JPH0385439A - 蛍光検出型電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＤＮＡの塩基配列決定などに用いられる蛍光検
出型の電気泳動装置に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、ＤＮＡの塩基配列決定は、放射性同位元素標識を
用いオートラジオグラフィーにより行なわれてきた。オ
ートラジオグラフィーは高感度な検出法であるが、取扱
いが面倒である。そこで。

取扱いが簡単で自動処理にも適した蛍光Ｓ＋＊を用いる
方法が発達してきた。蛍光＃Ａｆｆｌを用いる方法では
、レーザー光源をＤＮＡ試料の照射光源として用い、泳
動中のゲル平面内にレーザービームを導入することによ
って高感度で高分離な実時間検出を達成している。レー
ザービームのゲル内への入射法として、現在主に次の２
つの方法が使われている。ひとつは、ゲル平面に対して
レーザービームを斜めに入射させ、ビームを泳動方向に
垂直で平面に平行な方向に周期的にスキャンさせて、複
数の泳動レーンを照射する方法である（　Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、６０．　Ｎ
ａ６．３８１゜１９８８　）、もうひとつは、ゲル平面
の側面から泳動方向と垂直にレーザービームを入射させ
、複数の泳動レーンを同時に照射する方法である（特開
昭６１−６２８４３号公報参照）。

〔発明が解決しようとする課題〕

これらの蛍光検出を用いる方法のうち、後者は前者に比
べ、ひとつの泳動レーンでみて単位時間当りの照射光量
が大きく、検出感度を大きくとれる特徴がある。しかし
、後者の方法では次のような問題を生じる場合がある。

後者の側面入射法では、高分離を達成するためにレーザ
ービームをレンズで絞ってゲル板の側面から入射させて
いる。その際、レーザービームの焦点はゲル板の中央付
近に設定しているので、その付近ではレーザービーム径
がゲルの厚みよりも小さくなる場合が生じ得る。一方、
泳動するＤＮＡ断片は、ゲルの厚み方向に沿って均一に
分布しない場合が時々あり、そのようなりＮＡ断片には
レーザービームがほとんど照射できないことが生じ得る
。その結果、ＤＮＡ断片の検出ピークがほとんど消失し
てしまい、配列決定に支障をきたすことになる。

本発明の目的は、上記原因によるＤＮＡ断片の検出ピー
クの消失が生じないレーザービーム照射系を構成し、高
分離でかつ高いＤＮＡ塩基配列決定精度を有した電気泳
動装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明においては、泳動方
向のビーム径よりもそれに垂直な方向のビーム径の方が
大きくなるように、シリンドリカルレンズを用いてレー
ザービームの照射用光学系を構成することにより、ＤＮ
Ａ断片からの検出ピークの泳動方向への分離能は高く保
ち、かつゲル厚み方向のレーザービーム径が泳動板上の
全てのレーン上でゲルの厚みより大きくなるようなレー
ザービーム照射光学系を構成した。

より具体的には、 （１）レーザービームの照射光学系を、長軸をゲル平面
に垂直に向けたシリンドリカル凸レンズで構成した。

（２）レーザービームの照射光学系を、長軸をゲル平面
に垂直に向けたシリンドリカル凸レンズと同じく長軸を
ゲル平面に垂直に向けたシリンドリカル凹レンズとで構
成した。

（３）レーザービーム照射光学系を、凸レンズと長軸を
泳動方向に向けたシリンドリカル凹レンズとで構成した
。

（４）レーザービームの照射光学系を、凸レンズと長軸
を泳動方向に向けたシリンドル凹レンズ及び長軸をゲル
平面と垂直に向けたシリンドリカル凹レンズとから構成
した。

（５）レーザービームの照射光学系を、凸レンズと凹レ
ンズと長軸を泳動方向に向けたシリンドリカル凹レンズ
とで構成した。

〔作用〕

以上の方法を用いることにより、ゲル厚み方向のレーザ
ービーム径を泳動板上の全てのレーン上でゲル厚みより
大きくすることが可能である。これは次のようにして達
成される。すなわち、■固有のレーザービーム径がゲル
の厚みより大きい場合には、上記（１）のように、長軸
をゲル平面に垂直に向けたシリンドリカル凸レンズによ
って泳動方向のみのレーザービーム径を縮小する。■固
有のレーザービーム径がゲル厚みよりも大きすぎて、そ
のままでは光量の損失層が大きい場合には、上記（３）
のように凸レンズと長軸を泳動方向に向けたシリンドリ
カル凹レンズを用いて、レーザービーム径を泳動方向に
は縮小し、泳動方向と垂直な方向にはゲル厚みと同程度
までに縮小する。

上記（２）、（４）、（５）のように縮小されたビーム
径を一様にするために、補助的なシリンドリカルレンズ
を付は加えることもできる。

以上の方法によって、泳動方向にはレーザービーム径を
縮小しつつ、ゲル平面に垂直な方向にはレーザービーム
径をゲル厚みより大きくすることができる。これらによ
って、泳動するＤＮ断片がゲル厚み方向に均一に分布し
ない場合が生じても、分離は高く保ちつつ、それらのＤ
ＮＡ断片を全てレーザービーム径内に含めることが可能
になり。

ＤＮＡ断片の検出ピークの消失を防ぐことができる０以
上により、高分離でかつ高精度のＤＮＡ塩基配列決定の
実現が達成される。

〔実施例〕

以下１本発明の一実施例を第１図により説明する。ここ
ではレーザービーム照射用光学系として凸レンズとシリ
ンドリカル凹レンズを用いた場合の説明を行う、蛍光体
１例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ
）によって蛍光標識されたＤＮＡ断片は、２枚の泳動パ
ネル２，２′によってはさまれた泳動分離用ゲル板１の
上部に載せられ、電界に引かれて下方に泳動する（電界
印加手段は図示省略しである）、ＦＩＴＣ：の励起極大
波長は４９０ｎｍであるから、ＤＮＡの照射用の光源と
してはアルゴンレーザー光源３（発源波長４８８ｎｍ）
を用いる。光源３からのレーザービームはミラー４で反
射され、凸レンズ５と長軸を泳動方向に向けたシリンド
リカル凹レンズ６をとおしてゲル板１の側面から水平に
ゲル板に平行に入射される。つまり、複数の泳動路は直
列に照射される。このレーザービーム照射光学系５゜６
によってレーザービームは泳動方向には絞られ、泳動板
と垂直な方向にはその径がゲル厚みより大きく保たれる
。各泳動路中を泳動するＤＮＡはレーザー照射部７を通
過するときに蛍光を発し、この蛍光はゲル板と直角方向
に蛍光像として放射される。この蛍光像は、フィルター
８を通して結像レンズ９によって検出器１０上に結像さ
れる。」受光信号は、コンピュータ１２によって制御さ
れるカメラコントローラエ１を通して、コンピュータ１
２で処理される。処理結果の出力はプロッター１３ある
いはＴＶモニター１４上に表示される。

検出器１０には、イメージ増幅器付きのダイオードアレ
イを用いる。ＴＶモモ−ター上検出像１５を例示する。

以下では、第２図によりレーザービーム照射光学系の詳
細を説明する。レーザービーム径はレーザーの種類、波
長、出力によるが、アルゴンレーザーを用い微弱な蛍光
検出に通常必要な１０ｍＷ程度の出力の場合、レーザー
ビーム径は１　ｍ　ｍ程度である。一方、ＤＮＡのバン
ド幅とバンド間隔は３００塩基長のＤＮＡ断片を２５ｃ
ｍ泳動させたとき０．５ｍｍ程度であるから、隣合った
ＤＮＡバンドを分離して測定するには０．２〜０．３ｍ
ｍ以下の光学系分解能が必要である。１ｍｍ径のレーザ
ービームを焦点距離２５ｃｍの凸レンズ５で絞れば、焦
点付近の１０ｃｍの長とにわたってレーザービーム径が
０．２ｍｍ程度以内におさまるので上記の必要な光学的
分解能が達成される。

ゲル厚みは、発熱量と試料添加のしやすさ等によって最
適値がある。長いＤＮＡ塩基配列を一度に決定できるた
めには、高速、すなわち高電圧の電気泳動が必要になり
、そのためには発熱量を少くするためにゲル厚みを薄く
した方がよい、しかしゲル厚みが薄すぎるとゲル作製や
ゲル上に試料を添加する際に困難が生じることになる。

従って通常は０．２〜Ｑ　、　４　ｍ　ｍ程度のゲル厚
みが用いられている。そこでゲル厚みを０　、３　ｍ　
ｍとして考えると、上記の凸レンズ５によるゲル厚み方
向のレーザービームの収束の様子は第２図（ａ）のよう
になる、第２図（ａ）に示すように凸レンズ５によって
絞られたビームの焦点付近でビーム径がゲル厚みより小
さくなり（Ｑ、１ｍｍ程度）、ゲル厚み方向に沿ってゲ
ル中でレーザービームに照射されない領域１６が生じる
。何らかの原因でＤＮＡ断片がゲル厚み方向に沿って偏
在し、領域１６内にのみＤＮＡ断片が存在した場合、こ
れらのＤＮＡ断片にはレーザービームが照射されず。

ＤＮＡ断片が存在するにもかかわらずＤＮＡ断片からの
蛍光が検出されないことになる。（ピークの消失）。か
かるピーク消失をさけるために、第２図（ｂ）、（ｃ）
に示すようにシリンドリカル凹レンズ６をそのレンズ長
軸を泳動方向に向けて凸レンズ５と泳動板と２，２′の
間に設置した。第２図（ｂ）は、泳動板と垂直な方向の
収束の様子を示し、第２図（ｃ）は泳動方向の収束の様
子を東作用は泳動方向にはないので、泳動方向には凸ン
ズ５によって収束されたレーザービームがそのままゲル
１中に入射される。これによって泳動方向の検出分解能
を高く保つことができる。一方、泳動板２，２′と垂直
な方向には、凸レンズ５によって収束されたレーザービ
ームはシリトリカル凹レンズ６によってゲル厚みである
０、３ｍｍ以上の径に保たれ、ゲル中に入射する。従っ
て、ゲル厚み方向に沿ってＤＮＡ断片が偏在した場合に
も、それらのＤＮＡ断片はレーザービームによって照射
され、前述したようなピーク消失を生じることがない。

第３図に凸レンズ５のみを用いた場合＆、凸レンズ５と
シリンドリカル凹レンズ６を伴用した場合の測定結果を
示す。試料としてＭ　Ｂ　ｍ　ｐ　８ベクターを用いた
４種（Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔ）の反応群を用いた。第３図（ａ
）中に示すように、４種のサンプルをＡ、Ｃ，Ｇ、Ｔの
順に８回繰りかえし並べてゲル上に添加し泳動検出を行
った。横軸は検出器のチャネル数で、泳動板の横方向の
座標を示す。縦軸は蛍光強度である０図中には１０分間
のデータを積算したものを表示した。第３図（ａ）は凸
レンズ５のみを用いた場合で、泳動開始後３０分のデー
タである。このように泳動初期にはピークの消失は生じ
ておらず、全てのレーンからの蛍光がほぼ−様な強さで
測定されている。しかし、第３図（ｂ）に示すように泳
動開始後１８０分のデータでは、泳動板の左側の半分で
ピークの消失が生じていることがわかる。この第３図（
ｂ）のデータを測定した直後に、凸レンズ５に加えてシ
リンドリカル凹レンズ６を設置して泳動検出した結果を
第３図（ｃ）に示す、このように、シリンドリカル凹レ
ンズを付設した場合にはピークの消失がなくなり、はぼ
−様なピーク強度が回復していることがわかる。

泳動方向のレーザービーム径をより一様にするためには
、凸ンズ５とシリンドリカル凹レンズ６の光学系にさら
に第３のレンズを付は加えることが有効である。第４図
に、上記第３のレンズとしてシリンドリカル凹レンズ１
７を、その長軸（シリンドリカル軸）を泳動板と垂直方
向に向けてシリンドリカル凹レンズ６と泳動板２，２′
との間に設置した場合を示す、第５図には、上記第３の
レンズして凹レンズ１８をシリンドリカル凹レンズ５の
間に設置した場合を示す。それぞれの図で（ａＬ　（ｂ
）はそれぞれ泳動板と垂直な方向、および泳動方向の収
束の様子を示す、第４図の場合は、凸レンズ５の側から
みて、１段目のシリンドリカル凹レンズ６によって泳動
板２，２′と垂直な方向のレーザービーム径をゲル厚み
以上に保持し、２段目のシリンドリカル凹レンズ１７に
よって泳動方向に０　、２　ｍ　ｍ程度の−様なレーザ
ービーム径を保持している。第６図の場合は、凸レンズ
５で絞られたレーザービームを、凹レンズ１８で０．２
ｍｍ程度の−様なビームにしたあとに。

シリンドリカル凹レンズ６によって、泳動板２゜２′と
垂直な方向にレーザービーム径を拡げている。

レーザービームの出力が十分強く得られるとき、あるい
は、０　、５　ｍ　ｍ程度の細いレーザービーム径が得
られる場合には、次に示す方法が有効で、より簡単な光
学系を実現できる。これは第６図と第７図に示すように
、泳動板２，２′と垂直な方向に長軸をもつシリンドリ
カルレンズのみを使う方法である。第６図には、泳動板
２，２′と垂直な方向の長軸をもつシリンドリカル凸レ
ンズ１９のみの系を示し、第７図には、泳動方向のレー
ザービーム径をより一様にするために、泳動板２゜２′
と垂直な方向の長軸をもつシリンドリカル凸レンズ２０
とやはり同じ方向の長軸をもつシリンドリカル凹レンズ
２１とを組み合わせた系を示す。

これらの方法では、泳動板と垂直な方向には収束作用が
ないので、レーザービーム径が固有の大きさに保たれた
ままゲル側面に入射する。泳動方向には、シリンドリカ
ルレンズ系によって、０．２ｍｍ程度の大きさに絞られ
る。

〔発明の効果〕

以上説明したように１本発明によれば、泳動方向のビー
ム径よりもそれに垂直な方向のビーム径の方が大きくな
るように、シリンドリカルレンズを用いてレーザービー
ムの照射用光学系を構成することにより、泳動方向には
レーザービームを絞り、かつ泳動板と垂直な方向へのレ
ーザービーム径を拡げ、好ましくはゲル厚みよりもレー
ザービーム径を大きくすることができ、結果として、泳
動方向への検出分解能を高く保ちつつ、ＤＮＡ断片のゲ
ル厚み方向への偏在に起因する検出ピークの消失を防ぐ
ことができる０以上により、高分離で精度の高いＤＮＡ
塩基配列決定を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す、レーザービームの照
射用光学系として凸レンズとシリンドリカル凹レンズを
用いた蛍光検出型電気泳動装置の全体構成を示す概略図
である。第２図は、レーザービーム照射光学系として、
凸レンズのみの系（ａ）と凸レンズとシリンドリカル凹
レンズを組み合わせた系（ｂ）、（Ｇ）の収束の様子を
示した光路図である。第３図は、本発明による測定結果
の一例を示す曲線図である。第４図は、第２図（ｂ）、
（ｃ）の光学系にシリンドリカル凹レンズを加えた光学
系の、泳動板と垂直の方向（ａ）と泳動方向（ｂ）の収
束の様子を示した光路図である。第５図は、第２図（ｂ
）、（ｃ）の光学系に凹レンズを加えた光学系の、泳動
板と垂直な方向（ａ）と泳動方向（ｂ）の収束の様子を
示した光路図である。第６図は、シリンドリカル凸レン
ズのみを用いたレーザービーム照射光学系の、波動板と
垂直な方向（ａ）と泳動方向（ｂ）の収束の様子を示し
た光路図である。第７図は、シリンドリカル凸レンズと
シリンドリカル凹レンズを用いたレーザービーム照射光
学系の、泳動板と垂直な方向（ａ）と泳動方向（ｂ）の
収束の様子を示した光路図である。 （符号の説明） １・・・泳動分離用ゲル板、２，２′・・・泳動板、３
・・・アルゴンレーザー光源、４・・・ミラー、５・・
・凸レンズ、６・・・シリンドリカル凹レンズ、７・・
・レーザー照射部、８・・・フィルター、９・・・結像
レンズ、１０・・・検出器、１１・・・コントローラー
　１２・・・コンピューター　１３・・・プロッター　
１４・・・ＴＶモニタ１５・・・検出像、１６・・・レ
ーザービーム照射不可領域、１７・・・シリンドリカル
凹レンズ、１８・・・凹レンズ、１９・・・シリンドリ
カル凸レンズ、２０・・・シリンドリカル凸レンズ、２
１・・・シリンドリカル凹レンズ。 ｔｂ） 番３図 −ｈネオ−１陣： ナヤわし荻 （Ｉ２−） （久） ネ２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少くとも励起用レーザー光源、レーザービームの照
   射用光学系、平板型ゲル電気泳動装置、及び光検器を具
   備し、ゲル平面の側面からレーザービームを入射する光
   検出型電気泳動装置において、泳動方向のビーム径より
   もそれに垂直な方向のビーム径の方が大きくなるように
   、シリンドリカルレンズを用いてレーザービームの照射
   用光学系を構成したことを特徴とする蛍光検出型電気泳
   動装置。 ２、第１項記載の蛍光検出型電気泳動装置において、前
   記のレーザービームの照射用光学系が、その長軸をゲル
   平面に垂直に向けたシリンドリカル凸レンズであること
   を特徴とする蛍光検出型電気泳動装置。 ３、第１項記載の蛍光検出型電気泳動装置において、前
   記レーザービームの照射用光学系が、その長軸をゲル平
   面に垂直に向けたシリンドル凸レンズと同じくその長軸
   をゲル平面に垂直に向けたシリンドリカル凹レンズとで
   構成されていることを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
   置。 ４、第１項記載の蛍光検出型電気泳動装置において、前
   記のレーザービームの照射用光学系が、凸レンズとその
   長軸を泳動方向に向けたシリンドリカル凹レンズとから
   構成されていることを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
   置。 ５、第１項記載の蛍光検出型電気泳動装置において、前
   記のレーザービームの照射用光学系が、凸レンズとその
   長軸を泳動方向に向けたシリンドリカル凹レンズ及びそ
   の長軸をゲル平面と垂直に向けたシリンドリカル凹レン
   ズとから構成されていることを特徴とする蛍光検出型電
   気泳動装置。 ６、第１項記載の蛍光検出型電気泳動装置において、前
   記のレーザービームの照射用光学系が、凸レンズと凹レ
   ンズとその長軸を泳動方向に向けたシリンドリカル凹レ
   ンズとで構成されていることを特徴とする蛍光検出型電
   気泳動装置。