JPH04102064A - エンドトキシンの測定剤 - Google Patents
エンドトキシンの測定剤Info
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- JPH04102064A JPH04102064A JP2218954A JP21895490A JPH04102064A JP H04102064 A JPH04102064 A JP H04102064A JP 2218954 A JP2218954 A JP 2218954A JP 21895490 A JP21895490 A JP 21895490A JP H04102064 A JPH04102064 A JP H04102064A
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- Japan
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- factor
- lysate
- endotoxin
- glucan
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
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- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用
いるエンドトキシンの測定剤に間する。
いるエンドトキシンの測定剤に間する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単にラ
イセートという）を使用して、エンドトキシンを測定す
る方法が知られている。この方法は、ライセートが微量
のエンドトキシンにより凝固することに基づいているが
、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつか
の凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らかに
されている（中村降動はか、日本細菌学雑誌、旦、７８
１−８０３ ＋１９８３） ｌ。
イセートという）を使用して、エンドトキシンを測定す
る方法が知られている。この方法は、ライセートが微量
のエンドトキシンにより凝固することに基づいているが
、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつか
の凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らかに
されている（中村降動はか、日本細菌学雑誌、旦、７８
１−８０３ ＋１９８３） ｌ。
すなわち、第１図に示すように、ライセートにエンドト
キシンが加わるとＣ因子（エンドトキシン感受性因子、
分子量１２３．０００）を活性化して活性型Ｃ因子とな
り、これはＢ因子（分子量６４．０００）を限定水解し
、活性化して活性型Ｂ因子となり、これはプロクロッテ
ィングエンザイム（分子量５４．０００）を活性化して
クロツティングエンザイムに変換する。クロッティング
エンザイムはコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量
１９．７２３）のＡ ｒｇＩ＠、−７ｈｒ１＠とＡｒｇ
”−Ｇｌｙ”の特定箇所を限定水解することによりペプ
チドＣを遊離し、コアギュローゲンをコアギュリンに変
換して凝固（ゲル化）させる、岩永らの方法（Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ、 ７．１８３−１８８（１９７８））
により、さらにこのコアギュローゲンの氷解部位と共通
のアミノ酸配列を持った合成ペプチド、すなわち発色合
成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロア
ニリド（ｐＮＡ）あるいは発蛍光合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ １ ｙ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−ア
ミドとライセートを組み合わせた定量性のある測定法が
知られている。
キシンが加わるとＣ因子（エンドトキシン感受性因子、
分子量１２３．０００）を活性化して活性型Ｃ因子とな
り、これはＢ因子（分子量６４．０００）を限定水解し
、活性化して活性型Ｂ因子となり、これはプロクロッテ
ィングエンザイム（分子量５４．０００）を活性化して
クロツティングエンザイムに変換する。クロッティング
エンザイムはコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量
１９．７２３）のＡ ｒｇＩ＠、−７ｈｒ１＠とＡｒｇ
”−Ｇｌｙ”の特定箇所を限定水解することによりペプ
チドＣを遊離し、コアギュローゲンをコアギュリンに変
換して凝固（ゲル化）させる、岩永らの方法（Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ、 ７．１８３−１８８（１９７８））
により、さらにこのコアギュローゲンの氷解部位と共通
のアミノ酸配列を持った合成ペプチド、すなわち発色合
成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロア
ニリド（ｐＮＡ）あるいは発蛍光合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ １ ｙ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−ア
ミドとライセートを組み合わせた定量性のある測定法が
知られている。
該測定法は、エンドトキシンが引金（トリガー）となっ
て複数の凝固因子〔全でセリンプロテアーゼ前駆体）を
順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコア
ギュリンゲルを形成するという一連の反応を利用してい
る。
て複数の凝固因子〔全でセリンプロテアーゼ前駆体）を
順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコア
ギュリンゲルを形成するという一連の反応を利用してい
る。
また、ライセートに（１−３）−β−Ｄ−グルカンが加
わると、第１図におけるＣ因子を活性化して活性型Ｃ因
子となり、これがブロクロツテインクエンザイムをクロ
ッティングエンザイムに変換し、エンドトキシンの場合
と同様にクロツティングエンザイムがコアギュローゲン
をコアギュリンに変換してゲルを形成し、また合成基質
を水解する（森田ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、、 １２９
．３１８−３２１＋１９８１）ｌ。
わると、第１図におけるＣ因子を活性化して活性型Ｃ因
子となり、これがブロクロツテインクエンザイムをクロ
ッティングエンザイムに変換し、エンドトキシンの場合
と同様にクロツティングエンザイムがコアギュローゲン
をコアギュリンに変換してゲルを形成し、また合成基質
を水解する（森田ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、、 １２９
．３１８−３２１＋１９８１）ｌ。
二〇〇因子に反応する物質としては（１−３）−β−Ｄ
−グルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらにはセ
ルロース系血液透析膜のｆＣｅ液中及び該膜と接触した
血液中に含まれる物質などが知られており、これらはい
ずれもウサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認
められている。
−グルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらにはセ
ルロース系血液透析膜のｆＣｅ液中及び該膜と接触した
血液中に含まれる物質などが知られており、これらはい
ずれもウサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認
められている。
ところで、エンドトキシンはグラム陰性菌細胞壁の構成
成分としても知られ、特に血液中のエンドトキシンを測
定することにより体内におけるダラム陰性菌の存在を検
知することができるので、エンドトキシンを（１−３）
−Ｂ−Ｄ−グルカンの影響を全く受けずに、高い感度で
再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医学の分野で
望まれている。
成分としても知られ、特に血液中のエンドトキシンを測
定することにより体内におけるダラム陰性菌の存在を検
知することができるので、エンドトキシンを（１−３）
−Ｂ−Ｄ−グルカンの影響を全く受けずに、高い感度で
再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医学の分野で
望まれている。
ライセート中のＣ因子系を用いることによりエンドトキ
シンを測定する方法が報告されている（太材ら、Ｃ１１
ｎ、 Ｃｈｉ＋ｎ、 Ａｃｔａ、 １４９．５５−６５
ｆ１９８５） ）が、この方法はうイセートをゲル７戸
通？去によりあるいはヘパリンまたはデキストラン硫酸
を固定化したアフィニティー相体を用いるクロマトグラ
フィーにより分画し、 （１−３） −Ｂ−Ｄ−グルカ
ンｇ受付のＣ因子を除去することにより、Ｃ因子、Ｂ因
子とプロクロツティングエンザイムのみで再構成するも
ので、きわめて煩雑な操作を必要とする方法である。
シンを測定する方法が報告されている（太材ら、Ｃ１１
ｎ、 Ｃｈｉ＋ｎ、 Ａｃｔａ、 １４９．５５−６５
ｆ１９８５） ）が、この方法はうイセートをゲル７戸
通？去によりあるいはヘパリンまたはデキストラン硫酸
を固定化したアフィニティー相体を用いるクロマトグラ
フィーにより分画し、 （１−３） −Ｂ−Ｄ−グルカ
ンｇ受付のＣ因子を除去することにより、Ｃ因子、Ｂ因
子とプロクロツティングエンザイムのみで再構成するも
ので、きわめて煩雑な操作を必要とする方法である。
［課題を解決するための手段］
本発明は、（１−３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に
対する抗体を使用し、（１−３）−β−Ｄ−グルカン惑
受性のＣ因子の影響を受けずに、ライセート中のＣ，Ｂ
因子による反応を利用してエンドトキシンを測定する試
薬に関する。
対する抗体を使用し、（１−３）−β−Ｄ−グルカン惑
受性のＣ因子の影響を受けずに、ライセート中のＣ，Ｂ
因子による反応を利用してエンドトキシンを測定する試
薬に関する。
すなわち、本発明のエンドトキシンの測定剤は、
（１）ライセートと、 （１−３）−β−Ｄ−グルカン
感受性因子に対する抗体とからなるエンドトキシンの測
定剤、および （２）（１−３）−β−Ｄ−グルカン悪受悪因性因子す
る抗体を固定化した担体に、ライセートを接触させて得
た（１−３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子不含ライセ
ートからなるエンドトキシンの測定剤、である。
感受性因子に対する抗体とからなるエンドトキシンの測
定剤、および （２）（１−３）−β−Ｄ−グルカン悪受悪因性因子す
る抗体を固定化した担体に、ライセートを接触させて得
た（１−３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子不含ライセ
ートからなるエンドトキシンの測定剤、である。
（１−３）−〇−Ｄ−グルカン感受性因子は前述したよ
うに（１−３）−β−〇−グルカンによって活性化さす
るＣ因子であり、ライセートを用いてエンドトキシンを
（１−３）−〇−Ｄ−グルカンの影響を受けることなく
特異的に測定するには、ライセートに含まれるＣ因子の
影響を排除しなければならない、このため本発明ではＣ
因子に対する抗体をライセートと共に用いるが、または
抗Ｇ因子固定化によるＣ因子不含ライセートを用いるも
のである。
うに（１−３）−β−〇−グルカンによって活性化さす
るＣ因子であり、ライセートを用いてエンドトキシンを
（１−３）−〇−Ｄ−グルカンの影響を受けることなく
特異的に測定するには、ライセートに含まれるＣ因子の
影響を排除しなければならない、このため本発明ではＣ
因子に対する抗体をライセートと共に用いるが、または
抗Ｇ因子固定化によるＣ因子不含ライセートを用いるも
のである。
本発明で使用するライセートは、リムルス・ポリフエム
ス（Ｌ、 ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ、アメリカ産）、クキ
ブレウス・ギガス（Ｔ、 ｇｉｇａｓ、タイ国、マレー
シア半島産）、タキプレウス・トリデンタツス（Ｔ、
ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、日本、中国産）、カルシノス
コルピウス・ロツンデイカウダ（Ｃ，ｒｏｔｕｎｄｉｃ
ａｕｄａ、タイ国、マレーシア半島産）等のカブトガニ
から血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、その
成分（ライセート）を分離する。ライセートは一４０℃
以下に小分けして保存し、必要に応じ凍結融解して使用
するのが望ましい。
ス（Ｌ、 ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ、アメリカ産）、クキ
ブレウス・ギガス（Ｔ、 ｇｉｇａｓ、タイ国、マレー
シア半島産）、タキプレウス・トリデンタツス（Ｔ、
ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、日本、中国産）、カルシノス
コルピウス・ロツンデイカウダ（Ｃ，ｒｏｔｕｎｄｉｃ
ａｕｄａ、タイ国、マレーシア半島産）等のカブトガニ
から血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、その
成分（ライセート）を分離する。ライセートは一４０℃
以下に小分けして保存し、必要に応じ凍結融解して使用
するのが望ましい。
得られたライセートからＧ因子に対する抗体を製造する
には、まず抗原となるＧ因子を精製しなければならない
が、この方法としては、アガロース、セファロース（フ
ァルマシア社販売、商品名）、またはその架橋体等の適
当な担体にデキストラン硫酸、ヘパリン等を固定化した
ものにライセートを接触させ、Ｇ因子を含む画分を採取
する方法を採用することができる。接触させる方法とし
ては、例えば、上記固定化物とライセートとを溶液中で
接触させる方法、カラムクロマトグラフィーにより接触
させる方法等を挙げることができる。
には、まず抗原となるＧ因子を精製しなければならない
が、この方法としては、アガロース、セファロース（フ
ァルマシア社販売、商品名）、またはその架橋体等の適
当な担体にデキストラン硫酸、ヘパリン等を固定化した
ものにライセートを接触させ、Ｇ因子を含む画分を採取
する方法を採用することができる。接触させる方法とし
ては、例えば、上記固定化物とライセートとを溶液中で
接触させる方法、カラムクロマトグラフィーにより接触
させる方法等を挙げることができる。
（１−３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を抗原とする
抗体は、精製した（１−３）−Ｂ−Ｄ−グルカン感受性
のＧ因子またはＣ，Ｂ因子を含まないＧ因子画分を抗原
として使用し、これら抗原に対するポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体を製造する。
抗体は、精製した（１−３）−Ｂ−Ｄ−グルカン感受性
のＧ因子またはＣ，Ｂ因子を含まないＧ因子画分を抗原
として使用し、これら抗原に対するポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体を製造する。
本発明で使用するポリクローナル抗体の製造方法として
は、該抗原をウサギ、ヤギ等の被免疫動物に投与し、得
られた抗体を、さらに精製することが望ましい、被免疫
動物に投与する際に、補助剤（アジュバント）を併用す
ることは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。
は、該抗原をウサギ、ヤギ等の被免疫動物に投与し、得
られた抗体を、さらに精製することが望ましい、被免疫
動物に投与する際に、補助剤（アジュバント）を併用す
ることは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。
本発明で使用するモノクローナル抗体の製造方法として
は、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した後
に牌臓などを摘出し、該牌臓などから採取した細胞と腫
瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハ
イブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを試験
管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマ
から上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細胞
株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウスの
腹腔などの生体内にて培養することによって、モノクロ
ーナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができる
。細胞融合に用いる細胞としては、牌細胞以外にリンパ
節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることがで
きる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のも
のに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体
産生ハイブリドーマを得ることができる。
は、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した後
に牌臓などを摘出し、該牌臓などから採取した細胞と腫
瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハ
イブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを試験
管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマ
から上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細胞
株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウスの
腹腔などの生体内にて培養することによって、モノクロ
ーナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができる
。細胞融合に用いる細胞としては、牌細胞以外にリンパ
節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることがで
きる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のも
のに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体
産生ハイブリドーマを得ることができる。
得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム
等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポリ
エチレグリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法
、ないしは電気泳動、ＤＥＡＥ−１ＣＭ−誘導体等のイ
オン交換体やプロティンＡならびにハイドロキシアパタ
イト吸着体による吸脱着性、ゲル濾過および超遠心法等
を挙げることができる。
の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム
等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポリ
エチレグリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法
、ないしは電気泳動、ＤＥＡＥ−１ＣＭ−誘導体等のイ
オン交換体やプロティンＡならびにハイドロキシアパタ
イト吸着体による吸脱着性、ゲル濾過および超遠心法等
を挙げることができる。
エンドトキシンを測定する上記（１）の方法において、
該抗体をライセートとエンドトキシン溶液中に存在させ
るには１例えばライセートの凍結乾燥品を蒸留水あるい
は適当な緩衝液で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液
を添加する方法、ライセート中に予め必要量の抗体溶液
を゛共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適
当な緩衝液で溶解して用いる方法、ライセートと合成基
質の凍結乾燥品を適当な緩衝液等で溶解して調製した溶
液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセートと合成基
質の混合液中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾
燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で濡解し
て用いる方法、および必要量の該抗体溶液を試料に添加
する方法等が挙げられる。
該抗体をライセートとエンドトキシン溶液中に存在させ
るには１例えばライセートの凍結乾燥品を蒸留水あるい
は適当な緩衝液で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液
を添加する方法、ライセート中に予め必要量の抗体溶液
を゛共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適
当な緩衝液で溶解して用いる方法、ライセートと合成基
質の凍結乾燥品を適当な緩衝液等で溶解して調製した溶
液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセートと合成基
質の混合液中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾
燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で濡解し
て用いる方法、および必要量の該抗体溶液を試料に添加
する方法等が挙げられる。
また、上記（２）の方法に用いる該抗体の固定化担体に
ライセートを接触させてＧ因子を含まないライセートを
得る方法としては、該担体にライセートを接触させた後
に、遠心分離、濾過等の手法により該担体を除去する方
法、あるいは該担体を充填したカラムにライセートを添
加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。
ライセートを接触させてＧ因子を含まないライセートを
得る方法としては、該担体にライセートを接触させた後
に、遠心分離、濾過等の手法により該担体を除去する方
法、あるいは該担体を充填したカラムにライセートを添
加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。
該抗体の固定化担体としては、例えばセルロファイン（
生化学工業株式会社 販売、商品名）またはセファロー
ス等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通常
の方法により共有結合させた固定化担体を用いることが
できる。担体としては、この他にもセルロース、アガロ
ース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シリ
カビーズ等を用いることができる。
生化学工業株式会社 販売、商品名）またはセファロー
ス等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通常
の方法により共有結合させた固定化担体を用いることが
できる。担体としては、この他にもセルロース、アガロ
ース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シリ
カビーズ等を用いることができる。
さらにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法として
、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方法
、例えば担体をエポキシ活性死後ホルミル化したのち、
抗体を結合させる方法等を挙げることができる。
、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方法
、例えば担体をエポキシ活性死後ホルミル化したのち、
抗体を結合させる方法等を挙げることができる。
ライセートを固定化担体に接触させる場合のｐＨとして
は、ライセート中のＣ因子およびエンドトキシンとＣ因
子により開始される経路に関与する凝固因子が不活化さ
れない程度のｐ）ｌであれば良いが、好ましくはｐ）１
６〜９の範囲が好ましい、また、接触させる場合の温度
としては、該凝固因子が同様に不活化されない温度であ
れば良いが、通常Ｏ〜４５℃、より好ましくは０〜１０
℃である。
は、ライセート中のＣ因子およびエンドトキシンとＣ因
子により開始される経路に関与する凝固因子が不活化さ
れない程度のｐ）ｌであれば良いが、好ましくはｐ）１
６〜９の範囲が好ましい、また、接触させる場合の温度
としては、該凝固因子が同様に不活化されない温度であ
れば良いが、通常Ｏ〜４５℃、より好ましくは０〜１０
℃である。
本発明により、エンドトキシンを測定する生体試料とし
ては、血液、血漿または血清の他に、脳を髄液、腹水、
関節液、胸水、乳汁および尿などの体内外の浸出または
排泄液を挙げることができる。たと＾ば、血漿な試料と
するときは、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸等の抗凝固
剤を加えて分離することが必要である。
ては、血液、血漿または血清の他に、脳を髄液、腹水、
関節液、胸水、乳汁および尿などの体内外の浸出または
排泄液を挙げることができる。たと＾ば、血漿な試料と
するときは、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸等の抗凝固
剤を加えて分離することが必要である。
本発明の測定剤を用いてエンドトキシンを測定するには
、前述の発色合成基質あるいは発蛍光合成基質を反応液
中に共存させ、クロツティングエンザイムのアミグーゼ
活性を測定する方法、凝固反応によるゲル形成の有無を
肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴って生ずる濁度を適
当な光学系を用いて測定する比濁法、一定の濃度に達す
るまでの時間を適当な光学系を用いて測定する比濁時間
分析法、凝固に伴って生ずる粘性の変化を共振周波数の
変化としてとらえ、水晶振動子ゲル化測定装置を用いて
測定する方法等を採用することができる。
、前述の発色合成基質あるいは発蛍光合成基質を反応液
中に共存させ、クロツティングエンザイムのアミグーゼ
活性を測定する方法、凝固反応によるゲル形成の有無を
肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴って生ずる濁度を適
当な光学系を用いて測定する比濁法、一定の濃度に達す
るまでの時間を適当な光学系を用いて測定する比濁時間
分析法、凝固に伴って生ずる粘性の変化を共振周波数の
変化としてとらえ、水晶振動子ゲル化測定装置を用いて
測定する方法等を採用することができる。
［作用コ
本発明のエンドトキシンの測定剤は、Ｃ因子に対する抗
体を使用しているので、少量でも優れたＣ因子に対する
特異的結合能および中和効果を示すことが第一の特徴で
ある。また、該抗体はリムルス反応阻害物質として知ら
れているアンチトリプシン、アンチトリンビンＩ１１等
のセリンプロテアーゼインヒビター類を含まず、Ｃ因子
活性を全（損なわないことが第二の特徴である。
体を使用しているので、少量でも優れたＣ因子に対する
特異的結合能および中和効果を示すことが第一の特徴で
ある。また、該抗体はリムルス反応阻害物質として知ら
れているアンチトリプシン、アンチトリンビンＩ１１等
のセリンプロテアーゼインヒビター類を含まず、Ｃ因子
活性を全（損なわないことが第二の特徴である。
（実施例）
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。
実施例Ｉ
Ｃ因子に対するポリクローナル抗体の製造カブトガニ血
リンパ液１０Ｉ２を４℃下に、１．５００ｒｐｍで１０
分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）約５０ｇ
に２５０−の０．０２Ｍ Ｉ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）を加え、ホモゲナイザー（ポリトロンＲＰＴＩ
Ｏ（商標） 、 Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）にて均一
に破砕及び抽出し、冷却遠心分離機（トミー精工ＲＤ−
２０ＩＩ＋）にて、１０．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心
した。得られた沈澱物をさらに１５０−の同上緩衝液に
て２回抽出し、最終的に５５０−のライセートを得た。
リンパ液１０Ｉ２を４℃下に、１．５００ｒｐｍで１０
分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）約５０ｇ
に２５０−の０．０２Ｍ Ｉ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）を加え、ホモゲナイザー（ポリトロンＲＰＴＩ
Ｏ（商標） 、 Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）にて均一
に破砕及び抽出し、冷却遠心分離機（トミー精工ＲＤ−
２０ＩＩ＋）にて、１０．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心
した。得られた沈澱物をさらに１５０−の同上緩衝液に
て２回抽出し、最終的に５５０−のライセートを得た。
同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム（５Ｘ２３ｃｍ、０．０５ＭＮａ
Ｃｊｌ！含有０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、
０）で平衡化）に添加し、０２Ｍ ＮａＣＪ２含有００
２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）にて溶出される
画分、すなわち第１図に示すＣ因子を含むＣ因子画分を
、後２する太材らの方法（Ｃ１ｉｄ、 Ｃｈｉｍ、 Ａ
ｃｔａ、１４９．５５−６５＋１９８５＋ ＋により、
その活性を測定した。ついでその５０Ｔ１１１を１０ｙ
ｄ！に減圧濃縮後、Ｃ因子の活性化を防ぐために０．２
３ｇのＥＤＴＡ−４Ｎａを添加した。
ースＣＬ−６Ｂカラム（５Ｘ２３ｃｍ、０．０５ＭＮａ
Ｃｊｌ！含有０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、
０）で平衡化）に添加し、０２Ｍ ＮａＣＪ２含有００
２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）にて溶出される
画分、すなわち第１図に示すＣ因子を含むＣ因子画分を
、後２する太材らの方法（Ｃ１ｉｄ、 Ｃｈｉｍ、 Ａ
ｃｔａ、１４９．５５−６５＋１９８５＋ ＋により、
その活性を測定した。ついでその５０Ｔ１１１を１０ｙ
ｄ！に減圧濃縮後、Ｃ因子の活性化を防ぐために０．２
３ｇのＥＤＴＡ−４Ｎａを添加した。
そのｌ、０−に等量のフロイントコンブリートアジュバ
ント（ヤトロン社販売、商品名）を加え、ウサギ（ＪＷ
、２２．５ｋｇ）の背中、尻および横腹のそれぞれに０
．３−１０．３−および０、４１．１ずつ皮下注射（感
作）した、感作は２遍間に１度肝５回行い、ゲル内二重
拡散法により抗体価の上昇を確認後、最終感作日より１
週間後に頚静脈を切開して全採血した。ひきつづき室温
１時間、４℃−晩放置後、２．００Ｏｒｐｍで５分間遠
心分離を行い、得られた血清５２−を５６℃で３０分間
の熱処理を行い非動化した。その血清の、５０−に対し
て３４％（Ｗ／Ｖ）Ｎ ａ ｚ Ｓ Ｏａ溶液を５０ｄ
加え、生じた沈澱を１０、ｏｏｏｒｐｍで３０分間遠心
分萌し、得た沈澱を１７％（Ｗ／ＶＩＮａ、Ｓｏ、溶液
で２回洗浄し、その沈澱をＱ、１Ｍトリス−塩Ｍ緩衝液
（ｐＨ８，０）５０−に溶解した。この溶液に、固形の
Ｎａｚ Ｓ０４７．５ｇを攪拌しながら溶かし込み、生
じた沈澱を上記と同様のトリス−塩！緩衝液に渚かし、
さらにＮａ ２ Ｓｏ ４濃度７５ｇ１５０−の条件で
沈澱操作を３回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解
した。ひきつづき０．０５Ｍ ＮＨ，ＨＣＯ，で平衡化
したセルロファインＧＨ−２０■（生化学工業株式会社
販売、商品名）カラム（２，８ｘ９０ｃｍ、０．０５Ｍ
ＮＨ４ＨＣＯｓで溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾
燥し、ウサギ抗（Ｇ因子画分）血清のＩｇＧ溶液を得た
。
ント（ヤトロン社販売、商品名）を加え、ウサギ（ＪＷ
、２２．５ｋｇ）の背中、尻および横腹のそれぞれに０
．３−１０．３−および０、４１．１ずつ皮下注射（感
作）した、感作は２遍間に１度肝５回行い、ゲル内二重
拡散法により抗体価の上昇を確認後、最終感作日より１
週間後に頚静脈を切開して全採血した。ひきつづき室温
１時間、４℃−晩放置後、２．００Ｏｒｐｍで５分間遠
心分離を行い、得られた血清５２−を５６℃で３０分間
の熱処理を行い非動化した。その血清の、５０−に対し
て３４％（Ｗ／Ｖ）Ｎ ａ ｚ Ｓ Ｏａ溶液を５０ｄ
加え、生じた沈澱を１０、ｏｏｏｒｐｍで３０分間遠心
分萌し、得た沈澱を１７％（Ｗ／ＶＩＮａ、Ｓｏ、溶液
で２回洗浄し、その沈澱をＱ、１Ｍトリス−塩Ｍ緩衝液
（ｐＨ８，０）５０−に溶解した。この溶液に、固形の
Ｎａｚ Ｓ０４７．５ｇを攪拌しながら溶かし込み、生
じた沈澱を上記と同様のトリス−塩！緩衝液に渚かし、
さらにＮａ ２ Ｓｏ ４濃度７５ｇ１５０−の条件で
沈澱操作を３回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解
した。ひきつづき０．０５Ｍ ＮＨ，ＨＣＯ，で平衡化
したセルロファインＧＨ−２０■（生化学工業株式会社
販売、商品名）カラム（２，８ｘ９０ｃｍ、０．０５Ｍ
ＮＨ４ＨＣＯｓで溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾
燥し、ウサギ抗（Ｇ因子画分）血清のＩｇＧ溶液を得た
。
［Ｇ因子活性測定法］
Ｑ、２Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，０１
３Ｍ ＭｇＣｌ２を含有）Ｏｌ−に、（１−３）−β−
Ｄ−グルカン（カードラン：和光純薬工業販売、商品名
； ４００ｎｇ／ｄ、各画分０．０５ｍ１．０．００５
ＭＮ−ターシャリ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ （ｐ −Ｚトロアニ
リド）００２−と凝固酵素前駆体（プロクロツテイング
エンザイム）０．０５−を加え、３７℃で反応させる。
３Ｍ ＭｇＣｌ２を含有）Ｏｌ−に、（１−３）−β−
Ｄ−グルカン（カードラン：和光純薬工業販売、商品名
； ４００ｎｇ／ｄ、各画分０．０５ｍ１．０．００５
ＭＮ−ターシャリ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ （ｐ −Ｚトロアニ
リド）００２−と凝固酵素前駆体（プロクロツテイング
エンザイム）０．０５−を加え、３７℃で反応させる。
発色が認められることを確認し、０．６Ｍの酢酸０．８
Ｊを添加することにより反応を停止し、次いで４０５ｎ
ｍの吸光度を測定する。
Ｊを添加することにより反応を停止し、次いで４０５ｎ
ｍの吸光度を測定する。
実施例２
精製Ｇ因子に対するポリクローナル抗体の製迫
カブトガニ血リンパ１．２Ｉ２を４℃下に１．５００ｒ
ｐｍで１０分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト
）約５３ｇに２５０−の０．０２Ｍ ｌ−リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，００，００１Ｍベンズアミジン、Ｏ，Ｏ
ＯＩＭＥＤＴＡ−４Ｎａ含有）を加え、実施例１と同様
に破砕、抽出後、１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心し
た。得られた沈澱を２００−の同上緩衝液にてさらに２
回抽出し、最終的に６４０−のライセートを得た。
ｐｍで１０分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト
）約５３ｇに２５０−の０．０２Ｍ ｌ−リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，００，００１Ｍベンズアミジン、Ｏ，Ｏ
ＯＩＭＥＤＴＡ−４Ｎａ含有）を加え、実施例１と同様
に破砕、抽出後、１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心し
た。得られた沈澱を２００−の同上緩衝液にてさらに２
回抽出し、最終的に６４０−のライセートを得た。
同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ２３．５ｃｍ、０．０２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，０で平衡化）に添加し、
０．２ＭＮａＣｌ２含有０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）にて溶出されるＧ因子画分をカラムライ
ト（生化学工業販売、商品名）カラム（３，０ｘ２９．
６ｃｍ２０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，０で
平衡化）に添加し、０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ８，０および０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム各８００
−で洗浄後、２−炭酸水素アンモニウムにて溶出し、精
製Ｇ因子を得た。
ースＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ２３．５ｃｍ、０．０２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，０で平衡化）に添加し、
０．２ＭＮａＣｌ２含有０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）にて溶出されるＧ因子画分をカラムライ
ト（生化学工業販売、商品名）カラム（３，０ｘ２９．
６ｃｍ２０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，０で
平衡化）に添加し、０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ８，０および０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム各８００
−で洗浄後、２−炭酸水素アンモニウムにて溶出し、精
製Ｇ因子を得た。
上記により精製したＧ因子溶ｆｉ、５０ｗＩを１０−に
濃縮後、Ｇ因子の活性化を防ぐため０．２３ｇのＥＤＴ
Ａ−４Ｎａを添加した。その１．０−に等量のフロイン
トコンプリートアジュバントを加λ、ウサギ（ＪＷ、♂
、２．５ｋｇ）の背中、尻および横腹のそれぞれに０３
−１０３−および０．４−づつ皮下注射（感作）した。
濃縮後、Ｇ因子の活性化を防ぐため０．２３ｇのＥＤＴ
Ａ−４Ｎａを添加した。その１．０−に等量のフロイン
トコンプリートアジュバントを加λ、ウサギ（ＪＷ、♂
、２．５ｋｇ）の背中、尻および横腹のそれぞれに０３
−１０３−および０．４−づつ皮下注射（感作）した。
感作は２週間に１度肝５回行い、ゲル内二重拡散法によ
り抗体価の上昇を確認後、最終感作日より１週間後の頚
静脈切開により全採血した。
り抗体価の上昇を確認後、最終感作日より１週間後の頚
静脈切開により全採血した。
ひきつづき室温１時間、４℃−晩放置後、２、ＯＯＯｒ
ｐｍで５分間遠心分離を行い、得られた血清６５−を５
６°Ｃで３０分間の熱処理を行い非動化した。その５０
−の血清に対して３４％（Ｗ／ＶＩ Ｎ ａ ｘ Ｓ
Ｏ−溶液を５０−加え、生じた沈澱を１０．ＯＯＯｒｐ
ｍで３０分間遠心分離し、沈澱を１７％（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
ｇ ＳＯ４溶液で２回洗浄し、その沈澱を０．ＩＭｌ−
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５０−に溶解した。こ
の溶液に固形のＮａｇ ＳＯ４７−５ｇを撹拌しながら
溶かし込み、生じた沈澱を上記と同様のトリス−塩酸緩
衝液に溶かし、さらにＮａ ａ Ｓｏ ４濃度７．５ｇ
１５０ｍｌの条件で沈澱操作を３回繰り返し、最終沈澱
を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき０．０５ＭのＮＨ
４ＨＣＯ，で平衡したセルロファインＧＨ−２０ｍカラ
ム（２，８Ｘ９０ｃｍ、００５ＭＮＨ４８ＣＯ，にて溶
出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、抗Ｇ因子血清
のＩｇＧ溶液を得た。
ｐｍで５分間遠心分離を行い、得られた血清６５−を５
６°Ｃで３０分間の熱処理を行い非動化した。その５０
−の血清に対して３４％（Ｗ／ＶＩ Ｎ ａ ｘ Ｓ
Ｏ−溶液を５０−加え、生じた沈澱を１０．ＯＯＯｒｐ
ｍで３０分間遠心分離し、沈澱を１７％（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
ｇ ＳＯ４溶液で２回洗浄し、その沈澱を０．ＩＭｌ−
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５０−に溶解した。こ
の溶液に固形のＮａｇ ＳＯ４７−５ｇを撹拌しながら
溶かし込み、生じた沈澱を上記と同様のトリス−塩酸緩
衝液に溶かし、さらにＮａ ａ Ｓｏ ４濃度７．５ｇ
１５０ｍｌの条件で沈澱操作を３回繰り返し、最終沈澱
を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき０．０５ＭのＮＨ
４ＨＣＯ，で平衡したセルロファインＧＨ−２０ｍカラ
ム（２，８Ｘ９０ｃｍ、００５ＭＮＨ４８ＣＯ，にて溶
出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、抗Ｇ因子血清
のＩｇＧ溶液を得た。
実施例３
精製Ｇ因子に対するモノクローナル抗体の製造
実施例２で得られたＧ因子０．５ｍＦ（タンパク量、２
００μｇ ／ ｙｄ ）を等量のフロイントコンプリー
トアジュバントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ１５週
令、体重２５ｇ）の背中に０．２−ｉ３よび尻に０．３
ｉＪを皮下注射し、２度目の感作を２週目に行い、３週
後に３００Ｌｉｇ／−のＧ因子０．３−を静脈内投与し
最終免疫とした。これより４日後に９．２ＸＩＯ’個の
牌細胞を分離し、マウスミエローマ５Ｐ１０細胞の１．
８Ｘ１０’個と常法により融合させて、ハイブリドーマ
を作製した。得られたハイブリドーマにつき、Ｇ因子に
結合すること、またはＧ因子活性を中和させることがで
きることを確認した。つづいて、上記と同様のマウス腹
腔内にブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）を０２−投与し、１週後にハイブリドー
マ３Ｘ１０’個／匹を腹腔内に投与し、腹水の大量貯留
がみられる２週目に腹水を回収し、４０％飽和硫酸アン
モニウムでＩｇＧ画分を沈澱させ、最終的な腹水型モノ
クローナル抗体を得た。
００μｇ ／ ｙｄ ）を等量のフロイントコンプリー
トアジュバントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ１５週
令、体重２５ｇ）の背中に０．２−ｉ３よび尻に０．３
ｉＪを皮下注射し、２度目の感作を２週目に行い、３週
後に３００Ｌｉｇ／−のＧ因子０．３−を静脈内投与し
最終免疫とした。これより４日後に９．２ＸＩＯ’個の
牌細胞を分離し、マウスミエローマ５Ｐ１０細胞の１．
８Ｘ１０’個と常法により融合させて、ハイブリドーマ
を作製した。得られたハイブリドーマにつき、Ｇ因子に
結合すること、またはＧ因子活性を中和させることがで
きることを確認した。つづいて、上記と同様のマウス腹
腔内にブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）を０２−投与し、１週後にハイブリドー
マ３Ｘ１０’個／匹を腹腔内に投与し、腹水の大量貯留
がみられる２週目に腹水を回収し、４０％飽和硫酸アン
モニウムでＩｇＧ画分を沈澱させ、最終的な腹水型モノ
クローナル抗体を得た。
実施例４
抗Ｇ因子固定化セルロファインによるＧ因子不含ライセ
ートの調製 実施例１に記載の方法で得られたライセート１００−を
、０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０．０．
１５ＭＮａＣｆｆ含有）で平衡化したエンドトキシンお
よびβ−グルカン不含の抗Ｇ因子固定化セルロファイン
（調製方法は後記）カラム（１，２ｘｌ１ｃｍ）に添加
し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０、ＩＭ
ＮａＣｆｆ含有）にて洗浄後、素通りした非吸着画分を
集め、Ｇ因子を全く含まないＧ因子不含ライセートを得
た。
ートの調製 実施例１に記載の方法で得られたライセート１００−を
、０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０．０．
１５ＭＮａＣｆｆ含有）で平衡化したエンドトキシンお
よびβ−グルカン不含の抗Ｇ因子固定化セルロファイン
（調製方法は後記）カラム（１，２ｘｌ１ｃｍ）に添加
し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０、ＩＭ
ＮａＣｆｆ含有）にて洗浄後、素通りした非吸着画分を
集め、Ｇ因子を全く含まないＧ因子不含ライセートを得
た。
［抗Ｇ因子固定化セルロファインの調製方法］
ホルミルセルロファイン１０ｇを０．１Ｍリン酸−Ｎａ
緩衝液（ｐＨ７，１）で充分洗浄し、実施例１〜４に記
載のＧ因子に対する抗体溶液（１０ｍｇ／ｄｏ、１Ｍリ
ン酸−Ｎａ緩衝液、ｐＨ７，１）２０−に懸濁し、Ｎ
ａ ＣＮ Ｂ Ｈｓ ５０ ｍｇを加え溶解させる。ひ
きつづき室温で８時間ゆるやかに攪拌し、０．２Ｍｌス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄、濾過し、ｌｏｍｇ
のＮ ａ ＣＮ Ｂ Ｈｓを含む５−の上記緩衝液を加
え、室温で３時間振とうする。その後、０１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８０，０，１５ＭＮａＣｊ２含有）で
充分洗浄する。
緩衝液（ｐＨ７，１）で充分洗浄し、実施例１〜４に記
載のＧ因子に対する抗体溶液（１０ｍｇ／ｄｏ、１Ｍリ
ン酸−Ｎａ緩衝液、ｐＨ７，１）２０−に懸濁し、Ｎ
ａ ＣＮ Ｂ Ｈｓ ５０ ｍｇを加え溶解させる。ひ
きつづき室温で８時間ゆるやかに攪拌し、０．２Ｍｌス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄、濾過し、ｌｏｍｇ
のＮ ａ ＣＮ Ｂ Ｈｓを含む５−の上記緩衝液を加
え、室温で３時間振とうする。その後、０１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８０，０，１５ＭＮａＣｊ２含有）で
充分洗浄する。
実施例５
エンドトキシンの測定
以下の方法で３種類の試薬を調製し、３種類の試料につ
いてその反応性を比較検討した。
いてその反応性を比較検討した。
へ剤は、ライセート４４０４、塩化マグネシウム４４０
ｕモル、およびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌ ｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ２．８６１．１モルを混合し、凍結乾燥して調製
した。Ｂ剤は、Ａ剤の成分に実施例１で調製した抗Ｇ因
子画分血清のＩｇＧ画分の１０ｍｇ／ｄ０ 、０２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１８０ｔＪを添加、
混合し、凍結乾燥して調製した。Ｃ剤はＡ剤の成分に実
施例２で調製した抗Ｇ因子血清のＩｇＧ画分の１０ｍｇ
／ｄ０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液１８０４を添加、混
合し、凍結乾燥して調製した。
ｕモル、およびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌ ｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ２．８６１．１モルを混合し、凍結乾燥して調製
した。Ｂ剤は、Ａ剤の成分に実施例１で調製した抗Ｇ因
子画分血清のＩｇＧ画分の１０ｍｇ／ｄ０ 、０２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１８０ｔＪを添加、
混合し、凍結乾燥して調製した。Ｃ剤はＡ剤の成分に実
施例２で調製した抗Ｇ因子血清のＩｇＧ画分の１０ｍｇ
／ｄ０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液１８０４を添加、混
合し、凍結乾燥して調製した。
３種類の試薬それぞれを２．２Ｎ１の０．２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解させ、その溶液０．１
−を試験管に分注し、そこへ試料０．１ｍ＃を添加して
よく混合し、３７℃にて３０分間反応させた。３種類の
試薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐＮＡ
を、０．５！’の００４％亜硝酸ナトリウム（０，４８
Ｍ塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、
０．０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩
酸塩を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で
示した。その結果を第１表に示した。
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解させ、その溶液０．１
−を試験管に分注し、そこへ試料０．１ｍ＃を添加して
よく混合し、３７℃にて３０分間反応させた。３種類の
試薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐＮＡ
を、０．５！’の００４％亜硝酸ナトリウム（０，４８
Ｍ塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、
０．０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩
酸塩を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で
示した。その結果を第１表に示した。
この結果から、Ｇ因子画分に対するポリクローナル抗体
及びＧ因子に対するポリクローナル抗体を添加して調製
した試薬を用いれば、（１−３）−β−Ｄ−グルカンの
影響を全く受けずに、エンドトキシンを特異的に定量す
ることができることは明らかである。
及びＧ因子に対するポリクローナル抗体を添加して調製
した試薬を用いれば、（１−３）−β−Ｄ−グルカンの
影響を全く受けずに、エンドトキシンを特異的に定量す
ることができることは明らかである。
実施例６
エンドトキシンの測定
以下の方法で２種類の試薬を調製し、エンドトキシン及
び（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を比較
検討した。Ａ剤は、ライセート４４０ｄ、塩化マグネシ
ウム４４０μモル、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ２８６μモルを混合し、凍結乾燥して調製した。
び（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を比較
検討した。Ａ剤は、ライセート４４０ｄ、塩化マグネシ
ウム４４０μモル、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ２８６μモルを混合し、凍結乾燥して調製した。
Ｄ剤はＡ剤の成分に、実施例３で調製した精製Ｇ因子に
対して中和能のあるモノクローナル抗体を含む溶液８０
μを洋加し、凍結乾燥して調製した。
対して中和能のあるモノクローナル抗体を含む溶液８０
μを洋加し、凍結乾燥して調製した。
２種類の試薬それぞれを２，２−の０．２Ｍトノスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８、０）に溶解させ、その溶液０１−を
試験管に分注し、そこへ試料０．１−を添加してよく混
合し、３７℃にて３０分間反応させた。２種類の試薬に
対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐＮＡを０．
５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，４８Ｍ塩酸溶
液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．０７
％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸塩を順
次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示した。
酸緩衝液（ｐＨ８、０）に溶解させ、その溶液０１−を
試験管に分注し、そこへ試料０．１−を添加してよく混
合し、３７℃にて３０分間反応させた。２種類の試薬に
対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐＮＡを０．
５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，４８Ｍ塩酸溶
液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．０７
％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸塩を順
次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示した。
第２図は（１−１３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応
性を比較した実験結果である。Ａ剤は（ｌ−３）−β−
Ｄ−グルカンに対して濃度依存的に反応するが、Ｄ剤は
１．ＯＯＯｎｇ／−の（１−３）−β−Ｄ−グルカンに
対しても全く反応しない、この結果は、精製Ｇ因子に対
するモノクローナル抗体が、ライセート中のＧ因子を完
全に中和し、（１−３）−β−Ｄ−グルカンに対する反
応性を消失させていることを示している。
性を比較した実験結果である。Ａ剤は（ｌ−３）−β−
Ｄ−グルカンに対して濃度依存的に反応するが、Ｄ剤は
１．ＯＯＯｎｇ／−の（１−３）−β−Ｄ−グルカンに
対しても全く反応しない、この結果は、精製Ｇ因子に対
するモノクローナル抗体が、ライセート中のＧ因子を完
全に中和し、（１−３）−β−Ｄ−グルカンに対する反
応性を消失させていることを示している。
第３図は、Ａ、Ｄ両試薬のエンドトキシンに対する反応
性を用量反応曲線で比較した結果である。２つの試薬の
用量反応曲線はほとんど一致しており、このことはＤ剤
に含まれる精製Ｇ因子に対するモノクローナル抗体が、
ライセートのエンドトキシンに対する反応性に全く影響
を与えないことを示している。
性を用量反応曲線で比較した結果である。２つの試薬の
用量反応曲線はほとんど一致しており、このことはＤ剤
に含まれる精製Ｇ因子に対するモノクローナル抗体が、
ライセートのエンドトキシンに対する反応性に全く影響
を与えないことを示している。
第４図はエンドトキシンの蒸留水による希釈系列と、ｌ
ｏｏｎｇ／−の（１−３）−β−Ｄ−グルカン溶液によ
る希釈系列に対するＤ剤の用量反応曲線である。２つの
用量反応曲線はほとんど一致しており、このことは、Ｄ
剤を用いれば、試料中に混在する（１−３）−β−Ｄ−
グルカンには全く影響されずにエンドトキシンを特異的
に定量できることを示している。
ｏｏｎｇ／−の（１−３）−β−Ｄ−グルカン溶液によ
る希釈系列に対するＤ剤の用量反応曲線である。２つの
用量反応曲線はほとんど一致しており、このことは、Ｄ
剤を用いれば、試料中に混在する（１−３）−β−Ｄ−
グルカンには全く影響されずにエンドトキシンを特異的
に定量できることを示している。
以上の結果から、精製Ｇ因子に対するモノクローナル抗
体を添加して調製した試薬を用いれば、（１−３）−β
−〇−グルカンの影響を全く受けずに、エンドトキシン
を特異的に定量することができることは明らかである。
体を添加して調製した試薬を用いれば、（１−３）−β
−〇−グルカンの影響を全く受けずに、エンドトキシン
を特異的に定量することができることは明らかである。
実施例７
エンドトキシンの測定
以下の方法で２種類の試薬を調製し、３種類の試料につ
いてその反応性を比較検討した。
いてその反応性を比較検討した。
Ａ剤は、ライセート４４０４、塩化マグネシウム４４０
８モルおよびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ２．８６ｇモルを潰合し、凍結乾燥して調製した。Ｅ
剤は、実施例４で調製したＧ因子不含ライセート４４０
４、塩化マグネシウム４４０ｕモル、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２．８６μモルを混合し、凍結
乾燥して調製した。
８モルおよびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ２．８６ｇモルを潰合し、凍結乾燥して調製した。Ｅ
剤は、実施例４で調製したＧ因子不含ライセート４４０
４、塩化マグネシウム４４０ｕモル、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２．８６μモルを混合し、凍結
乾燥して調製した。
２種類の試薬それぞれを２．２−の０．２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐ）１８． ０）に瀉解し、その溶液０．１
ｍｆｆを試験管に分注し、そこへ試料ｏ１−を添加して
よく混合し、３７℃にて３０分間反応させた。２種類の
試薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたＰＮＡ
を、０．５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，４８
Ｍ塩酸溶液）、０３％スルファミン酸アンモニウム、０
．０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸
塩を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示
した。その結果を第２表に示した。
酸緩衝液（ｐ）１８． ０）に瀉解し、その溶液０．１
ｍｆｆを試験管に分注し、そこへ試料ｏ１−を添加して
よく混合し、３７℃にて３０分間反応させた。２種類の
試薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたＰＮＡ
を、０．５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，４８
Ｍ塩酸溶液）、０３％スルファミン酸アンモニウム、０
．０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸
塩を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示
した。その結果を第２表に示した。
この結果から、Ｇ因子不合ライセートを用いて調製した
試薬によれば、 （１−３）−β−Ｄ−グルカンの影響
を全く受けずに、エンドトキシンを特異的に定量するこ
とができることは明らかである。
試薬によれば、 （１−３）−β−Ｄ−グルカンの影響
を全く受けずに、エンドトキシンを特異的に定量するこ
とができることは明らかである。
実施例８
血漿検体の測定
対象は、ダラム陰性薗による敗血症を疑った自治医大血
液科に入院中の白血病等の重症血液疾患および感染を合
併した肝、胆道疾患を有する患者の２５例で、それぞれ
無菌的に採血したヘパリン加血液を試料として、４℃で
１５０ＸＧ、１ｏ分間遠心して多血小板血漿（ＰＲＰＩ
を得た。その０．１−に０．３２Ｍの過塩素酸０．２−
を加え、３７℃で２０分間加温し、析出物を遠心（３，
０００ｒｐｍ、１０分間）除去し、その上清０．０５−
に０．１８ＭＮａＯＨを０．０５−加えて中和し被検液
とした。
液科に入院中の白血病等の重症血液疾患および感染を合
併した肝、胆道疾患を有する患者の２５例で、それぞれ
無菌的に採血したヘパリン加血液を試料として、４℃で
１５０ＸＧ、１ｏ分間遠心して多血小板血漿（ＰＲＰＩ
を得た。その０．１−に０．３２Ｍの過塩素酸０．２−
を加え、３７℃で２０分間加温し、析出物を遠心（３，
０００ｒｐｍ、１０分間）除去し、その上清０．０５−
に０．１８ＭＮａＯＨを０．０５−加えて中和し被検液
とした。
ひきつづき実施例６に記載の方法で調製した、本発明に
よるエンドキシン測定剤０１−を加え、３７℃で３０分
間加温した。この溶液に０．０４％亜硝酸ナトリウム（
０，４８Ｍ塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモ
ニウム。
よるエンドキシン測定剤０１−を加え、３７℃で３０分
間加温した。この溶液に０．０４％亜硝酸ナトリウム（
０，４８Ｍ塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモ
ニウム。
０．０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩
酸塩の各０．５−を順次加えてジアゾヵップリングし、
５４５ｎｍでその吸光度を測定し、別に作成した検量線
（第５図）のａよりＥ、 ｃｏｌｉｏｌｌｌ：Ｂ４エン
ドキシン換算量として表わした。第６図に示すように２
５例全例において高濃度のエンドトキシンが検出され（
健常人２５例０．８±０．６ｐｇ／ｄ）、そのうちの３
例（＊印）は血培にて、イシエリキア・コリ［Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノ
ーザ［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）をそれぞれ検出し、残りの
２２例は血培では陰性であったが、熱発、白血球数、そ
の他臨床症状及び抗生物質感受性よりダラム陰性菌敗血
症と診断された。
酸塩の各０．５−を順次加えてジアゾヵップリングし、
５４５ｎｍでその吸光度を測定し、別に作成した検量線
（第５図）のａよりＥ、 ｃｏｌｉｏｌｌｌ：Ｂ４エン
ドキシン換算量として表わした。第６図に示すように２
５例全例において高濃度のエンドトキシンが検出され（
健常人２５例０．８±０．６ｐｇ／ｄ）、そのうちの３
例（＊印）は血培にて、イシエリキア・コリ［Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノ
ーザ［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）をそれぞれ検出し、残りの
２２例は血培では陰性であったが、熱発、白血球数、そ
の他臨床症状及び抗生物質感受性よりダラム陰性菌敗血
症と診断された。
従って、本発明方法は通常の検査法では診断がきわめて
困難なダラム陰性菌敗血症の迅速診断法としてきわめて
有力な手法として評価されうるものであることが理解で
きよう。
困難なダラム陰性菌敗血症の迅速診断法としてきわめて
有力な手法として評価されうるものであることが理解で
きよう。
実施例９
尿検体の測定
自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿培
養でイシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉｌ、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓｌを検出した３症例につき、本発
明方法による尿中エンドトキシンの定量を行った。
養でイシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉｌ、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓｌを検出した３症例につき、本発
明方法による尿中エンドトキシンの定量を行った。
尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コツプに採取し、その０
．００５−に実施例７に記載の本発明方法によるエンド
トキシン測定剤０２−を加え、３７℃で３０分間加温し
た。実施例８と同様にジアゾカップリング後、５４５ｎ
ｍでその洛液の吸光度を測定し、別に作成した検量線（
第５図）のｂよりＥ、 ｃｏｌｉ ０１１１ ：Ｂ４
ｘンドキシン換算値として表わした。第３表に示すよう
に３例中全例において高濃度のエンドトキシンが検出さ
れ（健常人：６０ｐｇ／−以下）、本発明方法はグラム
陰性菌尿路感染症の迅速確定診断法として、きわめて有
力な手法であることが理解できよう。
．００５−に実施例７に記載の本発明方法によるエンド
トキシン測定剤０２−を加え、３７℃で３０分間加温し
た。実施例８と同様にジアゾカップリング後、５４５ｎ
ｍでその洛液の吸光度を測定し、別に作成した検量線（
第５図）のｂよりＥ、 ｃｏｌｉ ０１１１ ：Ｂ４
ｘンドキシン換算値として表わした。第３表に示すよう
に３例中全例において高濃度のエンドトキシンが検出さ
れ（健常人：６０ｐｇ／−以下）、本発明方法はグラム
陰性菌尿路感染症の迅速確定診断法として、きわめて有
力な手法であることが理解できよう。
第３表
ダラム陰性菌感染尿の尿中エンドトキシン濃度３ ５ｅ
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＞１０’
２１６．７＊コロニ一形成単位 実施例１０ 脳を髄液検体の測定 自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にシュード
モナス・エルギノーザｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ）およびヘモフィルス・インフルエンザ
ｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅｌを
検出した細菌性髄膜炎の３症例につき、本発明方法によ
るエンドトキシンの定量を行った。
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＞１０’
２１６．７＊コロニ一形成単位 実施例１０ 脳を髄液検体の測定 自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にシュード
モナス・エルギノーザｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ）およびヘモフィルス・インフルエンザ
ｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅｌを
検出した細菌性髄膜炎の３症例につき、本発明方法によ
るエンドトキシンの定量を行った。
腰椎穿刺にて無菌的に採取した髄液００５ｉに注射用蒸
留水００５−を加え、さらに実施例５に記載の本発明方
法によるエンドトキシン測定剤０．１−を加え、３７℃
で３０分間加温した。
留水００５−を加え、さらに実施例５に記載の本発明方
法によるエンドトキシン測定剤０．１−を加え、３７℃
で３０分間加温した。
実施例８と同様にジアゾカップリング後、５４５ｎｍで
その？８液の吸光度を測定し、別に作成した検量ＭＡ（
第５図）のｂよりＥ、 ｃｏｌｉ ０１１１Ｂ４エン
ドキシン換算値として表わした。第４表に示すように、
３例中全例において高濃度のエンドキシンが検出され（
健常人 ３ｐｇ／−以下）本発明方法はダラム陰性菌髄
膜炎の早期迅速診断法としてきわめて有力な手法として
評価され得るものであることが理解できよう。
その？８液の吸光度を測定し、別に作成した検量ＭＡ（
第５図）のｂよりＥ、 ｃｏｌｉ ０１１１Ｂ４エン
ドキシン換算値として表わした。第４表に示すように、
３例中全例において高濃度のエンドキシンが検出され（
健常人 ３ｐｇ／−以下）本発明方法はダラム陰性菌髄
膜炎の早期迅速診断法としてきわめて有力な手法として
評価され得るものであることが理解できよう。
第４表
（ｐｇ／ｍ＃）
［発明の効果］
以上述べたように、本発明はライセートを用いたエンド
トキシンに特異的な測定剤を提供するものであり、血液
や尿、髄液等の生体試料中に存在するダラム陰性菌由来
のエンドトキシンを迅速簡便かつ高い精度で測定するこ
とが可能であり、ダラム陰性菌血症ならびにエンドトキ
シン血症の迅速な詑断ならびに治療効果の判定に役立つ
もので、特に臨床検査医学に貢献するところ大である。
トキシンに特異的な測定剤を提供するものであり、血液
や尿、髄液等の生体試料中に存在するダラム陰性菌由来
のエンドトキシンを迅速簡便かつ高い精度で測定するこ
とが可能であり、ダラム陰性菌血症ならびにエンドトキ
シン血症の迅速な詑断ならびに治療効果の判定に役立つ
もので、特に臨床検査医学に貢献するところ大である。
さらに本発明は、注射用蒸留水、医療用具および注射薬
を汚染したエンドトキシンを迅速かつ正確にｉ＋＋定す
ることを可能とし、これらはいずれも本発明の副次的効
果として、とくに医薬品製造分野に貢献するところ大で
ある。
を汚染したエンドトキシンを迅速かつ正確にｉ＋＋定す
ることを可能とし、これらはいずれも本発明の副次的効
果として、とくに医薬品製造分野に貢献するところ大で
ある。
第１図はカブトガニ血液凝固系のカスケード機構を示す
。 第２図はＡ剤、Ｄ剤の（１−３）−β−Ｄ−グルカンに
対する反応性を示す。第３図はＡ、Ｄ剤のＥ、 ｃｏｌ
ｉ Ｏ１１１： Ｂ ４エンドキシンに対する反応性
を示す。第４図はＳａ１ｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔ
ｉｄｉｓエンドトキシンの水及び（１−３）−β−Ｄ−
グルカン添加希釈液に対するＤ剤の反応性を示す。 第５図は実施例８〜１０のＥ、 ｃｏｌｉ ０１１１
：Ｂ４エンドキシンの検量線を示す。 第６図は実施例８の血漿検体中のエンドトキシン測定結
果を示す。 ０６．２５１２５ 工゛／トドキシン （ｐｇ／ｍＬ） 第 図 第 図 １２．５ ２５ ５０工゛ノＦトキ：
／ン （ｐｇ／ｍＬ） 第 図 手続補正書
。 第２図はＡ剤、Ｄ剤の（１−３）−β−Ｄ−グルカンに
対する反応性を示す。第３図はＡ、Ｄ剤のＥ、 ｃｏｌ
ｉ Ｏ１１１： Ｂ ４エンドキシンに対する反応性
を示す。第４図はＳａ１ｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔ
ｉｄｉｓエンドトキシンの水及び（１−３）−β−Ｄ−
グルカン添加希釈液に対するＤ剤の反応性を示す。 第５図は実施例８〜１０のＥ、 ｃｏｌｉ ０１１１
：Ｂ４エンドキシンの検量線を示す。 第６図は実施例８の血漿検体中のエンドトキシン測定結
果を示す。 ０６．２５１２５ 工゛／トドキシン （ｐｇ／ｍＬ） 第 図 第 図 １２．５ ２５ ５０工゛ノＦトキ：
／ン （ｐｇ／ｍＬ） 第 図 手続補正書
Claims (2)
- （１）カブトガニ・アメボサイト・ライセートと、（１
→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対する抗体とか
らなるエンドトキシンの測定剤。 - （２）（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対す
る抗体を固定化した担体に、カブトガニ・アメボサイト
・ライセートを接触させて得た（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン感受性因子不含ライセートからなるエンドトキシ
ンの測定剤。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21895490A JP2944721B2 (ja) | 1990-08-22 | 1990-08-22 | エンドトキシンの測定剤 |
| EP91914761A EP0500947B1 (en) | 1990-08-22 | 1991-08-22 | Assaying agent for endotoxin |
| DE69129365T DE69129365T2 (de) | 1990-08-22 | 1991-08-22 | Testagens für endotoxin |
| PCT/JP1991/001118 WO1992003736A1 (en) | 1990-08-22 | 1991-08-22 | Assaying agent for endotoxin |
| US07/789,583 US5286625A (en) | 1990-08-22 | 1991-11-08 | Method for assaying endotoxin in a whole blood sample or protein solution containing the same |
| US08/427,260 US5605806A (en) | 1990-08-22 | 1995-04-24 | Reagent for assaying endotoxin |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21895490A JP2944721B2 (ja) | 1990-08-22 | 1990-08-22 | エンドトキシンの測定剤 |
| US07/789,583 US5286625A (en) | 1990-08-22 | 1991-11-08 | Method for assaying endotoxin in a whole blood sample or protein solution containing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04102064A true JPH04102064A (ja) | 1992-04-03 |
| JP2944721B2 JP2944721B2 (ja) | 1999-09-06 |
Family
ID=26522843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21895490A Expired - Fee Related JP2944721B2 (ja) | 1990-08-22 | 1990-08-22 | エンドトキシンの測定剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5286625A (ja) |
| EP (1) | EP0500947B1 (ja) |
| JP (1) | JP2944721B2 (ja) |
| WO (1) | WO1992003736A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014104352A1 (ja) * | 2012-12-28 | 2014-07-03 | 生化学工業株式会社 | リムルス試験に付されるアンチトロンビンiii用の前処理剤及び前処理方法 |
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| CN1063489C (zh) * | 1993-06-29 | 2001-03-21 | 生化学工业株式会社 | 新多肽及编码该多肽的dna |
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-
1990
- 1990-08-22 JP JP21895490A patent/JP2944721B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
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| US10132812B2 (en) | 2012-12-28 | 2018-11-20 | Seikagaku Corporation | Pre-treatment agent and pre-treatment method for antithrombin III to be subjected to limulus test |
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