JPH03500002A - 新規な血栓崩壊蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の名称〕 新規な血栓崩壊蛋白 〔技術分野〕　“ 本発明は組織プラスミノーゲン活性化因子−ｆｍ（ｔＰＡ）活性を持つ物質に関 する。特に、不発明は“組換え体”血栓崩壊蛋白、遺伝子工学で処理された細胞 からその蛋白（又はタンパク質）を得る方法、及び血栓崩壊薬としてのその物質 の治療的使用に関する。

〔発明の開示〕

天然ヒトｔＰＡと比較して改良された＋１！維累浴解の側面を持つ活性血栓崩壊 （溶解→桑であるようにこれらのタンパク質は企図されている。このことは増加 した線維Ｘ親和性、ｔＰＡの阻害剤に対する減少しだ反応性、より速い血栓崩壊 （溶解→の速度、増加した？ｆＭ維累溶解活性、減少したまたは少（とも受け入 れられる水準の融維：ＩＡ鳳浴解、および／または延長された生物半減期として 現われるであろう。本発明のタンパク質はまた天然ヒトｔＰＡよりもより均一な 形でより容易に調製できるよう企図されている。必要ならこれらのタンパク質を 含む医果組放物の大量注射による投与が可耗なようにこれらのタンパク質に対し て改良された総合的な薬勤学プロフィールが企図されている。

臀に１一連のｔＰＡ変異体のｌＡＩＩＭおよび研究を含む探究の中で、そのよう な変異体の脣定の評か上に記載したごとき都合の良い性質で特徴付けられること が発見すした。以下により詳細に説明されるごとく、本発明はｔＰＡの９１−ア ミノ酸成熟Ｎ−末端以内を除いて（天然ペプチド配列で観察される一連のアミノ 酸は欠失している、および／または興ったアミノ酸で置換されている）天然のｔ ＰＡのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列により構造的に特徴付けられ るヒトｔＰＡの新規タンパク質類似物を提供し、その結果新合成ペプチド領域は ヒトプラスミノーゲンのクリｙグルーｌ領域に類似している。１つまたはそれ以 上のＮ一連鎖グリコシル化部位および／またはプラスミン切断部位でのこの例の タンパク質変異体はｔＰＡ部位２７５−２７６にかかつている。

不発明のタンパク質は天然ヒトｔＰＡおよびｔＰＡのある鴇の他の修正星の両者 と比較して改良された融維累溶解および系動字プロフィールを待っている。変異 体の例が以下の表１に示しである。

天然ヒトｔＰＡのポリペプチドバックボーンは４つの共通Ａ＃％一連鎖グリコシ ル化部位を含んでいることが知られている。メラノーマー白米唾乳類細胞からの ｔＰＡ中ではこれらの２つの部位が典型市にはグリコジル化されていることが示 されている（ｊ！ＩＪちΔ＄１１１１？およびＡｅｓｕｓ）。Ａ＃町、４は時々 グリコジル化されるがＪ　ａ　％２１　＠は典型的にはグリコジル化されない。

メラノーマー由米晴乳類細胞（例えばバウズ細胞）からのｔＰＡもここでは”天 然”または１自然の２ヒトｔＰＡと称される。

上に説明したごと（本発明はｔＰＡ−型血栓溶解活性を持つＥトｔＰＡの新規タ ンパク質類似体を含んでいる。

本発明のタンパク質は表１に例示したごとく、そのペプチド配列中（１）天然Ｓ ＰＡに存在するＡｓ５一連鎖グリ；シル化部位の３つまでの所に；（υｔＰＡの ９１−アミノ酸成熟Ｎ−末端以内に；　（ｉｌｌ）　Ａｒｇ　−２７５およびｌ １ｍ−２７６にわたるタンパク分解切断部位にある種の改変を含む点でヒトｔＰ Ａの構造と異っている。アミノ酸の番号付けは表１の一文字コード配列中に示し である。便宜上、通常のｔＰＡアミノ酸の番号付けを残すため（例えばグリコジ ル化部位およびプラスミン切断部位に）％Ｅ−８２およびＥ−８５間のペンタペ プチド配列”ＣＥＥＩＤ”内のギャップも番号付けには含まれている。しかしな がら、Ｃ−８１およびＣ−９５間の結合を會む檀々の構造領域間のポリペプチド 結合はアミノ酸の組成および長さが異なるであろうことを理解しなければならず 、不発明はそのような変異を持つ化合物も包含する。

〔発明を実施するための最良の形態〕

本発明の一つの態様において、タンパク質はｔＰＡのＮ−１ｇ端領域のすべてま たは一部が（天然の配列のアミノ＠１−９１にわたる）プラスミノーゲンの第１ のクリシグル領域（クリングル−１）と同一または実質的に同一のペプチド領域 により置換されていることｋより特徴付けられている。本発明のタンパク質の例 示的笑施例においては霧ＰＡのアミノ１！１−８４がｆｉｌの成熟Ｎ−末端に示 されているととく８２のアミノ酸配列で本質的処置き換えられている。それ故こ れらのタンパク質はＮ末端からＣ末選の方向に、プラスミノーゲンクリジグルー １タンパク質領域と！ＰＡセリンプロテアーゼ領域の融合−が種々の笑施態ＩＩ においてｔＰＡクリングル−１およびｔＰＡクリングル−２領域を含む他のｔＰ Ａ領域に連結されていることを特徴とする一部のキメラタンパク質から底ってい る。

表１に例示したごとく、本発明のタンパク質変異体はまたＮ一連鎖炭化水素部分 を全く含まないか、または天然ヒト＊ＰＡと比較してごり一部がグリコジル化さ れているであろう。ここで用いる句＠部分的グリコジル化”タンパク質とは完全 にグリコジル化された天然ヒト霧ＰＡよりも少ないＮ一連鎖炭化水素部分を含む タンパク質を意味する。このグリコジル化の消失または部分的のみのグリコジル 化は天然１１１分子に存在する共通Ｎ一連鎖グリコシル化認装部位の１つまたは それ以上におけるアミノ酸の置換または欠失により生じる。１つまたはそれ以上 のＮ一連鎖グリコシル化部位でのそのような改良を具体化し、ある場合にはより 強い扉維累溶糎活性を持つｔＰＡ−型血栓溶解活性を保持する本発明の変異体タ ンパク質は、天然ｔＰＡよりもより均一な形でより容易に産生５され、多くの場 合、天然ｔ／Ａよりも長い生体内半減期を持っていることが見い出された。

Ｎ一連鎖グリコシル化認識部位は現在トリペプチド配列から成ると信じられてお り、それは適当な細胞グリコジル化酵素により特異的に認識される。これらのト リペプチド配列はアスパラギン−Ｘ−トレオニンかまたはアスパラギン−Ｘ−セ リン（式中Ｘは通常任意のアミノ酸である）である。ペプチド配列内のこれらの 位置は表１中Ｊｉ　１　、Ｒ１およびＲ１として各々示しである。グリ；シル化 認識部位の３つの位置での１つまたはそれ以上のアミノ酸の変異または欠失によ り改変配列ではグリコジル化が起こらなくなる。実施例によるとすると、一つの 実施態様においてはＡ＃％、１．およ、び７口１．４は独立して両方とも６１％ に置換されている。２重のＧ１ｍ置換の場合においては、得られる糖タンパク質 （ＧＥ％ｎｔＧｌ町、４）は天然のｔＰＡの場合のととき２または３つのＮ一連 鎖グリコシル化部分というよりただ１つのそのような部分（Ａｓｓ１に）を含ん でいるべきである。

化合物　ＡＳ　Ｒ冨　Ｒ１化合物　ＢＩＢ＊　Ｂｓ１−ＯＮＳＳ　ＮＧＳ　ＮＲ Ｔ　１−４１　−−Ｑ　−−５−−Ｔ１−Ｉ　ＱＳＳＮＧＳＮＲＴ　１−１２　 Ｎ５ＡＮＧＳＮＲＴ１−２　ＮＳＳ　ＱＧＳ　ＮＲＴ　１−ｉ３　ＮＳＳ　ＮＧ Ａ　ＮＲＴｌ−３Ｎ５ＳＮＧＳ（、ｌＲＴ　１−１４　Ｎ５ＳＮＧＳＶＲＡ１− ４　ＱＳＳ　ＱＧＳ　ＮＲＴ　１−１５　）ｉｓＡ　）ＩＧＡ　ＮＲＴｌ−５Ｑ ＳＳＮＧＳ−ＲＴ　１−１６　Ｎ５ＡＮＧＳＮＲＡ１−６　Ｎ５Ｓ−ＧＳＱＲＴ 　１−１７　Ｎ５ＶＮＧＳ）ｉＲＴｌ−７ＱＳＳ−ＧＳ−ＲＴ　１−１８　ＥＳ Ｓ）ＪＧＶＮＲＶｌ−８−−−−−−−−−１−１９ＴＳＳ　ＮＧＳ　）ｉＲＴ ｌ−９Ｎ−ＱＮ−５Ｎ−Ｔ　１−２０　ＴＳＳＴＧＳＮＲＴｌ−１０Ｎ−−Ｎ− −Ｎ−−１−２１ＴＳＳ　ＴＧＳ　ＱＲＴＪ＝アミノ酸またはペプチド結合；λ ｌＲ宜およびＲｓは独立にペプチド結合、アミノ酸、ジペプチドまたはトリペプ チドから成る群より適訳される；　ｌｌ−１１１％−一”、および１−−一”＝ ペプチド結合。さらに本発明の変異体は２４５位ＫＭかまたはｒ（上に示した） を含んでいるであろうし、および典型的には七〇Ｎ末端は示したごと（ＳＥＣ・ ・・より前のＮ末端で始まる：例えば５ＱＥＩＢＡ−ＲＦＲＲＧＡＲ５ＥＣＫ、 、、、ＲＧＡＲ５ＥＣＪＥ・・・・・・および／または最も典型的には（，１Ｒ ５ＥＣＫ−１，で始まる。

当業者は同一のＡ＃％４４．モノグリコジル化部位を持つ類似の糖タンパク質が 、先に記載したごとく、１１７および１８４位でのアミノ酸の欠損または他の７ ミノ駿への置換および／または各々のグリ；シル化認識部位（例えばＳｍＷＨ＠ およびＳｍｒ１ｍｓでの）内の他の位置での１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠 損または置換および／またはトリペプチドの＠ｘ１位での１つまたはそれ以上の 置換またはより好適には欠損により製造されるであろう事を評価するであろう。

他の実施態様においては１１７．１８４および４４８の位置のＡｓｓが０１％に 置換されている。その結果書られる変異体は天然ｔＰＡの場合のととき２または ３つのＮ一連鎖炭化水素部分というより、そのような部分は全く含んでいないべ きであろう。他の実施態様において潜在的グリコジル化部位が別個に改変されて おり、１つの現在の好適な実施態様においては１１７位のｈｌが例えばＧＬ％で 置換されており、他の実施態様では１８４位で、さらに他の実施態様では４４８ 位で改変されている。本発明はそのような非−グリコシル化、モノグリコジル化 、ジグリコシル化、およびトリグリコジル化変異体も包含されている。本発明の 種々の実施態様で見られる３つの共通Ｎ一連鎖グリコシル化配列、Ｈｔ　、　Ｂ 　ｔおよびＢｊの１つまたはそれ以上での模範的改良は以下の嚢２に示しである 。

本発明の１つの様相において変異体は任意に１７ｇ−２７５および７重ｇ−２７ ６にわたろタンバク質切断部位がＡｒｔｌ−２７５の欠損または他のアミノ酸（ ＡｒｇＫ対し好適にはＬｙａ、ＣｙｍまたはＥ４ｍ以外のアミノ酸〕の置換によ り改良されている。Ｔｈデは本発明の種々の笑施態様中Ａデσ−２７５に対して 現在のところ特に好適な置換アミノ酸である。天然ｔ　Ｐ　Ａ　Ｌｆ）Ａｒｇ　 −２７５でのタンパク質分解切断によりこの分野で既知のごとく“２ｇ″分子と 呼ばれているものを得る。この切断部位で改良されていることで特徴付けられて いる本発明のタンパク質は切断部位の改良がない対応するタンパク質よりもより 均一な形でより容易に産生されるであろうし、多分より重要なことは改良された 線維素溶解プロフィールおよび薬動字峙性を持っていることであろ５゜Ｒ−２７ ５位の改良の代わりまたは補うものとして、本発明の変異体は２７６位および／ または２７７位でまたは公開された国際出願１ＦＯ８６１０１５３８に記載され ているごとく同様に改良される。

それ故本発明は七トｔＰＡに関連する一部の新規血栓溶解タンパク質な提供する 。この群はいくつかの種類のタンパク質からなっている。

明瞭さと便利さの目的のため、下記の命名法を使用する：Ｒ１、Ｒ１およびＲＢ ；および２７５位（１）における（その順で）本発明の改良を示す多一部位呼称 により変異体が同定される。１Δ”はアミノ酸の欠落を示し、即ち問題とする部 位はペプチド結合で占められている。置換アミノ酸は特別に示されている。表１ の特別に同定されている１Ｒ″基を持つ化合物はその我からの適当な化合物呼称 を１考とする呼称により同定されるであろう。

−１−一および−−−＝ペプチド結合 争＝任意の７ミノ識 ｊ／　＝Ｊ　ａ　ｓ　、　Ｔ　ＡデまたはＳ−デを除（任意の７ミノ駿Ｆ−Ａ１ ＠％：除いた任意のアミノ酸またはペプチド結合Ｗ＝５−デ　ＩＮ　Ｉ　または ペプチド結合Ｘ＋＝ＧＪｙ　ｊ　＃　＃　またはペプチド結合Ｙ＝Ａデ１１　＃ 　Ｉ　またはペプチド結合、Ｚ　＝　Ｔｈｅまたはｓａｙを除いた任意の７ミノ 駿またはペプチド結合 ｍｔ＝野生株、即ち突然変異誘発前 それ故、３つすべての共通Ｎ一連鎖グリコシル化部位を含む変異体は１化合物１ −０”と称され、Ｒ１およびＲ３でＮがＱに置換されることにより更に改良され ている変異体は１化合物１−４２または”Ｑ−１１７、Ｑ−１８４変異体”のご とく称され；Ｒ−２７５がＴにより置換されることにより更に改良されている変 異体は“化合ｅｍｌ−４，７−２７５”または＠Ｑ−１１７、Ｑ−１８４、Ｔ− ２７５変異体”と称される。

一つの属のタンパク質は表ＩＫ示されたペプチド配列と本質的に同一なペプチド 配列により特徴付けられる。

ここで用いる句１表１のペプチド配列と本質的な同一なペプチド配列により特徴 付けられる１とは表１の特異的ペプチド配列または少くとも約９０％および好適 には少くとも約９５％それに相同なペプチド配列を意味する。

本発明の変異体の血栓溶解活性誘導体をコードしているＤＮＡ配列によりコード されるペプチド配列もまた包含され、そこでＤＮＡ配列はストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下本発明のＤＮＡ配列とハイブリダイズできる。ここで 使用される句１ストリンジェント条件”とはＴ、Ｍａ＊４＊ｔ４ａ、　Ｅ、Ｆ、 　ＦｔｉｔａｃｋおよびＪ、　５ａｘｋｒ＠ｏｋによる七レキエラークローニン グ（実験手引書）（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１１９８２）のペ ージ３８７−３８９に記載されているごときハイブリダイゼーション条件を意味 するが、ただし工程１１（ページ３８８）の塩濃度は〜０．１および〜５ｘｓｓ ｃの間でなければならないか、またはその工程１１に示されている注意に従う。

それ故本発明のタンパク質は、ストリンジェント条件下タンパク質なコードして いるＤＮＡが本発明の変異体な；−ドしているＩ）ＮＡ配列とハイブリダイズで きる限り、または遺伝＝−ドの縮重を反映する同義のコドンの使用が可能ならば 血栓溶解活性を保持しているのでそのような他の変異体（例えば対！遺伝子変異 またはアミノ酸の更なる欠落、を換または挿入）もまた含まれているであろ５゜ 前記のごとき種々の改良または改良の組合わせにより特徴付けられるｔＰＡｆ） 類似体な宮んでいる。それ故本発明はここに記載した改良を具体化する変異体を 包んでおり、それはまた（、）新規Ｎ−末端のｇＰＡグリングル−１領域への結 合領域内および／または（＆）新規Ｎ−末端および／または結合領域の前または 内の共通Ｎ一連鎖グリコシル化部位の介在物により、および／または（１）新規 Ｎ−末端ベブチド領域の多コピーの介在物により改良されているであろう。

第２の属においてタンパク質は表１のペプチド配列と本質的に同一のペプチド配 列により特徴付けられ、その中で（１）　１つまたはそれ以上のＪｈ％一連鎖グ リコシル化部位は随意に欠落しているかさもなくば共通Ａ＃龍一連鎖クりリシル 化部位以外あものに改変されており、および／または（６）　Ａｒｇ　−２７５ は随意に欠落しているか、異ったアミノ酸（好適にはリジン、システィンまたは ヒスチジン以外Ｋ）で置換されている。

本発明の１つの態様において、タンパク質は少くとも１つの哩乳類楯タンパク質 に特徴的な”複合体炭化水素”と一般に称される糖部分を含んでいる。以下によ り詳細に例示するごとく、そのような１複合体炭化水素”糖タンパク質は哺乳類 宿主細胞中の所望のポリペプチド配列をコードしているＩ）ＮＡ分子の発現によ り産生されるであろう。適した哺乳類宿主細胞および形質転換、培養、増幅、ス クリーニングおよび生成物産生および精製の方法はこの分野では既知である。例 えば、Ｇａｔｈｉ％ｇおよ１７５９（１９８５）またはＥｏ−１ｇｙ　ら、米国 等許第４４１９．４４６号を参照されたい。

不発明の更なる態様には、各々の炭化水素部分が哺乳類由来ｔＰＡを含む哨乳類 糖タンパク質に特徴的な１複合体炭化水素”置換基とは反対に昆虫細胞産生糖タ ンパク質ＫＷ徴的である第一ドリコール一連鎖オリゴサツカリドの処理形である 前に定義の霧ＰＡ変異体を含んでいる。そのような昆虫細胞−厘グリコシル化は ここでは簡素化の目的の為１高ｉンノース”炭化水素と称する。この記述の目的 には、複合体および高マンノース炭化水素されている通りのごとくである。本発 明に従う＠高マンノース炭化水素は前に記載したごとき変異体ポリペプチドバッ クボーンにより特徴付けられ、それは少（とも１つの占有されたＮ一連鎖グリ； シル化部位を含んでいる。

そのような変異体は昆虫宿主細胞中の変異体をコードしているＩ）ＨＡ配列の発 現により産生されるであろう。本発明のこの態様に有益な適した昆虫宿主細胞は 形質転換／トランスフェクション、昆虫細胞培養、スクリーニングおよび生成物 産生および精製の方法および物質同様この分野では既知である。そのようにして 産生された糖りり哺乳類細胞中でこれまで産生されたｔＰＡとは異っており、本 発明のこの態様の変異体は炭化水素部分または嘩乳類由米糖タンパク質に特徴的 な他のタンパク質改良部上に末端シアル酸またはガラクトース置換基を含んでい ない。

Ｎ一連鎖炭化水素部分を含まない本発明のタンパク質はまた、所望の変異体（例 えば表１の化合物１−７から１−１１）をコードしているＤＮＡ分子な哺乳類、 昆虫酵母またはｍ菌宿主細胞中で（現在のところ真核生物宿主細胞が好適である ）発現させることによっても産生される。前に示したごとく、本発明のこの態様 の実施に有益な形質転換／トランスフェクション、糺胞培養、スクリーニングお よび生成物産生および精製の方法および物質同様に適しだ哺乳類および昆虫宿主 細胞および加えて適した酵母および細曹宿主細胞もまた本分野では既知である。

前のことから明らかであろうごとく、本発明のすべての変異体は天然’に一トｔ ＰＡに較べてより少いがまたは潜在的グリコジル化部位がなく、および／または Ａｒｇ−２７５の欠落または置換をも含むであろ５類似体をコードしているＤＮ Ａ配列を用いる組換え技術によりｐｉ製される。そのようなりＮＡ配列はｔＰＡ をコードしているＤＮＡ配列の通常の部位ｑ！ｉ異的突然変異誘発および合成り ＮＡへの連結により産生されるであろう。

ｔＰＡをコードしているＤＮＡ配列はクローン化および特徴付けされている。例 えば、Ｄ、？−％％＋ｆａらの、ネーチャー（ロンドン）と■：２１４（１９８ ３）およびＲ，Ｘｔｓ％／ａａＳらのモレキュラー　セル　バイオロジー５　（ ７）１７５０（１９８５）を参照されたい。血栓溶解活性３９８９１は２４５位 にＶａｇではなくＪ（＃！残基な含んでいるという点で独特である。天然ｔＰＡ ｆ＊−ドしているＤＮＡ配列はＧｌｌ、Ａ島、　Ａｒｇ、　Ｓｕｒ、　０１％、 　Ｃｙｓ　、、曲の配列で始まり、完全長タンパク質のアミノ酸残基に続いて典 型的には処理される（即ち宿主細胞により認識され除去される）リーダー配列を コードしている。ＤＮＡ配列が発現される培地および宿主細胞に依存して、その ようＫして産生されるタンパク質はＧ１１１＋　Ａｌａ＠　Ａｒｇアミノ末端で 始まるかまたは第１の３つのアミノ酸残基がタンパク質分解的に除去されるよう に更に処理されるであろう。後者の場合、成熟タンパク質はＳＹ　Ｑ　Ｖ、、・ ０１．から成るアミノ末端を持っている。両方のアきノ末端を持つｔＰＡ変異体 は血栓溶解活性である。不発ＩＭにおいては、成熟タンパク質はよりはやく始ま っているアミノ末端を持っている。例えば５ＱＥＩＥＡＲＦＲＲＧＡＲ５ＥＣＸ 、、、、、、。

ＲＧＡＲ５ＥＣＫ、、、、・１、および／または（最も典型的には）ＧＡＲ５Ｅ ＣＫ等。不発明に従った変異体はまた他の変異体同様（例えば血栓溶解活性を保 持している対立遺伝子変異体または他のアミノ酸置換または欠失）　Ｍａｔ！、 、かまたはＦａｊｔａｉを含んでいる。

本発明はまた前に記載したごと＜、２１９位が叉に改良された化合物を包んでい る。本実施態様の化合物は２１９位にｐｒｏ以外（好適にはＣｙ＆以外）の７ミ ノ散の存在により特徴付けられる。そのような化合物はそれ故メ２ノーマー由来 ｔＰＡまたはその組換え休作製物においてはグリコジル化されないＡａｓ−２１ ８でＮ一連鎖グリコシル化を受けやすいであろう。

先に記載したごと（１本発明の個々の変異体をコードしているＤＮＡ配列は、ヒ トｇＰＡ　またはその類似体または変異体をコードしているＤＮＡ配列の通常の 部位−特異的突然変異誘発により、また好適には新規Ｎ−宋端領域をコードして いる合成りＮＡ配列へ結合させて産生されるであろう。そのような突然変異誘発 の方法には（１９８３）；およびＤＮＡ　３：　４７９−４８８（１９８４）等 の単鎖ＤＮＡを用いる方法、およびＭｏｒｉｘａｇａらの。

バイオテクノロジー、６３６−６３９（１９８４年７月〕りテロ二重鎖ＤＮＡを 用いる方法が含まれる。＠ＰＡＮ−宋端の欠失を達成するまたは例えばアスパラ ギン残基をトレオニンまたはグルタミンに変換するそのような方法に従って使用 されるいくつかの模範的オリゴヌクレオチドを表４に示した。もちろん、不発明 の各々のタンパク質をコードしているＤＮＡを、適切に選択されたオリゴヌクレ オチドを用いる部位−特異的突然変異誘発および／または１つまたはそれ以上の 合成りＮＡ配列の結合により当業者は類似して産生できるであろうことを理解せ ねばならない。晴乳類、＃母、細菌または昆虫宿主細胞系において常法によるＤ ＮＡの発現により所望の変異体を得る。そのようにして得られる哺乳類発現系お よび変異体が現在のところ好適である。

ここに記載した哺乳類細胞発現ベクターは当業者にはよ（知られた技術により合 成される。細菌レプリコン、選択遺伝子、工ンハンナー、プロモーター等のごと きベクターの構成品は自然界からまたは既知の方法による合発明の変異体をコー ドしているＤＮＡ配列（形質転換細胞中で本ＤＮＡ配列の発明を支配できるプロ モーターに作動可能に結合されているンを含むそのようなベクターはこのように 容易にｖｊ４製できるであろう。そのようなベクターのｖ４製、それによる適し た宿主細胞の形質転換およびベクター運搬ＤＮＡの発現を許す条件下での形質転 換体細胞の培養はこのようにここに記載された変異体の製造のための通常の方法 から成っている。

確文された細胞株（形質転換細胞株な含む）は宿主として適している。−次外植 片（造血幹細胞のごとき比較的未分化の細胞を含む）同様に一次組織のインビト ロ培養から鋳導される細胞株である正常二倍体細胞もまた適している。選択遺伝 子が優勢に働（かぎりは、候補の細胞は選択遺伝子中が遺伝子型的に欠失してい る必要はな宿主細胞は好適にはａ又された哺乳類細胞株であろう。

通常の方法による染色体ＤＮＡ内へのベクターＤＮＡの安定した組込みおよび続 いての組込まれたベクターＤＮＡの増幅の為、Ｃｌ０（チャイニーズ　ハムスタ ー卵巣）細胞が現在のところ好適である。もしくは、ベクターＤＮＡはウシ乳頭 腫ウィルス遺伝子（Ｌｓａｋｙら、−ｋｙ、３６：３９１−４０１（１９８４） ）の全体または一部に含まれていてもよく、安定なエビソーム要素としてＣ１２ ７マウス細胞のごとき細胞株中で運ばれる。他の使用可能Ｌ−９２９ｍ胞、スイ スから由来する３１３株、　Ｂ、１ｂ−ＣまたはＮＩＨマウス％ＢＨＩｒまたは Ｈａｇ　ハムスター細胞株等が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。

安定な形質転換体は標準的免疫または酵素検定法により、生成物の発現をスクリ ーニングする。変異体タンパク質をコードしているＤＮＡの存在はサザンブロツ テイングのごとき標準的方法により検出されるであろう。

ＣＯ５−１サル細胞のごとき適した宿主細胞内へ発現ベクターＤＮＡを導入後数 日の間の変異体をコードしているＤＮＡの過渡的発現は培養培地中のタンパク質 の活性または免疫学的検定による選択をしないで測定される。

細菌での発現の場合、変異体をコードしでいるＤＮＡはこの分野で既知の細菌発 現のための異ったコドンを含むようにさらに修飾され、および好適には再びこの 分野では既知の細胞の発現、分泌および成熟変異体タンパク質のプロセシングを 可能にする分泌先導ポリペプチドを；−ドするヌクレオチド配列に作動可能に読 み枠内に結合されるであろう。哺乳類、昆虫、酵母または細菌宿主細胞中で発現 された化合物は、すべて既知の方法により回収され、精製されおよび／または物 理化学的、生化学的および／または臨床パラメータに関して特徴付けられる。

これらの化合物はエリトリナトリプシンインヒビタ一連結レジン（この分野で既 知である）およびヒトｔＰＡに対するモノクローナル抗体に対して結合すること が観察されており、それ故そのような試薬を用いてアフィニティークロマトグラ フィーにより回収および／または精製されるであろう。さらに、これらの化合物 はｔ？Ｊ−ｆｆｉ醪素活性を待っていた。即ち１本発明の化合物は線維素存在下 プラスミノーゲンを効果的に活性化し、プラスミンクロモゲン基質Ｓ−２２５１ を用いる通常の間接検定により測定される線維素溶解を引き起こした。

本発明の変異体はまた。オーストラリア特許出御ＡＵ−，４−５５５１４／８６ 、ＥＰ−ｉ−０１５５３８８、ＥＰ−Ａ−Ｏ１５２，７３６、Ｊ？ＰＡｓ５３０ Ｂ５３３．０１ＥＰＡ８Ｓ３０８５３４．８、およびＥＰＪ０１９６９２０に記 載されているごとき抱合体を提供するように誘導化でき、それは既知の担体また は添加剤と処方されて、以下に記載するような他の医薬として有益な組成物が提 供されるであろう。

不発ＢＡはまた治療に有効量の前記変異体と医薬として適当な非経口担体との混 合物からなる血栓溶解治療のための組成物も含んでいる。処方はＧＢ８６１２７ ８１゜ＧＢ８５１３３５８、ＧＢ８５２１７０４．ＥＰＡ２１１５９２およびＧ Ｂ２１７６７０３に記載されているごとくして調製される。そのような組成物は ヒト１ＰＡで説明された方法と同じ方法で使用でき、血栓性心臓血管問題を起こ しやすいことが知られているヒトまたはイヌ、ネコおよび他の哺乳類のごとき下 等な動物に有益であろう。本組成物は心筋梗塞、深部静脈血栓症および血栓溶解 的治療が有益であろうような他の適応症のごとき血栓性状態の処置および望まし くは予防の両刃に使用できるであろうように企図されている。正確な用量および 投与の方法は１例えば体重、性別、飲食物、投与の時間、薬剤の組合せ１反応感 受性および特定の場合の猛烈さなどのごとき薬剤の作用を改変する種々の因子同 様に特定の化合物の力価および薬動学プロフィールに依存して医師に従って決定 されるであろう。

以下の実施例を本発明の実施態様を例示するために記載する。これらの実施例は 例示のためであり１本発明はそれに制限されると考えてはならず、付随する請求 の範囲に示したごと（制限される。

た核多角体病ウィルスはオートゲ２フア　カリホルユヵＣＡｓｔ＠Ｉｒ”ｐλａ 　ｃａｌｆｌｏｒｓ＜ｅａ）　のＬ−１変異体であり、２１３−２１７）であっ た。細胞およびウィルスの取扱いは文献に詳述されている（Ｐ−％ｓｅｇｋＧ、 Ｄ、ら、前記文献；　Ｍｉｌｌａｒ、　Ｄ、Ｗ、、　５ａｆｅｒ、　Ｐ、、およ びＭｉｌｌａｒ、Ｌ。

−２９８ページ、Ｊ、に、　ＳｍｔｌｔｒｖおよびＡ、　Ｅｏｌ　１ｔｓａｓｄ ａｒｅ編Ｌ　７”レヌムプレス、１９８６）。ＲＦｗｈ１３　ベクター、ｔｐｈ 　ｐ　１８および５ｙｌｌはニューイングランドバイオラボから市販されている 。しかしながら、本発明に関係する通常の当業者は他のウィルス、株、宿主細胞 、プロモーターおよび関連した＃　Ｉ）　Ａ’　Ａを含むベクターもまた先に議 論したごとく本発明の各々の尖ａｍ様の実施に使用できることを認知するであろ う。特に示さないかぎり、ここで用いられたＤＮＡの取扱いはＭａｎｉａｔｉａ ら、モレキュ？−／ロー二ング：冥験手引（コールドスフリングハーバ−＃ｒ１ ９８２）に従っている。

畳括弧内に示された突然変異のスクリーニングに使用された（スクリーニングオ リゴヌクレオチドは示されていない、突然変異誘導およびスクリーニングに同一 のオリがヌクレオチドが使用される）。置換アミノ酸のコドンは下線が付けられ ており、Δは欠失部位を示している。当業者はオリゴヌクレオチド中のコドンの 欠失または所望の置換アミノ酸のためのコドンに置換することにより所望の位置 で各々１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失または異ったアミノ酸の挿入（即ち 置換）に使用するためのオリゴヌクレオチドが容易に構築できることを認めるで あろう。他の突然変異誘発オリゴヌクレオチドは所望の位置にまたがる約２０− ５０のヌクレオチド配列に基づいて計画でき、変化させたい本来のコドンを置換 または欠失させる。

プラスミド誘導 種々の７ミノ醗のコドンでのａ　Ｄ　Ｎ　Ａの突然変異誘発はＺ　ｏ　Ｅｌ−デ およびＳｖ＊ｉ　ｔ　ｋの方法によりＭ１３ベクター中の−１）ＮＡの適当な制 限断片を用いて実施された。

、Ｉ）ＮＡ内の欠失はＭ１３中ベクター中のｃＤＮＡの適当な制限断片（例えば Ｓａｍｌ断片）を用いるループ外突然変異誘発またはプラスンドｐｓＶＰＡ４中 のへテロ二本鎖ループ外突然変異誘発により達成される。

哺乳類細胞中でのｔＰＡ糖タンパク質の発現を可能にするためプラスミドｐｓＶ ＰＡ４が構築された。このプラスミドは最初にプラスミドｐａｐＬＴ５からＳＶ ４０：ｙ−ジＴポリペプチドをコードしているＤＮＡを除去するこ完全Ｘｈ６Ｉ 消化に続いての部分Ｂ・ｙａ−Ｅ■制限エンドヌクレアーゼ消化の５Ａ施により 達成される。プラスミドＪ２０５（ＡＴＣＣ番号３９５６８）を５ａｌｌおよび Ｂａ１ｌｌＥｌで消化する事により単離された付着Ｓａ目／Ｂａ□■ｔＰＡコー ド制＠断片を前記のごとくしてＵ７４製された親ＸＡｏＩ／ＢａＪＩ切断ベクタ ーｐａｐＬＴ５に連結することｌＣよりｐａｐＬＴ５中ｆ）ＳＶ４０５’−シフ 　ｗ　−）”領域カヒトｔＰＡ−コード配列に置き換えられる。その結果、哺乳 類細胞内へ導入された場合５Ｖ４Ｑ後期プロ七−−−の１１ｊｉＩのもとｔＰＡ がこのベクター中で転写される。この最終構築物を、５ＶＰＡ４と称する。

プラスミド、ＬＸ）ＳＧはＣＨＯ細胞のごとき哺乳類細胞中でのｔＰＡの発現の ための増幅可能ベクターである。

ｐＬＤｓＧはアデノウィルス２ｍ生後期プロモータ（ＮＬＰ）を利用するマウス ＤＥＦＲｇＤＮＡ転写ユニット、サルウィルス４０　（ＳＶ４０）エンハンサ− および複製起点、５Ｖ４Ｑ後期プロモーター（アデノウィルスＭＬＰと同じ向き ｋ）、ナト２サイクリン低抗性をコードしている遺伝子およびアデノクイルスフ ：、型ＭＬＰＩＩＣ関して適切な方向にあるヒトｔ　Ｐ　Ａ　ＣＭｍ　ｔ−２４ ５’）をコードし１いるｃＤＮＡを含んでいる。

、ＣＶＳＶＬ２ＣＡＴＣＣ番号３９８１３）およびｔＰＡをコードしているａ　 ｊ）　Ａ’　Ａからの、ＬＤＳＧｆ）製造はＣＥＯＩＩＢ胞中の、ＬＤＳＧの共 形質転換および増幅ととも（１９８５）。

プラスミド、ＩＰ′ＧｓＭはａＤＮＡ挿入物がｒａｌ−２４５ヒトｔＰＡをフー ドしていることを除いてｐＬＤｓＧと同一である。アＩＩ’ＧＳＭはプラスミド １２０５（ＡＴＣＣ醤号３９５６ｇ）または、ＩＶＰＡ／１（ＡＴＣＣ番号３９ ８９１）からの１ＤＮＡ　（２４５位で所望の突然変異誘発を持つ）を用いて構 成される。本Ｆ！ＡＩＩａ書を通じてｐＭ’Ｇ　ＳＭおよび、ＬＤＳＧは交換で きるように使用されるであろうが、先に示したごとく前者のベクターはＶａｌ− ２４５タンパク質および後者はＮｅｔ−２４５タンパク質を産生するであろう。

ｐｌＶＰＡ／１（ＡＴＣＣ番号３９８９１）はｇＰＡ−コードｅＤＮＡを含むバ キュロウィルストランスプレースメントベクターである。ｐ　ｌ　Ｖ　Ｐ　Ａ　 ／　ｌおよびその突然変異誘発誘導体は所望のｃＤＮＡのバキュロウィルスゲノ ム内への挿入に使用され、そのためｃＤＮＡはバキュロウィルスポリヘトリンプ ロモーターの転写制御下にはいるであろう。

ｐＭＴ　２　ｐ、はアデノウィルス−ＶＡ遺伝子、エンハンサ−を含むＳＦ’− ４０複製起点、３分節系先導および５ｒ供与スプライス部位を含むアデノウィル ス主後期プロモーター、３′スプライス受容部位、ＤＨＦＲｃＤＮＡ挿入物、Ｓ １’４０ｕ期ポリアゾ′ニル化信号およびｐＢＲ３２２配列を含む曙乳類発現ベ クターである。ｐＭＴ　２２Ｇは独特のＰＪ１クローニング部位を含んでいる。

本ベクターはアメリカンタイプカルチャーコレクションにＡＴｃｃ番号４０３４ ８号として供託されている。

ｐＭＴ２ｐｃ−ｔＰＡおよびその誘導体はそれら自身。

２Ｍ７２ｐｃ上に存在するＢｇｔＨ部位を破壊し、ｐ、目で９Ｍ７２ｐ、を消化 し、直線化ＤＮＡを平滑端リンカ−に結合し、リンカ−を付けたＤＮＡ％ｐｔｐ Ａ−コードｃＤＮＡまたはその突然変異誘発誘導体を含む、ＷＧＳＭのＢａ１ｌ 制限断片に結合することにより産生されるｐ、％ＩＴ２ｐｔ：の誘導体である。

そのようにして産生されたベクターはのｔＰＡの制限地図を与えられ（例えば以 下に示される）通常の制限分析により分析される。

発現ベクターの作製 哺乳類発現ベクｐ−ｐＭＴ２ｐｅ−ＦＥ７８７’は最初１０μりのプラスミドｐ Ｍ７２　ｐｇ　ＤＮＡ　を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＮで消化することによ り作製される。

これに続き、切断末端をヌクレオチド存在下ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断 片）を用いてふさぐ。切断されおよびふさがれたプラスミドは希釈され結合され る。プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１　の形質転換に使用し、ＥＱに■−抵抵抗ジ ブラスミド含むコロニーを選択する。精製されたプラスミドはＰｘｔｌで切断す る。これに続きフェノール／クロロホルム抽出を行いエタノールで沈殿させる。

下記の平滑端化アダプターは続いてＰｓｔｌ直線化ベクターと５０：１（アダプ タｍ：ベクター）のモル比で結合させる： （５’　）　ＨＯ−ＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡ−ＯＨ（３’　）（３’） 　ＨＯＧＡＴＣＴＣＣＧＧ−Ｐ（５’）ベクターをその後Ｂａ１ｌで切断し、混 合物は０．７チアガロースゲル上を移動させ、〜４．８Ｋｂｐ発現ベクターＤＮ Ａを切り出し精製する。このベクターは今ｔ、Ｐ、４６ＤＮＡ挿入物を受容する ことができる。

上記のごと（して調製されたベクター内へ挿入するための変異体ｔＰＡ　配列を コードしている。ＤＮＡ挿入物はプラスミド、ＷＧＳＭ−ＦＥ７８７’の制限エ ンドヌクレアーゼＢａ１ｌによる消化により産生される〜２．　Ｉ　Ｋｂｐ制限 断片のアガロースゲルによる精製によりｌｐｌ製される。

ｐＷＧｓｌｊｌ−ＦＥ７８７’はアミノ酸６−８６を欠き、１１７位にＮの代わ りにＱおよび２４５位のＶの代わりにＭを含んでいるｃＰＡ　変異体をコードす る。ＷＧＳＨの誘導体である。この変異体（化合物２−１７Ｎ−２２７Ｒ−２７ ５）は公開されている国際特許出願番号ｒｏＢ７７０４’１２２ＫＣｅＤＮＡ　 およびベクターの調製とその発現）記載されている。、ＷＧＳＭ−ＦＥ７８’ｌ ’のＢαＩＩ断片は公開されている国際特許出願Ｆ０８７１０４７２２に記載さ れているごと＜Ｑ−１１７＊ＰＪ　変異体の完全長翻訳に必要とされるＤＮＡ配 列を含んでいるが、天然タンパク質の９１−アミノ酸Ｎ−禾端に観察される“フ ィンガー”および１上皮増殖因子”領域が欠けている。

ｐＭＴ　２　ｐｃ内へのＢｃＬＩＬ断片の挿入によりベクターｐＭＴ２ｐａ−Ｆ Ｅ７８７’が産生される。（ＩＪ　ＢｙＥ＊およびＡｐａ　ｌでｐＭＴ２ｐｃ− ＦＥ’１８７’を消化することにより、成熟Ｎ−末端に先豆って始まり第３の共 通Ｎ一連鎖グリコシル化部位まで拡がっているｇＰＡ　変異体の大部分をコード しているＤＮＡ　配列を除去する。および（２Ｊその場所へ、ＷＧＳＭまたは他 の５ＰＡ−コードベクターからの対応するＥｒｔｌ　＊／Ａｐａ　Ｉ制限断片を 挿入することにより１Ｍ７２ｐｃ−Ｊ’Ｅ７８７’がｐＭＴ２ｐｃ−ｔＰＡまた はその誘導体へ変換されるであろう。もしくは、所望の突然変異誘発を達成する ためＰＭＴ　２　ｐｃ　−ＦＥ７　Ｂ　７’　上でヘテロ二本鎖突然変異誘発が 実施されるであろう（例えば１つまたはそれ以上のグリコクル化部位および／ま たはプラスミン切断部位）。

ｔＰＡ　ｃＤＮＡの誘導体の作製：Ｍ１３法下記の図式的制限地図はヒトｔＰＡ （前記）をコードしているｃＤＮＡ　を説明しており、特定のエンドヌクレアー ゼ（下に示しである）の切断部位も示されている：開始コドン（ＡＴＧ）および Ｒ１，Ｒ１およびＢｓをコードしているｃＤＮＡ　領域も示されている。それ故 、Ｎ−末端での突然変異誘発は例えばＳａｃ　ｌ断片またはＢＱＥＨ／Ａ’ｓｒ ｌ断片を使用して達成されるであろう。Ａｒｇ−２７５および／またはＲＩおよ び／またはＲ２での突然変異誘発は例えばＳａｇ　ｌ断片またはＥｇｇ　ｌ　／ 　Ｓａｃ　１断片を用いて達成されるであろう、Ｒａ　での突然変異誘発は例え ばＳａｇ　夏／Ｘ％Ｇｌまたは５ａｃｌ／Ａｐａ　ｌ断片を用いて達成されるで あろう。制限断片の選択は突然変異誘発および／または発現ベクター構築のため 使用する特定のベクターの都合に基づいて決定されるであろう。

一般的に突然変異誘発されるべき６ＤＮＡ　制限断片は−例えばｐＷＧｓＭ、ｐ ＭＴ２ｐｃ−＊ＰＡ、ｐｌＶＰＡ／１またはｐ　Ｓ　Ｆ　Ｐ　Ａ　Ｊ中に存在す る完全長ｃＤＮＡから示されたエンドヌクレアーゼ酵素を用いて切り出され、適 轟なベクター内へサブクローンされ、その後１例えば表４に示したオリゴヌクレ オチドまたは所望の突然変異誘発のために設計された他のオリゴヌクレオチドに より突然変異誘発される。

そのようにして調製された模範的な突然変異誘発を受けたｃＤＮＡ断片が次の表 ５に示しである。そのような断片はｐＭＴ　２　ｐ６−　＠ＰＡまたは前記のご とく突然変異誘発を受けたその誘導体中のヌクレオチド配列の置き換えに使用さ れる。

（！） （ＩＴ） （Ｖ） （ｖＩ） 中　突然変異生成の部位を示している；　ｃＤＮＡ断片Ｉ断片■はｐＷＧｓＭま たはｐ　Ｓ　Ｖ　Ｐ　Ａ　４を５ａｃＩで消化し。

Ｓａｃ　Ｉ断片をＭ１３　ベクター内へ挿入し、所望のオリゴヌクレオチドで突 然変異誘発し、突然変異したＭ１３／ｌＰＡ　ＤＮＡをＳａｃ　Ｉで消化して調 製した；もしくは、■−■は突然変異を生成したＭ１３／ｌＰＡからＢｇｌＮお よび５ａＣＩで切り出し、Ｎ−宋端、Ｒ１、Ｒ８およびＡｙｇ　−２７５にわた るペプチド領域をコードしているＢｇｔ＠ｌ５ａ６　！断片がＢｙｌ　ＩＩ　／ 　５ａＧＩ消化ｐ　Ｉ　Ｖ　Ｐ　Ａ内へ挿入サレるであろう：ｃＤＮＡ断片Ｖお よび■は各々実施例２および１に記載されることくして調製される。新Ｎ−末端 配列はＣ１ａ　ｉ部位が先にある。

突然変異誘発に続いて断片（更なる突然変異誘発があるにしろないにしろ）がＭ １３から切り出され１Ｍ１３ベクターからの突然変異生成断片の切り出しに使用 されたものと同じ酵素で前もって切断されている完全長または部分的ｅＤＮＡを 含む発現ベクター内へ結合し直される。この方法によると完全長ｃＤＮＡ（望ま れるとと（突然変異生成した）は１つまたはそれ以上の突然変異生成断片を制限 断片カセットとして用いて再構成される。

例示化合物０表１参照）をコードしているｃ　ＤＮＡは以下のごとく調製された 。

化合物１−１をコードするＤＮＡの作製には表４Ａに示した重なり合ったオリゴ ヌクレオチドの組が、市販の自動ＤＮＡ合成機を用い説明に従って、常法により 最初に合成された。奇数の番号を付けたオリゴヌクレオチドは°センス鎖であり 、偶数の番号を付けたオリゴヌクレオチドは１アンチ−センス鎖である。オリゴ ヌクレオチド２．３．４および５は別々に常法によりリン酸化された。オリゴヌ クレオチド対１および２．３および４．５および６は各々普通の条件下お互いに アニール化させる。例えば８５　ｘＭ　）リス、　ｐＨ７，５，５０ｍ　Ｍ　Ｎ ａＣ１゜＆　５　ａＭＭｇＣＩ、および４．２ピコモル（の各々のヌクレオチド ）／λの溶液、８０℃に加熱し続いて２時間以上かけて３７℃まで徐々に冷却し １重なり合った合成二連体の組を形成させる： 二連体の個々の混合物を合併し濃縮し、二連体をお互いに標準的条件下結合させ る；例えば５０ｔａＭトリス。

ｐＨ７，４，１０ｖｓｈＭ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭＤＴＴ　および１ｍｎＡＴＰ および５ワイス単位のＴ４リガーゼにューイングランドバイオラボ）で４℃−夜 （〜１６時閲）。混合物は２％低ゲル化温度アガロースゲルｆｊｒ：通して電気 泳動し、〜２５０　ｈｐ　のバンドなゲルから切り出す。そのようにして産生さ れたＤＮＡ分子はカセット上の合成クリングル領域をコードしており、５′　お よび３′末端で各々ＥａｖｎＢ　ｌおよびＣ１ａ　ｉがオーバーハングしている 。

大腸菌ＧＭ１６１のごときｄａｔａ−細画宿主中でｖ４製された１Ｍ７２ｐｃ− ＦＥ７８１’　プラスミドＤＮＡ−ｋＢｇＥｌおよびＣ１ａｌ（部分的）で消化 し、ｐＭＴ２ｐａ−ＦＥ７８７′　中に存在するＡｒｒｔ　−（−ンコドンで始 まり、１１ｍ１５）　−ＡｌｐＣ８７）融合部位まで続くコード領域を切り出す 。

そのように消化されたｐＭＴ　２　ｐｃ　−ＦＥＴ　８７’を常法によりＢａ惰 Ｈｌ−ＣＬ　ａ　１合成力セットに結合させる。

上記の構築により新しい２Ｍ７２ｐｅベクター、ｐＭＴ２ｐ６−ＰＫｌ−ＦＥ７ ８７’が創造され、そこにおいてＡｒｇ−（１）および／！＃　−５（）１ｍ− ５−Ａｓｐ−８７融合部位に）対するコドンが再創造されており、その間に力七 ット配夕Ｕが挿入されている。それ故、生じたベクターは今化合物１−１を；− ドしている改良ｃＤＮＡ挿入物を含んでいる。

下は１Ｍ７２ｐｅ−ＦＥ’１８７’　のコード配列の制限地図を表わしている： ここで１＊”はノｌ−（５）−Ａｇｐ（８７）融合をコードしている配列の位置 を示しており、およびＲ１は記載されたごと（改変される。

合成カセットの制限地図は下のごと（である：下はＢａｔｈｌｌ　ｌ　／　（： ’　ｊ　Ｇ　Ｉカセットを取り込んでいる９Ｍ７２ｐｃ−ＰＫｌ−ＦＥ７８７９ ｔコードする配列の制限地図を示している： ここで°＊”’Ｉ”！合成カセットの位置を示している。ベクター内へのカセッ ト５′宋端の結合の部位でのＥａｍＢ　１／ＢＱＥＩ融合の結果Ｂα−８１およ びＢＱＩｌ制限部位が破壊されることに注意せねばならない。さらにベクター内 へのカセットの挿入によりカセットの３′宋端でＣＥａ　１部位が再創造され、 カセット配列内のＧにｙ−ＡＪＣＬコードヌクレオチドにわたり新しいＮ（、， １部位が導入された。

更なる突然変異が望まれるなら（例えば１つまたはそれ以上の共通Ｎ一連結グリ コクル化部位および／マタハブラスミン切断部位で）、９Ｍ７２ｐｃ−ＰＨＩ− ＦＥ７８Ｔ’および表４に示したごとき適当なオリゴヌクレオチドを用いて通常 のへテロ二本鎖突然変異誘発により都合よ（達成されるであろう。

プラスミドｐｌＶＰＡ、ｐｓＶＰＡ４ｔたに＠ｐＭＴ２ｐｃ−ｔＰＡ　は発現ベ クターとしての用途に加え、所望の突然変異生成の順列を持つｃＤＮＡの構築に おいて１貯留槽１としても使用されるであろう。それ故、所望の改変なｃＤＮＡ に含む（例えばＡｒｇ　−２７５、Ｒ１、Ｒ１および／またはＲ３コード領域の 任意の組合せで）突然変異生成（Ｍ２Ｓまたはへテロ二本鎖を経て）プラスミド は１つまたはそれ以上の適当な制限酵素で消化され、所望の断片が同定され、単 離され、９Ｍ７２ｐｃ−ＰＫｌ−ＦＥ７８７’のごとき対応するように消化され ている発現ベクター内へ連結される。

Δ６−８６、Ｑ−１１７ｔＰＡ　のポリペプチド配列をコードしているｃＤＮＡ 分子はＺＯｌｌｍｒおよびＳ淋ｏ１のオリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発 法な用いて調製される（本質的にはＦＯＲＴ１０４７２２に記載されているとと く］。特定的には１Ｍａｔ−２＜５ｔＰＡ遺伝子を含む突然変異誘発ベクターＲ Ｆ　Ｍ１３７ｔＰＡは隔乳類、Ｐ１発現プラスミドｐｓＶＰＡ４から構築される 。

ＲＦ　Ｍ１３／ｇＰＡは最初ｐｓＶＰＡ４を制限エンドヌクレアーゼＨ４ｎｄ　 ＩＩＩおよびＸｍｓ　ｌで完全に消化することにより構築される。約１，８６０ ４基対Ｃｂｐ）のＨｉ％ｄ■／Ｘｍｔｚ■断片はＭ−２４５ｔＰＡ　のポリペプ チド配列の大部分をコードしており、アスパラギン１１７．１８４および２１８ ％：含む共通Ｎ一連鎖グリコシル化部位をコードしているヌクレオチド配列な含 んでいる。この〜１，８６０ｈｐ　（以後１．９Ａ６ｐ）断片は分取用アガロー スゲル電気泳動により精製された。

上記のごとく得られたｔＰＡ　ｃＤＮＡの８４％ｄ　［Ｉ／ＸｔｎａＩ断片は前 もってＢｉ％ｄｍおよびＸｔｍ　ｌで消化され℃いる直線状二重＠　ＲＦ　Ｍ　 １３　ｖｓ＊ｐ　１８　ＤＩＶ　Ａベクターと連結する。連結混合物は形質転換 受容性Ｍｉ慕）ＡｆｌＯ１細胞の形質転換に使用する。形質転換された細胞から 産生される霧ＰＡ−由来ＤＮＡ含有Ｍ１３プラークは分析的ＤＮＡ制限分析およ びプラークハイブリダイゼーションにより同定し単離する。ｔＰＡ　ＤＮＡ　含 有のウィルスプラークの検出にフィルターハイブリダイゼーションが用いられた 場合、ｇＰＡ−コードヌクレオチド配列の８ｉ％ｄ　［１７Ｘｍａ■制限部位内 から訪導された放射性標諏オリゴヌクレオチド（〜ｌ　７　ｍａｒｌ　、正の方 向性）がプローブとして使用された。すべてのオリゴヌクレオチドは製造元の説 明に従つ℃アプライドバイオシステムスＤＮＡ　４７ｆ？、機による自動合成に より製造された。

制限またはハイブリダイセーフ３フ分析により検出されたいくつかの陽性プラー クを１さらに通常のプラーク精製によりクローン化された。プラーク精製過程か ら得られた精製Ｍ１３／ｌＰＡバクテリオファージをＪＭ　１０１細胞の感染に 使用した。これらの感染細胞は細胞質二重鎖′″ＲＦ’Ｍ１３／！ＦＡＲＦ’Ｍ １３／！ＦＡプラスミドすした細胞はまたｇＰＡ　ｃＤＮＡの１．９　Ｋｂｐ　 Ｂｉｎｄ　ｍ／Ｘｍｌ断片およびＭ１３ＤＮＡと相補的な一重鎖ＤＮＡを含む培 養培地中にバクテリオファージも産生じた。−重鎮ＤＮＡは培養培地から単離さ れたＭ１３／ｇＰＡ−含有ファージから精製された。　この−１ｉＬ頭Ｍ１３／ １ＰｉＤＮＡは国際特許出願ＷＯ３７１０４７２２に記載されている表７の＃１ および＃１０のオリゴヌクレオチドを用いるＺｏｌｌａｒおよび５ｔｎｔｔｈの 方法に従った２回連続の突然変異誘発での鋳塁として使用される。この突然変異 誘発は１１７位のＡ３Ｂ：ｙトンへ変化させ、続いて得られるＤＮＡのコーディ ング鎖のアミノ酸６から８６をコードするヌクレオチドが欠失している。突然変 異誘発反応に胱いて、ＤＮＡで細菌株ＪＭ　１０１を形質転換する。

突然変異生成のｃＤＮＡを同定するため形質転換体プラ−りからのＨ１３のｓＪ 型を配列決定する。

ＲＦ　Ｍ１３／ｌｒＡプラスミドＤＮＡは突然変異誘発寥ＰＡ　ｃＤＮＡを含む 精製Ｍ１３ファージで感染させたＪＭｌｏｌかう精製される。そのようにして得 られたＲＦＭ１３７＠ＦＡプラスミドは前記のごとくして突然変異生成ｉ”ｔり ｇＰＡ　ＤＨＡｆ）Ｈ４ｎｄ　Ｔｒｉ／Ｘｔｍ　Ｉ制限断片を含んでいる。この 突然変異生成制限断片は、必要なら、表４に記載したごとき適当なオリゴヌクレ オチドを用い、再びＺＯ１ｌａデおよび５ｖｈｉｔｌｄＱ方法により、公開され た国際特許出願ＷＯ３７１０４７２２に記載されているごとく、例えば１つまた はそれ以上のＮ一連鎖グリコシル化部位さもなくはＡｒｆＪ　−２７５のプラス ミン切断部位で、さらに突然変異誘発を受ける゛ことができる。特に興味な持た れるのは第１（Ｒ”）、第１および第２　（Ｊ？ｌおよびＲ１）または３つすべ ての（８１％Ｒ１およびＲ３〕の共通Ｎ一連鎖グリコシル化部位が共通Ｎ一連鎖 グリコシル化部位以外へ改変されている本発明の変異体である。

Ｂ０発現ベクターｐＭ７２ｐｃ−ＦＥ７８７’の作製この場合、Δ１−８６、Ｑ 　−１１７ｔＰＡ　をコードしている突然変異生成ｃＤＮＡはＭ１３ベクターか らＢｉｎｄｌ　／Ｘｖｐｂａ　ｌ断片として切り出される。この断片を常法によ りＨｉ　ｓｄ　［［／Ｘ％Ｇ　ｌ消化ｐＷＧｓＭに結合し−（ｐＷＧｓＭ−ＦＥ ７８７’を産生する。ｐＭＴ２ｐｃ−ＦＥ７８７’はその後前記のとと＜、ｐＭ Ｔ２ｐｅ’ＡよびｐＷＧｓＭ−ＦＥ７Ｂ７’Ｃ６合成カセットの作製 化合物１−１をコードしているベクターの作製の為。

最初に表４Ａに示した重複オリゴヌクレオチドが市販の自動ＤＮＡ合成機を製造 元の説明に従って使用する常法により合成される。奇数の番号が付けられたオリ ゴヌクレオチドは“センス”鎖であり、偶数の番号が付けられたオリゴヌクレオ チドは“アンチ−センス錫である。

オリゴヌクレオチド対１および２；３および４；および５および６は各々お互い にアニール化し、適当なリン酸化後前に記載したごとき通常の条件下合成二連体 の組を形成する。個々の二連体の混合物を合併し、前に記載したごとく二連体を お互いに結合させる。混合物は２チ低ゲル化温度アガロースゲルを通して電気泳 動し、〜２５０ｈｐのバンドをゲルから切り出す。そのようにして産生されたＤ ＮＡ分子はカセット上合成りリンゲル領域をコードしており５′および３Ｆ：ｉ 端に各々に％Ｈ１およびＣ１ａｌカオーバーハングしている。

Ｄ、ｐＭＴ２ｐｃ−ＰＩ−１−ＦＥ７８７’の作製大腸菌（、Ｈ１６１中で増殖 されたｐＭＴ２ｐｃ−ＦＥ７８７’をＢＱＩｎおよびｃｔａｌｃ部分的〕で消化 して、　２Ｍ７２ｐｃ−ＦＥ７８７’に存在するＡｒｙ−（−）コドン内に始ま り。

１１ａ（５）　−ＡｓｐＣ８’ｌ）融合部位のＪｉｍ　−５コドン中へ続くコー ド領域を切り出す。そのようにして消化された２Ｍ７２ｐｃ−ＦＥ７８７’はそ の後常法によりＢ、、Ｈｌ　−ＣｌｃＬｌ合成カセットと連結する。この構築に より新しいｐＭ７２ｐｃベクター、ｐＭＴ２ｐｅ　−ＰＫｌ−ＦＢ７８７’、が 創造され；そこにおいてＡｒｙ−（−１）およびｌｉｇ　−５（）１ｍ−５−Ａ ｌｐ−Ｒ７融合部位に〕に対するコドンが再創造されており、それらの間にカセ ット配列が挿入されている。それ放生じるベクターは改変ｃＤＮＡ挿入物を含み 、それは今では化合物１−１をコードしている。

前に記載したごとく、ｐＭ７２　ｐｃ　−ＰＫ　１−ＦＥ　７８７’は通常のへ テロ二本鎖突然変異銹発法および他の都合よく作製された合成オリゴヌクレオチ ドを用いて便利に突然変異生成され、それはＤＮＡ配列を所望のように改変する 。例えばＲ１における共通Ｎ一連鎖グリコシル化部位の復元および／またはＲ２ およびＲ３の１つまたは両方のＮ一連続グリコシル化部位以外への変換、および ／または２７５位にわたるプラスミン切断部位の改変。

所望のポリペプチド配列をコードしているｃＤＮＡ分子を含むｐＭ７２ｐｃ誘導 体のごとき発現ベクターは前に記載したごと（作製される。

哺乳類宿主細胞の形質転換、形質転換体の選択、遺伝細胞培養はＫａ％ｆ％ａｎ らの方法（前記文献）（ＣＢＯ宿主細胞］またはｎｏｗにりらの方法、米国特許 第４．４１９．４４６号＜１９８３）（ＥＰＶ発現系を用いる）により達成され 対応する哺乳類−由来変異体タンパク質な得る。ＣＨＯ細胞発現の場合には、ベ クターＤＮＡは普通の原形質体融合によりＣＥＯ細胞内へ導入され％Ｋａ％／％ Ｇ％の方法（前記文献）により増幅される。形質転換されおよび増幅されたＣＨ ＯＩＦ５胞は所望の変異体を良好な収量で産生じ、それは培養培地中ヒトｔＰＡ ％異的抗体（多分Ｎ−末端以外のエピトープへ向う）により検出できるであろう 。その後変異体が回収され、免疫アフイニテイクロマトグラフイーまたはＦＴＩ レジンを含むもののごとき他の通常の方法により精製される。同様に１本発明の 他の変異体も哨乳類細胞中で発現され、そのような方法で回収および精製される ・ 上に記載したごと＜、２Ｍ７２ｐｃ−ＰＫｌ−ＦＥ７８７’で形質転換されたＣ ＨＯａ胞により発現された変異体はラットおよびウサギモデルで測定されるごと くインビボでの半減期により！＃徴付けられ、野生型客ＦＡ　のそれより少くと も約１０から２０倍長＜、５−２２５１を用いる間接クロモゲ７基質検定により 測定される比活性はＷＨＯεＰＡ標準品よりも有意に高かった１例えば約５Ｏ− Ｚｏｏチ高い。

手続補正書（ハ）　■ 平成　２年り０月／８Ｂ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．組織プラスミノーゲン活性化因子ー型活性を持つ血栓崩壊蛋白において、Ｌ ＰＡのアミノ酸１−８２が下記の配列と同一または本質的に等しい配列を含むア ミノ酸配列で置き換えられている成熟Ｎ−末端部位を除いてヒトＬＰＡ配列のペ プチド配列と本質的に同一のペプチド配列であることを特徴とする蛋白。 【配列があります】。
2. ２．１つまたはそれ以上の共通Ｎ−結合グルコシル化部位が共通Ｎ−結合グリコ シル化部位以外に改変されている請求の範囲第１項記載の血栓崩壊蛋白。
3. ３．Ａｓｎ−１１７にかかる共通Ｎ−結合グリコシル化部位が共通Ｎ−結合グリ コシル化部位以外に改変されている請求の範囲第２項記載り血栓崩壊蛋白。
4. ４．Ａｓｎ−１１７、Ａｓｎ−１８４およびＡｓｎ−４４８にかかる３つの共通 Ｎ−結合グリコシル化部位が各々共通Ｎ−結合グリコシル化部位に改変されてい る請求の範囲第２項記載の血栓崩壊蛋白。
5. ５．Ａｒｇ−２７５が欠失するかまたほ異つたアミノ酸に置換されることでさら に特徴付けられる請求の範囲第１項記載り血栓崩壊蛋白。
6. ６．Ａｒｇ−２７５が久失するかまたは異つたアミノ酸で置換されることをさら に特徴とする請求の範囲第２項記載の血栓崩壊蛋白。
7. ７．請求の範囲１〜６項記載の蛋白をコードするＤＮＡ分子。
8. ８．哺乳類宿主細胞中請求の範囲第７項記載のＤＮＡ分子の発現により産生され る組織プラスミノーゲン−型活性を持つ血栓崩壊蛋白。
9. ９．有効量の請求の範囲第１〜６または８項記載り蛋白と医薬として適当な担体 との混合を特徴とする血栓症状態の処置の為の治療用組成物。