JPH04501065A - 改良されたバキュロウイルス発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サレタバキニロウイルス　ベタ９− アメリカ合衆国政府は、本発明の権利を有する。この研究は、国立衛生研究所の 研究費Ｎ、ｒ、Ｈ，Ｎｏ、Ａｌ２３７１９　ニ援助された。

挾１しし！ 本発明は、遺伝子発現の改良に関する方法および組成物に関する。より詳しくは 、本発明は、バキュロウィルス基における異種遺伝子の発現を改良するための新 規なプロモータ類に関する。

及豆旦麓盈 本明細書において、本発明の目的に対して下記の定義が適用される。

用語”発現”は、下記のように特徴づけられ得る。１個の細胞は、多くのタンパ ク質を合成する能力がある。細胞が合成することができる多くのタンパク質は、 常に合成されるわけではない。所定の遺伝子によりコードされた所定のポリペプ チドが細胞により合成されたときに、その遺伝子は発現されたといえる。発現さ れるために、その所定のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は該遺伝子の制御 領域に対して適切に配置されていなければならない。この制御領域の機能は、そ の制御の下に遺伝子の発現を許すことである。

用語”ベクター”とは、細胞中で複製され得る、完全なレプリコンを含む２本鎖 のＤＮＡである染色体外分子を指す。一般にベクターは、ウィルス、または細菌 および酵母のプラスミドに由来する。バ牛１０ウィルスベクターはパキュロウイ ルスレプリフンを含む。

用語”遺伝子”とは、１本のタンパク質鎖の合成のための情報を伝達し、その合 成を指示するＤＮＡ配列を指す。

用語”感染”とは、細胞の複製および増殖に好ましい条件において、細胞への作 用物（例えばウィルス、細菌など）による侵入を指す。

用語”　トランスフェクシ璽ン”とは、ウィルスの精製された核酸を細胞に感染 させる技術を指す。

用語′異種遺伝子”は、ここではバキエロウイルスベクターに関連し、通常はそ のベクターが由来するウィルスにより生産されるのではなく、組換えＤＮＡとし て細胞に導入されるか、あるいは、組換えＤＮＡゲノムを有するウィルス内に存 在するポリペプチドをコードするＤＮＡをさす。ここで使用される用語”パラセ ンジャー遺伝子”あるいは”パラセンジャーＤＮＡ”は、用語“異種遺伝子”と 同等である。ここで使用される”外来性の“とは、′異種の”と同意である。

用語”　トランスプレイスメント　プラスミド”とは、ウィルスベクターの構築 における中間生成物として使用される細菌ベクターをさす。トランスブレイスメ ンドブラスミドは、同種の組換えにより、外来性ゲノム情報のウィルスゲノムの 特定部位への転移を促進する。上記外来性ゲノム情報とは、例えば、新規プロモ ーター、およびそのプロモーターの制御ノ下に存在する異種構造遺伝子の組み合 せである。この同種の組換えは、そのキメラ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列により 生じる。

遺伝子工学は、生化学的に有用なある種の生産物が多量に生産され得る段階にま で発展してきた。例えば、２つの商業的に成功した医薬品であるヒト成長ホルモ ンおよび組織プラズミノーゲンアクティベーター（ｔ−ＰＡ）は、今や多量に生 産され、病理学的な種々の治療に使用されている。しかし、科学者は、種々の生 化学的な系においてタンパク質や他の生産物を生産するための新しくより能率的 な系の発見を絶えず試みている。

遺伝子を１つの種から他の種に転移し、かつ発現させる技術は、全ての生物のＤ ＮＡが、同じ４個のヌクレオチドを含有する長い鎖を有する化学的に類似したも のであるという理由により、可能となっている。ヌクレオチド配列は、基本的に 全ての生物種に同様のアミノ酸とヌクレオチド配列との対応関係により特定のア ミノ酸をコードするコドン（トリブレブト）で配列されている。ＤＮＡは、遺伝 子の発現の開始を媒介する制御領域およびフード領域を含む遺伝子に組み立てら れている。

これらの制御領域は、一般に、′プロモーター”と呼ばれる。

ＲＮＡポリメラーゼと称される酵素は、プロモーター領域に結合し、さらに活性 化されるか、あるいは何らかの方法で指令を与えられる。このことによりこの酵 素はコード領域に沿って移動し、そのＤＮＡからメツセンジャーリボ核酸（謬Ｒ ＮＡ）へ二一ドされた情報を転写する。そのｍＲＮＡは、認識シグナルを含有す る。それは、リポソーム結合についてのシグナルと、翻訳の開始および終止シグ ナルと、ボリアデニール化についてのシグナルである。次に細胞性リポソームは 、＋ｅＲＮＡのヌクレオチドコドンの情報を、ヌクレオチドコドンにより決定さ れるアミノ酸配列をもつタンパク質に翻訳する。

制限エンドヌクレアーゼの一般的な使用、ならびにＤＮＡ配列を操作する能力は 、有用な制限部位の配列を含有する、望ましいヌクレオチド配列を有する２本鎖 のオリゴヌクレオチドを化学的に合成できることができるようになり太き（改良 されている。実質的には、天然に存在する、クローンされた、遺伝的に変化させ られた、あるいは化学的に合成されたＤＮＡセグメントは、適切な配列あるいは 認識部位がＤＮＡ分子の末端に接続することにより、他のどのようなセグメント とも対になり得る。この生成物は、適当な制限エンドヌクレアーゼの加水分解作 用によりＤＮＡ分子を結合させるために必要な相補的末端を生じる。遺伝子転移 のスキームには、種々の多くの変形が存在し得るが、その技術においては、それ らの配列の発現を可能とするようにプロモーター領域に関して適切なｆＥ置およ び方向に、ＤＮＡ配列を挿入するこが可能であることに、注目すべきことが重要 である。あらゆるＤＮＡ配列は、人工的な組換え分子、あるいはキメラ、あるい はハイブリッドＤＮＡと呼ばれる複合体を構築するためにベクター分子に挿入さ れ得る可能性がある。大部分の目的においては、用いられるベクターは、２本鎖 の染色体外ＤＮＡ分子であり、このＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子が形質転換 により細菌や酵母に入れられたときに複製され得るための完全なレプリコンを含 有する。通常使用されるベクターは、ウィルス出来であり、あるいは細菌および 酵母に関連するプラスミドである。

遺伝コードの性質のため、挿入された遺伝子あるいはその遺伝子部分は、ベクタ ーが複製する細胞中において発現を調節し得る制御領域（プロモーター）に結合 するならば、それがコードしているアミノ酸配列の生産を指示する。

プロモーター領域に対して適切な関係に、クローン化された遺伝子が配置された 発現ベクターの構築のための一般的な技術は、文献（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、 （１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）に開示されている。

上記の一般的なスキームと技術とを利用する多くのベクター系は、遺伝子的に修 飾された生物によるタンパク質の、商業的あるいは実験的な合成に使用されるた めに開発された。

これらの多くのベクター系では、ベクターの複製および異種遺伝子の発現のため に、原核性の１１１ｒｓ性の宿主を用いる。さらに、ベクターの複製および異種 遺伝子発現のために真核性の細胞を用いる系も用いられてきた。このような系は Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原の合成、およびヒト組織プラスミノーゲンアクティ ベーターの合成に用いられている。

真核性の宿主は、生物学的に活性になるために、合成のあとに修飾を必要とする （例えば糖付加）、真核細胞のタンパク質の生産に望ましい。原核性細胞は、一 般にこのような修飾を行えない。

真核性宿主においてウィルスベクターを使用することは、最近のかなりの量の研 究において課題となっている。ウィルス性ベクター系には、その有用性を減じる 重大な不都合ならびに限界がある。例えば、ある種のウィルス性ベクターは、価 格的に高くつく真核細胞の培養系において経済的にタンパク質を生産するために 、遺伝子発現を十分に高レベルに到達させることができい。ある種の真核細胞に 対するウィルス性ベクターは、哺乳類系において病原性あるいは発ガン性があり 、突発的感染と結び付く重大な、健康および安全性についての潜在性な問題をも たらす可能性がある。ある種のウィルス性ベクターには、そのウィルス粒子の中 へ安定に挿入することができる異種遺伝子の大きさに関して、きびしい制限があ る。

遺伝子工学の技術がより高度になるにつれて、１個を越える異種遺伝子の、例え ば１個を越えるタンパク質をコードする遺伝子の調和的な発現を達成し、種々の 遺伝子生産物の調和的な活性を得るために、これらを宿主細胞に挿入することの 興味が増している。

理想的なウィルス性のベクターとは、異種ＤＮＡの大きいセグメントを安定に保 有する能力があり、効果的に細胞を感染させる能力があり、その細胞のタンパク 質合成のすべてを、実質的に外来の遺伝子を高度に発現するように変化させるよ うな能力があるものである。高度に真核的な環境における多くの異種遺伝子の、 増殖ならびに高レベルの発現においてベクターに適したウィルスは、バキユロウ イルスＡｕｔＯｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　核ポリへドロシス（核多 角体病）ウィルス（ＡｅＭＮＰ■）である、（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ、に、（１９８ １）−Ｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ　ｉｎ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ、−Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｓ ｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｓｅｓ、　Ｎ、　Ｐａｎｏｐ ｏｌｏｕｓ編、Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌ、、Ｎ、Ｙ、、ｐｐ、２０３−２２４ ；米国特許　Ｎｏ、　４．７４５．０５１）バキュロウィルス群には、核ポリへ ドロシスウィルス（ＮＰＶ）とグラヌロシスウイルス（ａｙ）のサブグループが 存在する。

バキュロウィルスは、節足動物宿主のみに感染する。ＮＰＶおよびＧＶのウィル ス粒子は、タンパク質性の結晶中にとじこめられている。バキユロウイルスのと じこめられた形態において、ピリオン（エンベロープに包まれたヌクレオカプシ ド）は、結晶性タンパク質マトリックス中に埋め込まれている。この構造は、封 入体ないしは包接体とよばれるが、自然界において生体外で見いだされる形態で あり、そして生物間の感染を広めることに一役かっている。サブグループＮＰＶ は、１つの大きい（５μ冒にも達する）多面体結晶中に封入された多くのピリオ ンを生産する。他方、サブグループＧｖは、小さな結晶中に封入された１個のピ リオンを生産する。そのいずれの形態においても結晶性タンパク質マトリックス は、ＮＰＶあるいはＧＶにおいて各々ポリヘトリンあるいはグラヌリンとして知 られている２５ｋＤａから３３ｋＤａの単独のポリペプチドから本質的に構成さ れている。

バキユロウィルスの構造ならびに感染の過程についてのより一般的な情報は、下 記の総説にある。：　Ｃａｒｓｔｅｎｓ　（１９８０）−Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ ｓｅｓ−Ｆｒｆｅｎｄ　ｏｒ　Ｍａｎ、Ｆｏｅ　ｏｆ　Ｊｎｓｅｃｔｓ？、−Ｔ ｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、５２：１０７ −１０；　Ｈａｒｒａｐ　ａｎｄ　Ｐａｙｎｅ　（１９７９）−Ｔｈｅ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　１ｎｓｅｃｔ　Ｖｉｒｕｓｅｓ−ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　 Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ４ｏ１．２５．Ｍ、Ａ、Ｌａｙｅｒら編、Ａｃａｄ ｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、２７３−３５５；および Ｍｌ　１１ｅｒ、　Ｌ、に、（１９８１）　（、前出）。

バキ二ロウイルスヘルパー独立性のウィルス性ベクターは、特に、生物学的に活 性な真核性のタンパク質の高レベルの生産に有用である。い（つかの外来遺伝子 の発現レベルは、組換え感染細胞の総タンパク質の１０％から２５％であると報 告されている。１本鎖のペプチドの断片、糖付加、りん酸化、重合、複合体の形 成、単離ならびにタンパク質の加水分解などの翻訳後の適当な修飾は、この発現 系を用いて生産された種々の興なる異型タンパク質について報告されている。

現在まで開示されているバキ二ロウイルス発現ベクターは、外来遺伝子発現を導 くために超後期プロモーター（ｖｅｒｙ　ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）、たとえ ば、ポリヘトリンあるいはポリペプチド１０（ｐｌｏ＞プロモーターを使用して いる。（Ｌｕｃｋｏｗ　ａｎｄ　Ｓｕ＋ｓｍｅｒＳによる総説（１９８８）−Ｔ ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｓ＋ｅｎｔ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖ ｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、＋旧ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　６：４７−５５；Ｍｉｌｌｅｒ几、に、　（１９８８）−Ｂａｃｕｌｏ− ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　Ｇｅｎｅ　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ、　” Ａｎｎ、Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４２：１７７−１９ ９．）これらのプロモーターは、ウィルス感染の過程の間に調節され、非常に遅 く通常感染後１８から２４時間後に開始する感染過程において活性化される。ポ リヘトリンならびにｐ１０遺伝子は、細胞培養における複製に欠くことのできな いものではない。従って、この遺伝子は、出芽状態のウィルスの生成に影響する ことなく、問題としている異種遺伝子と置き換えられ得る。しかしながら、ポリ ヘトリン遺伝子置き換えは、ウィルスの封入体形成に影響する。組換え体のプラ ーク中に封入されたウィルスが存在しないことにより、組換えウィルスについて の表現型の選択がなされ得る。これは有用であるが、いくぶん繁雑である。これ はまた、昆虫の幼虫においてより安価にタンパク質を大量生産するのに、組換え ウィルスを使用することの可能性に限界を与える。

バキ二ロウイルスベクターの経済的価値および一般的な有用性は、異種遺伝子の 発現を導くために用いられるプロモーターの性質に強く依存している。ポリへド リンプロモーターは、タンパク質の高レベル生産のために広く一般にえらばれる プロモーターである。しかしながら、しばしばより高レベルのタンパク質生産が 経済的な実現性のためには必要とされる。

高生産性に加えて、ベクターには、１個以上の異種遺伝子を発現し得ることが必 要とされてる。このようなベクターの不都合さは、ベクター内でプロモーター配 列が複製されるときにそれらがゲノムとして不安定であることである。その不安 定さを最小限にするために、もう１つ別のプロモーターが、個々の異種遺伝子の 発現のためにもちいられなければならない。これらのプロモーターは、ゲノムの 不安定さの問題を避けるために、ベクター内に自然に生じるウィルス性プロモー ターとは興なる（非相同であるンべきである。ベクターはまた、タンパク質生産 の初期において遺伝子発現を行うプロモーターを含む能力をもたねばならない。

このことによりタンパク質の品質を同上させ、タンパク質は翻訳後の必要な修飾 を受け生物学的活性あるいは免疫学的性質を有するようになる。このような、翻 訳後の修飾は、ＡｃＭＮＰｖベクターの超後期プロモーター、例えばポリヘトリ ンおよびｐｌｏが活性化されるとき、感染の超後期段階において減少するように みえる。

バキ１０ウィルス系において異種遺伝子の著しく増加された発現をもたらすか、 あるいは、高品質タンパク質の生産を可能とする、修飾され、あるいは合成され たプロモーター領域が必要とされる。新しいプロモーターは、十分適応性を有す るべきものであり、単独の異種遺伝子、あるいは一連の異種遺伝子がベクター系 へ挿入され、そのことにより種々のタンパク質が１度に、あるいは異なる時期に 生産され得る。さらに、もしもベクターが適切な昆虫宿主へ経口投与され得るな らば、ポリヘトリン遺伝子が、存在するべきである。

及朋ｆ１枚 本発明は、新規あるいは修飾されたプロモーターの制御の下に、異種遺伝子を配 置することによりその異種遺伝子を発現させるために、バキニロウイルス遺伝子 発現ベクターを用いる改良された方法を提供する。より好ましくは、上記プロモ ーターは遺伝子の高レベル発現を促進し、昆虫細胞における遺伝子生産物の適切 な翻訳後の修飾を可能とする新規プロモーターである。より詳細には、好ましい 実施態様においては、本発明は異種遺伝子が接続され修飾されたバキニロウイル スプロモーターを提供することを包含する。本プロモーターは、トランスブレイ スメンドブラスミドにより、あるいは直接挿入により、ウィルス中へ挿入され、 適当な宿主細胞に感染するために用いられる組換えウィルスベクターが生産され る。その感染された宿主細胞は異種遺伝子産物を生産するために用いられる。

本発明によれば、異極遺伝子の発現レベルあるいは、遺伝子の収集（ｃｏｌｌｅ ｃｔｔｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ）のレベルを向上するための方法ならびに組成が 開示される。本発明は、パ牛二ロウイルス発現系において機能する天然バキ：Ｌ ロウイルスプロモーターの修飾物あるいは合成的に修飾されたプロモーターを含 む新規プロモーターを包含する。その新規プロモーターは、２個の開始部位を持 つプロモーター（例えば、２個のＡＴＡＡＧ）のような組み合せプロモーターま たは、２個の異なるプロモータ期プロモーターのような、プロモーターの組み合 せであり得る。本発明は、また新規な配！ないしはゲノムの方向づけにおける外 来遺伝子の配置を包含することも意図する。全ての前記プロモーターは、ここで は、′修飾されたバキュロウィルスプロモーター”と称する。

本発明の修飾されたバ牛二口ウィルスプロモーターは、Ａ４Ｔにきわめて富む領 域が隣接したＡＴＡＡＧ配列でなる群から選ばれる１またはそれ以上の特性を有 している。このＡＴＡ、ＡＣ配列は、上流の活性化配列であり、転写開始部位の 約１０ないし約３０ｂｐ上流に位置しており、約１０ｂｐのＧＣに富む配列であ り、リンカ−・スキャン・プロモーターであるＬＳＸＶＩ、　ＬＳＸＩＶ、およ びＬＳＸＶｌｌの上流賦活化配列に類似Ｌ７ており、外来遺伝子に偶然に存在す る’ｒＡＡＧ配列から起こるアンチセンス転写を阻止するために、望ましい転写 に対立する配置においてポリアデニル化部位（Ａ２［ＩＡ３部位）であり、そし て、３個の非常に遅いプロモーター（ｖｐ３９．　ｐｌＯ，ｐａ、　９）の１個 以上および／または、非常に強く発現する、非常に遅い遺伝子（ポリヘトリン、 、　、　ｐｆｏ）とからなる選ばれた要素である。これらの要素の選択は、豊富 に発現された後期ならびに超後期遺伝子の非翻訳リーダー配列中での存在または 保存に基づく。修飾されたプロモーターの上流の活性配列（ａｃｔｉｖａｔｏｒ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ）は、下流に位置する転写開始部位での転写レベルを増すた めに作用する配列である。

バキニロウイルス発現ベクターにおいては、後期あるいは超後期プロモーターを もちいるためには、上流の活性配列は、ＧＣに富む配列であり、少なくとも約６ ０％Ｇ＋Ｃのヌクレオチド組成をもつ。

本発明の修飾されたプロモーターは、他のＡｃＭＮＰＶプロモーターと、限られ た配列の相同性あるいは連続性を持っているにすぎない。この新規なプロモータ ーの主たる利点はｓ　ＡｃＭＮＰｖゲノムのいかなる領域にも、そのＡｃＭＮＰ Ｙゲノムの他の領域と組換えをおこさないで安定して組み込まれ得る点にある。

この修飾されたプロモーターは、ポリへドリンプロモーターよりも強力に設計さ れ得る。

本発明の修飾されたプロモーターは、当業者において周知の方法によっていくつ かの異なるトランスブレイスメンドブラスミドに挿入されてきた。例えば、プラ スミドｐｓｙｎＶＩは、３．１から６．１６　ｍａｐ−Ｌ−−／トの間のＡｃＭ ＮＰＶ配列中で、ＥｃｏＲＶからＫｐｎｌまでのセグメントの代わりに合成プロ モーターを含有する。本発明の一面によれば、プロモーターの方向は、発現の方 向が正常のポリヘトリン遺伝子発現の方向と反対であり、それ故、外来遺伝子が この方向に位置するとき、遺伝子発現が潜在的に増大するという利点を持つ。外 来遺伝子はこのプラスミドのマルチクローニング部位に位置し得、そして、組換 えウィルスは封入された負の表現型に基づいて同定され得る。

第２のトランスブレイスメンドブラスミドｐｓｙｎＶｌｌ−ｗｔｐは、合成プロ モーター（パラセンジャー遺伝子挿入のためのマルチクローニング部位を有する ）、および野生型ポリヘトリンプロモーターの制御下に、ポリヘトリン遺伝子を 有する。このトランスブレイスメンドブラスミドは、ポリへドリンー欠損変異ウ ィルス由来のＤＮＡを共トランスフェクトされると、ポリヘトリンと外来遺伝子 の生産物との両者の生産を指令する組換えウィルスの構築（あるいは形成）が可 能となる。その利点は２倍となる。すなわち、つまり組換えウィルスは、容易に 見え、かつ速やかに選択されうる（正の封体で）表現型を有しており、そして、 その組換えウィルスは経口的に昆虫に感染し得る。それ故に、容易に昆虫におけ る大量生産のために用いられる。

トランスブレイスメンドブラスミドは、種々の状態で発現を増大する多くの付加 的な方法において操作され得る。例えば、外来遺伝子の挿入に効果的なポリアデ ニル化部位が含有されていない場合に、能率的なポリアデニル化が起きるように 、マルチクローニング部位に、および外来遺伝子挿入の下流にポリアデニル化シ グナルをふくむことが有用である。トランスブレイスメンドブラスミドの構築に 使用されなかったマルチクローニング部位の部分は、ＡＴＧの近くのＡＣＴに富 むリーダー配列およびＡＡＣＡＡＴ配列が高発現されたバキュロウィルス遺伝子 （すなわち、ｖｐ３９．　ｐｌｏ、およびｐａ、　９）にとって好ましいもので あるから、発現を同上するために削除される。

リンカ−スキャン修飾から、あるいは他のプロモーターの要素から修飾されたプ ロモーターを構築する能力は、プロモーターを設計することにおいての新規な試 みである。その新規プロモーターのほとんどの構成要素は、１つの理論的な順序 で配列される。非翻訳リーダー配列の要素の順序には融通性があるようである。

従って、本発明によれば、修飾されたプロモーターにより多数の異種遺伝子が１ つのベクターにより発現されることが可能となる。

本発明の１つの目的は、１を越える異種遺伝子が１つのベクターで発現されるこ とを可能とする、修飾されたプロモーターを持つバキ二ロウイルスベクターを提 供することにある。

本発明のさらにもう１つの目的は、ウィルスゲノムの一部の相同組換えおよびそ れに続いて起こる欠失あるいは変換の可能性を実質上避けるために、ウィルス中 での他のプロモーターとは、その配列において十分に異なる修飾されたプロモー ターを提供することにある。

本発明のさらにもう１つの目的は、適切な昆虫宿主に経口投与され得る組換えバ キニロウイルス発現ベクターを提供し、その結果昆虫宿主ウィルスベクター系が 所望の異型タンノくり質を生産することが可能となることにある。

さらにもう１つの目的は、ポリヘトリン系と比較して、異型タンパク質の発現の 増加を可能とする、バキュロウィルス基における発現ベクターを提供することに ある。

本発明のこれら、および他の目的の特性と利点は、下記の開示された実施態様の 詳細な記述ならびに添付の請求の範囲により明らかである。

培養された宿主細胞において複製能力のあるバキユロウィルスは、本発明のベク ターに変換するのに有用である。好ましくは、使用されるバキユロウィルスは、 核ポリへドロシスウィルスであり、更に好ましくは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｅａ 　ｃａｌｉｆｏｒｎＬｅａである。

本発明のベクターは、当該分野において周知の遺伝子工学技術により調製され、 好ましくは、本発明の修飾されたプロモーターを含有するキメラ遺伝子を、挿入 することにより調製される。このような挿入は、上記バキユロウィルスの複製機 能を妨害することなく挿入を許容し得る前記ゲノムの領域において、相同組換え を行うことにによってなされ、これらは、当業者にとって明かである。該プロモ ーターの制御の下に配置された異種遺伝子と組み合わせてバキユロウィルスのゲ ノムへ挿入することにより調製される。

本発明の修飾されたプロモーターの制御の下の異種遺伝子の発現に有用な宿主細 胞とは、当業者に周知であるようにその中で本発明のバ牛二ロウイルスベクター が、複製および発現の可能な昆虫細胞のことであり、インビトロで培養された昆 虫細胞ならびに昆虫の幼虫をも包含する。

本発明の後期および超後期プロモーターの保存された配列は、当業者にとり容易 に同定され得、そして、表１にその例が示されている。

当業者に周知のいかなる上流の活性化配列も本発明のキメラ遺伝子の発現を増強 するために使用される。本発明の好ましい上流の活性化配列は、約ｔｏｂｐのＧ ＋Ｃに富む配列であり、さらに好ましくは、配列ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧにより例 示される旧ｎｄｌ＋１部位リンカ−である。

発現ベクターとして作用するバキユロウィルスと相同であり、本発明のキメラ遺 伝子に隣接する、当業者に周知の配列を有するいかなるトランスブレイスメンド ブラスミドも、本発明の実施に使用し得る。この相同の隣接する配列は、バキユ ロウィルスに対するトランスブレイスメンドブラスミドからキメラ遺伝子の相同 組換えを引き起こすのに十分なくらい長くなければならないと理解されている。

本発明により例示されているトランスブレイスメンドブラスミドは、　ｐｉ：ｖ ｓｓおよびその誘導体である。

図面の簡単な説明 第１図は、ＰｈｃＬＳＸＩＶと呼ばれるプラスミドの模式図である。

第２図は、ｐｓｙｎＶ［−と呼ばれるプラスミドの模式図である。

第３図は、ｐｓｙｎＶＩ＋マｔｐと呼ばれるプラスミドの模式図である。

第４図は、Ｉ）ＳｙｎｗｔＶＩ−と呼ばれるプラスミドの模式図である。

第５図は、ｐｓＰＬｓＸＩＶＶ［＋ｃＡＴと呼ばれるプラスミドの模式図である 。

第６図は、ｐＬｓＸ［ＶＶＩ＋ｃＡＴと呼ばれるプラスミドの模式図である。

第７図は、プラスミドｐｈｃｖｔの模式図である。

第８図は、プラスミドｐＥＶ＋ｅｏｄの模式図である。

第９図は、プラスミドｐＥＶ＋ａｏｄＸ　ＩＶの模式図である。

第１０図は、プラスミドｐＳｙｎＶ　Ｉ−ＣＡＴの模式図である。

第１１図は、プラスミドｐＳｙｎＶ　Ｉ＋ｖｔｐＣＡＴｌの模式図である。

第１２図は、プラスミドｐｓｙｎｗｔＹＩ−ＣＡＴＩの模式図である。

第１３図は、プラスミドｐＬｓＸＩＶｓＶＩ＋の模式図である。

第１４図は、プラスミドｐＬｓＸＩＶ２の模式図である。

第１５図は、プラスミドｐｈｃ３９の模式図である。

第１６図は、プラスミドｐＥＶｖｐ３９／ＬＳＸＩＶ　ＣＡＴの模式図である。

箪１７図は、プラスミド模式図についての説明書きである。

バされた　の　な１日 本発明によれば、バキニロウイルス発現ベクター中の遺伝子の発現あるいは遺伝 子の収集を改良するための方法および構成が提供される。より詳細には、本発明 は、外来遺伝子の発現を導くのに用いられ、そして感染の間に生産されるタンパ ク質の質の改良をするための新規なプロモーターを含有するプラスミドを提供す る。この新規なプロモーターは、必要に応じて、合成プロモーター、天然プロモ ーターの修飾物および／または、天然型、修飾型あるいは合成型プロモーターの 組み合せを含有し得る。この新規なプロモーターは、また、組み合されたプロモ ーターを含有する。それには２つの開始部位（すなわち２つの＾ＴＡＡＧ）を有 するプロモーター、あるいは、例えば初期／超後期プロモーター、あるいは後期 ／超後期プロモーターのような２つの異なるバキユロウィルスのプロモーターの 組み合せが含まれるがこれらに限定されない。

本発明はまた、新規位置へ、あるいはゲノムの位置づけにおいて、プロモーター 外来遺伝子を配置させることをふくむことを意図する。

昆虫バキｘｏウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａＩｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリへ ドロシスウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）は、広く遺伝子発現ベクターとして用いられ る（ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓによる総説、Ｔｒｅｎｄｓｉｎ　ｔｈｅ 　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ。

Ｂ１ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：４７−５５，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ 、に、、　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓａｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ａｎｎ、Ｒｅｖｉｅｖ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

４２：１７？−１９９，１９８８）。ヘルパー独立性ウィルスベクター系は、一 般に、超後期ウィルスプロモーター、つまりポリへドリンプロモーターあるいは ｐｌＯプロモーターの制御の下にＡｃＭＮＰＶゲノム中で発現される外来遺伝子 の挿入物を含む。この２つの新規なプロモーターは、各々の遺伝子の高レベルの 転写を行わせ、その結果、感染過程の最後の段階、すなわち、封入段階でｍＲＮ Ａの高い定常状態のレベルをもたらすので、特に有用であると考えられる。封入 、すなわちウィルス粒子が疑似結晶性のタンパク質マトリックス中へ埋め込まれ ることは、宿主幼虫の効果的な経口感染に必要とされるにもかかわらず、細胞培 養におけるウィルスの増殖には必須なものではない。

それ故に、封入段階に特定の遺伝子を再配置すること、および封入遺伝子の代わ りに異種遺伝子を高レベルで発現させることは、細胞培養中の感染の原因である 非封入性ウィルス（出芽性ウィルス）による生産に対し何ら観察できる影響を及 ぼさない。

バキュロウィルス発現系は、バキュロウィルス遺伝子の構造、あるいはバキュロ ウィルスプロモーターの性質についてのほんのわずかの知識をもとにして当初は 発展した。（上記Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｌ、　’１．　、１９８１）ポリへドリンプ ロモーターに基づくベクター系に対して開発された最初のトランスブレイスメン ドブラスミドの１つはｐＡｃ３７３であった。これは、遺伝子発現の通常レベル に必要な配列のいくつかが、このベクター中にはないことが報告される以前には 広く使用されていた（ＭａｔＳｕｕｒａら（１９８〕）−Ｂａｃｕｌ。

ｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｔｈｅ　ｒｅｑｕｉｒｅ ｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　１ｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ、１ｎｃｌｕｄｉＢ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６８：１２３３−１２５０）　ｏ　ポリヘトリン遺伝子の ＋１　（ＡＴＧのＡ）の位置のすぐ上流のヌクレオチドを含有するトランスブレ イスメンドブラスミドは、今やベクターの使用にとり推薦される（上記Ｌｕｃｋ ｏｖ　ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８ｇ）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ、に、（１９８ ｇ））。

＋１　（例えば、ポリヘトリンのオープンリーディングフレームの中で）下流の 位置のヌクレオチドは、最適な転写効果には必要とされていない（上記Ｃａｒｂ ｏｎｅｌｌら（１９Ｂｇ）″昆虫特異性サソリ神経毒をコードする遺伝子の合成 およびバキュロウィルスをもちいてそれを発現する試み”　Ｇｅｎｅ、？３：４ ０９−４１８）。

本発明により配列をコードするポリヘトリンのすぐ上流領域のリンカ−スキャン 変異分析は、この領域のいくつかの新しい性質をあきらかにした。プロモーター 活性の第一の決定要素は、翻訳開始部位のＡＴＧ（＋１．＋２．４３）に関して 、−５０に位置した転写開始部位の配列ＴＡＡＧＴＡＴＴ中に存在する。転写開 始部位に接続した配列は、より巧妙な方法により、転写のレベルならびにリポー タ−遺伝子の発現に影響する。ＴＡＡＧＴＡＴＴの上流にある１０から３０まで の配列のリンカ−の再配置により、転写のレベルおよび遺伝子の発現は５０％増 大する。一方、ＴＡＡＧＴＡＴＴと＋１位置（すなわち、翻訳されていないリー ダー領域を特定する配列中のことである）の間でリンカ−を再配置するとプロモ ーター活性は２倍からｌＯ倍調節が減じる。リポータ−遺伝子および９３このヌ クレオチドよりなるポリヘトリン”プロモーター″　（すなわち、＋１から−９ ２までのこと）のゲノム方向を逆にもどることにより、天然の方向において観察 される場合に比べて、リポータ−遺伝子の発現は、同等あるいはわずかに高レベ ルになる。いかなる変異も遺伝子発現の一時的な調節も変化させない。修飾され たポリへドリンブロモータからの全ての遺伝子発現は、非常に遅い段階に限定さ れる（Ｒａｎｋｉｎう（１９８ｇ）”バキ二ロウイルスポリヘドリン遺伝子発現 のための転写開始点および重要な決定因子を包囲する８塩基対″　Ｇｅｎｅ　７ ０：３９−４９．ここに取り入れられている参考文献）。

非常に遅いポリヘトリンおよびｐｌＯプロモーターは、たぶん外来遺伝子発現に 対して最も望ましいプロモーターであると考えられているにもかかわらず、外来 遺伝子発現を導く遅いプロモーターの相対的な能力は、直接には験証されたこと がない。ｖｐ６．９（コア）ならびにｖｐ３９　（カプシド）をコードする最も ひんばんに発現された２つの遅いウィルス構造遺伝子は、位置がきめられ、配列 がきめられ、ならびに転写地図が決められた（Ｗｉｌｓｏｎら（１９８７）“小 さなアルギニンリッチポリペプチドをコードするバキュロウィルスの配置および 転写ならびに配列″Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６１：６６１−６６６）。これら の遺伝子は、感染後１２時間、および強いポリへＦリンプロモータからの転写前 約１２時間の間に十分に転写された。ｖｐ６．９とｖｐ３９遺伝子の生産物は、 ウィルスの封入型と出芽型について要求される。それ故に、これらの発現は、感 染後の非常に遅い時期の間中、継続ならびに外来遺伝子に対してポリヘトリンあ るいはｐ１０プロモーターよりさらに長い時間をかけることが期待されている。

、非常に遅い時期における外来遺伝子生産物の特異的発現は、その生産物が出芽 性のウィルス合成を妨げるような外来遺伝子の発現にとって望ましいと考えられ る（上記Ｍｉｉ　ｌｅｒ、　Ｌ、　Ｋ。

（１９８１））。

しかしながら、多くの異種遺伝子生産物は、ウィルス合成に不利に作用しないし 、ならびにより早い時期の高レベルの発現は生産展望からして有利である。遅い 段階での発現は。

また非常に遅い段階での効果的転写後の修飾に対してより好ましい。宿主の核ｍ ＲＮＡ転写物は、感染後の１２時間から２４時間の間に劇的に減少する。そして 翻訳後の修飾は、最初に、宿主遺伝子生産物により伝えられるのであるが、発現 の非常に遅い段階において非効率的にみえる。本発明者は、遅いカプシドプロモ ーター、すなわちｖｐ３９プロモーターは、遅い段階において外来遺伝子の発現 を導くのに優れていることを見いだした。ポリへドリンプロモーターは、感染後 １２時間から２４時間の間に約５から８倍性能が上昇する。

本発明は、天然ウィルスポリヘトリンならびにｐ１０プロモーターのような、非 常に遅いプロモーターによりもたらされるよりも、外来遺伝子の高レベル発現を もたらすためのパキニロウイルス遺伝子発現ベクターの改良を包含する。本発明 はまた、２つの異なる研究方法を含有する＝（１）ポリへドリンプロモーターの 転写開始点に接続する上流配列の修飾、および（２）外来遺伝子発現を導くため の遅いｖｐ３９　（カプシド）プロモーター、あるいは遅い／非常に遅いプロモ ーターの組み合せの利用である。プロモーターと外来遺伝子のゲノム配置を逆に することは、遺伝子発現のレベルにはほとんど影響がないようであるし、ならび に１個のバキ二口ウイルスベクターにより命令される２個あるいはそれ以上の外 来遺伝子の同時の転移および発現のためのプラスミドのデザインを可能にする。

加えて、本発明に従うと、新規な合成プロモーターは、他の天然バキュロウィル スプロモーターと最小のＤＮＡ配列の相同性をもつようにデザインされた。

このようなプロモーターは、１個の組換えウィルスを用いる１個より多くの外来 遺伝子の発現に有用であり、ならびに、ベクター中で、天然ウィルスプロモータ ー配列を複製する必要性を除外する。それにより、繰り返されたプロモーター配 列の間での同型の組み換えによるゲノムの潜在的な不安定性が最小になる。

本発明の一部として下記の能力のあるバキ二ロウイルス発現ベクターの形成を仲 介するトランスブレイスメンドブラスミドについて開示している。（１）遺伝子 発現の高められたレベル、（２）２つのパラセンジャー遺伝子の同時発現、（３ ）非常に遅い段階および遅い段階におけるパラセンジャー遺伝子の発現、および ／または、（４）パラセンジャー遺伝子およびポリヘトワンタンパク賀両者の同 時発現。トランスブレイスメンドブラスミドは、外来遺伝子挿入のための有用な 制限部位、すなわち、プロモーターの下流の適切な部位にあるマルチクローニン グ部位を提供することより、そして外来遺伝子が完全なものにされ得るようにウ ィルスゲノムの領域から、ウィルスＤＮＡの配列を接続させることにより、バキ ニロウイルスゲノムの中への外来遺伝子の挿入を促進する。接続しているウィル ス配列は、組換えられていないウィルスＤＮＡと、組換えウィルスベクターをも たらすために、組換えられたトランスブレイスメンドブラスミドとの間に細胞に より仲介される相同的組換えのための部位を提供する。

本発明者は、ポリヘトリンＴＡＡＧＴＡＴＴの上流のリンカ−スキャン変異は、 野生型ポリへドリンプロモーター（Ｒａｎｋｉｎう、（１９８８）上記）に比べ て転写と外来遺伝子発現とを増大することを見いだした。第１図に示されている プラスミドｐｈｃＬｓＸＩＶ。

およびこれと同じプロモーターと基本的なマルチクローニング部位とをもつがＣ ＡＴ遺伝子を欠＜　ｐＥＶ■ｏｄＸＩＶは、リンカ−スキャン　変異プロモータ ーを含有し、現在、ＬＳＸＩＶプロモーターといわれている。ｐｅＥＶ＋＊ｏｄ ＸＩＶ由来のウィルスあるいはｐｈｅＬＳＸＩＶ由来のウィルスは、既知のリン カ−スキャン修飾よりも高レベルのリポータ−遺伝子（ＣＡＴ）発現をもたらす 。ＬＳＸＩＶプロモーターの制御の下に、ＣＡＴリポータ−遺伝子をもつウィル スからの発現は、本発明者により、ポリへドリンプロモーター（すなわち、ｐｈ ｃｖｔ由来の、第１０図に示されている野生型ポリへドリンプロモーターを含有 する組換えウィルスからのＣＡＴ遺伝子発現に比較してのことである）からの発 現に比べて５０％高いことが示された。

それ故に、本発明の好ましい実施態様は、ＴＡＡＧＴＡＴＴ配列の上流での種々 の修飾を有するプロモーターを含有するいくつかのプラスミドを包含する。第１ 図にしめされるｐｈｃＬｓＸＩＶと呼ばれるプラスミドは、このような修飾され たプロモーターを含有するプラスミドの例である。このような性質を持つ他のプ ラスミドとしてｐｈｃＬｓＸＶ　ＩおよびｐｈｃＬｓＸＹＩＩが包含される（表 ５に示される）。これらのプラスミドは、組換えウィルスへ組込まれるときに、 遺伝子の高レベル発現をもたらす上流で修飾されたプロモーターを含有する。

もう一つの好ましい実施態様として、本発明は、合成プラスミドを含有してなる プラスミドを有する。合成プロモーターは、異種遺伝子発現を導（のに使用され るプロモーターのヌクレオチド配列に多様性を与え、ならびに外来遺伝子発現の レベルに相異性をもたらす。好ましい合成プロモーターに対する配列は、表１に 示されるＤＮＡ配列によってよく説明される。そのＤＮＡ配列中の矢印は、開始 点および転写の方向を示す。

プロモーターの要素の配列と順序を可能とする適応性があり、しかも、第２図に 示されるそのプロモーターの配列は、本発明の実施態様の一例であることが理解 される。

上記の合成プロモーターを含有する策２番目の実施態様のトランスブレイスメン ドブラスミドの例は、東２図にその一般的な構築がしめされている。ｐｓｙｎＶ Ｉ−と称するこのプラスミドは、表１に示される合成プロモーターおよびここで ＭＣＳ＃２と称されるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）とをもつトランスブレ イスメンドブラスミドである。ｐｓｙｎＶＩ−のＭＯＳ＄２配列は表２に示され ている。合成プロモーターの配向性は、外来遺伝子発現が、配向と反対のゲノム の配向で起こることである。このプロモーターの構築は、野生型ポリへドリンプ ロモーターのレベルの約１０％から２０％の異種遺伝子の発現を導く。

本発明の第２番目の好ましい実施態様のもう一つの例は、ｐＳｙｎＶ　Ｉ＋ｖｔ ｐと称されるプラスミドである。このプロモーターの図解は第３図に示される。

この構築は、上述のｐＳｙｎ’／Ｉ−と同様に上記の合成プロモーターとＭＣＳ ＃２とを含む転移ベクターであり、しかも野生型ポリへドリンプロモーターの制 御の下に、ポリヘトリン遺伝子を発現する。これは、２つの遺伝子を同時に発現 し得るプラスミドの例である。このプラスミドは、選択可能な封入型止の表現型 をもたらし、組換えウィルスは封入型止であるので、昆虫を経口的に感染させる のに使用し得る。このプラスミドの構築は、天然型ポリへドリンプロモーターの 約１０％から２０％の異種遺伝子の発現を導く。

本発明の簗２番目の好ましい実施態様の一例として含有されるもう一つのプラス ミドは、ｐｓｙｎｖｔＶ！−と称されたものであり、それは第４図に示される。

これは、ポリへドリンプロモーター（ＭＣＳ部位、ＭＣＳ＃１を持つ）および合 成プロモーター（第２番目ＭＣＳ部位、ＭＣＳ＃２をもつ）とを含有するトラン スブレイスメンドブラスミドであり、２つの外来遺伝子の発現を特徴とする特徴 がある。このトランスブレイスメンドブラスミドは、それ故に、２個の遺伝子の 発現ベクターの例である。しかしながら、他の合成プロモーターが、上述の合成 プロモーターに対して示された原理に基づいて、ポリへドリンプロモーターを置 き換えるためにデザインされ得るが故に、ポリへドリンプロモーターを使用する 必要性はないと考えられる。

本発明の第３番目の好ましい実施態様において、そのプラスミドは、自然におけ る配向性とは逆の配向性のプロそ一ターあるいはいくつかのプロモーターを含有 する。ｐｓＰＬｓＸＩＶＶＩ＋ＣＡＴおよびｐＬｓＸＩＶＶＩ＋ｃＡＴ　（第５ 図ならびに第６図）のプラスミドは、逆の配向性を持ったｐＬｓＸＩＶプロモー タープラスミドである（もとのポリヘトリンの方向に関して）。これらのプラス ミドは、逆の配向性でＬＳＸＩＶプロモーターからのＣＡＴ発現をテストするの に使用される。そのｐＬｓＸＩＶＶＩ＋ｃＡＴプラスミドは、タンデム型の２重 プロモーターである。逆の配向性でのＬＳＩＩＶプロモーターからのＣＡＴ遺伝 子発現は、もとの配向性において達成されたレベルと同程度であり得ることが本 発明者により見いだされた。

そのプロモーターは、発現のレベルを高め得るために異なるゲノムの位置／配向 性で位置され得ることが、本発明の一部として意図される。プラスミドｐｓＰＬ ｓＸＩＶＶＩ＋ｃＡＴ　（第５図）およびｐＬｓＸＩＶ３ＶＩ　（第１３図）と は、逆の方向性での高レベル発現ベクターの２つの実施例である。

本発明の第４番目の好ましい実施態様は、ｖｐ３９　（カプシド）プロモーター 配列を含有するプラスミドを包含する。このプロモーターのＤＮＡ配列は表３に 示す。リポータ−ＣＡＴ発現をテストするのに用いられ得るトランスブレイスメ ンドブラスミドは、ｐｈｃ３９およびｐＥＶｌｏｄ３９を包含する。そのｖｐ３ ９プロモーターは、天然型のポリへドリンプロモーターに比ベテ、感染後１２時 間から２４時間の時期に、約５から１２０倍の高レベル発現をもたらす。また本 発明は、例えば、より初期の遺伝子発現ならびに異型タンパク質のより高い最終 レベル（合計レベル）をもたらすポリヘトリンおよびｖｐ３９プロモーターのよ うな遅い／非常に遅いプロモーターの組み合せを包含することを意図する。感染 過程のより初期に発現されるが故に（すなわち、ポリヘトリンの場合、感染後１ ８時間よりむしろ６時間後に姿をみせることである）、その遅いプロモーターか らの感染後１２時間により高レベル発現がえられる。遅い／非常に遅いプロモー ターの組み合せは、感染後約６時間で理想的には作動し、引き続いて感染後７０ 時間の開作動し続け、こうして遅いおよび非常に遅い遺伝子発現をもたらす。

ム　プロモーターおよびＡ　プロモーターをもっ上ランススレイスメンドブラス ミドの　！ 本発明者は、ポリヘトリン遺伝子発現に対する重要な決定因子は、ＡＴＡＡＧＴ ＡＴＴ配列中に位置するらしいことを発見した。

豊富に転写される遅い遺伝子の転写は、ＡＣＴに富む領域により接続されたＡＴ ＡＡＧ配列中で起こる（Ｗｔｌｓｏｎら、１９８７．上記）新規なバキ二口ウイ ルスプロモーターは、他の豊富に発現された遅いおよび非常に遅い遺伝子と共通 の短い配列モチーフを結合することによって、他のウィルスプロモーターに対し て、最小限の配列上の相同性を欠くようにデザインされている。

新規プロモーターのデザインに組み込まれた２つの付加的な特徴は、ＡＴＡＡＧ 上流のＧ＋Ｃに富む領域に関するＬＳＩＩＶリンカ−と、およびＡＴＧの近くで 非翻訳領域にあるＴＴＴＡＴＴ配列である。そのＴＴＴＡＴＴは、外来遺伝子挿 入で偶然に起こる、ＡＴＡＡＧ配列から逆の配向性で起こる転写物に対するポリ アデニル化シグナルとなる。

本発明者は、遅いおよび非常に遅いプロモーターは、最もよく起こる転写開始点 にＡＴＡＡＧを含有することを発見した。

この配列は、ポリヘトリン発現ならびにプロモーター活性に重要である。さらに 、ポリへドリンプロモーター」のリンカ−・スキャン変異分析は、非翻訳リーダ ー領域を通して、ヌクレオチドが最適の遺伝子発現に寄与するように見えること をしめした。ＡｃＭＮＰＶの最も頻ばんに発現される遺伝子の４つのプロモータ ーの非翻訳リーダー領域を特徴づける配列は、すなわち、主カプシドタンパク質 （ｐ３９）をコードする遅い遺伝子、塩基性コアタンパク質（ｐ６．９）をコー ドする遅い遺伝子、ｐｌＯをコードする非常に遅い遺伝子、および、ポリヘトリ ン遺伝子であり、これらは−列に並んでいる。４個ともすべてＡＣＴに富む領域 に関しては、ＡＴＡＡＧを含有する。

２個またはそれ以上のプロモーター中にみいだされるいくつかの短いセグメント が、合成プロモーターの構成要素としてえらばれてきた。２こまたはそれ以上の プロモーターに共通して最も長いセグメントは、９このヌクレオチドＴＡＡＡＴ ＴＡＣＡであり、ｐｌＯおよびｐ６．９の両者のプロモーター中でみいだされる 。ＡＣＡＡＴ配列は、４個のプロモーター（ポリヘトリンではない）中の３個で 、ＡＴＧ近くに発現され、ＴＡＣＴＧＴはポリヘトリンとｐ１０プロモーター中 に発見され、ＴＴＴＧＴＡはｐｌＯとブリへドリンプロモーターとの両方に発見 され、ＴＣＡＡＮＴＣＡはｐｌＯおよびｐ３９プロモーター中に発見された。さ らに、全てのプロモーターは、少なくとも３個のＴの伸びた部分をもっており、 たいていのものは、Ａで接続されておりそして少なくとも３Ａの伸びをもってお り、たいていはピリミジンが前についている。これらの全ての構成要素は、合成 プロモーターモデルにデザインされできた。この構成要素は、長さを最小限にす るように位置していて、たとえばＴの伸びとＡの伸びはＡＴＡＡＧのすぐ下流に いちしており、ＡＴＴＡＣの下流のＡＣＴに富む部分として作用する。

しかしながら、ＡＣＡＡＴ配列は、プロモーターをマルチクローニング部位に結 合する３′制限部位（ＢｇｌＴＩ）の近くに−している。

ならびに、ＴＴＴＡＴＴ　（逆行において、ポリアデニル化シグナルである）は 、この配列に接続しており、逆転写物の終止を促進するように、ＡＴＡＡＧから できるだけ遠くに位置し、このことにより５′末端でのアンチセンスＲＮＡの妨 害を最小にする。合成プロモーターモデルを構成するために合成されたＳｙｎプ ロモーターと呼ばれる２つのオリゴヌクレオチド配列は、構成要素の標示ととも に表１に示されている。

トランスブレイスメンドブラスミドｐＳｙｎ−（第２図）は、ポリへドリンプロ モーターとして逆方間に発現を導＜　Ｓｙｎプロモーターを含有する。それはま た、非常に多くの有用な制限部位を有するマルチクローニング部位（ＭＣＳ＃２ ）も包含する。それに、ポリヘトリンのＮ−末端をコードする６２７ヌクレオチ ドを欠き、その故に、このトランスブレイスメンドブラスミドを使用することに より、封入型負の表現型との組換え体となる。

合成プロモーターおよび結合されたマルチクローニング部位（ＭＣＳ＃２）は、 制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＭＣＳ＃２の下流Ｓａｃ！あるいはプロモー ターの上流にｐｎ＋もしくはＳｅａりを用いて、他のＡｃＭＮＰＶゲノム位置へ の転移のために他のプラスミドへ移動させられ得る。

本発明は、下記の実施例によりさらに説明される。このことにより本発明は何ら 制限を強制されるものではない。これに対して、この記載を読んだとき、本発明 の精神および／または特許請求の範囲から離れることなく当業者に示唆されると ころの方法が種々の他の実施態様、改変ならびにそれと均等なものを包含するこ とは明かに理解され得る。

（以下余白） 罠亘皿 実施例１ 全てのウィルスは、本来、ＡｃＭＮＰＶＬ−１に由来しくＬｅｅ　ａｎｄ　Ｍｉ １１ｅ’ｒ　（１９７Ｂ）“Ａ、　ｃａｌ　１ｆｏｒｎｆｃａ核ポリへドロシス ウィルスの遺伝子型変異体の単離″Ｊ、Ｖｉｒｏ１．２７：７５４−７６７）　 、プラーク法ａｕｇｈｎら、（１９７７）　−昆虫５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒ ｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ：Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）からの２ つの昆虫細胞株の樹立″　Ｉｎ　Ｖｉ工四１３：　２１３−２１７＞中で、以前 に報告された方法（Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ　（１９７８）：Ｍｉｌｌｅ ｒら（１９８６）同上”外来遺伝子の高レベル発現のためノ昆虫バキュロウィル ス宿主ベクター系“遺伝子工学、原理ｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　、　ｐｐ、　２ ７７−２９８．１９８６）を用いて増殖させる。

以前に報告されている方法にしたがって（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８５）″ 双翅目の昆虫および哺乳類細胞中での細菌遺伝子のバキコ、ロウイルスにより仲 介された発現”　Ｊ、Ｖｊｒｏｌ、５６：１５３−１６０ＨＲａｎｋｉｎら（１ ９１３８）前出：　）　ＣＡＴアブセイされ、そして特異活性が計算された。こ れらの研究に用いられている全てのＣＡＴ−含有プラスミドに対するＣＡＴ遺伝 子は、ＣＡＴ遺伝子が５ａｉｌカセツトとして挿入されるｐｃＭｌｃＡＴ（ＬＫ Ｂ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｌ　Ｊ。）に由 来する。

実施例２ ｐＥＶｉｏｄＸＩＶ　）ランスブレイスメンドブラスミド（第９図）の構築が説 明される。前述の転移プラスミドｐｈｃｖｔ　（第７図）の構築の基礎となり、 またｐＥＶ＋ｍｏｄＸ　ＩＶ構築のための開始プラスミドとなる。ｐＥＹ５５プ ラスミドは、３．１８から７．３のマ・ノブ単位（ｌＵ）のＡｃＭＮＰｖＤＮＡ を含有している。マルチクローニング部位は、＋１から＋６３５までの配列をコ ードするポリヘトリンにおきかわる。ｐＥＶ５ｓノｐｔｌｃヘクタ一部位と３， １８のＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡのＳａｌ　１部位の接続にある多くの制限エンドヌ クレアーゼ部位は、マルチクローニング部位に用いられ得る制限部位の型を決定 する。

それ故に、この接続部位は、Ｓｍａ　Ｉ　により消化されるｐＥＶ５５により取 り除かれる。これは、ベクター接続点で切ることであり、ならびにＥｘｏｒ目お よびマング豆ヌクレアーゼの組み合わされた作用により、接続点で約７０個のヌ クレオチドを削除することにより除去される。この削除部位でのライゲーシヨン によりプラスミドｐＥＶｄｅｌをえる。ｐＥＶｄｅｌ中の６．１６ｗｕと７．３ ＋ｏｕとの間のウィルス性配列は、適切なベクター接続点でＢａｎ旧（６゜１６ ｍｕ）およびＮｏｔｌ　（７，３＋ｏｕ）による消化により削除される。削除さ れた接続点セの平滑末端ライゲーシヨンによりｐＥＶｍｏｄ　（東８図）を得る 。ｐＥ’／ｓｏｄのポリへドリンプロモーター（−９２のＥｃｏＲＶから＋ＩＢ ｇｌｌｌまでの）は、ｐｈｃＬＳＸＩＶ　（第１−図）の小ＥｃｏＲＶ−Ｂｇｌ ｌ！セグメントでおきかえられて改良された好都合なブラスミトテあ６　ｐＥＶ ｍｏｄＸ　ＩＶを得る。ｐＥＶｍｏｄＸＩＶに基づくトランスブレイスメンドブ ラスミドに由来するウィルスベクターは、ｐＥＶ５５あるいは他のいかなる既知 のプラスミド由来のウィルスベクターよりも約５０％高レベルの発現をもたらす 。

実施例３ ｐｈｃ３９　（第１５図）およびＩ）Ｅ’Ｖｔ１ｌｏｄ３９　（第９図）トラン スブレイスメンドブラスミドの構築が説明される。ｖｐ３９プロモーターを包含 するプラスミドがまず下記のごとく構築される。ＡｃＭＮＰＶゲノム上の５７． ６から５７．９ｍｕの間にｖｐ３９プロモーターを含むＮａｒ　ＩからｇｃｏＲ Ｖのセグメントは、プラスミドベクターブルースクリプトＫＳ−（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｊｅｇｏ、ＣＡ）の／１ｃｃｌおよびＥｅｏＲＶの両部 位にクロー、ニングされる。この得られたプラスミド、ｐｓＴＶＮＭは、Ｘｈｏ ｌおよびＡｐａｉ部位とで切られる。ｖｐ３９をコードする配列のト末端配列は 、エクソヌクレアー・ゼＩＩＩおよびマング豆ヌクレアーゼによる消化により削 除される。Ｂｇｌｌ＋リンカ−オリゴヌクレオチドは、　ＤＮＡリガーゼを用い てギャップに挿入される。ｖｐ３９のＡＴＧ（＋１．　＋２゜＋３）に比べて− ２にあるＢｇｌ１１部位を含有する１つのプラスミドが選択される。ｐ３９ｐｒ ｏの構−築のために、４５８ｂｐ　カプシドプロモーター領域は、Ｋｐｎ！およ びＥｃｏＲＶを用いて、さきに選ばれたプラスミドから除去され、そして、Ｋｐ ｕＩとＥｃｏＲＶで切断されたプラスミドブルースクリプトＫｓｔ　（Ｓｔｒａ ｎｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に連結されるＯ　トランスブレイスメ ンドブラスミドｐｈｃ３９の構築のために、ｖｐ３９プロモーターを含有するｐ ３９ｐｒｏの、４５８ｂｐよりなるＥｃｏＲＶからＢｇｌｌｌに至るセグメント は削除され、ついでＥｃｏＦＩＶおよびＢｇｌ　Ｉ！で消化されたｐｈｃｖｔに 挿入される。こうして、ｐｈｃ曹ｔのポリへドリンプロモーターはｖｐ３９プロ モーター領域でおきかえられる。こうしてえられたトランスブレイスメンドブラ スミドｐｈｃ３９（第１５図）は、ウィルスベクターｖｈｃ３９の構築に用いら れる。感染後１２時間から２４時間の間において、このベクターを用いるＣＡＴ 遺伝子発現は、ポリへドリンプロモーターにょるＣＡＴに比べて、５倍から１０ 倍の高レベルになる。外来遺伝子のより初期の発現は、タンパク質生産のより効 果的な翻訳後の修飾をもたらす。さらに好ましいトランスブレイスメンドブラス ミド、例えば、ｐＥＶ＋＊ｏｄ３９　（示されていない）は、Ｂｇｌ　１１およ びＫｐｎｌ末端（例えばＭＣＳ＃１）を含有するＭＣＳ　テＣＡＴ遺伝子をおき かえることによりｐｈｃ３９から容易に得られる。

実施例４ ポリへドリンプロモーターの位置に、Ｓｙｎプロモーターおよび隣接するマルチ クローニング部位（ＭＣＳ＃２）を含有するプラスミドｐＳｙｎＶＩ−（第２図 ）を構築するために、表１に示される２つのＳｙｎプロモーターオリゴヌクレオ チドがアニーリングされ、その２本鎖は、ポリアクリルアミド電気泳動により精 製され、ついでＫｐｎｌとＥｃｏＲＶとで消化されたブルースクリプトプラスミ ドベクターｐＢＳＫＳ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃ，Ａ 、）　ヘ挿入される。このブルースクリプトプラスミドは、マルチクローニング 部位にＳｍａ　Ｉ制限酵素部位を欠く。これにより、ブルースクリプトプラスミ ドのマルチクローニング部位へのオリゴヌクレオチドの強制的なりローニング、 および、ＥｃｏＲＶとＫｐｎｌとの両方の再生が可能となる。

ＥｅｏＲＶから５ｓｃｌ部位にわたるこのプラスミドのマルチクローニング部位 の部分は、ＥｃｏＲＶとＥｃｏＲＩと、Ｐ＋ｓｔ　Ｉと、Ｂａｇ旧と、５ｐｅｌ と、Ｘｂａｌと、Ｎｏｔｌと、５ａｃｌｌと５ｓｃｌ部位とをこの順序で含有ス ル。その合成プロモーターおよびこのマルチクローニング部位は５ｓｃｌとマン グ豆ヌクレアーゼおよびＸｐｎｌにより秩序立って消化されて、ブルースクリプ トベクターから除去される。その小さなセグメントは、ゲルで精製され、ついで ＫｐｎｒとＥｃｏＲＶとで消化され、ゲル精製されたｐＥＶｍｏｄ　（第８図） の大きいセグメントへ挿入される。ＭＣＳ＃２と称されるＳ＋ｇａ　１部位から 、隣接するマルチクローニング部位を介してのプロモーター配列が決定される。

その配列は表２に示される。５ｓｃｌ部位は、クローニング過程の間に、予期さ れず偶発的に再生される。

５ｓｃｌ部位の下流へのマング豆ヌクレアーゼの作用は、観察された連結の原因 となる。

リポータ−ＣＡＴ遺伝子を含有するｐｓｙｎＶ　Ｉプラスミドは、構築されたＣ ＡＴ−含有プラスミドのＣＡＴ遺伝子発現を測定することにより、ｐｓｙｎＶＩ プラスミドの遺伝子発現のレベルを測定するために構築される。

ｐｓｙｎＶＩ−ＣＡＴプラスミド（第１０図）の構築において、ＣＡＴ遺伝子は 、５ａｉｌによりｐｃＭｌｃＡＴから削除され、マング豆ヌクレアーゼにより平 滑末端とされ、ＥｅｏＲＶにより切断されたｐｓｙｎＶＩへ挿入される。ＣＡＴ 遺伝子のＮ末端部分で、ＥｃｏＲ１部位を用いることにより方向性が確かめられ る。対応するウィルスベクターｖｓｙｎＶ　Ｉ−ＣＡＴは、ポリへドリンプロモ ーター制御の下でＣＡＴを発現するウィルスベクターで観察されるレベルの、約 １０％から約２０％のレベルの、ＣＡＴ発現をもたらす。ポリへドリンプロモー ター発現と同程度ではないが、構成要素である合成プロモーターからのこの発現 レベルは重要である。Ｓｙｎプロモーター、および組み合せにより得られるプロ モーターは、２つの異なる外来遺伝子のおよび／または特異的な翻訳後の修飾を 制御するタンパク質をコードする遺伝子の発現に対して有用である。

実施例５ いくつかの応用において、外来遺伝子発現およびポリヘトリン遺伝子発現を可能 とする組換えウィルスを形成するための遺伝子情報を運ぶことは、トランスブレ イスメンドブラスミドにとって有用である。両者の遺伝子の発現は封入体形成を もたらし、安価で大量のタンパク質生産のための能率的な昆虫幼虫の経口感染を 可能とする。さらに、昆虫の幼虫中での生産は、分化した昆虫細胞（昆虫の主た る分泌性の組織を構成する脂肪体を含む）での発現を可能とし、ＳＦ９細胞のよ うな有用な鱗翅類の昆虫細胞系でみられるよりも、より効率的な翻訳後の修飾を もたらす。

それ故に、ｐｓｙｎＶＩ　（第２図）は、トランスブレイスメンドブラスミドｐ ｓｙｎＶＩ＋マｔｐ（第３図）を生産するように修飾される。これは、ポリヘト リンおよび外来遺伝子両者が同時に高レベルで発現することを可能とし得る。ｐ ｓｙｎＶｌ＋ｖｔｐのもう１つの利点は、ポリヘトリン欠損変異体（あるいは、 ポリヘトリン／β−ガラクトシダーゼ融合変異体）のＤＮＡが、ウィルス性のＤ ＮＡおよびトランスブレイスメンドブラスミドとともに、初期に宿主細胞へ共ト ランスフェクトされる時には、封入体陽性のプラークとして、組換えウィルスを 選択する能力があることである。

ｐｓｙｒ＋ｖＩ＋マｔｐトランスブレイスメンドブラスミドは、ＡｃＭＮＰＶゲ ノムのＥｃｏＲＩ−１セグメントを有するプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＫｐｎ ｌを用いて消化し、ポリへドリンプロモーターならびにＮ末端ポリヘトリン領域 を削除することにより構築される。約０．７ｋｂのＥｃｏＲＶ／Ｋｐｎｌセグメ ントはゲル精製され、Ｓｍａ　ＩおよびＸｐｎｌにより消化されたｐｓｙｎＶｌ −に挿入される。ライゲージ璽ンによりＳｍａｌおよびＥｃｏＲＶが削除される が、ポリへドリンフード領域に見いだされるＫｐｎｌは再生される。さらに詳細 には、ポリへドリンプロモーターおよびＥｃｏＲＶ（−９２＞からＫｐｎｌ　（ ＋６３５＞までのＮ末端コード配列は、トランスブレイスメンドブラスミドｐｓ ｙｎＶＩ＋豐ｔｐを生産するためにｐｓｙ＋１ＶＩ−に挿入される。このように 、ポリヘトリン＋ｍＲＮＡは、正常なプロモーターの制御の下に正常な方何に転 写され、他方外来遺伝子は合成プロモーターのもとてマルチクローニング部位に 挿入され、そして、ポリヘトリンに対して逆方向に転写される。そのプラスミド の特徴は、茅３図に示される。ＥｃｏＲＶ／Ｓ＋＊ａｌの接続と、合成プロモー ター、およびマルチクローニング部位（ＭＣＳ＄２）の配列は表１に示される。

転移ベクターｐｓｙｎｖｌ＋ｖｔｐの有効性をテストするために、リポータ−Ｃ ＡＴ遺伝子は、ＥｃｏＲ’／部位”ｔ’　ｐｓｙｎＶＩ＋ｖｔｐ　（第３図）の ＭＣ５へ挿入され、プラスミドｐｓｙｎＶＩ＋ｖｔｐｃｃＡＴＩ　（第１１図） が得られる。ｐｓｙｎＶ　Ｉ＋ＣＡＴ１　ノ構築のために、ｐＣＭ−１ＣＡＴ（ １）末端が平滑化されたＣＡＴ含有５ａｉｌセグメントは、ＥｃｏＲＶで消化さ れたｐＳｙｎＶＩ＋ｖｔｐに挿入される。ポリヘトリン遺伝子発現と同時に、リ ポータ−ＣＡＴ遺伝子を駆動させるＳｙｒ＋プロモーターの能カバ、組換えウィ ルスｖｓｙｎＶＩ＋ｖｔｐｃＡＴ　１を単離し、ＣＡＴの発現のレベルをｖｓｙ Ｖ　Ｉ−ＣＡＴにより得られるレベルと比較することによりテストされる。この ２つのウィルスベクター間にはＣＡＴ遺伝子発現における重要な差異は認められ ず、ポリヘトリン遺伝子の同時発現が外来遺伝子発現を妨げないことを示す。ま た、組み換えウィルスｖＳｙｎＶＩ＋ｖｔｐＣＡＴｌは封入体を高いレベル生産 するので、ポリヘトリン遺伝子は豊富に発現される。

実施例６ トランスブレイスメンドブラスミドｐｓｙｎｖ　ｔ　Ｖ！−の構築（第４図）が 説明される。このプラスミドは、近接した２つのプロモーターを有しており、２ つの異種遺伝子の同時転移および１このベクターによる２つの遺伝子の協同発現 を可能とする。ｐＥＶ５５ＥｃｏＲＶ−Ｋｐｎｌセグメントは、ポリへドリンプ ロモーターおよびマルチクローニング部位ＭＣＳ＄１を含有しており、Ｓｍａｌ およびＫｐｎｌにより消化されたｐｓｙｎＶＩへ挿入された。

リポータ−ＣＡＴ遺伝子を含有するｐｓｙｎｖｔＶＩ−は、ｐｓｙｎｖｔＶＩ− の遺伝子発現の指標となるために構築される。そのプラスミドはｐｓｙｎｖｔＶ Ｉ−ＣＡ、ＴＩ　（第１２図）である。ｐｓｙｎｖｔＶＩ−ＣＡＴＩの構築ノタ メに、ｐＣＭ−１ｃＡＴの鈍末端化されたＣＡＴ−含有５ａ１１セグメントは、 ＥｃｏＲＶ消化ｐｓｙｎｖｔＶ＋−に挿入される。等量のウィルスベクターｖｓ ｙｎｗｔＶ１−ＣＡＴｌは、ポリへビリンプロモーター制御下のＣＡＴ発現ベク ターで観察されるレベルの１０％から２０％にＣＡＴ活性を発現する。

実施例７ ｐＳＰＬＳＸ　ＩＶＶＩ＋ＣＡＴおよびｐＬｓＸＩＶＹＩ＋−ＣＡＴ　トランス ブレイスメンドブラスミド（第５図および第６図）の構築が説明される。

ｐｓＰＬｓＸＩＶＶｌ＋ｃＡＴの構築のために、ＣＡＴ遺伝子ならびに接続され たＬＳＸＪＹプロモーターは、Ｘｐｎｌ消化（ならびにマング豆ヌクレアーゼに より平滑末端化される）ならびにＥｃｏＲＶ消化によりｐｈｃＬｓＸＩＶ　（第 １図）から削除され、”）　イテＥＣ０ＲＶ消化によすｐＳｙｎＶＩ＋ｖｔｐへ 挿入される。これは、合成プロモーターと縦にならぶ位置にＬＳＸＩＶプロモー ターを配置する。そのプラスミドは、ついでＥｃｏＲＶとＩｐｎｌとにより切ら れ、大きいベクターセグメントは、ゲルで精製される。野生型ポリへドリンプロ モーターおよびト末端を含有するＡｃＭＮＰＶ　Ｅｃ、ｏＲＩ−１セグメントの ＥｃｏＲＶ／Ｋｐｎｌ　セグメントは、ゲルで精製され、ｐＳＰＬＳＸＩＶＶｔ ＋ＣＡＴのベクターセグメント（ＥｃｏＲＶ／Ｋｐｎｌ）へ挿入されることによ り、　ＬＳＸＩＶプロモーター制御下にＣＡＴ遺伝子をモしてポ替ヒドリンプロ モーター制御下に完全なポリヒドリン遺伝子を含有するｐＬｓＸＩＶＶｒ＋ｃＡ Ｔを生じる。コれらのプラｘ　ミＦ　（ｖＳＰＬＳＸＩＶＶＩ＋ＣＡＴ及びｖＬ ｓＸＩＶＶ＋ｃＡＴ）由来＋７）ウィルス性ベクターは、野生型ポリへドリンプ ロモーターの制御下に、ＣＡＴを発現するウィルスに比べて、ＣＡＴを等量おあ るいは少し上回ったレベルで発現する。ｐＬｓＸＩＶＶＩ＋ｃＡＴ由来のウィル ス性ベクターのさらにもう１つの利点は、ポリヘトリンを高レベルに生産するこ とである。

実施例８ ｐＬｓＸＩＶ３ＶＩ＋およびｐＬｓＸＩＶ２　）ランスブレイスメンドブラスミ ド（第１３図および茅１４図）の構築が説明される。プラスミドｐＬｓＸＩＶＶ Ｉ＋ｃＡＴは、ＢｇｌｌｌとＥｃｏＲＴにより消化され、粘着末端は、マング豆 ヌクレアーゼにより削除される。ＤＮＡは、Ｓｍａｌによって切られ、大きいセ グメントは、ゲルで精製され、ついで、ＥｃｏＲＶおよびＳａｃ■末端を有する マルチクローニング部位（ＭＣＳ＄３）へ結合され、ＣＡＴ遺伝子を欠＜　ｐＬ ｓＸＩＶ３ＶＩ＋を形成する。

このプラスミドは、ついでＥｃｏＲＶとＫｐｎｌとにより消化される。

その大きイセグメントは単離され、ｐＥＶｍｏｄＸＩＶ（ＯＥｃｏＲＶ／Ｋｐｎ ｌハ、大きいセグメント」に挿入される。各々自身のＭＣＳを有する２つの隣接 するＬＳＸＩＶプロモーターをもつｐＬＳＸ　ＩＶ２となる。９ＬＳＸＩＶ３Ｖ ｌ＋プラスミドは、力強いＬＳＩＩＶプロモーターをもちいて外来遺伝子発現を ポリヘトリン遺伝子発現と同程度のレベルにおいてなし得る。ｐＬｓＸＩＶ２プ ラスミドは、各々ＬＳＩＩＶプロモーター制御の下に２つの外来遺伝子の最上の 発現を可能とする。

実施例９ トランスブレイスメンドブラスミドｐｈｅ３９　（第１５図）は、ｖｐ３９プロ モーターの制御の下にＣＡＴリポータ−遺伝子によって構築される。ｖｈｃ３９ からのＣＡＴ発現は、そのベクターが野生型プロモーターの制御の下にＣＡＴを 有するｖｈｃｖｔに比べて、感染後１２時間における約８倍の高レベルを示す。

ｐｈｃ３９のＣＡＴ遺伝子は、問題としている異種遺伝子でおきかえられる。感 染過程のより初期の発現は、異型タンパク質生産物のより効果的な翻訳後の修飾 を可能とする。

実施例１Ｏ トランスブレイスメンドブラスミドは、ウィルスベクターへの２つの外来遺伝子 の同時転移を可能とするため、およびその組換えウィルスにより両者の外来遺伝 子を同時に豊富に発現することを可能とするために構築される。トランスブレイ スメンドブラスミドｐｓｙｎｖｔＶＩ　（第４図）は、このような２重遺伝子ト ランスブレイスメンドブラスミドの一例である。

このプラスミドは、ｐｓｙｎＶＩ−をＳｍａｌおよびＫｐｎｌにより消化するこ とにより、および野生型ポリへドリンブロモーターとＭＣ１１とを含有するｐＥ Ｖ５ｓＥｅｏＲＶ／Ｉｐｎ＋セグメントを挿入することによって構築される。し たがって、このプラスミドは、２つの異なるマルチクローニング部位を含有し、 それぞれ隣接するＳｙｎおよび野生型ポリへドリンプロモーターの下流にある。

実施例１１ 第２番目の遺伝子の同等の高レベルを可能とする他の例は、ｐＬｓＸＩＶ２　（ 第１４図）である。このプラスミドは、隣接するＬＳＩＩＶプロモーターをもた らし、その各々は、２つの異なる外来遺伝子を挿入するのに有用な制限部位を含 有マルチクローニング部位（ＭＣＳ＃ｌおよびＭＣＳ＃２）をもち、その各々は ＬＳＩＩＶプロモーターの制御の下にある。隣接プロモーターの能率は、ｖＬｓ ＸＩＶＶＩ＋ｃＡＴを用いてテストされる。これは、ポリへドリンプロモーター と隣接しｒ　ＣＡＴ発現を導＜　ｐＬｓＸＩＶＶＩ＋ｃＡＴ＄ｉｆ築をもつ組換 えウィルスであり、ポリヘトリン遺伝子発現をもたらす。　ｖＬｓＸＩＶＶＩ＋ ｃＡＴヘク９−ニよルＣＡＴ発現は、ＣＡＴのみ発現するｐｈｃｗｔのみにより 観察されたときに比較して、同等あるいはわずかに高いレベルである。

実施例１２ ｖｐ３９／ポリへドリンプロモーター融合体構築が説明される。

Ｂｉｎｄｌｌｌリンカ−は、ｖｐ３９の４６２ｂｐプロモーターへ挿入される。

ｖｐ３９のＤＮＡ配列は、表３に示されている（Ｒａｎｋｉｎ　ａｔ　ａｌ、参 照（１９８８）上記、一般リンカースキャンアプローチのために）。

Ｂｉｎｄｌｌｌリンカ−は、遅い／非常に遅い組み合せプロモーターを作成する ために、リンカ−スキャン修飾プロモーターのＨｉｎｄ［Ｉ部位と結び付けるこ とを可能とするように作用する組み合せプロモーターは、（Ｒａｎｋｉｎら（１ ９８８）上記の）ＬＳＩＩＶプロモーターのポリへドリンプロモーターの＋１か ら約−６０に融合されたｖｐ３９部位（例えば−６５から−３５０まテ）１７） ＯＣＴ−Ａおよび０ＣＴ−Ｂの領域を含有するように構築される。これを行うた めに、適切な部位（例えば−６５のことである）にＨｉｎｄｌｌｒリンカ−を有 するこのプラスミドが選ばれる（例えばｖｐ３９−６５）。Ｈｉｎｄｌｌｌから Ｂｇ’ｌｌｌへのセグメントはＨｉｎｄｌｌｌをｐｈｃＬＳＸＩＶのＨｉｎｄｌ ｌｌからＢｇｌ［Ｉへのセグメントと入れ換えられる。組み合せ体ｖｐ３９／Ｌ ＳＸＩＶプ・ロモーターを含有するＢｇｌｌｌからＥｃｏＲＶへの全セグメント は、］Ｐ・ＥＶＳ５へ転移され、トランスブレイスメンドブラスミド、すなわち ＣＡＴ発現を制御する組み合せプロモーターをもつｐＥＶｖｐ３９／ＬＳＸＩＶ ＣＡＴ　（第１６図）、を構築する。

実施例１３ トランスブレイスメンドブラスミドｐＥＶｖｐ３９／ＬＳＸＩＶ　（第１６図） の構築は上記実施例１２に説明された方法に従って達成された。ハイブリッドｖ ｐ３９／ＬＳＸＩＶプロモーター配列は表４に示す。ｖｐ３９／ＬＳＸＩＶ組み 合せプロモーターの接続点配列は、接続点（ＣＣＡＡＧＣＴＴＧ）のＨｔｎｄｌ １１部位および接続点のｖｐ３９の約１個から１０個のヌクレオチド（Ｎｌ−１ ０）を指す”Ｎ１−１０　ＣＣＡＡＧＣＴＴＧ″により印をつけられる。

もちろん前述したことは、本発明の好ましい実施態様に関係するものであること 、ならびに以後追加請求にあるように、本発明の意図ならびに展望から外れるこ となく、多くの修飾あるいは改変がここに行われるものであることが理解されけ ればならない。

４→Ｔ４む村；八゛ し己ａａｍ　ｔｔｅｅ　ａｑＣ亡ａｑｔ　ａａａｃａ亡表２．マルチクσ−二ン グ°％ｌｉ　＃２　（／’４ｃｒ　ｆｆＪ−）＊　ｉｌ乙ＰＩ　Ｌ　７ｑ　ｒ＋ ｐＮＡ　白乙万す 瓢　に　宴　〉　？　乏　に ■　ミ　５　匠　目　Ｅ　藍 ６１Ｍ６Ｂ　ヨ ト　＜　じ　ｈｕ＜　リ ＜（ＪＩＪ（Ｊ　じ　、ｕ　＜ ０　←　＜ｈ＜　、＜　Ｑ ご　×　５　淀　ゴ　：ご　１ く　←　ｕ　Ｉ−Ｉ　ａ　、＜ｔ− ト　！＋　ベ　ト　Ｕ　←　Ｕ 〉　仁　淀　急　？　姿　と 曹　巨　、ヨ　砦　Ｅ　書　ト　ヨ ー矢 ｐｈｃＬｓＸＩＶ ＦＩＧ、　１ ｐＳｙｎＶＩ− ＦＩＧ、　２ ｐｓｙｎＶＩ”ｗｔｐ ＦＩＧ、　３ ｐ８ｙｎｗｔＶＩ− ＦＩＧ、　４ ｐｓＰＬ８ＸＩＶＶｆ”ｃＡＴ ＦＩＧ、　５ ｐＬｓＸＩＷｌ”ｃＡＴ ｈｃｗｔ ＦＩＧ、　７ ＥＶｍｏｄ ＦＩＧ、　８ ｐＥＶｍｏｄＸＩＶ ＦＩＧ−９ ｐｓｙｎＶ［ＣＡＴ ＦＩＧ、　［０ ｐｓｙｎＶｌ〜ｔｐＣＡＴ　Ｉ ＦＩＧ、ｌＩ ｐｓｙｎｗｔＶｌ−ＣＡＴ　Ｉ ＦＩＧ、ｌ２ ｐｔ、ｓｘ＋ｖｓｖＩ＋ ＦＩＧ、　［３ ｐＬｓＸＩＶ２ ＦＩＧ、　１４ ｈｃ３Ｇ ＦＩＧ、　１５ ｐＥＶｖｐ３９／ＬＳＸＩＶＣＡＴ ＦＩＧ、　１６ Ｆｉｇ、　１７ 国際調査報告　ＰＣＴ／ＬＩＳ　９０１０２８１４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主細胞中において遺伝子生産物を生産するためのバキユロウイルスベクタ ーであって、該ベクターは、修飾されたバキュロウイルスプロモーターならびに 異種遺伝子とを有し、該異種遺伝子は、修飾されたプロモーターの調節制御の下 にある。 ２．前記修飾されたバキュロウイルスプロモーターが該修飾プロモーターにより 指示される転写の方向とは逆方向のポリアデニル化部位を有し、そして、該ポリ アデニル化部位が、転写開始部位に対して３′側に位置する、請求項１に記載の ベクター。 ３．前記修飾されたバキユロウイルスプロモーターが開始部位を２ケ所含有する 、請求項１に記載のベクター。 ４．前記修飾されたバキュロウイルスプロモーターが、バキュロウイルスの後期 ／超後期プロモーターの保存されたＤＮＡ配列を有する、請求項１に記載のベク ター。 ５．転写開始部位の約１０から約３０ｂｐ上流に位置するＧＣに富む配列の約１ ０ｂｐを含む上流活性化配列を有し、該上流活性化配列は該修飾されたプロモー ターにより指示される発現を増大させる、請求項１に記載のベクター。 ６．前記修飾されたバキュロウイルスプロモーターがｐｈｃＬＳＸＩＶ、ｐｈｃ ＬＳＸＶＩＩおよびｐｈｃＬＳＸＶＩからなるプラスミドの群から選ばれるプラ スミドから単離される、請求項１に記載のベクター。 ７．前記新規プロモーターが表１に示すＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のペ クター。 ８．前記修飾されたプロモーターが、ｐＥＶｍｏｄ３９の修飾後期プロモーター である、請求項４に記載のベクター。 ９．前記修飾されたｐＳＰＬＳＸＩＶＶＩ＋ＣＡＴプロモーターが、前記プラス ミドから単離される、請求項１に記載のベクター。 １０．プラスミドｐＳｙｎＶＩ−、ｐＳｙｎＶＩ＋ｗｔｐ、ｐＳｙｎｗｔＶＩ− 、ｐＬＳＸＩＶＶＩ＋、およびｐＬＳＸＩＶ２の修飾されたバキュロウイルスプ ロモーターからなる群から選択されるバキュロウイルスプロモーターを有する、 請求項１に記載のベクター。 １１．宿主細胞中の複数の遺伝子生産物の生産のための、請求項１に記載のバキ ユロウイルスベクターであって、複数の修飾されたバキュロウイルスプロモータ ーおよび請求項１の異種遺伝子を有するベクター。 １２．前記バキュロウイルス発現ベクターが核ポリヘドロシスウイルス由来であ る、請求項１に記載のベクター・１３．前記核ポリヘドロシスウイルスがＡｕｔ ｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａウイルスあるいはｃの変異体であ る、請求項１２に記載のベクター。 １４．宿主細胞での異種遺伝子の発現に適したバキュロウイルス発現ベクターを 調製する方法であり、該方法はバキュロウイルスゲノムへ修飾されたバキュロウ イルスプロモーターおよび異種遺伝子を挿入することを包含し、その異種遺伝子 ほ、該修飾されたバキュロウイルスプロモーターの調節制御の下にある。 １５．前記バキュロウイルス発現ベクターが、昆虫細胞中で複製するバキュロウ イルスとトランスプレイスメントプラスミドとを接触させ、そして、該外来遺伝 子によりコードされる遺伝子生産物を発現する組み換えウイルスを選択すること により形成される、請求項１４に記載の方法。 １６．前田バキユロウイルスが核ポリヘドロシスウイルスである、請求項１４に 記載の方法。 １７．前記核ポリヘドロシスウイルスがＡｕｔｏｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏ ｎｉｃａ　ウイルスまたはその変異体である、請求項１６に記載の方法。 １８．表１のＤＮＡ配列を有する、修節されたバキュロウイルスプロモーター。 １９．プラスミドｐＳＰＬＳＸＩＶＶＩ＋ＣＡＴに含有される、修飾されたバキ ュロウイルスプロモーター。