DE68916407T2

DE68916407T2 - Zuchtverfahren für pflanzliche gewebe.

Info

Publication number: DE68916407T2
Application number: DE68916407T
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Hishinuma; Tadashi Matsunaga; Mayumi Ono; Hironori Umetsu; Hitoshi Wake
Original assignee: Pentel Co Ltd
Current assignee: Pentel Co Ltd
Priority date: 1988-07-27
Filing date: 1989-07-25
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2009-07-26
Also published as: EP0525914B1; DE68916407D1; WO1990000855A1; EP0380692A1; DE68926054T2; EP0380692A4; EP0380692B1; DE68926054D1; EP0525914A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Pflanzengewebekultur. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Pflanzengewebekultur, das die Kultivierung eines Gewebes oder eines Organs einer Pflanze, eines Teils hiervon oder von kultivierten Zellen umfaßt, um das Gewebe, das Organ oder die kultivierten Zellen zu proliferieren, wodurch ein Pflanzenkörper regeneriert wird oder eine von dieser Pflanze gebildete brauchbare Substanz produziert wird.
Bei der Kultivierung von Pflanzengewebe werden allgemein ein Gewebe oder ein Organ einer Pflanze, ein Teil hiervon oder kultivierte Zellen unter Verwendung eines Mediums kultiviert, das ein Pflanzenhormon (wie Auxin, Cytokinin, Gibberellin, Ethylen usw.) zusätzlich zu den Nährstoffen enthält, die für das Wachstum von Pflanzen essentiell sind (wie anorganische Salze, Vitamine, Zucker usw.), um Kallusse zu bilden, die anschließend mehrere Generationen lang kultiviert werden, wodurch eine nutzbare Substanz produziert wird, oder der ursprüngliche Pflanzenkörper hieraus regeneriert wird.
Verfahren zur Regenerierung eines Pflanzenkörpers durch Pflanzengewebekulturtechnologie können in zwei Arten klassifiziert werden, d. h. Differenzierung und Entdifferenzierung, entsprechend der Art des verwendeten Ausgangsmaterials. Das Verfahren der Entdifferenzierung regeneriert einen Pflanzenkörper über den entdifferenzierten Zustand der Kallusse oder der flüssigkultivierten Zellen. Typische Beispiele umfassen das Verfahren zur Entwicklung vieler Sprosse aus Cluster-Kallussen und die Entwicklung von Wurzeln aus jedem Sproß (shoot), wodurch ein juveniler Pflanzenkörper regeneriert wird, und das Verfahren der direkten Bildung von Adventivembryos (somatischen Embryos) in Zellen, wodurch ein juveniler Pflanzenkörper regeneriert wird. Es ist bekannt, daß, wenn ein Pflanzenkörper über Adventivembryos regeneriert wird, die Embryos zu kugelförmigen, herzförmigen, torpedoförmigen und reifen Embryos, in dieser Reihenfolge, wachsen. Andererseits verwenden die Verfahren zur Differenzierung als Ausgangsmaterial Sproßspitzen, ruhende Keime, laterale Keime, Embryos und Keimlinge, die Wachstumspunkte enthalten, und ebenso Hypocotyle, Cotyledonen und Stämme, die keinen Wachstumspunkt enthalten. Ein typisches Beispiel ist das Verfahren, das die Entwicklung mehrerer Sprosse aus den oben genannten Pflanzengeweben, das Abschneiden dieser mehreren Sprossen, das Entwickeln mehrerer Sprosse aus den oben genannten Pflanzengeweben, das Abschneiden dieser mehreren Sprosse, das Entwickeln mehrerer Sprosse aus jedem derart erhaltenen einzelnen Sproß und schließlich das Entwickeln von Wurzeln aus jedem der abgeschnittenen Sprosse umfaßt, wodurch ein juveniler Pflanzenkörper regeneriert wird.
Bei der Regenerierung eines Pflanzenkörpers durch Entdifferenzierung neigt die Zellkultivierung für mehrere Generationen über einen langen Zeitraum dazu, die Fähigkeit zur Differenzierung zu verringern, was zu einer verringerten Bildungsrate von Adventivembryos aus kultivierten Zellen und einer verringerten Bildungsrate von Sprossen und Wurzeln aus Kallussen führt. Wenn Adventivembryos künstlich abgeleitet werden, ist es allgemein üblich, die Art, die Konzentration und die Kombination von Pflanzenhormonen (wie Auxin und Cytokinin), die zum Kulturmedium zugegeben werden, von der Zusammensetzung der anorganischen Salze ganz zu schweigen, zu untersuchen. Es gibt jedoch viele Arten von Pflanzen, bei denen die Bildung von Adventivembryos und die Bildung von Sprossen und Wurzeln aus Kallussen durch die bloße Behandlung mit Auxin oder Cytokinin nicht erwartet werden können. Insbesondere Adventivembryos tendieren dazu, ihr Wachstum auf der Stufe der Torpedoform einzustellen, wodurch die Redifferenzierungsrate des Pflanzenkörpers signifikant verringert wird. Auch bei der Regenerierung eines Pflanzenkörpers durch Differenzierung wurden Untersuchungen durchgeführt, die die Art, die Konzentration und die Kombination von Pflanzenhormonen (wie Auxin und Cytokinin), von anorganischen Salzen und organischen Spurenelementen, die zum Kulturmedium zugegeben werden, betrafen; es sind jedoch Fälle bekannt, bei denen keine Bildung von Sprossen und Wurzeln beobachtet wurde, wobei dies von der Pflanzenart und von der Gewebeart abhängt. Sowohl bei der Differenzierung als auch bei der Entdifferenzierung hemmt die Verwendung von Pflanzenhormonen in einigen Fällen das Wachstum und die Differenzierung, in Abhängigkeit von der Art und von der zugegebenen Menge des Hormons. Demnach bestand ein Bedürfnis für ein verbessertes Verfahren, das die Bildungsrate von Adventivembryos aus verschiedenen Pflanzengeweben, Organen oder kultivierten Zellen erhöht, und das das Wachstum von Adventivembryos und die Regenerierung eines Pflanzenkörpers wirksam beschleunigt.
Natürliche organische Verbindungen, die von Pflanzen produziert werden, beispielsweise Alkaloide, Terpenoide und verschiedene Pigmente, werden seit langem in großem Umfang als Arzneimittel und Nahrungsmittel eingesetzt. Um diese nützlichen Substanzen zu erhalten, machte man sich lange Zeit die Extraktion aus natürlich gewachsenen oder kultivierten Pflanzen zu eigen; dies ist jedoch kein effizientes Verfahren, um eine große Menge der nützlichen Substanzen zu erhalten, da die Masse und die Natur der Pflanzen stark von den natürlichen Bedingungen beeinflußt werden und viel Arbeit und Zeit erforderlich sind, um die Pflanzen zu ernten. In den vergangenen Jahren werden die planmäßige und stabile Produktion dieser nützlichen Substanzen durch Massenkultivierung von Pflanzenzellen, basierend auf der Pflanzengewebekulturtechnologie, durchgeführt. Bei der Durchführung dieses neuen Verfahrens ist es erforderlich, kultivierte Zellen, die eine nützliche Substanz enthalten, schnell wachsen zu lassen. Es sind jedoch tatsächlich viele Fälle bekannt, in denen überhaupt keine nützlichen Substanzen produziert werden oder die Menge der Produkte sehr gering ist, und zwar in Abhängigkeit von der verwendeten Zusammensetzung des Kulturmediums. Demnach besteht in derartigen Fällen ein Bedürfnis für ein verbessertes Verfahren, das die Produktion nützlicher Substanzen beschleunigt.
Weiterhin wurde ein verstärktes Augenmerk auf die Entwicklung synthetischer Samen als ein Verfahren zur Kultivierung von geklonten Pflanzen in großen Mengen durch die Pflanzengewebekulturtechnologie gerichtet, und mit verschiedenen Arten von Pflanzen, beispielsweise Gemüse- und Reispflanzen, wurden praktische Anwendungen versucht. Synthetische Samen umfassen pflanzenregenerierende Gewebe wie Adventivkeime oder -embryos, die in einem synthetischen Eiweiß und in einer synthetischen Membran eingebettet und umschlossen sind. Das synthetische Eiweiß umfaßt Substanzen, die das pflanzenregenerierende Gewebe mit Nahrung versorgen und die Keimung regulieren. Calciumalginat wird z. Zt. als das beste Material für die synthetische Membran angesehen. Es wurde jedoch auch die Verwendung vieler anderer polymerer gelatierender Mittel untersucht. Um die Keimungsrate in einem derartigen synthetischen Samen zu erhöhen, wurde ebenfalls die Zugabe von Abscisinsäure (ein Pflanzenhormon) zum synthetischen Eiweiß beschrieben. Es wird jedoch nicht immer eine Zunahme in der Keimungsrate beobachtet, da die Auflösung und die Diffusion dieser Säure in Wasser eine lange Zeit benötigen. Weiterhin wurde ebenfalls eine Technik zur Zugabe eines Zuckers oder einer ähnlichen Verbindung in einer hohen Konzentration zum synthetischen Eiweiß vorgeschlagen; diese Vorgehensweise fördert jedoch die Proliferation unerwünschter Bakterien und hemmt in einigen Fällen das Wachstum von Pflanzen. Demnach würden die praktischen Verwendungen von synthetischen Samen weiter gefördert werden, falls das Wachstum von pflanzenregenerierenden Geweben wie von Adventivembryos in synthetischen Samen beschleunigt werden könnte, um die Keimungsrate zu erhöhen.
Beispielsweise wird auf eine Veröffentlichung mit dem Titel "Effect of the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii on growth and biosynthetic activity of Solanum laciniatum cells grown in mixed culture", (vgl. Chem. Abs., 104, 7, 325, 48786α) hingewiesen.
Es ist eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Pflanzengewebekultur bereitzustellen, das Pflanzengewebe oder kultivierte Zellen ohne Verwendung irgendeines Pflanzenhormons, das das Wachstum und die Differenzierung von Pflanzen hemmen könnte, wirksam proliferieren oder differenzieren kann.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Pflanzengewebekultur bereitzustellen, das die Regenerierung eines Pflanzenkörpers aus Pflanzengeweben oder kultivierten Zellen wirksam fördern kann.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Pflanzengewebekultur bereitzustellen, das Pflanzenzellen, die in der Lage sind, nützliche Substanzen zu produzieren, wachsen oder proliferieren lassen kann, wodurch die Produktion dieser Substanzen beschleunigt wird.
Zur Lösung dieser Aufgaben wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Pflanzengewebekultur bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Kultivierung wenigstens eines Teils eines Pflanzengewebes, wenigstens eines Teils eines Pflanzenorgans oder von kultivierten Zellen hiervon in einem Kulturmedium umfaßt, das ein Kulturfiltrat und/oder einen Extrakt aus einem photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthält.
Zur Vermeidung von Zweifeln wird darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung die Kultivierung von Zellen oder von Geweben umfaßt, die bereits durch herkömmliche Verfahren vorkultiviert wurden.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das Wachstum von Pflanzengeweben, Organen und kultivierten Zellen, die Bildung von Adventiv-Embryos, die Regenerierung eines Pflanzenkörpers und die Produktion nützlicher Substanzen wirksam zu beschleunigen.
Als Beispiele für photosynthetische prokaryotische Mikroorganismen können die Stämme von Cyanobakterien [wie sie von R. Rippka und R.Y. Stanier, J. Gen. Microbiol., 111, 1-61 (1979) klassifiziert wurden] und photosynthetische Bakterien genannt werden.
Beispiele für Cyanobakterien umfassen Chlorogloeopisis sp., Dermocarpa sp., Nostoc sp., Synechococcus sp., Oscillatoria sp. und ähnliche Arten. Beispiele, die diese Bakterien veranschaulichen, umfassen Chlorogloeopisis sp. ATCC 27181, Dermocarpa sp. ATCC 29371, Nostoc sp. ATCC 27895, Synechococcus sp. ATCC 27192, ATCC 29404, ATCC 29534 und ATCC 27170, und Oscillatoria sp. ATCC 27906.
Beispiele für photosynthetische Bakterien umfassen Halobacterium sp., Rhodopseudomonas sp., Rhodospirillum sp. und ähnliche Arten. Beispiele, die diese Bakterien veranschaulichen, umfassen H. cutirubrum ATCC 33170, H. mediterranei ATCC 33500, H. saccharovorum ATCC 29252, H. salinarium ATCC 19700, H. sodomense ATCC 33755, R. acidophila ATCC 25092, R. rutila ATCC 33872, R. spheroides ATCC 17024, R. viridis ATCC 19567, R. blastica ATCC 33485, R. molischianum ATCC 14031, R. photometricum ATCC 27871, R. rubrum ATCC 277 und ATCC 17031, und R. tenue ATCC 25093.
Zusätzlich zu den oben genannten Mikroorganismen können erfindungsgemäß auch Varianten und Mutanten hiervon und verschiedene photosynthetische prokaryotische Mikroorganismen, die aus der Natur isoliert wurden, z. B. aus Salzwasser- oder Frischwasserquellen, ebenfalls verwendet werden.
Die photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismen können unter Verwendung eines Mediums, das anorganische Salze und andere Nährstoffe enthält, in einem Behälter kultiviert werden, oder außerhalb unter Verwendung von Sonnenlicht, um hierdurch eine Kulturlösung zu erhalten. Falls die Mikroorganismen reichlich in der Natur vorkommen, kann die Salzwasser- oder Frischwasserquelle, die die Mikroorganismen enthält, als Kulturlösung verwendet werden.
Das Kulturfiltrat des photosynthetischen Mikroorganismus kann durch Filtration oder durch Zentrifugation der Kulturlösung, die durch das oben genannte Kultivierungsverfahren erhalten wurde, erhalten werden. Wenn die biologische Aktivität des so erhaltenen Kulturfiltrats zu gering ist, kann es unter verringertem Druck konzentriert werden. Wenn die Salzkonzentration im konzentrierten Kulturfiltrat zu hoch wird, wird bevorzugterweise das konzentrierte Kulturfiltrat nach der Entsalzung verwendet, bis kein nachteiliger Einfluß auf die Pflanzengewebe mehr beobachtbar ist.
Der Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus wird dadurch erhalten, daß die Mikrobenzellen oder die in geeigneter Weise zerstörten Mikrobenzellen mit einem geeigneten Lösungsmittel bei Umgebungstemperatur oder bei einer erhöhten Temperatur in Kontakt gebracht werden. Es kann ein einzelnes Lösungsmittel oder eine Kombination von Lösungsmitteln verwendet werden, und es kann in Abhängigkeit des Falles ausgewählt werden; im allgemeinen werden jedoch wäßrige Lösungsmittel bevorzugt. Typische Beispiele für derartige wäßrige Lösungsmittel umfassen Wasser und wäßrige Lösungen von Säuren, Basen, Salzen und organischen Lösungsmitteln. Die Mikrobenzellen können mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Ether und ähnlichen Verbindungen extrahiert werden, gefolgt von der Entfernung des Lösungsmittels und der Auflösung des Rückstandes in Wasser. In der vorliegenden Erfindung kann ein wie oben hergestellter Extrakt, eine Fraktion, die aus dem Extrakt erhalten wurde, oder eine in geeigneter Weise konzentrierte oder verdünnte Lösung verwendet werden, die aus dem Extrakt oder der Fraktion erhalten wurde. Weiterhin kann ein Pulver, das dadurch erhalten wurde, daß der Extrakt oder die Fraktion einer Vakuumtrocknung, einer Gefriertrocknung oder einer Sprühtrocknung unterzogen wurde, verwendet werden. Eine Fraktion mit einer hohen Aktivität kann aus dem Extrakt dadurch erhalten werden, daß er einer Dialyse, einer Gelfiltration, einer Ultrafiltration oder einem anderen Reinigungsverfahren unterworfen wird, das gereinigte Produkt auf der Basis des Molekulargewichts fraktioniert wird und eine aktive Fraktion ausgewählt wird.
Es wurde gefunden, daß basische Substanzen, die aus dem oben genannten Kulturfiltrat oder Extrakt photosynthetischer prokaryotischer Mikroorganismen durch Fraktionierung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels isoliert wurden, eine besonders hohe biologische Aktivität aufweisen. Dieser Fraktioniervorgang kann auf der Grundlage der Theorie und des Verfahrens durchgeführt werden, die auf den S. 25-31 in "Isolation and Purification of Substances" (herausgegeben 1976 von der University of Tokyo Press) beschrieben wurden. Bei der normalen Vorgehensweise in diesem Verfahren wird eine wäßrige Lösung einer Probe auf pH 3 durch Zugabe einer Säure, beispielsweise von Salzsäure, eingestellt und anschließend mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel behandelt, um die sauren Substanzen zu extrahieren und zu entfernen. Anschließend wird die entstandene wäßrige Schicht auf pH 12 durch Zugabe einer Alkaliverbindung, z. B. Natriumhydroxid, eingestellt, und es wird ein geeignetes organisches Lösungsmittel zugegeben, um die basischen Substanzen zu extrahieren. Die Extraktion kann jedoch bei verschiedenen pH-Werten und unter anderen Bedingungen durchgeführt werden. Als Lösungsmittel werden häufig Ethanol, Chloroform, Ethylacetat, Butanol und ähnliche Verbindungen verwendet; es sind jedoch auch viele andere Lösungsmittel verwendbar. Die Fraktion aus basischen Substanzen, die oben erhalten wurde, kann ebenfalls vom Lösungsmittel befreit werden, gefolgt von einer Auflösung in Wasser zur Verwendung.
Die wirksame Menge des Kulturfiltrats und/oder des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus, der zu einem Grundmedium für die Pflanzengewebekultur zugegeben wird, kann mit der Art des verwendeten Mikroorganismus, den Kulturbedingungen, der Konzentration des Extraktes und anderen unbestimmten Faktoren (wie den Veränderungen in der Rückgewinnungsrate des aktiven Bestandteiles und im Volumen der Lösung nach dem Fraktionierschritt) variieren; sie kann jedoch leicht durch Versuche bestimmt werden. Wenn beispielsweise Synechococcus sp. ATCC 27192 oder Rhodopseudomonas blastica ATCC 33485 als photosynthetischer prokaryotischer Mikroorganismus verwendet wird, kann ein um das 100fache konzentriertes Kulturfiltrat oder ein Extrakt, hergestellt durch Extrahieren von 3 g getrockneter Mikrobenzellen mit 100 ml des Extraktionslösungsmittels, zum Grundmedium auf eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 20% zugegeben werden. Höhere Konzentrationen können in einigen Fällen verringerte Wirkungen ergeben.
Die Grundkulturmedien, zu denen das Kulturfiltrat und/oder der Extrakt der photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismen zugegeben wurden, und die Kultivierungsmethoden, die allgemein zur herkömmlichen Pflanzengewebekultur verwendet werden, können ebenfalls in dieser Erfindung verwendet werden. Das Medium von Murashige und Skoog (1962) (im folgenden als "MS-Medium" abgekürzt) kann als typisches Grundmedium verwendet werden; von Fall zu Fall können jedoch auch viele andere Medien verwendet werden, die zur Pflanzenkultur geeignet sind, wobei auch Modifikationen dieser Medien verwendbar sind. Zusätzlich zum Kulturfiltrat oder zum Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus können auch Pflanzenhormone, Kokosnußmilch, Casein-Abbauprodukte und Hefeextrakt, die bei der herkömmlichen Kultivierung verwendet werden, erforderlichenfalls zum Medium zugegeben werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf beliebige Pflanzenarten angewandt werden, die totipotent sind und eine Gewebekultur zulassen. Gewebe, Organe, Teile hiervon oder kultivierte Zellen dieser Pflanzen können einer Kultivierung unterworfen werden, und erfindungsgemäß können auch solche verwendet werden, die einer Primärkultur oder einer Passagenkultur unterzogen wurden.
Die nachfolgenden Beispiele werden die Erfindung weiter veranschaulichen. In den Beispielen bedeutet die Beschreibung "%" "% w/v".
Die Herstellung von Karottenkulturzellen, Kultivierung ihrer Adventivembryos und die Herstellung des Kulturfiltrats und des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus wurden wie unten beschrieben ausgeführt.

(I) Herstellung von Karottenkulturzellen und Kultivierung ihrer Adventivembryos:

Hypocotyle, die aus sterilen Samen der Karotte (Daucus carota L. cv. Kurodagosun) bis zu einer Länge von etwa 10 cm wuchsen, wurden in Stücke von etwa 1 cm Länge geschnitten, und diese Stücke wurden in einem modifizierten MS-Medium (MS-Medium mit 3% Sucrose und 1 mg/l 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, die eine Art von Auxin ist), die hierzu zugegeben wurden, pH 5,5 bis 5,7) bei 25ºC unter Dunkelbedingungen kultiviert. Nach der Kultivierung für etwa einen Monat wurden die kultivierten Gewebe auf ein neues Medium übertragen, das 2,4-D in einer verringerten Konzentration von 0,11 mg/l enthielt, und einer Schüttelkultur unter Verwendung eines Schüttelapparates, der sich 90 mal pro Minute vor- und zurückbewegte, unterworfen. Anschließend wurde die Überführung in ein neues Medium, das 0,11 mg/l 2,4-D enthielt, in einwöchigen Intervallen wiederholt, um Karottenkulturzellen herzustellen.
Es ist bekannt, daß kultivierte Karottenzellen in der Lage sind, durch morphologische Differenzierung Adventivembryos zu bilden. Demnach wurden die oben erhaltenen kultivierten Zellen in MS-Medium (Grundmedium, enthaltend kein 2,4-D) kultiviert, um Adventivembryos herzustellen.

II) Herstellung von Kulturfiltrat und Extrakt aus einem photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus:

Synechococcus sp. ATCC 27192 wurde als Cyanobakterienstamm und Rhodopseudomonas blastica ATCC 33485 wurde als photosynthetischer Mikroorganismusstamm verwendet. Jeder dieser zwei Stämme wurde unter den Bedingungen, die von der American Type Culture Collection angegeben waren, kultiviert; die so entstandene Kulturlösung wurde einer Zentrifugalfiltration unterzogen, und das Filtrat wurde unter Verwendung eines Verdampfers auf das 100fache konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend in einem Entsalzer vom mosaikbeschickten Membrantyp entsalzt (Desaltion DS-103; Tosoh Co., Ltd.), gefolgt von einer Filtration durch einen 0,45 um-Membranfilter; anschließend wurde das so erhaltene Filtrat als Kulturfiltrat des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus verwendet. Getrennt wurden Mikrobenzellen aus der oben erhaltenen Kulturlösung gesammelt, gefriergetrocknet und in Wasser auf eine Konzentration von 3% suspendiert. Diese Suspension wurde bei 100ºC 60 Min. lang erhitzt, um die Extraktion zu bewirken, und sie wurde anschließend zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde über ein 0,45 um-Membranfilter filtriert, und das so erhaltene Substrat wurde als Extrakt eines photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus verwendet.

Beispiel 1: Proliferierung von kultivierten Karottenzellen

Die oben in (I) hergestellten kultivierten Karottenzellen wurden in einer Schüttelkultur bei 25ºC unter Dunkelbedingungen für 12 Tage in MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose und 0,11 mg/l 2,4-D, und in einem modifizierten Medium hiervon (weiterhin enthaltend 1% des oben (II) hergestellten Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus) kultiviert, und die Zahl der gewachsenen Zellen wurde bestimmt. Das Ergebnis ist in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Additiv Zahl der Zellen pro am Tag am Tag Keines Cyanobakterien Photosynthetische Bakterien
Anmerkung:
*¹ Die Zahl der Zellen wurde wie unten beschrieben gemäß dem auf S. 38 in "Technology of Plant Tissue Culture" (1983; Takeuchi, Nakajima und Furuya; Asakura-shoten) beschriebenen Verfahren bestimmt.
Das Schütteln wurde bei 30ºC 60 Min. lang (Amplitude: 7 cm; Schüttelfrequenz: 90 pro Min.) unter Verwendung von 2% Cellulase Onozuka R-10, 1% Macerozym R-10, 2% Driselase, 0,5% CaCl&sub2;·2H&sub2;O und 0,7 M Mannitol fortgeführt, mit nachfolgendem Schütteln bei einer Schüttelfrequenz von 50 pro Min. für 90 Min., und die Zahl der freigesetzten Protoplasten wurde unter Verwendung eines Hämocytometers mit einer Tiefe von 0,1 mm bestimmt.

Beispiel 2: Regenerierung des Pflanzenkörpers aus kultivierten Karottenzellen

Die oben in (I) hergestellten kultivierten Karottenzellen wurden bei 25ºC unter Dunkelbedingungen für 30 Tage in MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose, und in einem modifizierten Medium hiervon (weiter enthaltend 1% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus) in einer Schüttelkultur kultiviert, und die so erhaltenen Adventivembryos wurden am 10., 20. und 30. Tag kontrolliert. Das Ergebnis ist in der Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Additiv Bildungsrate von Adventivembryos Keimungs- und Wurzelungsbedingungen Kulturperiode (Tage) am Tage am Tage am Tag Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt
Anmerkungen:
*² Bildungsrate von Adventivembryos: die Zahl der Adventivembryos, dividiert durch die Zahl der Gesamtzellen oder der Zellaggregate.
*³ Erklärung der Symbole:
o: morphologische Veränderungen der Adventivembryos (Keimung und Wurzelung) und das Wachstum waren je schnell.
X: Es wurde keine schnelle morphologische Veränderung der Adventivembryos beobachtet.

Beispiel 3: Regenerierung des Pflanzenkörpers von Adventivembryos der Karotte

Die oben in (I) hergestellten Adventivembryos wurden unter Verwendung von 148 um- und 200 um-Nylonsieben ausgewählt, und die so ausgewählten Proben (kugelförmige bis torpedoförmige Embryos) mit einer Größe von 148 bis 200 um wurden in diesem Beispiel verwendet. Diese Adventivembryos wurden einer Schüttelkultur bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16 Stunden) über einen Zeitraum von 30 Tagen in MS-Medium, das kein Pflanzenhormon enthielt, und in einem modifizierten Medium hiervon (enthaltend 1,5% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus), unterzogen und die Beschaffenheit der entstandenen Adventivembryos wurde untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle 3(1) angegeben. Tabelle 3(1) Additiv Beschaffenheit der Adventivembryos kultiviert für 30 Tage Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt
Anmerkung:
*&sup4; Erklärung der Symbole:
X: Es wurde kaum ein Wachstum der Embryos beobachtet.
Δ: Es wurde innerhalb des obigen Zeitraums keine Regenerierung des Pflanzenkörpers beobachtet, obwohl ein Wachstum der Embryos beobachtet wurde.
: Es wurde eine Regenerierung des Pflanzenkörpers bis zu den reifen Embryos hin beobachtet.
Weiterhin wurden, wie unten beschrieben wird, die Wirkungen der Fraktionen mit dem hohen Molekulargewicht und mit dem niedrigen Molekulargewicht, die im Kulturfiltrat und im Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthalten sind, auf die Regenerierung des Pflanzenkörpers untersucht. Das Kulturfiltrat und der Extrakt des oben in (II) hergestellten photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus (je 50 ml) wurden gegen 1 l destilliertes Wasser durch ein Celluloserohr zur Dialyse ("Cellulose Tube 30/32" der Fa. VISKASE Inc.) dialysiert, und das so erhaltene Dialysat wurde als die Fraktion mit dem hohen Molekulargewicht verwendet, während die Außenlösung (die Lösung, die durch das Celluloserohr nach außen diffundierte) unter reduziertem Druck auf 50 ml konzentriert wurde, und das so erhaltene Konzentrat wurde als die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht verwendet. Andererseits wurden die oben in (I) hergestellten Adventivembryos unter Verwendung von 425 um- und 800 um-Nylonsieben ausgewählt. Die so erhaltenen Proben mit einer Größe von 425 um bis 800 um wurden einer Schüttelkultur bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16 Std.) über einen Zeitraum von 10 Tagen in MS-Medium, enthaltend kein Pflanzenhormon, und in einem modifizierten Medium hiervon, enthaltend 200 ug/ml der Fraktion mit dem hohen Molekulargewicht oder der Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht, die im Kulturfiltrat oder im Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthalten waren, unterzogen, und die Regenerierungszustände des Pflanzenkörpers wurden beobachtet. Das Ergebnis ist in der Tabelle 3(2) angegeben. Tabelle 3(2) Additiv Gesamtzahl der Embryos Unreife Pflanze Zahl Menge Reife Pflanze Zahl Menge Keines Cyanobakterien Extrakt Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion Kulturfiltrat Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion Photosynthetische Bakterien Extrakt Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion Kulturfiltrat Hochmolekulare Fraktion Niedrigmolekulare Fraktion

Beispiel 4: Regenerierung des Pflanzenkörpers von protocormähnlichen Körpern von Cattleya

Das in diesem Beispiel verwendete Ausgangsmaterial sind protocorm-ähnliche Körper (im folgenden als PLBs = protocorm-like bodies abgekürzt), die aus dem meristematischen Gewebe nahe am Wachstumspunkt der lateralen Keime von Laeliocattleya stammen, und zur Kultivierung der PLBs wurde ein Medium verwendet, das Hyponex (6.5-6-19), 7% Kartoffelsaft und 2% Sucrose als Kohlenstoffquelle enthielt.
Reife PLBs wurden nach ihrer frühen Kultur ausgewählt, und jeder der ausgewählten PLBs wurde in vier Teile geschnitten, wodurch PLB-Proben hergestellt wurden.
Die PLB-Proben wurden bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16 Std.) über einen Zeitraum von 60 Tagen auf einem Agarmedium, das das Medium zur Kultivierung der PLBs enthält, und auf einem hiervon modifizierten Agarmedium (weiterhin enthaltend 0,5% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus) kultiviert. Die Beschaffenheit der PLBs auf diesen Agarmedien wurde nach 40 Tagen untersucht, und die Zahl der gewachsenen PLBs und die Zahl der Sprossen, die hiervon ausgingen, wurden nach 60 Tagen untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Additiv Beschaffenheit nach 40 Tagen (pro 50 angesetzten Zahl der toten Zahl der gewachsenen Gesamtzahl der (nach 60 Tagen) Gesamtzahl der Zahl der mit Sprossen Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt

Beispiel 5: Regenerierung des Pflanzenkörpers aus Tabakkallussen

Das in diesem Beispiel verwendete Ausgangsmaterial sind Kallusse, die aus den caulinen Markgeweben von Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow stammen. Die Kallusse wurden auf einem Agarmedium aus MS-Medium, enthaltend 1 mg/l Indolessigsäure und 0,1 mg/l Kinetin, einer Passagenkultur unterzogen.
Es wurde eine Vielzahl an Teströhrchen hergestellt, wobei jedes der Teströhrchen das gleiche Agarmedium erhielt, das in der Passagenkultur oder in einem hiervon modifizierten Agarmedium (weiterhin enthaltend 1,5% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus) verwendet wird. Von jeder Medienart wurden 25 Teströhrchen hergestellt. Die der Passagenkultur unterzogenen Kallusse wurden unter Verwendung einer Rasierklinge in 5 mm² große Stücke geschnitten. Jedes geschnittene Stück wurde in den jeweiligen Teströhrchen auf das Agarmedium gegeben, und bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16 Std.) über einen Zeitraum von 14 Tagen kultiviert. Anschließend wurde die Bildung von Sprossen untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Additiv Zahl der verwendeten Callusse Zahl der gebildeten Sprosse Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt

Beispiel 6: Regenerierung des Pflanzenkörpers von Afrikanischen violetten (Saintpaulia ionatha) Petiolen

MS-Medium, enthaltend 1 mg/l Naphtalinessigsäure und 1 mg/l Kinetin und ein modifiziertes Medium hiervon (weiterhin enthaltend 2,0% des oben in (II) hergestellten Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus), wurde hergestellt. Saintpaulia-Petiolen wurden in etwa 5 mm lange Stücke geschnitten. Jedes geschnittene Stück wurde auf ein Agarmedium eines jeden der obigen Medien gegeben und in einen 300 ml-Erlenmeyer- Kolben gegeben und unter dunklen Bedingungen eine Woche lang kultiviert und anschließend bei 20ºC 30 Tage unter hellen Bedingungen (2000 lux · 16 Std.) kultiviert; die Beschaffenheit der gebildeten Sprosse und Blätter wurden untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 Additiv Beschaffenheit der Sproßbildung Zahl der Blätter Mittlere Größe Blatt Petiole Keines Cyanobakterien Photosynthetische Bakterien

Beispiel 7: Herstellung von Carotinoiden aus kultivierten Karottenzellen

Zellen, die in der Lage sind, Carotinoid zu produzieren und die aus den Wurzeln der Karotten (Daucus carota L. cv. Kintoki) stammen, wurden in diesem Beispiel als Ausgangsmaterial verwendet.
MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose, 1 mg/l 2,4-D und 1% Agar (pH 5,5 bis 5,7) und ein modifiziertes Medium hiervon (weiterhin enthaltend 1% des Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus, wurde hergestellt. Die Zellen wurden je auf den obigen Medien bei 25ºC 50 Tage lang unter dunklen Bedingungen kultiviert, und die in den Zellen akkumulierte Carotinoidmenge wurde bestimmt.
Die Carotinoidmenge wurde bestimmt durch Messen des Naßgewichts der kultivierten Zellen, Aufbrechen der Zellen in einem Mörser, Extrahieren der aufgebrochenen Zelle mit einem kleinen Volumen Aceton, Zugabe von 3 ml Petrolether zum Extrakt, um das Carotinoid aus der Acetonschicht in die Petroletherschicht zu überführen, und Bestimmen der Absorption der Etherschicht bei 453 nm mit einem Spektralphotometer. Das Ergebnis ist in der Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Additiv Naßgewicht Carotinoidmenge Naßgewicht Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt

Beispiel 8: Herstellung von Betacyanin aus kultivierten Zellen von Pokeweed (Phytolacca americana)

Zellen, die in der Lage sind, Betacyanin zu produzieren und die von den Stengeln von Phytolacca americana abstammen, wurden in diesem Beispiel als Ausgangsmaterial verwendet.
MS-Medium, enthaltend 3% Sucrose und 0,1 mg/l 2,4-D (pH 5,5 bis 5,7) und ein modifiziertes Medium hiervon (weiterhin enthaltend 1% des oben in (II) hergestellten Kulturfiltrats oder Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus), wurde hergestellt. Die Zellen wurden einer Flüssigsuspensionskultur in jedem der obigen Medien bei 25ºC 14 Tage lang unter hellen Bedingungen (2000 lux) unterzogen, und die Menge des in den Zellen akkumulierten Betacyanins wurde bestimmt.
Die Betacyaninmenge wurde bestimmt durch Messen des Naßgewichtes der kultivierten Zellen, Aufbrechen der Zellen in einem Mörser, Extrahieren der aufgebrochenen Zellen mit einem kleinen Volumen Wasser, Zentrifugieren der erhaltenen Mischung und Bestimmen der Absorption des Überstandes bei 535 nm mit einem Spektralphotometer. Das Ergebnis ist in der Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8 Additiv Naßgewicht Betacyaninmenge Naßgewicht Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt

Beispiel 9: Wachstum von Karottenadventivembryos

Die im Kulturfiltrat und Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthaltenen basischen Substanzen wurden, wie unten beschrieben, fraktioniert. Zum in (II) hergestellten Kulturfiltrat und Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus wurden je 1N-HCl zugegeben, um den pH auf 3 einzustellen; anschließend wurde Chloroform zum Extrakt zugegeben und die enthaltenen sauren Substanzen wurden entfernt. Anschließend wurde die erhaltene wäßrige Schicht durch Zugabe von 1N-NaOH auf pH 12 eingestellt, und Chloroform wurde zugegeben, um die basischen Substanzen zu extrahieren. Vom Extrakt wurde Chloroform unter reduziertem Druck abdestilliert, der Rückstand wurde in ultrareinem Wasser von pH 4 aufgelöst, und die Lösung wurde gefriergetrocknet, um eine Probe der basischen Substanzen zu erhalten.
Andererseits wurden die oben in (I) hergestellten Karottenadventivembryos durch ein 148 um-Nylonsieb abgetrennt, und diejenigen, die zu einer Größe von 148 um oder darüber gewachsen waren, wurden gesammelt. Die meisten der gesammelten Embryos waren von kugelförmiger bis herzförmiger Gestalt.
Diese Adventivembryos wurden kultiviert in MS-Medium, enthaltend kein Pflanzenhormon; in einem modifizierten Medium hiervon, enthaltend 1,5% des Kulturfiltrats oder des Extrakts des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus; und in einem anderen modifizierten Medium hiervon, enthaltend 100 ppm der basischen Substanzen, isoliert aus dem Kulturfiltrat oder dem Extrakt; bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 12 Std.) über einen Zeitraum von einem Monat, und die Wachstumsbedingungen der Embryos wurden überprüft. Das Ergebnis ist in der Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9 Additiv Zahl der gewachsenen Adventivembryos Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Basische Substanzen im Kulturfiltrat Basische Substanzen im Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt Basische Substanzen im Kulturfiltrat Basische Substanzen im Extrakt
Anmerkungen:
*&sup5; Die gewachsenen Adventivembryos sind diejenigen, die zu einer Länge von wenigstens 5 mm gewachsen waren.
*&sup6; Werte in ( ) sind die Anzahl der Adventivembryos, die Keime und Wurzeln regeneriert hatten.

Beispiel 10: Herstellung synthetischer Samen unter Verwendung von Karottenadventivembryos

Der oben in (II) hergestellte Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus (50 ml) wurde gegen 1 l destilliertes Wasser durch ein Celluloserohr zur Dialyse ("Cellulose Tube 30/32" der Fa. VISKASE Inc.) dialysiert, und das so erhaltene Dialysat wurde als die Fraktion mit dem hohen Molekulargewicht verwendet, während die Außenlösung unter verringertem Druck auf 50 ml konzentriert wurde, und das so erhaltene Konzentrat wurde als die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht verwendet.
Andererseits wurden die oben in (I) hergestellten Karottenadventivembryos durch ein 148 um-Nylonsieb gesiebt, und diejenigen, die auf eine Größe von 148 um oder darüber gewachsen waren, eingesammelt. Die meisten der gesammelten Embryos wiesen eine kugelförmige bis herzförmige Gestalt auf.
Diese Adventivembryos wurden in 25 ml MS-Medium suspendiert; diese Suspension wurde mit 75 ml MS-Medium, enthaltend 3% Natriumalginat als Einbettungsmittel, vermischt. In die so erhaltenen 100 ml der vermischten Lösung wurde das oben in (II) hergestellte Kulturfiltrat oder der Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus zugegeben, oder die oben erhaltene Fraktion mit dem hohen Molekulargewicht oder die oben erhaltene Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht, auf eine Konzentration von 10%. Die so hergestellte gemischte Lösung wurde tropfenweise in eine 50 mM CaCl&sub2;-Lösung gegeben, um kugelförmige synthetische Samen mit einer aus Calciumalginat gebildeten synthetischen Membran zu erhalten.
Diese synthetischen Samen wurden in steriler Weise bei 25ºC unter hellen Bedingungen (2000 lux · 12 Std.) über einen Zeitraum von einem Monat kultiviert, und die Keimung und die Wurzelbildung wurden kontrolliert. Das Ergebnis ist in der Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10 Additiv Zahl der synthetischen Samen Zahl der Wurzeln Zahl der Keime Keines Cyanobakterien Kulturfiltrat Extrakt Hochmolekulare Fraktion im Extrakt Niedrigmolekulare Fraktion im Extrakt Photosynthetische Bakterien Kulturfiltrat Extrakt Hochmolekulare Fraktion im Extrakt Niedrigmolekulare Fraktion im Extrakt
Die anhängige Patentanmeldung P-A-0 525 914 (92202710.7) hängt mit der vorliegenden Anmeldung zusammen; diese Anmeldung betrifft synthetischen Samen, umfassend ein pflanzenregenerierendes Gewebe, eingebettet und umschlossen in einem synthetischen Eiweiß und in einer synthetischen Membran, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Eiweiß darin ein Kulturfiltrat und/oder einen Extrakt des photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthält.

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung von Pflanzengewebe, dadurch gekennzeichnet, daß es die Kultivierung wenigstens eines Teils eines Pflanzengewebes, wenigstens eines Teils eines Pflanzenorgans oder von kultivierten Zellen hiervon in einem Kulturmedium umfaßt, das ein Kulturfiltrat und/oder einen Extrakt aus einem photosynthetischen prokaryotischen Mikroorganismus enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es weiterhin die Proliferierung des Pflanzengewebes, des Pflanzenorgans oder der kultivierten Zellen hiervon in dem Medium zum Wachstum umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es weiterhin die Regenerierung eines Pflanzenkörpers aus dem Pflanzengewebe, dem Pflanzenorgan oder den kultivierten Zellen hiervon umfaßt.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, wobei es weiterhin die Bildung von Adventivembryonen des Pflanzengewebes, des Pflanzenorgans oder der kultivierten Zellen hiervon in dem Medium zur Regeneration umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Kallusse oder die Adventivembryonen oder die Gewebestücke oder die protokorm-ähnlichen Körper kultiviert werden, wodurch der Pflanzenkörper regeneriert wird.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, wobei es weiterhin die Produktion einer Substanz umfaßt, die vom Pflanzengewebe, vom Pflanzenorgan oder von den kultivierten Zellen hiervon produziert wird.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-6, wobei der photosynthetische prokaryotische Mikroorganismus ein Stamm der Cyanobakterien oder ein Stamm photosynthetischer Bakterien ist.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-7, wobei das Kulturfiltrat oder der Extrakt eine basische Substanz enthält, die aus dem Kulturfiltrat isoliert wurde, eine basische Substanz, die aus dem Extrakt isoliert wurde, eine Fraktion mit einem hohen Molekulargewicht aus dem Kulturfiltrat, eine Fraktion mit einem hohen Molekulargewicht aus dem Extrakt, eine Fraktion mit einem niedrigen Molekulargewicht aus dem Kulturfiltrat oder eine Fraktion mit einem niedrigen Molekulargewicht aus dem Extrakt, wobei das Kulturfiltrat durch Filtration oder Zentrifugation einer Kulturlösung erhalten wird, erhalten durch Kultivierung des Mikroorganismus, wobei der Extrakt erhalten wird durch in Kontakt bringen von wahlweise aufgebrochenen Mikrobenzellen mit einem Lösungsmittel und wobei eine basische Substanz, unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, um saures Material zu entfernen, aus dem Filtrat oder dem Extrakt durch Fraktionierung isoliert wird.