JP2930713B2 - タンパク質ホルモン形成の抑制用の組成物およびその使用法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫学／生化学の領域であり、そして特に
タンパク質ホルモン形成の阻害剤を同定する組成物およ
び方法並びに高められたレベルのホルモンに関連する疾
病を処置する阻害剤の予防学的および治療学的使用方法
に関する。より詳しくは本発明は、種々の疾病、特に敗
血病、AIDSおよび自動免疫疾患を治療するのに使用する
ことができ、従って内科医の代わりに治療計画を与える
化合物の同定を促進する。

米国だけにおいても、病院内の菌血症が約194,000名
の患者に達し、そのうち約75,000名が死亡する。Maki,
D.G.,1981年，Noscomial Infect.,（Dikson,R.E.編），
第183頁,Yrke Medical Books,U.S.A.これらの死亡のう
ちのほとんどが６種類の主要なグラム陰性桿菌に帰すも
のであり、そしてこれらの桿菌は、緑膿菌、大腸菌、プ
ロテウス、クレブジア、エンテロバクターおよびセラチ
アである。菌血症に対する現時の治療は、抗生物質の投
与であるが、不幸なことにかゝる抗生物質の有する有効
性が制限される。

菌血症の正確な病因は説明されていないが、細菌性内
毒素、すなわちリポポリサッカライド（LPS）が主要な
誘因因子であることが知られている。LPSは、少なくと
も３種の有為な抗原性領域、すなわち、脂質Ａ、核ポリ
サッカライドおよび０−特異ポリサッカライドを含んで
なる。後者は、０−特異鎖または単純に０−抗原とも言
われている。０−特異鎖領域は、ポリサッカライド繰り
返し単位から構成された長鎖ポリサッカライドである。
数多くのポリサッカライド単位は、異なる微生物種間で
異なり、そして１ないし６または７程度のモノサッカラ
イド単位にわたることができる。０−特異鎖が異なるグ
ラム陰性桿菌の間で変化するが、脂質Ａおよび核ポリサ
ッカライドは、同一でない場合であっても同様である。

LPSが敗血病に鍵となる役割を果たすので、その活性
を中和するための種々のアプローチが行われている。最
近、LPSに対する抗体が直ちに標準抗生物質治療に有効
な臨床学的付加に供されることを提案するかなりの研究
がある。

LPSは、患者の死亡を結局は引き起こしてしまう生化
学的事項のカースケードを開始する。LPSの導入後の第
２の事項が、マクロファージ細胞のLPS刺激の結果とし
ての腫瘍壊死因子（TNF）であるということが広く信じ
られている。従って、TNFに対する中和抗体またはその
敗血効果を阻害することができるその他の分子を製造す
るためにかなりの労力が費やされている。TNFに対する
抗体が有効な臨床学的用途を有しているであろう。Trac
ey等,1987年，Nature,330:662。

TNFは、膜境界および可溶性分泌形態の両者で存在す
ることが示されている。Decker等,1987年，J.of Immuno
l.,138:957;Kriegler等,1988年，Cell,53:45。ヒトTNF
は、クローニングされ、そして17kdポリペプチドプラス
非常に長い76個のアミノ酸推定シグナルリーダー配列か
らなることが示されている。17kd分子は、敗血病に応答
性のある生化学的カースケードを開始することを包含す
る鍵となる試薬である。Kriegler等,1988年，Cell,53:4
5によりTNFが膜境界26kd形態および17kd種に相当する可
溶性形態の両者で存在し得るということが提案されてい
る。26kb形態は、成熟17kd分子の先駆体またはプロホル
モンである。更に、上記のKriegler等によりTNFの２種
類の形態が異なる生物学的効果を有し得るということも
提案されている。

TNFが敗血病を引き起こすのに鍵となる役割を果たす
ので、抗−TNF予防薬／治療薬を同定しかつ開発する必
要があるということが理解されよう。上記の通り、抗−
TNF抗体は、有望でありそうであり、そしてヒヒにおい
て有効であることが示されている。しかしながら、これ
らの研究は、非−ヒトTNFおよび非−ヒトTNF抗体の使用
を伴っている。実施上の観点から、非−ヒト抗−TNF抗
体は、患者の免疫系による該抗体の免疫的拒絶反応のゆ
えに治療用途が制限されるであろう。従って、ヒト抗体
またはヒト一定領域およびマウス可変領域からなる遺伝
子工学操作された抗体が好ましい。

敗血病に臨界的役割を果たすのに加えて、最近になっ
てTNFは、潜在的ウイルスを担持するヒト細胞における
ヒト免疫不全ウイルスの発現を開始するのに関連するこ
とが示されている。Folks等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.v
ol.86,第2365頁（1989年）。従って、17kdまたはTNFの
低分子量形態の形成の予防または阻害が患者において潜
在的であるウイルスの発現を抑制することによるAIDS患
者の治療に有効な予防薬であろう。

またTNFは、種々の自動免疫疾患、特に関節炎に関連
している。Duff等,1987年,International Confrence on
Tumor Necrosis Factor and Related Cytotoxins,vol.
175:10。従って、TNF作用を阻害する化合物および方法
は、免疫由来の種々の疾病の治療のためのかなりの用途
を有している。

抗体に加えて、TNF禁止活性を有するその他の分子が
調査されてきている。非抗体阻害剤は、Seckinger等,19
88年,J.Exp.Med.,167:151およびSeckinger等,1989年,J.
Biol.Chem.264:11966,およびヨーロッパ特許出願第8883
0365.8号明細書（発明者Wallach等）に記載されてい
る。禁止剤は、熱病患者の尿中に存在しており、そして
精製されかつ27,000〜33,000の分子量を有していること
が示されている。今まで、いかなる阻害剤も敗血病の治
療に有効であることが示されていない。

上記の記載から、敗血病の治療に有効に適用される抗
体またはその他に基づく付加的な抗−TNF阻害剤を同定
しかつ開発する必要があるこが明らかである。

その最も一般的形態において、本明細書に記載される
発明は、プロホルモン先駆体からのタンパク質ホルモ
ン、好ましくは免疫由来のタンパク質ホルモンの成熟形
態の産生を禁止する方法および組成物を提供する。これ
らの組成物は、該成熟ホルモンの高められた循環レベル
と関連する患者における疾病を防止するかまたは治療す
るのに有効である。

本発明の第２の目的は、TNFの１または複数の成熟形
態の産生を阻害する分子を同定する方法を提供すること
に関する。かゝる阻害剤は、TNFを中和する抗−TNF抗体
TNFおよびLPSに結合しLPSの影響を中和する抗−LPS抗体
の両者と識別可能である。

本発明の第３の目的は、26kd分子を分裂し、もって低
分子量敗血病誘因分子を産生するコンバーターゼと命名
された酵素によって26kd TNFプロホルモンの分裂を干渉
する敗血病の予防薬および治療薬の能力を前提としてこ
れらの医薬品を同定するのに使用できる方法の記載であ
る。

本発明の第４の目的は、76個のアミノ酸シグナル配列
を26kd分子から除去して17kd TNFを産生するコンバータ
ーゼの活性で阻害することによってTNFの26kd先駆体か
らTNFの17kd成熟形態の産生を干渉する禁止剤の能力を
前提として著しい予防薬および／または治療薬用途を有
する阻害剤を同定する方法の記載である。

本発明の第５の目的は、コンバーターゼの阻害剤であ
りなおかつ敗血病の予防および／または治療に有効であ
る化合物の群の表示である。この群に属する化合物の部
分的リストとして、抗コンバーターゼ抗体、プロホルモ
ン系のムテインおよびコンバーターゼへの結合に対して
TNFの26kd形態と競合するタンパク質およびペプチドが
包含される。

本発明の第６の目的は、コンバーターゼ活性を阻害
し、そしてコンバーターゼによって認識されたものに対
応するTNFのアミノ酸配列を有する敗血病を治療するの
に有効である好ましい予防薬または治療薬の表示であ
る。

本発明の第７の目的は、26kd TNF分子を敗血病誘導形
態に転化するコンバーターゼの記載である。

これらの目的および別の目的は、以下に記載する本発
明の詳細な説明の後に明らかになるであろう。

図1,パネルＡは、26kd TNFをコード化するDNA配列の
制限マップを示す。パネルＢは、26kd TNFの疎水性プロ
ットを示し、そして分子のDNAおよびアミノ酸配列を示
す。

図２は、TNFコンバーターゼによる26kd TNFの転化を
示す。レーンＡ、ＢおよびＣは、種々の対照を示す。す
なわち、TNF6.8細胞分解物（Ａ）、26kd転写／翻訳
（Ｂ）およびインキュベーション（Ｃ）対照である。レ
ーンＤ、ＥおよびＦは、HL 60 S−１サイトソール非誘
導（Ｄ）および誘導（Ｆ）画分または誘導細胞から調製
されたＰ−１ペレット画分のいずれかに存在するコンバ
ーターゼによる転写／翻訳発生26kd TNFの主として17kd
TNFへの転化を示す。Ｇは、ブランクレーンである。

図３は、ゲル電気泳動により測定した26kd TNFのその
低分子量形態への転化を示す。パネル１のＡ、Ｂ、Ｃお
よびＤは、各々pFVXM−TNF6トランスフェクト細胞系TNF
6.8（Kriegler等,1988年,Cell,53:45）、生体外転写／
翻訳26kd TNFの免疫沈降物、（１−（（３−（（アセチ
ルオキシ）−７−メトキシ−８−オキシ−８−オキソ−
５−チオ−１−アゾビシクロ［4.2.0］オクト−２−エ
ン−２−イル）カルボニルモルホリン,S,S−ジオキサイ
ド（6R−シス）の26kd TNFの転化に対するおよび（１−
（（３−（（アセチルオキシ）−７−メトキシ−８−オ
キシ−８−オキソ−５−チオ−１−アゾビシクロ［4.2.
0］オクト−２−エン−２−イル）カルボニルモルホリ
ン,S,S−ジオキサイド（6R−シス）の不存在下の26kd T
NFの転化に対する効果を示す。パネル２のＡおよびＢ
は、各々pFVXM−TNF6トランスフェクト細胞系TNF6.8（K
riegler等,1988年,Cell,53:45）および生体外転写／翻
訳26kd TNFの免疫沈降物を示す。レーンＣおよびＤは、
各々3,4−ジクロロクマリンの存在下および不存在下の2
6kd TNFの転化を示す。レーンＥおよびＦは、各々エラ
スチナールの存在下および不存在下の26kd TNFの転化を
示す。

本願出願人の発明の特徴および範囲の理解を促進する
ために、本発明の種々の態様に関するいくつかの定義を
以下に記載する。しかしながら、これらの定義が実際に
一般的でありそして定義に包含されるのものが当業者に
周知であるということが理解されよう。

用語「プロホルモン」および「成熟」ホルモンとは、
以下の意味を持つ。プロピルホルモンは、生体内産生の
際に除去されたタンパク質のプペチドセグメントを有す
るタンパク質、好ましくは免疫器官のタンパク質をカバ
ーすることが意図される。ペプチドの除去は、ホルモン
の「成熟」形態をもたらす。本発明の好ましい態様は、
以下に記載するように17kd TNF成熟形態に主として分裂
される25kd TNFである。しかしながら、その他の分裂生
成物も該プロホルモンから形成され、これらは、「成
熟」ホルモンの内に入ることを意図する。最後に、TNF
に加えてプロホルモンがこれらの定義の範囲内に入るこ
とが意図され、そして本発明の一部に考慮されているこ
とを記載するのは重要なことである。プロホルモンの例
は、CSFおよびIL−１である。

敗血病とは、本明細書においてグラム陽性またはグラ
ム陰性微生物感染により生じた疾病を意味すると定義さ
れ、後者は、主として細菌性内毒素、すなわちリポポリ
サッカライド（LPS）によるものである。これは、少な
くとも６種類のグラム陰性桿菌により誘導され、そして
かゝる桿菌は、桿菌は、緑膿菌、大腸菌、プロテウス、
クレブジア、エンテロバクターおよびセラチアである。
TNFは、疾病の所期相で検出可能でありかつその進行に
寄与する１つの因子である。17kd分子および当該技術分
野に公知のより短いムテインが主要な活性種である。

本発明において使用されているとおり、約26,000の分
子量を有するTNFとは、TNFのプロホルモンの形態であ
る。該プロホルモンのアミノ末端ペプチドの長さが誘導
された種に依存して変化し、一方該分子のプロペプチド
セグメントが高度に転化されるということは公知であ
る。事実、マウスにおいて、プロホルモンの推定リーダ
ー配列を構成する79個のアミノ酸の約86％がヒトTNFの
プロ配列を構成する76個の公知のアミノと同一である。
従って、約26,000の分子量を有するTNFについて参照し
た際に、何を示すのかとは特定の種から誘導されずかつ
当該技術分野に公知のとおりのヒトTNFと比較して若干
変更されたリーダー配列を持ってもよい分子であるとい
うことが当業者に理解されよう。

用語「コンバーターゼ」または「TNFコンバーター
ゼ」とは、26kd TNFの分裂に関して１種類またはそれ以
上の低分子量種に対して応答性である体内に通常存在す
る酵素を包含することを意味する。該コンバーターゼ
は、有為な活性がサイトゾルに位置するが実質的に膜関
連である。該コンバーターゼの別の性質は、このものが
TNFを産生する細胞と主として関連するということであ
る。

TNFコンバーターゼに適用される用語「膜関連」と
は、30,000xgペレット画分におけるほとんどのコンバー
ターゼ活性の存在により示されるような実質的不溶性で
あるコンバーターゼの形態である。

「組換抗体」とは、重鎖および短鎖の各アミノ酸配列
の１つが特定の種から誘導されたあるいは特定の群に属
する抗体における対応する配列に相同性であり、一方鎖
の残りのセグメントが他における対応する配列と相同で
ある抗体を言う。最も一般には、組換抗体において、短
鎖および重鎖の両者の可変領域が哺乳動物のある種の抗
体の可変領域を写し、一方一定領域が他から誘導された
抗体における配列と相同である。

その最も一般的な形態において、本発明は、これらの
プロホルモン形態から誘導された成熟ホルモンの産生に
関連する疾病の阻害剤を同定する方法および組成物に関
する。プロホルモンの好ましい態様は、敗血病をもたら
すのに関連する低分子量分子、好ましくは17,000の分子
量をもつものに分裂する26kd TNFである。従って、TNF
の26kd形態の転化を干渉することができる阻害剤は、敗
血病を抑制または治療するのに有効である。

本発明において記載される検定は、プロホルモンのそ
の成熟形態への転化を決定するが、好ましい態様はTNF
の26kd分子量形態の好ましくは17,000分子量形態への酵
素転化である。転化に関して応答性の酵素は、コンバー
ターゼと命名される。従って本発明は、４つのパートを
最も速やかに提供する。パート１は、TNFの26kd形態を
実現する物質および方法である。パート２は、TNFコン
バーターゼのソースおよび該酵素を部分的に精製する方
法を同定する。パート３は、種々のコンバーターゼ禁止
剤を決定しそして同定する検定を記載する。最後に、本
発明のパート５は、敗血病に病む患者を治療するための
該禁止剤の使用方法の記載を提供する。これらの各セク
ションを、個々に説明する。

数例の特許／特許出願および科学文献を、以下に記載
する。本発明は、これらの文献に記載された物質および
方法のいくつかを参考にしており、従ってこれらの全て
を完全な形態で参考文献として取り込んでいる。

26kd TNF種の転化の測定を可能にする実質的にいかな
る方法を使用してもTNFの阻害剤を同定することができ
るということを記載するのは重要であり、そして強調す
べきである。従って、以下に記載する組換系が26kd分子
をかなりの量で獲得せしめ、従ってTNF阻害剤の検定を
促進するが、非組換系も使用できることが理解されよ
う。例えば、26kd分子が刺激単球において同定できると
いうことが示されている。これは、Kriegler等,1988年,
Cell,53:45に記載されている。従って、好適な検定法
は、単球を刺激して26kd分子を産生し、次いでコンバー
ターゼの存在下に、低分子量種、好ましくは17,000分子
量種への消失を測定する。

26,000分子の転化に関して、以下に明らかにするよう
にコンバーターゼは、１つの内部部位、そしておそらく
数箇所で分子を分裂する。主要な部位は、TNFの分泌形
態、すなわち17,000分子量種をリーダー配列から分離す
る接点である。この接点における配列は、−Gln−Ala−
Val−Arg−Ser−である。従って、バリンが17,000分子
量分子のアミノ末端アミノであることが知られているの
で、主要な分裂は、アラニンとバリンとの間で生じる。
TNFの数例の別の種がコンバーターゼによって産生さ
れ、従ってこれらは、第２の分裂部位の産生物である。
阻害病の禁止剤の同定に関する限りは26,000分子が１ま
たは複数の部位で分裂するかに無関係に、本検定が26,0
00TNFの転化の阻害または低分子量形態の出現のいずれ
かを監視することができるので、これは、重要なことで
はない。

26kdまたは17kdのいずれかの形態でTNFがクローニン
グされており、そして数多くの系で発現されている。例
えば、ラビットTNFのクローニングは、1985年６月26日
に発行されたヨーロッパ特許第146,026号明細書（大日
本薬品株式会社）および1985年７月17日に発行されたヨ
ーロッパ特許第148,311号明細書（旭化成工業株式会
社）に記載されている。151および155アミノ酸（２およ
び６原型より少ない）を有するヒトTNFのクローニング
が1985年９月25日に発行されたヨーロッパ特許第155,54
9号明細書（大日本薬品株式会社）および155アミノ酸を
有するヒトTNFのクローニングが1985年10月３日に発行
され、そして1985年11月20日に発行れた英国特許第1,15
8,829Aに対応するたヨーロッパ特許第158,286号明細書
（旭化成工業株式会社）に記載されている。成熟TNF（1
57アミノ酸）およびその種々の変性形態（ムテイン）の
クローニングが1986年１月15日に発行されたヨーロッパ
特許第168,214号明細書（Genetrch）および1985年10月
３日に出願されたPCT US 85/01921明細書に記載されて
いる。会社のPCT 85/01921は、WO 86/02381号明細書に
対応する。

加えて、米国特許第4,677,063号明細書および同第4,6
77,064号明細書は、TNFの26,000および17,000形態並び
にこれらのムテインをコード化するcDNAを示している。

26kd種をコード化するcDNAを、WO 86/02381号明細書
および米国特許第4,677,063号明細書および同第4,677,0
64号明細書に記載されたプラスミドpB11から得るのが好
ましい。プラスミドpB11は、TNFコード配列への操作可
能な結合においてSV40を含有しており、従って真核性宿
主細胞における26kd TNF種を発現するのに有効である。
加えて、26kd TNF種をコード化する全配列を含有する第
２のプラスミドが米国特許出願および米国特許に記載さ
れている。これをpE4と命名する。プラスミドpE4は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番
号39894で寄託されている。

26kd種をコード化するcDNAは、Pst1画分としてプラス
ミドpB11中に存在する。従って、これは、速やかに除去
されそして数多くの好適な発現系のうちのいずれか１つ
に挿入される。好ましい発現系は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託番号39894で寄託さ
れているプラスミドpFVXMである。

pFVXMは、Kriegler等,1988年,Cell,53:45に記載され
たプラスミドpEVXから誘導されたレトロウイルスベクタ
ーである。pEVXは、モロネイネズミ白血病ウイルス誘導
スプライス宿主部位３′ないし５′−長末端繰り返しを
有している。このスプライス宿主配列がレトロウイルス
構造の正確にスプライシングされた翻訳鋳型の収率を減
少することが先に報告されている。従って、pEVXを操作
してスプライス宿主部位を除去し、そしてモロネイネズ
ミ白血病ウイルススプライス宿主を欠く同様な肉腫ウイ
ルスゲノムで置換する。得られたベクターpFVXMは、モ
ロネイネズミ白血病ウイルススプライス宿主を欠き、そ
してウイルス性パッケージ配列を担持する。pFVXMは、2
6kd TNF種をコード化するDNA配列を挿入できる便利なPs
t I部位を有する。

種々の生物学的材料がコンバーターゼ活性のソースと
して利用できる。これには、組織、細胞または抽出物あ
るいはこれらと関連する流体を包含し、必須ではないが
免疫由来のものが好ましい。さらにまた、確立された細
胞系も利用できる。好適なソースとして、ヒト末梢血単
核細胞、例えば白血球または白血球由来の細胞系、好ま
しくは細胞系HL60が挙げられる。確立された細胞の操作
容易性のゆえに、コンバーターゼの好ましいソースは、
HL60である。従って、26kd TNF種の17kd種への転化は、
26kd種を無傷のHL60細胞、これから誘導された抽出物ま
たはHL60細胞を成長させる、従ってコンバーターゼ活性
を含有する培地のいずれかと一緒にすることによって感
作することができる。数例の細胞種において、コンバー
ターゼ活性は、以下に記載する好適アニリン刺激の後に
培養培地中に存在する。さらに、コンバーターゼ活性が
部分的に膜関連であるので、使用可能な膜画分を得るこ
とが可能である。

単球を単離する方法は、細胞系、例えばHL60を培養す
るその他の方法と同様に当該技術分野に公知である。要
するに、単球を、標準的操作を用いてまずFicoll−paqu
eおよび濾過器（percol）を通じての遠心により末梢血
から調製することができる。これにより、単球および白
血球の富化された母集団が得られ、そして上記単球は、
細胞の混合物を組培養皿上にプレートし、そして単球を
皿の上に付着させるのに充分な時間細胞をインキュベー
トすることによって更に富化することができる。つい
で、白血球をプレートから洗い出し、付着単球だけを残
す。ついで、これらの細胞をそのまま使用することがで
き、あるいは該細胞を刺激して公知の単球活性剤、好ま
しくはリポポリサッカライドおよびフォルバールミリス
テートアセテートを用いて高められたレベルのコンバー
ターゼを得ることもできる。細胞は、分画することがで
き、そしてこれから調製された抽出物または膜であるこ
とができ、そして以下に記載する検定に利用することが
できる。

コンバーターゼ活性の阻害剤はまた、敗血病の治療に
使用できる予防剤または治療剤であり得る。これらは、
先の検定を使用して、そしてさらに阻害活性を試験しよ
うとする反応混合物化合物を検定に含めて同定すること
ができる。好適な検定は、26kd TNF、コンバーターゼお
よび推定阻害剤を組み合わせてなる。阻害材料をコンバ
ーターゼをTNFに添加する前にコンバーターゼに添加す
るかあるいはこれを先にまたはコンバーターゼを添加し
た直後に添加することことができるということが当業者
に理解されよう。添加の順序は、阻害剤の同定を促進す
るであろうが、これは限定されない。ある物質が阻害活
性を有する場合に、このものは、26kd種の量の減少を表
しそして付加的に低分子量TNF分子の存在を表す溶液の
電気泳動検定によって表すことができる。

疑いのない抗コンバーターゼ活性を有する化合物の同
定に加えて、いくつかの化合物、例えば抗コンバーター
ゼ抗体、モノクローナルまたはポリクローナルあるいは
組換抗体好ましくはヒューマナイズドされたものが強い
阻害活性を示すであろう。コンバーターゼに対するモノ
クローナル抗体を、長年にわたって当該技術分野で変更
されてきたKohler,GおよびMillstein,C,1975年,Nature,
256:495に記載の一般的方法を使用して製造することが
できる。これらの初期的な研究は、ネズミリンパ球およ
び薬物選択的形質細胞を融合してハイブリドーマを製造
することを伴う。引き続いて、ヒトモノクロナール抗体
を分泌するハイブリッド細胞系を製造する技術を適用す
る。後者の操作は、一般にAbrams.P.,1986年,Method in
Enzymology,121:107に記載されているが、その他の変
更も当該技術分野において公知である。ネズミまたはヒ
ト抗体を製造するかに無関係に、抗体分泌細胞を、融合
パートナーおよび好適な融合剤、好ましくはポリエチレ
ングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール
1000と一緒にする。後者は、穏やかに撹拌しながら短時
間にわたって少量で抗体分泌細胞および融合パートナー
を含有する細胞ペレットに添加される。融合剤の添加
後、細胞混合物を洗浄して融合剤、細胞性組織片および
選択的成長培地を含む好適な細胞培養室内で接種された
融合および非融合細胞からなる細胞混合物を除去する。
数週間の期間の後に、ハイブリッド細胞が出現し、そし
てこのものは抗体産生として同定され、そして安定なハ
イブリッド細胞系に確実にサブクローンニングすること
ができる。

好ましい抗体は、抗体産生ハイブリッド細胞系の不滅
化（immoryalization）により生体内外のいずれかでの
コンバーターゼを用いて合成されたリンパ球から製造す
ることができるヒトモノクローナル抗体であり、しかし
て所望の抗体の永久的ソースを利用可能とする。生体内
免疫化技術は、当該技術分野に周知であり、一方生体外
技術は、一般にLuben,R.およびMohler,M,1980年,Melecu
lar Immunology,17:635、Reading,C,Methods in Enzymo
logy,121（第Ｄ部）:18,またはVoss,B.,1986年,Methods
in Enzymology,121:27に記載されている。数多くの生
体外免疫化系がヒトＢ−細胞を感作するのに有効である
ことが示されている。Reading,C,1982年,J.of Immun.Me
thods,53:161。

コンバーターゼで直接個体を感作する代わりに、リン
パ球を、実験的であるかまたは桿菌アタックを受けた個
体から単離することができることは当業者に明らかであ
ろう。これらのリンパ球の画分を、コンバーターゼに感
作させ、そして永久的抗体分泌ハイブリッド細胞系を製
造するのに使用できる。例えば、免疫無防備ヒト患者
は、一般に桿菌感染に感受性があり、特に種々の悪性疾
患、甚だしい火傷等に病む患者およびこれらから単離さ
れたリンパ球は、抗体分泌細胞であり得る。

感作されたリンパ球は、ウイルス性形質転換により不
滅化することができる。ヒトリンパ球のための好ましい
ウイルス性形質転換は、エプスタイン−バーウイルスの
使用を伴う。このウイルスは、ヒトＢ−細胞を形質転換
することができ、そしてヒトモノクローナル抗体を発生
するのに使用されている。Crawford,D.等,1983年,J.Imm
un.Today,4:72。

感作されたリンパ球を不滅化するその他の方法は、上
記の２種類の技術の組み合わせ、すなわちウイルス形質
転換と細胞融合との組み合わせからなる。好ましい組み
合わせは、抗体分泌細胞のエプスタイン−バーウイルス
による形質転換および引き続きの形質転換細胞の好適な
融合パートナーへの融合からなる。融合パートナーは、
マウスミエローマ細胞系、ヘテロミエローマ系またはそ
の他の不滅化細胞系であり得る。PCT特許出願81/00957;
Schhlom等,1980年,PANS USA,77:6841;Croce等.,1980年,
Nature,288:488。好ましい融合パートナーは、マウス−
ヒトヘテロ−ハイブリッドであり、そしてより好ましく
はF3B6と命名された細胞系である。この細胞系は、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号
HB8758で寄託されている。これは、1985年４月18日に寄
託された。F3B6を発生させる方法は、ヨーロッパ特許出
願公告第174,204号明細書に記載されている。

エプスタイン−バーウイルス形質転換の使用および不
滅抗体分泌細胞系の製造に適用可能な技術は、Roder,J
等,1986年,Methods in Enzymology,121:140により提供
されてる。基本的に、この方法は、好適なソース、一般
には感染細胞系からエプスタイン−バーウイルスを単離
し、ターゲット抗体分泌細胞を該ウイルスを含有する上
澄み液に暴露することかなる。この細胞を洗浄し、そし
て好適な細胞培養培地中で培養する。引き続いて、細胞
培養液に存在するウイルス性形質転換された細胞を、エ
プスタイン−バーウイルス性核抗原の存在により同定
し、そして形質転換抗体分泌細胞を、当該技術分野に公
知の標準方法により同定することができる。

本発明の好ましい態様が中和抗コンバーターゼモノク
ローナル抗体単独またはその組み合わせであるが、１な
いし複数の抗体を変更し、そしてなおも生物学的活性を
保持し得るということは当業者に明らかであろう。従っ
て、本発明の範囲内の包含されるのは、種々のサイズの
フラグメント、例えばＦ（ab′）_２、Fab、Fv等であ
る。また、抗体を産生するハイブリット細胞系は、公知
の遺伝子技術により単離され細胞に移植されて遺伝子工
学抗体を産生することができる所望の抗体をコード化す
るDNAのソースであるとみなし得る。後者の例は、本明
細書に記載されたハイブリドーマの抗体結合部分を有す
る単鎖抗体の産生である。単鎖抗体は、米国特許第4,70
4,692号明細書に記載されている。遺伝子工学抗体の第
２の例は、組換またはキメラ抗体である。組換抗体を製
造する方法は、米国特許第4,816,567号明細書、発明者C
abilly等、1984年８月15日に出願した日本国特許出願第
84169370号明細書;1984年９月３日に出願した米国特許
出願第84422238号明細書；および1985年10月28日に出願
した日本国特許出願第85239543号明細書に示されてい
る。また、1984年３月27日に出願した英国特許出願第86
7679号明細書は、軽鎖または重鎖可変ドメインにおける
少なくとも一部の相補性測定領域（CDR）が異なる特異
性の抗体からの同様な部分のCDRで置換されている変更
抗体を製造する方法を記載している。この明細書に記載
されている方法を使用して、一方の種のCDR領域がそのC
DR領域が置換された第２の種のからの抗体上にグラフト
した組換抗体を構築することが可能である。この例にお
ける好ましい態様は、ヒト抗体のCDR領域を置き換える
ネズミ抗コンバーターゼ抗体CDR領域である。

抗体に加えて、コンバーターゼへの結合に関して26kd
TNFと競合する化合物が26kd TNFの17kd形態への転化を
阻害または減少し、従って敗血病を治療するのに有効な
医薬品である。かゝる群の試薬は、TNFの26kd形態と同
様なコンバーターゼ結合活性を有するペプチドまたはタ
ンパク質あるいは合成または天然由来の化合物からな
る。この群の内の好ましいものは、26kd TNFおよび17kd
種間の接点で見出されたものと同様のアミノ酸配列を有
するペプチドおよびタンパク質である。この配列は、Gl
n−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−Ser（式中、Alaは分裂の
後に膜内に残存するTNFの部分上に存在する残基であ
り、そしてValは17kd TNFのＮ−末端アミノ酸である）
である。この配列が７つのアミノ酸からなるが、何が最
小に意図されるかとはコンバーターゼにより認識される
ジペプチド配列であり、そしてこの配列がAla−Valであ
るということを記載するのは重要である。従って、ペプ
チド配列が阻害性のペプチドまたはタンパク質の一部と
して必要とされるが、後者は、コンバーターゼと結合し
かつその酵素活性を阻害するのを高めるあるいはコンバ
ーターゼと結合しかつその酵素活性を阻害するのにジペ
プチド配列に必要とされる付加的なアミノ酸を持つこと
もできる。

ペプチド／タンパク質コンバーターゼ阻害剤の変更態
様は、アミノ酸配列、すなわちGln−Ala−Val−Arg−Se
r−Ser−Ser−Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Va
l−Alaに機能的に同等である配列を有するものである。
このペプチドは、両コンバーターゼ分裂部位にわたり、
従ってTNFの17kd形態および低分子量形態の形成を防止
する。第１のそして有為の分裂部位は、位置−１および
＋１におけるアラニンとバリンとの間であり、そして第
２の部位は、位置＋12および＋13におけるプロリンとバ
リンとの間である。これらの位置は、図１に示されたア
ミノ酸配列に相当する。

第２の群の競合的阻害剤は、上記の配列、すなわちGl
n−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−SerまたはGln−Ala−Val
−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−Lys
−Pro−Val−Alaを有するアミノ酸が突然変異または欠
如して非分裂基質を与える化合物からなる。この群の好
ましい態様は、標準部位特異性突然変異技術により製造
された非−分裂性TNFムテインである。最も好ましいも
のは、アラニンおよび／またはバリンが置換または削除
されたムテインである。

上記のペプチドは、当該技術分野に周知の技術、例え
ばScienece,232:第341〜347頁（1985年）に記載されたM
errifield固相法によって作製することができる。この
方法は、市販の合成剤、例えばBiosearch9500自動化ペ
プチド機械を使用してよいが、ブロックアミノ酸の分裂
は、弗化水素および15〜20μm Vvdac C4 PrepPAK上のWa
ters Delta Prep 3000装置を使用して調製用HPLCにより
精製されたペプチドを用いて達成される。

最後に、コンバーターゼの特異性がエラセターゼのよ
うな酵素、すなわち自然にチャージされたアミノ酸、例
えばバリン、プロリンおよびアラニン残基の間で分裂す
るのが好ましい酵素と同様であるということを認識する
ことは重要である。従って、上記のペプチド阻害剤に加
えて、エラスターゼを阻害することが知られている種々
の別の阻害剤も、一般にTNFを分裂する酵素を阻害す
る。以下の検定を使用して、コンバーターゼを阻害する
ような化合物を同定することができる。種々のエラスタ
ーゼ阻害剤が市販されており（例えば、Boehringer Man
nheim Biochemicalsのカタログを参照されたし）、ある
いは当該技術分野に公知である。Doherty等,1986年,Nat
ure,322:199:米国特許第4,711,886号明細書；同第4,79
7,396号明細書；同第4,717,722号明細書，および同第4,
699,904号明細書。好ましいエラスターゼ阻害剤は、変
性セファロポリン抗生物質、例えば上記のDoherty等に
よって示されたものである。より好ましくは、１−
（（３−（（アセチルオキシ）−７−メトキシ−８−オ
キシ−８−オキソ−５−チオ−１−アゾビシクロ［4.2.
0］オクト−２−エン−２−イル）カルボニルモルホリ
ン,S,S−ジオキサイド（6R−シス）である。また、Stet
ler等,1986年,Nucleic Acid Research,14:7883は、好中
球エラスターゼの阻害剤に関してコードするcDNAクロー
ンを記載している。

細胞を形質転換しベクターを作製し、メッセンジャー
RNAを抽出する等に使用し得る本明細書において記載さ
れたほとんどの組換技術は、バイオテクノロジーにおい
て実施されており、そしてほとんどの当業者は、利用す
る標準材料および方法に精通している。しかしながら、
以下のパラグラフを、ガイダンスとして提出する。

所望とするTNFコード配列を含有する好適なベクター
の構成は、当該技術分野に充分に理解されているライゲ
ーションおよび制限技術を利用する。単離されたベクタ
ー、DNA配列または合成ヌクレオチドを分裂し、仕上
げ、そして所望の形態に再ライゲーションする。部位特
異性DNA分裂は、１種または複数の好適な酵素で当該技
術分野に一般に理解されている条件下にそしてその内特
にこれらの市販酵素の製造者に特定された条件下に処置
することによって行われる。例えばNew England Biolab
s,製品カタログを参照のこと。一般に、プラスミドまた
はDNA配列１μを、緩衝溶液約20μ中の酵素約20μ
により分裂する。本明細書における例において、代表
的には過剰の制限酵素を使用してDNA基質の完全な消化
を保証する。変更もあり得るが、37℃で約１ないし２時
間のインキュベーション時間が処理可能である。各イン
キュベーションの後、タンパク質をフェノール／クロロ
ホルムでの抽出により除去し、そして引き続いてエーテ
ル抽出してもよく、そして核酸をエタノールによる沈降
および引き続きのSephadex G−50カラムを使用したクロ
マトグラフィーによる水性フラクションから分離する。
所望により、分裂フラグメントのサイズ分離を、標準技
術を使用したポリアクリルアミドゲルまたは電気泳動に
より行ってもよい。サイズ分離の一般的な記載は、Meth
ods in Enzymology,1980年,62:499〜500に見出される。

制限分裂フラグメントは、50mMトリスpH7.6、50mM Na
Cl、6mM MgCl₂、6mM DTTおよび10mM dTNP中で20〜25℃
で約15ないし25秒のインキュベーション時間を使用して
４つのデオキシヌクレオチドトリフォスフェート（dNT
P）の存在下に大腸菌DNAポリメラーゼＩの巨大なフラグ
メント、すなわちクレノウ（Klenow）フラグメントで処
置することによってブラントエンド（blunt ended）て
もよい。Klenow処置の後に、この混合物を、フェノール
／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈降する。
好適な条件下でのSIヌクレアーゼでの処置の結果、単鎖
部位の加水分解が生じる。

ライゲーションは、15〜30μ容量中で以下の標準条
件下に行われる。20mM トリス−Cl,pH7.5、10mM MgC
l₂、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM〜50mM NaClおよび1
mM ATP、0.3〜0.6（Weiss）単位T4 DNAリガーゼ、４
℃、スティッキーエンド（sticky end）ライゲーション
またはブラントエンドライゲーション。分子内「スティ
ッキーエンド」ライゲーションは、通常33〜100μg/ml
総DNA濃度で行われる。ブラントエンドライゲーション
におて、最後の総DNA濃度は、約1mMである。

「ベクターフラグメント」を利用するベクター構築に
おいて、ベクターフラグメントは、５′燐酸塩を除去
し、そしてベクターのライゲーションを防ぐために、細
菌性アルカリ燐酸塩（BAP）で共通に処置される。BAP消
化は、約150mMトリス中でNa⁺およびMg²⁺の存在下に60℃
で約１時間ベクター１μｇ当たりBSA約１単位を使用し
て行われる。別法として、望ましくないフラグメントの
付加的な制限酵素消化により二重消化されているベクタ
ーにおいて、再ライゲーションを防ぐことができる。

以下に示す構築において、正確なライゲーションが、
先ず適当な大腸菌株をライゲーション混合物で形質転換
することによって確認される。上首尾な形質転換株が、
アンピシリン、テトラシクリンまたはその他の抗生物質
に対する耐性によりあるいは当該技術分野において理解
されているとおりプラスミド構築の態様に依りその他の
マーカーを使用して選択される。ミニプレップ（minipr
ep）DNAを、D.Ish−Howowicz等,1981年,Nucleic Acids
Res.,9:2989の方法により該形質転換株から調製するこ
とができ、そして制限により分析および／またはF.sANG
ER等,1977年,Proc.Natl.Acad.Sic.（USA）,74:543のジ
オキシ法によりそして更にMessing等,1981年,Nucleic A
cids Res.,9:309またはMaxam等,1980年,Methods in Enz
ymology,65:499の方法により配列することができる。

M13におけるクローニングに使用される宿主菌株は、
ファージ感染に感受性のある大腸菌株、例えば大腸菌K1
2株DG98が利用される。このDG98は、ATCCに1984年７月1
3日に寄託蛮行1965で寄託されている。

使用する宿主細胞に依り、形質転換が、その細胞に適
当な標準技術を使用してなされる。S.N.Cohen,1972年,P
roc.Natl.Acad.Sic.（USA）,69:2100に記載されたよう
な塩化カルシウムを使用するカルシウム法またはManiar
ts等,1984年,Molecular Cloning:A laboraty Manual,Co
ld Sprirg Harbor Press,第254頁に記載されたRbCl
₂を、原核生物に使用してもよい。また、トランスフェ
クションもGraham,F.L.等,1973年,Viology 52:456また
はWigler等,1978年,Cell,14:725の燐酸カルシウム調製
法の変法を使用して達成し得る。

合成オリゴヌクレオチドは、Matteuci等,1981年,J.A
m.Chem.Soc.,103:3185のトリエステル法によりまたは市
販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製さ
れた。アニーリングに先立ってのまたは標識化のための
単一株のキナージングは、50mM トリス,pH7.6、10mM Mg
Cl₂、5mM ジチオセリトール、１〜2mM ATP、1.7pモルガ
ンマ³²P−ATP（2.9McI/mモル）、0.1mM スペロミヂン、
0.1mM EDTAの存在下に0.1nモル基質に対して過剰の、例
えば約10単離のポリプクレオチドキナーゼを使用して達
成される。

突然変異生成は、数多くの当該技術分野に公知の方法
を使用して行うことができる。これらの技術は、Smith,
1985年,Annual review of Genetics,19:423に記載され
ており、これらの技術のいくつかの変法は、Methods in
Enzymology,154,第Ｅ部（編者）WuおよびGrossman（19
87年）、第17、18、19および20章に記載されている。一
般的方法は、Kramer等，上記のMethods in Enzymology
の第17章に記載されている。

従来のM13突然変異生成法は、短合成オリゴヌクレオ
チドを突然変異生成しようとするクローンされたターゲ
ットコード配列を有する鎖M13 DNAにアニーリングする
ことを伴う。このオリゴヌクレオチドは、完全ではない
がほとんどターゲット配列に相同であり、単鎖DNAの残
りの部分は、満たされていてムテインの発現をさせる好
適な宿主細胞にトランスフェクトされ得るヘテロデラッ
クスDNAを与えなければならない。ギャップデラックス
法において、ターゲット領域および残部の単鎖M13 DNA
が暴露されるのとは異なりターゲット領域だけが暴露さ
れる部分的デラックスDNAが構築される。従来法と同様
に、短オリゴヌクレオチドがターゲット領域にアニーリ
ングされ、そして延長されライゲーションされてヘテロ
デラックスを製造する。しかしながら、ほんの小部分の
単鎖DNAがギャップデラックス法においてハイブリッド
形成に有効であるので、オリゴヌクレオチドは、M13ゲ
ノムの望ましくない領域にアニーリングされない。更に
また、この方法は、ターゲット領域のいずれかの側上の
DNAの非常に小さい領域だけが満たされるのでヘテロデ
ラックスの形成の際により少ないエラーを取り込むとい
う付加的な利点を有している。

より詳しくは、ギャップデラックス法は、ターゲット
DNA配列を選択的マーカー、例えば停止コドンアンバー
ムテインを担持する好適なM13ファージ内にクローニン
グすることを伴う。後者は、ムテインの効果を抑制でき
ない宿主細胞における陰性の選択を認める。ファージ
は、臨界的ファージ遺伝子中に２つのアンバーコドンを
含有するM13mp9であることが好ましい。従って、26kd T
NFをコード化する配列は、M13mp9アンバー＋中にクロー
ニングされ、そして単鎖DNAは、標準技術を使用してそ
れから製造される。次に、M13 GAP二重鎖複製形態DNA、
すなわちアンバーコドンを欠く遺伝子工学M13誘導体M13
を、Hinc II制限酵素で分裂される。M13 GAPの塩基配列
は、アンバーコドンと塩基対6172および6323の両方を欠
くM13mp18と同様である。この欠如は、M13mpシリーズの
多重クローニング部位の側部に位置し、そして独特のHi
nc II部位を発生する。アンバーコドンを有する単鎖DNA
およびアンバーコドンとTNFコード化配列の両者を欠くH
inc II消化M13 GAPからの第２の鎖とからなるギャップ
デラックスDNAが標準DNA/DNAハイブリッド形成技術を使
用して形成される。従って、暴露されるギャップデラッ
クスの唯一の部分は、26kd TNFターゲット配列である。
所望のオリゴヌクレオチドは、ギャップデラックスDNA
にアニーリングされ、そして残りのいかなる部分もDNA
ポリメラーゼで満たされ、そしてニックがDNAリガーゼ
で封止されてヘテロデラックスが製造される。後者は、
好ましくはミスマッチリペア欠如宿主にトランスフェク
トれるのが好ましく、そして混合ファージが製造され
る。この混合ファージ母集団から、アンバームテインを
有している非突然変異26kd TNF DNAを担持するファージ
が、アンバームテインを制御できない宿主細胞中に該混
合ファージを感染させることによって選択できる。次い
で、クローンを、所望とするTNFムテインを担持するフ
ァージに対してスクリーニングできる。

コンバーターゼ阻害活性を有すると同定された化合物
はまた、敗血病の治療における予防薬または治療薬用途
を有している。敗血病の襲来がTNFの循環の増加に関連
するので、これらの阻害剤を、桿菌感染の危険のある
例、特に予備操作に予防的に使用できる。同様にして、
敗血病の初期診断がある例において、阻害剤は、製造さ
れるTNFの量を実質的に減少する便利な治療効果を有し
ている。

コンバーターゼの阻害剤のための第２の医療適用は、
AIDSの治療用である。TNFが潜在的免疫不全ウイルスの
活性化を引き起こすことが示されている。Folks等,Pro
c.Natl.,Acad.Sci.USA,vol.86,第2365頁（1989年）。従
って、コンバーターゼの阻害によるTNFの17kdまたは低
分子量形態の形成の抑制または阻害は、AIDSの治療の貴
重な予防薬であり、そして潜在的相であるウイルスに感
染された患者を治療に使用するのに好ましい。

本願出願人が何を本発明と確信するかを一般に記載し
たが、以下に本発明の範囲の説明をする実施例を挙げ
る。本発明の範囲を逸脱することなしに数多くの置換を
なすことができるので、これらの実施例を記載された材
料および方法に限定するものではないといういことが当
業者に明らかであろう。

実施例１ 26kd TNFの転化 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄
託番号67,103で寄託したベクターpFVXMを使用して、26k
d TNF種をコード化するDNA配列を含有するpFVXM−TNF6
を製造した。後者のベクターを製造するために、26kd T
NF種をコード化するcDNA配列を含有するプラスミドb11
を、コード配列を削除するPst Iで処置した。フラグメ
ントを、標準電気泳動技術を用いて精製した。次に、ベ
クターpFVXMをPst Iで処置し、そして26kdコード配列を
含有するpB11からのPst Iを、上記の標準技術を使用し
てベクターのポリリンカー領域に挿入して、pFVXM−TNF
6を製造した。pFVXM−TNF6を使用して上記のKriegler等
（1988年）に記載のごとくあるいは本特許出願と同時に
出願した“Cleavage Site Blocking Antibody to Proho
rmone Proteins and Use Thereof"と称する特許出願に
記載のごとく細胞系TNF6.8を製造した。この出願は、Ce
tus Case No.2534であり、発明者KrieglerおよびPerez
である。

TNF6.8は、26kd TNFと17kd TNFとの両者を発現する。
図２は、HL60細胞に存在するコンバーターゼ活性による
26kd TNFの転化を示している。生体内転写／翻訳による
標識化された26kd TNFの製造およびゲル電気泳動による
分析は、後述の実施例２に記載する。Ｓ−１サイトゾル
またはペレット画分が26kd TNFの16kd TNFへの略完全な
転化を引き起こすことを注目する。図２はまた、比較の
目的で、TNF6.8細胞の溶解産物における26kdおよび17kd
TNFをも示す。

pFVXMおよびプラスミドB11を、両方とも大腸菌株HB10
1中で増幅した。フラグメントのライゲーションを、標
準状態を使用して行った。プラスミドDNAを、ライゲー
ション操作の後に単離し、そしてTNFエンコード配列の
正確な配向を、制限分析により確立した。

プラスミドDNAを、Nucleic Acid Research,7:1513（1
979年）に記載された通りにBirnboimおよびDolyの操作
に従って調製した。このプラスミドDNAを、塩化セシウ
ムに二度結合させ、そして10mMトリス,pH8.0および1mM
EDTAからなるTE緩衝液に対して徹底的に透析した。

実施例２ コンバーターゼ検定 A. 生体外転写／翻訳検定 好ましい検定法は、26kd分子の生体外転写／翻訳およ
び引き続いてコンバーターゼ阻害活性について試験する
化合物の存在下または不存在下でのコンバーターゼによ
る処理からなる。この方法は、プラスミドB11に存在す
る26kd分子の生体外転写／翻訳を伴う。従って、この配
列は、pB11からPst I消化により除去され、そしてpGEM
−３（Promega Biotec社から得られる）のPst I部位の
挿入される。pGEM−TNF4と命名された得られたプラスミ
ドを、構築された技術および上記のBirmboimおよびDoly
の方法に従って調製されたプラスミドDNAを使用して大
腸菌中で増殖した。プラスミドDNAは、Hind IIIでこれ
を直線化することによって生体外転写され、そして直線
化されたプラスミド鋳型を使用してT7 RNAポリメラーゼ
およびPromega Biotec社製の生体外転写キットを用いて
キャップされたトランスクリプトを製造した。転写は、
製造者の支持に従って標準的技術を使用して行われた。

mRNAを、³⁵S−シトシンの存在下に翻訳して³⁵S−シト
シン標識26kd TNFを製造した。この操作は、ラビット網
状赤血球溶解産物キット（これもPromega Biotec社製で
ある）を使用することからなり、そして製造者が勧める
条件に従った。

³⁵S−シトシン標識26kd TNFを、以下の通りにコンバ
ーターゼ阻害剤に対する検定に使用した。生体外翻訳材
料25μを、未誘導HL60コンバーターゼ活性250μプ
ラス阻害活性について検定しようとする化合物と一緒に
した。このコンバーターゼは、２×10⁹個のHL60細胞を
収穫し、そして各々総量18および6mlのＳ−１およびＰ
−30画分を単離することによって製造した。Ｓ−１画分
も使用できるが、250λのＰ−30画分を使用した。この
検定を、本質的に以下に記載する通り30℃で１時間行っ
た。次に、この反応混合物を、抗−TNFポリクローナル
抗血清およびプロテインＡセファロースで免疫沈降さ
せ、ペレット化し、そして洗浄した。結合タンパク質を
溶出させ、そして電気泳動した。ゲルを乾燥し、そして
Ｘ−線フィルムに暴露し、引き続いて展開した。HL60コ
ンバーターゼの希釈度を代えて処理された26kd TNFのゲ
ル電気泳動プロフィールは、阻害活性を有している化合
物を表した。

上記検定を使用して、3,4−ジクロロ−イソクマリン
およびエラスチナールが各々100μg/mlおよび５μg/ml
の濃度でコンバーターゼを阻害することを測定した。ま
た、1mMの濃度で（１−（（３−（（アセチルオキシ）
−７−メトキシ−８−オキシ−８−オキソ−５−チオ−
１−アゾビシクロ［4.2.0］オクト−２−エン−２−イ
ル）カルボニルモルホリン,S,S−ジオキサイド（6R−シ
ス）がコンバーターゼを阻害することも測定した。これ
らの結果を、図３に示す。

B. 単球検定 上記生体外転写／翻訳検定によって製造された26kd T
NFに加えて、Kriegler等,1988年,Cell,53:45に記載の通
り26kd TNFを製造し、従って分子のソースとして使用で
きる刺激単球がある。

好適な検定法は、単球を刺激し、次いでコンバーター
ゼの存在下に26kd種の低分子量種、好ましくは17kd種へ
の消失を測定することである。

要するに、ヒト単球を、遠心によりヒト血液から精製
し、引き続いて単球の細胞培養皿への付着に基づいて富
化する。遠心は、単球をPharmaciaより得られるFicol−
plaqueおよび濾過器により精製することからなる。製造
者の推奨する操作に従う。次に、単球およびリンパ球よ
りなる遠心段階より生じた細胞の混合物を、20％コウシ
血清で捕捉されたRPMI培地を含有する組織培養皿上にプ
レートする。この皿を、30分間37℃でインキュベーショ
ンし、その後これらを、同一培地で強く濯ぐ。この処理
により非−付着リンパ球が除去され、そして残りの付着
単球だけが残る 単球26kd TNFを、以下の通りに放射線標識する。この
単球を、20％コウシ血清で捕捉されたRPMI培地中で３時
間37℃でインキュベートし、100mg/mlリポポリサッカラ
イドおよび10μg/mlフォバールミリステートアセテート
で30分間37℃でインキュベートする。後者の２種の化合
物は、TNFの発現を導く。このRPMI培地は、シトシン−
マイナスおよび５％の最終濃度で存在するコウシ血清で
ある。この血清を、存在するいかなるシトシンを除去す
るのに使用する前に透析する。30分のインキュベーショ
ン期間の後に、100uCi³⁵S−シトシンを添加し、そして
細胞を、３時間37℃で放射線標識し、その後これらを、
溶解しそしてコンバーターゼ活性の検定に使用する。こ
の検定を行いなおかつコンバーターゼの阻害を同定する
段階は、上記に記載したものと同様である。

実施例３ コンバーターゼ活性のTNFムテイン／抗体／ペプチド阻
害剤 以下の化合物は、コンバーターゼ阻害活性を有してお
りそして以下の通りに調製することができ、また上記の
通りに阻害活性について試験される。

A. 抗−コンバーターゼ抗体 コンバーターゼの酵素活性を中和するかまたはコンバ
ーターゼに結合し、しかしてコンバーターゼが26kd TNF
に結合するのを厳密に妨害するモノクローナルまたはポ
リクローナルのいずれかの抗体を調製する。この方法
は、好適な宿主動物をコンバーターゼを産生するHL60細
胞の膜画分で免疫化することからなる。充分な量の材料
を使用して免疫反応を引き出さなければならず、そして
通常は、この量は体重1kg当たり10μｇないし10mgであ
る。免疫化は、当該技術分野に公知の如く生物学的に相
溶性緩衝液中の賦形材料を用いて行われる。最良の免疫
化ルートは、実験的に決定することができ、そして第１
の免疫化につづいて初期免疫に対する免疫応答の強度に
依存して１ないしそれ以上の第２の免疫化を続けること
ができる。血清中の中和抗コンバーターゼ抗体の存在
は、抗血清が検定混合物中に存在する上記のコンバータ
ーゼ検定を使用すて決定することができる。26kd TNF種
の低分子量種への転化の阻害は、中和抗体の存在を表
す。もちろん、好適な対照が非免疫化動物が阻害活性で
ないと保証すると断定すると見なされる。ポリクローナ
ル抗体を、以下に記載の通りに精製することができる。

（ｉ） ネズミ抗体 マウスの生体内免疫化のために、Nature 256:495（19
75年）に記載されたKohlerおよびMilsteinの方法または
変更方法、例えばFendly等,1987年,Hybridoma,6:359;Bu
ck等,1988年,In Vitro,18:377に記載のものに従った。
生体外方法は、一般に、Louben,RおよびMohler,M.,1980
年,Molecular Immunology,17:635,Reading,C,Method in
Enzymology,121（第１部）またはVoss,B,1986年,Metho
d in Enzymology121:27に記載されている。

マウスを、コンバーターゼ活性について先に示された
HL−60細胞の膜画分1mg/mlで免疫化する。この免疫化
は、フロインド完全アジュバント中で行われる。２種類
の付加的免疫化またはブーストを、１か月間隔で賦形剤
なしで行い、第１のブースト後１か月、膜材料10ugのI.
V.ブーストが得られる。I.V.ブースト後３日、マウスを
殺し、その脾臓を除去し、そして脾臓球を単離し、不滅
化薬物選択性ミエローマパートナー細胞系に融合する。
数多くのかゝるミエローマ系が当該技術分野に公知であ
り、そのほとんどがHAT捕捉細胞培養培地で成長させる
ことができない。代表的なミエローマ細胞系は、SP−2/
0Ag 14である。従って、ハイブリドーマを、脾臓球とミ
エローマ細胞とを5:1比で一緒にすることによって形成
するが、このものは一般に、２×10⁶個のミエローマ細
胞と１×10⁷個の脾臓球からなる。この細胞混合物は、
ペレット化され、培地が除かれ、そして融合がポリエチ
レングリコール1500の40％（v/v）溶液の室温での60秒
間にわたる滴下による添加が行われ、続いて60秒間37℃
でインキュベートされる。穏やかに撹拌しながらこの細
胞懸濁液に、５分間にわたってダルベッコ変性イーグル
培地9mlが添加される。この混合物中の細胞塊を、穏や
かに再懸濁し、細胞を洗浄して残留するPEGを除去し、
そして20％コウシ血清で捕捉されたDMEM中で約２×10⁵
細胞／ウェルで微少力価プレート上にプレートする。24
時間後、細胞を、ヒポキサンチンおよびアザセリン選択
培地の溶液二回が供給される。

陽性の細胞成長を示すウェルからの培地を、コンバー
ターゼに対する中和抗体に対してスクリーニングするこ
とができる。好ましい検定は、抗体活性について試験し
ようとする培地が検定内に存在する上記の実施例２で記
載したコンバーターゼ検定である。３〜８微少力価ウェ
ルからの培養上澄み液を一緒にし、そしてこの混合物を
検定するのがより好ましい。この混合物が陽性である
と、各ウェルからの培地を別々に検定して１種類または
複数の分泌ハイブリドーマを同定することができる。数
多くの検定が当該技術分野に知られており、そして可溶
性、不溶性抗体を決定でき、そしてLangone,JおよびVon
Vinakis,H.,Method in Enzymology,9第Ｅ部，（1983
年）に示されている。

抗体がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体かは
無関係に、当該技術分野に公知の技術であるいはSpring
er,1980年,Monoclonal Antibodies;194（Kennett,T.Mac
kearnおよびK.Bechtol編，ニューヨークPlenum Press）
に記載の技術により抗体を精製するのが望ましい。一般
に、これは、50％硫酸アンモニウム溶液を使用した少な
くとも１回の抗体の硫酸アンモニウム沈降からなる。抗
体アフィニティーカラムも使用できる。

（ii） ヒトモノクローナル抗体 末梢血リンパ球を、敗血病患者から単離し、次いでエ
プスタイン−バーウイルスで感染させ、そして感染リン
パ球を、選択性ミエローマ細胞系への融合により不滅化
し、そしてこのようにして発生したハイブリッド細胞系
を、単離し、そして抗体産生として特徴付ける。

より詳しくは、単核細胞を、Ficol−hypaqu（Pharmac
ia）上で分離し、そして単球を、プラスチックへの付着
によりこの混合物から除く。標準実験室技術を利用して
これらの方法を行った。次に、非付着細胞を、抗体−特
異パンニングにより抗体製造者のために富化する。パン
ニングとは、一般に当該技術分野に公知の技術であり、
そして好適な抗原で被覆されたプラスチック表面上の抗
体分泌細胞の母集団のインキュベーションを含む。プラ
スチック表面上で抗体を発現するこれらの細胞は、抗原
を結合し、従ってプラスチック表面に付着するが、細胞
表面抗体を発現しない細胞は、付着せずそして洗浄によ
り除去することができる。従って、特定の抗体分泌細胞
がこの技術により富化される。

より詳しくは、６−ウェルプレート（Coaster）を、
上記通りの誘導または非誘導HL−60細胞のいずれかから
調製されたコンバーターゼを含有する膜画分で、ウェル
１つ当たり150μｇの膜材料が燐酸緩衝生理食塩水中で
４℃で一晩被覆されるように被覆する。これらのウェル
は、一晩のインキュベーション期間の後に１％コウシ血
清アルブミンを含有する燐酸緩衝生理食塩水中で少なく
とも１時間４℃でブロックされ、引き続いて燐酸緩衝液
/BSAで洗浄される。次いで、PBS/BSA 1mg中10⁷個のリン
パ球を、６ウェルプレートの各ウェルに添加する。リン
パ球を、70分間上記プレート上でインキュベートし、し
かる後に非付着細胞を吸引濾過により除去する。付着細
胞を、10％コウシ血清を含有する細胞培養培地（IMDM,S
igma Chemical Co.,ミズリー州，セント・ルイス）を用
いてインキュベートする。

エプスタイン−バーウイルス感染マーモセット細胞
系,B95−８を成長させて得られ、従って該ウイルスを含
有する等量の培養培地を付着細胞を浸す培地に添加する
ことによって付着細胞をエプスタイン−バーウイルス形
質転換させる。この細胞を、この環境下に37℃で３時間
培養し、そしてこの方法で付着細胞母集団中のリンパ球
を、エプスタイン−バーウイルス感染させる。感染時間
に続いて、この細胞を洗浄し、そしてIMDM媒体プラス10
％コウシ血清および30％条件培地中の96ウェル微小力価
プレート上に約10⁴〜10⁵細胞／ウェルの密度でプレート
する。後者は、リンパ芽細胞、好ましくはJW5から誘導
される。この培地はまた、５×10^-5M 2−メルカプトエ
タノール、50μg/mlゲンタマイシンサルフェート（Sigm
a）および600ng/mlシクロスポリンＡ（Sandimmun,Sando
z,Basel,スイス）を含有している。

約14ないし21日のインキュベーションの後、細胞培養
上澄み液を、一緒にし、そして上記のコンバーターゼ中
和活性についてスクリーニングする。陽性のハイブリド
ーマを、低密度でサブ培養し、中和抗体について再試験
し、そして成長させそしてポリエチレングリコールおよ
び当該技術分野に公知のプレート融合技術を用いて細胞
系F3B6に融合させる。後者の技術は、Human Hybridomas
and Monoclonal Antibodies,E.G.Engleman,S.K.H.Foun
g,J.W.LarrikおよびA.A.Raublischek編，ニューヨークP
lenum Press第466頁において、Larrik,J.W.（1985
年），により記載されている。F3B6は、100μＭヒポキ
サンチン、５μg/mlアザセリンおよび５μＭウアバイン
を含有する培地中での成長に感受性であるヘテロミエロ
ーマ細胞である。最後に、得られたハイブリッドを再び
スクリーニングしてこれらが中和抗コンバーターゼ抗体
を産生することを保証する。

B. 26kd非−分裂ムテイン コンバーターゼへの結合に関して競合し、しかしてそ
の活性を阻害または減少する26kd TNFムテインを記載す
る。好ましい態様のムテインは、１および／または13位
においてバリンまたは−１位においてアラニンおよび／
または12位においてプロリンが置換されたおよび／また
は削除されたものである。このムテインは、部誘導突然
変異形成ギャップデラックス法を用いて構成される。

以下の溶液／緩衝液を使用して所望の方法を行う。

0.938M KCl、0.063Mトリス,pH7.5からなる５×ギャッ
プデラックス緩衝液;1.0M KCL、0.30M トリス、0.15M M
gCl₂、0.02M DTT,pH7.5からなる10×PEL;0.50M トリス,
0.10M MgCl₂、0.05M DTT、0.001M EDTA,pH8.0からなる1
0×KB;10mM ストックから新たに作製された0.25mM dCT
P、dATP、dGTP、dTTPを含有する溶液;ATP 60mgをH₂O 0.
80mlに溶解し、0.1M NaOHでpH7.0に調整し、H₂Oで最終
容量1.0mlとすることによって作製されたATP溶液;20％P
EG/2.5M NaCl;3.0M NaOAc;およびTE標準フェノール。

種々の桿菌株およびファージを利用して所望のムテイ
ンを得、そしてこれらは、BMH71−18,ファージ株を成長
させるJM103;HB2154であり;MultL,Su−,DNA形質転換の
競合用に作製され；およびHB2151:Su−を形質転換の際
のローン細胞として使用し;M13 GAP,RFをギャップデラ
ックスの形成のために使用し；そしてM13mp19アンバー,
26kd TNFターゲットDNAをこのベクター中でクローニン
グするおよびssDNAをギャップデラックスの形成のため
に単離する。

ファージを好適な桿菌株中で感染させ、成長させ、そ
して以下の通りに滴定する。ssDNA用のファージまたはd
sDNAまたはRFDNA用の細胞のいずれかの大規模の調製に
おいて、同一の感染プロトコールを使用する。

プラーク精製ファージを、標準技術を使用して製造す
る。要するに、これは、ファージ上澄み液を寒天培地上
で筋をつけ（streaking）、続いて軟質寒天4.0mlおよび
BMNH 71−18の新鮮な一晩培養液100μで注意深く被せ
ることからなる。次に、単離ファージを取り出し、振盪
しながら37℃で4.5〜６時間R26またはR17中の1:50希釈
のBMNH 71−18の新鮮な一晩培養液＋10mM MgCL₂でイン
キュベートする。R17（Ｎ−Ｚアミンスープ）は、10g N
−Ｚアミン，タイプＡ、5g NaClをH₂Oで１に希釈して
なり、一方R26は、8gチロシン、5g NaClをH₂Oで１に
希釈してなる（Ｙ−Ｔスープ）。ファージストックを滴
定し、そしてファージを10の感染多重度（MOI）で桿菌
中に感染させる。37℃で５時間振盪しながらインキュベ
ートした後、細胞懸濁液を、ペレット化し、そして上澄
み液をssDNA単離のために蓄え、そして細胞をRF単離の
ために蓄える。RF DNAを、構築されたプラミドDNA単離
技術を用いて単離し、一方ssDNAを以下の如くして単離
する。

ファージ上澄み液250mlをはげしく高速回転し、しか
る後上澄み液200mlをデカンテーションし、引き続いて2
0％PEG/2.5M NaCl 200mlを添加し、そして４℃で一晩ま
たは氷上で30分インキュベートする。この混合物もま
た、はげしく高速回転し、そして上澄み液をデカンテー
ションする。ボトルを再び高速回転してボトルの側部に
沿ったファージ沈降物をペレット化し、そして残った流
体をパスツールピペットで吸引する。ペレットを、1x T
E 5mlに再懸濁し、そして４℃で保存し、しかる後に0.5
mlを二度TE飽和フェノール0.5mlで抽出する。水層に3.0
M NaOAc 0.050mlおよび1.0ml90％エタノールを添加す
る。この混合物を、ドライアイス浴上に10分間配置し、
そしてマイクロファージに４℃で10分間遠心する。ペレ
ットを乾燥し、そして1X TE 200μに再懸濁させる。
この材料を、0.050mlアリコートで−20℃で26kd TNFの
突然変異形成に使用するまで保存できる。

以下のオリゴヌクレオチドを使用して２および／また
は13位におけるバリン、−１位におけるアラニンおよび
12位におけるプロリンを変化させる。これらのオリゴヌ
クレオチドおよびそれらの対応するムテインを表１に示
す。

これらのオリゴヌクレオチドは、以下の反応溶液およ
び反応条件を使用してキナーゼ化する。3ul 10×KB緩衝
液,3λ 10mM rATP（1:10希釈の0.1M rATPストック）、
２λ突然変異性オリゴヌクレオチド（100pモル／λ）、
21λH₂Oおよび１λポリヌクレオチドキナーゼ（10単位
／λ）。この反応を、37℃で45分間操作し、次いで65〜
68℃で５分間操作する。次に、24λのキナーゼオリゴヌ
クレオチドを、H₂O 56λで希釈して2pモル／λを得る。

ギャップデラックスを、以下の通り形成し、次いでオ
リゴヌクレオチドをアニーリングする。以下の試薬、す
なわち８λ:5×GDB緩衝液、0.50pモルSS DNAおよび0.10
pモルHinc II直線化M13 GAP RF DNAを40λの総量で一緒
にする。10λを更に使用するために除去し、そして残り
の30λを以下の通りに順次処置する。すなわち100℃で
３分、65℃で５分次いで30分で室温まで冷却し、次いで
反応混合物を氷上に配置する。次に、10λのギャップデ
ラックスおよび10λの対照非ギャップ材料をアガロース
ゲル上で電気泳動に供してギャップデラックス形成をチ
ェックする。ゲルが第３のバンドの存在を示すことを認
めると、ギャップデラックスを形成しており、そしてキ
ナーゼオリゴヌクレオチドは、16λのギャップデラック
ス反応混合物および４λの希釈キナーゼオリゴヌクレオ
チドを一緒にし、そしてこの混合物を65℃に３時間加熱
し、次いで室温に20分間冷却することによってデラック
スにアニーリングすることができる。

ヘテロデラックスは、以下の試薬、すなわち10λギャ
ップデラックスおよびプライマー、４λ10x PEL緩衝
液、４λdNTP（10mMストック、３λATP（10λの0.1mM A
TPストック＋1490λH₂O＝0.662mM）、17λH₂O、１λク
レノウ（5u/λ）および１λT4 DNAリガーゼ（0.6ウェイ
スu/λ:1x PELでの希釈ストックから作製された0.25mM
溶液）を一緒にすることからなる。この反応を、16℃で
２時間行い、次いで10λの延長／ライゲーション混合物
を200λの解凍成分HB2154細胞に形質転換する。この細
胞を０℃で30分間保持し、次いで42℃で1.5分間保持
し、引き続いて種々の容量の形質転換混合物（例えば、
50λ、10λ等）を100λのHB2151細胞＋3.0λの軟質寒天
の新鮮な一晩倍溶液を用いてプレートする。

得られたプラークを、プラークハイブリッド形成法を
用いてクスリーニングする。種々のこのような方法が公
知であるが、好ましい方法の記載は次の通りである。プ
レートを、複製ニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ型BA−8
5）上に折り重ね、そしてDNAを0.5N NaOHプラス1.5M Na
Cl;1.0M NaClプラス0.5Mトリス−HCl pH7.4;および2x S
SC（標準サリーンシトレート）で５分間順次処理するこ
とによって濾紙の固定する。濾紙を風乾し、そして80℃
で２時間減圧下にベーキングする。

複製濾紙を、55℃で２時間DNA濾紙当たり10mlのハイ
ブリッド形成緩衝液、5x SSC,pH7.0、5xダンハート溶液
（ポリビニルピロリドンプラスFicolおよびコウシ血清
アルブミン；各1x0.02％）、50mM燐酸ナトリウム緩衝液
pH7.0、5mM EDTA、0.1％SDSおよび100ug/ml酵母RNAで予
備ハイブリッド形成する。予備ハイブリッド形成緩衝液
を除去し、そしてサンプルを、好適なキナーゼプロー
ブ、すなわち上記のキナーゼオリゴヌクレオチドで所望
とされる過酷さに依存する条件下にハイブリッド形成す
る。約２×10⁶cpm/ml総量を使用する。代表的な穏やか
な過酷条件は、42℃の温度プラス50％ホルムアミドでプ
ローブを含有する１〜5ml/濾紙のを含有するDNAハイブ
リッド形成緩衝液を用いて24〜36時間である。より高い
過酷さに関して、高温および短時間が利用される。好ま
しいハイブリッド形成条件は、5x SSC、ダンハート溶
液、50mM NaPO₄,pH7.0、5mM EDTA、0.1％SDSおよび100m
g/ml酵母RNA中でオリゴヌクレオチドをスクリーニング
をなすのに使用する温度より10゜低い温度で濾紙にハイ
ブリッド形成することからなる。次に、濾紙を二度各々
室温で2x SCC、0.1％SDSで洗浄し、次いで一度2x SCC、
0.1％SDSでオリゴヌクレオチドをスクリーニングする温
度より５℃低い温度で洗浄し、そして風乾する。最後
に、濾紙を、−70℃で36時間オートラジオグラフィーす
る。オートラジオグラフィーは、興味あるムテインを担
持するウイルスを含有するプラークを表す。

２位および／または13位におけるバリンが削除または
置換されているムテインを構築するのに加えて、26kd T
NFの２つの有為な分裂部位を包含する大きな削除ムテイ
ンを製造することができる。好ましい態様のムテイン
は、図１に示す通り領域−９〜＋14にわたるアミノ酸を
欠如する。このムテインは、上記の材料および方法ナフ
トール以下の配列を有するオリゴヌクレオチドCP375を
用いて構築された。

５′−GTTTGCTACAACATGGAGGTCCCTGGGGGA−３′ C. タンパク質／ヘプチド阻害剤 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを、Merrifiel
d,R.B.（1985年）Science,232:第341〜347頁に詳細に記
載されや固相法により合成する。Gln−Ala−Val−Arg−
Ser−Ser−Ser、Gln−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−Ser−
Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−Ala、Pro−
Leu−Ala−Gln−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg−
Thr−Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−Ala−His−Val−
Val−Ala、Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−
Ala−His−Val−Val−AlaおよびPro−Leu−Ala−Gln−A
la−Val−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg−Thr−Pro。弗化水
素分裂を有するBiosearch 9500自動化ペプチドマシンを
使用し、そして15〜30μm Vvdac C4 PrepPAKカラム上で
Watters Delta Prep 3000装置を使用して調製的HPLCに
より精製した。

これらのペプチドがコンバーターゼ活性を阻害すると
いうことは、量を変えた各ペプチドの存在下に上記の検
定を行うことによって示される。反応コンバーターゼの
ゲル電気泳動およびウエスタンブロッドは、26kd TNFの
17kd形態への転化を示す。

実施例４ 敗血病の治療におけるコンバーターゼ阻害剤の保護効果 コンバーターゼ活性の有効な阻害剤である化合物は、
以下の通りのヒヒモデル系における敗血病を阻止するこ
とを示す。5mg/kgの濃度でネズミ、ヒトまたは組換抗コ
ンバーターゼ抗体を、動物を致死量の大腸菌で免疫試験
する前に単一I.V.丸薬で60分間投与し、そして大腸菌免
疫試験と同時に2mg/kg投与する。この抗体を、生物学的
にバランスのある塩溶液で投与し、そして約4x10⁴大腸
菌を使用した。大腸菌服用量を、２時間にわたって導入
する。抗体を受けた動物は、少なくとも７日間保護さ
れ、一方バランスされた塩溶液だけを投与された対照動
物は、16ないし32時間の内に絶命する。

同様な保護は、実施例３に示されたTNFムテインコン
バーターゼ阻害に寄与する。ムテインを、単一I.V.丸薬
で60分間5mg/kgの濃度で、動物を4x10⁴大腸菌で免疫試
験する前に投与する。ヒヒはまた、大腸菌免疫試験と同
時に2mg/kg受信する。

最後に、実施例３に示されたペプチド、すなわちGln
−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−SerおよびGln−Ala−Val
−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−Lys
−Pro−Val−Alaを上記と同様にして試験し、そして同
様な保護効果が得られる。

本発明を、特定の態様に従って説明してきた。しかし
ながら、本願は、添付の請求の範囲の精神および範囲か
ら逸脱することなしに当業者によってなされる変化およ
び変更をカバーするつもりである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/02 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/37 A61K 45/00 A61K 37/02 A61K 39/395 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】成熟タンパク質ホルモン、他はコンバータ
   ーゼによるそのプロホルモンの解裂によりそのプロホル
   モンから産生されるその成熟タンパク質ホルモンの１以
   上の低分子量種によって引き起こされた疾病の候補予防
   薬又は治療薬としての分子を同定し又はスクリーニング
   する方法であって、以下の段階： ａ）反応混合物中上記プロホルモンを有効量の上記コン
   バーターゼと接触させ； ｂ）上記プロホルモンの、上記成熟ホルモン又は上記成
   熟ホルモンの１以上の低分子量種への変換を段階“a"に
   おいて測定し； ｃ）上記段階“a"を繰り返し、ここで、上記反応混合物
   が上記成熟ホルモンによって引き起こされた疾病の候補
   予防薬又は診断薬として同定しようとする分子をさらに
   包含し； ｄ）上記プロホルモンの、上記成熟ホルモン又は上記成
   熟ホルモンの低分子量種への変換を段階“c"において測
   定し；そして ｅ）段階“b"及び“d"からの上記プロホルモンの変換の
   量を比較し、これにより段階“b"におけるよりも段階
   “d"における、プロホルモンのより低い変換が、上記疾
   患のための候補予防薬又は治療薬として上記分子を同定
   する、 を含む、前記方法。
2. 【請求項２】前記プロホルモンが26kd TNFである、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】TNFコンバーターゼによるプロTNFから成熟
   TNFへの変換に関連する有害徴候をもつ疾患の候補予防
   薬又は治療薬として分子を同定し又はスクリーニングす
   る方法であって、以下の段階： ａ）実質的に単離され、そして精製されたTNFコンバー
   ターゼの有効量とそのコンバーターゼにより解裂される
   ことができる基質をその中に含む反応混合物を提供し； ｂ）段階“a"の反応混合物中の上記TNFコンバーターゼ
   による上記基質の解裂を計測し； ｃ）上記疾患の候補予防薬又は治療薬として同定又はス
   クリーニングしようとする分子の所定量をその中にさら
   に含む段階“a"における反応混合物を提供し； ｄ）段階“c"の上記反応混合物中の上記TNFコンバータ
   ーゼによる上記基質の解裂を計測し；そして ｅ）段階“b"と“d"において計測される上記基質の解裂
   を比較し、それにより、段階“b"におけるよりも段階
   “d"におけるいずれかのより少ない解裂が、上記疾患の
   ための候補治療薬又は予防薬として、上記分子を同定す
   る、 を含む、前記方法。
4. 【請求項４】前記基質及びTNFコンバーターゼが中性pH
   をもつ溶液中にある、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】前記TNFコンバーターゼがHL60細胞由来で
   ある、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】前記基質が26kd TNFであり、そしてその基
   質が約17,000及び約15,000から成る群から選ばれた分子
   量をもつ１以上の低分子量TNF種に解裂される、請求項
   ５に記載の方法。
7. 【請求項７】前記コンバーターゼの阻害の計測が、以下
   の段階： ａ）約26,000の分子量をもつTNFを好適な標識により標
   識付けして、標識された26kd TNFを形成し； ｂ）その標識された26kd TNFを上記コンバーターゼによ
   り処理してその26kd TNFを約17,000の分子量をもつTNF
   に変換し； ｃ）上記17,000の分子量のTNFから約26,000の分子量を
   もつTNFを分離し；そして ｄ）上記17,000の分子量のTNF及び上記26kd種中に存在
   する標識を計測する、 を含む、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】前記標識が放射性核種、蛍光又は酵素であ
   る、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】前記約26,000の分子量を有するTNFと17,00
   0の分子量のTNFとが、電気泳動により分離される、請求
   項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】TNF 26kdを１以上の低分子量TNF種に変
    換するTNFコンバーターゼを阻害する敗血病の予防薬又
    は治療薬であって、それが抗コンバーターゼ抗体を含む
    ことを特徴とする、前記予防薬又は治療薬。
11. 【請求項１１】TNF 26kdを１以上の低分子量TNF種に変
    換するTNFコンバーターゼを阻害する敗血病の予防薬又
    は治療薬であって、それが約26,000の分子量をもつTNF
    の非加水分解性のムテインを含むことを特徴とする、前
    記予防薬又は治療薬。
12. 【請求項１２】前記ムテインが、２位においてバリンが
    置換又は欠失されたものである、請求項11に記載の予防
    薬又は治療薬。
13. 【請求項１３】前記ムテインが、13位においてバリンが
    置換又は欠失されたものである、請求項11に記載の予防
    薬又は治療薬。
14. 【請求項１４】前記ムテインが、２位において、かつ、
    13位においてバリンが置換又は欠失されたものである、
    請求項11に記載の予防薬又は治療薬。
15. 【請求項１５】前記ムテインが、26kd TNFの−９〜14に
    わたるアミノ酸が欠失されたムテインを含む、請求項11
    に記載の予防薬又は治療薬。
16. 【請求項１６】TNF 26kdを１以上の低分子量TNF種に変
    換するTNFコンバーターゼを阻害する敗血病の予防薬又
    は治療薬であって、それが、TNFコンバーターゼへの結
    合について上記TNF 26kdと競合するジペプチド配列Ala
    −Valを含むペプチド又はタンパク質を含むことを特徴
    とする、前記予防薬又は治療薬。
17. 【請求項１７】TNF 26kdを１以上の低分子量TNF種に変
    換するTNFコンバーターゼを阻害する敗血病の予防薬又
    は治療薬であって、それが、Gln−Ala−Val−Arg−Ser
    −Ser−Ser、Gln−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg
    −Thr−Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−Ala、Pro−Leu
    −Ala−Gln−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg−Thr
    −Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−Ala−His−Val−Val
    −Ala、Arg−Thr−Pro−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−Ala
    −His−Val−Val−Ala−、及びPro−Leu−Ala−Gln−Al
    a−Val−Arg−Ser−Ser−Ser−Arg−Thr−Proから成る
    群から選ばれたアミノ酸配列をもつペプチド又はタンパ
    ク質を含む、前記予防薬又は治療薬。