JPH04500459A

JPH04500459A - 組換えコールドショックタンパク質、その製造および農業における使用

Info

Publication number: JPH04500459A
Application number: JP50459690A
Authority: JP
Inventors: ゴールドスタイン，ジョエル; ポリット，スティーブン　エヌ．; イノウエ，マサヨリ
Original assignee: ユニバーシティー、オブ、メディシン、アンド、デンティストリー、オブ、ニュージャージー
Priority date: 1989-02-13
Filing date: 1990-02-13
Publication date: 1992-01-30
Also published as: CA2009917C; CA2009917A1; EP0423264A1; WO1990009447A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えコールドショックタンパク質、その製造および農業における使用産業上の利用分野本発明は、一般的にはバイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、植物細胞などの細胞を低温による悪影響および傷害から保護することができると今日までのデータを基に信じられており、生理的温度において安定である、新規の有益なタンパク質（抗凍結タンパク質）に関する。本発明は、また、このタンパク質を製造する方法に関する。さらに、本発明は、このタンパク質または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する新規のプロモーターに関する。さらに、本発明は、その発現が異種プロモーターによって調節され得るコールドシラツク構造遺伝子に関する。さらに、本発明は、形質転換されたコンピテント宿主、抗凍結タンパク質を発現することができるトランスジェニック植物体および農業および他の分野でのいくつかの他の有用な応用に関する。

発明の背景１　技術分野霜による作物への害は、世界における天候の変化の自熱現象による農業生産の損失の主たる原因の一つである。

１年間に世界の農業総生産量の５〜１５％が霜害によって失われていると推定されている。地域によっては、損失は１００％に達するかもしれない。米国における霜害による作物の経済的損失は、年間５０億ドルを越えると報告されている。

この害のほとんどは、ｓｙｒｉｎｇａｅｓｃｏｒｏｎａｒａｃｌｅｎｓ　５ｐｉｓｉ％ｔａｂａｃｌまたはｒ　Ｉ　ｕｏｒｅｓｅｅｎｓなどのＰｓｅｕｄｏａｏｎａｓ菌種、ｔ　ｒａｎｓ　Ｉ　ｕｃｅｎｓなどのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌種またはｈｅｒｂｌｃｏｌａなどのＥｒｖｉｎｌａの菌種などの、天然の氷核細菌（Ｉｃｅ−ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　）のある菌種が起こす凍結によって引き起こされる。植物体表面におけるこのような天然の着生ＣｅｐｌｐｈｙｔＩｃ　）細菌の存在は、０℃を僅かに下回る温度において氷の結晶の核形成および形成を促進することができる。そのような氷核形成能を有する（ＩＮＡ”）細菌は、トウモロコシ、大豆、小麦、トマト、ナシ、アーモンド、リンゴ、サクランボなどの美味の果実樹木および柑橘類およびアボカドなどの多くの亜熱帯植物など、多種の重要な農業作物に対する霜害の原因となっている。

霜害感受性植物からの氷核細菌の除去は、直ちに明かな経済的利益をもたらす。

この必要性によって、作物への霜害を予防するために用いられると思われる多くの技術が生まれた。その技術の一つは、細菌から氷核形成遺伝子を除去して、これらの遺伝子工学的に処理された微生物（ＯＥ　Ｍ、）を作物に再導入することに基づいている。

これらのＯＥＭが植物体に定着すると、これらは天然の氷核細菌にとって代わり、それによって霜に対する保護の方法が提供される。この問題の解決を試みたいくつかの特許について後に考察する。本発明は、その重要な態様の一つであって、この問題の解決へのアプローチを示唆するものである。したがって、米国および全世界において植物および他の生物材料への損害を抑制するための方法を提供する緊急の経済的要請がある。細菌株による植物の処理は、アメリカ合衆国およびその他で法律的および公共の問題となっているが、本発明は、その重要な態様の一つにおいて、非氷核細菌株の適用に代わるものを示唆している。本発明は、以下により詳細に記述されるように、現在までに得られた証拠に基づいて、抗凍結タンパク質として機能すると思われるタンパク質を提供する。また、本発明は、遺伝子を有するＤＮＡ配列を受容作物宿主細胞に組み込むことによって、本発明の抗凍結タンパク質を合成しまたは同様の抗凍結の性質を付与するように植物体を形質転換させて、植物体の低温への感受性を低下させるまたは抵抗性にすることをも意図している。

本発明が関係するさらに他の重要な分野がある。組換えＤＮＡまたは発酵技術によって生産されるタンパク質は、生理的温度において酵素的に分解されて、その結果、タンパク質の所望の生物学的活性の修飾、低下または破壊が起きるという例が知られている。さらに、大腸菌の正常の増殖温度（３７℃）において産生されるタンパク質において誤った折り畳みが起き得て、その結果、タンパク質の所望の性質（例えば生物学的活性）の完全なあるいは部分的な損失が生じることを示す最近の証拠がある。本発明は、他の重要な態様において、所望のタンパク質を正常の増殖温度以下の温度で産生させることによってこれらの問題の解決を示すものと思われる。

したがって、商品価値のあるタンパク質をコードする遺伝子を、正常の増殖温度以下に温度を下げた後でのみ、そのタンパク質が産生されるように調節できることによって、目的とするタンパク質の発現を、タンパク質の所望の生理的活性に悪影響を与えることなく最適温度において進行させ得ることができる。

２　背景技術遺伝子工学の分野に関しては、かなり豊富な文献（米国および外国を含む）が発表されてきた。当業者の理解を助けるために適当と思われる場合に、本明細書の記述中にまたはその束部にそのような文献が参考のためにあげられている。多くの特許および参考文献が本明細書の束部に「参考文献」として記載されている。

これによって、全てのそのような参考文献は本明細書に組み込まれる。

米国特許第４．７６６．０７７号明細書（１９８１１）は、氷核形成活性（ＩＮＡ）を担うポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列（ＩＮＡ遺伝子）内で、非可逆的突然変異を誘導した、氷核形成欠失（ＩＮＡ−）微生物に関するものである。開示されたＩＮＡ−微生物は、ＩＮＡ　微生物による植物の集落形成より前に確立されるように、植物部分に適用される。この特許による処理は、インビトロにおいて氷核に関与する遺伝子の全部または一部を欠申請通知の対象となることは明かである。

米国特許第４，３７５，７３４号（１９８３）もまた、植物体上にふつうに存在する氷核細菌に種特異性を示す非植物毒性ビルレントバクテリオファージを用いた氷核形成阻害組−ジ、Ｅｒｈｌである。

米国特許第４．４６４，４７３号（１９８４）は、氷核形成活性をコードするＤＮＡ断片の単離法を提供するものであって、このＤＮＡ断片は、次いで適当なベクターに導入される。

氷核微生物は、種々の商業的応用において水の過冷却防止に用い得る。

米国特許第４，１６１，０８４号（１９７９）は、霜害を低減するために、植物の凍結を起こす温度を下げる方法を提供する。これは、凍結温度に達する前におよび、好ましくは、植物の苗の段階において、植物体に非氷核細菌を加えることによって達成される。

凍結温度になる前のＥｒｖｊｎｌａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａによる植物体の処理が記述されている、より早期の米国特許第４．０４５，９１０号（１９７７）もまた参照される。

米国の特許文献のいくつかをこのようにみると、農業作物への霜害の問題はもちろんよく認知されており、この深刻な問題を軽減するための多くの提案がなされてきたことがわかる。しかし、これら特許のいずれも、本発明の主題を教示または示唆するものではない。

技術的な文献の総説は、次の刊行物に記載されている。

増殖培養物の温度を上げることによって微生物中で合成されるタンパク質、いわゆる「ヒートショック」タンパク質をもたらし、増殖温度を低下させることによって合成されるタンパク質、いわゆる「コールドショック」タンパク質、等に関連する刊行物が特に注目されている。

本明細書に完全な引用が示されていない場合には、括弧中の番号によって本明細書束部の参考文献が参照される。

Ｎｅ１ｄｈａｒｔ、、Ｆ、Ｃら（［ヒートンＢ　ツクタンパク質の遺伝学および調節（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｌｃｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｌｏｎ　ｏｆＨｅａｔ−Ｓｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｅｌｎｓ　）　Ｊ　、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、＋　Ｖａｔ。

１８、ｐｐ、　２９５−３２９、１９８４　）は、原核および真核細胞におけるヒートショック応答について考察している。大腸菌で同定されたヒートショックタンパク質について記載されている。

Ｃｏｖｌｆｎｇ％Ｄ、Ｗ、ら（「大腸菌ヒートショック遺伝子プロモーターのコンセンサス配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌＩ　Ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）　Ｊ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　Ｖａｔ、　Ｉｉ２、　Ｉ）ｐ、　２６７９−２６８３．１９８５）は、大腸菌ヒートショックプロモーターのコンセンサス配列およびヒートショックタンパク質をコードする遺伝子を同定している。各々のプロモーターからの転写は、インビボで熱誘導性であって、ｒｐｏＨ（ｈｔｐＲ）によってコードされるσ７０因子を含むＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで認識されるが、主要大腸菌σ３０因子を含むＲＮＡポリメラーゼでは認識されない。

ヒートショックタンパク質の転写の誘導は、主に、ｒｐｏＨ（Ｈｔ　ｐＲ）によってコードされるＲＮＡポリメラーゼの別のσサブユニットによって達成されることが報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎら（１）および５ｔｒａｕｓｓら（２））。

種々の生物におけるヒートショック応答についての総説は、Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ　（ｒ　ヒートン５１７り応答（Ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋＲｅｓｐｏｎｓｅ）　Ｊ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、Ｖｏｌ、　５５．　ｐｐ。

１５１−１１０１、１９８Ｇ　）およびＮｅ１ｄｈａｒｄｔら［ヒートショックタンパク質の遺伝学および調節（ＴｌＩＢ　ｇＨ６ｔｉｅｓ　ａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｅｌｎｓ）Ｊ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ　、、Ｖｏｌ、　１８、　ｐｐ、　２９５−３２９、１９８４　）を参照されたい。

Ｂｒｏｅｚｅら（２４）は、５℃への温度シフトの後の大腸菌およびＰ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓによるタンパク質合成の相違を報告している。好中温（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）大腸菌においては、タンパク質合成は１時間低下してから止まることが報告された。そのような温度シフトの後に見出された７０ｓリポソームの蓄積は翻訳開始の阻止を示すものと解釈されている。一方、１０℃へのシフトの結果は、４時間の増殖遅延をもたらし、その後に新たな増殖が続く。Ｎｇら（４）および前出のＪｏｎｅｓらを参照されたい。

抗凍結タンパク質に関するさらなる背景については、）ｆｅｗら（５）およびＤｕ■ａｎら（６）を参照されたい。そのようなタンパク質は、極地に棲息する海洋魚の血清および冬季には氷点下になる領域の昆虫の血リンパに高濃度で共通して見られる、低分子量のタンパク質である。

転写の調節に一般に関係する背景情報については、例えば、「転写におけるタンパク質−核酸相互反応：分子分析（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｉｎｔｅｒａｅｔｆｏｎｓ　１ｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ１ｏｎ　：　Ａ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　Ｊ、Ｈｌｐｐｌｅｌ。

Ｐ、Ｈ，ら：　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　５３、　ｐｐ、　３８９−４４０．１９８４　）を参照されたい。この記述に関連した他の参考となる刊行物については、束部の参考文献を参照されたい。本明細書において用いている用語および技術を使用する遺伝子工学分野のいくつかの特許に関しては、「微生物宿主におけるポリペプチドの発現のための新規のクローニング担体ＣＮｏｖｅ！　Ｃｌｏｎｌｎｇ　ＶｅｈｌｃｌｅｓｆｏｒＰｏｌｙｐｅｐｔｌｄｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）ｎ　Ｍｌｃｒｏｂｌａｌ　１ａｓｔｓ）Ｊと題する米国特許第４，８２４，９２８号明細書（Ｍａｓａｙｏｒｌ　ＩｎｏｕｙｅおよびＫｅｎｚｏ　Ｎａｋａｍｕｒａ　、１９１１６）、［微生物宿主におけるポリペプチドの発現のための新規のクローニング担体（Ｎｏｖｅｌ　Ｃｌｏｎｌｎｇ　Ｖｅｈｌｃｌｅｓ　ｒｏｒ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｊｄｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｎ　Ｍｉｃｒｏｂｌａｌ　Ｈｏ５ｔｓ）Ｊと題する米国特許第４．６８６，８３８号明細書（Ｍａｓａｙｏｒｆ　ＩｎｏｕｙｅおよびＫｅｎｚ。

Ｎａｋａｍｕｒａ　、　１９８７）、「微生物宿主におけるポリペプチドの発現のための新規のクローニング担体（ＮｏｖｅｌＣｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｈｊｃｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　１ｎ）ｌｌｃｒｏｂｆａｌ　Ｈｏ５ｔｓ）Ｊと題する米国特許第４，８４３，９８９号明細書（Ｍａｓａｙｏｒｌ　１ｎｏｕｙｅおよびＹｏｓｈｉｈｌｒｏ　Ｍａｓｕｌ、１９８７）　、および［微生物宿主におけるポリペプチドの発現のためのクローニング担体（Ｃｔｏｎｉｎｇ　Ｖｅｈｌｃｌｅｓ　ｆｏｒＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｍｌｃｒｏｂｌａｌ　Ｈｏ５ｔｓ）　Ｊと題する米国特許第４，７５７．口１３号明細書（Ｍａｓａｙｏｒｌ　１ｎｏｕｙｅおよびＹｏｓｈｌｈｌｒｏ　Ｍａｓｕｌ、　１９８１１）が参照されよう。

その他の刊行物では、興味のある文献が最近発表された（「大腸菌における低温への応答によるタンパク質誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ＬｏｗＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　１ｎ　Ｅｘｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　Ｊ、Ｊｏｎｅｓ、Ｐ、Ｇ。

ら：　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ！　ｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ＩＶｏｌ、　１８９　、ｐｐ。

２０９２−２０９５、１９１　：ｌ。この文献では、転写および翻訳あるいは口１ＲＮＡ分解に関与する一群のタンパク質の合成について考察がなされている。

細菌の増殖温度が３７℃から１０℃に下げられる場合に、タンパク質が増殖遅滞の間に合成されることが報告されている。約１３のタンパク質について言及されている。１２の同定されたタンパク質が増殖遅滞中に合成され（温度を３７℃から下げた後で）、５個は同定されておらず、コールドショックタンパク質の一つ（Ｆｌｏ、６と称される）は、低温度での増殖中に検出可能なほどに合成される。これが一時的合成であるということは示されていない。

図面の簡単な説明第１図は、主なコールドショックタンパク質誘導を示す。右方の矢印は、誘導された主要なコールドショックタンパク質、ｅｓ７．４、を示す。

第２図（ＡおよびＢ）は、ｃｓ７．４の一時的誘導を示す。示される番号は以下のごとくである。１）パルス−標識、温度シフト後、０〜３０分、２）３０〜６０分、３）６０〜９０分、４）９０〜１２０分、５）１２０〜１５０分、６）１５０〜１８０分。矢印は第１図に記載の通りである。

第３図は、ｃｓ７．４の安定性を示す。矢印はｃｓ７．４を示す。

第４囚は、ｃｓ７．４の精製において用いられる二次元ゲルを示す。

第５図は、ｃｓｐＡのサザンプロット分析を示す。

第６Ａ図は、ｃｓｐＡのＤＮＡ配列を示す（制限地図および配列決定手順）。

第６Ｂ図は、クローニングしたＨｉｎｄｍ断片の部分的ヌクレオチド配列を示す。ｅｓｐＡをコードする領域およびｃｓ７．４に対応するアミノ酸配列を太字で示す。

下線を付したＡＧＧは、おそらくシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ）配列である。半矢印で下線を付した領域は、逆向き反復を示す。

第７図は、ｃｓｐＡ遺伝子（矢印で表示）を有するプラスミドｐＪＪＧＯ１を図示したものである。

第８図は、ｐＪＪＧ１２を図示したものである。

第９図は、ｐＪＪＧＯ４を図示したものである。

発明の開示の概要本発明は、微生物、特に細菌、を遺伝学的に形質転換し、遺伝子量的能力を付与し、特に「コールドショック」または「抗凍結」および他のタンパク質を産生ずるための、方法、システムおよび組成物を提供する。また、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の正しい結合およびそれに続く特異的ＲＮＡ転写開始能を有する型への活性化を指示するシグナルを含むＤＮＡ断片（「プロモーター」）を提供する。

本明細書において記述されるプロモーターは、低温によって誘導されて、コールドショックまたは抗凍結または他のタンパク質をコードするｃｓｐＡ遺伝子の発現を調節することができる。具体的な適用については、以下に示される通りである。

コールドショックまたは抗凍結タンパク質と称されるタンパク質、特にｃｓ７．４と呼ばれる大腸菌のコールドショックタンパク質、を発現させるための遺伝学的システムが提供される。

本発明は、周囲の温度以下または生理的増殖温度以下への温度低下に応答して、大腸菌において合成される新規のポリペプチドを提供する。ポリペプチド（またはタンパク質）は、コールドショック下で誘導される７、４ｋｄａｔのタンパク質で、ｒｃｓ７．４Ｊと称する。

このポリペプチドの注目すべきところは、これがそれが誘導された低温度以上の温度で安定であることである。

本発明は、また、ｃｓ７．４タンパク質をコードする遺伝子を提供する。さらに、本発明は、ｃｓ７．４をコードする遺伝子の発現を調節し、また、微生物の増殖温度以下への温度シフトに応じてｃｓ７．４以外のタンパク質の転写を開始することができる、低温によって誘導されるプロモーターを提供する。

また、本発明は、本発明のプロモーター以外のプロモーターの指示の下に抗凍結タンパク質をコードする遺伝子を発現させる系を提供する。

さらに、本発明は、プロモーター、構造遺伝子および他の必要な機能的ＤＮＡ要素を含むプラスミドのようなりローニングベクターなどの種々のＤＮＡ構築物、および形質転換された宿主を提供する。

また、本発明は、低温による傷害または致死、例えば微生物および植物細胞の凍結などを予防または低減させる分野において本発明の産生物を種々に利用することも意図している。本発明のタンパク質を例えば作物に対する「抗凍結」化合物として用いること、また、本発明のｃｓ７．４のタンパク質をコードする遺伝子またはその部分によって形質転換された無毒の微生物を農業または他の利用に用いることが意図されている。また、ｅｓ７．４タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡを作物宿主細胞に移して、そこでｃｓ７．４抗凍結タンパク質を産生させて、これによって作物を霜害から守ることも意図されている。

本発明は、抗凍結タンパク質をコードするコールドショック誘導遺伝子の発現を調節することができる、コールドショックで誘導されるプロモーター（「本来の」プロモーター）を提供する。

さらに、本発明は、抗凍結タンパク質または他のタンパク質をコードする遺伝子の発現を生理的温度以下の温度で調節することができるプロモーター（「本来の」）を提供する。ｃｓ７．４が本明細書ではしばしば参照されるが、本発明のプロモーターによっていかなるタンパク質をも産生ずることが意図されている。

また、本発明は、生理的温度における異種（外来の）プロモーターの調節下での抗凍結タンパク質をコードする遺伝子の発現を提供する。

さらに、本発明は、プロモーター配列をさらに明らかにして、プロモーターのＤＮＡ配列を合成によって作出し得ることを意図する。そのようなプロモーターは、低温、すなわち、生理的温度以下の温度におけるタンパク質の発現の調整にを用であろう。

本発明において、プロモーターが本来の構造遺伝子なしで用いられ得て、また逆に、構造遺伝子が異種プロモーターによって調節され得るという意味で「非連結（Ｕ口ｃｏｕｐｌｅｄ）　Ｊであり得ることは、注目すべき点である。

本発明の他の特性については、以下の説明によって明らかになろう。

図面の簡単な説明（第１図−主要コールドショックタンパク質誘導）３０℃で増殖している細胞培養分液を４２℃、３０℃、２５℃および１８℃として、直ちに［３５Ｓ］メチオニンで１０分間パルス（ｐｕｌｓｅ　）標識した。サンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。オートラジオグラムを本図に示す。分子量標準サイズを左方にキロダルトンで示す。右方の矢印は、誘導された主要コールドショックタンパク質を示す。

（第２Ａ図および２Ｂ図−ｃｓ７．４の一時的誘導）３７℃で増殖している細胞培養液を分けて１０℃または１５℃とした。次いで、各々の培養液分を［３５Ｓ］メチオニンで３０分間間隔でパルス標識して、第１図の記述と同様に電気泳動に供した。第２Ａ図二本図に示したオートラジオグラムにおいて、Ｃは温度シフト前に分液を３７℃で５分間パルス標識した対照を示す。数字は次のものを示す。パルス標識、温度シフト後、１．０−３０分、２．３０−６０分、３．６０− ９０分、４．９０−１２０分、５．１２０−１５０分、および６．１５０−１８０分。矢印は第１図の記述と同じである。第２Ｂ図：Ａ図のオートラジオグラムを走査デンシトメトリーに供して、全体細胞中のメチオニン標識ｃｓ７．４タンパク質の百分率を各々の時間間隔で測定した。グラフ上の各々の時間点は、各３０分間隔の終わりにおけるメチオニン標ｆｉｃｓ７．４タンパク質の百分率を示す。例えば、３０分と６０分の間（縦座標では時間６０分の点）では、ｃｓ７．４は１０℃で細胞中の全メチオニン標識タンパク質の１０％を占める。０時間は、３７℃で５分間パルスを表し、これはＡ図に記述されている。

（第３図−ｃｓ７．４の安定性）３７℃で増殖している細胞培養液を１５℃とした。

３０分後、培養液を［３５Ｓ］　トランスラベル（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ）で３０分間パルス標識した。次いで、培養液を、本図で示したオートラジオグラムの上に示した種々の時間の長さで、非放射性標識のメチオニンおよびシスティンを用いて追跡した。サンプルを第１図に記述したように電気泳動に供した。３７℃ のサンプルを第２図の記述のようにして調製した。矢印はｃｓ７．４を示す。

（第４図−ｅｓ７．４の精製に利用する二次元ゲル）３７℃で増殖している細胞培養液を４時間１４℃とした。培養液を集菌処理して、分画して、細胞質画分を二次元ゲル電気泳動に供した。第１次元は等電点電気泳動を、第２次元は５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルを、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロプロットシ、クマシーブルー染料で染色した。矢印はＣＳ７．４を示す。

（第５図−ｃｓｐＡのサザンプロット分析）大腸菌染色体ＤＮＡを、種々の制限酵素によって消化して、ＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロース紙に移した。本明細書に記載の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プローブを用いてハイブリダイゼーションを行って、本図に示すオートラジオグラムを得た。制限酵素消化は、Ｓ　（Ｓａｌｌ）、Ｐ　（ＰｓｔＩ）、Ｂ　（ＢａｍＨＩ）　、Ｅ　（ＥｃｏＲＩ）およびＨ（ＨｉｎｄＩｆｆ）で行った。

λＤＮＡをＨｉｎｄＩｎで消化して、サイズ標準物質として用いた。ＨｉｎｄＩｌｌで消化した染色体ＤＮＡもまたアガロースゲル電気泳動で分画して、本図に示される画分１〜１２を得た。

（第６Ａおよび６Ｂ図−ｃｓｐＡのＤＮＡ配列）クローンｐＪＪＧＯ１からの２．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩ［断片の約半分を配列決定した。第６Ａ図は、制限酵素地図および配列決定工程を示す。制限酵素部位は、Ｈ（ＨｆｎｄＩ［［）、Ｄ　（Ｄｒａｌ）、Ｓ　（Ｓｍａｌ）、Ｂ（ＢｇｌＩ）、Ａ（ＡｐａＬり、Ｐ（ＰｖｕＩＩ）およびＸ（ＸｍｎＩ）である。太線矢印はｃｓｐＡをコードする領域を示す。第６Ｂ図は、クローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ断片の部分的ヌクレオチド配列が示されている。ｃｓｐＡをコードする領域およびｃｓ７．４に対応するアミノ酸配列は太字で示されている。下線を付したＡＧＧは予想されるＳＤ配列である。半矢印で下線を付した領域は、逆向き反復を示す。

第７．８および９因についてはさらに以下に記述する。

特異的および好ましい態様の記述本発明は、「コールドショックＪタンパク質の製造法、そのためのプロモーターおよび種々の構築物を提供する。

以下に記述される一つの態様において、コールドシップクタンパク質をコードする遺伝子は異種プロモーターの調整下で発現される。他の態様においては、コールドショックで誘導されるプロモーターは、低下させた増殖温度に応答して、異種タンパク質の合成を調節するために用いられる。

本発明のｃｓ７．４タンパク質を誘導して産生ずる本発明の方法は、適当な微生物、例えば大腸菌、を高栄養培地中で指数速度で各微生物の生理的増殖温度で所望の増殖密度にまで増殖させることから成る。大腸菌では、そのような温度は、約り０℃〜約５０℃の範囲、好ましくは２０℃〜約４０℃の範囲である。微生物は各々固有の最適増殖温度を有している。大腸菌の場合は、温度を約４０℃に上げるか２０℃以下に下げると増殖は漸次遅くなり、増殖温度の上限、約４９℃、または下限、約８℃、で増殖は停止する。

所望の増殖程度が得られたときに（分光光度測定などの適当な方法によってモニターする）、温度を約１０℃以上で約２０℃以下、好ましくは約２０℃以下および約８℃以上、の低い温度に急速にシフトさせる。一般に、低温においては実質的な増殖速度は維持されない。望ましければ、低温であるが微生物が増殖しない温度よりは高い温度ヘシフトさせてもよい。低い温度範囲で適当な期間、本発明のポリペプチドの最適生産のために、培養する。ポリペプチド誘導の動力学は、放射性メチオニンによってパルス標識し、培養物を集め、二次元ゲル電気泳動によって処理分離して、オートラジオグラフィーによって合成されたタンパク質量を決定するなどの適当な方法によって、追跡される。

本発明のタンパク質は微生物、この場合は大腸菌、が正常に増殖する生理的増殖温度においては合成されず、本ポリペプチドはより低い温度範囲で合成されることが見出された。ポリペプチド合成の急激な誘導は、１０℃または１５℃への温度シフト後、大体最初の３０分間に起きる。合成の最大の誘導および速度は温度シフト後の温度に依存する。１５℃へのシフトの後、最大の合成は温度シフトから３０〜６０分後に達成され、最大の合成率は、全タンパク質合成の約１３．１％である。第２Ａおよび２ＢＣを参照されたい。１０℃へシフトした場合、シフト後６０〜９０分に全タンパク質合成の約８．５％の最高合成率となる。したがって、温度の調整は、本発明の目的に適合して、ポリペプチドの合成率および／または収量の調整を可能にする。最大の全ポリペプチド収量が達成された後に、ポリペプチド合成率は低下して、例えば１５℃に温度シフトした培養物では最大時の約５分の１、および１０℃に温度シフトした培養物では最大時の約５分の３に最終的には低減する。

本発明のｃｓ７．４タンパク質の注目すべき特徴は、誘導され合成された温度範囲より高い温度における安定性である。そのような生理的温度は、約り５℃〜約４０℃の範囲、またはより高温、である。第３図のデータは、タンパク質が合成後１５℃で２０時間安定であり（約３０％のタンパク質が分解されたのみ）、３７℃で（少なくとも１．５時間）安定であることを示している。

生理的温度における本発明のタンパク質の安定性は、実際の応用に重要である。

これによって、本発明のプロモーター以外のプロモーターを用いての生理的温度における本タンパク質合成が可能になる。また、本タンパク質が凍結または霜害の予防機能を開始する前に、周囲温度で作物に本タンパク質を農業上適用しておくことが容品になる。

本発明の他の要素は以下に記述される通りである。本発明のプロモーターは、クローニングされたＨｉｎｄＩＩ［断片のヌクレオチド１と６０５の間に位置していると考えられている。クローニングされたＢｉｎｄｕ断片の最初の９９７ｂｐは、リポソーム結合部位を含む調節された発現のための機能的遺伝子の全必須要素を含んでいる。

コーティング領域の一３５上流および一１０上流、すなわち、各々３３０の位置および３５５の位置にプロモーター配列の証明がある。プロモーターの他の特徴は、温度の降下に応答することである。

本発明のプロモーターは、下げられた温度で活性化されて、本発明の遺伝子の転写を指示する。

本発明のプロモーターは、インビボで低温誘導性であり、インビボでＲＮＡポリメラーゼによって認識される。

本発明者らは、作用機序または機能に関するいかなる特定の説または原則にも捕られれることを欲しないが、いくつかの仮説が現在考えられている。本発明者らは、本発明のプロモーターの調節の機序として三つの可能性（互いに重複する可能性もある）を考えている。まず、低温によって活性化されるインデューサーが低温においてプロモーターからの発現を誘導するという可能性がある。第二に、低温感受性リプレッサーが低温において不活化されて、その結果、遺伝子が発現されるのかもしれない。第三に、ＲＮＡポリメラーゼによる構造遺伝子の上流の新規のプロモーター配列の認識を可能にする低温誘導性の別の（σ７０のような標準物以外の）シグマ因子によって遺伝子が調節されることが、考えられる。特に形質転換される宿主が腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｅｅａｅ）に属するものでなくてもよいことを考慮すると、別の機序が仮定されてもよい。

本発明は、さらに、大腸菌などの微生物の増殖温度において安定であるｃｓ７．４と称される低温誘導性細胞質タンパク質を提供する。このポリペプチドは、部分的アミノ酸配列、ＳＧＫＭＴＧ　（Ｘ）ＶＫＷＦＮＡＤＫＧＦＧＦ　Ｉ、を有する。ここでＸはロイシンまたはイソロイシンである。イソロイシンおよびロイシンがともに同定された（各々６４％および３６％）。したがって、本発明は一方および両方のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、７０個のアミノ酸残基からなるタンパク質である。計算による分子量は７４０２ダルトンであり、計算によるｐＩは５．９２である。ポリペプチドは荷電残基を２０％以上含んでおり、著しく親水性である。

リジン残基がタンパク質の１０％を占める。ＮＢＲＦデータベースによれば他のいかなる配列との相同性も認められなかった。

本発明を進めるにあたって行われた二次構造決定に関して、ＣｈｏｕおよびＰａｓｍａｎ　（１９７８）　（１１）のルールれば顕著な二次構造形態は認められなかった。しかし、アミノ酸残基を螺旋状網（ｈｅｌｉｃａｌ　ｎｅｔ　）にプロットすると、１６個の荷電残基のうちの１２個が反対に荷電した対として隣接していることが決定された。また、タンパク質をα−へリックスに折り畳むと、タンパク質中の１６個の荷電アミノ酸残基のうちの１２個が反対に荷電した残基と並列になる。このデータは、本発明のタンパク質の大部分または実質的には全部がα−ヘリックス構造をしているかもしれないことを示唆する。

魚（　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｆｌｏｕｎｄｅｒ）からの抗凍結ポリペプチドの二次構造の最近の結晶学的研究は、分子が単一のα−へリックスであることを示している。抗凍結ポリペプチドの結晶構造およびその作用メカニズム（ＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎ　Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｉｔｓＭｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　Ｙａｎｇら：　Ｎａｔｕｒｅ．　Ｖｏｌ。

３３３、　１９　Ｍａｙ　１９８８、　ｐｐ．　２３２−２３７）　（２５）を参照されたい。抗凍結タンパク質結合の機序は、氷結晶の全表面はタンパク質表面に水素結合できる原子で密になっていること、および側鎖の柔軟性によって水素結合の多くのパターンが存在し得るという事実に基づいて提案されている。示唆された機序は、抗凍結ポリペプチドが氷格子の局所配列を誘導して、螺旋構造からの双極子モーメントがペプチドの好ましい配列を氷核のＣ−軸に指示し、次いで、螺旋構造のシフトが起き得て、親水性アミノ酸の側鎖の捻れ運動によってタンパク質と氷表面との結合が強化されるというものである。

本発明のポリペプチドの螺旋構造のさらなる証明によって、本発明のポリペプチドｃｓ７．４が、遺伝子工学的方法によちて生産され得る、大腸菌において低温誘導される最初の抗凍結タンパク質であるかどうかが明かにされよう。ｃｓ７．４の二次構造の研究によって他の可能性も生まれよう。例えば、α−へリツクス構造を有するペプチドの部分のみが抗凍結機能に必須であり、同様に、そのようなペプチド画分をコードするヌクレオチド配列の部分のみがそのような抗凍結適用に必須であることが想定され得る。

ｃｓ７．４のための遺伝子を含むクローニングされた２、４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｈｉｎｄｍによる消化および５％ポリアクリルアミドゲル上での分離によってｐＵＣ９から単離した。次いで、断片をＭ１３中にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定をチェインターミネーシジン法（Ｓａｎｇｅｒら：　１９７７）によって行った。ＤＮＡ配列決定を、［３５Ｓ］　ｄＡＴＰおよび酵素、シクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　）を用いて製造者（υｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｌｏｃｈｅｓｌｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）の指示による方法で行った。

クローニングされたＨｉｎｄＩ［Ｉ断片の部分的ヌクレオチド配列は、ｃｓ７．４およびそのプロモーターをコードする配列を含む。本発明のポリペプチドｃｓｐＡをコードするヌクレオチド配列は、以下の２１０個のヌクレオチド配列を含む。

ＡＴ　”　ＣｒＣＣＴＧＡＣＧＡ　ｎアスはαコＡαπ ＣＴＧｃｓｐＡによってコードされる対応するアミノ酸配列は、次に示す通りである。

Ｈ＠ｔｓ＠ｒＧｌｙＬｙｄ＊ｔｚｙＸ１ｍＶａ３１．ｙｓＴｒｐ　Ｐｈ山飢−卯ＬＹｓＧｌｙＰｉ＋ｅＧｌｙＰｈｅ工１ｅτｈｒＰｒ。

態μ卯ＧｌｙｓａｒＬｙｓＡｓｐｖａｕ’ｂ＠ＶａｌＥｉｓＰｂｅ５框紅社麺Ｃ麟ｎＡｓｐＧＬｙ？ｙｒＬｙｓＳ＠ｒＬａｕＡｓｐＧｌｕＧｌｙＧｊ≦Ｙ薯ＶｔＬＳａｒＰｈ＊シｎｓＧｌｕｓａｒｃＬｙＡｌａＬｙニｙｂ−崩ムＧｌｙＡｓｎＶａｌ？ｈｒＳａｒＬｍｕ配列は第６Ｂ図に示され、これはクローニングされたＨｉｎｄＩ［［断片のヌクレオチド６１フ番目のＡＴＧコドンに始まってＴＡＡ終止コドンで終る２１０個のヌクレオチドからなるオーブンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｌｌｅ）を含む。このオーブンリーディングフレームは、ｃｓ７．４合成に関与する本明細書でｃｓｐＡと命名した遺伝子のコーディング領域である。

本発明は、その範囲に、ポリペプチドｃｓ７．４またはｃｓ７．４の性質を有するＣｍ能的に同等の）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそのいかなる部分配列をも包含する。また、本発明は、一つまたはそれ以上のコドンが他のあるコドンによって置換されている、そのヌクレオチド配列がｃｓ７．４ポリペプチドまたは機能的にそれと同等であるものをコードする、同等のいかなるヌクレオチド配列をも包含する。

本発明と関連した研究において、低温誘導ポリペプチドｃｓ７．４をコードする遺伝子の二つのコピー（ｅ　ｓ　ｐＡおよびｃｓｐＢ）が存在する可能性のあることを示唆する証拠が今日までに提示された。この証拠については以下にさらに検討する。本発明は、その範囲に、ｃｓ７．４ポリペプチドまたはその機能的同等物をコードするような他の考えられる遺伝子を含む。分子生物学においては、大腸菌における同一のタンパク質をコードする複数遺伝子の例、例えばエロンゲーシジンファクターＴｕ（ｔｕｆＡおよびｔ　ｕ　ｆ　Ｂ）およびオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（Ａｒｇ　ＡｒｇＦＡｒｇｌ）などがある。ｃｓ７．４をコードする遺伝子が二つあるとすると、これは二遺伝子低温誘導性ポリペプチドの最初の発見となる。

本発明によると、クローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ断片の９９７ｂｐの断片からｃｓｐＡ構造遺伝子を除去して、外来性の遺伝子で置き換え得ることが考えられる。必要であれば、８５７〜８６６および８６９〜８７８の３′末端の逆向きの反復を保持してもよい。しかし、必要でなければ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片はＴＡＡ終止コードンの上流の塩基対を含む必要はない。外来性遺伝子（またはその部分）は、低温誘導性プロモーター（またはそれと同等のもの）によって誘導され得て、目的のタンパク質をコードすることができる。

本発明の他の態様において、コールドショックタンパク質はそれをコードする遺伝子によって本発明のプロモーターの調節下で発現される。

さらに本発明の他の態様において、本来のプロモーター以外のプロモーターは、生理的温度、すなわち細菌が指数的増殖をする温度範囲、においてｅｓ７．４遺伝子の発現を調整することができる。したがって、本発明によると、異種プロモーター、大腸菌１ａｃプロモーター、がｃｓ７．４遺伝子の発現を調節するために用いられた。

ｃｓｐＡ構造遺伝子を、高レベル発現ベクター、ｐ　ＩＮ■（Ｉｐｐｐ５）（７）　、中にサブクローニングした。得られる構築物、ｐＪＪＧ１２は第８図に図示される通りである。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えて、３７℃におけるｃｓ７．４タンパク質の発現が全細胞溶解物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出された。タンパク質の発現は、本来のプロモーターによって１５℃で調節された発現から得られたものよりも５〜】０倍少なかった。

しかし、本タンパク質の発現が本来のプロモーター以外のプロモーターによってより高い温度において得られた事実は、特に本タンパク質が通常は３７℃で発現されないことから、有意義である。これによって多くの興味のある新たな可能性が開かれる。ｌａｃプロモーター以外のプロモーターが本遺伝子の発現の調節により効果的であることも考え得る。また、低温（１５〜１０℃）範囲における細胞の増殖は選択された微生物、例えば大腸菌、の最適増殖温度におけるよりも遅い。したがって、最適増殖温度では収量は少ないかもしれないが、低収量は細菌のより速い増殖によってカバーされるようである。

ｌａｃプロモーターよりも強力なプロモーターをｃｓ７．４遺伝子の発現の調節に用いれば、ｃｓ７．４のような有用な抗凍結タンパク質を高収量で満足すべき時間内に商業的な規模で得ることが期待され得る。したがって、大量の抗凍結タンパク質が得られるであろう。

上記の性質、すなわち、タ゛ンバク質が生理的温度で産生されてかつ抗凍結タンパク質として活性であることは、したがって、きわめて有意義である。

この開示の結果、当業者は、ｌａｃプロモーター以外の他の適当なプロモーター、例えばｔｒｐ、ｔａｃプロモーター、λｐ　Ｌ、　ｏ　ｍ　ｐ　Ｆ　Ｓｏ　ｐ　ｐおよび他のプロモーター、を所望のタンパク質をコードする遺伝子の発現の調節に用いられるかもしれないことを認めるであろう。

酵母などの他の形質転換微生物を用いてタンパク質を発現させる場合には、ＧＡＬＩＯその他のプロモーターが適しているかもしれない。

さらに、簡単に上記したように、低温において活性である本発明のｃｓｐＡプロモーターを、ｃｓ７．４コールドシヨツクタンパク質以外のタンパク質の発現の調節に用いることができる。したがって、これは、さらに他の可能性を当然に開くものである。生理的温度において酵素的に（例えばタンパク質分解によって）分解されることがなければ有用であるタンパク質を、酵素分解に対して影響が少ない低い温度において発現し得るということは、特に興味深い。同様の可能性は、生理的に活性の温度において産生されたときにおそらく誤った折り畳みのために、生物学的に非活性となるような有用なタンパク質にも認められる。本発明のｃｓｐＡプロモーターの調節下で、正しく折り畳まれて活性であるタンパク質を生産することは有利であるかもしれない。

これらの観察は、抗凍結タンパク質にのみ適用されるだけではなく、従来、生理的温度において所望の構造形態では発現することができなかったいかなるタンパク質の発現にも適用される。これらのタンパク質をより低い非傷害温度において本発明のプロモーターを用いて発現させることができる。

本発明の上記の態様において、本発明のｃｓｐＡプロモーターは、古典的モデルにおいてβ−ガラクトシダーゼの発現の調節に用いられた。この目的のために、１ａｃＺ構造遺伝子を含みプロモーターを持たないプラスミド（ｐＫＭＯＯ５）（２１）を、８０６ｂ９のＨｉｎｄｍ−Ｐｖｕｎ断片上にｃｓｐＡプロモーターを含むプラスミド（ｐＪＪ’ＧＯ４）と比較した。第９図を参照されたい。

第二のプラスミド、ｐＪ’ＪＧＯ８（第９図を参照されたい）を、ｃｓｐＡ遺伝子の上流領域のより小さいヌクレオチド分画を含み、ＡｐａＬＩ部位（ｂｐ５３４）で終結するように構築した。その結果を以下の表１に示す。

表１プラスミド　温度　１５℃への　１０℃への３７℃　シフト後　シフト後ｐＫＭＯＯ５６，７４，１３，７ｐＪＪＧＯ４５４９，０９００，０ｇ５１．０ｐＪＪＧＯ８４０，７４５，８５６，１数字は酵素活性の「単位」を表す。

ｐＪＪＧＯ４とｐＪＪＧＯ５の収量の差は、プロモーターまたは他の調節要素が０〜５３４ｂｐ断片中にあることを示唆しよう。５３４から遺伝子の開始点までの領域もまた調節要素を包含するのかもしれない。同様に、ｂｐ８７８までの遺伝子の下流領域もまた調節要素を包含するかもしれない。

結果は、ｃｓｐＡプロモーターが、タンパク質の発現を異挿遺伝子に指示する能力があることを示している。

次の諸例は単に本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。当業者は、容易に変更および代替を行って同等の結果を得ることができる。

大腸菌５Ｂ２２１（ｌｐｐ　ｈｓｄＲｔｒｐＥ５１ａｃＹ　ｒｅｃＡ／Ｆ’　１ａｃＩｑｌａｃ＋ｐｒｏ”）（７）の培養を１０１１の培養容量中で温度シフトに先だって約２×１０８細胞／−１の密度にまで増殖させた。３０℃で増殖している細胞培養液の１．１１分液を、１０ｕＣ１の［３５３］メチオニン（＾＊ｅｒｓｈａｓＣｏｒｐ、、＞１０００　Ｃ１／ｍ５ｏｌ）または［３５Ｓ］　）ランスラベル（ＩＣＮ　Ｒａｄｌｏｃｈｅｓｊｃａｌｓ、　ＩｒＶＩｎ８、ＣＡ　）を含む４２℃、３０℃、２５℃および１８℃のビーカーに移して、１０分間パルス標識した。全サンプルを遠心分離によって集めて、ベレットを凍結乾燥によって乾燥させた。次いで、サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の１７．５％の分離用ゲル上に供した。ゲルを乾燥させて、Ｘ線フィルムに当てた。

得られたオートラジオグラムは、見かけの分子量が８ｋｄａｌであるタンパク質が２５℃へのシフト後にのみ産生されたことを示した。シフト前または４３℃へシフトされた培養液では対応するバンドは見られなかった。このタンパク質をｃｓ７．４と称する。

コールドショックタンパク質をコードする配列およびその調節要素を含むプラスミドの構築において、まず、遺伝子座（ｆｏｃｕｓ　）を同定して単離することが必要である。オリゴヌクレオチドプローブを調製するために、タンパク質の部分的なアミノ末端配列を得る。大腸菌５Ｂ２２１　（７）の培養液の１０１を、３７℃で約２×１０８細胞／１の密度になるまで増殖させて、１４℃に４時間移す。次いで、細胞を集めて４．前記（９）のようにして可溶画分を分画した。上記のように１５℃へのシフト後に３０分間パルス−標識したタンパク質の微量を、次いで、２５０μｇの可溶分画タンパク質と混合した。

次いで、二次元電気泳動を、−次元を等電点電気泳動法（ａｓｐｈｏ！　１ｎｅｓ、　ｐ　Ｈ３〜１０．１．５％、ｐＨ６〜８．０．５％）および二次元を５ＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（１０〜１８．４％アクリルアミド、架橋度２．７％）で、０°Ｆａｒｒｅｌｌ　（１５）の方法に従って行った。分離されたタンパク質を、半乾燥ブロック−装置（Ｓａ＋４ｔｏｒｉｕｓ　Ｇｍｂ）Ｉ　、Ｇｏｅｔｔｌｎｇｇｅｎ、ＦＲＧ）および移動緩衝液として４８ｍＭ）リス、３９１Ｍグリシン、１．３ｇＭ　ＳＤＳおよび２０％　（Ｖ／Ｖ　）ｙ１９）−ル（ｐＨ９，２）を用いてボリニフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＨＡ　）に電気泳動的に移した。次いで、膜をクマシーブルーＲ−２５０でタンパク質染色処理し、乾燥して、オートラジオグラフィーに供した。オートラジオグラムによって、前に観察されたｃｓ７．４とほぼ同じ分子量の位置に濃く標識されたタンパク質がはっきりと同定された（第４図）。オートラジオグラムのスポットを用いて染色膜上のｃｓ７．４スポツトを同定して、次いで、これをプロットから切り出した。自動エドマン分解を、）Ｉａｔｓｕｄａｉ　ｒａ（１９１１７）の方法に従ってＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅａｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０ガス相シーケンサ−を用いて、染色された膜断片上で直接行った。得られたアミノ酸配列は上記の通りである。

サザンプロット分析のための混合縮重オリゴヌクレオチドプローブを、以下に示したアミノ酸配列の短い領域に対合するように作出した。

、、、＋に−ＷＦ　Ｎ　入１．＋サザンプロット分析のために、染色体ＤＮＡを大腸菌５Ｂ２２１　（７）の−晩培養物から調製した。細胞を遠心分離によって集めて、１０Ｉｌ）Ｉトリス塩酸（ｐＨ８）で洗浄して、リゾチーム（０，２５Ｍトリズ塩酸（ｐＨ８）溶液）を３．３Ｂ／ｍｌの濃度になるように加えた。次いで、サンプルを０℃で２０分間インキュベートしてからＲＮａｓｅＡを６０■Ｘの濃度になるように加えた。さらに５分間氷上においた後、１０％ＳＤＳを約１％の濃度になるように加えた。

次いでサンプルをすばやく混合して、前に加えたＲＮａｓｅＡの等量を、添加後の濃度が０、　１ａｇ／ｍｌになるように調整したプロナーゼ（２５℃Ｍトリス塩酸（ｐＨ８）溶液）とともに、再び加えた。次いで、サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした後、フェノール抽出、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：　１）抽出およびエタノール沈澱に供した。

次いで、サンプルをさらにフェノール抽出、エーテル抽出およびエタノール沈澱に供した。制限酵素消化の前に、染色体Ｄ　Ｎ　Ａ−ｆ−Ｍｌｌｌｊｐｏｒｅ　Ｔｙｐｅ　ＶＳ　Ｏ，，０２５ｕ−フィルターを用いて滴下（ｄｒｏｐ）透析した。

染色体ＤＮＡ分画を、少なくとも５０μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩ［、Ｓａ　ｌ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｐｓ　ｔ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化して０．７％アガロースゲル上で電気泳動することによって行った。

アガロースゲルからニトロセルロース紙へのＤＮＡのサザン移動を、Ｎａｎ１ａｔｉｓら（１９）によるマニュアルに記載の方法を次のように変更して行った。

ＤＮＡの部分加水分解のための酸浄化（ａｃｉｄ　ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ　）を、ゲルを０．２５Ｍ塩酸中で１５分間１回だけ洗浄することによって行った。さらに、移動を行う皿を１０ＸＳＳＣの代わりに２０ＸＳＳＣで満たした。

ハイプリダーゼ−ジョンを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（２６）の方法を次のように変更して行った。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液は、ともに、０．１ｍｌの５０　ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　０　、２ｍｌの３０ＸＮＥＴ。

０．５１の２０％デキストラン硫酸および０．０５ｍ１の１０％ＳＤＳ　（いずれも溶液１ｍｌ当り）を含んでいた。

これら溶液はＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ　（１９）に記述されている。プローブとして用いられたオリゴマーは、上記に示される。［３２Ｐ］標識されたプローブを、Ｉ　ｎｏｕｙｅおよび１ｎｏｕｙｅ　（１９）に従って作出して、プレハイブリゼーションおよびハイブリダイゼーションを３２℃で行った。

ｌ　ｎｏｕｙｅおよび１ｎｏｕｙｅ　（１９）の方法によって、フィルターを洗浄して乾燥させた。

混合オリゴヌクレオチドプローブとのサザンプロットハイプリダイゼーシランからのオートラジオグラムは、各消化物において少なくとも一つの明瞭なバンドを示した。特に、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物は、２．４ｋｂの大きさの一つのバンドを示した（第５図を参照されたい）。

２．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を次のようにして単離した。

染色体ＤＮＡのＨｔｎｄＩ［［消化物を０．７％アガロースゲル上で分画した。

次いでゲルスライスをゲル最上表層から０．５ｃｍ毎に切り出した。各ゲルスライスを、−２０℃で少なくとも２０分間凍結して、次いで、エッペンドルフ管中で１０分間遠心分離した。これを３回繰り返したが、最終回では凍結前にＩＩＩＮトリスおよび０．１■Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）を適量加えて、上溝液を各遠心分離の後に集めた。サンプルを、次いで、フェノール抽出３回、エーテル抽出およびエタノール沈澱に供した。

各画分を、プローブを用いてサザンプロット分析した。

画分７および８からのＤＮＡ断片は、オリジナル染色体消化物における２、４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩバンドによく対応するプローブと明かにハイブリダイズした。

例３ｃｓｐＡ遺伝子のクローニングｐＵＣ９プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＨｉｎｄｍ染色体消化物の画分７（例２を参照されたい）と連結させた。

次いで大腸菌ＪＭ８３株（ａｒａ　Ａ　（Ｉａｃ−ｐｒｏＡＢ）　ｒｐｓＬ　８０　ＩａｃＭ１５）（１３）を形質転換させて、５０μｇ／ｓｌのアンピシリンを含み２５μｌの４０ｇ＋ｇ／ｍｌのｘｇａｌを塗布したし一寒天プレート上で細胞をスクリーニングした。白色コロニーをワットマン濾紙に取り上げて、］　ｎｏｕｙｅおよび１ｎｏｕｙｅ　（１９）により記述されているようにコロニーノ＼イブリダイゼーシジンスクリーニングに供した。用いたプローブは、サザンプロット分析（例２を参照されたい）に用いたものと同じであった。／Ｘイブリダイゼーシラン温度は３２℃であった。オートラジオグラフィーで明るく見えたコロニーを、クローンが得られていることを確認するためにコロニーハイブリダイゼーションによる第二のスクリーニングに供した。

例４異種タンパク質合成の指示のためのａｓｐプロモーターの使用ｃｓｐプロモーターを、プラスミドｐＪＪＧＯ４からの、大腸菌におけるβ−ガラクトシダーゼの合成の指示に用いた。このプラスミドを次のようにして構築した。

遺伝子を含む２．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片をＰｕｖｌｌで消化した。得られる８０６ｂｐの断片を０．８％のアガロースゲル上で分離して、バンドを切り出して、塩−架橋電気溶出装置（ＩＢＩ　＊　Ｉｎｃ、製）を製造者の指示に従って用いて電気溶出によってＤＮＡを回収した。この断片を、次いで、ＤＮＡＴ４リガーゼを用いて、ベクター断片をＸｂａ制限酵素およびＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片で処理した後、プロモーター−確認ベクター（ｐ　ＫＭＯ０５）　（Ｍａｓｕｉら）（２１）に連結した。大腸菌ｌａｃ欠失株５Ｂ４２８８　（２１）を形質転換させて、組換えプラスミドを有する細胞を５０μｇ７膳１のアンピシリンおよび４０１ｇ／ｍｌのＸｇａ　ｌを含むＬ−寒天プレート上で青色コロニーとして選択した。

プラスミドｐ　Ｊ　Ｊ　ＧＯ４を有する大腸菌５Ｂ４２８８の培養物を３７℃で増殖させて、温度を１０℃または１５℃にシフトした。シフト前後のβ−ガラクトシダーゼ活性をＭｕｔｔｅｒ　（２２）の記述のようにして基質Ｏ−ニトロフェニール−β−Ｄ−ガラクトシドを用いて決定した。

結果は、培養物の１５℃へのシフトによってβ−ガラクトシダーゼ活性の６４％の増加を示し、これはクローニングされたｃｓｐＡプロモーターからの転写および続いてのβ−ガラクトシダーゼの発現の誘導を立証するものである。

この例は、本発明のプロモーター配列の多機能性をよｃｓｐＡ構造遺伝子を、高レベル発現ベクターであるｐ　ＩＮＩｔＩ　（ｌ　ｐｐＰ５）　（２３）に、部位特異性突然変異誘導に向けられたオリゴヌクレオチドを用いて構造遺伝子のすぐ上流に作られたＸｂａ１部位を用いて、サブクローニングした。Ｉ　ＰＴＧの添加によって、ｃｓ７．４タンパク質の発現を全細胞分解物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出することができた。

プロモーターを有するＤＮＡ断片のクローニングおよびプロモーターの有効性を調べるために用い得るベクターについては、Ｎａ５ｕｆ　ら（２１）を参照されたい。

他のコンピテントにした微生物宿主（真核および原核）は本発明に止って遺伝学的に形質転換できることが理解される。形質転換に感受性である細菌としては、大腸菌のよな腸内細菌科の菌、サルモネラ、枯草菌などのバチ特に、本発明の構造遺伝子または第６図に示されたヌクレオチド配列の全部または一部を用いてのサツカロミセス−セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞の形質転換は、興味深いかもしれない。酵母遺伝学の基礎的な技術、適当な酵母クローニングおよび発現ベクターおよび形質転換プロトコールは、本明細書に参考文献として特にあげられている「分子生物学の最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）Ｊ　（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　５、１９８９）　（２３）中で検討されている。

同様に、を椎動物細胞培養物も、本発明の構造遺伝子またはその部分または第６図に示されたヌクレオチド配列の全部または一部を用いて形質転換されるかもしれない。当業者は、サル線維芽細胞のＣＯ３−７系などの適当な細胞培養を選択するであろう。真核細胞へのＤＮＡのトランスフェクシヨンのための適当な技術は、「最近のプロトコールＣＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）Ｊ第９章（これも本明細書中の参考としてあげられている）に記載されている。例示されているプロトコールは、ＨｅＬａ。

ＢＬＡＢ／ｃ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３およびラット胎児線維芽細胞などの細胞系を用いて好結果が得られるものが示されている。

さらなるベクターおよびその源については、科学的な適当な参考文献とともに酵母クローニングベクター、植物ベクターおよびウィルスベクターが、さらに市販のクローニングベクターが、Ｐｅｒｂａｌ　（２２）　（ｐｐ、　２７７−２９８　）によってあげられている。

多くの適当な微生物がＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（１２３０１Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＨＤ　。

２０８５２−１７７８）から入手できる。

本発明の開示から、当業者には、本発明が、本発明のタンパク質の生物学的性質、または実質的に機能的に等価とみなされる性質、を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意図していることは明かになったであろう。同様に、本発明は、本明細書に記載したものと実質的には同じ機能を有するプロモーター配列をも意図する。このように、本発明は、ここに記述して開示した機能的な要素の機能的な等硬物を包含することを意図しており、事実包含する。

参考文献１、Ｇｒｏｓｓｍａｎ＋　Ａ、Ｄ、、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ、Ｊ、Ｗ、およびＧｒｏｓｓ、　Ｃ，Ａ、：　ｒ大腸菌のｈ　ｔ　ｐ　ｌ？、遺伝子産生物はヒートショックプロモーターのためのシグマ因子である（ＴｈｅｈｔｐＲＧｅｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　ｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ｉｓ　ａ　Ｓｉｇｍａ　Ｆａｃｔｏｒｆｏｒ　Ｈｅａｔ−５ｈｏｃｋ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　、　３８　、３８３−３９０、２、　５ｔｒａｕｓ、Ｄ、Ｂ、、　ｖａｔｔｅｒ、　Ｖ、Ａ、およびＧｒｏｓｓ、Ｃ，Ａ、：　Ｉ大腸菌におけるヒートショック応答はσ３２の濃度の変化によって調節される（Ｔｈｅ　Ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅＩｎ　Ｅ、ｃｏ！１　ｉｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　Ｃｈａｎｇｅｓ　Ｉｎ　ｔｈｅＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　（７３２）　Ｊ、Ｎａｔｕｒｅ、　３２９、３４１１−３５１、３、Ｂａ旧、　Ｈｌ、　Ｅｃｈｏｌｓ　＊　Ｈ，、５ｔｒａｕｓ、Ｄ、Ｂ、、Ｃｏｕｒｔ　ｖ　Ｄ、、Ｃｒｏｗｌ　、　Ｒ，およびＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ　。

Ｃ，Ｄ、：　ｆファージラムダｃｍタンパク質によるσ３２の安定化を通しての大腸菌のヒートショック応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　Ｒａ５ｐｏｎｓｅｏｆ　Ｅ、　ｃｏｌＩＴｈｒｏｕｇｈ　５ｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　３２　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｐｈａｇｅ　Ｌａｍｂｄａｃｌｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｊ、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ、、　ｌ、　５７−６４、１９８７４、Ｎｇ、Ｈ，、Ｉｎｇｒａｈａｓ、　Ｊ、Ｌ、およびＭａｒｒｖ　Ａ、Ｇ、　：「低温での増殖の結果の大腸菌における傷害および抑制解除（Ｄａｓａｇｅ　ａｎｄ　Ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｌｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌＩＲｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｆｒｏｍ　Ｇｒｏｖｈ　ａｔ　Ｌｏｗ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ）　Ｊ、」９Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　８４、３３１−３３９、　１９６２５．　Ｈｅｗ、ｃ、ｔ、、、　５ｃｏｔｔ、Ｇ、に、およびＤａｖｉｅｓ、Ｐ、Ｌ、　：　抗凍結の分子生物学。「低温における生存：生理学的および生化学的適応（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｊｏｌｏｇｙ　ｏｒ＾ｎｔｌｒｒｅｅｚｅ、　Ｉｎ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏ１ｄ：　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄ　Ｂ１ｏｃｈｅｍ！ｃａｔ　Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ）Ｊ、　Ｈ，Ｃ，Ｈｅ１ｌｅｒ　編、Ｅｆｓｖｌｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、　Ｎ、Ｙ、　＋　ｐｐ。

１１７−１２３．１９８６６、Ｄｕｍａｎ、Ｊ、およびＨｏｒｖａｔｈ　＊　Ｋ：　ｒ昆虫の低温耐性における血液リンパタンパク質の役割（Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｒ）１ｅｓｏｌｙｍｐｈ　ＰｒｏｔｅＩｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏ１ｄ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆＩｎｓｅｃｔｓ）Ｊ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏ！、、　４５．２６１− ２７０゜７、Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｋ、、Ｍａｓｕｉ、Ｋ３、　およびＩｎｏｙｕｅ。

Ｍ、：［大腸菌における構成的１ｐｐ遺伝子の発現のための転写調節スイッチとしてのｌａｃプロモーター−オペレーター断片の使用（Ｕｓｅ　ｏｆＬａｅ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＯｐｅｒａｔｏｒＦｒａｇｓｅｎｔ　ａｓ　ａ　Ｔｒａｎｓｃｒｌｐｔｌｏｎａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｗ１ｔｃｈ　ｆｏｒｔｈｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ’　ｔｈｅ　Ｃｏｎ５ｔｌｔｕｔｊｖｅ　Ｉｐｐ　Ｇｅｎｅ　！ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　Ｊ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎ、、　■、２８９−２９９．１９８２８、Ｖｌａｓｕｋ、Ｇ、Ｐ、、　Ｉｎｏｕｙｅ　ｔ　Ｓ、、　Ｉｔｏ、Ｈ，、Ｉｔａｋｕｒａ、Ｋ、および１ｎｏｕｙｅ　、Ｍ、：　ｒ大腸菌におけるリポタンパク質の分泌へのシグナルペプチドからの塩基性アミノ酸残基の完全除去の影響（ＥｆＴｅｃｔｓ　ｏｒ　ＣｏｍｐｌｅｔｅＲｅｍｏｖａｌ　ｏｆ’　Ｂａ５ｉｃ　Ａｓ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｔｄｕｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅＳｌｇｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｃｌｅ　ｏｎ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｌ）Ｊ、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５８、７１４１−７１４８、１９８３９、Ｌｅｈｎｈａｒｄｔ、Ｓ、、　ＰＯｌｌＩｔｔ、Ｓ、およびＩｎｏｕｙｅ、Ｈｌ：「二つのバイブリドタンパク質に及ぼす大腸菌ＯｍｐＡシグナルペプチドの疎水性領域の欠失突然変異の差別的効果（Ｔｈｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　１Ｊｆｅｃｔ　ｏｎ　Ｔｗｏ　ＨｙｂｒｉｄＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｒ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｖｊｔｈｉｎ　ｔｈｅＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　Ｒｅｇｌｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏｉｌ　ＯｓｐＡＳｉｇｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）Ｊ、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｔ、　２６２、１７１６−１７１９、１０、　１ｎｏｕｙｅ　＊　Ｓ、、５ｏｂｅｒｏｎ、Ｘ、、　Ｆｒａｎｃｅｓｅｈｉｎｌ　ｓＴ３、　Ｉｔａｋｕｒａ　、Ｋ、および１ｎｏｕｙｅ　＋　Ｍ、：「膜を隔てたタンパク質分泌のためのシグナルペプチドのアミノ末端領域における陽性荷電の役割（Ｒｏｌｅ　ｏｆＰｏｓｌｔｊｖｅ　Ｃｈａｒｇｅ　ａｔ　ｔｈｅ　Ａｍ１ｎｏ　Ｔｅｒｌｎａｌ　Ｒｅｇｌｏｎ　ｏｒｔｈｅ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　Ａｃｒｏｓｓｔｈｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）　Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、、７９．３４３ｇ−３４４１、１９８２１１、Ｃｈｕｏ　、Ｐ、Ｙ、およびＦａＳＩａｎ、Ｇ、Ｄ、：　ｒタンパク質構造の経験的予測（Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ　ｏｒＰｒｏｔｅｌｎ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）　Ｌ　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ＊、１　４７　．２５１−２７［ｉ、１９７８１２、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、Ｃｒｅａ　＊　Ｒ，およびＳｅｅｈｕｒｇ。

Ｐ、Ｈ，：　ｒ　ショットガンＤＮＡ配列決定のシステム（Ａ　５ｙｓｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｓｈｏｔｇｕｎ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）　Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　９、３０９−３２１．　１９８１１Ｂ、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｊｅｒｉａ　％Ｊ、およびＭｅｓｓｌｎｇ、　」、二Ｆ改良されたＭ１３ファージクローニングベクターおよび宿主株：Ｍ１３ｍｐ１８およびｐＵｃ１９ベクターのヌクレオチド配列（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｍ１３Ｐｈａｇｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｈｏ５ｔ　５ｔｒａｉｎｓ：　ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｍ１３＋＋ｐ１８　ａｎｄ　ｐＵｃ１９　Ｖｅｃｔｏｒｓ）Ｊ。

Ｇｅｎｅ、　３８、１０３−１１９、１９８５１４、Ｋｒｅｕｇｅｒ、Ｊ、Ｈ，およびＷａｌｋｅｒ、Ｇ、Ｃ，：　ｆ大腸菌のｇｒｏＥＬおよびｄｒ＋ａＫ遺伝子およびｈ　ｔ　ｐＲ＋におけるＵＶ照射およびナリジキシン酸による誘導−依存型（ｇｒｏＥＬ　ａｎｄ　ｄｎａＫ　Ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｔ　ａｎｄＩｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＵＶ　Ｉｒｒａｄｉａｔｌｏｎ　ａｎｄ　Ｎａ１ｉｄ１ｘｉｃ　Ａｃ１ｄ　１ｎ　ａｈｔｐＲ＋−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｆａｓｈｌｏｎ）Ｊ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８１、１４９９−１５０３、１９８４１５、　０’Ｐａｒｒｅｌｌ、Ｐ、Ｈ：　ｒタンパク質の高速二次元電気泳動（）１１ｇｈ　Ｒｅ５ｏｌｕｔｊｏｒ＋　Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａ！Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　。

２５０、４００７−４０２１．　１９７５１６、Ｆｅｅｎｅｙ　、Ｒ，Ｅ　およびＢｕｒｅｈａｓ、　Ｔ、Ｓ、：　ｒ寒帯魚血液からの抗凍結糖タンパク質（＾ｎｔｌｆｒｅｅｚｅＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｏ１ａｒ　Ｆｉｓｈ　Ｂｌｏｏｄ）Ｊ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｗ、　、１５、５９−７８、１９８６１７、Ｉｎｏｋｕｃｈｌ、　Ｋ１、　Ｆｕｒｕｋａｖａ　＋　Ｈ，、Ｎａｋａｍｕｒａ　ｓＫ、およびＭｉｚｕｓｈｉｉａ　、Ｓ、：　ｒ　ｏ　ｍ　ｐ　ｆのプロモーター領域のインビトロ欠失突然変異誘導性による特徴付け、積極的に調節される大腸菌遺伝子（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙＤｅｌｅｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｌｓ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ｏｒ　ｔｈｅ　ＰｒｏｍｏｔｅｒＲｅｇｉｏｎ　ｏｒ　ｏ＊ｐｆ、　ａ　Ｐｏ５ｉｔｉｖｅｌｙ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｇｅｎｅ　ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｔ）　］、Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｂ４ｏ、、　１７８、６５３−［Ｋ６８、ＩＬ　ＤｅＶｒｌｅｓ＋　Ａ、Ｌ、：　ｆ冷水魚における抗凍結ペプチドおよびグリコペプチド（＾ｎｔｉｆ’ｒｅｅｚｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄＧｌｙｃｏｐｅｐｔｌｄｅｓ　１ｎ　Ｃｏ１ｄ−Ｗａｔｅｒ　Ｆｉｓｈｅｓ）　Ｊ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　４５、２４５−６０、１９８３１９、Ｉｎｏｕｙｅ、Ｓ、および１ｎｏｕｙｅ　、Ｎ、：　ｒ二本鎖プラスミドＤＮＡを用いるオリゴヌクレオチド指定部位特異性突然変異誘導（０１１，ｇｏｎｕｅｌｅｏｔｌｄｅ−Ｄｌｒｅｃｔｅｄ　５ｉｔｅ−８ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｄｏｕｂｌｅ−８ｔｒａｎｄｅｄＰｌａｓｌｉｄ　ＤＮＡ　）　Ｊ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ＡｐｐＨｅａｔｆｏｎｓ　ｏｒ　ＤＮＡａｎｄ　ＲＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　、Ｓ、＾、　Ｎａｒａ、ｎｇ　編（ＡｃａｄｅｓｌｃＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　０ｒｌａｎｄｏ）、ｐＬ　１８１．−２０６、１９８７２０、Ｉｎｏｕｙｅ　、Ｓ、およびＩｎｏｕｙｅ　＊　Ｍ、：　ｒ大腸菌のｌｐｐ遺伝子におけるアッププロモーター突然変異（Ｌｌｐｐｒｏｓｏｔｅｒ　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｐｐｇｅｎｅｏｆＥｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　。

Ｖｏｌ、１３、　Ｎ０５９、　ｐｐ、３１０３−３１１０、１９８５２１、Ｍａｓｕｉ、Ｙｌ、Ｃｏ１ｅＩｌａｎ、Ｊ、およびＩｎｏｕｙｅ　＊Ｘ、：「遺伝子発現の実験的操作（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｕｐｕｌａｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｊ、　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｐｒｅｓｓ＋Ｉｎｏｕｙｅ編、　１９８３２２、Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ、：　１分子クローニングの実用ガイド（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕ！ｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ）　Ｊ、　ＪｏｈｎＷｌｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ＋　Ｗｌｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＊ＮＹ、１９８ｇ２３、＾ｕｓｕｂｅｌ、　Ｆ、Ｍ、ら編二［分子生物学の最近のプロトコール（最近のプロトコール）　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ））Ｊ、Ｂｒｏｏｍｌｙｎ、ＮＹおよびＶｉｌｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＊　ＮＹ　（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ　１− ５）、２４、Ｂｒｏｅｚｅ、ＲＪ、、Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｃ，Ｊ、およびＰｏｐｅ　。

Ｄ、Ｈ，：　ｒ大腸菌およびブセウドモナス・フルオレッセンスにおけるインビボおよびインビトロタンパク質合成への低温の影響（ＥｆＴｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｌｏｗ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ＩｎＶｉｖｏ　ａｎｄ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｉｌ　ａｎｄ　Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　Ｊ、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　１３４、８６１−８７４、１９８７２５、Ｙａｎｇら：［抗凍結ポリペプチドの結晶構造およびその機械論的意味（Ｃｒｙｓｔａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎＡｎｔｉｆｒｅｅｚｅ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｊｄｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ＭｅｃｈａｎｉｓｔｉｃＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　Ｊ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３３３　、　ｐｐ、２３２−２３７、２６、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｃｈ　、Ｅ、Ｆ、および５ａｉｂｒｏｏｋ、Ｊ、：　Ｉ分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）　Ｊ　、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｌＣｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　−ＮＹ　。

ｐｐ、　３８３−３８９、１９８２国際調査磐失国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．大腸菌の正常の増殖温度以下の温度でのみ、大腸菌において合成が誘導され得る、タンパク質。
２．大腸菌の正常の増殖温度および正常の増殖温度以下でも安定性を示す、請求項１に記載のタンパク賞。
３．細胞質タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
４．約７．４ｋｄａｌの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質。
５．大腸菌生存細胞への低温による悪影響を低減することができる、請求項１に記載のタンパク質。
６．次のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のタンパク質。【配列があります】
７．アミノ酸配列に開始Ｍｅｔ残基を含まない、請求項６に記載のタンパク質。
８．高度に親水性である、請求項６に記載のタンパク質。
９．α−ヘリックス構造の証拠となる二次構造を有する、請求項６に記載のタンパク質。
１０．大腸菌の正常な増殖濃度以下の温度で遺伝子の転写を開始することができる、プロモーター配列。
１１．大腸菌生存細胞への低温の悪影響を軽減することができるタンパク質をコードする遺伝子の転写を開始することができる、請求項１０に記載のプロモーター。
１２．大腸菌生存細胞への低温の悪影響を軽減することができるタンパク質をコードする遺伝子の転写を、大腸菌の正常な増殖温度以下の温度で開始することができる、請求項１１に記載のプロモーター。
１３．低温で転写が開始される遺伝子の転写が同種の遺伝子である、請求項１２に記載のプロモーター。
１４．遺伝子がｃｓ７．４である、請求項１３に記載のプロモーター。
１５．同種の遺伝子の代わりに、異種の遺伝子の転写を大腸菌の正常な増殖温度で開始することができる、請求項１１に記載のプロモーター。
１６．遺伝子の上流で、第７図に示されるヌクレオチド１と６０５との間に位置している、請求項１２に記載のプロモーター。
１７．第７図に示される、ＤＮＡ断片。
１８．第７図に示されるヌクレオチド１から９９７までのＤＮＡ断片。
１９．第７図に示されるＤＮＡ断片において、大腸菌生存細胞への低温の悪影響を軽減することができるタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の転写を低温で開始することができるプロモーターおよび他の遺伝的調節要素を含む、ヌクレオチド配列。
２０．増殖している大腸菌細胞への低温の悪影響を軽減するタンパク質をコードする、ＤＮＡ配列。
２１．次のヌクレオチド配列を有する、請求項２０に記載のＤＮＡ配列。【配列があります】
２２．タンパク質をコードすることができて、その転写が大腸菌において低温誘導性であるプロモーターによって調節される、遺伝子。
２３．請求項１に記載のタンパク質をコードする、請求項２２に記載の遺伝子。
２４．請求項４に記載のタンパク質をコードする、請求項２２に記載の遺伝子。
２５．請求項５に記載のタンパク質をコードする、請求項２２に記載の遺伝子。
２６．請求項６に記載のタンパク質をコードする、請求項２２に記載の遺伝子。
２７．ｃｓ７．４と呼称される、請求項２２に記載の遺伝子。
２８．その転写が低温誘導性プロモーター以外のプロモーターによっても調節される、請求項２２に記載の遺伝子。
２９．低温誘導性プロモーター以外のプロモーターがｌａｃプロモーターである、請求項２８に記載の遺伝子。
３０．大腸菌の正常の増殖温度においてタンパク質をコードする、請求項２９に記載の遺伝子。
３１．請求項１に記載のタンパク質を発現することができる、組換えプラスミド。
３２．第７図に示される遺伝子を含む、請求項３１に記載のプラスミド。
３３．遺伝子の転写を開始することができるプロモーター領域配列をも含む、請求項３２に記載のプラスミド。
３４．転写調節タンパク質を結合することができるプロモーター領域の上流のＤＮＡ配列をさらに含んでなる、請求項３３に記載のプラスミド。
３５．調節タンパク質結合部位をさらに含んでなる、請求項３４に記載のプラスミド。
３６．染色体外要素から請求項１に記載のタンパク質を発現することができる、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細胞。
３７．細胞が大腸菌である、請求項３６に記載の細胞。
３８．大腸菌の正常の増殖温度以下の温度でのみ誘導されることができ、増殖している大腸菌への低温による悪影響を軽減することができるタンパク質の製造法および、該タンパク質をコードする遺伝子の転写を開始することができるプロモーター配列の製造法であって、大腸菌を指数速度で所望の増殖レベルまでに生理的温度で増殖させること、温度をほぼ１５℃以下に低下させることおよび該大腸菌の増殖をその温度で継続させることからなり、これによって、該タンパク質の合成を行わせること、培養の増殖を中断すること、そして、該タンパク質をコードする遺伝子および該遺伝子の転写を開始したプロモーター配列を少なくとも含む所望のＤＮＡ断片をこれから単離すること、からなる、製造法。
３９．遺伝子がｃｓ７．４であり、タンパク質がｃｓｐ７．４である、請求項３８に記載の製造法。