JPH01503808A - 固定化された凝集剤を用いるアフイニテイ分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化された凝集剤を用いるアフイニテイ分離発明の背景 アフイニテイ分離は一方の分子に対するもう一方の分子の特異的な結合を用いる ことにより達成される任意の分離と定義される。バイオフイニテイ分離はそのア フイニテイ反応に関与する化合物の少くとも１種が生物学的に活性であるかまた は生物学的に重要であるアフィニテイ分離である。バイオアフイニテイ分離には 一般に少くとも１種の生物学的巨大分子、例えばタンパク質または核酸が結合対 の一方の成分として包含される。かかる結合対の例には、抗原−抗体、基質−酵 素、エフェクター−酵素、インヒビター−酵素、相補性核酸ストランド、結合タ ンパク質−ビタミン、結合タンパク質−核酸その他が包含される。特異的な結合 対に関し２種の成分を表わすのにリガンドおよびバインダーなる用語を用いるこ とにする。これら用語の使用は簡単にするためであり。

ありうる出願の範囲を限定するものではない。

結合された物質を結合されてないまま残っている物質から分離するのに最も普通 に用いられる手段はリガンドまたはバインダーの一方を固形支持体に結合させ１ 次に一旦結合が起ったら固体を液状環境からとり出すことである。固形支持体へ のこの結合は共有または非共有のいるかまたは支持体とりガントまたはバインダ ーとの間にリンカ−を組み込むこともできる。

アフィニテイ分離は通常他の工程の一部分として用いられる。一つの例はへテロ ジニアスイムノアツセイの領域である。そこではしばしば血清または血漿である 複雑な混合物から被分析物質を捕捉するのにパイオアフイニティ分離が用いられ る。被分析物質を捕捉したのち汚染物を洗い去りそして被分析物質を任意の種類 の周知のアッセイプロトフルを用いて検出する。ヘテロジニアスイムノアッセイ に用いられるいくつかの固形支持体は礪インチプラスチック球、試験管の内側、 マイクロタイタープレートウェルの内側、ラテックス粒子および磁気粒子である 。

ヘテロジニアスイムノアツセイにおける適用では小さな粒子を使用するのがしば しば望ましく、これらは磁気粒子または非磁気粒子であることができる。これら の粒子は一般に大量のりガントまたはバインダーを表面に結合させて受容するこ とができるという長所を有する。また、比較的表面積が大きいので、高い結合容 量および迅速な捕捉速度が得られる。粒子が溶液中に懸濁されたままであって、 標的分子が固相に結合されたりガントまたはバインダーに遭遇するまでに移動す るに要する拡散距離が最小限に抑制される場合は、この迅速な捕捉速度はさらに 促進される。

かかる小粒子を液体溶液から分離することはしばしば単調で労働集約的である。

遠心分離はこの分離を達成する一手段である。しかし時間がかかりそして労働集 約的である。磁気粒子が用いられる場合に可能なもう一つの方法は磁場の影響の 下に液体からそれらを分離することである。この方法は特別の粒子および強力な 磁場を必要とし、かつ容易には自動化されない。すべての種類の小粒子を液体懸 濁液から分離するための改良された手段が必要なままである。この手段は簡単で 、迅速で、効率的でかつ容易に自動化されねばならない。

凝集剤とは懸濁液からの微粒子の集合を促進および加速しそして究極的（二はこ れら集合物を沈殿に至らしめる物質である。凝集剤の最大の用途は有機および無 機微粒子状物質の両方を除去するための水の精製の領域においてである。４リエ テレンイミン（ＰＥＩ）が凝集剤の一つの例である。慣用の凝集剤は硫酸カリウ ム、塩化第二鉄および硫酸第二鉄である。最近、重合体状凝集剤が水精製に好都 合に適用される。かかる種々の試薬が当業上知られている。また、負に荷電した ν過助剤微粒子または吸着剤および繊維を正に荷電したポリマーを用いて凝集さ せる方法も濾過媒体の生産に普通に実施される（　Ｈｏｕ。

米国特許第４，５７８，１５０号、１９８６年３月２５日発行）。

ＰＥＩが結合されたクロマトグラフィー支持体は先にＡｌｐｅｒｔ他［Ｊｏｕｒ ｐａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第１８５巻３７５〜３９２（１ ９７９）］、Ｖａｎｅｃｅｋ他［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ＢｌｏＣｈｅｍｉＳｔ ｒ’ｙ。

ツバ特許第０．１６２，４６２号、１９８５年１１月２日公告により報告されて いる。これらは最初ＨＰＬＣイオン交換充填物としての使用について報告された ものでありそしてＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の精製に特に有用である。

発明の要約 本発明はアフィニティ分離の分野に関するものであり、そしてより詳しくは臨床 的なアッセイの分野に関する。

分離およびアッセイ用媒体として使用されうる固定された凝集剤を含む固形支持 体は開示されている。例えば凝集剤が固定されている膜または分離用カラムであ る。

例えば、慣用のクロマトグラフィーカラムを用いると、小さな粒子は一般にカラ ムを通過するかまたはカラムの頂部に密集する。固定された凝集剤をクロマトグ ラフィー支持体内に導入すること（二より、小粒子がより均一にカラム中に分布 されるであろう。粒子試薬は粒子にリガンドまたはバインダーを結合させること により調製されうる。次に粒子を凝集剤カラム中に捕捉するとこれを標準的なア フイニティ力ラムとして用いうる、すなわち混合物をカラムに通すとそれにより 標的物質がりガントまたはバインダーに結合しよう。望ましからぬ物質が溶離さ れたのち、標的物質は溶離緩衝液を適当に変化させること（二より遊離されうる 。このカラムはまた、容易に分離、洗浄およびアッセイされうる試薬粒子を使用 し、凝集剤が固定されたクロマトグラフィー支持体を含有するカラムにインキュ ベートされた混合物を通し、それにより粒子なカラム中に捕捉させることにより イムノアッセイにも使用されうる。次に、展開された基質を溶離しそして測定す る。この方法により、粒子を固形支持体として使用するエンザイムイムノアッセ イが簡略化されそしてアッセイの自動化が促進される。

発明の詳細な記載 本発明方法（二よりアフィニティ分離を実施するための大きな利点が得られる。

最大の利点のうちの２点は、多種類の粒子および方法にこの方法が一般的に適用 できること、および自動化が容易であることである。他の利点には貴重な試薬を 保存する機会および迅速な分離が得られることが包含される。

任意の凝集剤が本発明方法に使用されうるがＰＥＩが好ましい。ＰＥＩは種々の 種類の方法で適当な支持体に結合されうる。ＰＥＩは過沃素酸塩酸化法によりセ ファデックス型樹脂に結合されうる。この方法においては、セファデックスを洗 浄しそして次に過沃素酸塩を用いて酸化してアルデヒド官能基を生成させる。次 にＰＥＩを加え、アルデヒド基とＰＥＩのアミン基との間にシッフ塩基を形成さ せる。次にこれらシッフ塩基を水素化ホウ素シアノナトリウムを用いて還元する 。この誘導体形成された樹脂を洗浄し適当な緩衝液で平衡としたあとはすぐ使用 できる。

ＰＥＩを支持体に結合させるもう一つの方法はただ吸着から入手できるような多 孔性プラスチックロンドが用いられる場合は、これは３０％イソプロパツール中 の３％ＰＥＩ溶液中に前記ロンドを一夜浸漬させることにより達成できる。次に このロンドを水および適当な緩衝液で洗浄するとすぐ使用ができる状態となる。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ社からバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）の商品名の下に入手しうるも ののようなポリアクリルアミド樹脂が用いられる場合は、これは樹脂を０．１　 Ｍ塩化ナトリウム中の３％ＰＥ工溶液中に浸漬することにより達成できる。これ らは代表的な操作のみであって当業者には多くの代替法が認識されよう。

ＶａｎｅＣｋ他およびＦ１ａ５ｈｅｒのＰＥＩにより誘導体化された支持体も本 発明における機能を有すると予測される。

前記論議されたセファデックス、バイオゲルおよび多孔性プラスチック型支持体 に加え、任意の他の種類の支持体も機能を有すると予想される。支持体それ自体 は非反応性でかつ標的物質と用いられるリガンドまたはバインダーとの間の非特 異的結合が低いものでなければならない。支持体の多孔度は特定の粒子で得られ る流速が最適となるように調整されうる。酵素基質のような小さな分子を最小限 にしか保持しないカラム充填物質を用いるのがしばしば好ましい。かかる支持体 を用いることにより、粒子に結合された酵素をそれがカラムに捕捉されている間 （：アツセイできる。前記アッセイに用いられる基質および生成物は次にカラム から容易に溶離し検出されうる。これら物質がかなり遅延する場合は、それによ りアッセイの完了が遅延されよう。この点でバイオゲルＰ−２のような支持体が 好ましい。

本発明で使用するのに適する緩衝液は一般に生物学的試薬および検体と相容性の ものである。一般に燐酸塩緩衝液が好ましい。

前記したとおり、本発明方法の大きな利点の一つはこの方法に多種類の粒子を使 用できることである。好ましい粒子は一般に小さく、そして標的分子と用いられ るリガンドまたはバインダーとの非特異的結合が低いものであろう。小さい粒子 が好ましいが、比較的大きな粒子も使用できる。しかしながら、粒子はカラムを 閉塞させるほど大きくてはならない。比較的大きい粒子が望ましい場合は、受容 されうる流速が得られるようにカラム充填物質の多孔性を調整することが可能で ある。Ｃｒａｉｇ他により開示された種類のラテックス粒子（米国特許第４．４ ０１，７６５号、１９８３年８月３０日発行）が用いられうる。＊ａｖａｎｃｅ 　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社からＢｉｏＭａｇの商品名の下（二人手しうるような磁 気粒子も適当である。しかしながら好ましい粒子はここに参照文献としてとり込 まれる１９８７年４月２８日に発行された米国特許第４，６６１，４０８号に記 載される安定化された二酸化クロム粒子である。これら粒子はルチル型二酸化ク ロムのコアから成り、このコアを充分に表面還元し、アルミナで被覆し、ホウ酸 塩を含有するシリカでさらに被覆しセしてシランでまださらに結合される。これ ら粒子は大きな表面積４０〜１００ｍ２／ｇを有しており、水溶液中で安定でか つ所望のリガンドまたはバインダーに容易に結合される。

リガンドとは抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、ビタミン、色素、または募素エ フェクターおよびインヒビターを含む他の小さな分子を意味し、そしてバインダ ーとは抗体、酵素、核酸、結合性タンパク質、結合性タンパク質の合成模造品例 えばポリリジンまたは相互に特異的な結合をしうる他の分子を意味する。リガン ドおよびバインダーは種々の知られた方法により容易に粒子に結合されうる。容 量の損失および時間による性能の減損を回避するには共有結合が一般に好ましい 。

ヘテロジニアスイムノアツセイの技術において多くのアッセイフォーマットが知 られている。本方法は任意の知られたフォーマットにおいて要求される分離を達 成するのに適用できる。それがいかにして成されうるか下記論議により一般的概 略を提供する。当業者は本発明方法を用いるための他の手段を迅速に認識しよう 。

本発明方法は競合イムノアッセイにおける結合された標識と遊離の標識とを分離 するのに適用できる。結合された標識は小さな粒子に捕捉され、その粒子が凝集 剤カラムに捕捉される。遊離の標識はカラムを通って溶離されて検出に用いられ うる。この標識が酵素である場合は、結合されたフラクションはカラムに基質を 流し、溶離を停止して基質を酵素と反応させ、次に溶離を再開して生成物を溶離 させ次にこれを定量することにより検出することもできる。

本発明方法はサンドイッチイムノアッセイにおける分離に適用できる。このフォ ーマットにおいては、捕捉された抗体が小さな粒子に結合される。この粒子を標 的物質を含有する検体および標識された抗体と反応させる。

適当な時間反応させたのち、この混合物を凝集剤カラムを通して溶離して粒子、 および捕捉された抗体に結合されている標的物質（二結合されたすべての標識さ れた抗体を捕捉する。結合されなかった標識を定量することができるが、結合さ れた標識をアッセイするのがしばしば好都合である。酵素標識の場合、これは実 質的には競合的イムノアッセイにおいて結合された酵素の検出について前記した ようにしてなされる。

本発明方法はまたパイオアフイニテイ分離を行うのに適用することもできる。パ イオアフイニテイ力ラムはりガントまたはバインダーを小さな粒子に結合させる ことにより調製されうる。次にこの粒子を凝集剤カラムに捕捉する。次にこのカ ラムを標準的なパイオアフイニテイ力ラムとして用いることができる。すなわち 、混合物をそれに通すことができそして標的物質がリガンドまたはバインダーに 結合できる。汚染物質が一旦溶離されると、次に溶離緩衝液を適当に変化させる ことにより標的分子が遊離されうる。これをいかにして用いうるかの一つのタン ノξり質ａはＩｇ（）イムノグロブリンの大抵のサブクラスに結合する。タン・ ξり質ａ粒子を捕捉して有する凝集剤カラムは血清からＩｇＯイムノグロブリン を除去するのに有用であろう。このＩｇＧは溶離緩衝液を適当に変化させること により回収されうる。

本発明方法はまたアフイニテイ力ラムにより仲介されたイムノアッセイ（ＡＣＭ ＩＡ）にも適用できる。代表的なＡＣＭＩＡアッセイはＦｒｅｙｔａｇ他［：Ｃ １１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、第３０巻。

４１７〜４２０　（１９８４））によりａＣａ■Ｃａ式臨床アナライザー　（Ｅ 、１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｃｏ、　、　Ｉｎｃ、　 、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＢ）に関して記載されている。アフイニテイ力 ラムを前記したようにして調製し、次にＦｒｅｙｔａｇ他により記載されるよう にして使用する。Ｆｒｅｙｔａｇ他により開示されたジゴキシンアッセイに関し ては、必要とされるウアバイン−ＢＳＡの量が本発明方法を用いると３００分の １以上低下′することが見出された。

多くの化学的沈殿は小さな粒子として形成されることも認識される。これら粒子 も本発明方法により除去されうる。かかる沈殿は免疫沈殿すなわち、抗原と抗体 の大きな集合物形成の結果として、または化学的沈殿の結果として形成されうる 。化学的沈殿の一つの例は緩衝された燐タングステン酸試薬を使用して低密度お よび非常に低密度のりボタンバク質を沈殿させ、高密度リボタン・９り質を定量 することである。免疫沈殿の一つの例はイムノグロブリーンの比濁測定または濁 り測定による定量に用いられるようなイムノグロブリンと抗−イムノグロブリン 抗体との直接反応である。

驚くべきことに、固定化された凝集剤を含有するカラムにより液体懸濁液から小 さな粒子を除去するための非常に簡単で効率的で効果的な手段が提供されること が見出された。この性質によりパイオアフイニチイ分離そして特にイムノアッセ イ己おけるこれらカラムの使用が非常に有利となる。

下記実施例（二より本発明をさらに説明する。

実施例　１ 共有結合したＰＥＩを用いる競合的ジゴキシンアッセイ（局　カラムの調製 セファデックスＧ−１０樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙＰｒｏｄｕｃｔｓ）　１６．６９を沸騰水中で１０分間加熱しそして蒸留水１ ００ｒｎｔを用いて２回洗浄した。この膨潤した樹脂に蒸留水６３−中の過沃素 酸ナトリウム０．６６　ｆを添加した。この混合物を室温で暗中２時間混合し、 ２回水洗し、０．１５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，８）で２回洗いそして前記燐 酸塩緩衝液を用いて総量９０−となした。次にこの混合物を渦巻かせて樹脂を均 等に懸濁させそしてこの懸濁液６０−を３０　％　ＰＥＩ　２９および水素化ホ ウ素シアノナトリウムｉｏａｇと混合した。この混合物の−を６Ｈ塩酸を用いて ５７に調整した。この混合物を室温で一夜混合し次に燐酸塩緩衝液１００−ずつ を用いて３回洗った。

Ｐｏｎｔ　ａｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏ ｎ、　ＤＥ）に使用するために設計されたカラム中に充填した。このカラムは直 径約５．５酊および長さ８８　ｍｓのプラスチック管であって、その両端にゴム 栓がついていてそれにより検体および希釈剤が自動的に流入し、そして溶出液が 出てきて分析用テストハックに入るようになっている。かかる分析用テストパッ クはり、　Ｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ他に出されたＲＥ　２９７２５中に記載された。

このカラムをａＣａ■アナライザー用の市販のジゴキシンパック中のカラムに代 えて用いた。

ＣＢ）　ウアバイン−ＢＳＡ−Ｃｒ０２粒子の調製ｉ、ＣｒＯ２の還元的表面処 理 品質改善され加熱された二酸化クロム２５０２を水１７５０ｄ中の重硫酸ナトリ ウム１ｏｏｒと混合した。この混合物をＷ−２５０Ｖ−Ｂたて型ばルト駆動−７ ｏイドミル（ＶｅｒｔｉｃａｌＢｅｌｔ−Ｄｒｉｖｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｍｉｌ ｌ）（（）ｒｅｅｒｃｏ　Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ、　Ｈｕｄｓｏｎ。

Ｎ、Ｈ，）中で４５分間粉砕しそしてガラス容器中で１週間熟成させた。この粒 子を蒸留水で透析して過剰の重亜硫酸ナトリウムを除去した。

１１、シリカ被覆 前記で得られた二酸化クロム粒子１００２を３１のビーカー中に入れそして２， ５１の蒸留水を添加した。この粒子を機械的に攪拌しながら９０℃±２℃に加熱 した。この混合物にアルミン酸ナトリウム（４０％溶液）　５．０　ｍｊ！を加 え、この懸濁液を５％硫酸の添加によりｐＨ９に調整した。

トリウム６．２５２を含有する水１５０−を１時間かかつて滴下した。５％硫酸 を同時に滴下することにより混合物をｐ）（９±０，５に保持した。反応時間中 ははげしく攪拌し続けた。全ての試薬が添加されたのち、この混合物を９０℃に 加熱しそしてさらに６０分間攪拌し、次に５チ硫酸を用いてｐＨ７に調整しそし て室温まで放冷させた。

この粒子を蒸留水で透析した。

ｉｉｉ、シラン被覆 シリカ被覆された二酸化クロム粒子１００りを、機械的攪拌機、還流冷却器およ び温度センサーを備えた２Ｅの丸底フラスコ中、１．８１の蒸留水中に懸濁させ た。２００ｄの７ミノプロピルトリエトキシシランを加え、この混合物を５５℃ で１８時間攪拌した。この粒子を蒸留水１３１を用い、沈降およびデカンテーシ ョンを反復により３回洗浄した。この洗浄した粒子を１０ミリモルの燐酸塩緩衝 液（−７）中に５ｏｎｙ／−で懸濁させた。

１ｖ、ウアバイン−ＢＳＡの調製 ウアバインオクタ水和物５２を熱蒸留水５０〇−中に溶解させそして室温まで放 冷させた。メタ過沃素酸ナト９　’）ム（ＮａＩＯ４）　７．３９をこのウアバ イン溶液に加え、暗中で２時間攪拌した。この溶液をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ ）（Ｉ　−Ｘ８　）アニオン交換樹脂（黄色が消失するまでダウエックユｍ脂２ ５（１１を水洗することにより調製）の床に通した。この酸化されたウアバイン 溶液をＢＳＡ　Ｉ　Ｏｒを含有この混合物を１時間攪拌しそして水素化ホウ素シ アノナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）　０．６４９を加えた。この混合物を室温で ４８〜７２時間攪拌した。ウアバイン−ＢＳＡ接合体を流水で１２〜２４時間、 および２０容量の０．０１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で４℃で１ ６時間透析した。この接合体を４℃で貯蔵した。

Ｖ、ＣｒＯ２粒子へのタンパク質の結合シランで被覆されたＣｒＯ２粒子の５０ １１９／−懸濁液１〇−を１０ｍＭ燐酸塩緩衝液５０ｒｎ１を用いて３回洗浄し た。この洗浄された粒子に５％グルタルアルデヒド２０−を加えそして室温で３ 時間混合した。この活性化された粒子を燐酸塩緩衝液５０−ずつで５回洗いそし て同じ緩衝液１〇−中に懸濁させた。緩衝液１〇−中のウアバイン−ＢＳＡ接合 体４０Ｑの溶液を加えた。混合物を室温で２０時間攪拌した。粒子を１０ｍＭ燐 酸塩緩衝液で１回洗浄し、未反応のアルデヒド基を１ｍグリシン（ｐｉ−１８） ５０−の添加によりクエンチしそして１時間混合した。タン・ξり粒子を１０　 ｍＭ燐酸塩緩衝液＋０１％ＢＳＡ　＋　０．１％チメロサールの５０−ずつで１ ０回洗いそして同じ緩衝液５０ｍｔ中４℃で貯蔵した。

（Ｃ）　アッセイ操作 ０．１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，８）の２００μｌ中にジゴキシン抗 体−酵素接合体試薬（Ｅ、　１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ　＆　 Ｃｏ、　、Ｉｎｃ、　、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）　２００μｌおよびジ ゴキシン含有ヒト血清２００μｌを加えた。このジゴキシン抗体−酵素接合体試 薬はウサギ抗ジゴキシン抗血清からのＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントとβ−ガ ラクトシダーゼの共有接合体である。この混合物を室温で１０分間インキュベー トしそしてウアバイン−ＢＳＡ−Ｃｒ０２粒子の１０ｊｌＰ’／ｒｎｔ懸濁液２ ００μｌを加えた。室温でさらに５分間インットでとりそして前記のようにして 調製さルたカラムを含有するジゴキシンパックに注入した。粒子がカラムにより 捕捉されそしてＰ液の酵素活性を、基質としてβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを用 いてアナライザー：二より自動的に測定した。０〜５　ｎｇ７’ｒｎｌの濃度で ジゴキシンを含Ｏｎｇ７／ｎ１ｌｌのバックグラウンド（Ｂ、（）、）、および ０および５℃ｇ／ｒｎｌ　（Ａ　Ｏ，５）間の応答差を測定して、それぞれ１８ ｍＡ／分および６４＋１１）Ａ／分であった。

実施例　２ 多孔性プラスチックに吸収されたＰＥＩを用いる結合相ジゴキシンアッセイ （４）カラムの調製 １５ａｍの細孔寸法を有し、直径約５．３　ｚｘおよび長さ約８０ｍｍを有する 多孔性プラスチックロッドをＰｏｒｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆａｉｒｂ ｕｒｎ、　ＧＡＪ）ら得た。約２０ロツドなそしてａｃａ■アナライザーで使用 するための１．Ａ０項に記載された空のカラムに挿入した。次にこのカラムを０ ．１５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，８）５−で洗浄した。

（Ｂ）　アッセイ操作 試験管にジゴキシン抗体−酵素接合体試薬５０μｌ、ジゴキシン含有ヒト血清５ ０μ！および１．１５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，８）５０ａｂを加え、渦巻か せた。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、モして１．８０項で調 製されたウアバイン−ＢＳＡ　−ＣｒＯ２粒子の１０ＪＩｇ／−懸濁液５０ａＬ を加え、よく混合した。この混合物をさらに２分間インキュベートしそしてその １５０μｌを前記のようにして調製されたカラムに注入し、０．１５Ｍ燐酸塩２ ゴを用いて溶離した。０．ｌＭｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ド１−をカラムに注入しそして３７℃で１０分間インキュベートした。次にこの 方ラムを０．１５Ｍ燐酸塩２−を用いて溶離しそして４０６ｎｍでの汲光度を記 録した。

（Ｃ）結果 Ｂ、Ｇ、は３０７ｍＡ／分そしてΔ０．５は２００　ｍＡ／分であった。５０８ Ｍの細孔寸法をした多孔性プラスチックロッドを用いてこの操作を反復した。Ｂ 、Ｇ、は２６ＢｍＡ／分でありモしてΔ０．５は１６２ｍＡ／分であった。

実施例　６ バイオゲルＰ−２に吸着されたＰＥＩを用いるＴＳＨサンド（囚　カラムの調製 バイオゲルＰ−２（１００−２００／　ッシュ）４０　ｆおよびＰＥＩ　１０９ の試料を０．１　Ｍ塩化ナトリウム３００ｄ中室温で一夜混合した。この樹脂を ０．１　ｍ塩化す）リウム３００ｍ１ずつで３回洗浄しモして１、Ａ０項記載の ａＣａ■アナライザーで使用するためのカラムに充填した。このカラムを０１％ ツイー７２０含有Ｂ　□　ｚｘ　Ｎａｃｌ　（ｐＨ６，０）を用いて平衡となし た。

（Ｂ）　抗−ＴＳＨＣｒＯ２粒子ノ調製ｉ、ＣｒＯ２の還元的表面処理 品質改善されたＣｒＯ２２５０ｆを水１７５ｏ−中の重亜硫酸ナトリウム１００ りと混合した。この混合物をＷ−２５ｏＶ　−Ｂたて型ベルト駆動コロイドミル （Ｖｅｒｔｉｃａｌ　Ｂｅ１ｔ”ＤｒｉｖｅＣｏｌｌｏｉｄ　Ｍｉｌｌ）（（） ｒｅｅｒｃｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＋　Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎ、Ｈ，）中で４５ 分間粉砕した。この粒子を水洗しそして’Ｊ霧乾燥した。噴霧乾燥されたＣｒ○ ２粒子２０９をデカンテーションにより蒸留水２００−を用いて２回洗浄した。

この粒子を２００ｒｎｌの組織培養フラスコ中で重亜硫酸ナトリウム２０？およ び％′のガラスピーズ５０９を含有スる蒸留水２００ゴ中に分散した。この混合 物を室温で５　ｒｐｍで４８時間回転させた。粒子をガラスピーズから分離しそ して磁気分離により１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）２００−を用いて ３回洗浄した。

１１、タンノξり質の結合 （ｐＨ７，４）の５０−ずつを用いて３回洗浄した。第３回目の洗浄後、粒子を 磁気により分離し、上清を吸引し、湿ったケーキに５チグルタルアルデヒド２０ ｒｎｔを加え、室温で３時間ゆり動かした。このグルタルアルデヒドにより活性 化された粒子を結合用緩衝液（１０ｍｍ燐酸カリウム、ｐＨ７，４）　５０−ず つを用いて１０回洗浄した。最後の洗浄後、粒子を緩衝液１０−中に再懸濁した 。これに結合緩衝液１〇−中の精製されたαサブユニット特異的抗体６　Ｑを加 えてこの混合物を４℃で２０時間ゆり動かした。抗体が結合した粒子を結合緩衝 液で１回洗い、次に未反応のアルデヒド基を１Ｍグリシン（ｐＨ８，ｏ　）　５ ０　ｄと１０分間反応させることによりクエンチした。この粒子試薬を洗浄緩衝 液（０１％ＢＳＡをも含有する結合緩衝液）５０ｍＡ’ずつを用いて１０回充分 に洗い、すべての非共有結合された抗体を除去した。最終的に得られた試薬を防 腐剤として０．１　％ナトリウムアジドを含有する洗浄緩衝液１０ｍｔ中に再懸 濁し、４℃で貯蔵した。

（Ｃ５アッセイ操作 試験管に既知量のＴＳｌ（を含有するヒト血清１５０μｌ、およびＨｙｂｒｉｔ ｅｃｈ　Ｔａｎｄｅｍ■−ｅ　ＴＳＨイムノエンザイメトリツクアツセイキット （Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）からの抗体 接合体試薬２５μｌを加え、渦巻かせた。この混合物を３７℃で１０分間インキ ュベートしそして抗−ＴＳＨ−ＣｒＯ２粒子（２５Ｊ１ｇ／ｄ）　２５ｔｔｌを 加えて渦巻かせた。

さらに１０分間インキュベーションを続け、そして前記のようにして調製された カラムにこの混合物１５０ａＬを注入した。このカラムを８［］ｍＭ塩化ナトリ ウム＋ｏ、　１　％ツイーン２０緩衝液（ｐ）（６，０）の２ｄで洗浄した。１ Ｍジェタノールアミン、０．５ｍＭ　Ｗ、ｇＣ１２（ｐＨ８，９）中の３ｍＭｐ −ニトロフェニルホスペード１−をカラムに注入した。カラムを３７℃で３０分 間インキ二に一トしそして５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ＊）（ｍ８ ．９　）　２−を用いて溶離した。４０６ｎｍでの溶離剤の吸光度を測定した。

それらの結果から０８ＩＵ／ｍ＋Ｊパックグラウンド（Ｂ、（）、）および０θ ＩＵ／ｍＪおよび５　Ｄ　μＩＵ／ｍＡ’　（Δ０．５０）の間の応答差を測定 してそれぞれ１２６　ｍＡ／分および３１２ｍＡ／分であった。

実施例　４ アフイニテイカラムとしてのＰＥｌ−バイオゲルｐ−２に捕捉されたウアバイン −ＢＳＡ　−ＣｒＯ２粒子を用いるＡＣＭＴＡジゴキシジゴキシン パンク　カラムの調製 ＰＥニーバイオゲルＰ−２カラムを実施例′５Ａ１項におけるようにして調製し た。このカラムにウアパイ＝ｙ−ＢＳＡ−ＣｒＯ２粒子の１０１９７＋＋＋７！ 懸濁液５０−２００μ／を注入した。このカラムを０．１５Ｍ燐酸ナトリウム緩 衝液（ｐ）１７．８）３ｍｌで洗浄しモしてａＣａ■アナライザー用の市販のジ ゴキシンパンク（Ｅ、　１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　 Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、）中に挿入した。

（Ｂ）　アッセイ操作 酵素接合体５００ａＬ（２つの試験に充分）を検体カップ中で混合しそして室温 で１０分間インキ二（−トした。

この混合物の４００μｌをａＣａ■アナライザーによりビＲットでとりそして商 業的な方法と同様にして処理した。

カラムに捕捉された種々の量の粒子を用いることにより得られた試験結果をウア バイン−ＢＳＡ−セファデックスＧ−１０を用いた商業的方法に比較して第１表 に示す。

第　１　表 ０．５　８８　６８ 商業的なパック　７２　７９ 実施例　５ 抗ジゴキシン抗体のアフイニテイ精製 実尻例５Ａ０項におけるようにしてＦＥＺ−バイオゲルＰ−２樹脂を調製しそし て１，５Ｘ１５ｃｍＯカラムに充填した。

このカラムを０．９％の塩化ナトリウムを含有する１０ｍ１ｌ燐酸ナトリウム（ ＰＨ７，ｏ　）　（ＰＢＳ）　１ｏ　ｏ−で洗浄した。実施例１．３０項で調製 されたウアバイン−ＢＳＡ　−ＣｒＯ２粒子の５０即／−懸濁液３ｒｎｔをカラ ムに負荷した。カラムの頂部を意図的にかきまわして樹脂の頂部半分をＣｒＯ２ 粒子と混合し、そして再び充填せしめた。この充填されたカラムをＰＢＳ　５０ 　ＴｒＬｌ、で洗浄して、ｃｒｏ２粒子の漏出は何ら観察されなかった。このカ ラムにウサギの抗−ジゴキシン血清１Ｄ−を負荷しそしてこの血清を１５分間イ ンキュベートした。結合されなかったフラクションをＰＢＳ　１００−を用いて 溶離した。結合された抗−ジゴキシンを２．５Ｍアンモニウムチオシアネー）（ ｐｉ（７，１３）を用いて溶離した。

タン・ぞり質を含有するフラクションを２８０ｎｍでの吸光度を監視することに より確認し、プールしそしてＰＢＳで透析した。免疫拡散分析によれば、全ての 抗−ジゴキシンが結合フラクション中にあり、結合されなかったフラクション中 には何ら抗−ジゴキシンは観察されなかったことが示された。

実施例　６ 高密度リボタン・ξり（ＨＤＬ）コレステロールの自動化されたアッセイ 検体を燐タングステン酸で予備加熱した場合：二沈殿する低密度ならびに非常に 低密度のりホタンパク質の除去を自動化した高密度リポタンパク（ＨＤＬ）コレ ステロールのアッセイを行うために下記操作を用いることができる。

（局　カラムの調製 ａＣａのアナライザー用のＰＥｌ−バイオゲルＰ−２カラムを実施例３．Ａ１項 に記載されるようにして調製する。次にこれらカラムをＨＤＬコレステロールの アッセイに必要な（Ｂ）　アッセイ操作 血清５００ａＬおよび２０り／ｌ燐タングステン酸溶液１００μｌをａｃａ■ア ナライザー検体カップ中で混合しそして５分間放置した。次にこの予備処理した 検体２５０μｌを６Ａ１項記載〔から〕のカラムに注入する。このカラムを１０ ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）４．７５−を用いて溶離する。ろ液を 分析用テストパック中に集め、これをａｃａ■アナライザーで処理して存在する ＨＤＬコレステロールの量を測定することができる。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１７７９ Ａ【セａｃｈｍｅｎヒ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ 　Ｉ工。

エエ、　ＦＩＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＨＥＤ／５ＥＡＲＣＨＴＥＲＭＳ：ｏｌｕｍ ｎ ｃｈｒｏｍｉｎｕｍ　（ｈ）ａｉｏｘｉｄｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＬＩＳＡ ５ＳＡＹ （ａｆｆｘｎｌｔｙ　（ｗ）　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ？　（Ｌ）　（ｐｏ ｌｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｌｎｅ　ｏｒ（ｗ）　５ｕｌｆａｔｅ　／ｂｉ、ａｂＳ ＯＬＩＤ　（ｗ）　（ｓｕｐｐｏｒｔ　ｏｒ　ｃａｒｒｌｅｒ）Ａｎｔｉｂｏｄ ？ Ａｎｔｉｇｅｎ？ Ａｎａｌｙｔｅ？

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．凝集剤が結合された固形支持体を形成させ、標的分子を含有している疑いの ある検体、およびこの標的分子と反応して微粒子懸濁液を形成するリガンドまた はバインダーを含有する試薬を包含する反応混合物を形成させ、 標的分子を前記リガンドまたはバインダーに結合せしめ、そして 反応混合物を前記固形支持体を通して溶離して微粒子懸濁液を固形支持体に捕捉 させそして支持体からすべての結合されなかつた物質を溶離する、ことからなる アフィニティ分離を行う方法。
2. ２．凝集剤が重合体状であることからなる請求項１記載の方法。
3. ３．凝集剤がポリエチレンイミンであることからなる請求項２記載の方法。
4. ４．凝集剤がポリエチレンイミン、硫酸カリウム、塩化第二鉄および硫酸第二鉄 からなる群から選択されることからなる請求項１記載の方法。
5. ５．固形支持体がクロマトグラフィーカラムであることからなる請求項１記載の 方法。
6. ６．凝集剤が重合体状であることからなる請求項５記載の方法。
7. ７．凝集剤がポリエチレンイミンであることからなる請求項６記載の方法。
8. ８．標的物質に対する捕捉された抗体を粒子に結合させて抗体が結合した粒子を 形成させ、 この粒子を、標的物質を含有する検体および標識された抗体と反応させて、前記 粒子、捕捉された抗体、標的物質および標識された抗体からなる複合体、および 未反応の標識された抗体を含有する混合物を形成させ、 凝集剤が結合されたクロマトグラフィーカラムを形成させ、 前記混合物をカラムに通して溶離してそれにより粒子および標的物質（これは捕 捉用抗体に結合されている）に結合されたすべての標識された抗体を捕捉し、そ して カラムに捕捉された粒子と会合した標識された抗体または未反応の標識された抗 体を測定してそれにより検体中における標的物質の存在を検出する、ことからな る検体中の標的物質の存在を検出する方法。
9. ９．凝集剤が重合体状であることからなる請求項８記載の方法。
10. １０．凝集剤がポリエチレンイミンであることからなる請求項９記載の方法。
11. １１．凝集剤がポリエチレンイミン、硫酸カリウム、塩化第二鉄および硫酸第二 鉄からなる群から選択されることからなる請求項８記載の方法。
12. １２．粒子が安定化された二酸化クロム粒子であることからなる請求項１０記載 の方法。
13. １３．標的物質に対するリガンドまたはバインダーを粒子に付着させることによ り粒子試薬を形成させ、標的物質を含有している疑いのある検体およびその標的 物質に対する標識された抗体を含有する反応混合物を形成させ、 凝集剤が結合されたクロマトグラフィーカラムを用意し、 反応混合物をクロマトグラフィーカラムに通して溶離してそれにより検体中の任 意の標的物質およびそれに結合した標識された抗体を有する前記粒子をカラム内 に捕捉し、そして 結合された標識された抗体または結合されてない標識された抗体のいずれかを測 定して標的物質の存在を判定する、 ことからなる、検体中の標的物質の存在を判定するための競合的イムノアツセィ を実施する方法。
14. １４．凝集剤が重合体状であることからなる請求項１３記載の方法。
15. １５．凝集剤がポリエチレンイミンであることからなる請求項１４記載の方法。
16. １６．凝集剤がポリエチレンイミン、硫酸カリウム、塩化第二鉄および硫酸第二 鉄からなる群から選択されることからなる請求項１３記載の方法。
17. １７．粒子が安定化された二酸化クロム粒子であることからなる請求項１５記載 の方法。
18. １８．凝集剤が結合されたクロマトグラフィーカラムを形成させ、 粒子にリガンドまたはバインダーを付着させることにより粒子試薬を形成させ、 この粒子試薬をクロマトグラフィーカラムに通して溶離しそれによりカラム内に 粒子を捕捉し、標的物質を含有する混合物をこのカラムに通し、それにより標的 物質がリガンドまたはバインダーに結合できるものとし、そして 結合されなかつたすべての物質をカラムから溶離する、 ことからなるバイオアフィニティ分離を行うための方法。
19. １９．凝集剤が重合体状であることからなる請求項１８記載の方法。
20. ２０．凝集剤がポリエチレンイミンであることからなる請求項１９記載の方法。
21. ２１．凝集剤がポリエチレンイミン、硫酸カリウム、塩化第二鉄および硫酸第二 鉄からなる群から選択されることからなる請求項１８記載の方法。
22. ２２．粒子が安定化された二酸化クロム粒子であることからなる請求項２０記載 の方法。