JPH04169195A - 抗ｅｄ―ｂモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗ＥＤ−Ｂモノクローナル抗体、より詳しく
はフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　　：Ｆ
Ｎ）、殊に癌組織に含まれるタイプの上記ＦＮに対する
新規なモノクローナル抗体に関する。

従来の技術 ＦＮは、１９４８年にモリソンらにより血漿蛋白質の一
つとして初めて報告されたものであり［Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ、Ｐ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ
ｍ、　Ｓｏｃ、。

７０、３１０３　（１９４Ｂ）　］、種々の組織や体液
中に広く分布する一群の多機能糖蛋白質であり、細胞の
接着因子として、細胞の移動、分化、増殖、癌化といっ
た多彩な生物現象に関与することが知られている［関口
清俊、細胞工学、４　（６）、　４８５−４９７（１９
８５）］。

また従来よりＦＮには、２つの分子種があり、肝臓で合
成され血液中に存在するＦＮは血漿ＦＮ（ｐＦＮ）と呼
ばれ、培養細胞表面及び培養液中に存在するＦＮは細胞
性ＦＮ（ｃＦＮ）と呼ばれていたが、之等ＦＮの分子多
様性は、遺伝子初期転写産物の可変的スプライシング（
ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇ）により生じ
ることが明らかにされている。かかる可変的スプライシ
ングを受ける領域には、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ及び■ｃｓ
と呼ばれる３領域があり、２等領域の発現の組合せによ
って、多数の分子種が生じるものと考えられている。

一方、癌組織に含まれるタイプのＦＮ（以下［癌性ＦＮ
Ｊと略称する）は、上記ＥＤ−Ｂ領域の発現が異常に高
いＦＮであって、９１アミノ酸からなるＥＤ−Ｂ領域を
有するＦＮとして知られテイル［Ｌｕｃｉａｎｏ　Ｚａ
ｒｄｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒ
ｎａｌ、　　６１．　　　（８）、　　２３３７−２３
４２　　（１９８７）　　コ　。

かかる現状において、上記癌性ＦＮについて分子レベル
での研究を進めるために、またその分子種に特異的な測
定（検出）乃至精製を可能とし、ひいては癌の診断を可
能とするための手段が、斯界で要望されている。

本発明の目的は、上記要望に合致する手段を提供するこ
とにある。即ち、本発明はＥＤ−Ｂを特異的に認識し、
従って癌性ＦＮに反応特異性を有するモノクローナル抗
体を提供すること、ＥＤ−Ｂに関連するペプチド、殊に
上記モノクローナル抗体の製造のための免疫原及び癌性
ＦＮの測定のためのトレーサーとなり得る特定のペプチ
ドを提供すること、更に之等を利用して所望の癌性ＦＮ
もしくはＥＤ−Ｂを、従来の固相系のみならず液相系に
おいても測定する技術を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明によれば、下式（１）で表わされるＥＤ−Ｂのア
ミノ酸配列を認識することを特徴とする抗ＥＤ−Ｂモノ
クローナル抗体が提供される。

式（１）： ％式％ また本発明によれば、上式（１）のアミノ酸配列で表わ
されるＥＤ−Ｂ領域９１アミノ酸とプロティンＡとの融
合蛋白質からなるペプチドが提供される。

上記及び以下の本明細書において、アミノ酸、ペプチド
、保護基、活性基、その他に関して略号で表示する場合
は、Ｉ　ＵＰＡＣの規定或いは当該分野における慣用記
号に従うものとする。また塩基配列における核酸の表示
も同様とする。

本発明により提供される上記特定の抗ＥＤ−Ｂモノクロ
ーナル抗体は、ＥＩ）−Ｂを特異的に認識する抗体であ
って、ＥＤ−Ｂもしくは該領域を有するＦＮ、即ち癌性
ＦＮに反応特異性を有することにより特徴付けられる。

従って、本発明抗体は、ＥＤ−Ｂもしくは癌性ＦＮの免
疫測定法における特異抗体として利用することができ、
これによって之等の高感度、高精度且つ簡便な測定法を
確立できる。また、上記測定法が確立できれば、癌のス
クリーニング並びに診断技術が提供できると共に、これ
は発癌機構の研究、解明等の基礎研究に極めて有用であ
る。

更に、本発明抗体は、例えばアフィニティークロマトグ
ラフィー等による上記ＥＤ−Ｂもしくは癌性ＦＮの免疫
学的精製に有用である。

また、本発明により提供される上記特定のペプチド（Ｅ
Ｄ−Ｂ・プロティンＡ融合ペプチド）は、本発明抗ＥＤ
−Ｂ抗体の製造のための免疫原として有用であり、また
上記測定方法におけるトレーサー（標識体）等としても
有効に利用できる。

以下、本発明抗体の製造方法につき詳述する。

本発明抗体は、前記式（１）で表わされるＥＤ−Ｂ領域
９１アミノ酸とプロティンＡとの融合蛋白質を免疫原と
して用いて、−船釣方法に従い製造すルコとができル［
Ｈａｎｆｌａｎｄ、　Ｐ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ。

Ｌｉｐｉｄｓ、　１５．１０５　（１９７５）　：　Ｈ
ａｎｆｌａｎｄ、　Ｐ、、　Ｃｈｅｍ。

Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、　１０．２０１　（１９７
６）　：　Ｋｏｓｃｉｅｌａｋ。

Ｊ、、　　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　
　シフ、　　２１４　　（１９７８）コ　。

尚上記ＥＤ−Ｂ領域は公知でありその遺伝子も決定され
ている。

上記方法はより具体的には、例えば上記免疫原で免疫し
た哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細
胞腫細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）を作成し、こ
れよりＦＮのＥＤ−Ｂ領域を認識する所望抗体（モノク
ローナル抗体）を産生ずるクローンを選択し、該クロー
ンを培養することにより実施される。

本発明抗体は上記方法により得られる粗精抗体液、即ち
抗体産生ハイブリドーマ培養上清又はマウス腹水そのま
まであってもよく、更に之等を硫酸アンモニウム分画や
イオン交換クロマトグラフィーやプロティンＡ抗原カラ
ム等によるアフィニティクロマトグラフィー等により精
製したものであってもよい。

本発明抗体の製造に当り、免疫原として用いられる上記
ＦＮのＥＤ−Ｂ領域９１アミノ酸とプロティンＡとの融
合蛋白質は、前記式（１）で表わされるアミノ酸配列を
少なくとも有している限り、特に限定はなく、例えば癌
組織から調製した癌性ＦＮ、遺伝子組換え技術に従い製
造された癌性ＦＮ、それら癌性ＦＮのＥＤ−Ｂ領域乃至
はそれらのフラグメント、上記特定のアミノ酸配列を有
する合成ペプチド等のいずれかとプロティンＡとの融合
蛋白質であればよい。之等の内で特に好ましいものとし
ては、本発明ＥＤ−Ｂ領域９１アミノ酸をハプテンとし
て利用して得られるものを例示できる。

上記ＥＩ）−Ｂ領域９１アミノ酸とプロティンＡとの融
合蛋白質は、より好ましくはＦＮのＥＤ−Ｂ領域を有す
る癌性ＦＮの樹立細胞株を利用して、遺伝子工学的手法
により製造することができる。

その詳細は次の通りである。

即ち、まず癌性ＦＮを産生ずる培養樹立細胞株、例えば
代表的にはヒト胎児肺組織から分離された正常２倍体腺
維芽細胞Ｗｒ−３８を腫瘍ウィルスＳＶ４０で形質転換
（癌化）して得られる株化細胞であるＷｒ−３８ＶＡ１
３細胞より、グアニジンチオシアネート法［Ｃｈｉｒｇ
ｗｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ、ｔｒｙ、　１８．５２９４−５２
９９　（１９７９）］にて、全ＲＮＡを得た後、このＲ
ＮＡからオリゴｄＴセルロースカラムにてポリ（Ａ”　
）ＲＮＡを選別し、次いでカワサキとウォングの方法（
Ｋａｗａｓａｋｉ　ａｎｄＷａｎｇ、　ＰＣＲＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、　Ｈ，Ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ、ｅｄ、。

５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
　ｐ８９−９８　（１９８９）］　ｌ、：従って、ポリ
メラーゼ・チエイン・リアクシジン法（以下これをｒＰ
ｃＲ法」と略す、５ａｉｋｉ、　Ｒ。

Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０．
１３５０−１３５４　（１９８５））を用いてＥＤ−Ｂ
領域をコードするｃＤＮＡを合成する。

即ち、ランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写酵
素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、５　’　−ＣＡ
ＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡ−３’を上流プ
ライマー、３　’−ＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴＴＴ
ＧＣＣ−５°を下流プライマーとして、ＰＣＲ法により
ＦＮｃＤＮＡ上のＥＤ−Ｂ領域をコードするＳａｃ　Ｉ
　−Ｐｖｕ　ＩＩ領領域増幅することができる。ここで
用いられる２本のプライマ−は、特に上記塩基配列に限
定される必要はなく目的のＳａｃ　Ｉ又はＰｖｕ　ＩＩ
部位を含むものであればいずれでもよい。上記で得られ
る二本鎖ｃ　ＤＮＡをＳａｃ　Ｉ及びＰｖｕＩＩテ切断
後、Ｆ　Ｎ　ｃ　ＤＮＡを含むプラスミドＩ）　Ｌ　）
’　５　　［Ｋ、　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、
。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５．４９３６−４９４
１　（１９８６）コから切り出したＦＮ　ｃＤＮ　、６
．（７）Ｐｖｅ　ＩＩ　−Ａｃｃ　Ｉ断片と共に、プラ
スミドｐＧＥＭ４　　［プロメガ社より市販コのＳａｃ
　Ｉ　−Ａｃｃ　１部位に挿入し、ＦＮ（７）ＥＤ−Ｂ
及びその周辺領域をコードするｃＤＮＡクローン（ｐＧ
ＥＭＢｌ）を得ることができる。

次に、上記ｐＧＥＭＢ１からＥＤ−Ｂを含む領域をコー
ドするｃＤＮＡを、Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片と
して回収し、これをプロティンＡ遺伝子融合ベクターｐ
ＲｒＴ２Ｔ　［ファルマシア社製コのＥｃｏ　ＲＩ　−
Ｐｓｔ　Ｉ部位に挿入して、目的のプロティンＡとＥＤ
−Ｂとの融合蛋白質の発現ベクターｐＰＡＢ１を収得す
る。

上記発現ベクターによる宿主の形質転換は、例えば宿主
細胞としてλＣｒ８５７温度感受性リプレッサーをもつ
大腸菌Ｎ４８３０　［ファルマシア社より入手］を用い
て、リン酸カルシウム法［Ｄ。

Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ、　ｅｄ
、、　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｖｏｌ、１．　ｐ１０９−１３５．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　ｏｘｆｏｒｄ、　１９８５］　（、−て行なうこ
とができる。かくして得られる形質転換体をＬＢ培地で
培養後、ハナハンとメセルソノの方法［ｆ（ａｎａｈａ
ｎ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　Ｍ、、　Ｇ
ｅｎｅ。

狭、　６３−６７　（１９８０）］を参照して、クロー
ニングを行なうことにより、目的とするプロティンＡ・
ＥＤ−Ｂ融合蛋白質陽性クローンを収得できる。

目的融合蛋白質の産生は、上記陽性クローンを単離後、
培養し、ヒートインダクションをかけることにより実施
でき、得られる蛋白質は超音波破砕により菌体中より放
出させて回収でき、またイムノグロブリンネ溶化カラム
を用いたクロマトグラフィーにより精製できる。かくし
て精製された所望の免疫原を得る。

尚、上記方法おいてはＥＤ−Ｂ遺伝子を、ＥＤ−Ｂ領域
をコードするＳａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片とソノ下
流（ｒ）Ｐｖｕ　ＩＩ　−Ａｃｃ　Ｉ断片とに分割して
ｐＧＥＭ４ベクターにクローニングしているが、特にそ
の必要はなく、例えば初めからＳａｃ　Ｉ　−Ａｃｃ　
Ｉ断片をＰＣＲ法により増幅させて用いることもできる
。

更に上記遺伝子は、ホスファイト・トリエステル法［Ｎ
ａｔｕｒｅ、　３１０．１０５　（１９８４）　］等の
常法に従って、核酸の化学合成により全合成することも
可能である。

本発明モノクローナル抗体の製造において、免疫原、即
ち上記プロティンＡとＥＤ−Ｂ領域との融合蛋白質で免
疫される咄乳動物としては、特に制限はないが、細胞融
合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択
されるのが望ましく、一般にはマウス、ラット等が有利
に用いられる。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫原又は後記す
るような適当な結合試薬を用いて担体（抗原性の高い異
種蛋白）と結合させた免疫抗原を、補乳動物に静脈内、
陵内、皮下、腹腔的注射等により投与することにより実
施できる。

上記免疫抗原の製造において、用いられる担体としては
、通常抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。

該担体としては例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブ
ミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類；馬血清
グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血清グロブリン
、人血清グロブリン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の
血清グロブリン類；馬チログロブリン、牛チログロブリ
ン、ウサギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジ
チログロブリン等の動物のチログロブリン類；馬ヘモグ
ロビン、牛ヘモグロビン、ウサギヘモグロビン、人ヘモ
グロビン、ヒツジヘモグロビン等の動物のヘモグロビン
類；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の
動物のヘモシアニン類；回虫より抽出された蛋白質（ア
スカ−リス抽出物、特開昭５６−１６４１４号公報、Ｊ
、Ｉｍｍｕｎ、・旦２６０−２６８　（１９７３）　　
Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、　１２２．３０２−３０８（１９７
９）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、　９８．８９３−９００　（
１９６７）及びＡｍ。

Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、−袢ど、　５７５−５７８　
（１９６０）に記載のもの又はこれらを更に精製したも
の）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタ
ミン酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重合体
等を挙げることができる。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広（使用できる。

具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架
橋結合させる、例えばビスジアゾタイズドベンジジン（
ＢＤＢ）　、ビスジアゾタイズド−３゜３′−ジアニシ
ジン（ＢＤＤ）等のジアゾニウム化合物；アミノ基とア
ミノ基とを架橋結合させる、例えばグリオキサール、マ
ロンジアルデヒド、ゲルタールアルデヒド、スクシンア
ルデヒド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド類
；チオール基とチオール基とを架橋結合させる、例えば
Ｎ。

Ｎ′−〇−フェニレンジマレイミド、Ｎ　、Ｎ’　　−
ｍ−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化合物；
アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例えばメタ
マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル、４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン
−１−カルボキシル−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミド
エステル、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジ
シクロ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等のマレイミドカ
ルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類
；アミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる通常
のペプチド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ、
　Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ
−エチル−Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−
エチル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、■
−シクロへキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチ
ル）カルボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合
剤等を挙げることができる。また上記ハプテン−担体結
合試薬としては、ｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジ
アゾニウムアリールカルボン酸類と通常のペプチド結合
形成反応試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたもの
も使用可能である。

上記ハプテン、担体蛋白、ハプテン−担体結合試薬、ス
ペーサー等を用いる免疫抗原の製造反応は、常法に従う
ことができ、一般には水溶液もしくはｐ　）（５〜１０
程度の通常の緩衝液中、好ましくはｐＨ６〜９程度の緩
衝液中、０〜４０℃、好ましくは室温付近で行なわれる
。該反応は通常的２〜５時間程度で完結する。

上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハプテンに
対して担体を０．５〜５倍重量程度、好ましくは１〜２
倍重量程度、及びハプテン−担体結合試薬を１〜３０倍
モル程度用いるのがよい。上記によりスペーサーを仲介
してもしくは直接に担体とハプテンとが結合したハプテ
ン−担体複合体からなる所望の免疫抗原が収得される。

反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば透析法、
ゲル泪過法、分別沈澱法等により容易に単離精製できる
。

前記免疫は、より具体的には、免疫原を生理食塩水含有
リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）や生理食塩水等で適当な濃
度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して
、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総投与量が、
例えばマウスでは約１０〜１００μｇ程度、家兎では約
０．　２〜２．　０■程度になるようにすることにより
行ない得る。上記アジュバントとしては、百日咳ワクチ
ン、完全フロインドアジュバント、アラム等を用い得る
。

抗体の採取は、上記最終投与の１〜２週間経過後、免疫
化された動物から採血し、これを遠心分離後、血清を分
離することにより行なわれる。

上記モノクローナル抗体の製造において用いられる免疫
細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出した肺臓
細胞を使用するのが好ましい。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、
例えばｐ３／Ｘ６３−Ａｇ３　（Ｘ６　３）　　　［Ｎ
ａｔｕｒｅ、　　２５６．　４９５−４９７　　（１９
７５’）　　コ　、　ｐ　３／Ｘ６３　　Ａｇ８．　　
Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）　　［ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ
　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ、　　８１゜１−７　（１９７Ｂ）］　、
Ｐ　３／ＮＳ　Ｉ−１−Ａｇｌ−１−Ａ　３−１　）　
　［Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６．５１１
−５１９（１９７６）］　、Ｓ　ｐ　２１０−Ａ　ｇ　
１４　（Ｓ　ｐ　２１０）［Ｎａｔｕｒｅ、　２７６、
２６９−２７０　（１９７８）　］　、Ｆ　Ｏ［Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　３５．１−２１　（
１９８０）　］等やラットにおける２１０．ＲＣＹ３．
Ａｇ１．２．３゜（Ｙ３）　　［Ｎａｔｕｒｅ、　２７
７、１３１　（１９７９）コ等の骨軸腫細胞等を使用で
きる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの
方法［Ｍｅｔｈｏｃｌ　ｆｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　７３．３　（１９８１）コ等に準じて行なうことがで
きる。より具体的には、上記融合反応は、通常の融合促
進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セン
ダイウィルス（）ＴＶＪ）等の存在下に、通常の培地中
で実施され、培地には更に融合効率を高めるためにジメ
チルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加するこ
ともできる。また、電気処理（電気融合）による方法等
を適宜採用することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細
胞との使用比は、通常の方法と変りはなく、例えば形質
細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いる
のか普通である。

融合反応時の培地としては、上記形質細胞腫細胞の増殖
に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４
０培地、ＭＥＭ培地、その他この種細胞培養に一般に利
用されるものを例示でき、通常２等培地は牛胎児血清（
Ｆ　ＣＳ）等の血清補液を抜いておくのがよい。

細胞融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を
上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰ
ＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０００程度の
ものを、通常培地に約３０〜５Ｑｗ／ｖ％の濃度で加え
て混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培地
を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返すこ
とにより所望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ａ法
［Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、、　　７０．４１９−４３９（１９８０）］　、
プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタｇニー　
（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）法、ラジオイムノアッセ
イ（Ｒｒ　Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられてい
る種々の方法〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗
体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁
、昭和５７年３月５日〕に従い実施することができ、こ
の検索には前記免疫抗原が利用できる。

かくして得られる本発明の所望のモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマは、通常の培地で継代培養する
ことができ、また液体窒素中で長期間保存することがで
きる。

上記ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
採取は、該ハイブリドーマを、常法に従って培養してそ
の培養上清として得る方法や、ハイブリドーマをこれと
適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水と
して得る方法等が採用される。前者の方法は、高純度の
抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の大量
生産に適している。

また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
濾過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手
段により精製することができる。

かくして、本発明抗ＥＤ−Ｂモノクローナル抗体を製造
できる。

本発明抗体の利用につき詳述すれば、該抗体はこれを利
用して例えば免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフ
ィー等の通常の精製手段によりＦＮのＥＩ）−Ｂ領域を
、簡便且つ特異的に精製することができる。また本発明
抗体の利用によれば、体液等を検体として該検体中の癌
性ＦＮを免疫反応により特異的に測定することができる
。該方法としては、通常の競合法、サンドイツチ法によ
るラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）　、酵素免疫測定
法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、凝集法等の通常の免疫学的手
段が挙げられ、之等各方法の操作、手順等は常法に従う
ことができる。

より具体的には、例えば競合法を実施する場合、測定し
ようとする検体中の癌性ＦＮと、一定量の不活性化され
たＦＮのＥＤ−Ｂとを、標識剤で標識された本発明抗体
の一定量と競合反応させ、次いで不溶化ＦＮのＥＤ−Ｂ
と標識抗体との結合体及び非結合標識抗体とを分離し、
そのいずれか−方の標識活性を測定することにより、検
体中の癌性ＦＮを定量することができる。またサンドイ
ツチ法を実施する場合、測定物質（検体）と不溶化され
た本発明抗体とを反応させて、ＦＮのＥＤ−Ｂ不溶化抗
体複合体を形成させ、この複合体に、標識抗体の一定量
を反応させ、次いで形成される複合体と標識抗体との結
合体の標識活性又は非結合標識活性を測定することによ
り、上記と同様に検体中の癌性ＦＮを定量できる。

上記各種の検定法において、検体としては、体液例えば
血液、尿、細胞組織液等を使用でき、之等の内では血液
、特に血清又は血漿が好ましい。

標識剤で標識された本発明抗体及び標識抗体の作成は、
適当な標識剤を用いて常法に従い実施できる。標識剤と
しては通常のもの、例えば　　Ｉ、１３１１、トリチウ
ム等の放射性物質、グルコアミラーゼ、パーオキシダー
ゼ（ＰＯＸ）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシ
ペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素
酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、Ｄ−Ｎａｓｅ、　Ｐ−Ｎａｓｅ、β−ガラク
トシダーゼ、グルコース−６−フォスフニードブハイド
ロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵
素試薬等を例示できる。標識化方法としては、例えば放
射性ヨードの場合、クロラミンＴを用いる酸化的ヨード
化法［Ｗ、　Ｍ、　Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｃ。

Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ　；　Ｎａｔｕｒｅ、　１９４．４
９５　（１９６２）　；Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊｌ、　８
９．１４４　（１９６３）参照］等により行なわれ、酵
素試薬の導入は、通常のカップリング法、例えばエルラ
ンガ−（Ｂ、　Ｆ、　Ｅｒｌａｎｇｅｒ）らの方法［Ａ
ｃｔａ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５ｕｐｐ１．、１
６８．２０６（１９７２）］　及び７’７０−ル（Ｍ、
　Ｈ，Ｋａｒｏｌ　）らの方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　５７．
７１３（１９６７）］等の方法によって行なうことがで
きる。

また、不溶化された本発明抗体及び不溶化ＦＮのＥＤ−
Ｂ、例えばプレートに物理的又は化学的に固相化したも
のは、本発明抗体又はＥＤ−Ｂを適当な不溶性担体に化
学的又は物理的に結合させることにより製造できる。用
いられる担体としてはセルロース粉末、セファデックス
、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチ
ルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラス
チックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガ
ラスピーズ、絹、ポリアミン−エチルビニルエーテル−
マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マ
レイン酸共重合体等を例示できる。上記不溶化は共有結
合法としてのジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架
橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてゲルタールア
ルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を使用）、
ＵｇＩ反応による担体結合法等の各種化学反応手段、イ
オン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法、ガラ
スピーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸
着法等により実施できる。

上記検定法における反応（免疫反応）は、通常４５℃以
下、好ましくは４〜４０℃の温度で、数時間〜２４時間
時間音要して実施できる。

かくして本発明抗体を用いれば、簡便に、高精度で、検
体中の癌性ＦＮもしくはＥＤ−Ｂを保有するＦＮを測定
することができる。

かかる本発明抗体を利用した精製系及び測定系の設定及
びその改変乃至応用は、当業者にとり自明である。

発明の効果 本発明によれば、ＦＮの抗ＥＤ−Ｂモノクローナル抗体
及びその製造のための免疫原としてのＦＮのＥＤ−Ｂ・
プロティンＡ融合蛋白質が提供される。本発明抗体の利
用によれば癌性ＦＮの研究や癌の診断法及び治療法が提
供される。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げ
るが、本発明は之等に限定されない。

実施例　Ｉ ＥＤ−Ｂ・プロティンＡ融合蛋白質の製造■　ＦＮのＥ
Ｄ−Ｂ領域を含むＳａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片の調
製 ａ）細胞の培養 この例ではＷＩ−３８ＶＡ１３細胞を用いた。

該細胞はヒト胎児肺組織から分離された正常２倍体腺維
芽細胞ＷＩ−３８を腫瘍ウィルスＳＶ４０で形質変換し
て得られた株化細胞であり、ギラルディ　（Ａ、　Ｊ・
Ｇｉｒａｒｄｉ　）らによりその性質が明らかにされて
おり［Ａｎｎ、　Ｍｅｄ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｆ
ｅｎｎ、。

生え、　　２４２−２５４　　（１９６６）コ　、　Ａ
Ｔ　ＣＣにＡＴＣＣＣＣＬ　　７５．１として寄託され
ている。

上記ＷＩ３８ＶＡ１３細胞を、フレッシュニー（Ｒ，１
，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）著「カルチャーオフアニマルセル
ズ（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ
　）　ｊ　（ｒ）記載（Ａｎａｎ　ＲＬｉｓ、　Ｉｎｃ
、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３）　ニ従い培養し
た。

トリプシン処理により浮遊させたＷＩ３８ＶＡ１３細胞
を約１０６個ずつ１５−培養皿（ファルコン組織培養デ
イツシュ＃３０２５）１０枚に播き、１０％ＦＣ３（牛
胎児血清）を含むＤＭＥ培地（ダルベツコ改変イーグル
培地、ギブコ社製）を用いて５％Ｃ０２存在下で、３７
℃で５日間培養し、ラバーポリスマンを用いて細胞を培
養皿より剥離し、遠心分離（５００Ｘｇ、５分）により
約１ｇのＷＩ３８ＶＡ１３細胞を回収した。

ｂ）　　ｃＤＮＡライブラリーの調製 上記ａ）で得られた細胞約１ｇを１５１１のＧＴＣホモ
ジネート緩衝液［５，３Ｍグアニジニウムチオシアネー
ト、０．０２ＭＮ−ラウリルザルコシルナトリウム、０
．０３Ｍクエン酸三ナトリウム、０，８％β−メルカプ
トエタノール、０．７％アンチフオーム２８９（除泡剤
、シグマ社製）コを入れたボッター式ホモジナイサーに
加えた。

１０往復させた後、内容物をビーカーに移し、２０１１
のシリンジに２２Ｇの注射針を付けて勢いよく３回通し
シアリングした。

５．７Ｍ塩化セシウム及びＯｏＩＭ　　ＥＤＴＡを遠心
チューブに約４１Ａ’入れ、その上に上記ホモジネート
約８．ｎを重層後、２０℃、３．２００　Ｏｒｐｍで２
０時間遠心分離を行なって全ＲＮＡを回収した。

全ＲＮＡを５■／１１以下の濃度に希釈し、６５℃で７
分間インキュベート後、水冷中で２分間急冷した。等量
の２倍オリゴｄＴ結合緩衝液［１、０Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ
Ａ’　、　２０　ｍ　Ｍ　ｈリス−ＨＣｌ。

ｐＨ７，５］及び１／１００容量の２０％ＳＤＳを添加
してよく混合した。次いでオリゴｄＴ結合緩衝液［０，
５Ｍ　　ＮａＣＡ７，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７
，５，０，１％ＳＤＳ］で平衡化したオリゴｄＴセルロ
ースカラム（バイオ・ラッド社製）に付加した。未吸着
区分を再度６５°Ｃで７分間反応させ、水冷中で２分間
急冷して再度カラムに付加した。カラムを１０倍容のオ
リゴｄＴ結合緩衝液で洗浄し、更に１０倍容のオリゴｄ
Ｔ洗浄液［０，１Ｍ　　ＮａＣＡ’、１０ｍＭ）リス−
ＨＣ／、ｐＨ７，５，０，１％ＳＤＳコを使用して洗浄
した。オリゴｄＴセルロースに結合したＡ”　ＲＮＡを
オリゴｄＴ溶出液［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，
５，０，０５％ＳＤＳ］により溶出させた。溶出液に１
／２５容量の５ＭＮａＣ１及び２．５容量のエタノール
を加え、よく混合して一２０℃で一昼夜放置した。次い
でこれを１２００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離して、ポ
リＡ”　ＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールに再度懸
濁させて同様に遠心分離し、沈殿を乾燥後、適当量の水
に溶かした。

上記方法で得られたポリＡ”　ＲＮＡからカワサキとウ
ォングの方法［Ｋａｗａｓａｋｉ　ａｎｄ　Ｗａｎｇ、
　ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｈ，Ａ、Ｅｒ１ｉｃ
ｈ、　ｅｄ、、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ８９−９８　（１９８９）］に
従って、ＦＮｃＤＮＡのＥＤ−Ｂ領域をコードする領域
をポリメラーゼ・チェインーリアクシジン法により増幅
した。

Ｃ）プライマーの合成 次の２つのオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを調
製した。

上流プライマー（Ｓａｃ　Ｉサイト）：５’−ＣＡＧＡ
ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡ−３゜上流プライマ
ー（Ｐｖｕ　ＩＩサイト）：３’−ＴＧＴＧＡＣＴＧＴ
ＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣ−５’上記プライマーの調製は、
自動ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムズ社
製、３８０Ａ型）を用いて、４種の塩基のβ−シアノエ
チルホスホアミダイト誘導体より固相法により合成した
。

合成されたオリゴヌクレオチドの脱保護と固相担体から
の遊離は、濃アンモニア水中で５５°Ｃ下に１０時間加
温することにより行なった。このようにして調製した合
成オリゴヌクレオチドは、ＨＰ　Ｌ　Ｃで精製し、最終
的に約５０μｇの目的オリゴヌクレオチドをそれぞれ上
流プライマー及び下流プライマーとして得た。

得られた精製オリゴヌクレオチドはＴＥ緩衝液［１０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣ／、ｐＨ７，４，１ｍＭＥＤＴＡ］に溶
解し、−２０℃で保存した。

ｄ）−末鎖ｃＤＮＡの合成 ０．５ｘｌチユーブ（エッペンドルフ社製）に、１０μ
ｌの２×反応用緩衝液［４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
８，４，１００ｍＭ　　ＫＣＩ。

５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．０．２ｍｇ／ｚｌ！ヌクレアー
ゼフリー牛血清アルブミン、２ｍＭ　　ｄＡＴＰ、２ｍ
Ｍ　　ｄＧＴＰ、２ｍＭ　　ｄＣＴＰ、２ｍＭＴＴＰ、
２単位７．Ｉ　ＲＮａｓｉｎ　　（〕ｏ　ｌ　ｎ　社製
）、１００ｐｎｌｌｏ１ランダムヘキサマー（ファルマ
シア社製）］と、予め９０℃で５分間熱処理した約１μ
ｇのＲＮＡを含む溶液９μｌとを混合した後、１μｌの
マウスモロニー白血病ウィルス由来の逆転写酵素（約２
００単位）を加え、室温で１ｏ分間、更に４２℃で３０
分間インキュベートして、−末鎖ｃＤＮＡを合成した。

反応液を１０分間９５℃で加熱して反応を停止させた。

ｅ）　　Ｓａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片の増幅上記ｄ
）の加熱処理により反応を停止させた−本鎖ｃＤＮＡ溶
液２０ｕｌｌに、５Ｑｐｍｏｌずつの上流プライマー及
び下流プライマーを含む８０μｌの１ｘＰｃＲ反応用緩
衝液［２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，４，５０ｍＭ
　　ＫＣＩ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１■／１１
ヌクレアーゼフリー牛血清アルブミンコと、５単位のＴ
ａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー／シージス社製、
１μりとを加え、１００μｌのミネラルオイルを重層し
た後、９５℃で１．５分間、次に５０℃で３分間、更に
７２℃で３分間加熱する操作を３５回繰り返して、所望
のＥＤ−Ｂ領域をコードするＳａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉ
Ｉ　（［）　Ｎ　Ａ断片を増幅シタ。反応終了後、１０
単位のＳａｃ　Ｔを添加し、３７℃で２時間インキュベ
ートして、増幅させたＳａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ１１ｃＤＮ
Ａ断片の５′側Ｓａｃ　Ｉサイトを露出させた。

上記反応液について、これを臭化エチジウムの存在下、
φＸ　１７４　ＤＮＡノＨａｅ　ＩＩＩ分解ＤＮＡ断片
を分子量マーカーとして１．５％アガロースゲルを用い
た電気泳動を行なことにより、所望の３８５塩基対の大
きさをもツＳａｃ　Ｉ　　Ｐｖｕ　ＩＩ断片が増幅され
ていることを確認した。

ｆ）　　Ｓａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片の精製上記ｅ
）に従いアガロースゲル上で分離されたＳａｃ　Ｉ　−
Ｐｖｕ　ＩＩ断片を、ドレッツエンらの方法［Ｄｒｅｔ
ｚｅｎ、　Ｇ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１１２、２９５−２９８　（１９８１）　］　ヲ用イテ
、ＤＥＡＥセルロース膜（ＳアンドＳ社製、ＮＡ４５）
上に吸着させた後、吸着されたＤＮＡ断片を溶出バッフ
ァー［５０ｍＭ）リス−ＨＣＡ’、ｐＨ８，０、ＩＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ］を用いて、ＤＥＡＥセ
ルロース膜より溶離させ、その後冷エタノール沈殿によ
り、所望のＳａｃ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片（約１０１
００ｎを回収した。

■　）’　Ｎ　（Ｄｉ’Ｊ　ＡＰｖｕ　ＩＩ　−Ａｃｅ
　Ｉ断片の調製ａ）セキグチらにより単離されたヒトフ
ィブロネクチンｃＤＮＡクローンＩ）　Ｌ　Ｆ　５　［
Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ。

Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
　　２５．　ｐ４９３６−４９４１（１９８６）］　２
０μｇを、５０μｌの反応緩衝液［１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ！、ｐＨ７，５，７ｍＭＭｇＣ１２，６０ｍＭ　　
ＮａＣ１，７ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１
％牛血清アルブミンコに溶解し、これに２０単位のＰｖ
ｕ　ＩＩとＡｃｃ　１（どちらも宝酒造社製）とを加え
、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、１％アガロ
ースゲルを用いた電気泳動を行なって、所望のＰｖｕ　
ＩＩ−Ａｃｃ　Ｉ断片（２２６塩基対）を分離し、その
後、前記■−ｆ）に記した如＜、ＤＥＡＥセルロース膜
を用いて所望のＤＮＡ断片（約５００ｎｇ）を回収した
。

■　ＦＮｃＤＮＡのＳａｃ　Ｉ　−Ａｃｃ　Ｉ断片のｐ
ＧＥＭ４へのクローニング ｐＧＥＭ４　（プロメガ社製）５μｇを２０μｌの反応
緩衝液［１０ｍＭトリス−ＨＣ／ＸｐＨ７、５，７ｍＭ
　　ＭｇＣ／２．６０ｍＭＮａＣＡ’、７ｍＭ２−メル
カプトエタノール、０．０１％牛血清アルブミン］に溶
解させ、これに１０単位の５ａｃＩ（宝酒造社製）と１
０単位のＡｃｃＩ（宝酒造社製）とを加えて、３７℃で
２時間インキュベートし、ｐＧＥＭ４のポリリンカー領
域をＳａｃ　ＩとＡｃｃ　１部位で開裂させた。反応生
成物をフェノール処理した後、エタノール沈殿により開
裂させた。プラスミドＤＮＡを回収し、これを４８μｌ
の反応緩衝液［５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ！、ｐＨ９，０
，０，１ｍＭ　　ＺｕＣ１２，１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．
１ｍＭ　　スペルミジンコに溶解させ、これに２０単位
の生小腸アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を加
えて、３７℃で１５分間、次いで５６℃で１５分間加温
して、５′末端の脱リン酸化を行なった。

１０％ＳＤＳを２．５μ！加えた後、６８℃で１５分間
加温して酵素を失活させ、フェノール抽出の後にエタノ
ール沈殿を行なって、５′末端を脱リン酸化したプラス
ミドＤＮＡを回収した。

次に、上記プラスミドＤＮＡ２０ｎｇと、上記■及び■
で得られた各ｃＤＮＡ断片のそれぞれ２０ｎｇとを、２
４μｌのライゲーション緩衝液［６６ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，６，５ｍＭＭｇＣ／２．５ｍＭジチオスレ
イドイル、１ｍＭＡＴＰ］に溶解させ、これに７４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）３００単位を加えて１６℃で
１６時間インキュベーションし、ｐＧＥＭ４のＳａｃ　
Ｉ−Ａｃｃ　Ｉ部位にＦＮのＥＤ−Ｂ領域をコードする
Ｓａｃ　１部位からＡｃｃ　Ｉ部位までのｃＤＮＡ断片
を挿入した。

次に、この反応液１μｌを分取し、これを１００μｌの
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩコンピテント細胞（宝酒造
社製）と混和後、水冷下で３０分間、次いで４２℃で９
０秒間インキュベーションして、プラスミドＤＮＡを大
腸菌に導入した。これにＬＢ培地［１％バクト・トリプ
トン、０．５％酵母抽出液、１％食塩］を１　ｘｉ加え
て、３７℃で１時間振盪培養した後、その１００μｌを
分取して、アンピシリン５０μｇ　／　ｘｉを含むＬＢ
寒天プレート［１，５％バクトアガー、１％バクト・ト
リプトン、０．５％酵母抽出液、１％食食塩上上播き、
３７℃で１４時間インキュベートしてプラスミドＤＮＡ
により形質転換した大腸菌のコロニー約２００個を得た
。この中から１２個を無作為に採取し、５０μｇ　／　
ｘｉのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、バイルン
ボインとドリー［Ｂｉｒｎｂｉｍａｎｄ　Ｄｏｌｙ］　
ｃ）変法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｔ、　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ。

ｐ３６８−３６９　（１９Ｂ２）　］により各コロニー
からプラスミドＤＮＡを回収した。Ｅｃｏ　ＲＩとＰｓ
ｔ　Ｉの二重消化により、予想される約６００塩基対の
挿入配列を有するプラスミドクローン（ｐＧＥＭＢｌ）
を選別した。

■　ｐＧＥＭＢｌからのＥｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断
片の回収 ａ）　プラスミドＤＮＡの単離 上記■で得られたプラスミドクローンｐＧＥＭＢ１を含
む大腸菌株を、５０μｇ　／　ｙｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地５００２／を用いて、３７℃で１２時間培養
した。その後、５０００Ｘｇ、１０分の遠心により菌体
を回収し、アルカリ溶菌法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ、　Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ、　　ｐ９０
−９１　（１９８２）］　ニより、以下の通りプラスミ
ドＤＮＡを単離した。

即ち、菌体を、８　ｙｌのリゾチーム５■／　ｙｌを含
む緩衝液Ｉ　　［５０ｍＭグルコース、２５ｍＭｈリス
ーＨＣｌ、　　ｐＨ８，０、１０ｍＭ　　　ＥＤＴＡコ
に懸濁させ、室温で５分間放置した後、これに１６ｚｌ
の０．２Ｎ　　ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液を加えて素早
く混和し、水冷下で１０分間溶菌させた。次に１２１１
の氷冷した５Ｍ酢酸カリウム溶液（ｐＨ４，８）を加え
て混和し、更に水冷下に１０分間放置した。

上記の後、２０００Ｏｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心し
、上清３２ｚＡ’を１６Ｉｌずつ２本のコーレックスガ
ラス遠心管に移し、それぞれに１０１１のイソプロパツ
ールを加えて室温で１５分間放置した後、１２０００Ｘ
ｇ、３０分間、１５℃で遠心し、プラスミドＤＮＡを沈
渣として回収した。

この沈渣を風乾した後、８　ｘｉのＴＥ緩衝液［１０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩＩ、ｐＨ８，０，０，１ｍ　Ｍ　　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ　］に溶解し、これに８ｇの塩化セシウム
と０．４ｘｌの１■／　ｘｉの臭化エチジウム溶液とを
加え、よく混和した後、２００Ｏｒｐｍ、５分間室温に
て遠心して不溶物を除いた。上清を１２ＰＡシールチユ
ーブ（日立王様製）に移し、チューブ上部をミネラルオ
イルで満たした後、５５０００ｒｐｍ、１６時間、１９
℃で遠心して、プラスミドＤＮＡのバンドを形成させた
。次に、注射針を用いてプラスミドＤＮＡを回収し、エ
タノール沈殿によって所望のｐＧＥＭＢ１プラスミドＤ
ＮＡ　（約２００μｇ）を得た。

ｂ）　　Ｅｃｏ　ＲＩ〜Ｐｓｔ　Ｉ断片の回収上記ａ）
で得られたｐＧＥＭＢ１プラスミドＤＮＡ５μｇを、２
５μｌのＥｃｏ　ＲＩ　−ｐｓｔ　Ｉ用反応緩衝液［１
０ｍＭ）リス−ＨＣｌ！、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＡ’２．５０ｍＭ　　ＮａＣＡ’、１ｍＭジチオス
レイトール］に溶解し、１０単位のＥｃｏ　ＲＩと１０
単位のＰｓｔ　Ｉとを加えて、３７℃で２時間インキュ
ベートし、プラスミドＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１部位とｐｓ
ｔ　Ｉ部位で切断した。得られた反応液より１．５％ア
ガロースゲル電気泳動により、所望のＥｃｏ　ＲＩ　−
Ｐｓｔ　Ｉ断片を分離し、前記のに記したＤＥＡＥセル
ロース膜を用いる方法により所望のＤＮＡ断片（約３０
０１ｇ）を回収した。

■　Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片のｐＲＩＴ２Ｔへ
の挿入ａ）プラスミドベクターの製造 プロティンＡ遺伝子融合ベクターｐＲＩＴ２Ｔ（ファル
マシア社製）２μｇを、Ｅｃｏ旧−Ｐｓｔ　Ｉ用反応緩
衝液２０μｌに溶解し、Ｅｃｏ　Ｒ１とＰｓｔ　Ｉとを
それぞれ１０単位ずつ加えて、３７℃で２時間インキュ
ベートし、Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ部位でプラスミ
ドＤＮＡを開裂させた。反応生成物をフェノール抽出し
た後、エタノール沈殿により開裂したプラスミドＤＮＡ
を回収し、その５′末端を前記■に記載した方法に従っ
て、生小腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化
し、再度フェノール抽出を行なった後、エタノール沈殿
により所望のプラスミドベクター１μｇを得た。

ｂ）　プラスミドベクターへのＥｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ
　Ｉ断片　　゛の挿入 上記ａ）に従いＥｃｏ　ＲＩとＰｓｔ　Ｉとで開裂され
、その５′末端を脱リン酸化されたｐＲＩＴ２Ｔプラス
ミド２０１ｇと、前記■で調製されたｐＧＥＭＢ１由来
（７）ＥＣＯＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片２０”ｇとを、前
記■に記載のライゲーション緩衝液２４μｌに溶解し、
これに３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて、１６
℃で１６時間インキュベートして、ｐＲＩ７２Ｔのポリ
リンカー領域にｐＧＥＭＢ１由来のＥｃｏ　ＲＩ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉ断片を挿入した。

Ｃ）形質転換体の作製 上記ｂ）で得られた反応液１μｌを用いて、前記■に記
した方法に従い、大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩ旧株を
形質転換し、９ｃｍのＬＢ寒天プレート上に約５０個の
コロニーを得た。この中から無作為に１２個のコロニー
を別々に採取し、１．５７／のアンピシリンを含むＬＢ
培地で培養した後、パイルンボインとドリー［Ｂｉｒｎ
ｂｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ］　（ｙ）変法により、各コ
ロニーからプラスミドＤＮＡを回収した。かくして得ら
れたプラスミドＤＮＡ　（約１μｇ）を、Ｅｃｏ　ＲＩ
　−Ｐｓｔ　Ｉ用反応緩衝液１−Ｏｔｔ、１に溶解した
後、Ｅｃｏ　ＲＩとＰｓｔ　Ｉとをそれぞれ５単位ずつ
加えて、３７℃で２時間インキュベートし、得られた反
応生成物を１％アガロースゲル電気泳動により分析して
、６２３塩基対のＥｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ工断片が生成
しているクローン（ｐＰＡＢｌ、）を同定した。

ｄ）上記Ｃ）で同定されたプラスミドｐＰＡＢ１を有す
る大腸菌株を５００ｚｌのアンピシリンを含むＬＢ培地
を用いて培養し、前記■のａ）に示したアルカリ溶菌法
に従って、所望のプラスミドＤＮＡｐＰＡＢ１約３００
μｇを得た。

■　プラスミドｐＰＡＢ１の大腸菌Ｎ４８３０への導入 上記■で得られたｐＰＡＢ１プラスミドＤＮＡを、マン
デルとヒガ（Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　Ｈｊｇａ　）　（
ｙ）　＋）　ジ酸カルシウム法［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｊ
ｏｌ、、鈴、　１５’ｉ　（１９７０）］に従って、大
腸菌Ｎ４８３０　（ファルマシア社より入手）に、以下
の通り導入した。

即ち、ＬＢ培地１００ｚ／中で大腸菌Ｎ４８３０を３７
℃で振盪培養し、菌体密度が約５Ｘ１０７／　ｘｌｌと
なったところで培養を止め、水浴中で急冷した。４００
０Ｘｇで５分間、４℃で遠心して集菌した後、沈渣を５
０ｚｌの氷冷した５０ｍＭ塩化カルシウム−１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）に懸濁させ、水浴中で１
５分間静置した後、４０００Ｘｇで５分間、４℃で遠心
分離した。

得られた沈渣を７　ｉｌｌの水冷した５０ｍＭ塩化カル
シウム−１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）の
溶液に再懸濁させ、水冷中に静置した。かくして調製し
た大腸菌の懸濁液０，２ｙ（！にＴＥ緩衝液に溶解させ
たｐＰＡＢ１プラスミド溶液１０μｌ（プラスミドＤＮ
Ａ１００ｇを含む）を加え、水浴中で３０分間静置した
後、４２℃の温渦中にて２分間加温し、次にＩ　Ｉｌｌ
のＬＢ培地を加えて、３７℃で１時間インキュベートし
た。か（して得られた大腸菌懸濁液１００μｌを前記し
た組成のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に播布し、
３７℃で１４時間インキュベートして、形質転換した大
腸菌コロニーを寒天培地上に生じさせた。

■　プロティンＡ−ＥＤ−Ｂ融合蛋白質の単離上記■で
得られた形質転換体（プラスミドｐＰＡＢｌで形質転換
した大腸菌Ｎ４８３０）を、５００ｚｌのＬＢ培地で３
０℃で１４時間、振盪培養した後、予め５４℃に加温し
た５００ｚｌのＬＢ培地を加え、更に４２℃の湯浴中で
９０分間振盪培養して、プロティンＡ−ＥＤ−Ｂ融合蛋
白質の発現を誘導した。

その後、５０００Ｘｇで１５分間、４℃で遠心して菌体
を回収し、これを氷冷したトリス緩衝生理食塩水［５０
ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６，１５０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ／］　１００ｙ／に懸濁させ、水浴中にて超音波破砕
（ブランソノ社製、ソニファイア−２５０を使用し、出
力設定７にて３分間の処理を３回繰り返す）することに
より１．菌体中の蛋白質を放出させた。この破砕液約Ｌ
ｏｏｌ／を遠心分離（１６０００Ｘｇ、２０分、４℃）
して上清画分的９５１１を回収し、３００ｚｌのトリス
緩衝生理食塩水を加えて希釈した後、約１０１１のＩｇ
Ｇ−セファロース６フアーストフロー（ファルマシア社
製）を充填したカラ１１に添着して、プロティンＡ−Ｅ
Ｄ−Ｂ融合蛋白質をカラムに吸着させた。該カラムを１
００７／のトリス緩衝生理食塩水、次に２０１１の５ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ５，０）でそれぞれ洗浄
した後、吸着した蛋白質を０．５Ｍ酢酸溶液にて溶出さ
せた。かくして得られたプロティンＡ−ＥＤ−Ｂ融合蛋
白質をトリス緩衝生理食塩水に対して二昼夜透析して、
所望の抗原的１■を得た。

実施例　２ ハイブリドーマの作製 実施例１で得られた精製ＥＤ−Ｂ−プロティンＡ融合蛋
白質の０．０５■を、０，５ｘｌのＰＢＳで希釈した後
、同量のフロイント完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔ
ｅ　Ｆｒｅｕｎｃｌ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合乳
化させ、これを０．２ｚｌずつ、雄のＢａ１ｂ／ｃ７ウ
ス（８週齢）に皮肉投与した。その後、同様にして４回
、２週問おきに追加投与して免疫し、最終免疫の３日後
に肺臓を摘出した。

摘出肺臓より牌細胞を取り出し、該細胞中に存在する赤
血球を０．８３％塩化アンモニウム液で４℃下に１〜２
分間処理して融解除去した。上記で得られた細胞を感作
リンパ球細胞として集め、３７℃に加温したＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄した。

次にマウス骨髄腫細胞［Ｐ３Ｕ１、Ｃｕｒｒｅｎｔｔｏ
ｐｉｃｓ　１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　７３゜ｐ３　（１９８１）
等参照］を、１５％ＦＣ８（牛胎児血清）を含有するＲ
ＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニン１００μＭを
加えた培地中で、継代培養し、これをミエローマ細胞と
して用い洗浄した。

上記ミエローマ細胞と骨髄腫細胞を細胞数比１０：１に
なるように５０１／のチューブ内で混和し、得られた細
胞混合物を５００Ｘｇで５分間遠心後、上清をパスツー
ルピペットで完全に除去した。之等の操作は３７℃に保
温した水槽内にて行なった。

次に３５％ポリエチレングリコール１５００（和光紬薬
社製、以下ＰＥＧと略称する）４１１を加えて、ゆっく
りと１〜２分間かき混ぜ、１分間放置し、次いで３７℃
に保温したＦｅ２を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地２
ｘｌをゆっくりと１分間位かけて加え、１分間放置し、
更に同波４ｙｌを加えて２分間放置し、更に同波４ｘｌ
を加えて４分間放置した。次いで、３７℃に保温した１
５％ＦＣ８，０，０５力価／ｌの硫酸ストレプトマイシ
ン、６００００Ｕ／ｌのペニシリンＧカリウム、５４■
／ｌのゲンタマイシン及びｌ　ｘｉピルベートを含有す
るＲＰＭＩ−１６４０（以下これを完全ＲＰＭＴ−１６
４０培地という）８１１を２〜３分間かけて加えた後、
５００Ｘｇで５分間遠心分離した。上清を吸引除去し、
３７℃に保温した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地液に、牌
細胞ｌＸ１０６個／　ｘｉとなるように懸濁させた。次
に、この懸濁液を９６ウエルのプレート（コースタ−社
製）に０．１ｘｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２，１
００％湿度のインキュベーター内で２４時間培養した。

その後、各ウェルに、ヒボキサンチン１×１０　Ｍ１ア
ミノプテリン４×１０　及びチミジン１．６Ｘ１０　　
Ｍを含む１０％ＦＣ８添加完全ＲＰＭＩ−１６４０培地
（以下これをＨＡＴ培地という）の０．１ｚｌずつを添
加した。以後、上清を２日目及び３日目にそれぞれ０．
１２７ずつ吸引し、新しいＨＡＴ培地０．１ｘ／ずつを
加えて液交換した。その後、上記液交換を２〜３日おき
に行なった。６日目に同様に上清を吸引し、ヒボキサン
チン１×１０　Ｍ及びチミジン１．６×１０　　Ｍを含
む完全ＲＰＭＴ−１６４０培地（以下これをＨＴ培地と
いう）に代えた。以後、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で
増殖維持した。

上記操作による細胞融合後、１０〜１４日間でコロニー
が肉眼で観察されるようになった。細胞が９６ウエルプ
レートの底面積の１／４を占めた時より、ＥＤ−Ｂを保
持したヒト胎盤由来ＦＮを抗原とする酵素免疫法（ＥＬ
ＩＳＡ法）にて、培養上清を試験し、陽性となったウェ
ルから直ちに限界希釈法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、　７３．３（１９８１））により、ハ
イブリドーマのクローニングを行なった。

即ち、Ｂａ１ｂ／ｃ系マウス胸腺細胞１×１０８個を含
むように調製した１０％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ−１６４０
培地の２０１１を用いて、ハイブリドーマを３個／ウェ
ル、１個／ウェル及び０．３個／ウェルとなるように６
ウエルプレートに０．２ｚｌずつ播いてクローニングを
行ない、目的とするハイブリドーマを樹立した。

上記クローニングは、ヒト正常腺維芽細胞Ｗ■−３８を
腫瘍ウィルスＳＶ４０で悪化させた細胞ＷＴ−３８ＶＡ
１３の培養上清から精製した癌性ＦＮ及び胎盤由来ＦＮ
との反応性を指標として、血漿型ＦＮとの反応性がない
ことを確認しながら、上記クローニングを４回行ない、
所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマ４株を得た。

之等をそれぞれｒＯＡＬ−ＴＦＮ−０１ｊ〜ｒＯＡＬ−
ＴＦＮ−０４Ｊと命名した。

上記で得られたクローン０ＡＬ−ＴＦＮ−０１〜０ＡＬ
−ＴＦＮ−０４を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地にて、
５％Ｃ０２条件下で、３７℃にて、９６時間培養した。

培養液を３００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離して、目
的のモノクローナル抗体を含む培養上清を得た。

得られたクローンの内の１株（本発明抗体産生ハイブリ
ドーマ０ＡＬ−ＴＦＮ−０１）を選定した。

該モノクローナル抗体産生細胞は、工業技術院微生物工
業技術研究所にｒＯＡＬ−ＴＦＮ−０１Ｊなる表示で寄
託されており、その寄託番号は「微工研菌寄第１１５４
０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５４０）　Ｊである。

上記クローン０ＡＬ−ＴＦＮ−０１の１×１０６個を、
予めプリスタン（アルドリッチ社製）を接種しておいた
Ｂａ１ｂ／ｃ系マウスに腹腔内投与した。１０〜１４日
後、蓄積した腹水を採取し、本発明抗体を含む腹水を得
た。

該腹水中の抗体を、ゲルクロマトグラフィー（セファク
リール−３−３００使用）及び陰イオン交換クロマトグ
ラフィー（Ｑ−セファロース使用）を用いて精製して、
精製抗体０ＡＬ−ＴＦＮ−０１を得た。

以下、上記で得られた本発明モノクローナル抗体の特性
を実施例３として示す。

実施例　３ 本発明抗体の性状 ■　抗体のサブクラス マウスモノクローナル抗体サブクラス同定用キット（バ
イオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製）を用いて、本発明
抗体のサブクラスを決定した。

その結果上記抗体のサブクラスは、ＩｇＭであった。

■　抗体産生レベル 実施例２でえた培養上清を遠心分離し、その上清を１０
％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて、３７℃、５
％ＣＯ２の条件で１０日間インビトロにて培養した。

ハイブリドーマが最大細胞密度になった時の培養上清中
の０ＡＬ−ＴＦＮ−０１の１ｇＭ量は、約５μｇ　／　
ｘｉであった。

■　抗体の力価 ＥＩ）−Ｂを保持した胎盤由来のＦＮの精製品（胎盤を
ホモジネート後ウレアにより抽出したもの）２μｇ／ウ
ェルをコートした（４℃、２４時間）９６ウエルポリス
チレンマイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）を、１％ＢＳ
Ａのダルベツコリン酸緩衝液（ｐＨ７，２、以下Ｄ’Ｐ
ＢＳと略称する）で、４℃、２４時間、ブロックした後
、該プレートの各ウェルに実施例２で得た本発明抗体を
含む培養上清５０μｌを加え、室温で３時間反応させた
。洗浄用緩衝液（Ｄ’　　ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン
２０）で３回洗浄後、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリン抗体（ザイメット社製）を用いて、Ｆ
ＮのＥＤ−Ｂ・プロティンＡ融合蛋白質に結合した抗体
を測定した。

その結果、培養上清のｌＸｌｏＩ倍希釈で充分な発色が
認められた。

■　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法による標準曲線 本発明モノクローナル抗体をＤ’ＰＢＳにて２５μｇ　
／　ｚｌに希釈して、これを９６ウエルマイクロプレー
トの各ウェルに１００μｌずっ入れ、４度℃で一晩固定
後、Ｄ’　　ＰＢＳ　（０，０５％ツイーン２０を含む
）で洗浄した。次いで、各ウェルにＤ’　　ＰＢＳ、０
．０５％チメロザール及び０、　５％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を３００μｌずつ入れ、４℃で一晩プロッキ
ングを行なった。ブロッキングの後、Ｄ’　　ＰＢＳ　
（０，０５％ツイーン２０を含む）で洗浄し、各ウェル
に０．０１Ｍリン酸緩衝液［０，１％ＮＰ−４０（ＮＯ
ＮＩＤＥＮＴ　Ｐ−４０、シグマ社製）、０．０５％チ
メロザール、１０％ＦＣ３，ｐＨ５，５］　　１００μ
ｌを入れた。更に各ウェルに、種々の濃度に希釈したヒ
ト血漿より精製したＦＮ　（ｐＦＮ）と、ヒト正常腺維
芽細胞Ｗｒ−３８を腫瘍ウィルスで悪化させた細胞Ｗｌ
−３８ＶＡ１３の培養上清から精製した癌性ＦＮ（ｃＦ
Ｎ）とを、それぞれ２０μｌずつ加え、室温で２．５時
間インキュベーションした後、０．０５％ツイーン２０
を含むＤ’ＰＢＳで６回洗浄した。

更に、上記各ウェルに、バイオチニレート標識（Ｂｉｏ
ｔｉｎｙｌａｔｅｄ）　した抗ＦＮモノクローナル抗体
［０ＡＬ−ｐＦ　１１．５、シグマ社のｐＦＮを免疫原
として樹立したもの、臨床病理、ｖｏｌ・３５補冊、１
９８７年、ｐＨ９；　Ｔｈｅ　１８ｔｈ　Ｃｏｎｇｒｅ
ｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａ
ｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＭｅｄｉｃａｌＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ、　Ａ
ｂｓｔｒａｃｔｓ、　ｐ２２５（１９８Ｂ）等参照］　
　（Ｘ１００Ｏ倍希釈液を１００μｌ／ウエル）　、Ｄ
’　　ＰＢＳ　（１００μ／／ウエル）、０．１％ＣＨ
ＡＰＳ　（３−［（３−フロラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、０．１％
ＢＳＡ、０．０５％チメロザール溶液；Ａ緩衝液１−０
０μｌを加えた後、２．５時間インキュベ゛−ジョンし
、０．０５％ツイーン２０を含むＤ’ＰＢＳ洗浄用緩衝
液で６回洗浄した。

次に、アビジン−パーオキシダーゼ複合体（バイオ・ラ
ッド社製）１００μｌ／ウエルをＡ緩衝に溶解して添加
した後、１時間インキュベーションした。プレートを洗
浄用緩衝液で洗浄後、０−フェニレンジアミン溶液（Ｏ
ＰＤ溶液）を、ウェル当り１００μ！加え、室温で１０
分間反応させた後、１００μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応
を停止させ、４９２１ｍの吸光度を測定した。

上記の結果を第１−図に示す。

図において縦軸は４９２ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を、横
軸はＦＮの濃度を示し、（１）が癌性ＦＮの結果、（２
）が血漿型ＦＮの結果である。

該図より、本発明抗体は血漿型ＦＮとは反応せず、癌性
ＦＮと用量依存的に反応することが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明抗体の各種ＦＮに対する反応性を調べた
結果を示すグラフである。 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下式（１）で表わされるＥＤ−Ｂのアミノ酸配列
   を認識することを特徴とする抗ＥＤ−Ｂモノクローナル
   抗体。 式（１）： 【遺伝子配列があります。】 ［２］ＥＤ−Ｂ領域９１アミノ酸とプロテインＡとの融
   合蛋白質を免疫原として得られる請求項［１］に記載の
   抗ＥＤ−Ｂモノクローナル抗体。