JPH04224559A - 血管新生阻害物質 ｆｒ−９０１４４８ およびｆｒ−９０１４４９ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＦＲ−９０１４４８物
質、ＦＲ−９０１４４９物質（それぞれＷＦ１６７７５
−Ａ１、同Ａ２という場合もある）を有効成分とする血
管新生阻害剤に関するものである。

【０００２】また本発明はこれらの物質の新規な製造方
法にも関するものである。これらの物質の内、ＦＲ−９
０１４４９物質は文献未載の新規物質である。

【０００３】これらの物質は、すぐれた血管新生阻害作
用を有しており、制癌剤をはじめ各種の医薬として有用
である。

【０００４】

【従来の技術】生体内において血管が新生するのを抑制
ないし阻害することは、生理学的見地から非常に重要な
意義を有する。例えば、癌細胞またはその周辺細胞にお
ける血管の新生を阻害すれば、これ（ら）の細胞に対し
て酸素や各種の栄養成分が運ばれなくなるため、結局死
滅せざるを得なくなり、間接的に、癌細胞を征圧するこ
ととなる。したがって、すぐれた血管新生阻害剤はすぐ
れた制癌剤として大いに期待することができる。

【０００５】本発明に係る物質は、血管内皮細胞に対す
る管腔形成阻害を指標として血管新生阻害物質をスクリ
ーニングする過程において発見されたものであるが、こ
れらＦＲ−９０１４４８及びＦＲ−９０１４４９物質の
ようなピリジン系誘導体が血管新生阻害作用を有するこ
とは、従来知られておらず新規である。

【０００６】上記のように作用の面からみても本発明は
新規であるが、物質の面からみても本発明は新規であつ
て、ＦＲ−９０１４４９物質は新規化合物である。また
、ＦＲ−９０１４４８物質は既知の化合物であつて（Ｔ
ｈｅ　　Ｊｏｕｎａｌ　　ｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
，ＶＯＬ．ＸＬＩＩＩ，Ｎｏ．９、１０６４−１０６８
（１９９０））、その抗カビ作用は明らかにされている
けれども、血管新生阻害作用については全く何も開示さ
れていない。

【０００７】また、本発明は、これらＦＲ−９０１４４
８及びＦＲ−９０１４４９物質をケトアスボリシア属菌
を培養することによって製造する方法にも関するもので
あるが、このような方法も全く知られておらず新規であ
る。すなわち、ＦＲ−９０１４４９物質は新規物質であ
るから、当然のことながらそれを製造する本発明方法は
新規であるし、またＦＲ−９０１４４８物質はＰｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ　　ｓｐ．ＦＯ−１２５の生産する抗カ
ビ性抗生物質であることが知られているが（上掲文献）
、本発明のようにケトアスボリシア属菌によって生産さ
れることは全く知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安全性が高
くしかもきわめて有効な血管新生阻害剤ないし抗腫瘍剤
を開発する目的でなされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記した目的
を達成するためになされてものである。

【００１０】そこで、本発明者らは、安全性の面から天
然物に着目し、微生物の醗酵生産物に注目するに至り、
各種微生物を検索した結果、石川県白山山中で採取され
た土壌から新たに分離したフィアロピクニディア亜目に
属する糸状菌Ｎｏ．１６７７５株がその菌体内に目的物
質を蓄積することを発見した。そして更にこの物質につ
いてその理化学的性質を詳細に研究した結果、２種類の
物質からなることを発見し、これらをＷＦ１６７７５−
Ａ１及びＷＦ１６７７５−Ａ２とそれぞれ命名し、更に
検討を行い本発明を完成するに至った。

【００１１】本発明に係るＷＦ１６７７５−Ａ２物質は
、下記表１の理化学的性質を有している。

【００１２】

【表１】

【００１３】このような理化学的性質を有する物質は従
来知られておらず、新規物質であることが確認された。 そしてこの新規物質であるＷＦ１６７７５−Ａ２物質に
ついて、その化学構造の決定を試みた結果、それに成功
し、このＷＦ１６７７５−Ａ２物質の構造式を下記化４
の式ＩＩのように決定した。

【００１４】

【化４】

【００１５】また本発明方法においては、上記したＷＦ
１６７７５−Ａ２物質とともにＷＦ１６７７５−Ａ１物
質も生産され、その構造決定を行った結果、下記化５の
式ＩＩＩで示される化合物であることが判明した。

【００１６】

【化５】

【００１７】この式ＩＩＩで示される構造式を有するＷ
Ｆ１６７７５−Ａ１物質がペニシリウム属菌の醗酵生産
物として既に知られている物質であることは、先に述べ
たとおりである。

【００１８】このようにして、ＷＦ１６７７５−Ａ１及
び同Ａ２物質の構造決定に伴ない、これらの物質を改め
てそれぞれＦＲ−９０１４４８及びＦＲ−９０１４４９
物質と命名し、以後、この名称も使用する場合がある。

【００１９】本発明において使用するＷＦ１６７７５物
質（ＷＦ１６７７５−Ａ１及びＡ２の総称）は、下記化
６の式Ｉで示される構造を有するものであって、本発明
者らが石川県白山で採取した土壌から新たに分離した糸
状菌Ｎｏ．１６７７５によつて生産される。

【００２０】

【化６】

【００２１】糸状菌Ｎｏ．１６７７５株はケトアスボリ
シア属に属するものと認められ、ケトアスボリシア・エ
リシホイデスＮｏ．１６７７５（Ｃｈａｅｔａｓｂｏｌ
ｉｓｉａ　　ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓ　　Ｎｏ．１６
７７５）と命名された。

【００２２】本菌株の凍結乾燥サンプルは、工業技術院
微生物工業技術研究所（〒３０５、茨城県つくば市東１
−１−３）へＦＥＲＭ　　Ｐ−１１８７３の番号で寄託
された。（寄託日＝１９９０年１１月２９日）

【００２
３】ＷＦ１６７７５物質の生産は、単に説明を目的とし
て挙げただけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限
定されるものでないことを理解すべきである。 この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照射、
Ｎ−メチルーＮ′−ニトローＮ−ニトロソグアニジン、
２−アミノプリン等の変異処理により取得できる人工変
異株並びに自然変異株を含めてＷＦ１６７７５物質を生
産しうる全ての変異株の使用をも包含するものである。

【００２４】本菌株（Ｎｏ．１６７７５株）は、各種培
地上でやや抑制的に広がり、暗茶色の集落を形成する。 Ｎｏ．１６７７５株は、各種培地上で、分生子殻のアナ
モルフを形成した。その分生子形成様式はフィアロ型で
あった。またテレオモルフは形成しなかった。これらの
形態的特徴から、Ｎｏ．１６７７５株はフィアロピクニ
デイア亜目（ｔｈｅ　　ｓｕｂｏｒｄｅｒ　　Ｐｈｉａ
ｌｏｐｙｃｎｉｄｉｉｎｅａｅ　　Ｓｕｔｔｏｎ　　１
９８０）に所属すると思われる。

【００２５】以下に、本菌の菌学的性質を示す。

【００２６】各種培地上での培養性状を下記表２に示し
た。麦芽抽出寒天培地の中心に接種し、２５℃で１４日
間培養した時の生育はやや抑制的で、直径３．０〜３．
５ｃｍに拡がった。集落の表面はフェルト状で、放射状
の溝を生じ、赤色味茶色から黒色であった。また赤色の
可溶性色素を生産した。集落裏面は暗茶色であった。分
生子殻を豊富に生じた。同様の培養をポテト・デキスト
ロース寒天培地上で行った時は、生育は抑制的であった
（直径２．５〜３．０ｃｍ）。集落表面は平坦からコッ
トン状で、放射状の溝を形成し、赤色味茶色から黒色で
あった。また、赤色の可溶性色素を生産した。集落裏面
は灰色味赤色から黒色であった。分生子殻が豊富に見ら
れた。

【００２７】形態的特徴の観察は、加圧滅菌した葉上で
の生育をもとに行った。分生子殻は、表在性、暗茶色、
球形、開孔性で、剛毛を持ち、多角菌組織の細胞１−２
層の薄壁から成り、直径６０μｍまであった。剛毛は、
隔壁はなく、暗茶色、いぼ状、長さ２５μｍまでで、巾
３．５−４．５μｍであった。分生子柄は観察されず、
フィアライドが分生子殻に配列した。フィアライドはと
っくり形、長さ４．０−９．０μｍで、基部は巾３．０
−４．０μｍ、細くなった先端は巾０．５−２．０μｍ
であった。フィアライドから無色の分生子が形成された
。分生子は１細胞、滑面、亜球形で、３．０−３．５×
２．５−３．０μｍであった。栄養菌糸は隔壁をもち、
茶色、粗面、分枝する。菌糸細胞は円筒形またはたる形
で、巾２．０−４．０μｍである。

【００２８】Ｎｏ．１６７７５株は７〜３２℃で生育可
能で、最適生育温度は２２〜２５℃である。（ポテト・
デキストロース寒天培地上で測定した）。

【００２９】上記の特徴からＮｏ．１６７７５株はケト
アスボリシア・エリシホイデス・スペガッチーニ（Ｃｈ
ａｅｔａｓｂｏｌｉｓｉａ　　ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅ
ｓ　　Ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉ　　１９１８）に所属する
と思われた（１）。従って、この生産株をケトアスボリ
シア・エリシホイデスＮｏ．１６７７５（Ｃｈａｅｔａ
ｓｂｏｌｉｓｉａ　　ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓ　　Ｎ
ｏ．１６７７５）と命名した。

【００３０】Ｎｏ．１６７７５株の培養上の特徴を、下
記表２の第１表にまとめて示す。

【００３１】

【表２】

【００３２】以上の特徴は、２５℃で、１４日間培養後
に観察した。色調の記載は、メチューン・ハンドブック
・オブ・カラー（Ｍｅｔｈｕｅｎ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ
　　ｏｆＣｏｌｏｕｒ）をもとにして行った（２）。

【００３３】上記において参考にした文献は、下記表３
のとおりである。

【００３４】

【表３】

【００３５】本発明に係るＷＦ１６７７５物質は、ケト
アスボリシア属に属する該物質生産菌（例えば、Ｃｈａ
ｅｔａｓｂｏｌｉｓｉａ　　ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓ
　　Ｎｏ．１６７７５）を資化しうる炭素及び窒素源を
含む栄養培地中に接種し、好気条件下で培養することに
より、（例えば、振とう培養、通気撹拌培養等）、生産
せしめることができる。

【００３６】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、フラクトース、グリセリンその他の炭水化
物を使用するのが好ましい。

【００３７】窒素源としては、オートミール、イースト
エキストラクト、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、
大豆ミール、コーンスティープリカー、乾燥イースト、
小麦胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するの
が好ましいが、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿
素、アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使
用することができる。

【００３８】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれ
ているからである。

【００３９】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

【００４０】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。

【００４１】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。

【００４２】また、培養を大きなタンクで行う場合、Ｗ
Ｆ１６７７５物質の生産工程において菌の生育遅延を防
止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を種培
養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそこ
で生産培養するのが好ましい。この場合、前培養ないし
種培養に使用する培地及び生産培養ないし本培養に使用
する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし必
要あれば両者を変えてもよい。

【００４３】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み等
既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌した
ものを用いる。

【００４４】培養温度は、本ＷＦ１６７７５物質生産菌
が本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は
１〜４０℃、好ましくは７〜３２℃、特に好ましくは２
２〜２５℃で培養するのがよい。培養時間は、培養条件
や培養量によっても異なるが通常は約１日〜１週間であ
る。

【００４５】醗酵終了後、培養物から目的とするＷＦ１
６７７５物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水及
び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的
に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び
／又は有機溶媒で抽出した後、常法したがって回収、精
製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがって回収
、精製すればよい。

【００４６】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。

【００４７】ＷＦ１６７７５物質の回収、精製は上記の
ように既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次のよ
うにしてもよい。まず、培養物、例えば菌糸体のアセト
ン抽出液を、酢酸エチル、ヘキサン、またはこれらの混
合溶媒で抽出し、抽出液を必要あれば蒸発又は蒸留して
濃縮する。濃縮液及び／又は抽出液には、ＷＦ１６７７
５−Ａ１及びＡ２の双方が含まれているので、これらを
分離しないで使用する場合には、この濃縮液及び／又は
抽出液をそのままあるいは常法にしたがって精製した後
、使用すればよい。

【００４８】また、ＷＦ１６７７５−Ａ１及びＡ２をそ
れぞれ分離精製する場合は、上記によって得た抽出液及
び／又は濃縮液を更に精製処理し、例えばクロマトグラ
フィ処理によってこれらＡ１及びＡ２成分をそれぞれ含
有するフラクションに分離すればよく、また更に純度の
高い物質を得るためには、クロマトグラフィ処理、抽出
処理、再結晶処理等、常法にしたがって精製処理を行え
ばよく、必要あれば更に凍結乾燥等を行ってもよい。こ
のようにして、ＷＦ１６７７５−Ａ１及びＡ２を純粋な
形で得ることができる。

【００４９】このようにして得たＷＦ１６７７５物質（
Ａ１、Ａ２及びこれらの混合物も含む）は、遊離の形で
使用するほか、例えば次のような塩基で処理するといっ
た常法によって薬剤上許容できる塩の形で使用してもよ
く、これらの塩類も本発明の権利範囲に包含される。

【００５０】塩基として好適なものの例は次のとおリで
ある：アルカリ金属（例えばナトリウム、カリウム等）
、アルカリ土金属（例えばマグネシウム、カルシウム等
）、これらの水酸化物又は炭酸塩、アルカリ金属アルコ
キサイド（例えばナトリウムメトキサイド、ナトリウム
エトキサイド、カリウムｔ−ブトキサイド等）その他。

【００５１】本発明に係る薬剤組成物は、ＷＦ１６７７
５物質（Ａ１、及び／又はＡ２）及び／又はその塩を有
効成分としてこれに常用される無機又は有機の担体を加
えて、固体、半固体又は液体の形で、経口投与剤のほか
、外用剤等の非経口投与剤に製剤化する。

【００５２】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げら
れる。非経口投与のための製剤としては、注射剤、点滴
剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、スプレー、懸
濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本発明の有効
成分を製剤化するには、常法にしたがえばよく、界面活
性剤、、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩
衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬を適宜使用
する。

【００５３】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（ＷＦ
１６７７５物質及び／又はその塩類）を０．１〜１００
ｍｇ／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合は同じく０．１〜１
００ｍｇ／ｋｇ投与し、経口投与の場合も同じく１〜１
０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与する。

【００５４】以下、本発明を実施例令について更に詳し
く説明する。

【００５５】

【実施例１】

【００５６】

【（１）　　醗酵生産】５００ｍｌ容エルレンマイヤー
フラスコ４８本に下記の表４に示す種培養培地７．７１
を等分に分注し、１２０℃で３０分間滅菌した。この各
々の培地に、Ｃｈａｅｔａｓｂｏｌｉｓｉａ　　ｅｒｙ
ｓｉｐｈｏｉｄｅｓ　　Ｎｏ．１６７７５（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１１８７３）株の斜面培養物を１白金耳ずつ接種
し、２５℃で３日間ロータリーシエーカー（２２０ｒｐ
ｍ、約５．１ｃｍストローク）で培養した。

【００５７】

【表４】

【００５８】次に、下記の表５に示す本培養培地を２０
０ｌ容のファーメンター３基に１５０ｌずつそれぞれ注
入し、１２０℃で３０分間滅菌した後、上記で得た前培
養物全量を３等分し、これらをそれぞれ接種し、２５℃
で７日間培養した。攪拌は２００ｒｐｍ、通気量は１５
０ｌ／分、且つ１．０ｋｇ／ｃｍ２、以上の加圧下で培
養を行った。

【００５９】

【表５】

【００６０】菌体量は、３０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離した後に定量した。検定サンプルとしては、全ブロ
ス抽出液（等量のアセトンを加えた後、室温で１時間抽
出したもの）を用い、その活性は、内皮細胞を使用する
管腔形成試験によってモニターした。

【００６１】

【（２）分離精製】上記によって得た発酵ブロスを、濾
過助剤としてケイソウ土１０ｋｇを用いて濾過した。得
られた菌体（湿重量５４ｋｇ）を、５０ｌのアセトンを
用いて２回抽出した。アセトンを減圧下で蒸発させ、得
られた水溶液に６Ｎ　　ＨＣｌを加えてｐＨを４に調節
した。酢酸エチル２０ｌを用いて３回抽出を行い、次い
で減圧下濃縮し、これをＮａ２ＳＯ４で乾燥し、その結
果、油状物質を得た。

【００６２】得られた油状物質を２１のシリカゲル（７
０−２３０メッシユ、メルク社）とともに乾燥し、得ら
れた粉末を、上記と同一のシリカゲルをｎ−ヘキサン中
で充填した１ｌのカラムに付した。次いでこのカラムを
、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの各混合溶液（１：０；８
：１；４：１；３：１；２：１；１：１）を各段階にお
いて各々カラム容量の３倍量（９１）を使用して、段階
的に溶出した。ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの８：１及び
３：１混液で溶出した。フラクションに活性が認められ
たので、これらのフラクションを合し、これを減圧下濃
縮して、油状物質５６．３ｇを得た。

【００６３】この油状物質を１５０ｍｌのシリカゲルと
ともに再度乾燥し、次いでこれを、上記と同じシリカゲ
ルをｎ−ヘキサンで充填した１ｌのカラムに再度付した
。上記したのと同じ混合溶媒を用いて段階的に展開した
結果、ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの３：１及び２：１混
液中に活性化合物が溶出された。これを減圧下濃縮して
、黄褐色油状物質１３．６ｇを得た。

【００６４】この油状物質を３４０ｍｌのエタノールで
希釈した後、水５１０ｍｌを加えた。黄色沈澱が生成し
たので、これに１Ｎ　　ＮａＯＨを加えてｐＨを７．５
に調節することによリ、これを再度溶解し、その結果赤
色の溶液を得た。一方、ＹＭＣゲル（ＯＤＳ−ＡＭ　　
１２０−Ｓ５０、山村化学研究所（株）製）を、１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）含有４０％メタノー
ル水中で１ｌカラムに充填しておき、このＹＭＣゲルカ
ラムに上記赤色溶液を適用した。上記メタノール水６ｌ
を用いてカラムを洗滌した後、活性化合物は、１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）含有５０％メタノール
水で溶出された。同時に、ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−
ＡＭ　　３０３　　Ｓ−５　　１２０Ａ　　ＯＤＳ（山
村化学研究所（株）製）、溶媒：１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７）含有６５％メタノール水、流速：１
．０ｍｌ／分、検出：２１０ｎｍ）を用いて、上記の溶
出液をモニターした。その結果、保持時間１０．１分及
び１４．６分のところにそれぞれ活性化合物が検出され
た。これら２つの活性化合物の中、前者をＷＦ１６７７
５−Ａ１（＝ＦＲ−９０１４４８）そして後者をＷＦ１
６７７５−Ａ２（＝ＦＲ−９０１４４９）とそれぞれ命
名した。

【００６５】ＷＦ１６７７５−Ａ１は７００ｍｌ〜３７
００ｍｌのフラクション（フラクションＩ）に溶出され
、他方、ＷＦ１６７７５−Ａ２は４０００ｍｌ〜８３０
０ｍｌのフラクション（フラクションＩＩ）に溶出され
た。

【００６６】フラクションＩ（ＷＦ１６７７５−Ａ１を
１２７０ｍｇ含有）を合し、そして最終濃度が３５％メ
タノール水となるよう水を加え、次いで次のようにして
再度クロマトグラフィー処理を行った。すなわち１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）含有４０％メタノー
ル水で充填した１ｌのＹＭＣゲルカラムに、上記サンプ
ルを負荷した。上記水性メタノール溶媒６ｌを用いてカ
ラムを洗滌した後、４５％メタノール水によって該化合
物が溶出された。減圧下この活性フラクション（ＷＦ１
６７７５−Ａ１を１１７６ｍｇ含有）からメタノールを
除去した後、１Ｎ　　ＨＣｌを用いてそのｐＨを４に調
節した。

【００６７】得られた懸濁液を、ｎ−ヘキサン：酢酸エ
チル（１：２）混液で５回（該混液を各等量ずつ使用）
抽出し、乾燥した。得られた赤色油状物質（１５４７ｍ
ｇ）を、ｎ−ヘキサン：酢酸エチルの（６：１）熱混液
中に再度溶解し、これを、上記と同じ溶媒を用いて充填
した１５０ｍｌのシリカゲルカラムに適用した。

【００６８】このカラムを、上記溶媒を用いてＷＦ１６
７７５−Ａ１の溶出が完結するまで、充分に展開した。 溶媒を減圧下で除去し、薄黄色油状残渣を少量の熱ｎ−
ヘキサン中に再溶解した。この溶液を室温に１夜放置し
たところ、白色針状を呈する結晶が８２２ｍｇ得られた
。

【００６９】また一方、赤色を呈するフラクションＩＩ
（ＷＦ１６７７５−Ａ２を３２８ｍｇ含有）については
、最終濃度が４０％メタノール水となるよう水で希釈し
、１ｌのＹＭＣゲルカラム上で再度クロマトグラフィー
処理を行なった。１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７）含有４０％メタノール水５ｌを用いて、このカラ
ムを洗滌した後、１０ｍＭの上記緩衝液含有５０％メタ
ノール水を用いてＷＦ１６７７５−Ａ２溶出した。

【００７０】純度９５％以上のフラクションを合し、こ
れを減圧下で濃縮してメタノールを除去した。この活性
物質をｐＨ７下でｎ−ヘキサンを用いて抽出し、薄黄色
の抽出液を得た。これを濃縮して、ＷＦ１６７７５−Ａ
２の無色針状結晶を２７３ｍｇ得た。

【００７１】

【実施例２】実施例１で製造したＷＦ１６７７５−Ａ１
及び同Ａ２物質（それぞれ単にＡ１及びＡ２ということ
もある）について、血管内皮細胞に対する管腔形成阻害
を測定して、血管新生阻害活性のほか、更に抗腫瘍活性
も確認し、併せて安全性も確認した。

【００７２】

【（１）管腔形成阻害活性】内皮細胞はウシ頸動脈由来
のものを用い、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むイ
ーグルＭＥＭ（最少必須）培地にて培養したものをトリ
プシン処理して集めた。９６穴マイクロタイタープレー
トの各穴に中性化したタイプＩコラーゲンを加えてゲル
化し、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地に懸濁した内皮細胞
１．５×１０４個をゲル上に播種した。ＣＯ２インキユ
ベーターで３日間培養後、血清を含まないＭＥＭ培地と
培地交換し、そこへサンプルおよびｂＦＧＦ（２０ｎｇ
／ｍｌ）を添加して培養を続けた。３日後、管腔様構造
の発達程度を顕微鏡により観察した。

【００７３】その結果、管腔形成に対するＭＩＣ値は下
記の表６のとおりであった。

【００７４】

【表６】

【００７５】なお、この際内皮細胞に対してＡ１、Ａ２
とも１０μｇ／ｍｌの濃度で細胞毒性は示さなかった。

【００７６】

【（２）細胞毒性】ウシ頸動脈血管内皮細胞は、１０％
ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭ培地にて培養したものをト
リプシン処理して集めた。マウスリンパ腫ＥＬ−４細胞
は、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ培地にて培養した。 また、マウス線維肉腫Ｍｅｔｈ　　Ａ細胞はＢａｌｂ／
ｃマウス（雌、８週令）腹腔中で継代したものを、１０
％ＦＢＳを含むダルベッコ培地に懸濁した。９６穴マイ
クロタイタープレートの各穴に上記培地に懸濁した細胞
をそれぞれ１×１０４個加え、そこへサンプルを添加し
てＣＯ２インキュベーター中、内皮細胞あるいはＭｅｔ
ｈ　　Ａ細胞の場合は７２時間、ＥＬ−４細胞の場合は
４８時聞培養した後、顕微鏡により細胞の生育を観察し
た。

【００７７】その結果、細胞増殖に対するＭＩＣ値は下
記の表７のとおりであった。

【００７８】

【表７】

【００７９】なお、これらの作用は内皮細胞、Ｍｅｔｈ
　　Ａ細胞に対してはｃｙｔｏｓｔａｔｉｃであったが
、ＥＬ−４細胞に対してはｃｙｔｏｔｏｘｉｃであった
。

【００８０】

【（３）抗菌活性】抗菌活性は、検定菌として細菌を用
いる場合はブイヨン培地を、酵母およびかびを用いる場
合はサブロー培地を使用して、サンプルを希釈した後、
ベーパーディスク−寒天拡散法によってＭＩＣ値を測定
した。その結果を下記の表８に示した。

【００８１】

【表８】

【００８２】

【（４）急性毒性】Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、８週令、
ｎ＝２）を用いた腹腔内投与によるＬＤ１００値はＡ１
が５ｍｇ／ｋｇ、Ａ２が１０ｍｇ／ｋｇであった。また
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、８週令、ｎ＝５）を用いたＡ
２による腹腔内５日間連続投与では、３ｍｇ／ｋｇ以下
の濃度でコントロール並の体重増加がみられた。

【００８３】

【（５）血管新生阻害作用】ｉｎ　　ｖｉｖｏにおける
血管新生阻害作用を鶏胚漿尿膜（ＣＡＭ）法により検討
した。アッセイはＮ．Ｇ．Ｔａｎａｋａらの方法（Ｅｘ
ｐ．Ｐａｔｈｏｌ．３０，１４３，１９８６）に多少の
改良を加えて行った。すなわち３日令の受精卵より卵白
を約３ｍｌ抜き取った後、卵殻に約１ｃｍ四方の小窓を
あけ、卵殻膜を除去してＣＡＭを露出させた。次いで、
小窓をふさいで２日間孵卵後、５日令のＣＡＭ上にシリ
コンリング（内径３ｍｍ、外径５ｍｍ、厚さ１ｍｍ：池
田理化）をのせ、その中にあらかじめＲ．Ｌａｎｇｅｒ
らの方法（Ｎａｔｕｒｅ　　２６３，７９７，１９７９
）により作製しておいた本化合物０．１〜１０μｇを含
む徐放性ペレットを置いた。小窓をふさいでさらに２日
間孵卵後、漿尿膜腔内に適量の１０％脂肪乳剤（イント
ラリポス、ミドリ十字）を注入してＣＡＭ上の血管を見
やすくした後、実体顕微鏡下でサンプルペレットのまわ
りに生じた血管新生阻止ゾーンを観察した。

【００８４】血管新生阻害活性（パーセント）は、試験
された総検体当りの血管新生阻害ゾーンを形成した検体
数として算出した。なお、各群において８〜１０個の受
精卵を用いた。

【００８５】その結果、本化合物は下記表９の第２表に
示すように、いずれも濃度依存的にＣＡＭにおける血管
新生を阻害した。

【００８６】

【表９】

【００８７】

【（６）抗腫瘍活性】マウス線維肉腫Ｍｅｔｈ　　Ａ細
胞をＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週令）腹腔中で継代し
、８日後にその細胞を１×１０５細胞Ｂａｌｂ／ｃマウ
スに皮内移植した。本化合物はｄａｙ０〜３、ｄａｙ６
〜１０およびｄａｙ１３に各濃度で腹腔内投与し、経時
的に腫瘍サイズを測定した。なお、相対的腫瘍重量はＮ
ＣＩ（ＵＳＡ）のマニュアルにより算出した。その結果
を下記表１０の第３表に示した。

【００８８】

【表１０】

【００８９】以上の結果から、ＷＦ１６７７５物質はす
ぐれた血管新生阻害作用及び抗腫瘍作用を有することが
判明した。すなわち、ｉｎ　　ｖｉｖｏ血管新生作用評
価系である鶏卵漿尿膜ａｓｓａｙ系において、Ａ１（０
．５〜５μｇ／ｅｇｇ）およびＡ２（０．２〜２μｇ／
ｅｇｇ）の濃度で阻害し、その強度は強いことが確認さ
れた。

【００９０】また、マウスの固形癌Ｍｅｔｈ　　Ａ（ｉ
ｄ→ｉｐ投与）で１〜３ｍｇ／ｋｇで、腫瘍の増殖の抑
制傾向が認められた。

【００９１】したがって、ＷＦ１６７７５物質は、例え
ば血管新生の阻害や癌の予防治療に有用であることがわ
かった。

【００９２】

【実施例３】下記表１１に示す原料を用いて錠剤を製造
した。

【００９３】

【表１１】

【００９４】すなわち、（１）、（２）及び（３）（但
し１７ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調整した
ペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（
但し５ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を
圧縮錠剤機により圧縮して、１錠あたり有効成分（１）
を５０ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。

【００９５】

【実施例４】下記表１２に示す原料を用いて注射剤を製
造した。

【００９６】

【表１２】

【００９７】すなわち、（１）〜（４）の全成分を蒸留
水１０００ｍｌに溶解した後、アンプルに１ｍｌずつ分
注して、注射剤１０００本を製造した。

【００９８】

【発明の効果】本発明はＷＦ１６７７５−Ａ１及びＡ２
物質（ＦＲ−９０１４４８及びＦＲ−９０１４４９）を
提供するものであるが、これらの物質はすぐれた血管新
生阻害作用を示し、医薬、例えば癌や腫瘍の予防及び／
又は治療剤として、非常に有用である。また、ＦＲ−９
０１４４９物質は新規物質でもあるので、化合物の面か
らも更に新しい発明が展開されることが大いに期待され
る。

【００９９】また、本発明によって、微生物を利用する
上記物質の工業的製法も確立された。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記化１の式Ｉで示される化合物、ＦＲ−
   ９０１４４８物質及び／又はＦＲ−９０１４４９物質、
   を有効成分とすることを特徴とする血管新生阻害剤。 【化１】
2. 【請求項２】　　下記化２の式ＩＩで示されるＦＲ−９
   ０１１４９物質。 【化２】
3. 【請求項３】　　ケトアスボリシア（Ｃｈａｅｔａｓｂ
   ｏｌｉｓｉａ）属に属するＦＲ−９０１４４８物質及び
   ＦＲ−９０１４４９物質生産菌を培養してＦＲ−９０１
   ４４８物質及びＦＲ−９０１４４９物質を生成せしめ、
   これ（ら）を採取することを特徴とするＦＲ−９０１４
   ４８物質及び／又はＦＲ−９０１４４９物質の製造方法
   。
4. 【請求項４】　　下記化３の式Ｉで示される化合物、Ｆ
   Ｒ−９０１４４８物質及び／又はＦＲ−９０１４４９物
   質、を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤。 【化３】