JPH04341179A - 抗菌性ポリペプチドの製造法 - Google Patents
抗菌性ポリペプチドの製造法Info
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- JPH04341179A JPH04341179A JP14106891A JP14106891A JPH04341179A JP H04341179 A JPH04341179 A JP H04341179A JP 14106891 A JP14106891 A JP 14106891A JP 14106891 A JP14106891 A JP 14106891A JP H04341179 A JPH04341179 A JP H04341179A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、双翅目または膜翅目に
属する昆虫の幼虫の体表障害時にその幼虫の体液中に誘
導される抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子を組み
込んだ形質転換体、及び該形質転換体を培養することに
よる該抗菌性ポリペプチドの製造方法に関する。
属する昆虫の幼虫の体表障害時にその幼虫の体液中に誘
導される抗菌性ポリペプチドをコードする遺伝子を組み
込んだ形質転換体、及び該形質転換体を培養することに
よる該抗菌性ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００２】更に詳細には、センチニクバエの幼虫の体
表に傷を与えることにより体液中に誘導される抗菌性を
有するポリペプチド、即ちザルコトキシン（Ｓａｒｃｏ
ｔｏｘｉｎ）Ｉをコードする遺伝子を宿主微生物である
酵母に組み込んで形質転換し、該酵母を培養することに
よってザルコトキシンＩを製造する方法に関する。
表に傷を与えることにより体液中に誘導される抗菌性を
有するポリペプチド、即ちザルコトキシン（Ｓａｒｃｏ
ｔｏｘｉｎ）Ｉをコードする遺伝子を宿主微生物である
酵母に組み込んで形質転換し、該酵母を培養することに
よってザルコトキシンＩを製造する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】細菌や異種の血球を、昆虫に接種したり
単に体表に傷をつけるといった刺激を与えると体液中に
数々の蛋白が誘導されることが知られている。これらの
物質は、抗体産生能を持たない動物の生体防御にとって
重要な係わりがあるものと考えられる。
単に体表に傷をつけるといった刺激を与えると体液中に
数々の蛋白が誘導されることが知られている。これらの
物質は、抗体産生能を持たない動物の生体防御にとって
重要な係わりがあるものと考えられる。
【０００４】これらのうちで、例えばセンチニクバエ（
Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）幼虫体
液中に誘導される活性蛋白として、血球凝集作用をもつ
蛋白〔Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５巻、
２９１９−２９２４頁（１９８０）〕、抗菌活性を持つ
蛋白〔Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２１１巻、７２７−
７３４頁（１９８３）〕などが同定されている。
Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）幼虫体
液中に誘導される活性蛋白として、血球凝集作用をもつ
蛋白〔Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５巻、
２９１９−２９２４頁（１９８０）〕、抗菌活性を持つ
蛋白〔Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２１１巻、７２７−
７３４頁（１９８３）〕などが同定されている。
【０００５】前者のレクチン様蛋白は、ザルコファルガ
（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）レクチンと命名され、マウス
の骨髄細胞やマクロファージの真菌殺能を増強させる、
ヒトＴ細胞よりのγ−インターフェロンの産生を導く、
生体防御等の作用が研究されている。
（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）レクチンと命名され、マウス
の骨髄細胞やマクロファージの真菌殺能を増強させる、
ヒトＴ細胞よりのγ−インターフェロンの産生を導く、
生体防御等の作用が研究されている。
【０００６】また後者の抗菌活性を持つ蛋白としては、
例えばザルコトキシン（Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ）Ｉと命
名されてその理化学的性質も明らかにされている（特開
昭５９−１３７３０）蛋白、ザルコトキシンＩＩと命名
されてその理化学的性質も明らかにされている（特開昭
６３−３５５９９）蛋白、および同じくセンチニクバエ
の幼虫体液から得られ、ザーペシン（Ｓａｐｅｃｉｎ）
と命名され、単離されてそのアミノ酸配列が決定されて
いる（特開昭６３−１８５９９７）蛋白等が知られてい
る。
例えばザルコトキシン（Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ）Ｉと命
名されてその理化学的性質も明らかにされている（特開
昭５９−１３７３０）蛋白、ザルコトキシンＩＩと命名
されてその理化学的性質も明らかにされている（特開昭
６３−３５５９９）蛋白、および同じくセンチニクバエ
の幼虫体液から得られ、ザーペシン（Ｓａｐｅｃｉｎ）
と命名され、単離されてそのアミノ酸配列が決定されて
いる（特開昭６３−１８５９９７）蛋白等が知られてい
る。
【０００７】これらは幅広い抗菌スペクトルを有するこ
とから、生体防御物質と考えられ、更にこれらの抗菌性
蛋白は特にグラム陰性菌の大腸菌及びグラム陽性菌の黄
色ブドウ状球菌に対して強い抗菌力を有している。しか
しながら、これらの蛋白を大量に、安価に生産する方法
に関しては報告されていない。
とから、生体防御物質と考えられ、更にこれらの抗菌性
蛋白は特にグラム陰性菌の大腸菌及びグラム陽性菌の黄
色ブドウ状球菌に対して強い抗菌力を有している。しか
しながら、これらの蛋白を大量に、安価に生産する方法
に関しては報告されていない。
【０００８】ザルコトキシンＩは４種ポリペプチドの混
合物であることが知られ、各々ザルコトキシンＩＡ（配
列番号：１に示される）、ザルコトキシンＩＢ（配列番
号：２に示される）、ザルコトキシンＩＣ（配列番号：
３に示される）およびザルコトキシンＩＤ（配列番号：
４に示される）と命名されている。本明細書においては
これらを総称してザルコトキシンＩと称する。ザルコト
キシンＩＡに関してはその前駆体のクローン化ＤＮＡ、
その断片及びそれらが組み込まれたプラスミドが報告さ
れている（特開平１−５１０８４、特開平１−５１０８
５）が、その蛋白をコードする遺伝子を宿主微生物に組
み込んだ組換体を得、該組換体を培養することによる該
蛋白の製造方法に関しては報告されていない。ザルコト
キシンＩＢ、ザルコトキシンＩＣおよびザルコトキシン
ＩＤについても、組換体による該蛋白の製造に関しての
報告はなされていない。
合物であることが知られ、各々ザルコトキシンＩＡ（配
列番号：１に示される）、ザルコトキシンＩＢ（配列番
号：２に示される）、ザルコトキシンＩＣ（配列番号：
３に示される）およびザルコトキシンＩＤ（配列番号：
４に示される）と命名されている。本明細書においては
これらを総称してザルコトキシンＩと称する。ザルコト
キシンＩＡに関してはその前駆体のクローン化ＤＮＡ、
その断片及びそれらが組み込まれたプラスミドが報告さ
れている（特開平１−５１０８４、特開平１−５１０８
５）が、その蛋白をコードする遺伝子を宿主微生物に組
み込んだ組換体を得、該組換体を培養することによる該
蛋白の製造方法に関しては報告されていない。ザルコト
キシンＩＢ、ザルコトキシンＩＣおよびザルコトキシン
ＩＤについても、組換体による該蛋白の製造に関しての
報告はなされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は抗菌性蛋白、
とりわけザルコトキシンＩをコードするＤＮＡを組み込
んだ酵母を宿主として発現可能なプラスミド及び該プラ
スミドを酵母に組み込んだ組換体、さらには該組換体を
培養することによるザルコトキシンＩの生産方法を提供
するものである。
とりわけザルコトキシンＩをコードするＤＮＡを組み込
んだ酵母を宿主として発現可能なプラスミド及び該プラ
スミドを酵母に組み込んだ組換体、さらには該組換体を
培養することによるザルコトキシンＩの生産方法を提供
するものである。
【００１０】ザルコトキシンＩは抗菌作用を有している
ため通常の大腸菌を用いた遺伝子組換えによる方法では
生産することができない。本発明は抗菌性蛋白であるザ
ルコトキシンＩを酵母を組換体の宿主として選択するこ
とにより、該蛋白を大量に生産する方法をはじめて可能
にしたものである。
ため通常の大腸菌を用いた遺伝子組換えによる方法では
生産することができない。本発明は抗菌性蛋白であるザ
ルコトキシンＩを酵母を組換体の宿主として選択するこ
とにより、該蛋白を大量に生産する方法をはじめて可能
にしたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ザルコトキシンＩの遺伝子を構築し、該遺伝子を
組み込んだ形質転換酵母を得、該形質転換体を培養する
ことによってザルコトキシンＩを生産することに成功し
、本発明を完成した。
結果、ザルコトキシンＩの遺伝子を構築し、該遺伝子を
組み込んだ形質転換酵母を得、該形質転換体を培養する
ことによってザルコトキシンＩを生産することに成功し
、本発明を完成した。
【００１２】即ち、本発明により配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：４のいずれかに
示されるアミノ酸配列によって示されるザルコトキシン
Ｉを安価に、大量に生産することができ、得られた蛋白
は抗菌剤として利用できる。以下、本発明をザルコトキ
シンＩＡの場合を例にとり、実施例、試験例を参照しな
がら詳細に説明する。尚、ザルコトキシンＩＢ、ザルコ
トキシンＩＣまたはザルコトキシンＩＤの場合について
もプライマーを適当にデザインすることによって同様に
実施できる。
号：２、配列番号：３または配列番号：４のいずれかに
示されるアミノ酸配列によって示されるザルコトキシン
Ｉを安価に、大量に生産することができ、得られた蛋白
は抗菌剤として利用できる。以下、本発明をザルコトキ
シンＩＡの場合を例にとり、実施例、試験例を参照しな
がら詳細に説明する。尚、ザルコトキシンＩＢ、ザルコ
トキシンＩＣまたはザルコトキシンＩＤの場合について
もプライマーを適当にデザインすることによって同様に
実施できる。
【００１３】
実施例１ ザルコトキシンＩＡ遺伝子の構築■ ザ
ルコトキシンＩＡ遺伝子断片の調製ザルコトキシンＩＡ
の遺伝子はセンチニクバエ脂肪体より〔バイオケミカル
・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．），２３９巻
，７１７〜７２２頁 （１９８６年）〕に従って取得
した。該遺伝子のうち成熟タンパク部分（配列番号：１
に示す）の遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。プライマ
ーとしてはプライマー１（配列番号：５に示す）及びプ
ライマー２（配列番号：６に示す）を用いた。
ルコトキシンＩＡ遺伝子断片の調製ザルコトキシンＩＡ
の遺伝子はセンチニクバエ脂肪体より〔バイオケミカル
・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．），２３９巻
，７１７〜７２２頁 （１９８６年）〕に従って取得
した。該遺伝子のうち成熟タンパク部分（配列番号：１
に示す）の遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。プライマ
ーとしてはプライマー１（配列番号：５に示す）及びプ
ライマー２（配列番号：６に示す）を用いた。
【００１４】プライマー１には酵母のα因子のシグナル
ペプチドの塩基配列の一部（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含
む）が含まれている。又、プライマー２にはストップコ
ドンとＥｃｏＲＩサイトが含まれている。
ペプチドの塩基配列の一部（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含
む）が含まれている。又、プライマー２にはストップコ
ドンとＥｃｏＲＩサイトが含まれている。
【００１５】ＰＣＲ法の反応はＧｅｎｅ ＡｍｐＴＭ
ｋｉｔ〔パーキンエルマージャパン社製〕を用いＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔パーキンエルマ
ージャパン社製〕により行った。反応液の組成は該キッ
トに添付されている説明書に記載されている方法に従っ
た。
ｋｉｔ〔パーキンエルマージャパン社製〕を用いＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ〔パーキンエルマ
ージャパン社製〕により行った。反応液の組成は該キッ
トに添付されている説明書に記載されている方法に従っ
た。
【００１６】反応液の入ったチューブをＤＮＡ Ｔｈ
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットし、以下の条件で
反応を３５サイクル行い増幅した。 ９５℃、１分 ４０℃、２分 ７２℃、３分
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットし、以下の条件で
反応を３５サイクル行い増幅した。 ９５℃、１分 ４０℃、２分 ７２℃、３分
【００１７】その後、さらに７２℃で７分間インキュベ
ートした。反応後に反応液を取り出しこれをクロロホル
ムにて抽出した。次にこれを１．５％アガロースゲルに
て電気泳動し増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した
。その結果、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片が約０．２μｇ
得られた。
ートした。反応後に反応液を取り出しこれをクロロホル
ムにて抽出した。次にこれを１．５％アガロースゲルに
て電気泳動し増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した
。その結果、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片が約０．２μｇ
得られた。
【００１８】この１５０ｂｐのバンドを含むゲルを取り
出して、ＭＥＲＭＡＩＤＫｉｔ（Ｂｉｏ １０１社製
）を用いてキットに添付されている説明書に従ってＤＮ
Ａを抽出し回収した。さらに回収したＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡
績社製）にて消化し、アガロース電気泳動を行ない約１
５０ｂｐのザルコトキシンＩＡ遺伝子断片を回収した。
出して、ＭＥＲＭＡＩＤＫｉｔ（Ｂｉｏ １０１社製
）を用いてキットに添付されている説明書に従ってＤＮ
Ａを抽出し回収した。さらに回収したＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ（東洋紡績社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡
績社製）にて消化し、アガロース電気泳動を行ない約１
５０ｂｐのザルコトキシンＩＡ遺伝子断片を回収した。
【００１９】■ ザーペシン遺伝子への酵母分泌シグ
ナル、転写ターミネーターの付加得られたザルコトキシ
ンＩＡ遺伝子断片を発現させるために、酵母において分
泌発現が可能なように分泌発現に必要なシグナルペプチ
ドの塩基配列と、転写の終結に必要な塩基配列（ターミ
ネーター）をザルコトキシンＩＡ遺伝子断片に結合した
。 その工程を図１および図２に示す。
ナル、転写ターミネーターの付加得られたザルコトキシ
ンＩＡ遺伝子断片を発現させるために、酵母において分
泌発現が可能なように分泌発現に必要なシグナルペプチ
ドの塩基配列と、転写の終結に必要な塩基配列（ターミ
ネーター）をザルコトキシンＩＡ遺伝子断片に結合した
。 その工程を図１および図２に示す。
【００２０】より具体的に説明すると、まず酵母α因子
のシグナルペプチド部分の塩基配列を前述のＰＣＲ法を
用いて増幅し単離した。すなわち、酵母のゲノムＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｔｅｃより購入）を鋳型ＤＮＡとし、プライ
マー３（配列番号：７に示す）及びプライマー４（配列
番号：８に示す）を用いてα因子のシグナルペプチド部
分の塩基配列を増幅した。増幅後、前述したように反応
液をアガロース電気泳動して増幅したＤＮＡ断片を確認
して、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを用いて抽出し
回収した。その結果、約０．５μｇの約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。
のシグナルペプチド部分の塩基配列を前述のＰＣＲ法を
用いて増幅し単離した。すなわち、酵母のゲノムＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｔｅｃより購入）を鋳型ＤＮＡとし、プライ
マー３（配列番号：７に示す）及びプライマー４（配列
番号：８に示す）を用いてα因子のシグナルペプチド部
分の塩基配列を増幅した。増幅後、前述したように反応
液をアガロース電気泳動して増幅したＤＮＡ断片を確認
して、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを用いて抽出し
回収した。その結果、約０．５μｇの約３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。
【００２１】ここで、プライマー３は制限酵素ＸｈｏＩ
のサイトを、プライマー４は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの
サイトをそれぞれ含んでいるので、得られたＤＮＡ断片
をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりα因
子のシグナルペプチドの塩基配列を含んだＤＮＡ断片の
両末端にそれぞれＸｈｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイ
トを導入できる。
のサイトを、プライマー４は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの
サイトをそれぞれ含んでいるので、得られたＤＮＡ断片
をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりα因
子のシグナルペプチドの塩基配列を含んだＤＮＡ断片の
両末端にそれぞれＸｈｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイ
トを導入できる。
【００２２】上記で得られたα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を含んだＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩ（共に東洋紡績社製）で消化してブルースクリプト
ｋｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＸｈｏＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化したラージフラグメントとライゲーシ
ョンした。ライゲーション反応はライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、キットに添付されている説明
書に従って行った。ライゲーション後、反応液で大腸菌
ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換はコ
ンピテントセルＤＨ５（東洋紡績社製）を用いて既知の
方法、例えば〔モレキュラー クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記
載されている方法により行った。
の塩基配列を含んだＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩ（共に東洋紡績社製）で消化してブルースクリプト
ｋｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＸｈｏＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化したラージフラグメントとライゲーシ
ョンした。ライゲーション反応はライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、キットに添付されている説明
書に従って行った。ライゲーション後、反応液で大腸菌
ＤＨ５（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換はコ
ンピテントセルＤＨ５（東洋紡績社製）を用いて既知の
方法、例えば〔モレキュラー クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記
載されている方法により行った。
【００２３】形質転換の結果、得られたアンピシリン耐
性の菌株よりプラスミドＤＮＡを既知の方法、例えば〔
モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記載されている方
法により調製した。このプラスミドをｐＢαと命名した
。
性の菌株よりプラスミドＤＮＡを既知の方法、例えば〔
モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）〕に記載されている方
法により調製した。このプラスミドをｐＢαと命名した
。
【００２４】次にこのプラスミドｐＢαをＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥｃｏＲＩ（共に東洋紡績社製）で切断して得られ
たラージフラグメントと前述のザルコトキシンＩＡ遺伝
子をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したフラグメン
トをライゲーションした。
ＩとＥｃｏＲＩ（共に東洋紡績社製）で切断して得られ
たラージフラグメントと前述のザルコトキシンＩＡ遺伝
子をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したフラグメン
トをライゲーションした。
【００２５】ライゲーション後、前述同様にこれを用い
て大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得られた形質転換体よ
り前述の如くプラスミド（以下、プラスミドｐＢＴαと
いう）を調製し、以下の実験に用いた。
て大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得られた形質転換体よ
り前述の如くプラスミド（以下、プラスミドｐＢＴαと
いう）を調製し、以下の実験に用いた。
【００２６】次にプラスミドｐＢＴαのザルコトキシン
ＩＡ遺伝子の下流に酵母ＰＧＫ遺伝子のターミネーター
配列を組み込んだ。
ＩＡ遺伝子の下流に酵母ＰＧＫ遺伝子のターミネーター
配列を組み込んだ。
【００２７】まず、酵母ゲノムＤＮＡよりＰＧＫ遺伝子
のターミネーター配列を増幅し単離した。即ち、鋳型Ｄ
ＮＡとしては酵母ゲノムＤＮＡを、プライマーとしては
プライマー５（配列番号：９にしめす）及びプライマー
６（配列番号：１０に示す）を用いてＰＣＲ法により増
幅した。反応液をアガロース電気泳動して、増幅したＤ
ＮＡ断片を確認し、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを
用いて抽出し回収した。その結果、約０．５μｇの約３
００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
のターミネーター配列を増幅し単離した。即ち、鋳型Ｄ
ＮＡとしては酵母ゲノムＤＮＡを、プライマーとしては
プライマー５（配列番号：９にしめす）及びプライマー
６（配列番号：１０に示す）を用いてＰＣＲ法により増
幅した。反応液をアガロース電気泳動して、増幅したＤ
ＮＡ断片を確認し、これをＭＥＲＭＡＩＤ Ｋｉｔを
用いて抽出し回収した。その結果、約０．５μｇの約３
００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００２８】プライマー６はＥｃｏＲＩサイトをプライ
マー７はＢａｍＨＩサイトを含んでおり、得られた断片
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）で消化する
ことにより、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列の両端
にそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトを導入
することができる。
マー７はＢａｍＨＩサイトを含んでおり、得られた断片
をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）で消化する
ことにより、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター配列の両端
にそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＢａｍＨＩサイトを導入
することができる。
【００２９】得られたＰＧＫ遺伝子のターミネーター断
片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しこれと先程のプラ
スミドｐＢＴαをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したラ
ージフラグメントを前述同様にライゲーションし、形質
転換を行った。
片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しこれと先程のプラ
スミドｐＢＴαをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したラ
ージフラグメントを前述同様にライゲーションし、形質
転換を行った。
【００３０】得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラ
スミドＤＮＡを調製しこれをプラスミドｐＢＧＴαと命
名し、以下の実験に用いた。
スミドＤＮＡを調製しこれをプラスミドｐＢＧＴαと命
名し、以下の実験に用いた。
【００３１】得られたプラスミドｐＢＧＴαの塩基配列
をシーケネースキット（東洋紡績社製）を用いて調べた
。その結果、ザルコトキシンＩＡの遺伝子の上流にα因
子のシグナルペプチドの塩基配列が、下流にＰＧＫ遺伝
子のターミネーター配列が結合している構造をとってい
ることが塩基配列レベルで確認された。
をシーケネースキット（東洋紡績社製）を用いて調べた
。その結果、ザルコトキシンＩＡの遺伝子の上流にα因
子のシグナルペプチドの塩基配列が、下流にＰＧＫ遺伝
子のターミネーター配列が結合している構造をとってい
ることが塩基配列レベルで確認された。
【００３２】さらに、α因子のシグナルペプチド部分の
塩基配列とザルコトキシンＩＡ遺伝子の上流側のつなぎ
目の塩基配列をより詳細に調べたところ、その塩基配列
はデザイン通りであって、それは配列番号：１１に示す
ようなものであった。
塩基配列とザルコトキシンＩＡ遺伝子の上流側のつなぎ
目の塩基配列をより詳細に調べたところ、その塩基配列
はデザイン通りであって、それは配列番号：１１に示す
ようなものであった。
【００３３】この部分がα因子の開始コドンであるメチ
オニンから順次アミノ酸に翻訳されると、グリシンーバ
リンーセリンーロイシンーアスパラギン酸ーリシンーア
ルギニンーグリシンートリプトファンーロイシンーリシ
ンーリシンーイソロイシンという配列になる。
オニンから順次アミノ酸に翻訳されると、グリシンーバ
リンーセリンーロイシンーアスパラギン酸ーリシンーア
ルギニンーグリシンートリプトファンーロイシンーリシ
ンーリシンーイソロイシンという配列になる。
【００３４】このうち最初のグリシンから７番めのアル
ギニンまではα因子のアミノ酸配列であり、８番めのグ
リシンからはザルコトキシンＩＡ成熟体のＮ末端領域の
アミノ酸を示している。この配列中のリジン−アルギニ
ンの配列はα因子のシグナルペプチドがプロセッシング
を受ける部分であり、この部分でザルコトキシンＩＡ成
熟タンパクが切り出され分泌されるものと予想される。
ギニンまではα因子のアミノ酸配列であり、８番めのグ
リシンからはザルコトキシンＩＡ成熟体のＮ末端領域の
アミノ酸を示している。この配列中のリジン−アルギニ
ンの配列はα因子のシグナルペプチドがプロセッシング
を受ける部分であり、この部分でザルコトキシンＩＡ成
熟タンパクが切り出され分泌されるものと予想される。
【００３５】実施例２ ザルコトキシンＩＡ遺伝子の
クローニング プラスミドｐＢＧＴαをＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し
てアガロース電気泳動し、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を
確認し、この断片をＭＥＲＭＡＩＤ ｋｉｔにより回
収した。この断片は前述したα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を上流に、ＰＧＫターミネーターを下流に持
ったザルコトキシンＩＡ遺伝子を含む。このＤＮＡ断片
を酵母−大腸菌のシャトルベクターであるｐＡＭ８２Ｂ
にクローニングした。
クローニング プラスミドｐＢＧＴαをＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し
てアガロース電気泳動し、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を
確認し、この断片をＭＥＲＭＡＩＤ ｋｉｔにより回
収した。この断片は前述したα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を上流に、ＰＧＫターミネーターを下流に持
ったザルコトキシンＩＡ遺伝子を含む。このＤＮＡ断片
を酵母−大腸菌のシャトルベクターであるｐＡＭ８２Ｂ
にクローニングした。
【００３６】ベクターｐＡＭ８２ＢはｐＡＭ８２のデリ
バティブであり、ｐＡＭ８２のＰｖｕＩＩサイトにＢａ
ｍＨＩリンカーを組み込むことによりＢａｍＨＩサイト
を導入したものである。
バティブであり、ｐＡＭ８２のＰｖｕＩＩサイトにＢａ
ｍＨＩリンカーを組み込むことによりＢａｍＨＩサイト
を導入したものである。
【００３７】ｐＡＭ８２ＢのＸｈｏＩサイトのすぐ上流
には酵母の抑酸性性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５の
プロモーターが配置されており、ＸｈｏＩサイト下流に
適当な構造を持つ遺伝子を組み込むことでその遺伝子の
発現を行うことができる。
には酵母の抑酸性性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５の
プロモーターが配置されており、ＸｈｏＩサイト下流に
適当な構造を持つ遺伝子を組み込むことでその遺伝子の
発現を行うことができる。
【００３８】即ち、ｐＡＭ８２ＢをＸｈｏＩとＢａｍＨ
Ｉで消化したラージフラグメントと、前述の７５０ｂｐ
のＤＮＡ断片とをライゲーションし、これを用いて大腸
菌ＤＨ５を形質転換した。
Ｉで消化したラージフラグメントと、前述の７５０ｂｐ
のＤＮＡ断片とをライゲーションし、これを用いて大腸
菌ＤＨ５を形質転換した。
【００３９】得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラ
スミド（以下、プラスミドｐＡＭ８２Ｂ−ＴＩという）
を約５００μｇ調製し、以下の実験に供した。
スミド（以下、プラスミドｐＡＭ８２Ｂ−ＴＩという）
を約５００μｇ調製し、以下の実験に供した。
【００４０】実施例３ プラスミドｐＡＭ８２Ｂ−Ｔ
Ｉによる酵母ＳＨＹ２の形質転換 前述で得られたプラスミドｐＡＭ８２Ｂ−ＴＩを用いて
酵母ＳＨＹ２（ＡＴＣＣＮｏ．４４７７０）を形質転換
した。形質転換の方法は〔ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕ
ｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）〕に記載されている方法に従って行った。
Ｉによる酵母ＳＨＹ２の形質転換 前述で得られたプラスミドｐＡＭ８２Ｂ−ＴＩを用いて
酵母ＳＨＹ２（ＡＴＣＣＮｏ．４４７７０）を形質転換
した。形質転換の方法は〔ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕ
ｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）〕に記載されている方法に従って行った。
【００４１】酵母ＳＨＹ２の性状は（α，ｓｔｅ−ＶＣ
９，ｕｒａ３−５２，ｔｒｐ１−２８９，ｌｅｕ−３，
ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３−１，ｃａｎ１−１００）
であり、この株はロイシンの存在しない培地では成育で
きない。この株がプラスミドｐＡＭ８２Ｂを保持すれば
、プラスミドｐＡＭ８２Ｂの持つロイシン合成遺伝子の
働きによりロイシンが含まれていない培地でも成育でき
る株、即ちロイシン非要求性の株となる。従って、プラ
スミドｐＡＭ８２Ｂ−ＴＩによる形質転換体の酵母はロ
イシン非要求性となる。
９，ｕｒａ３−５２，ｔｒｐ１−２８９，ｌｅｕ−３，
ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３−１，ｃａｎ１−１００）
であり、この株はロイシンの存在しない培地では成育で
きない。この株がプラスミドｐＡＭ８２Ｂを保持すれば
、プラスミドｐＡＭ８２Ｂの持つロイシン合成遺伝子の
働きによりロイシンが含まれていない培地でも成育でき
る株、即ちロイシン非要求性の株となる。従って、プラ
スミドｐＡＭ８２Ｂ−ＴＩによる形質転換体の酵母はロ
イシン非要求性となる。
【００４２】形質転換を行った結果、７３個の形質転換
体を得た。そのうちサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ
Ｔ２１と名付けた形質転換体（以下、ＹＴ２１という）
〔本株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１２２３８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３８）として
寄託されている。〕を以下の実験に供した。
体を得た。そのうちサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ
Ｔ２１と名付けた形質転換体（以下、ＹＴ２１という）
〔本株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１２２３８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３８）として
寄託されている。〕を以下の実験に供した。
【００４３】実施例４ ＹＴ２１の培養得られたＹＴ
２１の培養は次のようにして行った。ＹＴ２１を高リン
酸Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地１０ｍ
ｌに接種して一晩３０℃で前培養した。尚、Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地の組成は下記に示し
たとおりである。 （ＮＨ４）２ＳＯ４
２
ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４
１．５ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ
０．５ ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２
Ｈ２Ｏ
０．３３ ｇ／ｌ ＫＩ
０．１ ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２５ ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・４Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
（ＮＨ４）３ＰＯ４１２ＭｏＯ３・３Ｈ２Ｏ
０．０２ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ
０．３１ ｍｇ／ｌ イノシトール
１０ ｍｇ／ｌ チア
ミン
０．２ ｍｇ／ｌ
ピリドキシン
０．２ ｍｇ
／ｌ ｐａｎｔｏｔｅｎａｔｅ（Ｃａ ｓａｌ
ｔ） ０．２ ｍｇ／ｌ ナイアシ
ン
０．２ ｍｇ／ｌ
ビオチン
０．００２ｍｇ／ｌ
アスパラギン
２
ｇ／ｌ ヒスチジン
０．
０２ ｍｇ／ｌ トリプトファン
０
．０２５ｍｇ／ｌ ウラシル
０．０２０ｍｇ／ｌ グルコース
２０ ｇ／ｌ
２１の培養は次のようにして行った。ＹＴ２１を高リン
酸Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地１０ｍ
ｌに接種して一晩３０℃で前培養した。尚、Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地の組成は下記に示し
たとおりである。 （ＮＨ４）２ＳＯ４
２
ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４
１．５ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ
０．５ ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２
Ｈ２Ｏ
０．３３ ｇ／ｌ ＫＩ
０．１ ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２５ ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・４Ｈ２Ｏ
０．０４ ｍｇ／ｌ
（ＮＨ４）３ＰＯ４１２ＭｏＯ３・３Ｈ２Ｏ
０．０２ ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ
０．３１ ｍｇ／ｌ イノシトール
１０ ｍｇ／ｌ チア
ミン
０．２ ｍｇ／ｌ
ピリドキシン
０．２ ｍｇ
／ｌ ｐａｎｔｏｔｅｎａｔｅ（Ｃａ ｓａｌ
ｔ） ０．２ ｍｇ／ｌ ナイアシ
ン
０．２ ｍｇ／ｌ
ビオチン
０．００２ｍｇ／ｌ
アスパラギン
２
ｇ／ｌ ヒスチジン
０．
０２ ｍｇ／ｌ トリプトファン
０
．０２５ｍｇ／ｌ ウラシル
０．０２０ｍｇ／ｌ グルコース
２０ ｇ／ｌ
【００４４】前培
養液０．５ｍｌを１００ｍｌの高リン酸Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｍｉｎｉｍａｌ培地に接種して３０℃で振盪培養
しＯＤ６１０を経時的に測定した。
養液０．５ｍｌを１００ｍｌの高リン酸Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｍｉｎｉｍａｌ培地に接種して３０℃で振盪培養
しＯＤ６１０を経時的に測定した。
【００４５】ＯＤ６１０が１．０に達した時点で一旦培
養をやめ遠心分離（８０００×ｇ，１０分）で菌体を回
収した。回収した菌体を今度は１００ｍｌの低リン酸Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地（高リン酸
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地よりＫＨ
２ＰＯ４を除き、代わりにＫＣｌを１．５ｇ／ｌで加え
たもの）に懸濁してさらに振盪培養を２４時間行った。
養をやめ遠心分離（８０００×ｇ，１０分）で菌体を回
収した。回収した菌体を今度は１００ｍｌの低リン酸Ｂ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地（高リン酸
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ培地よりＫＨ
２ＰＯ４を除き、代わりにＫＣｌを１．５ｇ／ｌで加え
たもの）に懸濁してさらに振盪培養を２４時間行った。
【００４６】培養後、菌体を遠心分離（８０００×ｇ，
１０分）により取り除き、培養上清を回収して以下の実
験に供した。またコントロールとしては、プラスミドｐ
ＡＭ８２Ｂで形質転換されたＳＨＹ２（以下、ＹＴ０と
する）を用いて上記と同様に操作して回収された培養上
清を用いた。
１０分）により取り除き、培養上清を回収して以下の実
験に供した。またコントロールとしては、プラスミドｐ
ＡＭ８２Ｂで形質転換されたＳＨＹ２（以下、ＹＴ０と
する）を用いて上記と同様に操作して回収された培養上
清を用いた。
【００４７】実施例５ 培養上清の濃縮前記の培養上
清中に発現したザルコトキシンＩＡが含まれているかを
調べるために、まずＹＴ２１とＹＴ０の培養上清をそれ
ぞれ濃縮した。
清中に発現したザルコトキシンＩＡが含まれているかを
調べるために、まずＹＴ２１とＹＴ０の培養上清をそれ
ぞれ濃縮した。
【００４８】培養上清の濃縮にはＣＭセルロースカラム
（Ｗｈａｔｍａｎ ＣＭ５２使用；ベッドボリューム
５ｍｌ）を用いた。まず培養上清１００ｍｌを緩衝液Ａ
により５倍に希釈した。次にＣＭセルロースカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、この希釈した培養上清
をカラムにアプライした。アプライ後、更にカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、５００ｍｌの緩衝液Ｃ
にてカラムに吸着した成分を溶出し、０．５ｍｌずつフ
ラクションコレクターにより分取した。各フラクション
のＯＤ２８０を測定して、これらをＣＭセルロース吸着
画分として以下の実験に供した。尚、緩衝液Ａ、緩衝液
Ｂ及び緩衝液Ｃの組成は下記に示したとおりである。
（Ｗｈａｔｍａｎ ＣＭ５２使用；ベッドボリューム
５ｍｌ）を用いた。まず培養上清１００ｍｌを緩衝液Ａ
により５倍に希釈した。次にＣＭセルロースカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、この希釈した培養上清
をカラムにアプライした。アプライ後、更にカラムを５
０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、５００ｍｌの緩衝液Ｃ
にてカラムに吸着した成分を溶出し、０．５ｍｌずつフ
ラクションコレクターにより分取した。各フラクション
のＯＤ２８０を測定して、これらをＣＭセルロース吸着
画分として以下の実験に供した。尚、緩衝液Ａ、緩衝液
Ｂ及び緩衝液Ｃの組成は下記に示したとおりである。
【００４９】■ 緩衝液Ａ
ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌ■ 緩衝液Ｂ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ １．４
６ｇ／ｌ■ 緩衝液Ｃ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ ３０．
４ｇ／ｌ
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌ■ 緩衝液Ｂ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ １．４
６ｇ／ｌ■ 緩衝液Ｃ ＮａＨ２ＰＯ４ １．３７ｇ／
ｌＮａ２ＨＰＯ４ ０．４４ｇ
／ｌＮａＣｌ ３０．
４ｇ／ｌ
【００５０】試験例１ ＣＭセルロース吸着
画分の抗菌活性の測定 ＹＴ２１とＹＴ０の培養上清の各ＣＭセルロース吸着画
分の抗菌活性を以下の如く測定した。
画分の抗菌活性の測定 ＹＴ２１とＹＴ０の培養上清の各ＣＭセルロース吸着画
分の抗菌活性を以下の如く測定した。
【００５１】Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ
３（以下、Ｍ３という）プレート培地（Ｄｉｆｃｏ社
製）に成育したエシェエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２ ５９４株をＭ３液体培地
１０ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６５０＝０．３になる
まで振盪培養した。
３（以下、Ｍ３という）プレート培地（Ｄｉｆｃｏ社
製）に成育したエシェエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２ ５９４株をＭ３液体培地
１０ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６５０＝０．３になる
まで振盪培養した。
【００５２】培養後、遠心分離（８０００×ｇ，１０分
）により菌体を回収して緩衝液Ｄ〔１０ｍＭ リン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０），１３０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ〕にＯＤ６５０が正確に０．３になるように懸濁し
た。 この懸濁液０．０１ｍｌに０．１９ｍｌのＭ３液体培地
と各ＣＭセルロース吸着画分０．１ｍｌと０．２％ＢＳ
Ａを含んだ緩衝液Ｄ ０．１ｍｌを試験管中で混ぜ合
わせて、３７℃で３時間振盪培養した。培養後、試験管
を氷中で１時間冷却後、培養液のＯＤ６５０を測定した
。ＣＭ吸着画分の代わりに、緩衝液Ｃを０．１ｍｌ加え
た時の培養液のＯＤ６５０の値をコントロールとして、
下記の式によりエシェエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２５９４株の増殖率を算出
した。増殖率＝（各フラクションにおけるＯＤ６５０／
コントロールのＯＤ６５０）×１００
）により菌体を回収して緩衝液Ｄ〔１０ｍＭ リン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０），１３０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ〕にＯＤ６５０が正確に０．３になるように懸濁し
た。 この懸濁液０．０１ｍｌに０．１９ｍｌのＭ３液体培地
と各ＣＭセルロース吸着画分０．１ｍｌと０．２％ＢＳ
Ａを含んだ緩衝液Ｄ ０．１ｍｌを試験管中で混ぜ合
わせて、３７℃で３時間振盪培養した。培養後、試験管
を氷中で１時間冷却後、培養液のＯＤ６５０を測定した
。ＣＭ吸着画分の代わりに、緩衝液Ｃを０．１ｍｌ加え
た時の培養液のＯＤ６５０の値をコントロールとして、
下記の式によりエシェエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２５９４株の増殖率を算出
した。増殖率＝（各フラクションにおけるＯＤ６５０／
コントロールのＯＤ６５０）×１００
【００５３】各フラクションに対して計算された増殖率
と各フラクションのＯＤ２８０の値を図３及び図４に示
した。
と各フラクションのＯＤ２８０の値を図３及び図４に示
した。
【００５４】ＹＴ０の培養上清ではＯＤ２８０のピーク
はフラクション６〜１５にみられた。このとき、フラク
ション１２、１３で増殖率が減少しており抗菌活性が観
察された。
はフラクション６〜１５にみられた。このとき、フラク
ション１２、１３で増殖率が減少しており抗菌活性が観
察された。
【００５５】一方、ＹＴ２１の培養上清ではフラクショ
ン９〜１４にかけてＯＤ２８０のピークが観察された。 この時、各フラクションに対しての増殖率はフラクショ
ン１１、１２、１３で著しく減少しており、フラクショ
ン１１、１２、１３が抗菌活性を有することが明らかと
なった。またこのフラクション１１〜１３の抗菌活性は
見掛け上２つのピークとして存在した。
ン９〜１４にかけてＯＤ２８０のピークが観察された。 この時、各フラクションに対しての増殖率はフラクショ
ン１１、１２、１３で著しく減少しており、フラクショ
ン１１、１２、１３が抗菌活性を有することが明らかと
なった。またこのフラクション１１〜１３の抗菌活性は
見掛け上２つのピークとして存在した。
【００５６】以上のことより、ＹＴ０、ＹＴ２１の両培
養上清には抗菌活性を持つ物質が含まれていることが明
らかとなった。ＹＴ０の培養上清の抗菌活性は見掛け上
一つのピークでありこれは酵母が本来産生している抗菌
物質によるものと考えられる。一方、ＹＴ２１の培養上
清では見掛け上２つのピークの抗菌活性が観察された。 この内の一つは酵母が本来産生する抗菌物質に由来する
もの、もうひとつは導入されたザルコトキシンＩＡが発
現したために出現したピークと考えられる。
養上清には抗菌活性を持つ物質が含まれていることが明
らかとなった。ＹＴ０の培養上清の抗菌活性は見掛け上
一つのピークでありこれは酵母が本来産生している抗菌
物質によるものと考えられる。一方、ＹＴ２１の培養上
清では見掛け上２つのピークの抗菌活性が観察された。 この内の一つは酵母が本来産生する抗菌物質に由来する
もの、もうひとつは導入されたザルコトキシンＩＡが発
現したために出現したピークと考えられる。
【００５７】試験例２ ＣＭセルロース吸着画分のウ
エスタンブロット解析 ＹＴ２１の培養上清のＣＭセルロース吸着画分であるフ
ラクション１１、１２及び１３の抗菌活性を示す物質が
ザルコトキシンＩＡであることを更に確認するために、
これら３つのフラクションを用いてウエスタンブロット
解析を行った。
エスタンブロット解析 ＹＴ２１の培養上清のＣＭセルロース吸着画分であるフ
ラクション１１、１２及び１３の抗菌活性を示す物質が
ザルコトキシンＩＡであることを更に確認するために、
これら３つのフラクションを用いてウエスタンブロット
解析を行った。
【００５８】ウエスタンブロット解析の方法は、概ねモ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）に記載されている方法に従
って行った。
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）（１９８９）に記載されている方法に従
って行った。
【００５９】下記に示す各サンプルをＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動を行ってそのゲルを銀染色した結果を
図５に、又同じ電気泳動を行い、ウサギ抗ザルコトキシ
ンＩＡ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った結
果を図６に示した。それぞれのレーンには次のサンプル
がアプライされている。 レーン１；精製ザルコトキシンＩＡ レーン２；ＹＴ２１の培養上清ＣＭセルロース吸着画分
、フラクション１１ レーン３；同上、フラクション１２ レーン４；同上、フラクション１３ レーン５；ＹＴ０培養上清ＣＭセルロース吸着画分、フ
ラクション１２ レーン６；同上、フラクション１３
ルアミド電気泳動を行ってそのゲルを銀染色した結果を
図５に、又同じ電気泳動を行い、ウサギ抗ザルコトキシ
ンＩＡ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った結
果を図６に示した。それぞれのレーンには次のサンプル
がアプライされている。 レーン１；精製ザルコトキシンＩＡ レーン２；ＹＴ２１の培養上清ＣＭセルロース吸着画分
、フラクション１１ レーン３；同上、フラクション１２ レーン４；同上、フラクション１３ レーン５；ＹＴ０培養上清ＣＭセルロース吸着画分、フ
ラクション１２ レーン６；同上、フラクション１３
【００６０】まず、銀染色の結果ではレーン１に一本の
バンドがみられた。これはザルコトキシンＩＡである。 ＹＴ２１の培養上清のＣＭセルロース吸着画分をアプラ
イしたレーン２及び３でも同じ位置に一本のバンドが観
察され、他にはいかなるバンドも観察されなかった。
バンドがみられた。これはザルコトキシンＩＡである。 ＹＴ２１の培養上清のＣＭセルロース吸着画分をアプラ
イしたレーン２及び３でも同じ位置に一本のバンドが観
察され、他にはいかなるバンドも観察されなかった。
【００６１】一方、ＹＴ０の培養上清のＣＭセルロース
吸着画分をアプライしたレーン５及び６ではいかなるバ
ンドも観察されなかった。
吸着画分をアプライしたレーン５及び６ではいかなるバ
ンドも観察されなかった。
【００６２】次にウエスタンブロット解析の結果では、
ザルコトキシンＩＡをアプライしたレーン１で１本のシ
グナルが銀染色で観察されたバンドの位置に観察された
。この時、レーン２及び３でも同じ位置にシグナルがほ
ぼ同じ強さで観察された。又、レーン４、５及び６では
いかなるシグナルも観察されなかった。
ザルコトキシンＩＡをアプライしたレーン１で１本のシ
グナルが銀染色で観察されたバンドの位置に観察された
。この時、レーン２及び３でも同じ位置にシグナルがほ
ぼ同じ強さで観察された。又、レーン４、５及び６では
いかなるシグナルも観察されなかった。
【００６３】以上のことより、ＹＴ２１の培養上清には
ザルコトキシンＩＡと同じ抗原性を持つザルコトキシン
ＩＡと同じ分子量の物質が発現していることがわかった
。この物質はザルコトキシンＩＡ遺伝子の存在に依存し
て発現しており、これは酵母で発現したザルコトキシン
ＩＡであると結論づけられた。
ザルコトキシンＩＡと同じ抗原性を持つザルコトキシン
ＩＡと同じ分子量の物質が発現していることがわかった
。この物質はザルコトキシンＩＡ遺伝子の存在に依存し
て発現しており、これは酵母で発現したザルコトキシン
ＩＡであると結論づけられた。
【００６４】この結果と抗菌活性の測定の結果を併せて
考えると、抗菌活性の２つのピークのうち最初のピーク
がザルコトキシンＩＡによるものであると考えられる。 またＹＴ２１でのザルコトキシンＩＡの産生量はウエス
タンブロット解析の結果より、約０．８ｍｇ／ｌである
と推算された。
考えると、抗菌活性の２つのピークのうち最初のピーク
がザルコトキシンＩＡによるものであると考えられる。 またＹＴ２１でのザルコトキシンＩＡの産生量はウエス
タンブロット解析の結果より、約０．８ｍｇ／ｌである
と推算された。
【００６５】試験例３ ＣＭ吸着画分のＨＰＬＣによ
る解析 ＣＭ吸着画分をＨＰＬＣにより解析した。その結果を図
７及び図８に示す。図８は逆相ＨＰＬＣでザルコトキシ
ンＩＡを解析した結果である。リテンションタイム２５
分の位置にザルコトキシンＩＡのピークが観察された。 図７はＣＭ吸着画分の逆相ＨＰＬＣの解析結果である。 リテンションタイム２５分の位置に２本のピークが観察
された。これら二つのピークを別々に分取してその抗菌
活性を測定したところ活性は２本目のピークにのみ存在
することがわかった。
る解析 ＣＭ吸着画分をＨＰＬＣにより解析した。その結果を図
７及び図８に示す。図８は逆相ＨＰＬＣでザルコトキシ
ンＩＡを解析した結果である。リテンションタイム２５
分の位置にザルコトキシンＩＡのピークが観察された。 図７はＣＭ吸着画分の逆相ＨＰＬＣの解析結果である。 リテンションタイム２５分の位置に２本のピークが観察
された。これら二つのピークを別々に分取してその抗菌
活性を測定したところ活性は２本目のピークにのみ存在
することがわかった。
【００６６】以上のことより、ＣＭ溶出画分には、ＨＰ
ＬＣでザルコトキシンＩＡと同じリテンションタイムで
溶出される抗菌活性を示す物質が含まれていることがわ
かった。このものは酵母で発現したザルコトキシンＩＡ
であると結論できる。
ＬＣでザルコトキシンＩＡと同じリテンションタイムで
溶出される抗菌活性を示す物質が含まれていることがわ
かった。このものは酵母で発現したザルコトキシンＩＡ
であると結論できる。
【００６７】
【発明の効果】酵母の培養は昆虫細胞の培養に比べ経済
的で技術的にも簡便であるから、ザルコトキシンＩＡを
調製するための材料としてはＹＴ２１は大変に優れてい
る。また前述した様にその精製は簡単であることが期待
できる。以上のことよりこの方法を用いればザルコトキ
シンＩＡを大量にしかも安価に調製できる。
的で技術的にも簡便であるから、ザルコトキシンＩＡを
調製するための材料としてはＹＴ２１は大変に優れてい
る。また前述した様にその精製は簡単であることが期待
できる。以上のことよりこの方法を用いればザルコトキ
シンＩＡを大量にしかも安価に調製できる。
【００６８】配列番号：１
配列の長さ：３９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
３９
ｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
３９
【００６９】配列番号：２
配列の長さ：３９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
３９
ｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
３９
【００７０】配列番号：３
配列の長さ：３９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
３９
ｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
３９
【００７１】配列番号：４
配列の長さ：４０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
配列
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ
４０
ｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ １５Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ ３０Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ
４０
【００７２】配列番号：５
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＧＴＡＡＧＣＴＴＧ ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧ Ｇ
ＴＴＧＧＴＴＧＡＡ ３０ＡＡＡＧＡＴＴ
３７
ＴＴＧＧＴＴＧＡＡ ３０ＡＡＡＧＡＴＴ
３７
【００７３】配列番号：６
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴ ＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣ Ｔ
ＧＴＡＧＣＡＧＣＡ ３０ＡＣ
３２
ＧＴＡＧＣＡＧＣＡ ３０ＡＣ
３２
【００７４】配列番号：７
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴ ＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡ Ｔ
ＡＴＡＡＡＣＧＡＣ ３０ＣＡＡＡ
３４
ＡＴＡＡＡＣＧＡＣ ３０ＣＡＡＡ
３４
【００７５】配列番号：８
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣ ＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴ Ｔ
ＴＡＧＣＡＧＣＡＡ ３０ＴＧＣＴ
３４
ＴＡＧＣＡＧＣＡＡ ３０ＴＧＣＴ
３４
【００７６】配列番号：９
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴ ＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴ Ｔ
ＧＡＡＡＴＣＧＡＴ ３０ＡＧＡ
３３
ＧＡＡＡＴＣＧＡＴ ３０ＡＧＡ
３３
【００７７】配列番号：１０
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡ ＴＡＴＣＧＧＴＴＴＴ Ｔ
ＣＧＡＡＡＣＧＣＡ ３０ＧＡＡＴＴＴＴＣＧＡ
４０
ＣＧＡＡＡＣＧＣＡ ３０ＧＡＡＴＴＴＴＣＧＡ
４０
【００７８】配列番号：１１
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：フラグメント
配列
ＧＧＧＧＴＡＡＧＣＴ ＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧ Ａ
ＧＧＴＴＧＧＴＴＧ ３０ＡＡＡＡＡＧＡＴＴ
３
９
ＧＧＴＴＧＧＴＴＧ ３０ＡＡＡＡＡＧＡＴＴ
３
９
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＢＧＴαを作成する工程を示す。
【図２】プラスミドｐＢＧＴαからプラスミドｐＡＭ８
２Ｂ−ＴＩを作成する工程を示す。
２Ｂ−ＴＩを作成する工程を示す。
【図３】ＹＴ２１の培養上清の各フラクションに対して
計算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を
示すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８
０の値を示す。
計算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を
示すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８
０の値を示す。
【図４】ＹＴ０の培養上清の各フラクションに対して計
算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を示
すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８０
の値を示す。
算された増殖率と各フラクションのＯＤ２８０の値を示
すものであり、−●−は増殖率を、−○−はＯＤ２８０
の値を示す。
【図５】精製ザルコトキシンＩＡ、ＹＴ２１およびＹＴ
０培養上清のＣＭセルロース吸着画分である各フラクシ
ョンについて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行
ってそのゲルを銀染色した結果を示す。
０培養上清のＣＭセルロース吸着画分である各フラクシ
ョンについて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行
ってそのゲルを銀染色した結果を示す。
【図６】精製ザルコトキシンＩＡ、ＹＴ２１およびＹＴ
０培養上清のＣＭセルロース吸着画分である各フラクシ
ョンについて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行
い、ウサギ抗ザルコトキシンＩＡ抗体を用いてウエスタ
ンブロット解析を行った結果を示す。
０培養上清のＣＭセルロース吸着画分である各フラクシ
ョンについて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行
い、ウサギ抗ザルコトキシンＩＡ抗体を用いてウエスタ
ンブロット解析を行った結果を示す。
【図７】ＣＭ吸着画分の逆相ＨＰＬＣの解析結果を示す
。図中で−○−は抗菌活性の指標としての増殖率の測定
結果を示す。
。図中で−○−は抗菌活性の指標としての増殖率の測定
結果を示す。
【図８】ザルコトキシンＩＡの逆相ＨＰＬＣの解析結果
を示す。
を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：４のいずれかに示されるアミノ
酸配列を含有する抗菌性ポリペプチドをコードする塩基
配列を複製可能な発現ベクターに連結して該塩基配列と
複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換え
ＤＮＡを得、該組換えＤＮＡで微生物を形質転換した形
質転換体。 - 【請求項２】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：４のいずれかに示されるアミノ
酸配列を含有する抗菌性ポリペプチドをコードする塩基
配列を複製可能な発現ベクターに連結して該塩基配列と
複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換え
ＤＮＡを得、該組換えＤＮＡで微生物を形質転換し形質
転換体を得、該形質転換体を培養することよりなる配列
番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号
：４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有する抗菌
性ポリペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14106891A JPH04341179A (ja) | 1991-05-16 | 1991-05-16 | 抗菌性ポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14106891A JPH04341179A (ja) | 1991-05-16 | 1991-05-16 | 抗菌性ポリペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04341179A true JPH04341179A (ja) | 1992-11-27 |
Family
ID=15283496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14106891A Pending JPH04341179A (ja) | 1991-05-16 | 1991-05-16 | 抗菌性ポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04341179A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995018855A3 (en) * | 1994-01-07 | 1995-10-19 | Pioneer Hi Bred Int | Synthetic antimicrobial peptides |
-
1991
- 1991-05-16 JP JP14106891A patent/JPH04341179A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995018855A3 (en) * | 1994-01-07 | 1995-10-19 | Pioneer Hi Bred Int | Synthetic antimicrobial peptides |
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