CN110467655B - 一种蛋白质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质，该蛋白质具有核苷酸片段的结合活性，或者，该蛋白质为脱氧核糖核酸和核糖核酸片段结合蛋白。该蛋白质的表达可以改善细胞耐高温抗性，并且在提升工业微生物发酵生产目标化合物的过程中非常有应用前景。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种蛋白质及其在提升微生物耐热抗性和提高工业微生物产量等方面的应用。
背景技术
微生物必须在各种压力条件下存活。温度的升高会破坏细胞原有的内稳态，干扰正常的生理功能，并改变细胞结构。从嗜热菌中发现并表征的几种耐高温机制已被成功地作为促进嗜中温微生物(如大肠杆菌和酿酒酵母)在高温下生长的新策略(DOI：10.1016/j.biortech.2014.07.063)，但该领域的进展一直比较缓慢。提高微生物对高温的耐受性提供了潜在的应用价值，如降低开放式发酵的污染风险，从而大大降低了发酵生产的成本(DOI：10.1371/journal.pone.0004359)。此外，在某些情况下，发酵温度升高会促使物质交换加快，导致微生物生长加快，并增加总生物量，这使得提高微生物对高温生长的耐受性成为一个具有挑战和研究潜力的领域。
凝结芽孢杆菌来源的CspL隶属于冷激蛋白家族，Su等人的研究发现CspL与细胞耐热密切相关(DOI：10.1038/srep03926)。目前已知的CspL同源蛋白——大肠杆菌中的CspA是研究最为透彻的冷激蛋白之一。它是大肠杆菌在低温生长期间最主要的RNA分子伴侣，能够促进细胞低温存活，协助靶基因的转录和翻译(DOI：10.1074/jbc.272.1.196)。但是，冷激蛋白在细胞响应热激条件促进细胞生长的研究尚处空白。
因此，本领域的研究人员致力于开发一种提升微生物耐热抗性的蛋白质，应用于生物催化和代谢工程改造等领域。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提升微生物耐热抗性及改善工业微生物发酵生产特性。
为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种蛋白质。
在本发明的一个具体实施方式中，该蛋白质具有结合RNA和DNA片段的活性，或者，该蛋白质为DNA/RNA结合蛋白(DNA/RNA binding protein)：
进一步地，将天然蛋白质中的氨基酸序列密码子通过改良替换成大肠杆菌通用密码子。
进一步地，上述蛋白质还具有以下一种或多种特征：
1)蛋白质的氨基酸序列包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有60％以上、或90％以上、或95％以上、或99％以上同源性的氨基酸序列；或者蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或者蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
2)蛋白质由在高严谨条件与编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的蛋白质的核酸的互补链杂交的核酸编码；
3)天然蛋白质存在于微生物中。
进一步地，该蛋白质存在于芽孢菌属(Bacillus)的微生物中。
进一步地，该蛋白质存在于凝结芽孢杆菌2-6(Bacillus coagulans 2-6)中。
进一步地，该蛋白质具有用于结合核苷酸序列的功能，至少能结合脱氧核糖核苷酸序列或者核糖核苷酸序列；将蛋白质的第4位、第7位氨基酸密码子中的至少一个通过改良替换为大肠杆菌的通用密码子。
进一步地，该蛋白质的核苷酸结合位点至少包括11个氨基酸，所述的11个氨基酸选自甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、组氨酸。
进一步地，该蛋白质的三维结构至少包含位于核苷酸序列结合位点处的3个β折叠，所述的11个氨基酸位于所述的β折叠，按相对位置算，14位的甘氨酸、15位的酪氨酸、16位的甘氨酸、17位的苯丙氨酸、18位的异亮氨酸、19位的谷氨酸、20位的精氨酸、26位的缬氨酸、27位的苯丙氨酸、28位的缬氨酸和29位的组氨酸。
本发明的另一方面提供编码上述蛋白质的核苷酸序列。
进一步地，上述核苷酸序列具有以下一种或多种特征：
1)核苷酸序列包括与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有85％以上、或90％以上、或95％以上、或98％以上、或99％以上的同源性的核苷酸序列；或者核苷酸序列包括SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列；或者序列如SEQ ID NO:2所示；
2)核苷酸序列在高严谨条件能与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补链杂交。
进一步地，上述核苷酸引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示
本发明的又一方面提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体或宿主细胞。
本发明的再一方面提供上述的蛋白质在提升微生物耐热抗性中的应用。
本发明的再一方面提供上述的蛋白质在发酵生产中的应用。
本发明通过蛋白质工程的方法，利用大肠杆菌细胞表达蛋白质，通过酶动力学分析蛋白质与核苷酸片段的结合特性，通过生长曲线与生物量的测定和分批补料发酵验证蛋白质对细胞耐热抗性和工业发酵产量的影响。本发明的有益效果为：本发明开发了一种可以提升大肠杆菌、恶臭假单胞菌、酿酒酵母菌温度耐受的技术。在本发明的具体实施例中，经过遗传工程技术，提高了束丝放线菌生产高值抗肿瘤药物AP-3、地衣芽孢杆菌生产D-乳酸的产量。这种蛋白质独特的催化性质具有重要的研究意义和工业应用价值。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明实施例1的蛋白质CspL表达纯化图；
图2是本发明实施例2的蛋白质CspL结合RNA动力学曲线；
图3是本发明实施例3的蛋白质CspL结合单链DNA动力学曲线。
图4是本发明实施例4的蛋白质CspL表达大肠杆菌细胞形态的变化。
图5是本发明实施例5的蛋白质CspL表达大肠杆菌45℃生长曲线。
图6是本发明实施例6的蛋白质CspL提升恶臭假单胞菌耐热性的生长曲线。
图7是本发明实施例7的蛋白质CspL提升酿酒酵母菌耐热性的生长曲线。
图8是本发明实施例8的蛋白质CspL表达大肠杆菌45℃条件下的细胞干重。
图9是本发明实施例9的蛋白质CspL表达恶臭假单胞菌的细胞干重。
图10是本发明实施例10的蛋白质CspL表达酿酒酵母菌的细胞干重。
图11是本发明实施例11的蛋白质CspL提高安丝菌素P-3产量的柱状图。
图12是本发明实施例12的蛋白质CspL提高D-乳酸产量和葡萄糖底物消耗量的折线图。A：D-乳酸产量；B：葡萄糖底物消耗。
图13是本发明实施例13的蛋白质CspL进化树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：蛋白质CspL的克隆、表达及纯化
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
1)CspL的克隆：CspL蛋白的全场基因序列由许平课题组前期测序获得，如SEQ IDNO:2所示。利用PCR方法，以引物CspL-F和CspL-R从凝结芽孢杆菌2-6(DSM 21869)菌液中扩增出CspL全长序列，经EcoRI和NcoI酶切后连接到pET28a载体中，载体羧基端有6个组氨酸标签。其中引物序列为：
CspL-F:5’-CGCGGATCCATGGAACATGGTACAGTAAA-3’；
CspL-R:5’-CCGGAATTCTTAGTCTTCTTTTTGAACAT-3’；
如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
2)CspL的表达：重组质粒pET28a-CspL经测序验证正确后，转化至大肠杆菌表达宿主细胞BL21(DE3)中，挑取单菌落进行表达检测，将确定有蛋白表达的菌落于37℃，200r.p.m.放大培养，OD600为0.6-0.8时，用终浓度0.2mM异丙基硫代半乳糖苷在16℃诱导20小时。
3)CspL的纯化：诱导完成的菌液离心后收集菌体并重悬，经1,500bar压力破碎后高速离心，用Ni-NTA重力纯化柱(Qiagen公司，货号30430)收集上清液中的蛋白。用20mM和50mM咪唑洗脱非特异性结合的杂蛋白，随后用120mM、150mM和170mM咪唑洗脱目的蛋白；用5kDa超滤管(MD公司)以4,800r.p.m.的转速离心，从而将目的蛋白浓缩至6mg/mL，最后，进行聚丙酰胺凝胶电泳验证纯化的蛋白，如图1所示，其纯度可达到90％以上，-80℃保存。
实施例2：CspL结合RNA的动力学分析
设计长度不同的氨基端带有生物素标记的RNA片段(表1)，将带有生物标记的片段与硫酸链霉素探针结合，再利用Fortebio Octet RED96大分子相互作用仪测定CspL与RNA片段的结合信号，结果如图2所示，CspL可以结合长度大于4nt的RNA片段。
实施例3：CspL结合DNA的动力学分析
设计长度不同的氨基端带有生物素标记的单链DNA(ssDNA)片段(表2)，将带有生物标记的片段与硫酸链霉素探针结合，再利用Fortebio Octet RED96大分子相互作用仪测定CspL与ssDNA片段的结合信号，结果如图3所示，CspL可以结合长度大于4nt的ssDNA片段。
实施例4：CspL改变大肠杆菌形态
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
1)在实施例1所得的CspL基因序列连接到pUC19载体，转入大肠杆菌DH5α中。
2)利用DELONG LVEM25小型透射电镜观察大肠杆菌DH5α-cspL和大肠杆菌DH5α含有空载pUC19质粒菌株的细胞形态，结果如图4所示，表达CspL蛋白的大肠杆菌相比对照菌的长度缩短了50％。
实施例5：CspL提高大肠杆菌耐热性
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
1)在实施例1所得的CspL基因序列连接到pUC19载体，转入大肠杆菌DH5α中。
2)利用Bioscreen C全自动生长曲线测定仪测定45℃条件下大肠杆菌DH5α-cspL和大肠杆菌DH5α含有空载pUC19质粒菌株的生长曲线，结果如图5所示，表达CspL蛋白的大肠杆菌有着更好的耐热性。
实施例6：CspL提升恶臭假单胞菌的耐热性
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
1)在实施例1所得的CspL基因序列连接到pME6032载体；然后，转入恶臭假单胞菌KT2440中。
2)以液体培养的方式，设置温度梯度从30℃—38℃每2℃为一个梯度，用250mL规格的三角烧瓶装液50mL的方式置于200rpm摇床培养，每2小时取样，测定OD600，记录数据，结果如图6所示，相比空载质粒的对照组，表达CspL的恶臭假单胞菌的耐热性明显提升。
实施例7：CspL提升酿酒酵母菌的耐热性
本实施例中所用的培养基的组成如下：
酵母菌培养基：10g酵母粉，20g蛋白胨，20g无水葡萄糖，定容至1000mL蒸馏水中，115℃灭菌15min。
1)在实施例1所得的CspL基因序列连接到pYES2载体；然后，转入酿酒酵母INVSc1中。
2)以液体培养的方式，设置温度梯度从30℃—38℃每2℃为一个梯度，用250mL规格的三角烧瓶装液50mL的方式置于200rpm摇床培养，每2小时取样，测定OD600，记录数据，结果如图7所示，相比空载质粒的对照组，表达CspL的酿酒酵母菌的耐热性明显提升。
实施例8：CspL促进大肠杆菌生物量的积累
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
1)将实施例4所得的大肠杆菌DH5α-cspL和大肠杆菌DH5α含有空载pUC19质粒菌株的培养物离心收集；静置于50℃干燥箱中，48小时后每隔两小时测量培养物重量变化，直至重量不再改变，记录结果。结果如图8所示，表达CspL蛋白的大肠杆菌的细胞干重可达2.3g/L。
实施例9：CspL促进恶臭假单胞菌生物量的积累
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
1)在实施例1所得的CspL基因序列分别连接到pME6032和pYES2载体；然后，分别转入恶臭假单胞菌KT2440和酿酒酵母INVSc1中。
2)以液体培养的方式，设置温度梯度从30℃—38℃每2℃为一个梯度，用250mL规格的三角烧瓶装液50mL的方式置于200rpm摇床培养，稳定期离心收集细胞；静置于50℃干燥箱中，48小时后每隔两小时测量培养物重量变化，直至重量不再改变，记录结果。记录数据，结果如图9所示，相比空载质粒的对照组，表达CspL的恶臭假单胞菌生物量的积累显著提升。
实施例10：CspL促进酿酒酵母菌生物量的积累
本实施例中所用的培养基的组成如下：
酵母菌培养基：10g酵母粉，20g蛋白胨，20g无水葡萄糖，定容至1000mL蒸馏水中，115℃灭菌15min。
1)在实施例1所得的CspL基因序列分别连接到pME6032和pYES2载体；然后，分别转入恶臭假单胞菌KT2440和酿酒酵母INVSc1中。
2)以液体培养的方式，设置温度梯度从30℃—38℃每2℃为一个梯度，用250mL规格的三角烧瓶装液50mL的方式置于200rpm摇床培养，稳定期离心收集细胞；静置于50℃干燥箱中，48小时后每隔两小时测量培养物重量变化，直至重量不再改变，记录结果。记录数据，结果如图10所示，相比空载质粒的对照组，表达CspL的恶臭假单胞菌和酿酒酵母菌均有显著的生长优势。
实施例11：CspL提高微生物次级代谢物产量
以束丝放线菌生产安丝菌素P-3为例，本实施例中所用的培养基的组成如下：
YMG琼脂培养基(g/L)：4g酵母粉，10g麦芽提取物，4g葡萄糖，20g琼脂粉，pH 7.2-7.3，定容至1L，115℃灭菌20min。
第一种子培养基(g/L)：30g胰蛋白胨大豆粉末，5g酵母粉，5g蔗糖，pH 7.5，定容至1L，115℃灭菌20min。
第二种子培养基(g/L)：30g胰蛋白胨大豆粉末，5g酵母粉，25g蔗糖，10g可溶性淀粉，5mL异丁醇，5mL异丙醇，pH7.5，定容至1L，115℃灭菌20min。
放线菌发酵培养基(g/L)：8g酵母粉，10g麦芽提取物，15g蔗糖，25g可溶性淀粉，50mL异丁醇，120mL异丙醇，pH7.5，115℃灭菌20min。
1)大肠杆菌DH10B和大肠杆菌ET12567/pUZ8002分别用于质粒构建和接合转移。全基因合成5’-端和3’-端分别是BamHI和SpeI酶切位点的cspL基因序列。基因合成委托上海桑尼生物技术有限公司。将序列插入到整合了pDR3启动子kasOp*的质粒pLQ856中，构建重组质粒pLQ856-cspL。热激转化的方法将重组质粒pLQ856-cspL转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞，随后，通过接合转移的方法将重组质粒从大肠杆菌导入束丝放线菌ATCC31280。另外，将质粒pLQ856导入束丝放线菌ATCC31280，产生对照菌株ATCC31280::pLQ856。
2)束丝放线菌ATCC31280-cspL和对照菌株在YMG琼脂培养基上培养。将生长状态良好的菌丝体接种到第一种子培养基，30℃，220rpm下培养24小时。随后，取1mL第一种子培养液接种到第二种子培养基，30℃，220rpm下培养24小时。用第二种子培养液接种到发酵培养基，25℃，220rpm培养7天。同样的发酵条件，多批次重复发酵。
3)用2体积的乙酸乙酯萃取发酵液的上清液。随后旋转蒸发得到固体残留物；将残余物溶解在甲醇中，经0.22μm微孔滤膜过滤，制备HPLC样品。利用Agilent 1260高效液相色谱仪和Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，将样品以0.5mL/min的流速进行分析，梯度设置如下：0-5min 10％-50％B，5-10min 50％-60％B，10-20min 60％-75％B，20-30分钟75％-95％B，30-38分钟95％B，38-39分钟95％-10％B，39-48分钟10％B(溶剂A：水，溶剂B：甲醇)，检测波长为236nm和254nm。定量结果显示表达CspL的重组菌中AP-3的产量是对照组的约2.3倍以上(图11)。
实施例12：CspL提高有机酸的产量
以地衣芽孢杆菌生产D-乳酸为例，本实施例中所用的培养基的组成如下：
D-乳酸发酵培养基(g/L)：100g葡萄糖，40g花生粕，定容至1L，115℃灭菌20min。
1)全基因合成经过密码子优化的cspL基因和诱导型启动子Pgrac 100片段，将两个片段插入穿梭质粒pEB03，构建出重组质粒pEB03-Pgrac100cspL。基因合成委托上海桑尼生物技术有限公司。将重组质粒和空载pEB03质粒转入大肠杆菌S17-1细胞，随后通过接合转移将质粒转入地衣芽孢杆菌BN11中，构建出用于发酵D-乳酸的重组地衣芽孢杆菌BN11-cspL。用装有2.7L的小型全自动发酵系统(5L规格)进行D-乳酸发酵，发酵初始加入0.3g/L中性蛋白酶，发酵温度50℃，初始接种量为10％(v/v)。通过自动添加Ca(OH)2将培养体系的pH控制在7.0；通过添加葡萄糖粉末将体系的葡萄糖浓度维持在20g/L至120g/L之间。发酵10h后，加入诱导剂IPTG，终浓度为0.1mM。发酵过程的葡萄糖浓度经SBA-40D生物传感器测定。
2)发酵结束后取样，将样品加热至沸腾，保持10min，然后加入等体积的2MH2SO4酸化处理10min。酸化后的样品稀释50倍，10,000xg离心10min。取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，制备成HPLC样品。
3)利用Agilent 1260高效液相色谱仪和Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱进行分析，柱温设定50℃，DAD检测器设定为210nm，流动相为5mM H2SO4，流速设定为0.5mL/min。定量结果显示表达CspL蛋白的地衣芽孢杆菌乳酸产量提高了1.4倍，葡萄糖底物消耗量提高了1.33倍(图12)。
实施例13：CspL进化树
将CspL氨基酸序列与NCBI数据库比对，根据最大相似性法构建进化树，结果如图13所示。CspL的同源蛋白质广泛存在于不同种类的微生物中。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种蛋白质及其应用
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu His Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Arg Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Tyr Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Lys Val Ser
35 40 45
Phe Asp Val Glu Glu Gly Ser Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Gln
50 55 60
Lys Glu Asp
65
<210> 2
<211> 204
<212> DNA
<213> Bacillus coagulans
<400> 2
gtggaacatg gtacagtaaa atggtttaac agtgaaaaag gctacggttt tattgaacgg 60
gaaggcggag acgacgtgtt tgtccatttc tcggccatcc agggtgaagg ctataaaacg 120
cttgaagaag gccagaaagt atcatttgat gtggaagaag gatcacgcgg cccgcaggcg 180
gcaaatgttc aaaaagaaga ctaa 204
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcca tggaacatgg tacagtaaa 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggaattct tagtcttctt tttgaacat 29
Claims (1)
1.一种蛋白质在提升微生物耐热抗性中和发酵生产中的应用，其特征在于，该应用是使用所述蛋白质在发酵生产中提升微生物耐热抗性的方法，该方法包括：1)以引物CspL-F和CspL-R从凝结芽孢杆菌2-6菌液中扩增出基因CspL全长序列如SEQ ID NO:2所示，其中：CspL-F:5-CGCGGATCCATGGAACATGGTACAGTAAA-3’； CspL-R:5’-CCGGAATTCTTAGTCTTCTTTTTGAACAT-3’； 经EcoRI和NcoI酶切后连接到相应的质粒载体中；2)将所述质粒载体转入相应的发酵生产微生物中；其中，所述质粒载体表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示，所述微生物是大肠杆菌DH5α、恶臭假单胞菌KT2440和酿酒酵母菌INVSc1中的一种或者几种。
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