JPH04202137A - イリドイド配糖体の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ジオウの組織培養によりイリドイド配糖体を
生産する方法、およびイリドイド配糖体高生産株を作出
する方法に関する。

（従来の技術） アカヤジオウやカイケイジオウ等のジオウはゴマツバ科
に属する多年草で、根は生薬“地黄゛として用いられて
いる。地黄は血熱などによる出血や湿疹等の治療を目的
に八味地黄丸、当帰六黄湯などの方剤中に配剤される。

また、最も重要な補血薬の１つとして貧血、衰弱等の治
療、改善を目的に十全大補湯、四物湯などに配剤される
。

地黄の成分の化学的研究としては、１９７１年に北用ら
が日本産カイケイジオウの新鮮根から主イリドイド配糖
体としてカタルポールの単離を報告した〔北用勲、西村
正、薬誌９１巻第５９３頁（１９７１））。以来、日本
産カイケイジオウおよびアカヤジオウの新鮮根の含有成
分についての検討が行われている。これまでに糖類、ア
ミノ酸類、イリドイド配糖体、ヨノン配糖体などが知ら
れており、中でもイリドイド配糖体は含量が比較的高く
、地黄の品質評価の指標物質とされている。

地黄のイリドイド配糖体としては、カタルボールが主で
あり、他にレーマンニオシド（ｒｅｈｍａｎｎｉｏｓｉ
ｄｅ　）　Ａ、　Ｂ、　ＣおよびＤ、レオヌリド（Ｉｅ
ｏｎｕｌｉｄｅ）、オークビン（ａｕｃｕｂｉｎ　）等
がある。特にカタルボールは利尿作用や緩和な瀉下作用
が認められ、地黄の有効成分として最近注目されている
。

このように生薬の材料や有効成分の抽出材料として有用
なジオウは、わが国では奈良、長野でわずかに栽培され
ているだけで、そのほとんどを中国や韓国から輸入して
おり、またジオウの栽培は天候に左右される等の欠点が
あるため、安定に供給することが望まれている。

また、アカヤジオウはウィルス罹患率が高く、ウィルス
罹患株はウィルスに感染していない株番土比べてカタル
ポール含量が少ない、あるいはカタルボールを全く産出
しないことが知られている〔西岡五夫、生薬学雑誌、４
２　（１）、１〜１１頁（１９８Ｂ））。

従って、高品質の材料を天候の影響や地域的、季節的な
制約を受けることなく、高効率で安定に供給するため、
組織培養を利用した大量増殖を行うことが考えられるが
、植物体の増殖だけでなく、・　植物体が産生ずる有用
物質の採取をも目的とする場合、次のような問題点があ
る。

組織培養技術を用いて培養細胞を作出し、その植物の２
次代謝産物を培養細胞中に産生させる方法が、医薬品を
中心とした分野で検討されているが、十分な有用物質生
産能を有する培養細胞は、数例を除きほとんどの薬用植
物では得られていない。これは、下記の点に起因すると
考えられる。

・一般に２次代謝物質の生合成系は複雑であり、植物成
長調節物質の添加や他の培養条件により生合成系のある
分野が阻害を受けると、目的物質の産生能は著しく低下
してしまうこと。

・多くの植物の２次代謝物質の産生能は、器官分化との
関連が強く、一般には特定の器官にのみ認められること
が多いのに対し、培養細胞は植物成長調節物質によって
強制的に脱分化させた細胞であり、２次代謝活性のよう
な一種の生理的分化の性質を失っている可能体が強いこ
と。

そのため、植物の器官培養により親植物の２次代謝産物
の生産能を維持した例が、オタネニンジン、ジギタリス
、ニチニチソウではあるが、ジオウについての検討は全
くなされていない。

（発明が解決しようとする課題） 前記のように、植物の組織培養や器官培養により２次代
謝産物の産生量を増加させるのに成功した例もあるが、
２次代謝産物の産生については植物毎にその培養条件に
大きく影響を受け、特定の２次代謝産物の産生能を高め
ることは困難であった。

本発明の目的は、ジオウにおいて組織培養の手法を用い
てイリドイド配糖体、特にカタルボールの生産能を高め
た植物体を得て、これより高効率でイリドイド配糖体を
得ることにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者は、ジオウの植物体を特定の培養条件下での培
養によってイリドイド配糖体高生産株を作出し、イリド
イド配糖体を効率よく得ることができることを見出し、
本発明を完成させた。

即ち、本発明は、ジオウの細胞、組織あるいは器官から
培養によって誘導、成長させた植物体を、植物成長調節
物質としてナフタレン酢酸を０．５〜４ｍｇ／ｌ、炭素
源としてシュークロースを含む第１の培地で培養後、炭
素源としてグルコースを含む第２の培地で培養し、得ら
れた植物体からイリドイド配糖体を回収することを特徴
とする特許イド配糖体の生産方法を要旨とする。

上記方法において、第１の培地での培養後、イリドイド
配糖体高生産能の株を選抜してから、第２の培地で培養
を行えば、より効果的である。

さらに、本発明は、ジオウの細胞、組織あるいは器官か
ら培養によって誘導、成長させた植物体を、植物成長調
節物質としてナフタレン酢酸を０゜５〜４　ｍｇ／　ｌ
　、炭素源としてシュークロースを含む第１の培地で培
養後、炭素源としてグルコースを含む第２の培地で培養
することによりイリドイド配糖体高生産株を作出する方
法にも関する。

本発明において使用する植物は、ジオウであり、その栽
培種としては例えば、アカヤジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉ
ａ　　ｇｌｕｔｉｎｏｓａ　　ＬＩＢ、ｖａｒ、ｐｕｒ
ｐｕｒｅａ　　ＭＡＫＩＮＯ）　　、カイケイジオウ（
Ｒｅｈｍａｎｎｉａ　ｇｌｕｔｉｎｏｓａ　ｈｕｅｉｃ
ｈｉｎｇｅｎｓｉｓ）があるが、その他、イリドイド配
糖体産生能を有する植物であれば特に限定されない。

上記植物は、有効成分としてイリドイド配糖体を含むも
のであり、これは抗糖尿病作用、血液凝固抑制作用、利
尿作用を有する。このイリドイド配糖体は、カタルポー
ルを主成分とし、他にレーマンニオシド（ｒｅｈｍａｎ
ｎｉｏｓｉｄｅ　）　Ａ、　Ｂ、　ＣおよびＤルオヌリ
ド（ｌｅｏｎｕｌｉｄｅ　）　、オークビン（ａｕｃｕ
ｂｉｎ　）を含む。

本発明においては、上記ジオウの細胞、組織あるいは器
官から培養により誘導、成長させた植物体を特定の第１
の培地で培養し、次いで特定の第２の培地で培養するこ
とにより、圃場で栽培された植物体よりもイリドイド配
糖体産生能が大きい植物体を作出でき、この高生産株よ
りイリドイド配糖体、特にカタルポールを高収率で採取
できる。

高生産株の作出のために使用する植物体としては、ジオ
ウの外植片、例えば葉、茎、根等の器官の切片または細
胞から培養により誘導した植物体を使用するため、イリ
ドイド配糖体産生能を維持しているとともに、一定の遺
伝形質をもち、ウィルスフリーの植物体を安定に大量に
供給できるという利点も有する。

外植片からの植物体の誘導について以下に説明する。外
植片としては、これまで使用していた茎、根の他に、葉
を使用することができる。外植片は、例えば洗剤で洗浄
後、流水ですすぎ、ついで次亜塩素酸ナトリウム溶液に
浸漬し、滅菌水ですすぐ等の操作により洗浄、滅菌を行
ったものを使用する。次いで、この外植片を適宜培地上
に置床し、培養を行うことにより植物体を誘導し、さら
に成長させる。

この培養で使用する培地は、通常植物の組織培養に用い
られている培地であればよく、無機成分および炭素源を
含み、必要に応じ植物成長調節物質、ビタミン類、アミ
ノ酸類を添加した培地である。具体的にはムラシゲ・ス
クーグの培地（ＭＳ培地）、リンスマイヤー・スクーグ
の培地、ホワイトの培地、ニッチ・ニッチの培地等の、
無機成分からなる基本培地にシュークロース等の炭素源
、植物成長調節物質、ビタミン類、アミノ酸類を添加し
た培地が例示される。植物成長調節物質にはナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）等のオー
キシン類、ヘンシルアデニン（ＢＡ）、カイネチン等の
サイトカイニン類があるが、ここで植物体の誘導、成長
に用いる培地にはＩＡＡおよびＢＡを添加したものが好
ましい。特に、ＩＡＡおよびＢＡをそれぞれ１ｍｇ／ｌ
程度添加した培地が望ましい。植物体の誘導、成長に用
いる培地としては、寒天やゼラチンを０．５〜１％添加
した固形培地が好ましい。

培養条件は特に限定されないが、通常、温度１０〜４０
’Ｃ１照明下で行う。

上記培地および培養条件下で培養後、２週間〜２箇月、
通常１箇月程度で植物体が誘導される。

さらに培養を続け、１〜３箇月、通常２箇月程度で植物
体が約２〜３ｃｍに成長する。

このようにして得られた植物体から、次の方法でイリド
イド配糖体高生産株を作出する。

まず、植物成長調節物質としてＮＡＡｏ、５〜４ｍｇ／
］、炭素源としてシュークロースを含有する第１の培地
において植物体の培養を行う。

第１の培地の具体例としては前述のＭＳ培地等の基本培
地に、植物成長調節物質としてＮＡＡを０．５〜４　ｍ
ｇ／　ｌ　、炭素源としてシェークロースを。

１〜１０％、好ましくは約３％添加したものである。

必要に応じ、ビタミン類、アミノ酸類を添加してもよい
。

培養条件は特に限定されないが、通常、温度１゜翳１（
Ｌｌ＄ 〜４０°Ｃ，量孝２５°Ｃで、３〜６週間程度培養する
。

後述の実施例で示すように、培地中に植物成長調節物質
としてＮＡＡを０．５〜４ｍｇ／ｌ含有する場合に、他
の植物成長調節物質添加の場合に比べ、集中のイリドイ
ド配糖体含有量が高い。

ここで、葉中のイリドイド配糖体の含有量が特に高いイ
リドイド配糖体高生産株を選抜して次の培養に供すると
、本発明の目的により適した高生産株が最終的に得られ
る。

第２の培地は、炭素源としてグルコースを含有すること
を特徴とする特にグルコース３〜７％の濃度で含有する
場合にイリドイド配糖体の生産が良好である。具体的に
は、前述と同様のＭＳ培地等の基本培地に炭素源として
グルコースを添加、し、必要に応じ植物成長調節物質、
ビタミン類、アミノ酸類等を添加したものである。植物
成長調節物質としてＮＡＡを第１の培地と同様０．５〜
４ｍｇ／ｌ添加するとより好ましい。

培養は前記第１の培地による培養と同様に行い、培養期
間は通常６〜８週間程度である。

後の実施例において示すように、炭素源としてグルコー
スを用いた場合、グルコース濃度３〜７％で葉中のカタ
ルボール含有量は約３０〜５０Ｂ／　１であり、他の炭
素源を用いて培養した場合、および圃場で栽培したもの
の相中の含有量に比べ著しく高含有量である。最初から
グルコースをふくむ培地で培養すると、成育が悪い。

植物体からのイリドイド配糖体の採取は、葉、根、茎等
より次のような抽出方法により行う。例えば、刻んだ試
料にアセトニトリル：水（２：８）混液を加え、３０分
程度超音波抽出を行う。ジエチルエーテルで数回洗浄後
、遠心分離により得た上澄みをフィルターで濾過してイ
リドイド配糖体含有液を得る。

実施例 植生体生誘盪 アカヤジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ　ｇｌｕｔｉｎｏｓ
ａ　ＬＩＢ、ｖａｒ。

ｐｕｒｐｕｒｅａ　ＭＡＫＩＮＯ）の葉を中性洗剤で洗
浄後、流水でよくすすぎ、次いで有効態塩素１％の次亜
塩素酸ナトリウム溶液に２０分間浸漬し、クリーンベン
チ内で滅菌水により３回洗浄した。この葉を１ｃｍ角に
カミソリで切断し、ＭＳ基本培地にシュークロース３％
、Ｉ　Ａ　Ａ　１　ｍｇ／　Ｉ、ＢＡ１ｍｇ／ｌおよび
寒天０．８培養添加した培地に置床した。

培養は２５°Ｃで白色蛍光灯の連続照明（約２５００　
ＬＵＸ）下で行った。培養約１箇月後、カルスより植物
体が誘導され、さらに２箇月培養を続けると約３ｃｍの
植物体に成長した。

−Ｊ１の１立ｌによるｌ立１ 上記で得られた植物体を、ＭＳ基本培地に植物成長調節
物質としてＮＡＡを０．５〜５　ｍｇ／ｌ　、炭素源と
してシュークロースを３％添加した培地に移植し培養を
■週間行った。比較のためにＮＡＡに代えてＩＡＡを０
．５〜５’ｍｇ／ｌ添加した培地においても培養を行っ
た。

培養８週間後、得られた植物体の葉よりカタルボールを
抽出した。抽出は次のように行った。即ち、刻んだ試料
１ｇにアセトニトリル：水（２：８）混液を加え、３０
分間超音波抽出を行った後、ジエチルエーテルで３回洗
浄し、３５’００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。得
られた上澄み２ｍｌを０．４５ｍのフィルターで濾過し
てイリドイド配糖体含有溶液を得た。

得られた植物体の葉中のカタルボール含量を高速液体マ
イクログラフィーを用いて調べた結果を第１図に示す。

同図より明らかなように、ＮＡＡ濃度が０．５〜４　ｍ
ｇ／　ｌの場合、葉中のカタルボール含有量は１〜５ｍ
ｇ／ｌと良好であり、ＩＡＡを用いた場合は約半分の含
量であった。また、ＮＡＡ、ＩＡＡともに濃度が５ｍｇ
／ｌを超えるとカタルボールの生産はみられない。

ここで、葉中のカタルボール含有量が高い、カタルボー
ル高生産株を高速液体クロマトグラフィーで含有量を測
定し、選抜した。

ｌ立　　　−１立 前記で得たカタルボール高生産株を、ＭＳ培地に植物成
長調節物質としてＮＡＡ　１〜２ｍｇ／ｌ、炭素源とし
てグルコースを添加した培地に移植して８週間培養した
。比較のために炭素源をシュークロース、ガラクトース
、フラクトース、マンノース、マルトースに代えた培地
にも移植して培養した。

得られた植物体の葉中のカタルポール含有量を調べた結
果、ガラクトース、フラクト−ス、マンノース、マルト
ースを使用した場合はかなり低い。

本発明のグルコース添加の場合と、植物体の組織培養に
普通使用するシュークロースを添加した場合のカタルボ
ール含有量について第２図に示す。

同図より明らかなように、グルコースを添加した培地で
は、シュークロース添加の場合および圃場栽培の場合に
比較し、全般的にカタルポール含有量が増加し、特にグ
ルコース濃度３〜７％で効果が大きいことが判る。即ち
、シュークロース添加培地の場合に比べ８〜１０倍の生
産量であり、圃場栽培のアカヤジオウの相中のカタルポ
ール含有量の約４（＠の値であるというように、非常に
高い含有量である。

（発明の効果） 以上詳述したように、本発明によれば、圃場の栽培に比
ベイリドイド配糖体高生産性の植物体を作出でき、この
イリドイド配糖体高生産株よりイリドイド配糖体を抽出
して採取すれば、通常の栽培に比べ極めて短期間でしか
も高収率でイリドイド配糖体を大量に得ることができ、
非常に効率がよい。

【図面の簡単な説明】

第１図は、第１の培地で培養後カタルボール含有量を測
定した結果を示す図であり、 第２図は、第２の培地で培養後カタルボール含有量を測
定した結果を示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジオウの細胞、組織あるいは器官から培養により
   誘導、成長させた植物体を、植物成長調節物質としてナ
   フタレン酢酸を０．５〜４ｍｇ／ｌ、炭素源としてシュ
   ークロースを含む第１の培地で培養後、炭素源としてグ
   ルコースを含む第２の培地で培養し、得られた植物体か
   らイリドイド配糖体を回収することを特徴とするイリド
   イド配糖体の生産方法。
2. （２）第１の培地での培養後、イリドイド配糖体高生産
   株を選抜してその後の培養に使用する請求項１記載の生
   産方法。
3. （３）ジオウの葉より器官培養により誘導、成長させた
   植物体を用いる請求項１または２記載の生産方法。
4. （４）イリドイド配糖体の回収を植物体の葉より行う請
   求項１ないし３のいずれかの項記載の生産方法。
5. （５）ジオウの細胞、組織あるいは器官から培養により
   誘導、成長させた植物体を、植物成長調節物質としてナ
   フタレン酢酸０．５〜４ｍｇ／ｌを、炭素源としてシュ
   ークロースを含む第１の培地で培養後イリドイド配糖体
   高生産株を選抜し、次いでこれを、炭素源としてグルコ
   ースを含む第２の培地で培養することによりイリドイド
   配糖体高生産株を得ることを特徴とする、イリドイド配
   糖体高生産株の作出方法。