｍ）　へのＩＬ−２１７）ｍ６組換え体ＩＬ−２（ア ムジェン、ａｌｔ−１２５類似体）を、下記の方法により崩壊性セファデックス （商標）−Ｇ−１０樹脂粒子（７ｙ−マシ７．　ピＺヵタ９ニー、ＮＪ、架橋し たデキストラン粒子、４０−１２０μｌ１１）へ６−アミノカプロンｒｓ逼結ア ームで固定化した。水７．５ｍｌに充填した湿潤セファデックス（商標）Ｇ−１ ゜樹脂の約７．５ｍｌのスラリーを、公開された方法［説明のため本明細書に包 含させたＰ、キュアトレヵサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー、２４５巻、３ｏ５９頁（１９７０年）参照］に従い臭化シアン（ＣＮＢｒ ）ｌ−５ｇで活性化した。活性化ののち、樹脂を速やかに濾過し、冷０．２Ｍホ ウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）１００＋ａｌで洗浄し、これを１．ＯＭ　 ６−アミノカプロン酸の０．２Ｍホウ酸ナナトリウム溶液ｐＨ９，０）５０ｍｌ へ加えた。混合物を室温で２０時時間音した。濾過によつて樹脂を採取し、Ｈ□ Ｏ約２０１）＋１で洗浄し、高真空下で４８時間乾燥した。

乾燥樹脂のｌｏｎｇ部をＰＢＳ　１．０ｍｌで２４時間膨潤させた。ついで懸濁 液を遠心し、上溝を捨て、ＰＢＳ　（３Ｘ　１．ｏｍ＋）で樹脂を洗浄した。ペ レットをＰＢＳ　Ｏ，４ｎ＋１に懸濁し、ＩＬ−２の水溶液０．１ｍ１（ＩＬ　 ２　１００μｇ１活性７５００００単位）、ついでＥＤＣＩ　３．０ｍｇで処理 し、室温で１夜混合した。実施例１で報告したように樹脂を処理し、貯蔵用緩衝 液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ−２活 性の測定で８５２１位の活性（もとの活性の０．１％）が認められたので、Ｉ　 Ｌ−２の９９．９％が樹脂に結合したことが判明しｔ；。

実施例１５ １．６−シアミツヘキサン／グルタルアルデヒド連結アームによるセファデック ス（商標）−Ｇ−１０粒子へのＩＬ−２の結合組換え体ＩＬ−２（アムジェン、 ａｌａ−１２５類似体）を、下記の方法により、崩壊性セファデックス（商標） −Ｇ−１０粒子へ１．６−ヘキサンジアミン／グルタルアルデヒド連結アームで 固定化した。充填した湿潤セファデックス（商標）Ｇ−１０樹脂（約７゜５　ｍ ｌ）を、実施例１４で報告した方法に従いＣＮＢｒで活性化した。

ついで洗浄した活性化樹脂を、１．ＯＭ　１．６−ヘキサンジアミンの０．２Ｍ ホウ酸ナナトリウム溶液ｐＨ９，０）５０ｍｌへ加えた。スラリーを室温で２０ 時間混合した。濾過によって樹脂を採取し、Ｈ２Ｏ２００１１１１で洗浄し、高 真空下に４８時間乾燥しＩ；。乾燥樹脂の１０ｍｇ部を実施例１２で報告したよ うに膨潤させ、洗浄した。実施例８で報告したようにベレットを８％グルタルア ルデヒドのＰＢＳ溶液１．０ｍｌで活性化した。活性化ののち、スラリーを遠心 し、上溝を捨て、もう一度ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄しｔ； 。

活性化しｆ：樹脂をＰＢＳ　０．４ｍｌに懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２ １００μｇ１活性７５００００単位）Ｏ，１ＩＩｌで処理しｔ；、混−金物を室 温で１夜混合することにより反応させた。ついでスラリーを遠心し、上溝を注意 深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０゜５ｍｌに再懸濁し、懸濁液を遠心 した。上溝を取り、最初の上溝へ加えた。ついで実施例１と同様に樹脂を処理し 、貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上溝に残存し ているＩＬ−２活性の測定で２９８００単位の活性（もとの活性の４．０％）が 認められたので、ＩＬ−２の９６．０％が樹脂に結合したことが判明した。

実施例１６ 青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）　ヘノＩ　Ｌ　−４の結 合 組換え体ｒＬ−４（アムジェン、天然配列）を９．６４μｍの青色色素で染めた ポリスチレンビーズへ下記の方法により固定化した。

青色色素で染めたビーズの２．５％懸濁液の０．２５ｍ１から得られｊ：ベレッ トをＰＢＳ　（ｐＨ７，４，３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、ついで実施例１で報告 したようにグルタルアルデヒドで活性化した。ついでＩＬ−４１０，０μｇを含 有する商業的なＩＬ−４製剤（活性２Ｘ１０Ｓ単位）および０．０２５％ヒト血 清アルブミン（ＨＳ　Ａ）のＰＢＳ溶液１．０ｍｌにビーズを懸濁した。反応混 合物を室温で１夜混合しｔ；。結合反応のあと、ビーズを実施例１と同様に処理 し、ついで貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で保った。上記の 結合反応から得られた上清に存在するＩＬ−４活性の測定は、定量化可能な検定 方法がないため、測定できなかった。

実施例１７ 青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）へのＩＬ−６の結合 組換え体ＩＬ−６（アムジェン、天然配列）を９．６４μｍの青色色素で染めた ポリスチレンビーズへ下記の方法により固定化した。

青色色素で染めたビーズの２．５％懸濁液の０．２５ｍ１から得られたべＬ／７ トをＰＢＳ　（ｐＨ７，４，３Ｘ　ｌ　、０ｍ１）で洗浄し、ついで実施例１で 報告したようにグルタルアルデヒドで活性化した。ついでＩＬ−６１０，０μｇ を含有する商業的なＩＬ−６製剤（活性１〜２Ｘ１０’単位）および０．０２５ ％Ｈ３ＡのＰＢＳ溶液１．０ｍｌにビーズを懸濁した。反応混合物を室温で１夜 混合した。結合反応のあとビーズを実施例１と同様に処理し、ついで貯蔵用緩衝 液０．５ＩＩｌに懸濁し、使用時まで４℃で保った。上記の結合反応からの上溝 溶液のＩＬ−６活性の検定は、好適な指示細胞系がないため定量化できなかった 。

実施例１８ ネズミ顆粒球−マクロファージコロニー促進因子の青染色ポリスチレンビーズ（ ０，９３μｍ）への結合 組換え型ネズミ顆粒球−マクロファージコロニー促進因子（ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ、 アムゲン）を以下の方法で０．９３μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。

０．９２μｍ青染色ビーズの２゜５％懸濁液の０．２５ｍ１から得たペレットを ＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で洗い次いでゲルタールアルデヒドで 活性化し、以下、実施例２ｊ；記載した方法で処理した。次いでビーズを、５． ０μｇの成長因子（活性５Ｘ１０”単位）及びＰＢＳ中、０．０２５％ＢＳＡを 含む０．５ｍｌの市販ｒＭｕＧＭＣＳＦ処方中に懸濁した。反応混合物を一夜、 室温で混合しｔ；。次いで、最終洗浄し、ビーズを０．５ｍｌの貯蔵緩衝液中に 懸濁し、使用するまで４℃で保持した。上溝溶液のｒＭｕＧＭＣ５Ｆのアッセー は、指標細胞系が入手できないために定量化ができなかつに。

実施例１９ ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子の青染色ポリスチレンビーズ（０ ，９３μｍ）への結合 組換え箆ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子（ｒＨｕＧＭＣ３Ｆ、ア ムゲン）を以下の方法で０．９３μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。０ ．９３μｍ青染色ビーズの２．５％懸濁液の０．１２５ｍ１から得たペレットを ＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、次いで実施例２に記載した ようにタルメタルアルデヒドで活性化した。次いでビーズを、３．０μｇの成長 因子（活性１２０゜０００単位）とＰＢＳ中０．０２５％Ｈ５Ａを含む０．６ｍ ｌの市販「ＨｕＧＭＣ５Ｆ処方に懸濁した。反応混合物を一夜、室温で混合した 。

・次いで最終洗浄し、ビーズを０．５ｍｌの保存緩衝液に懸濁し、使用するまで ４℃に保持した。上清溶液のＧＭＣ５Ｆアツセーは４６単位（元の０．０４％） を明らかにし、ヒトＧＭＣ５Ｆの９９．９％がビーズに結合したことを示した。

実施例２０ Ｉ　Ｌ−３の青染色ポリスチレンピーズ（９，６４μｍ）への結合組換えｇｌＬ −３（アムゲン、天然配列）を以下の方法で９．６４μｍ青染色ポリスチレンビ ーズに固定した。青染色ビーズの２．５％懸濁液の０．２５ｍ１から得たペレッ トをＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ１゜０ｍ１）で洗浄し、グルタルアルデヒドで 活性化し、以下、実施例１に記載した手段で処理した。次いでビーズをＱ、４＋ ＋＋１のＰＢＳで懸濁し、２０μｇｌＬ−２（活性２Ｘ１０＠単位）及びＰＢＳ 中０．０２５％）（ＳＡを含むＱ、１ｍｌの市販ＩＬ−３処方で処理しｔ；。反 応混合物を一夜、室温で混合した。処理後、ビーズを０．５ｍｌの貯蔵緩衝液に 懸濁し、使用するまで４℃で保持した。上溝液のＩＬ−３活性アツセーは１４． １４４単位（元の０．７０％）を明らかにし、９９゜３％の！Ｌ−３がビーズに 結合したことＳ示した。

実施例２１ ９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズ、０．９３μｍ青染色ポリスチレンビー ズ；９．６７μｍカルボキシレートポリスチレンビーズ；６−アミノカプロン酸 、１．６−ジアミツヘキサン及び１．１２−ジアミノドデカン結合手をもつ９． ６７μｌカルボキシレートポリスチレンビーズｉ１．１２−ジアミノドデカン結 合手をもつ６５μｍカルボキシレートポリスチレンピーズ、５．２９μｍアミノ ポリスチレンビーズ；及びセファテックス（商標）Ｇ−１０ポリデキストランビ ーズ（実施例１．２．６．７．８．９．１３．１４及び１５参照）に固定化した 組換え型ＩＬ−２（Ａｌａ−１２５同族体）の試料を、固定したＩＬ−２がＩＬ −２保存細胞系ＣＴＬＬ−２、細胞傷害性Ｔ−リンノく球細胞系のインビトロ成 長を支持するか否かを測定するため試験しｔ二。

固定化ＩＬ−２を含むビーズの試料を、ベックマン・マイクロフェーダ中、４％ 抗生物質（ファンジーバクト・ソリューシ冒ン、アーヴイン・サイエンティフィ ック、サンタ、アナ、カリホルニア）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中 、懸濁及び遠心により３回洗浄した。ＩＬ−２［！ｉ定化ビーズをＲＰＭＩ−１ ６４０培地中ｌ；再び懸濁し、インビボ生成試験に用いた。ビーズのアリコツト を９６−ウェル平底組織培養板（ファルコン＄３０７５、ベクトン・デイキンノ ン・アンド・コンパニイ、ラザフオード・二ニージャーシイ）の個々のウェルに 加え、次いでｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＣＴＬＬ−２細胞（アメリカン・タイプ・カルチ ャー・フレクション、ロツクヴイル、メリーランドから得たＩＬ−２成長依存細 胞系（ＴＩＢ−２１４））を添加しｔ；。固定化ＩＬ−２を伴うセファデックス （商標）Ｇ−１０ビーズは非常に不規則に形作られ、非常に速く沈澱するのでビ ーズ／細胞数を正確に測定することは不可能であった。従って、一定容量の新し くポルテックス処理したビーズを実験に用いた。ＩＬ−２固定化ビーズとＣＴＬ Ｌ−２細胞を５％ＣＯ３雰囲気で３７℃インキュベーター中４８時間インキュベ ートした。４８時間後、１μＣ１の［３Ｈ］−ニミジン＜ＩＣＮ／＜イオメディ カルス・インコーポレーション、アーヴイン、カリホルニア）を加えて、混合物 をさらに４時間インキュベートした。細胞をスカトロン細胞集器で集めて液体シ ンチシー／ヨン計数管で計数し、［３Ｈ］−チミジン結合により測定された通り に細胞成長の量が測定された。結果は表３に報告され、全ての上記固定化Ｉ　Ｌ −２組合わせはＣＴＬＬ−２細胞成長を支持することを示す。

実施例２２ 固定化ＩＬ−２（組換えを天然配列）を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長 ９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した組換え型天然配列ＩＬ−２を 、ＩＬ−２依存細胞系ＣＴＬＬ−２のインヒドロ成長を支持するかを測定するた めに試験した。組換え型天然配列ＩＬ−２を実施例５に記載しｔ；ように９．６ ４μｍビーズ固定した。ＩＬ−２固定化ビーズを実施例２１に記載したように洗 浄しアッセーツした。結果は表４に報告され、固定化組換え型天然配列ＩＬ−２ がＣＴＬＬ−２細胞系を支持することを示す。

実施例２３ 固定化Ｉ　Ｌ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長：カルボキシ基対アミン基付 着 カルボキシ基を経てＩＬ−２に付着した１、１２−ジアミノドデカンスペーサー 腕で９．６７μｍカルボキンレートビーズに固定した組換え方ＩＬ−２（ａｌａ −１２５同族体）を、ＩＬ−２依存細胞系ＣＴＬＬ−２のインビトロ成長を支持 するか否かを測定するために試験した。組換え型ＩＬ−２を、実施例１１に記載 したようにＩＬ−２分子上のカルボニル基によって１．１２−ジアミノドデカン スペーサーをもつ９，６７μｍカルボキシレートビーズに固定した。固定化Ｉ　 Ｌ−２ビーズを実施例２１に記載したように洗浄してアッセーした。ＩＬ−２上 のカルボキシル基によって固定したＩＬ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長は 、（実施例１に記載されるように）ＩＬ−２上のアミン基によって固定したＩＬ −２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長と比較した。結果は、表５に報告され、カ ルボキシル基によってビーズに着付したＩＬ−２はＣＴＬＬ−２成長を支持し、 アミノ基によってビーズに付着したＩＬ−２よりも活性であることを示す（図１ 参照）。

実施例２４ 固定化ポリエチレングリコール修飾ＩＬ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長 １．１２−ジアミノドデカンスペーサー基をもつ９．６７μｍカルボキシレート ポリエチレンビーズに固定した化学的に修飾しｔ；（ポリエチレングリコール） 組換え型Ｉ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）を、Ｉ　Ｌ−２依存細胞系ＣＴ ＬＬ−２のインビトロ成長を支持するか否かを測定するために試験した。ＩＬ− ２を実施例１２で略述した方法に従って化学的に修飾し、固定しＩ；。固定化、 化学的修飾ＩＬ−２ビーズを実施例２１に記載されるように洗浄し、アツセーし た。

細胞成長の結果は表６に示され、ＰＥＧ−ＩＬ−２ビーズがＣＴＬＬ−２成長を 支持することを示す。

実施例２５ ＣＴＬＬ−２細胞の成長に対する固定化組換え型］Ｌ−２の濃度依存 ポリスチレンビーズに固定した組換えｆｆ１ｌ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族 体）の濃度（単位／ｍｌ又はｍｇ／ｍｌ）の、ＣＴＬＬ−２細胞の成長に対する 影響を試験した。組換えｑ■Ｌ−２を実施例４に記載されるように９．６４μｍ 胃染色ポリスチレンビーズに固定した。これらのビーズを実施例２１に記載され るように洗浄し、固定した。細胞当リｌ及びｌＯビーズの濃度を用いた。これら の条件下、ＣＴＬＬ−２細胞の成長は濃度依存を測定した（図２参照）。

実施例２６ 固定化！Ｌ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長対時間固定化組換え型ＩＬ−２ （ａｌａ−１２５同族体）に対するＣＴＬＬ−２細胞の成長を時間の関数として 測定し、可溶性ＩＬ−２に対するＣＴＬＬ−２細胞の成長と比較した。組換え型 ＩＬ−２を実施例１に記載したように９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズに 固定した。Ｉ　Ｌ−２固定化ビーズのアリコツト（１，５及び１０ビーズ／細胞 ）を、９６−ウェル平底組織培養板の各ウェルに加え、次いでｌＸＩ　Ｏ’ＣＴ ＬＬ−２細胞（ＩＬ−２成長保存細胞系）を添加した。

固定化Ｉ　Ｌ−２含有ビーズ及びＣＴＬＬ−２細胞を、５％ＣＯ，雰囲気で３７ ℃インキュベーターで種々の時間インキュベートした。

各時間の終りにｌμＣｉの［”Ｈ］−チミジンを加えて混合物をさらに４時間イ ンキュベートした。細胞をスカトロン細胞収集器を用いて集めて液体シンナレー ション計数管で計数してｍ胞成長を測定した。

結果は、溶融Ｉ　Ｌ−２（１００単位／＋＋＋１及び１０００単位／ｍｌ）を用 いる分析の結果と共に図３にグラフで示す。これらの結果は、固定化Ｉ　Ｌ−２ を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長は、対照、即ち可溶性ＩＬ−２を用いるＣＴＬ Ｌ−２細胞の成長と匹敵するか、又はより優れていたことを示す。ｌビーズ／細 胞で、成長は、２４ないし１２０時間帯で可溶性ＩＬ−２はど劇的でないが、成 長は１６８時間まで安定を保つ。

実施例２７゜ 循環ＩＬ−２固定化ビーズに対するＣＴＬＬ−２細胞の成長９．６４μｍ青染色 ポリスチレンビーズに固定した組換え２１Ｌ−−２を、実施例１に記載したよう に製造し、実施例２１に記載したように洗浄した。これらのＩＬ−２固定化ビー ズは、再使用され、長期間細胞培養を維持する能力について試験した。ＩＬ−２ 固定化ビーズのアリコツトを無菌１．５ｍｌねじ込み口金マイクロ７ユーグ管（ サーステッド・インコーホレーテッド、プリンストン、ニュージャーシイ）ニ加 え、］ＸＩＯ’ＣＴＬＬ−２細胞とインキュベートし、５％ＣＯ！雰囲気で３７ ℃インキュベーターで７２時間インキュベートした。培地の幾つかにｌμＣｉの ［３Ｈ］−チミジンを加えて、混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞 をスカトロン細胞収集器によって集め液体シンチシーシｎン計数管で計数して細 胞成長を測定した。残る培養物をベツクマンマイクロフユーグで５分遠心分離し 、上清を除去した。次いでこれらの培養物を、４％抗生物質を含む１ｍｌのＲＰ ＭＩ−１６４０組織培地で５回洗浄し、激しくかき回し、遠心分離した（この操 作は、９０％以上の細胞を除去する）。

５回目の洗浄後、Ｉ　Ｌ−２固定化ビーズを新しい培地に再び懸濁し、新しいＣ ＴＬＬ−２細胞を加えて２時間成長循環を繰り返した。この操作は数回繰り返し た。結果は表７に示され、これは、ＩＬ−２固定化ビーズがＣＴＬＬ−２細胞の 成長を４つの７２時間成長サイクルを支持したが、一方可溶性ＩＬ−２は２サイ クルの有意なＣＴＬＬ−２成長を支持したにすぎなかったことを示す。

実施例２８ 固定化、ｍｅえ型ＩＬ−２１：対するヒト末梢血リンパ球の成長固定化組換え型 Ｉ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）に対するヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ’ Ｓ）の成長を試験した。組換え型」Ｌ−２を実施例１に記載したように９．６４ μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ＩＬ−２ビーズを実施例２１ に記載したように製造して、以下の実験に用いた。ＰＢＬ″Ｓを以下の方法によ り健康なドナーから分離した。リンパ球を、Ｌｅｕｃｏ　ＰＲＥＰ（ベクトン・ ディキンノン・アンド・コンパニー）細胞分離培地越えに遠心分離後、ヘパリン 添加血液から分離した。粗リンパ球調整物を、４％抗生物質及び５％ヒトＡＢ血 清（熱不活性化、ノース・アメリカン・バイオロジカルス、インコーホレイテッ ド　マイアミ、フロリダ）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地で遠心分離す ることにより３回洗浄した。２Ｘ１０５ＰＢＬ’Ｓを種々の濃度のＩＬ−２固定 化ビーズに加えた。細胞を５％ＣＯ８雰囲気で３７℃インキュベーター中種々の 時間でインキュベートした。各時間の終わりに、ｌμＣｉの［”Ｈ］−チミジン を加えて混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞をスカトロン細胞収集 器により収集して液体シンチレ−シーン計数管で計数して細胞成長を測定した。

結果は図４にグラフで示す。本実施例は、固定化ＩＬ−２を用いるＰＢＬ’Ｓ成 長、及びＰＢＬ’Ｓの成長が対照の可溶性ＩＬ−２と、特に７２時間培養後、等 しいかより良好であることを示す。

実施例２９ 可溶性組み換え！Ｌ−２または固定化Ｉ　Ｌ−２により誘起されたＬＡＫ細胞活 性 固定化組み換えＩ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）上で成長させたヒトＰ　 Ｂ　Ｌ’ｓを、それらがリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を示すか どうかにつき測定した。ヒトＰ　Ｂ　Ｌ’Ｓは実施例２８に記載されるとおりに 単離し、実施例１記載のとおり調製したＩＬ−２固定化ビーズで９６時間活性化 し、実施例２１記載のとおり洗浄した。ＬＡＫ細胞の死滅作用は、作用標的に５ ６２．ラジおよびダウディを用いて検定した。ＬＡＫ細胞死滅検定には、文献に 報告され、ている４時間”Ｃｒ放出検定を用いた。Ｔ、Ｌ、ホワイトサイドら、 キャンサー・イムツール、イム／セラ、２６巻１頁（１９８８年）；Ｈ，Ｆ、プ ロスら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロジ−１巻５１頁（１９８１年 ）参照。新鮮なＰＢＬ’ｓから単離された正常ＮＫ（ナチュラル・キラー）細胞 はに６５２細胞を死滅するが、ラジまｔ；はダウディ細胞が活性化状態にある時 はそれらを死滅しない。結果は表８に示す。ＩＬ−２固定化ビーズが活性化しｒ ＝　Ｌ　Ａ　Ｋ細胞は、Ｋ２Ｏ２、ラジおよびダウディ細胞を死滅させた。死滅 作用は可溶性Ｉ　Ｌ−２活性化ＬＡＫ細胞と同等であった。

実施例３０ 固定化ＩＬ−２により誘起されるＮ　Ｋ／Ｌ　Ａ　Ｋ活性９．６４μ「青色染色 ポリスチレンビーズ（実施例１）および６５μｍポリスチレンビーズ（５！施例 １０）上固定した組み換えＩＬ−２（ａｌａ−１２５同族体）を、エクソ・ビポ 実験でそれらがネズミのリンノ（球を刺激し、標的セルラインのナチュラル・キ リング（ＮＫ）またはリンホカイン活性化キリング（ＬＡＫ）を増加したかどう かにつき測定した。すなわち、エクソ・ビポ実験は、固定化ＩＬ−２ビーズが、 可溶性ＩＬ−２がイン・ビボでＬＡＫ細胞の産生を活性化できるのと同じ方法で 、宿主の免疫系を活性化できた場合に実施し測定しｔ；。

実験は以下のように行った：成熟Ｂａ１ｂ／ｃ雄マウス（３群、１７週齢）に、 ＰＢ５２００μ１１可溶性組み換えＩＬ−２５００００単位、９．６４μｍ青色 ビーズ（５！施例１）に固定したＩＬ−２２０００００単位または６５μｍビー ズ（実施例１０）に固定しｆ：　Ｉ　Ｌ　−２１ｏｏｏｏｏ単位を腹腔内注射し た。９６時間後、腹腔および牌臓から細胞を採取し、ＮＫ／ＬＡＫ細胞活性を検 定した。牌細胞は、Ｍ。

Ｈ，ザローキアンら、イムツール、インペスト、１５巻８１３頁（１９８６年） およびＣ，Ｗ、ギルバートら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１４０巻２８２ １頁（１９８８年）に報告されているように、新鮮な牌臓から調製した。ＮＫ／ ＬＡＫ細胞活性は、”Ｃｒの４時間放出検定により検定したが、これも上記の参 考文献に報告されている。エクソ・ビポ実験の結果は表９にまとめている。この 結果より、可溶性ＩＬ−２は、予想通り、ネズミ牌細胞を活性化し、６５μｍビ ーズに固定したＩ　Ｌ−２は、腹腔内でＬＡＫ細胞を活性化することが示唆され ている。腹腔内のＬＡＫ細胞活性は局在化してｌ／するようであり、癌の局部処 置の治療に有効である。

実施例３１ 固定化組み換えＩＬ−４におけるヒト末梢血リンノく球の成長組み換えＩＬ−４ は、実施例１６記載のとおり９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定し た。固定化ＩＬ−４ビーズは実施例２１記載のとおり洗浄し、ＰＨＡ（フィトヘ マグルチニン）共刺激実験に用いてＴ細胞増殖を誘起した。末梢血リンパ球は、 健常提供者より採取した。Ｔ細胞に富んだ分画を、ヘパリン他車から単離しフィ コール・グラジェント（ＬＳＭ、　リンパ球分離用溶媒、オルガノン・テクニカ ・コーボシーシ蔚ン、デュルハム、ＮＣ）から分離したリンパ球より単離した。

粗いリンパ球は、プラスチック製組織培養フラスコ中、３７℃で、加熱して不活 性化した５％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０溶媒中で１時間加温し、単 球およびその他の共刺激Ｔ細胞増殖検定に干渉する粘着性細胞を除去した。この 段階は２回繰り返した。Ｔ細胞に富む非粘着性リンパ球は、ＰＨＡ共刺激増殖検 定で使用した。各ウェルに１×１０″セルを加え、さらに可溶性ＩＬ−４Ｃ１０ ０単位／ｍｆｆ）、ＰＨＡ（０，０５，ｐｇ／ｍＱ）、ＰＨ八へ可溶性ＩＬ−４ （１００単位／ｍＱおよび１単位／ｄ）またはＰＨＡ＋ビーズに固定したＩＬ− ４（初期濃度０．５および１ビーズ／セル）を加えて３７℃で９６時間加温した 。９６時間後、培養を［Ｈ”１−チミジンで４時間パルス化し、Ｔ−細胞増殖を 測定した。結果は表１Ｏにまとめたが、固定化ＩＬ−４ビーズはＴセル増殖を刺 激し、背景の準至適ＰＨＡ値を越すことが示唆される。

実施例３２ 固定化組み換えＩＬ−６におけるヒト末梢血リンパ球の成長組み換え！Ｌ−６は 、実施例１７に記載のとおり、９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定 した。固定化Ｉ　Ｌ−６ビーズは、実施例２１に記載のとおり洗浄し、ＰＨＡ（ フィトヘマグルチニン）共刺激実験に用い、Ｔ細胞増殖を誘起した。末梢血りン バ球は健常提供者より採取した。Ｔ＃！１胞に富む分画は、ヘパリン他車から単 離、しフィコール・グラジェント（Ｌ　Ｓ　Ｎ、　リンパ球分離溶媒）で分離し たリンパ球より単離した。粗リンパ球は、プラスチック製培養フラスコの中で、 加熱して不活化した５％ヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭｒ−１６４０中３７℃で １時間加温し、単球およびその他の共刺激Ｔ細胞増殖検定に干渉する粘着性細胞 を除去した。この段階は２回繰り返した。Ｔ細胞に富む非粘着性リンパ球を、Ｐ ＨＡ共刺激増殖検定に用いた。ｌＸｌ０’セルを各ウェルに加え、さらに無添加 、可溶性ＩＬ−６（ｔｏｏ単位／ａ＋１２）、ＰＨＡ（０，０５ｍｇ／ｍ１２） 、ＰＨＡ十可溶性ＩＬ−６（１００単位／ｍＱ８よびｌ単位／ｍ（２）、または ＰＨＡ＋ビーズに固定したＩＬ−６（初期濃度０．５および１ビーズ／セル）を 加え、９６時間３７℃で加温した。９６時間後、培養は［３Ｈ］−チミジンで４ 時間パルス化し、Ｔ細胞増殖を測定した。結果は表１１にまとめたが、固定化Ｉ Ｌ−６ビーズはＴセル増殖を刺激し、背景の準至適ＰＨＡ値を越すことが示唆さ れる。

実施例３３ 固定化組み換えヒトＧＭＣ５ＦにおけるＡＭＬ−１９３細胞の成長 ０．９３μ纜責色染色ポリスチレンピーズに固定した組み換えヒトＧＭＣ５Ｆ（ ｒＨｕＧＭＣ５Ｆ）は、イン・ビトロでＧＭＣ５Ｆ依存性セルラインＡＭＬ−１ ９３の成長を保持するかどうかにつき、測定した。組み換えヒトＧＭＣ５Ｆは実 施例１９記載のとおり０．９３μｍ青色染色ビーズに固定した。固定化組み換え ヒトＧＭＣ５Ｆビーズは実施例２１記職のとおり洗浄した。ＡＭＬ−１９３セル ラインの成長検定は以下のとおりであった：洗浄したビーズは、９６ウ工ル平底 組織培養プレートの各ウェルに加え、続いて１Ｘｌｏ’ＡＭＬ−１９３細胞（ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ謄ン、ロックビル、ＭＤから入手した ＩＬ−３／ＧＭＣ５Ｆ依存性セルライン）を加えたｒＨｕＧＭＣ３Ｆを固定した ビーズはＡＭＬ−１９３細胞と一緒に、５％Ｃ０２雰囲気下３７℃で１１６時間 加温した。

１１６時間後、１μＣｉの［ＩＨ］−チミジンを加え、混合物をさらに４時間加 温した。細胞は、実施例２１記載のとおりに収集した。結果は表１２にまとめｔ ；が、固定化組み換えヒトＧＭＣ３ＦはＡＭＬ−１９３細胞の成長を保持するこ とが示唆される。

実施例３４ 固定化１１１ｈ換工Ｉ　Ｌ　−３ニ＃ｌｔ６　ＡＭＬ　−１９３１ＨＭ１ｔｌ） 成長９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−３は、 イン・ビトロでＩＬ−３／ＧＭＣ３Ｆ依存性セルラインＡＭＬ−１９３の成長を 保持するかどうかにつき、測定した。組み換えＩＬ−３は、実施例２０に記載の とおり、９．６４μ回責色染色ビーズに固定した。固定化！Ｌ−３ビーズを、実 施例２１に記載のとおり洗浄し、実施例３３記載のとおり検定した。結果は表１ ３にまとめたが、固定化組み換えＩＬ−３はＡＭＬ−１９３細胞の成長を保持す ることが示唆される。

実施例３５ ＩＬ−１−βの響き染色ポリスチレンビーズ（９，６４μ＋ｅ）への結合 組み換えＩＬ−１−β（アムゲン）は、以下の方法で９．６４μｍ青色染色ポリ スチレンビーズに固定した。置き染色ビーズの２．５％懸濁液０．１５＋Ｊから 得られた塊を、ＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３×１゜０　ｍＱ）で洗浄し、次に実施 例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで活性化した。次いでビーズをＰＢＳｏ 、４６＋ｎ１２に懸濁し、ＰＢＳ中にＩＬ−１−β８．０℃ｇ（活性４ＸＩＯ’ 単位）および０．０２５％ＨＳＡを含有する市販のＩＬ−１−β調製物０−０４ ｍ０処理した。

反応混合物を室温で２４時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを実 施例１記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液（Ｌ５ｍ（ｌに懸濁し、用時まで４℃ を維持した。

実施例３６ ＩＬ−１−αの響き染色ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への付着 ヒト配列ＩＬ−１−α（ＲアンドＤシステムズ）を、以下の方法で９．６４μｍ 青色染色ポリスチレンビーズに固定した。胃色染色ビーズの２．５％懸濁液０． ２０−から得られた塊をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＸｐＨ７，４０，３Ｘ１ ．０ｍ１２）で洗浄し、次いで実施例１記載のとおり、ゲルタールアルデヒドで 活性化した。活性化したビ゛　−ズはＰＥ５０．４２ｍ（２に懸濁し、サイトカ イン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）　８　、　Ｏｐｇおよびヒト血清アルブミン（Ｈ５Ａ ）２００ｐｇをＰＢＳ中に含有する調製物０．０８ｄで処理した。反応混合物を 室温で２４時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを遠心にかけ、Ｐ ＢＳ（０、５ｍ１２）で洗浄し、次いで、実施例１記載のとおりエタノールアミ ンで処理した。次に、ビーズを０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ＰＢ Ｓ溶液で洗浄しく３Ｘ１．Ｏｍ（２）、共有結合していないサイトカイン（ｃｙ ｔｏｋｉｎｅ）の痕跡を残らず除去するよう努めた。このように洗浄した後、ビ ーズはさらに実施例１記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０．５ｄに懸濁し、用 時まで４℃を維持した。

実施例３７ 組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒＨｕＧＣＳＦ）の響き染色ポリスチレ ンビーズ（９，６４μｍ）への結合以下の方法で組み換えヒトＧＣ５Ｆ（ｒＨｕ ＧＣＳＦ、アムゲン）を、９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した 。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２０ｍ１２から得た塊をＰ　Ｂ　５（ｐ Ｈ７，４０，３ｘ］、０ｍ４）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりにゲルター ルアルデヒドで活性化した。活性化したビーズはＰＢＳｏ、３ｍ（＋に懸濁し、 ０．５μｇ（活性ｌＸｌ０’単位）の成長因子および０．０２５％Ｈ３Ａを０． ０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５、４）中に含有する市販のｒＨｕＧＣ３Ｆ調製物 ０．２−で処理しｔ；。懸濁液は室温で一晩混合した。

カップリング反応に続いて、ビーズは実施例１記載のとおりに処理し、貯蔵用緩 衝液Ｑ、５ｍ１２に懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例３８ 組み換えネズミ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＭｕＧＭＣＳ　Ｆ） の青色染色ポリスチレンビーズ（０，９３μｍ）への結合組み換えネズミＧＭＣ ＳＦ（アムゲン）は、以下の方法で０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに 固定した。青色染色ビーズの２゜５％懸濁液０−２５ｍＱから得られた塊は、Ｐ ＢＳ（ｐＨ７，４０，３×１．０ｍ１２）で洗浄は、次に実施例１および２記載 の方法で８％ゲルタールアルデヒドにより活性化した。活性化したビーズは５． ０℃ｇ（活性５Ｘ　Ｉ　Ｏ”単位）のｆｆ長因子８，１：びｏ、０２５％ＢＳＡ をＰＢＳ中に含有する市販のｒＭｕＧＭＣ５Ｆ調製物０．５０−に懸濁した。懸 濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に統いて、ビーズを実施例１ および２記載の方法で処理し、貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍ１２に懸濁し、用時まで４ ℃を維持しｔ；。

実施例３９ ｒＭｕＧＭＣ３Ｆの青色染色ポリスチレンビーズで（０，９３μｍ）への共有結 合的結合／吸着 ０．９３μｍ青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２ｍ１２の分画２個から得ら れた塊をＰ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　１−Ｏｍｆｆ）で洗浄した。１つの塊（Ｃと標識す る）を実施例１および２記載のとおり、８．０％ゲルタールアルデヒドのＰＢＳ 溶液１．０ｍ４で、室温で２０時間活性化した。別の塊（Ａと標識する）は、Ｐ ＢＳｌ、０ｍ＋２に懸濁し、これも２０時間混合した。両方の懸濁液を遠心にか け、塊はＰ　Ｅ　Ｓ（３Ｘ　１　、Ｏ＋ｎ４）で洗浄した。各々の塊をＰＢＳの ０　、１　ｔｎＱ部分に懸濁し、実施例３８で用いた市販のｒＭｕＧＭＣ３Ｆ調 製物の０．４一部分（４，０μｇ、活性４０００単位）で処理した。次に懸濁液 を室温で一晩混合し、遠心にかけ上澄を採り、貯えた。２個の塊を再度ＰＢ３０ ．５一部分に懸濁し、遠心にかけ、上澄を採り、最初の上澄に加えた（ＡＩおよ びＣＩと標識する、両者約１　、０　ｍＱ）。次いで塊を、実施例１記載のとお り０．５Ｍエタノールアミンの１．Ｑｍ１２部分で処理した。上澄（Ａ２および Ｃ２と標識する）を採り貯えた。塊は次いでＰＢＳのｌ。

Ｏ一部分に懸濁し、遠心にかけ、上澄（Ａ３およびＣ３と標識する）を採り貯え た。塊は０．１％ＳＤＳ／ＰＢＳの１．ＯｍＱ部分に３回懸濁し、１時間混合し 、遠心にかけ、上澄（各々Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６と標識する ）を採り、貯えた。塊をＰＢＳの１０ｍＭ部分で洗浄し、上澄（Ａ７およびＣ７ と標識した）を採り、貯えた。塊は実施例１に記載のとおり１％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ 　Ｂ　Ｓで処理し、種々の上澄（各々Ａ８、Ａ９、Ａｌ０１Ｃ８、Ｃ９およびＣ ＩＯと標識する）を採り、貯えた。最後にビーズを貯蔵用緩衝液０．５ｄに懸濁 し、上澄と一緒に用時まで４℃を維持した。

実施例４０ 組み換えヒトインスリン様成長因子Ｉ（ｒＨｕＩＬＧＦ−１）の胃色−染色ポリ スチレンビーズ（９，６４μｍ）への結合、組み換えヒトインスリン様成長因子 Ｉ（ｒＨｕｌＬＧＦ−Ｉ、ツマトメディンＣ，バケムより入手）は、以下の方法 で９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２． ５％懸濁液０　、２　ｍＱから得られた塊をＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．Ｏ ｒ＋＋１２）で洗浄し、実施例１記載のとおり８．０％ゲルタールアルデヒドの ＰＢＳ溶液１．０１で活性化した。洗浄し活性化したビーズはＰＢＳＯ１４２＋ ｎＱに懸濁し、無菌水中市販の成長因子２０．０μｇを含有する溶液０．０８− で処理した。懸濁液を室温で２０時間混合した。

カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、次いで貯蔵 用緩衝液０　、５　ｍ（２に懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例４１ 組み換えヒトインスリン様成長因子１［（ｒＨｕＩ　ＬＧＦ−ＩＩ）の青色染色 ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への結合組み換えヒトインスリン様成長因 子１１（ｒＨｕｌ　ＬＧＦ−ＩＩ、バケムより入手）は、以下の方法で９．６４ μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液 ０．２−から得られた塊をＰ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　１　、Ｏｄ）で洗浄し、実施例１ 記載のとおり８゜０ゲルタールアルデヒド／ＰＢ５１．ＯｍＱで活性化した。洗 浄し、活性化したビーズはＰＢＳ０．４５−に懸濁し、無菌水中１２．５μｇの ｒＲ長因子を含有する溶液Ｑ、Ｑ５ｍｆｆで処理した。懸濁液は室温で２４時間 混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、 次に貯蔵用緩衝液０．５−に懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例４２ 組み換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−σ／カケクチン）の青色染色ポリスチレン ビーズ（９，６４μｍ）への結合組み換えヒトＴＮＦ−α（アムゲン）は、以下 の方法で９．６４μｍ青色染色スチレンビーズに固定しｔ；。青色染色ビーズの ２．５％懸濁液０．２ｍＱから得られｔ；塊はＰ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　ｌ　、ＯｍＱ ）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで活性化した。活 性化に続いて、洗浄ビーズをＰＢＳ０．４６ｍ１２に懸濁し、成長因子１９゜２ μｇ（活性１．９２Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｊｌｉ位）をｏ、０４Ｍ）　リス１０．１Ｍ塩 化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，６０）中に含有する市販の組み換えヒトＴＮＦ− σ調製物で処理した。懸濁液を室温で２４時間混合した◇カップリング反応に続 いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０　、５　ｍＱに懸 濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例４３ 線維芽細胞成長因子ベーシック（ＦＧＦｂ）の青色染色スチレンビーズ（２，８ ５μｍ）への結合 繊維芽細胞成長因子ベーンツク（アムゲン）は、以下の方法で２゜８５μｍ青色 染色ビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０　、２　ｍＱから得 られた塊はＰＢＳ（３Ｘ１．０ｍ１２）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲ ルタールアルデヒドで活性化した。活性化に続イテ、洗浄ビー、（をＰＢｓｏ、 ４４ｍｆ２ｉ：懸濁Ｌ、０−０２　Ｍ　クエ７酸ナトリウム１０．１Ｍ塩化ナト リウム緩衝液（ｐＨ５，０）中成長因子３０μｇを含有する市販のＦＧＦｂ調製 物０−０６ｍｆ２で処理した。

懸濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に統いて、ビーズを実施例 ３９記載のとおり処理し、次いで貯蔵用緩衝液０．５ｍＱに懸濁し、種々上澄と 共に、用時まで４℃を維持した。

実施例４４ 形質転換成長因子−β−２（ＴＧＦ−β−２）の青色染色ポリスチレンビーズ（ ２，８５μｍ）への結合 ＴＧＦ−β−２（ＲアンドＤシステムズ）は、以下の方法で２．８５μｍ青色染 色ビーズに固定した。置き染色ビーズの２．５％懸濁液０．２−より得られた塊 を、ＰＢＳ（３Ｘ１．０ｍ４）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタール アルデヒドで処理しｔ；。活性化に統いて、洗浄したビーズはＰＢＳｏ、３５ｍ ２に懸濁し、０．０１％トライトンＸ−１００中成長因子７．５μｇを含有する 溶液、０１５ｍｆｆで処理した。懸濁液を室温で１８時間混合しｔ；。カップリ ング反応に続いて、ビーズを実施例３９記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０゜ ５ｔｎＱに懸濁し、種々の上澄と一緒に、用時まで４℃を維持しｔ；。

実施例４５ 組り換しヒトインターフェロンーσ−２人（商標ロフエロン＝Ａ）の置き染色ポ リスチレンビーズ（２，８５μｍ）への結合組ｈ　換、ｔヒトインターフェロン −α−２Ａ（商１［ロフェロンーＡ１０ツシュ・ラボラトリーズ）は、以下の方 法で２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２ ．５％懸濁液０．２ｍＱから得られた塊は、Ｐ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　１　、ＯｍＱ） で洗浄し、次に実施例】記載のとおりゲルタールアルデヒドで処理した。洗浄し 、活性化したビーズは次いでＰＢＳ０．４ｍ１Ｂこ懸濁し、塩化ナトリウム０　 、９　ｍｇ、ＨＳ　Ａ　Ｑ　、　５　ｒｔｒｙ８よびフェノール０　、３　ｒｉ ｇを含有する市販の組み換えヒトインターフェロン−α−２Ａ水性調製物０．１ ｍ１２で処理した。懸濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に続い て、ビーズは実施例３９記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０゜５ｍ１２に懸濁 し、種々上澄と共に、用時まで４℃を維持した。

実施例４６ 組み換えヒト表皮成長因子（ｒＨｕＥ　Ｇ　Ｆ　）の青色染色ポリスチレンビー ズ（０，９３μＬｌ＋）への結合 組み換えヒトＥＧＦ（ｒＨｕＥＧＦ、アムゲンより入手）は、以下の方法で０． ９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２，５％ス ラリー〇　、　２　ｒｎＱから得られた塊をＰＢＳ（３Ｘ１　、　Ｏｍ＋２）で 洗浄し、次に実施例１８よび２記載のとおりゲルタールアルデヒドで処理した。

洗浄し活性化したビーズをＰＢＳｏ、３５ｍＱに懸濁し、次にＰＢＳ（ｐＨ７， ４０）中成長因子２５．０μｇを含有する溶液０．１５ｍＱで処理した。懸濁液 を室温で１８時間混合した。

カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１および２記載のとおり処理し、次 いで貯蔵用緩衝液Ｑ　、　５　ｌｌ１（ｌに懸濁し、用時まで４℃で維持した。

実施例４７ 組み換えヒト血小板由来成長因子（ｒＨｕＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　）の冑色染色ボリス チレンビーズ（２，８５μｍ）への結合組み換えヒトＰＤＧＦ（ｒＨｕＰＤＧＦ 、バケムより入手）は、以下の方法で２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズ に固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２−より得られた塊を、ＰＢ Ｓ（３Ｘ１．０ｍｌ２）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデ ヒドで処理した。活性化に続いて、洗浄したビーズをＰＢＳ０．３５−に懸濁し 、無菌水中成長因子１５，０μｇを含有する溶液０．１５ｍ１＋で処理した。懸 濁液を室温で２０時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１ 記載のとおり処理し、次いで貯蔵用緩衝液０　、５　ｍ（ｌに懸濁し、用時まで ４℃で維持した。

実施例４８ 組み換えヒトエリトロポイエチン（ｒＨｕＥ　Ｐ　Ｏ）のコーバインドＭ ・ウェル・ストリップスへの結合 組み換えヒトエリトロポイエチン（ｒＨｕＥＰＯ）は、０．０２５ＭＨＥＰＥＳ 緩衝液中５０％グリセロールから成る５００単位活性／ｍ１２の溶液を含有する 液体調製物として、アムゲンより入手しｔ；。

Ｍ コーバインド　・ウェル・ストリップスのストリップスは、表面を化学的に変化 （すなわち活性化）させてタンパクと共有結合するようになっており、これはマ イクロ・メンブランズ・インコーポシーティッド、ニューアーク、ニューシャー シー州より入手した。

８−ウェル・ストリップの４個のウェルは、以下のように充てんしたニ ストリップを被覆し、３５℃で３時間加温した。上澄Ａ−Ｄを採り、残存活性検 定用に貯えた。ウェルは緩衝液（２ＸＯ，１ｍＱ）で洗浄し、次に用時調製した １％ＢＳＡ／ＦＢ３０．２ｄ部分で処理し、再度３５℃で１時間加温した。これ らの上澄は捨てた。次にウェルは１％フンギゾーンを含有するＲＰＭＩ−７６４ ０組織培養溶媒で完全に洗浄（３Ｘ　０．２ｍｌ２）Ｌ、同じ液で充てんした。

ストリップは被覆は、用時まで４℃を維持しｔ；。

実施例４９ 固定化組み換えＩＬ−１−βポリスチレンビーズで刺激したＬＢＲＭ、ＴＧ６細 胞から産生じたＩＬ−２を用いたＣＴＬＬ−２細胞の成長 ９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−βは、 ミズミリンパ腫セルラインＬＢＲＭ、ＴＧ６（アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクシ薦ン・カンパニー、ロックビル、ＭＤ）のＩＬ−２合成を誘起し、そ のＩＬ−２をＩＬ−２依存性セルライン中で検定した。固定化ＩＬ−１−βビー ズは実施例２１記載のとおり、懸濁液で３回洗浄し、遠心にかけた。ＩＬ−１− βビーズは、準至適濃度のＰＨＡ［７（トヘマグルチニンＰ１ウェルカム・７ア ウンデーシＪン、ダンフォード、イングランド］（１０μｇ／ｍ（ｉ）と−緒に 、イスコブのＭＥＭ（フィタッ力−Ｍ、Ａ、バイオプロダクツ、ワルカースビレ 、ＭＤ）ｌｏｏｍ（＋中の５Ｘ１０’ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞に加え［Ｊ　、Ｗ、 ラリツクら、Ｊ、イムツール・メソッズ、７９巻３９頁（１９８５年）］、５％ ＣＯ２雰囲気下３７℃で４８時間加温した。反応は、ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞を４ ℃のところに２４時間置くことによって止めた。次にＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞上澄 ５０μＱ部分を採り、新鮮なＣＴＬＬ−２細胞５０μａに加えた。放出された可 溶性ＩＬ−２は、それがＣＴＬＬ−２，細胞の成長を保持した場合に検定して測 定した。ＣＴＬＬ−２細胞の成長は、Ｉ　Ｌ−２濃度に依存し、取り込み、およ びテトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４゜５−ジメチルチアゾール−２−イル）− ２，５−ジフェニルテトラゾリウム・ブロマイド）の酸化により測定した［Ｔ、 モスマン、ジャーナル・オブ・イムツール・メス、６５巻５５頁（１９８３年） ；並びにＭ、Ｂ、ハンセン、Ｓ、Ｅ、二−ルノンおよびに、ベルブ、ジャーナル ・オブ・イムツール・メス１１９巻２０３−２１０頁（１９８９年）］。結果は 表１４にまとめたが、ＩＬ−１−βビーズがＬＢＲＭ。

ＴＧ６細胞から可溶性ＩＬ−２の放出を活性化し、ＬＢＲＭ、ＴＧ６により放出 されたＩＬ−２がＩ　Ｌ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞の成長を保持することが示 唆される。

実施例５０ ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−ａがＬ　Ｂ　ＲＭ。

ＴＧ６のＩＬ−２産生を促す。

９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−、は、 ネズミリンパ腫セルラインＬＢＲＭ、ＴＧ６（アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクシクン）にＩＬ−２合成を促し、そのＩＬ−２をＩＬ−２依存性ＣＴＬ Ｌ−２セルラインで検定した。

ヒト配列ＩＬ−１−σを、実施例３６記載のとおり９．６４μｍ責色染色ポリス チレンビーズに固定した。固定化ＩＬ−１−σビーズを実施例２１記載のとおり ３回洗浄した。ＩＬ−１−αビーズを、ＰＨＡ［フィトヘマグルチニンＰ１ウェ ルカム・ファウンデーション、ダンフォード、イングランド］（１０μｇ／ｍの と共に、イスコブのＭＥＭ１００μ４中（７）５Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＬＢＲＭ、ＴＧ６ ４：加、ｔ、５　％　ＣＯ！雰囲気下３７℃で４８時間加温した。反応は、ＬＢ ＲＭ、ＴＧ６細胞を４℃のところへ２４時間置くことによって止めｆ：。次に、 ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞上澄５０ｐＱを採り、新鮮なＣＴＬＬ−２細胞５０μＱに 加えた。放出した可溶性ＩＬ−２を実施例４９記載のとおり検定した。結果は表 １５にまとめるが、ＩＬ−１−αビーズがＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞から可溶性ＩＬ −２の放出を活性化し、ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞により放出されたＩＬ−２はＩＬ −２依存性ＣＴＬＬ−２細胞の成長を保持することが示唆される。

実施例５１ 固定化組み換えヒ１−ＧＣ５ＦにおけるＡＭＬ−１９３細胞の成長９．６４μｍ 責色染色ポリスチレンビーズに固定しｔ；組み換えヒトＧＣＳＦ（ｒＨｕＧＣＳ Ｆ）は、イン・ビトロで成長因子（ＧＣ３Ｆ）依存性セルラインＡＭＬ−１９３ （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシラン）の成長を保持する場合に、 測定した。組み換えヒトＧＣ３Ｆは実施例３７記載のとおり９．６４μｍ青色染 色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕＧＣ５Ｆビーズを実施例２１記 載のとおり洗浄した。ＡＭＬ−１９３セルラインの成長検定は以下のとおりであ る。洗浄したビーズを実施例３３記載のとおり９６ウ工ル平底組織培養プレート の各ウェルに加え、続いてＡＭＬ−１９３細胞ｌＸｌ０’加えた。ｒＨｕＧＣＳ Ｆを固定したビーズをＡＭＬ−１９３細胞と一緒に５％ＣＯ３雰囲気下３７℃で １１６時間加温した。次いで［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ）を各ウェルに加え 、混合物をさらに４時間加温した。細胞を実施例２１記載のとおり収集した。

結果は表１６にまとめるが、固定化組み換えヒ！−ＧＣ９ＦがＡＭＬ−１９３細 胞の成長を保持することが示唆される。

実施例５２ ０．９３μｍポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭｕ ＧＭＣＳＦ）がＢＤＦ１マウスの顆粒球形成を刺激する０、９３μｍ青色染色ポ リスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣＳＦ（ｒＭｕＧＭＣＳＦ）は 、ＢＤＦ　ｌマウスの顆粒球形成を刺激する。組み換えネズミＧＭＣ３Ｆを、実 施例３８記載のとおり０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固 定化ｒ　Ｍ　ｕ　ＧＭＣ３Ｆビーズは、可溶性ｒＭｕＧＭｃＳＦと同様、注射後 のマウス末梢血の顆粒球形成を刺激する。イシダら、アクタ、ヘマトロジ力。

８巻１頁（１９８８年）は最近、可溶性ＧＭＣ３ＦＩ回注射の後、０ＭＣ３Ｆが マウス末梢血の顆粒球形成を刺激すると報告した。これらの実験を、固定化ｒＭ ｕＧＭＣ５Ｆがイン・ビポで活性である場合に、固定化ｒＭｕＧＭＣ９Ｆを用い て繰り返した。ＢＤＦ　ｌマウスに可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ（２０単位、腹腔内 注射）かまたは固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ（５０単位、血管内注射）のどちらかを 注射した。末梢血はＢＤＦｌマウスの後部眼窩洞から、０．６．１２．２４．４ ８．７２および９６時間に採取し、全血球算定から好中球数（ＰＭＮ）／ｍＩ２ を測定した。結果は図５に示したが、固定化ｒＭｕＧＭＣＳＦはイン・ビポで活 性であることが示唆される。さらに、結果よりビーズはＰＭＮの産生を数（約２ 倍増加）および速度（１２時間で最高、以ｖｋ減少し２４〜４８時間以内に初期 値に達する）において刺激し、可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆに匹敵することが示唆さ れる。

実施例５３ ０．９３μｍポリスチレンビーズに固定しｔ；組み換えネズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭ ｕＧＭＣ５Ｆ）がシクロホスファミド処理ＢＤＦ　ｌマウスの顆粒球形成を刺激 する ０、９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ３Ｆ （ｒＭｕＧＭＣ９Ｆ）は、シクロホスファミド処理したマウスの顆粒球形成を刺 激する。組み換えネズミＧＭＣ３Ｆを、実施例３８記載のとおり、０．９３μｍ 青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定したｒＭｕＧＭＣ９Ｆビーズは可 溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ同様、注射後マウス末梢血の顆粒球形成を刺激する。イシ ダら、アクタ、ヘマトロジ力、８巻１頁（１９８８年）は最近、マウスにシクロ ホスファミド１回注射して、マウスのリンパ球を枯渇した後、ＧＭＣＳＦがマウ スの末梢血で顆粒球形成を刺激することが報告されｔ；。

ＧＭＣＳＦを繰り返し投与することにより、これらのマウスのリンパ球数は、未 処理マウスより２−３日早く回復することができる。

固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆはイン・ビボで活性を示す（実施例５２）ので、シクロ ホス７アミド処理マウスに可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆかまたは固定化ｒＭｕＧＭＣ ５Ｆのどちらかを投与し、ｒＭｕＧＭＣ５Ｆの好中球数に及ぼす効果を測定した 。実験計画は以下のとおりである。０時に、ＢＤＦＩマウスにシクロホスファミ ド（２５０＋ｘｇ／ｋｇ体重）を注射し、好中球セル数を枯渇した。２４時間後 、可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ（１２時間毎に６日間、２単位を腹腔内注射；または １．３および５日に２単位を血管内注射）または固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ（１， ３および５日に２単位を血管内注射）を投与した。０．３．５．７および９日に ＢＤＦ　１マウスの後部眼窩洞より末梢血を採取し、全血球算定から好中球数（ ＰＭＮ）７ｍＩ２を測定しｔ；。結果は図６に示すが、固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ はイン・ビボで活性であることが示唆されるＯさらに、ｒＭｕＧＭＣ５Ｆビーズ はＰＭＮ産生を数および速度において刺激し、これは可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆに 匹敵する。

実施例５４ 共有結合したｒＭｕＧＭＣ５Ｆポリスチレンビーズはサイトカイン活性を保持す るが、吸収されたｒＭｕＧＭＣＳＦポリスチレンビーズはサイトカイン活性を保 持しない ０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに共有結合的に付着し！二組み換え不 ズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ）は生物学的活性を保持する（すなわち、Ｄ ＡＩ−Ｅ５細胞の成長を促進する）が、０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビー ズに吸収されｆ：ｒＭｕＧＭｃＳＦは生物学的活性を保持しない（すなわち、Ｄ Ａ　ｌ　−Ｅ　５細胞が成長しない）。共有績した、および吸収されたｒＭｕＧ ＭＣＳＦ青色染色ポリスチレンビーズは実施例３９記載のとおり調製し、洗浄し た。実施例２１記載の検定を行う前に、ビーズを３回洗浄した。ＩＬ−３／ＧＭ Ｃ３Ｆ／ＥＰＯ依存性セルラインチあるＤＡＩ−Ｅ５細胞は、ドクター・ラリ− ・ギルバート、アルタ大学、エドモントン、アルペルタ、カナダから入手し、ｒ ＭｕＧＭＣ５Ｆの可溶性部分および（共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕ ＧＭＣ３Ｆビーズ部分の両方の検定に用いた。ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ検定は以下のと おりである。ＤＡｌ−Ｅ５細胞（ＩＸＩＯつを可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆまたは（ 共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕＧＭＣＳＦのどちらかを実施例２１記 載のとおり４８時間加温した。Ｍ　Ｔ　Ｔ　ｔ　ｆ：、は［３Ｈ］−チミジンｌ μＣｉのどちらかを加えた。混合物をさらに４時間加温した。細胞は実施例２１ 記載のとおり回収した。ポリスチレンビーズをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）で洗浄したとき、吸収されたｒＭｕＧＭＣ５Ｆをとり出した（ｒＭ７）。これ らのビーズはもはや生物学的活性を保持しなかった。しかし共有結合したｒＭｕ ＧＭＣ５Ｆは、ＳＤＳで洗い流されなかった。これらのビーズは生物学的活性を 保持した。

この結果は表１７にまとめる。

実施例５５ ９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定しＩ；組み換えヒトインスリン 様成長因子−１（ｒＨｕｌＬＧＦ−１）は粗リンパ球調製物を刺激し血清無添加 溶媒で増殖する 組み換えヒ）ＩＬＧＦ−１は、実施例４０記載のとおり９．６３μｍ青色染色ポ リスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕｌＬＧＦ−１ビーズを実施例２１記 載のとおり洗浄した。シムフら、アクタ・エンドクリノロシカ１０２巻２１頁（ １９８３年）は、ＩＬＧＦ−１はレクチン共刺激と組み合わせると、血清無添加 溶媒においてリンパ球の成長を促すことができると報告している。組み換えヒト ＩＬＧＦ−１活性は以下のように検定した：ＲＰＭＩ−１６４０組織培養溶媒］ 　００ｔｔＱ、５μｇ／ｍ１２ＰＨＡｓ　Ｏ，２５％低内毒素ＢＳＡおよび可溶 性ｒＨｕｌＬＧＦ−１かまたは固定化ｒＨｕｌＬＧＦ−１ビーズのどちらかを含 む９６ウ工ル平底組織培養プレートの各ウェルにリンパ球ｌＸｌ０’を加えた。

混合物を３７℃で４８時間加温した。

次に［”Ｈ］−チミジンｌμＣｉ／ウェルを加え、混合物をさらに１８時間加温 した。細胞は実施例２１記載のとおり回収しＩ；。結果は表１８にまとめる。こ れよりポリスチレンビーズに固定化されたｒＨｕＩＬＧＦ−１は、血清無添加溶 媒中ＰＨＡ共刺激検定において、リンパ球の成長を誘起することが示唆される。

実施例５６ ９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えヒトインスリン様 成長因子（ｒＨｕＩ　ＬＧＦ−ｎ）が血清無添加溶媒中粗リンパ球調製物を刺激 して増殖する。

組み換えヒ）ＩＬＧＦ−Ｉｆは、実施例４１記載のとおり９．６３μｍ青色染色 ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕＧ　Ｆ　−Ｉｆビーズを実施例２ １記載のとおり洗浄した。実施した検定は実施例５５で記載しｔ；とおりである 。結果は表１９にまとめるが、固定化ｒＨｕＩＬＧＦ−ｎビーズは血清無添加溶 媒中のＰＨＡ共刺激検定において、リンパ球の成長を誘起することが示唆される 。

実施例５７ 固定化組み換えヒトＩｌｌ瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａ）がネズミＬＭ細胞を死滅す る ９、６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換え腫瘍壊死因子α（ ＴＮＦ−σ）は、７２時間死滅検定でネズミＬＭ細胞を死滅する。組み換えＴＮ Ｆ−ｔを実施例４２記載のとおり９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固 定した。固定化ＴＮＦ−ａビーズを実施例２１記載のとおり３回洗浄した。ＴＮ Ｆ−σ死滅をネズミＬＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ）を用いて検定した。検定は以下のとおりであった。可溶性ＴＮＦ−σか固定化 ＴＮＦ−ａのどちらかを９６−ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに加え、 ざらにｌＸｌ０’ＬＭ細胞を加えた。混合物を７２時間加温しｔ；。次に、死滅 をｌμＣｉ［Ｈ’］−チミジンを各ウェルに加えるかまたはＭＴＴを加えること により検定し、混合物をさらに４時間加温した。チミジン標識した細胞を実施例 ２１記載のとおり収集した。ＭＴＴ標識した細胞をイソプロピルアルコールＩ； 固定し、ＭＴＴ取り込み量を５９Ｏｎ＋ｍでの吸収の読みにより、測定した。結 果を表２０にまとめｔ；が、固定化ＴＮＦ−ａは、チミジンの取り込み、ＭＴＴ の取り込みおよび酸化を阻害することを示唆し、このことは細胞死を示す。

実施例５８ ２．８５μｍポリスチレンビーズに固定した線繊芽細胞成長因子ベーシック（Ｆ ＧＦｂ）が成長因子枯渇溶媒中ネズミ３Ｔ３細胞の成長を誘起する 固定化ＦＧＦｂは成長因子枯渇溶媒中ネズミ３Ｔ３細胞の成長を刺激する。実施 例４３により調製した固定化ＦＧＦｂビーズを、実施例２１記載のとおり懸濁液 により３回洗浄し、遠心にかけた。ネズミ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクシジン）は、本明細書に参考として添付したゴスポダロウクッ 、不一チャー２４９巻１２３頁（１９７４年）に−告されているとおり、抗生物 質および１０％子ウシ血清（ａＳ）を含む１．２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ） 溶媒中成長した。３Ｔ３細胞はトリプシン化により単離し、１０％ｃｓ加ＤＥＭ 溶媒中６００かまたは２０００セル／ウエル（９６−ウェルプレート）で置いた 。３Ｔ３細胞を３７℃で一晩加温しｔ；。

翌朝ウェルを３回洗浄し、０．４％ａｓ含有ＤＥＭ溶媒中に再懸濁し、さらに２ ４時間加温して細胞および溶媒の成長因子を枯渇した。２４時間後、０．４％ｃ ｓ含有ＤＥＭ溶媒中、可溶性ＦＧＦｂ、固定化ＦＧＦｂまたは１０％ｃｓのいず れかを各ウェルＩ；加え、３Ｔ３細胞をさらに２４−４８時間加温した。次に細 胞をＩμＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジンで標識し、さらに１６時間加温しｊ ；。結果は表２１に示す。これより固定化ＦＧＦｂビーズは可溶性ＦＧＦｂに匹 敵する値まで３７３細胞の成長を刺激することが示唆される。

実施例５９ ２．８５μｍポリスチレンビーズに固定しＩ；形質転移成長因子β−２（Ｔ　Ｇ 　Ｆ−β−２）が成長因子枯渇溶媒中ＮＨＫ−４９Ｆ細胞の成長を誘起する。

固定化ＴＧＦ−β−２は、成長因子枯渇溶媒中ＮＨＫ−４９Ｆ細胞の成長を刺激 する。実施例４４の方法により調製した固定化ＴＧ遠心にかけた。ＮＨＫ−４９ ＦＭｉ胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジン）は、本明細書に参 考として添付したアソインら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリ ー２５８巻７１５２５頁（１９７３年）に報告されたとおり、抗生物質および１ ０％子ウシ血清（ｃｓ）を含むＤＥＭ溶媒中成長した。ＮＨＫ−４９Ｆ細胞をト リプシン化により単離し、１０％ｃｓ１Ｊｒ）ＤＥＭ溶媒中５Ｘ１０’セル／ウ ェル（９６ウエルプレート）の濃度で置いた。細胞は５％ｃｏ２雰囲気下３７℃ で一晩加温し、次に０．２％ｃｓ含有ＤＥＭ溶媒中２回洗浄した。溶媒は０．２ ％ｃｓ加ＤＥＭ１００ｐ１２で置き換え、細胞を上記のとおり３−４日間加温し 、溶媒の成長因子を枯渇した。ＮＨＫ−４９Ｆ細胞が合わせて約７５％に達した とき、可溶性ＴＧＦ−β−２ａｓ固定化ＴＧＦ−β−２ａまたはｌＯ％ｃｓを各 ウェルに加え、ＮＨＫ−４９Ｆ細胞をさらに１７時間加温した。次にｌμＣｉ［ Ｈ１〕−チミジンをウェルに加え、細胞をさらに４時間加温した後、実施例２１ 記載のとおり回収した。結果は表２２にまとめる。固定化ＴＧＦ−β−２ビーズ は成長因子枯渇溶媒中ＮＨＫ−４９Ｆ細胞の成長を刺激することが示唆される。

実施例６０ 固定組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａがインターフェロン感受性 ヒーラＳ３セルラインを死滅させる固定組換え体ヒトインターフェロンーアルフ ァー２ａがインターフェロン感受性ヒーラＳ３セルラインを死滅させた。２．８ ５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組換え体ヒトインターフェロンー アルファー２ａ　（ＩＮＦ−アルファー２ａ）はヒト上皮がんセルラインヒーラ Ｓ３中〔Ｈ３］−チミジンの取り込みを阻害する（すなわちヒーラＳ３を死滅さ せる）。組換え体ＩＮＦ−アルファー２ａを実施例４５に記載したように２．８ ５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ＩＮＦＮチーファー２ａビ ーズを実施例２１に記載したように３回洗浄した。ＩＮＦ−アルファー２ａ死滅 をヒト上皮がんセルラインヒトＳ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ション）を使用して検定した。ＩＮＦ−アルファー２ａは［”Ｈ］−チミジンの 取り込みを遮断し、細胞壊死を導く。検定は次の通りである。可溶性ＩＮＦ−ア ルファー２ａまたは固定ＩＮＦ−アルファー２ａのいずれかのアリコートを９６ −ウェル平底組織培養プレートに個々のウェルを加え、続いてｌＸｌ０’ヒーラ Ｓ３細胞を加えた。ＩＮＦ−アルファー２ａまたは可溶性ＩＮＦ−アルファー２ ａのビーズを４８または７２時間インキュベートし、この間に［３Ｈ］−チミジ ン１μＣｉを各ウェルに加え、混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞 を実施例２１に記載したように収集した。結果は第２３表に示され、固定ＩＮＦ −アルファー２ａがヒーラＳ３腫瘍細胞のチミジンの取り込みを阻害し、壊死を 導くことを示している。

実施例６１ ０．９３μｍポリスチレンビーズをに固定した組換え体ヒト表皮成長因子はＮＲ Ｋ−４９Ｆ細胞を血清なしで成長させる０　９３μｍ青色染色ポリスチレンビー ズに固定した組換え体ヒト表皮成長因子（ｒＨｕＥＧＦ）はＮＲＫ−４９Ｆ細胞 を血清なしで成長させる。組換え体ヒトＥＧＦを実施例４６に記載したように０ ．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ｒＨｕＥＧＦビーズを 試験例２１に記載したように３回洗浄した。血清はインビトロで細胞が成長する のに必要な多くの成長因子を含んでいる。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞の検定方法は、次 の通りである。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞を１０％うし血清（ＣＳ）を加えたＤＭＥＭ 　（ダルベコズ・モディファイド・イーグル培地、ホワイタカー・Ｍ、Ａ、パイ コプロダクツ）培地で維持した。ＮＨＫ−４９Ｆ細胞を９６−ウェル平底組織培 養プレートにウェルあたり５Ｘ１０３細胞で乗せ、１０％Ｏ８で２４時間インキ ュベートした。細胞を血清なしの培地で洗浄し、血清なしのＤＭＥＭを補充した 。可溶性ｒＨｕＥＧＦまたは固定ｒＨｕＥＧＦのいずれかのアリコートを個々の ウェルに加え−た。ｒＨｕＥＧＦのビーズまたは可溶性ｒＨｕＥＧＦを２４また は４８時間インキュベートした。成長を各ウェルに１μＣｉを加えて測定し、混 合物をさらに６時間インキュベートした。細胞を実施例２１に記載されたように 収集した。結果は第２４表示され、固定ｒＨｕＥＧＦがマウスＮＨＫ−４９Ｆ成 長を誘導することを示している。

実施例６２ ２．８５μｍポリスチレンビーズに固定した組換え住血小板誘導成長因子は血清 なしで成長するマウス３Ｔ３細胞を誘導する２、８５μｍポリスチレンビーズに 固定した組換え住血小板誘導成長因子（ｒＨｕＰＤＧＦ）は血清なしで成長する マウス３Ｔ３細胞を誘導する。組換え体ヒトＰＤＧＦを実施例４７に記載したよ うに２．８７μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ｒＨｕＰＤＧＦ ビーズを試験例２１に記載したように３回洗浄した。血清は細胞がインビトロで 成長するのに必要な多（の成長因子を含んでいる。はとんどの細胞はこれらの成 長因子が枯渇すると成長しない。マウススイス３Ｔ３は上記セルラインであり、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能である。検定方法 は次の通りである。スイス３Ｔ３細胞を１０％うし血清（Ｃ８）を加えたＤＥＭ Ｅ培地で維持した。３Ｔ３細胞を９６−ウェル平底組織培養プレート中ウェルあ たりｌＸｌ０’細胞でプレートし、全面培養になるまで成長させた。培地を２％ Ｃ８に変えると、３Ｔ３細胞は生育するが成長しなかった。成長因子を加える前 に、細胞を血清なしのＤＭＥＭで２％Ｏ８がなくなるまで洗浄し、血清なしのＤ ＭＥＭを補充した。可溶性ｒＨｕＰＤＧＦまたは固定ｒＨｕＰＤＧＦを個々のウ ェルに加えた。成長を各ウェルに［３Ｈ］−チミジン１μＣ】を加えて測定し、 混合物をさらに６時間インキュベートした。細胞を実施例２１に記載したように 収集した。結果は第２５表に示され、固定ｒＨｕＰＤＧＦはマウス３Ｔ３細胞成 長を誘導することを示している。

実施例６３ Ｃｏ−Ｂｉｎｃｌ（商標）ポリスチレンプレートに固定した組換え体ヒトエリス ロボイエチンによるＤＡｌ−Ｅ５細胞の成長Ｃｏ−Ｂｉｎｄ（商標）ポリスチレ ンプレートに固定した組換え体ヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥＰｏ）はＥＰ Ｏ／ＩＬ−３依存ＤＡＤ、−Ｅ５細胞の成長を誘導する（実施例５４参照）。組 換え体ヒｈＥＰ○を実施例４８に記載したようにＣｏ−Ｂｉｎｄ（商標）ポリス チレンプレートに固定した。固定ｒＨｕＥＰｏを含むつ工ルをＩＸ　ＰＢＳで５ 回洗浄し、続いて１０％熱−不活性化血清を含むイスコープのＭＥＭで５回洗浄 し、その後１０％血清を含むＩＭＤＭｏ、０５０ｍ１で満たした。１ｘｌｏ’細 胞を固定ｒＨｕＥＰＯまたは可溶性ｒＨｕＥＰｏを含むウェルに加えた。細胞を ４８時間インキュベートした後、ＭＴＴまたは［３Ｈ］−チミジン１μＣ１を各 ウェルに加え、混合物をさらに４時間インキュベートした。結果は第２６表に示 され、固定ｒＨｕＥＰｏがＥＰＯ／ＩＬ−３依存ＤＡＩ−Ｅ５細胞に成長を誘導 することが示されている。

実施例６４ 組換え体ヒトガンマーインターフェロンのＣｏ−Ｂｉｎｄ（商１ｊｌ）ウェルス トリップへの結合 組換え体ヒトガンマーインターフェロン（ｒＨｕ　Ｉ　ＦＮ−ガンマ）を、ｌＸ １０’Ｕ／ｍｌ　（２，５Ｘ１０”Ｕ／ｍｇ）を含む液体製剤としてマサチュー セッツ州、ボストン、ゲンザイムから入手した。この溶液のアリ：＋　−ト（０ ，０２ｍ１．２Ｘ１０’Ｕ）をＰＢＳ２ｍ］で希釈して、貯蔵溶液をＩ　Ｘ　１ ０’Ｕ／ｍ　］にした。］８−ウェルストリップ４のウェルを以下に示すように 満たした。

ｒＨｕ　ＩＦＮ−ガン７　ＰＢＳ、ｍｌウェル　ｍｌ　単位 、Ａ　Ｏ，１１００００，１ Ｂ　Ｏ，０５５０００，１５ ＣＯ，０１１０００，１９ Ｄ　０．００５　１０　鉤１９５ ウェルを満たした後、ストリップを覆い、３７℃で３時間インキュベートし、正 確に実施例４８に記載したように処理した。ＰＢＳで徹底的に洗浄し、ウェルを ＰＢＳで満たし、ストリップを覆い、使２用するまで４℃で放置した。

実施例６５ 組換え体ヒトガンマーインターフェロンの生物学的活性ヒト末梢血液単球をヘパ リン化シリンジへの採血から分離し、４６％バーコルにュージャージー州、ネワ ーク、ファルマシア社）で勾配遠心により単離した。単球を界面から単離し、り ん酸緩衝食塩水で３回洗浄し、ｍ】あたりＩ　Ｘ　１０’細胞の濃度になるまで ５％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中再懸濁した。実施例６７のよ うに固定した４種のウェルガンマ−インターフェロンを含むＣｏ−ｂｉｎｄ（商 標）ストリップをりん酸緩衝食塩水で３回洗浄し、２％フンギーバクトを含むＲ ＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、無菌ガーゼで拭いた。各ウェルにＯ，１ｒ ｎｌ容量の１×１０５単球を加えた。可溶性ガンマ−インターフェロンを、固定 ガンマ−インターフェロンを含まないウェルに加えた。培養物を２４時間インキ ュベートし、培地０．１ｍｌを取り除き、市販のエリザキットを使用して腫瘍壊 死因子産生を検定した。第２７表に示された結果は、固定ガンマ−インターフェ ロンに生物学的活性があることを示している。

本発明を様々な具体的および好ましい態様および技術に基づいて記載した。しか しながら、多くの変更および修正を本発明の精神および範囲内においてなし得る ことが明らかである。

第１表 族　メンバー 上皮成長因子（ＥＧＦ）　上皮成長因子腫瘍増殖因子アルファ （ＴＧＦ−アルファ） ワクシニア成長因子（ＶＧＦ） うさぎ線維腫形成因子（ＳＦＧＦ） 粘液層成長因子（ＭＧＦ） アンフィレグリン（ＡＲ） 血小板由来成長因子　ＰＤＧＦ−ＡＡ （ＰＤＧＦ）　ＰＤＧＦ−ＡＢ ＰＤＧＦ−ＢＢ 腫瘍増殖因子ベータ　ＴＧＦ−ベータ１（ＴＧＦ−ベータ）　ＴＧＦ−ベータ２ ＴＧＦ−ベータ３ ＴＧＦ−ベータ４ インヒビン ミュラー阻害物質（ＭＩＳ） 骨形態蛋白（ＢＭＰ’ｓ） 繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）　酸性ＦＧＦ塩基性ＦＧＦ ｈｓｔ遺伝子生成物 １ｎｔ−２遺伝子生成物 インスリン様成長因子（ＩＧＦ）　ＩＧＦ−Ｉレラキサン 特表千４−５０３６０７　（４１） 分あたりの分解率（ＤＰＭ’ｓｘ　１０−３）分あたりの分解率（Ｄ　ＰＭ’　 ｓＸ　１０−３）分あたりの分解率（ＤＰＭ’５Ｘ１０−”）分あたりの分解率 （ＤＰＭ’５Ｘ１０−リ時間（時） ＦＩＧ、　５Ａ “時間（時） ＦＩＧ、　５Ｂ 末梢血液のＰＭＮ １μ青色ビーズと結合したｒＭｕＧＭＣ３Ｆ残余パーセント！ ２；０　−５ｃ′″ｌ　Ｊ′ｕ１　（７１−Ｊ　ロ　ロ　０ｏｏｏｏ　ロ　ｏｏ ｏｏ。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１ｏ３１ 、発明の名称 固定化サイトカイン類 ３、特許出願人 名称　イムノセラビューティックス・インコーホレイテッド４、代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号ツイン２１ＭＩＤタ ワー内　電話（０６）９４９−１２６１１９９１年７月２６日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１　過 成長因子とも呼ばれる一群のサイトカインは、それらの生物活性の中でも、走化 的活性、上皮細胞および線維芽細胞の増殖、成長および分化、マトリックス形成 および軟骨形成の刺激並びに管形成（血管形成）を含む創傷治癒および組織修復 に対する陽性または陰性調節作用を有する。多数の生物活性蛋白質がこの領域内 で報告され、分類原則に従ってそれらの生物学的作用およびアミノ酸配列相同性 に基づき群および種類に分類されている（下記表１に示されている通り）。この 群のサイトカインは組織修復に関与するが、それらは他の生物学的作用を有する 。さらに、他のサイトカイン類、例えば免疫応答を調節するインターロイキン− １およびインターロイキン−３もまた組織修復に対する作用を有する。

表皮成長因子（ＥＧＦ）は、腫よう増殖因子（ＴＧＦ）アルファ、アンフィレグ リンおよびワクシニア成長因子を含む一群の構造的に関連した蛋白質の重要な代 表的構成員である。ヒトＥＧＦは最初尿から単離され、それが胃液分泌を阻止し 得ることからウロガストロンと命名された（Ｈ，グレゴリ−１「ネイチャー」、 ２５７．３２５（１態がある。Ｊ　、Ｍ、ウォズネイおよびＶ、ローゼン等、「 サイエンス」、２４２．１５２８（１９８８）参照。

繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、１４−１８キロダルトンの単鎖蛋白質である 。２種の充分に特性確認された形態は、脳および下垂体から単離された塩基性Ｆ ＧＦ、並びに脳および網膜から単離された酸性ＦＧＦである。塩基性ＦＧＦは、 大部分の系において、酸性ＦＧＦよりも安定し、１０倍の効力を有する。ＦＧＦ の両形態は、同じレセプターに結合し、中胚葉起源の細胞、例えば線維芽細胞、 血管内皮細胞、血管平滑筋、筋芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞に対して細胞分 裂促進性を示す。Ｆ、エシュおよびＡ、ベアド等、「プロシーディンゲス・オブ ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッ ド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８２．６５０７（１９８５）参照。１ｎｔ− ２およびｈｓｔプロト−騰よう遺伝子の生成物もまた、ＦＢＦ群の構成員として 含まれる。

（Ｃ，ディクソンおよびＧ、ピータース、「ネイチャー」、３２６．８３３（１ ９８７）参照）。

ツマトメディンＣとしても知られているインシュリン様成長因子１（Ｉ　ＬＧ− １）およびインシュリン様成長因子１１（ＩＬＧ−１１）は、血清から最初に精 製され、軟骨へのスルフェート取り込みの刺激、インシュリン様活性および増殖 刺激活性の３つの生物活性を共有する若干の因子に関する現行の名称を代表する 。肝臓および線維芽細胞は循環性インシュリン様成長因子の主たる供給源である が、本質的に全ての組織がそれらを生産することが示された。

また、インシュリン様成長因子は、それらの生物活性の中でも、グルコース代謝 を刺激し、線維芽細胞、セルトリ細胞、胎児脳細胞、筋芽細胞、レンズ上皮、す い臓ベータ細胞、レクチン刺激リンパ球、および血小板誘導成長因子と「反応能 をもつ」状態になった後密度阻止されＩ：Ｂａ１ｂ／ｃ　３　Ｔ　３細胞のＤＮ Ａ合成および細胞増殖を刺激することが示された。（Ｒ，Ｃ，バクスター、Ａｄ ｖ、　ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、、２５．５０（１９８６）参照）。

サイトカイン類は、それら自体複合体であり、サブユニットを構成し得る細胞表 面レセプターと反応する。サイトカインの一部分は、ンビーズ；１．１２−ジア ミノドデカン結合手をもつ６５μｍカルボキシレートポリスチレンビーズ；５． ２９μｍアミンポリスチレンビーズ；及びセファテックス（商標）Ｇ−１０ポリ デキストランビーズ（実施例１，２．６．７．８．９．１３．１４及び１５参照 ）に固定化した組換え型Ｉ　Ｌ−２（Ａｌａ　−１２５同族体）の試料を、固定 したＩＬ−２がＩ　Ｌ−２保存細胞系ＣＴＬＬ−２、マウス細胞傷害性Ｔ−リン パ球細胞系ＡＴＣＣ＃ＴＩ　Ｂ−２１４のインビトロ成長を支持するか否かを測 定するため試験した。

固定化Ｉ　Ｌ−２を含むビーズの試料を、ベックマン・マイクロフェーダ中、４ ％抗生物質（ファンジーバクト・ソリューション、アーゲイン・サイエンティフ ィック、サンタ、アナ、カリホルニア）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地 中、懸濁及び遠心により３回洗浄した。！Ｌ−２固定化ビーズをＲＰＭＩ−１６ ４０培地中に再び懸濁し、インビボ生成試験に用いた。ビーズのアリコツトを９ ６−ウェル平底組織培養板（ファルコン＃３０７５、ペクトン・デイキンノン・ アンド・コンバニイ、ラザ７オード拳ニュージャーシイ）実施例２９ 可溶性組み換えＩ　Ｌ−２または固定化ＩＬ−２により誘起されたＬＡＫ細胞活 性 固定化組み換えＩ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）上で成長させたヒトＰ　 Ｂ　Ｌ’ｓを、それらがリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を示すか どうかにつき測定した。ヒトＰＢＬ″Ｓは実施例２８に記載されるとおりに単離 し、実施例１記載のとおり調製したＩＬ−２固定化ビーズで９６時間活性化し、 実施例２１記載のとおり洗浄した。ＬＡＫ細胞の死滅作用は、作用標的に５６２ 、ラジおよびダウディを用いて検定した。ＬＡＫ細胞死滅検定には、文献に報告 されている４時間”Ｃｒ放出検定を用いた。Ｔ、Ｌ、ホワイトサイドら、キャン サー・イムツール、イム／セラ、２６巻１頁（１９８８年）；Ｈ，Ｆ、プロスら 、ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロジ−１巻５１頁（１９８１年）参照 。新鮮なＰＢＬ″Ｓかも単離された正常ＮＫ（ナチュナル・キラー）細胞はに６ ５２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４３ヒト慢性骨髄性白血病）を死滅するが、ラ ジ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８６ヒトバーキツトリンパｌ１ｌ）またはダウディ細胞 （ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２１３ヒトバーキツトリンパ腫）が活性化状態にある時は それらを死滅しない。結果は 再度３５℃で１時間加温した。これりの上澄は捨てた。次にウェルは１％フンギ ゾーンを含有するＲＰＭＩ−７６４０組織培養溶媒で完全に洗浄（３Ｘ　０．２ ｍ４）Ｌ、同じ液で充てんした。ストリップは被覆は、用時まで４℃を維持した 。

実施例４９ 固定化組み換えＩＬ−１−βポリスチレンビーズで刺激したＬＢＲＭ、ＴＧ６細 胞から産生じたＩＬ−２を用いたＣＴＬＬ−２細胞の成長 ９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−βは、 ミズミリンパ腫セルラインＬＢＲＭ、ＴＧ６（アメリー　カン・タイプ・カルチ ャー・コレクション・カンパニー、ロックビル、ＭＤＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７７ ８）のＩＬ−２合成を誘起し、そのＩ　Ｌ−２をＩＬ−２依存性セルライン中で 検定した。固定化ＩＬ−１−βビーズは実施例２１記載のとおり、懸濁液で３回 洗浄し、遠心にかけた。ＩＬ−１−βビーズは、準至適濃度のＰＨＡレイトヘマ グルチニンＰ１ウェルカム・ファウンデーション、タンフ才激し、可溶性ｒＭｕ ＧＭｃｓＦに匹敵することが示唆される。

実施例５３ ０．９３μｍポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ３Ｆ（ｒＭｕ ＧＭＣ３Ｆ）がシクロホス７アミド処理ＢＤＦＩＦウスの顆粒球形成を刺激する ０、９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ５Ｆ （ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ）は、シクロホスファミド処理したマウスの顆粒球形成を刺 激する。組み換えネズミＧＭＣＳＦを、実施例３８記載のとおり、０．９３μｍ 青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定しｔ：ｒＭｕＧＭｃＳＦビーズは 可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ同様、注射後マウス末梢血の顆粒球形成を刺激する。イ シダら、アクタ、ヘマトロジ力、８０巻１頁（１９８８年）は最近、マウスにシ クロホスファミド１回注射して、マウスのリンパ球を枯渇した後、ＧＭＣＳＦが マウスの末梢血で顆粒球形成を刺激することが報告された。ＧＭＣＳＦを繰り返 し投与することにより、これらのマウスのリンパ球数は、未処理マウスより２− ３日早く回復することができる。固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆはイン・ビポで活性を 示す（実施例５２）ので、 ズはサイトカイン活性を保持しない ０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに共有結合的に付着した組み換えネズ ミＧＭＣ３Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ）は生物学的活性を保持する（すなわち、ＤＡ Ｉ−Ｅ５細胞の成長を促進する）が、０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズ に吸収されたｒＭｕＧＭＣ３Ｆは生物学的活性を保持しない（すなわち、ＤＡ　 １−Ｅ　５細胞が成長しない）。ＤＡ　１−Ｅ　５はマウス白血病ウィルス誘導 ＤＡＩリンノく腫、カナダ国、アルバータ、エドモントン、アルタ大学のラリ− ・ギルバート博士〔ブランチ等、１９８７年、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　６９巻 １７８２−１７８５頁〕のクローンである。共有結した、および吸収されたｒＭ ｕＧＭＣ５Ｆ青色染色ポリスチレンビーズは実施例３９記載のとおり調製し、洗 浄した。実施例２１記載の検定を行う前に、ビーズを３回洗浄した。Ｉ　Ｌ−３ ／ＧＭＣ５Ｆ／ＥＰＯ依存性セルラインであるＤＡ　ｌ　−Ｅ　５細胞は、ドク ター・ラリ−・ギルバート、アルタ大学、エドモントン、アルベルタ、カナダか ら入手し、ｒＭｕＧＭＣ３Ｆの可溶性部分および（共有結合または吸収された） 固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆビーズ部分の両方の検定に用いた。ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ検 定は以下のとおりである。ＤＡ　１−Ｅ　５細胞（ＩＸＩＯつを可溶性ｒＭｕＧ ＭＣ３Ｆまたは（共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆのどちら かを実施例２１ 組み換えヒ）　Ｉ　ＬＧＦ−ｎは、実施例４１記載のとおり９．６３μｍ青色染 色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕＧ　Ｆ　−１１ビーズを実施例 ２１記載のとおり洗浄した。実施した検定は実施例５５で記載したとおりである 。結果は表１９にまとめるが、固定化ｒＨｕＩＬＧＦ−Ｉ［ビーズは血清無添加 溶媒中のＰＨＡ共刺激検定において、リンパ球の成長を誘起することが示唆され る。

実施例５７ 固定化組み換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）がネズミＬＭ細胞を死滅する ９、６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換え腫瘍°　壊死因子 ａ　（Ｔ　Ｎ　Ｆ−σ）は、７２時間死滅検定でネズミＬＭ　（ＡＴＣＣ＃ＣＣ Ｌ　１．２、Ｌ９２９結合組織のＮＣＴＣクローン）細胞を死滅する。組み換え ＴＮＦ−αを実施例４２記載のとおり９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズ に固定した。固定化ＴＮＦ−σビーズを実施例２１記載のとおり３回洗浄した。

ＴＮＦ−σ死滅をネズミＬＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン）を用いて検定した。検定は以下のとおりであった。可溶性ＴＮＦ−実施例 ６０ 固定組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａがインターフェロン感受性 ヒーラＳ３セルラインを死滅させる固定組換え体ヒトインターフェロンーアルフ ァー２ａがインターフェロン感受性ヒーラＳ３セルラインを死滅させた。２．８ ５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組換え体ヒトインターフェロンー アルファー２ａ　（ＩＮＦ−アルファー２ａ）はヒト上皮がんセルラインヒーラ ５３ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２，２ヒト頚部上皮がん中［Ｈ３］−チミジンの取り込 みを阻害する（すなわちヒーラＳ３を死滅させる）。組換え体ＩＮＦ−アルファ ー２ａを実施例４５に記載したように２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズ に固定した。固定ＩＮＦ−アルファー２ａビーズを実施例２１に記載したように ３回洗浄した。ＩＮＦ−アルファー２ａ死滅をヒト上皮がんセルラインヒトＳ３ （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を使用して検定した。ＩＮ Ｆ−アルファー２ａは［３Ｈ］−チミジンの取り込みを遮断し、細胞壊死を導く 。検定は次の通りである。可溶性ＩＮＦ−アルファー２ａ４たは固請求の範囲 （１）細胞と固定化サイトカインとの接触段階を含む細胞における生物活性の刺 激方法であり、上記固定化サイトカインは共有非臭化シアン結合により固体支持 体に堅固かつ安定した状態で結合しており、固定化サイトカインが少なくとも実 質的に遊離サイトカインの示す生物活性を有し、固定化サイトカインが再使用可 能である方法。

（２）サイトカインが、ウレタン、トリアジンエーテル、アミンまたはアミド結 合を用いて固体支持体に結合している、請求項１記載の方法。

（３）サイトカインがアミンまたはアミド結合を用いて固体支持体に結−合して いる、請求項２記載の方法。

（４）さらに結合アームを含み、サイトカインが結合アームにより固体支持体に 結合している、請求項１記載の方法。

（５）結合アームが、 （ａ）一般式ＮＨ＊　Ｒ’　ＮＨｚ（式中、Ｒ１はＣ＊　Ｃｔｏアルキル基であ る）を有するジアミン類、 （ｂ）一般式Ｎ　Ｈｚ　Ｒ”　ＣＯ！　Ｈ（式中、Ｒ２はＣ，−Ｃ２゜アルキル 基である）を有するアミノ酸、および （ｃ）一般式０ＨＣ−Ｒ”−ＣＨｏ（式中、ＲｓはＣＩ　Ｃ２０アルキル基であ る）を有するジアルデヒド類 から成る群から選ばれた１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項４記載の方 法。

（６）結合アームが、６−アミノカプロン酸、■、６−ジアミツヘキサン、１． １２−ジアミノドデカン、グルタルアルデヒドれらの混合物から成る群から選択 された１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項５記戦の方法。

（７）サイトカインが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インタ ーロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイ キン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、腫よう壊死因子、ガ ンマ−インターフェロン、アル７アーインター７エａン、ベーターインターフェ ロン、エリトロポエチン、か数球コロニー刺激因子、ネズミか数球コロニー刺激 因子、カ数球−マクロファージ・コロニー刺激因子、ネズミか数球ーマクロファ ージ・コロニー刺激因子、インシュリン様成長因子１１インシユリン様成長因子 Ｉ＋，腫よう増殖因子ベータ、類表皮成長因子、血小板由来成長因子および線維 芽細胞成長因子ベーシックから成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。

（８）サイトカインが、インターロイキン−１１インターロイキン−２、インタ ーロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、か数球〜マク ロファージ刺激因子、か数球コロニー刺激因子、エリトロポエチン、アルファー インターフェロン、腫よう壊死因子、インシュリン様成長因子！、インシュリン 様成長因子ＩＩ、線維芽細胞成長因子ベーシック、腫よう増殖因子ベータ、類表 皮成長因子および血小板由来成長因子から成る群から選ばれる、請求項７記載の 方法。

（９）サイトカインが、インターロイキン−Ｉ−アルファ、インターロイキン− １−ベータ、組換えインターロイキン−２、インターロイキン−２、インターロ イキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、ネズミか粗球−マ クロファージ・コロニー刺激因子、ヒトか粗球−マクロファージ・コロニー刺激 因子、ヒトか数球コロニー刺激因子、ヒト・エリトロポエチン、アル７アーイン ターフエロン、ガンマ−インターフェロン、腫よう［Ｉ［子−フルファ、ヒト・ インシュリン様成長因子Ｉ、ヒト・インシュリン様成長因子Ｈ，線維芽細胞成長 因子ベーシック、腫よう増殖因子ベーターＩＩ。

ヒト類表皮成長因子、ヒト血小板由来成長因子から成る群から選ばれる、請求項 ７記載の方法。

（ｌＯ）サイトカインが、インターロイキン−２、か粗球−マクロファージ・コ ロニー刺激因子、か数球コロニー刺激因子、エリトロポエチン、腫よう壊死因子 、線維芽細胞成長因子ベーシック、腫よう増殖因子ベータ、血小板由来成長因子 から成る群から選ばれる、請求項７記載の方法。

（１１）サイトカインが、類表皮成長因子、血小板由来成長因子、腫よう増殖因 子ベータ、線維芽細胞成長因子並びにインシュリン様成長因子Ｉおよびインシュ リン様成長因子■１から成る群から選ばれる成長因子である、請求項１記載の方 法。

（１２）サイトカインが、サイトカインの生物活性を有する、遺伝学的または化 学的に得られた類縁体、誘導体またはフラグメント、または生物学的に均等な合 成リガンドを含む、請求項１記載の方法。

（１３）サイトカインが、ポリエチレングリコール修飾インターロイキン−２ま たはａｌａ　−１２５インターロイキン−２類縁体である、請求項１２記載の方 法。

（１４）固体支持体が生物学的融和性である、請求項１記載の方法。

（１５）固体支持体が生物分解性である、請求項１４記載の方法。

（１６）固体支持体が非多孔質である、請求項１記載の方法。

−（１７）固体支持体が、約０．５−５００μｍの直径を有する実質的に球形の ビーズである、請求項１６記載の方法。

（１８）球形ビーズが約１−７５μｍの直径を有する、請求ＸＪ１７記載の方法 。

（１９）固体支持体が約５−２００μｍの直径を有する短繊維である、請求項１ ６記載の方法。

（２の支持体が、無機支持体、例えばガラス、石英、セラミック、ゼオライト、 金属および金属酸化物、ポリマー材料、例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、 エチレン、ブタジェン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリ ル酸およびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリル アミドおよびメタクリルアミドから成る群から選ばれる七ツマ一単位から誘導さ れたホモポリマーおよびコポリマー、炭水化物支持体、例えばアガロース、架橋 アガロース、デキストラン、インシュリン、ヒアルロン酸、セルロース、セルロ ース誘導体、澱粉および澱粉誘導体、および不溶性蛋白質材料、例えばゼラチン 、コラーゲンまたはアルブミンから成る群から選ばれる、請求項１６記載の方法 。

（２１）支持体力、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジェン、アク リロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルおよびメタクリル酸のエス テル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミド から成る群から選ばれる七ツマ一単位から誘導されたホモポリマーまたはコポリ マーを含む、請求項２０記載の方法。

（２２）支持体が、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシルおよび水硫基から成る 群から選ばれる複数の官能基を有する官能化表面を含む、請求項１６記載の方法 。

（２３）サイトカイン依存性セルラインのインビトロ培養を含む方法であって、 セルラインの生長に関する固定化サイトカインの有効量をセルラインと接触させ ることにより、その生長を誘導することを含む、請求項」記載の方法。

（２４）依存性セルラインがＣＴＴＬ−２（ＡＴＣＣ＃ＴＩ　Ｂ−７１４）であ り、サイトカインがインターロイキン−２である、請求項２３記載の方法。

（２５）依存性セルラインがＡＭＬ−１９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−９５８９）で あり、サイトカインが、ヒトか粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子、ヒト か数球コロニー刺激因子およびインターロイキン−３から成る群から選ばれる、 請求項２４記載の方法。

（２６）依存性セルラインがスイス３Ｔ３（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−９２）であり、 サイトカインが血小板誘導成長因子または線維芽細胞成長因千−ベータである、 請求項２３記載の方法。

（２７）依存性セルラインがＮＨＫ−４９Ｆ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７０）で あり、サイトカインが腫よう増殖因子−ベータまたは類表皮ＩＲ長因子である、 請求項２３記載の方法。

（２８）依存性セルラインがＤＡＩ−Ｅ５であり、サイトカインがエリトロポエ チンである、請求項２３記載の方法。

（２９）細胞性血液成分のインビトロ培養方法であって、細胞性血液成分の成長 に関する固定化サイトカインのを動量を前記成分と接触させることにより前記成 分の成長を誘導することを含み、固定化サイトカインが共有非臭化シアン結合に より固体支持体へ堅固かつ安定した状態で結合している場合、固定化サイトカイ ンは少なくとも実質的に遊離サイトカインの示す生物活性を有し、固定化サイト カインが再使用可能である方法。

（３０）細胞性血液成分がヒト末梢血リンパ球である、請求項２９記載の方法。

（３１）リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、腫よう浸潤性 リンパ球および細胞毒性Ｔ細胞から成る群から選ばれるエアエフター細胞のイン ビトロ培養方法であって、エアエフター細胞の成長に関する固定化サイトカイン の有効量を前記細胞と接触させることにより前記細胞の生長を誘導することを含 み、固定化サイトカインが共有非臭化シアン結合により固体支持体へ堅固かつ安 定した状態で結合しており、前記固定化サイトカインが実質的に遊離サイトカイ ンの示す生物活性を有し、前記固定化サイトカインが再使用可能である方法。

（３２）造血細胞の生長に関する固定化サイトカインの有効量を注射することを 含む、宿主の造血細胞生長のインビボ刺激方法であって、固定化サイトカインが 共有非臭化シアン結合により固体支持体へ堅固かつ安定した状態で結合しており 、前記固定化サイトカインが実質的に少なくとも遊離サイトカインの示す生物活 性を有し、前記固定化サイトカインが再使用可能である方法。

（３３）造血細胞がか数球マクロ７アージであり、サイトカインがか数球−マク ロ７アージ・コロニー刺激因子である、請求項３２記載の方法。

国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）固体支持体に結合したサイトカインを含む固定化サイトカインであって、 遊離サイトカインにより示された実質的生物活性を有し、さらに再使用可能な固 定化サイトカイン。
2. （２）サイトカインが固体支持体に共有結合している、請求項１記載の固定化サ イトカイン。
3. （３）サイトカインが、ウレタン、トリアジンエーテル、アシンまたはアミド結 合を用いて固体支持体に共有結合している、請求項２記載の固定化サイトカイン 。
4. （４）サイトカインがアミンまたはアミド結合を用いて固体支持体に共有結合し ている、請求項３記載の固定化サイトカイン。
5. （５）さらに結合アームを含み、サイトカインが前記結合アームにより固体支持 体に結合し、前記結合アームが、（ａ）一般式ＮＨ２−Ｒ１−ＮＨ２（式中、Ｒ １はＣ２−Ｃ２０アルキル基である）を有するジアミン類、 （ｂ）一般式ＮＨ２−Ｒ２−ＣＯ２Ｈ（式中、Ｒ２はＣ１−Ｃ２０アルキル基で ある）を有するアミノ酸、および （ｃ）一般式ＯＨＣ−Ｒ３−ＣＨＯ（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ２０アルキル基であ る）を有するジアルデヒド類 から成る群から選ばれた１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項４記載の固 定化サイトカイン。
6. （６）結合アームが、６−アミノカブロン酸、１，６−ジアミノヘキサン、１， １２−ジアミノドデカン、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物から成る群 から選択された１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項５記載の固定化サイ トカイン。
7. （７）サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、 ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、腫よう壊死因子、ガンマーインターフェロン、 アルファーインターフエロン、ベーターインターフェロン、エリトロポエチン、 か粒球コロニー刺激因子、ネズミか粒球コロニー刺激因子、か粒球ーマクロファ ージ・コロニー刺激因子、ネズミか粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、 インシュリン様成員因子Ｉ、インシュリン様成員因子ＩＩ、腫よう増殖因子ベー タ、類表皮成長因子、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子ベーシック から成る群から選ばれる、請求項１記載の固定化サイトカイン。
8. （８）サイトカインが、ＩＬ−２、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＮＦ、Ｆ ＧＦｂ、ＴＧＦｂ、ＰＤＧＦから成る群から選ばれる、請求項７記載の固定化サ イトカイン。
9. （９）サイトカインが、ポリエチレングリコール修飾ＩＬ−２または８１ａ１２ ５ＩＬ−２類縁体である、請求項８記載の固定化サイトカイン。
10. （１０）固体支持体が非多質である、請求項１記載の固定化サイトカイン。
11. （１１）固体支持体が、約０．５−５００μｍの直径を有する実質的に球形のビ ーズである、請求項１０記載の固定化サイトカイン。
12. （１２）球形ビーズが約１−７５μｍの直径を有する、請求項１１記載の固定化 サイトカイン。
13. （１３）固体支持体が約５−２００μｍの直径を有する短繊維である、請求項１ ２記載の固定化サイトカイン。
14. （１４）支持体が、無機支持体、例えばガラス、石英、セラミック、ゼオライト 、金金属および金属酸化物、ポリマー材料、例えば、スチレン、ジビニルベンゼ ン、エチレン、ブタジエン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、ア クリル酸およびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アク リルアミドおよびメタクリルアミドから成る群から選ばれるモノマー単位から誘 導されたホモポリマー、コポリマーおよびオリゴポリマー、炭水化物支持体、例 えばアガロース、架橋アガロース、デキストラン、架橋デキストラン、イヌリン 、ヒアルロン酸、セルロース、セルロース誘導体、澱粉および澱粉誘導体、およ び不溶性蛋白質材料、例えばゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンから成る群 から選ばれる、請求項１０記載の固定化サイトカイン。
15. （１５）支持体が、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジエン、アク リロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルおよびメタクリル酸のエス テル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミド から成る群から選ばれるモノマー単位から誘導されたホモポリマー、コポリマー またはオリゴポリマーを含む、請求項１４記載の固定化サイトカイン。
16. （１６）支持体が、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、水硫基およびハロゲ ンから成る群から選ばれる複数の官能基を有する官能化表面を含む、請求項１０ 記載の固定化サイトカイン。
17. （１７）サイトカイン依存性セルラインのインビトロ培養方法であり、固体支持 体に結合させた有効量のサイトカインとセルラインを接触させることにより、そ の成長を誘導することを含む方法。
18. （１８）依存性セルラインがＣＴＴＬ−２であり、サイトカインがＩＬ−２であ る、請求項１７記載の方法。
19. （１９）依存性セルラインがＡＭＬ−１９３であり、サイトカインが、ＨｕＧＭ ＣＳＦ、ＨｕＧＣＳＦおよびＩＬ−３から成る群から選ばれる、請求項１７記載 の方法。
20. （２０）依存性セルラインがＢａ１ｂ／３Ｔ３であり、サイトカインがＰＤＧＦ またはＦＧＦ−ベータである、請求項１７記載の方法。
21. （２１）依存性セルラインがＮＲＫ−４９Ｆであり、サイトカインがＴＦＧ−ベ ータまたはＥＧＦである、請求項１７記載の方法。
22. （２２）依存性セルラインがＤＡ１−Ｅ５であり、サイトカインがエリトロポエ チンである、請求項１７記載の方法。
23. （２３）細胞血液成分のインビトロ培養方法であり、固体支持体に結合させたサ イトカインの有効量を前記成分と接触させることにより前記成分の成員を誘導す ることを含む方法。
24. （２４）細胞血液成分がヒト末梢血リンパ球である、請求項２３記載の方法。
25. （２５）リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、腫よう浸潤性 リンパ球および細胞毒性Ｔ細胞から成る群から選ばれるエフエクター細胞のイン ビトロ培養方法であり、固体支持体に結合させたサイトカインの有効量を前記細 胞と接触させることにより前記細胞の成長を誘導することを含む方法。
26. （２６）固体支持体に結合させた有効量のサイトカイン注射することを含む、宿 主の免疫系における天然キラーまたはリンホカイン活性化キラー細胞のインビボ 刺激方法。
27. （２７）固体支持体に結合させた有効量のサイトカインを注射することを含む、 宿主の造血細胞生長のインビボ刺激方法。
28. （２８）造血細胞がか粒球マクロファージであり、サイトカインがＧＭＣＳＦで ある、請求項２７記載の方法。
29. （２９）宿主への導入前に固体支持体へサイトカインを結合させることを含む、 サイトカインを安定化させ、インビボ蛋白質分解的減成を実質的に低減化させる 方法。
30. （３０）宿主への導入前に固体支持体へサイトカインを結合させることを含む、 サイトカインの全身吸収およびサイトカインの吸収により誘発された毒性を阻止 する方法。