JPH04325086A - セラチア属に属する形質転換微生物及びそれを用いるビオチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、ビオチン・シンテター
ゼ遺伝子を組み込んだ微生物とそれを用いたビオチンの
製造方法に関し、さらに詳しくはバチルス属に属する微
生物のデスチオビオチンをビオチンに変換する反応に関
与する酵素をコードするＤＮＡを有する組み換えベクタ
ーで形質転換したセラチア属に属する微生物とそれを培
養することを特徴とするビオチンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビオチンは、ヒト・動植物にとって不可
欠なビタミンであり、医薬品或いは飼料添加物として重
要なものである。その製造技術として、最近では、遺伝
子組み換え技術の応用が検討されている。

【０００３】ビオチン合成に関与する遺伝子を組み込む
宿主としては、エシェリヒア属、バチルス属、シュード
モナス属に属する微生物などが知られている（特開昭６
１−１４９０９１号、特開昭６２−１５５０８１号、特
開昭６２−２７５６８４号、特開昭６３−４４８８９号
）。

【０００４】一方、ビオチン合成に関与する遺伝子とし
ては、バチルス属に属する微生物のデスチオビオチン（
以下、ＤＴＢという）をビオチンに変換する反応に関与
する酵素（以下、ビオチン・シンテターゼという）が知
られており（前記特開昭６２−２７５６８４号）、高い
活性を有することも報告されている（前記特開昭６３−
４４８８９号）。

【０００５】このほか、セラチア属に属する微生物を宿
主とした例として、セラチア属に属する微生物のビオチ
ン合成に関与する遺伝子の一部、または全部を該微生物
に組み込み、ビオチンを製造する方法も知られているが
（特開平２−２７９８０号）、別の属に属する微生物の
ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡをセラチア
属に属する微生物に組み込んだ例はなかった。

【０００６】一般に、別の属に属する微生物のＤＮＡを
組み込んだ組み換え微生物が、該ＤＮＡを発現し、発現
したタンパク質が高い活性を示すことを予想することは
困難であるとされている。これは、微生物の属が違うと
、ＤＮＡの相同性が低いことが多いためである。

【０００７】ＤＮＡがビオチン・シンテターゼをコード
するＤＮＡの場合、エシェリヒア属とバチルス属に属す
る微生物のものの塩基配列は、既に知られている（前記
特開昭６３−４４８８９号、特開昭６１−２０２６８６
号）が、これらを比較すると相同性が３２％と計算され
、ビオチン・シンテターゼの塩基配列は属間の差が大き
い。このことから生成するビオチン・シンテターゼの性
質やビオチン・シンテターゼの反応条件も属間で異なっ
ていると考えられる。

【０００８】そのため、別の属に属する微生物のビオチ
ン・シンテターゼをコードするＤＮＡをある微生物に組
み込んだとき、必ずしもビオチン・シンテターゼが発現
し、発現したタンパク質が高い活性を示すことができる
かどうかを予測することは困難であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、バチル
ス属微生物由来のビオチン・シンテターゼをコードする
ＤＮＡを組み込んだ、ビオチン高産生能を有する微生物
を得るべく鋭意研究の結果、ビオチン・シンテターゼを
コードするＤＮＡ断片をバチルス属に属する微生物から
切り出し、これを組み込んだベクターを用いてセラチア
属に属する微生物に移入することにより、ビオチン高産
生能を有するセラチア属に属する形質転換微生物を得る
ことができることを見い出し、この知見に基づいて本発
明を完成するに到った。

【００１０】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれば
、バチルス属に属する微生物のビオチン・シンテターゼ
をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターで形質転
換したセラチア属に属するビオチン高産生能の微生物、
及びそれを用いたビオチンの製造方法が提供される。

【００１１】バチルス属微生物由来のビオチン・シンテ
ターゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターの
構築

【００１２】本発明において、ビオチン・シンテターゼ
をコードするＤＮＡの採取に用いられる微生物は、ビオ
チン産生能を有するバチルス属であればよく、好ましく
はバチルス・スフェリカスに属するビオチン生産菌であ
る。これらの微生物はビオチン・シンテターゼをコード
するＤＮＡを有しているものである限り、自然界から新
たに分離されたものでも既知ものでもよく、またこれら
の微生物を通常の微生物突然変異誘発法（例えば、紫外
線、Ｘ線、γ線照射などの物理的処理やニトロソグアニ
ジンなどの薬剤による化学的処理による方法）で処理す
ることによって得られたものであっても良い。さらに、
ビオチン産生能を高めるために、これらの微生物にアク
チチアジン酸または５−（２−チエニル）吉草酸のそれ
ぞれ単独、あるいは双方に対する耐性を付与しても良い
。その具体例としては、例えば、バチルス・スフェリカ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＩＦ
Ｏ３５２５　　や、そのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン処理変異株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６
４２２、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０９８、ＦＥＲＭＰ−６
１４３などが例示される。

【００１３】これら微生物からビオチン・シンテターゼ
をコードするＤＮＡを採取する方法については特に限定
されない。例えば、バチルス属に属する微生物の全ＤＮ
Ａを常法により単離精製し、制限酵素で切断した後、該
制限酵素と同じ接着末端をＤＮＡに生じさせうる制限酵
素で切断したプラスミドと酵素的に結合させ、得られた
組み換えプラスミドを用いてデスチオビオチンからのビ
オチン生合成能を欠失したビオチン要求性変異株を形質
転換（または形質導入）し、得られた形質転換株の中か
らビオチン産生能を付与されたものを選択すれば、バチ
ルス属由来のビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する形質転換微生物が得られる。次いで、この形
質転換微生物から、該微生物に組み込まれた組み換えプ
ラスミドを常法により取り出し、制限エンドヌクレアー
ゼで処理して、バチルス属由来のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを採取すればよい。

【００１４】なお、該ＤＮＡには、該ＤＮＡと実質的に
同一の機能を有する修飾されたＤＮＡ、即ち、塩基配列
の一部が置換され、挿入され、または欠失されたもので
あっても、同一の機能を有するものも当然含まれる。

【００１５】さらに上記ＤＮＡとしては、シャイン・ダ
ルガノ配列、翻訳開始コドン、翻訳終了コドンを含有し
ているものが好ましく使用される。

【００１６】組み換えベクターを構築するに際しては、
プラスミドベクター、λｇｔ系ファージベクターなどが
使用される。

【００１７】本発明において組み換えベクターを構築す
るためのベクターとしては、後述のセラチア属に属する
微生物を形質転換（または形質導入）し得るものならど
のようなものでもよく、例えば組み換えベクターの構築
に用いる宿主としてビオチン要求性の大腸菌を用いる場
合は、ＥＫ系プラスミドベクターとしてストリンゼント
型のｐＳＣ１０１、ｐＲＫ３５３、ｐＲＫ６４６、ｐＲ
Ｋ２４８、ｐＤＦ４１など、リラックス型のＣｏｌＥ１
、ｐＶＨ５１、ｐＡＣ１０５、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ
１、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２４、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐ
ＫＹ２２８９、ｐＫＹ２７００、ｐＫＮ８０、ｐＫＣ７
、ｐＫＢ１５８、ｐＭＫ２００４、ｐＡＣＹＣ１８４、
ｐＵＣ８、ｐＵＣ９など、λｇｔ系ファージベクターと
してλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、λＷＥＳ・λＣ、λ
ＷＥＳ・λＢ、λＺＪｖｉｒ・λＢ’、λＡＬＯ・λＢ
、λＷＥＳ・Ｔ５６２２、λＤａｍなどが用いられる。 これらのベクターの中ではプラスミドが特に好ましい。

【００１８】また、当該組み換えベクターに含まれるビ
オチン・シンテターゼをコードするＤＮＡは、上述の形
質転換株中で機能するプロモーター配列を有するＤＮＡ
（以下、単にプロモーターという）の支配下で、かつそ
の下流に組み込まれている必要がある。組み換えベクタ
ーの該ＤＮＡの組み込み部位の上流にプロモーターが存
在しない場合は、該ＤＮＡの上流にプロモーターを該Ｄ
ＮＡが支配されるように組み込めばよい。

【００１９】本発明に使用しうるプロモーターとしては
、セラチア属微生物中で該プロモーターが組み込まれて
いる組み換えベクターが機能しうるものであれば、天然
のものでも人工合成のものでも使用可能である。このよ
うなプロモーターとしては、グラム陰性菌由来のものが
あり、大腸菌由来のｌａｃプロモーター、ｌｐｐプロモ
ーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔｒｐ
プロモーター、Ｔａｃプロモーター、シュードモナス属
微生物由来のカテコール−２，３−オキシゲナーゼプロ
モーター等が例示される。天然のものとしては、組み換
えベクターとして使用するベクター中に含まれるものを
そのまま利用してもよい。

【００２０】ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えベクターを調製し、単離する方
法は、該ベクターがセラチア属に属する微生物の細胞に
移入後、該細胞内でバチルス属微生物由来のビオチン・
シンテターゼが発現可能であるようなに調製し、単離で
きる限り特に限定されない。例えば、組み換えプラスミ
ドの調製方法は、制限エンドヌクレアーゼ（例えばＥｃ
ｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ等）を
用いてプラスミドのＤＮＡを切断した後、ＤＮＡリガー
ゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼや大腸菌ＤＮＡリガーゼ
等）で処理するか、或いはその切断末端によっては、タ
ーミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼ等で
処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させてビオチン・シ
ンテターゼをコードするＤＮＡを結合する等の常法（メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、６８、４１（１９７
９）；遺伝子操作実験法、１３５頁（高木康敬著、講談
社、１９８０年）　により実施することができる。

【００２１】ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する組み換えベクターを選択する方法は、例えば
、次の手順によって行われる。

【００２２】まず、ビオチン・シンテターゼをコードす
るＤＮＡを有する組み換えプラスミドを用いて、制限エ
ンドヌクレアーゼ欠損性でかつビオチン要求性のエシェ
リヒア・コリの変異株、例えばエシェリヒア・コリＣ６
００〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス・イン・ＵＳＡ、７１、４５９７（１
９７４）〕を、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、
９４、１９３０（１９６７）記載の方法に準じて変異誘
導処理して得られるデスチオビオチンからビオチンへの
生合成能の欠如した微生物、例えば、エシェリヒア・コ
リＫ３（ｐＳＢ０１）ＦＥＲＭ−１０９９（特開昭６２
−４４８８９）をキュアリングして得られるエシェリヒ
ア・コリＫ３等を形質転換する。次いで得られる形質転
換処理細胞を、上記のビオチン要求性のエシェリヒア・
コリの変異株が生育可能な培地からビオチンを除去した
寒天平板培地に塗布した後、２７〜３７℃で２〜４日間
培養し、得られるコロニーを釣金分離する。この際、形
質転換方法は、特に限定されず、例えば低温下で細胞を
塩化カルシウム溶液で処理して宿主細胞の膜透過性を増
大させ、組み換えプラスミドＤＮＡを宿主中に取り込ま
せる方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー、５３、１５９（１９７０）など〕により行うこと
ができる。次いで、得られた形質転換株の一部の細胞か
ら迅速法〔モレキュラー・クローニング、３６５頁〔マ
ニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、（１９８２年）〕等の方法で抽出したプラ
スミドＤＮＡにより、ビオチン要求性のエシェリヒア・
コリの変異株の細胞を形質転換して得られる微生物がビ
オチン非要求性であることを確認した後、残りの該形質
転換株から、クリヤード・ライセイト法〔遺伝子操作実
験法１２５頁（高木康敬著、講談社、１９８０年）〕等
により、プラスミドを抽出することによって組み換えプ
ラスミドを単離することができる。このような組み換え
プラスミドとして好ましいものは、例えばｐＳＢ３０１
（特開昭６３−４４８８９号）等がある。

【００２３】ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有するベクターを用いたセラチア属に属する形質転
換微生物の構築 本発明において形質転換に使用される微生物は、セラチ
ア属に属する微生物であり、好ましくはセラチア・マル
セッセンスに属する微生物である。これらの微生物は、
微生物菌株保存機関から分釀される既知のものであって
も、自然界から新たに分離されるものであっても良く、
例えばセラチア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８（財
団法人発酵研究所にて保存されている微生物）、セラチ
ア・マルセッセンスＳｒ４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４８
７）等があげられる。また、これらの微生物は、ビオチ
ン産生能を有しているものであっても、ビオチン産生能
を有していないものであっても構わない。

【００２４】セラチア属に属する微生物以外の微生物、
例えば、エンテロバクター属やシトロバクター属に属す
る微生物では、ビオチンの産生能の高い形質転換微生物
を得ることはできない。

【００２５】ビオチン産生能を有するバチルス属微生物
から採取したビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する組み換えベクターによりセラチア属に属する
微生物を形質転換する方法は、該組み換えベクターがセ
ラチア属に属する微生物中に導入され、発現しさえすれ
ば特に限定されない。例えば塩化カルシウムで菌体を処
理するして組み換えプラスミドを導入する方法（例えば
、エリックら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイク
ロバイオロジー、１３３、２０５３−２０５７、１９８
７）法等が挙げられる。具体例としては、以下の方法が
挙げられる。

【００２６】まずビオチン・シンテターゼをコードする
ＤＮＡを有する組み換えプラスミドを例えばセラチア・
マルセッセンスの野生株（例えばセラチア・マルセッセ
ンスＩＦＯ１２６４８株）の細胞にレイドらの方法〔ジ
ーン、１７、１０７（１９８２）〕により取り込ませ、
薬剤耐性のコロニーを釣菌分離することにより形質転換
株を得る。かくすることにより本発明の微生物、即ちビ
オチン産生能を有するバチルス属微生物から採取したビ
オチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを有する組み
換えプラスミドでセラチア属に属する微生物を形質転換
した組み換え微生物を得ることができる。

【００２７】かくすることにより本発明の微生物、即ち
ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを有する組
み換えベクターにより形質転換したセラチア属に属する
微生物を得る事ができる。

【００２８】セラチア属に属する形質転換微生物を用い
たビオチンの製造 上述のセラチア属に属する形質転換微生物を以下の方法
で培養し、ビオチンを製造することができる。

【００２９】本発明において使用されるビオチン生産用
培地としては、炭素源としてブドウ糖、蔗糖、糖蜜の如
き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機酸、またはグリ
セロールの如きアルコール類等を１０〜２０％、窒素源
として酢酸アンモニウム塩、又は尿素を１〜２％さらに
有機栄養物としてコーン・スティープ・リカー、ペプト
ン、酵母エキス、カゼイン加水分解物質等を０〜１％の
範囲でそれぞれ適当量含有する培地を好適に用いること
ができる。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム等を少量加
え、更に培地のｐＨを６〜８に保つために炭酸カルシウ
ムを、或いは必要に応じてアンモニア等を添加しても良
い。本発明においては、必要に応じて培地にデスチオビ
オチンを添加することができる。デスチオビオチンの添
加量はとくに制限されず、微生物のビオチン産生能に応
じて適宜選択すればよい。

【００３０】上記培地に、本発明の微生物を接種し、２
０〜３７℃、好ましくは２０〜３５℃、さらに好ましく
は２３〜２８℃にて振盪或いは通気攪拌の如き好気的条
件下で２日以上、好ましくは３日以上で培養することに
より培地中にビオチンを著量蓄積せしめることができる
。ときに、培養時間が長すぎると、培地中のビオチン量
が減少することがある。生成したビオチンの精製は、例
えば、培養終了後、菌体その他の不溶物を除去し、次い
で公知の方法、例えば特公昭４２−８９１８号に記載の
方法により実施することができる。即ち菌体を除去した
溶液中のビオチンを活性炭に吸着し、アンモニア含有エ
タノールの如き溶媒で溶出した後濃縮し、次いで陰イオ
ン交換樹脂に供すればよい。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例中ビオチンの定量はラクトバ
チルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂｕｃｉｌｌｕｓ　
　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）による微生物定量法｛ビタミン
学実験法、ＩＩ巻、４８６頁〔日本ビタミン学会編、東
京化学同人（１９８５年）〕｝により定量した。

【００３２】（実施例１）（１）プラスミドの脱落エシ
ェリヒア・コリＫ３（ｐＳＢ０１）ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１０９９からｐＳＢ０１を脱落させるため、この株をア
クリジン・オレンジを１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に
植菌し、３７℃で１５時間振盪培養した。培養終了後、
培養液を１０５倍希釈した溶液１００μｌを、ＬＢ平板
寒天培地に塗抹し、３７℃で２４時間培養した。２４時
間培養後、出現したコロニーをアンピシリンを５０ｍｇ
／ｌ含むＬＢ平板寒天培地にレプリカし、３７℃で１５
時間培養し、生育しない株を選択した。１５時間培養後
、ＬＢ平板寒天培地では生育するが、アンピシリンを含
むＬＢ平板寒天培地では生育しない株シェリヒア・コリ
Ｋ３−１を選択した。

【００３３】（２）ｐＳＢ０１の回収 エシェリヒア・コリＫ３（ｐＳＢ０１）を用いてビルン
ボイム（Ｂｉｒｕｎｂｏｉｍ）とドーリー（Ｄｏｌｙ）
の方法〔ヌクレイック・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃｉｄ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、７、１５１
３（１９７９）〕で全長約１２．５ＫｂｐのｐＳＢ０１
を回収した。プラスミドｐＳＢ０１は、バチルス属に属
する微生物のビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有するプラスミドである。その制限エンドヌクレア
ーゼ切断地図を図１に示す。

【００３４】（実施例２）　　ハイブリッドプラスミド
ｐＳＢ０３の構築と解析 （１）ハイブリッドプラスミドの構築 実施例１（２）で得たｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡ１μ
ｇを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に分解し
、得られた３種のＤＮＡ断片の混合物１μｇを１０ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２　、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび１０ｍＭデ
チオスレイトールｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸中
でＴ４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩
反応させることにより再結合を行った。

【００３５】（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換と
ビオチン産生能を有する形質転換大腸菌の選択実施例１
の（１）で得たエシェリヒア・コリＫ３−１を１００ｍ
ｌのＬＢ培地中３７℃で２時間半振盪培養し、対数増殖
期に菌体を遠心分離により集めた。この菌体をクシュナ
ー（Ｋｕｓｈｎｅｒ）の方法〔ジェネティック・エンジ
ニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ）ｐ．１７、１９７８年〕により許容細胞とした。

【００３６】次に（１）で得たＴ４ＤＮＡリガーゼによ
る反応混合物０．１μｇを上記許容細胞懸濁液０．２ｍ
ｌに加えて０℃で３０分間静置培養した。４３．５℃で
３０秒間保った後、ＬＢ培地１．８ｍｌを加えて３７℃
で１時間培養した。これを遠心分離して集菌した。この
菌体を０．８５％ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した後、０
．８５％ＮａＣｌ水溶液１ｍｌに懸濁した。次に菌体懸
濁液０．１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＣ
Ａ培地［グリセリン２％、カザミノ酸（ビタミンフリー
）１％、Ｋ２ＨＰＯ４　　０．２％、ＫＨ２ＰＯ４　　
０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．００５％、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．００１％、ＭｎＳＯ４・４
〜６Ｈ２Ｏ　　０．００１％、チアミン塩酸塩０．００
００１％］の１．５％寒天培地に塗抹し、３７℃にて二
晩培養した。 生じたコロニーはアンピシリン耐性、ビオチン非要求性
であり、かくして目的とするビオチンの生合成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだハイブリッドプラ
スミドによる形質転換株を得た。 ＄ （３）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ０３の解析実施例
２（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＣＡ培地５ｍｌ中で一晩振盪培養して遠心
分離で集菌後、ビルンボイムとドーリーの方法〔ヌクレ
イック・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉ
ｄ　　Ｒｅｓ．）７，１５１３〜（１９７９）〕により
ハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプ
ラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖長約８．８ｋ
ｂであり、ｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡから約３．７ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ切断断片が欠落したものであった。 このハイブリッドプラスミドをｐＳＢ０３と命名し、そ
の制限エンドヌクレアーゼ切断地図を図２に示す。

【００３７】（実施例３）　　ハイブリッドプラスミド
ｐＳＢ１０３の構築と解析 実施例２で得たｐＳＢ０３プラスミドＤＮＡ３μｇを制
限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解した
。これとは別にｐＵＣ９　　１μｇを制限エンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解した。次いでｐＳＢ
０３を切断して得られた３種のＤＮＡ断片の混合物（１
μｇ）と開裂されたｐＵＣ９（１μｇ）を１０ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２　、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび１０ｍＭデチオ
スレイトールを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸
中でＴ４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し反応混合物
を調製した。これを各々４℃で一晩反応させることによ
ってハイブリッドプラスミドを得た。

【００３８】（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換上
記実施例３の（１）の反応混合物１μｇを用いること以
外は実施例２の（２）と同様にしてハイブリッドプラス
ミドによる形質転換株を得た。

【００３９】（３）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ１０
３の解析 実施例３の（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＣＡ培地５ｍｌ中で一晩振盪培養
して遠心分離で集菌後、前述のビルンボイムとドーリー
の方法によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した
。抽出したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖
長約６．２ｋｂであった。このプラスミドはｐＳＢ０３
プラスミドＤＮＡの約２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ切断
断片が挿入されたものでありｐＳＢ１０３と命名した。

【００４０】この挿入断片中に含まれるバチルス・スフ
ェリカスＩＦＯ０３５２５由来のＤＮＡ断片はＭｂｏＩ
からＨｉｎｄＩＩＩまでの約１．５ｋｂであり、その詳
細な制限エンドヌクレアーゼ切断地図は図３に示すとお
りである。

【００４１】（実施例４）　　ハイブリッドプラスミド
ｐＳＢ３０１の構築（図４参照） Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペロン領域にビオチン
・シンテターゼをコードするＤＮＡを直結するために以
下の操作を行った。ｐＳＢ１０３を制限エンドヌクレア
ーゼＭａｅＩで完全分解せしめた後、分解したＤＮＡ断
片（２．０μｇ）を３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
５）、２５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭＺｎＳＯ４、５
％グリセロール中でＳ１ヌクレアーゼ１単位と混合し、
３７℃、３０分間反応させることによってＤＮＡ断片の
両末端を平滑にした。次いで反応物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

【００４２】一方Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペレ
ーターを含み、アンピシリン耐性をマーカーとしてもつ
ｐＤＲ７２０（ファルマシア社製）を制限エンドヌクレ
アーゼＳｍａＩで完全分解せしめたの後、アルカリホス
ファターゼで処理した。

【００４３】アガロースゲルより回収した約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片（０．１μｇ）と開裂されたｐＤＲ７２０
（０．１μｇ）を１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１ｍＭＡＴ
Ｐおよび１０ｍＭデチオスレイトールを含むｐＨ７．４
の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位
と共に混合し、１５℃で４時間反応させることによって
ハイブリッドプラスミドを含む反応混合物を得た。

【００４４】この反応混合物０．２μｇを用いること以
外は実施例２の（２）と同様にしてハイブリッドプラス
ミドによる形質転換株を得た。

【００４５】得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で一晩培養して遠心分
離で集菌後、ビルンボイムとドーリーの方法によりハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラス
ミドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長約６．１ｋｂであ
った。このプラスミドはＴｒｐプロモーターの転写開示
部位の約７０塩基下流からバチルス・スフェリカス由来
のビオチン合成酵素遺伝子の翻訳開始コドンＧＴＧが始
まっていた。これをｐＳＢ３０１と命名した。

【００４６】（実施例５）　　セラチア・マルセッセン
スＩＦＯ１２６４８を宿主とする形質転換株の取得実施
例４で得たｐＳＢ３０１を用いレイドらの方法〔ジーン
、１７、１０７（１９８２）〕により取り込ませる。即
ちセラチア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８をＬＢ培
地（バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、Ｎａ
Ｃｌ１％；ｐＨ７．５に調整）、２０ｍｌ中で３０℃で
通気振とう培養し、菌体濃度が１ｍｌ当り２×１０８個
の細胞数になった時点で菌体を１２０００×ｇ、１０分
の遠心分離により集めた。この菌体を１０ｍｌの１０ｍ
Ｍ、冷ＮａＣｌ溶液に懸濁する。この懸濁液を６５℃で
１分熱処理した後氷上で冷却し、遠心分離により集菌し
上清を一旦捨てた後０℃、１０ｍｌの３０ｍＭ冷ＣａＣ
ｌ２溶液に懸濁し、冷却した後、５℃にて３０００×ｇ
、５分遠心分離にて集菌し、上清を一旦捨てた後、２ｍ
ｌの冷３０ｍＭ　　ＣａＣｌ２、１５％グリセロール溶
液に懸濁する。このＣａＣｌ２　　処理液０．２ｍｌに
プラスミドを０．１μｇ加え、４２℃で７５秒（約２〜
５×１０８細胞／ｍｌ）熱処理した後、１〜２４時間０
℃で保持した後、アンピシリン５００μｇ／ｍｌ入りＬ
Ｂ平板培地と塗抹し２８℃で二晩培養した後生育して来
たコロニーを釣菌分離することにより形質転換株セラチ
ア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８（ｐＳＢ３０１）
を得る。この形質転換株の含有するプラスミドＤＮＡが
ｐＳＢ３０１であることを制限エンドヌクレアーゼの切
断部位を利用することで確認した。

【００４７】（実施例６）　　ビオチンの製造実施例１
で得られるセラチア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８
（ｐＳＢ３０１）、並びに対照株としてセラチア・マル
セッセンスＩＦＯ１２６４８をそれぞれＬＢ平板培地で
１夜前培養した。アンピシリン１００ｍｇ／ｌを添加し
た特公平２−２７９８０号に記載の発酵培地（ショ糖１
０％、尿素１．０％、Ｋ２ＨＰＯ４　　０．１％、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
　　０．０１％、ＣａＣＯ３　　１％）に、前駆体とし
てＤＴＢを最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように加えた培
地（ｐＨ７．０）１ｍｌをフィルター滅菌し、予め滅菌
しておいた１８ｍ／ｍ（内径）試験管に注入し、前述の
菌体をそれぞれ１白金耳植菌する。ついで２５℃で往復
振とう培養する。９６時間後のビオチン産生量は表１の
通りである。

【００４８】

【表１】

【００４９】（比較例１）シトロバクター・フレウンデ
ィー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）
ＩＦＯ１３５４４にプラスミドｐＳＢ３０１を導入せし
めたＩＦＯ１３５４４（ｐＳＢ３０１）、エンテロバク
ター・クロアクエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｃｌ
ｏａｃｅａ）ＩＦＯ１２９３５にプラスミドｐＳＢ３０
１を導入せしめたＩＦＯ１２３９５（ｐＳＢ３０１）、
エンテロバクター・エアロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２０１０にプ
ラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめたＩＦＯ１２０１０
（ｐＳＢ３０１）を用いて、実施例２に記載の方法でＤ
ＴＢからビオチンを産生させた。一方、エシェリヒア・
コリＭＣ１６９にプラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめ
たエシェリヒア・コリＭＣ１６９（ｐＳＢ３０１）を５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンと５００μｇ／ｍｌのＤＴ
Ｂを含むＰＣ培地（グリセリン２％、プロテオースペプ
トン５％、カザミノ酸２％、Ｋ２ＨＰＯ４　　１％、Ｋ
Ｃｌ　　０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０
５％、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　　０．００１％、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．００１％、ｐＨ７．０）の
１．２倍濃度培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１時間振盪
培養後、Ｔｒｐプロモーターを誘導するために、インド
ールアクリル酸を１６．７μｇ／ｍｌとなるように添加
し、さらに３７℃で１晩振盪培養した。それぞれの菌株
のビオチン産生量は表２の通りである。

【００５０】

【表２】

【００５１】

【発明の効果】かくして本発明によれば、ビオチン産生
能を有するバチルス属微生物由来のビオチン・シンテタ
ーゼをコードするＤＮＡを有する組み換えプラスミドを
セラチア属に属する微生物に形質転換せしめることによ
り、ビオチンへの産生能に優れた微生物を得ることがで
き、それらの該微生物を培養することにより効率よくビ
オチンを製造することができる。

【００５２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ切断地図である。

【図２】ｐＳＢ０３プラスミドＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ切断地図である。

【図３】バチルス属微生物由来のビオチン・シンテター
ゼＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。

【図４】ｐＳＢ３０１プラスミドＤＮＡの調製方法であ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属
   する微生物のデスチオビオチンをビオチンに変換する反
   応に関与する酵素をコードするＤＮＡを有する組み換え
   ベクターを組み込んだセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
   に属する微生物。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の微生物を、好気的条件
   下で培養した後、培地からビオチンを回収することを特
   徴としたビオチンの製造方法。 【０００１】