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EP0403598A1 - tPA-ÄHNLICHE POLYPEPTIDE, IHRE HERSTELLUNG UND VERWENDUNG - Google Patents

tPA-ÄHNLICHE POLYPEPTIDE, IHRE HERSTELLUNG UND VERWENDUNG

Info

Publication number
EP0403598A1
EP0403598A1 EP89909751A EP89909751A EP0403598A1 EP 0403598 A1 EP0403598 A1 EP 0403598A1 EP 89909751 A EP89909751 A EP 89909751A EP 89909751 A EP89909751 A EP 89909751A EP 0403598 A1 EP0403598 A1 EP 0403598A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tpa
polypeptides
dna
sequences
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP89909751A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alfred Bach
Martin Schmidt
Karl-Hermann Strube
Verena Baldinger
Margarete Schwarz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP0403598A1 publication Critical patent/EP0403598A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Definitions

  • the present invention relates to new tPA-like polypeptides with plasma activator activity, processes for their preparation and their use in combating diseases.
  • the human, mature tissue plasmin activator is a polypeptide of 527 amino acids and a molecular weight of about 68 kD (Pennica et al. 1983, Nature 301, 214-221 and Ny et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei USA 81, 5355-5359) (see Fig. La-lc).
  • the molecule contains several distinct regions, so-called domains, to which various functions are assigned.
  • the N-terminus is formed by a finger region that is homologous to the fibronectin. This is followed by a region that is similar to several growth factors. This is followed by two Kringel domains.
  • the protease domain follows a cleavage site at which the single-chain molecule can be cleaved into two chains; this contains the active center and has homology to other serine proteases.
  • tissue plasminogen activator has a strong affinity for fibrin, the plasminogen activation is dependent on fibrin; as a protease, tPA cleaves plasminogen to plasmin, which in turn breaks down fibrin into cleavage products. tPA can be inhibited by plasminogen activator inhibitors. Furthermore, tPA has a relatively short half-life; the molecule breaks down rapidly in the liver.
  • tPA specifically activates plasminogen to plasmin in blood clots and causes the vascular current to be restored by breaking down the fibrin.
  • tPA can therefore be used in fibrinolytic therapy, e.g. B. after a heart attack.
  • tPA-like polypeptides which have the amino acid sequence of tPA or sequences derived therefrom, but in which 1-6 tripeptides are replaced by the tripeptide RGD, have improved properties.
  • sequences derived from the tPA are to be understood as naturally occurring allele variants and synthetic variants which, in their primary structure, agree more than 90% with the natural tP ⁇ and have a plasminogen-activating effect.
  • the new polypeptides preferably contain one or more RGD
  • polypeptides which contain the tripeptide RGD in position 130-132 are particularly preferred. Also preferred are polypeptides which contain one to two additional RGD tripeptides in addition to the RGD sequence in position 130-132.
  • the invention further relates to DNA sequences for the mutated
  • Encode polypeptides as well as vectors containing these DNA sequences.
  • the new polypeptides can be produced genetically using known methods.
  • the starting point for the constructions described here is a cDNA clone, hereinafter called pUCtpa, which contains the coding sequence of tPA and 5'- and 3'- untranslated regions *. After a "leader” and pro sequence, the mature protein begins with Ser (1) and ends after Pro (527).
  • PUCtPA is isolated as follows: RNA is isolated from human uterine tissue and transcribed into double-stranded cDNA. After inserting this cDNA into the commercially available cloning vector pUC9, a cDNA library is created. The methods used can be found, for example, in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH-press. 5 “Screening” of such gene banks with radioactively labeled oligonucleotide probes has also become a widely used and described method. A cDNA clone containing the coding region and adjacent regions can be isolated by this method.
  • the genes or gene fragments can be provided with suitable chemically synthesized control regions or isolated from bacteria, phages, eukaryotic cells or their viruses, which control the of the proteins.
  • the transformation or transfection of the hybrid plasma obtained in this way into suitable host organisms is also known and has been described in detail.
  • the hybrid plasmids can also be provided with corresponding signal sequences which allow the polypeptides to be secreted into the medium.
  • vectors can be used which place the gene to be expressed, in this case the mutated tPA cDNA, under the control of the mouse metallothionein or the SV40 viral promoter.
  • Clones are then isolated which have copies of these vectors as episomes or integrated into the genome.
  • the integration and expression of the foreign gene based on the bovine papillo virus are particularly advantageous.
  • the construction of so-called “shuttle” vectors is possible.
  • the plasmid is first constructed and propagated in bacterial cells; the conversion into the eukaryotic cells then takes place, for example into the mouse fibroblast cell line C127.
  • yeast, insect cells and other mammalian cells such as CHO, L and 293 cells, can also be used for the expression.
  • the tissue plasma activator receives glycoside side chains at amino acids 117, 184 and 448 (Asn) when expressed in eukaryotic cells.
  • Bacteria are unable to synthesize glycoside side chains.
  • bacteria are often unable to split off the initiator amino acid methionine from the finished protein. These difficulties can be avoided by using secretion systems.
  • the new polypeptides are purified by separating them from the culture medium by affinity and ion exchange chromatography using known methods.
  • the polypeptides obtained according to the invention have improved properties in at least one of the points mentioned below: clot specificity, half-life, inhibitor binding, proteolytic activity and can therefore be used for thrombolysis. They show improved properties compared to human tissue plasminogen activator.
  • the invention therefore also relates to medicaments which contain at least one of the new polypeptides, optionally in a pharmaceutically acceptable carrier or binder.
  • the drugs can also combinations of the new proteins with other fibrinolytics, such as prourokinase, urokinase or streptokinase or their derivatives, as well as with other pharmaceutical proteins, e.g. B. Superoxide disase included. Further embodiments of the invention are described in more detail in the following examples.
  • RNA was sedimented by centrifugation through a 5.7 M CsCl cushion overnight at 45,000 rpm.
  • the polyA + -containing RNA fraction was then separated by affinity chromatography on oligo (dT) cellulose.
  • the polyA + RNA was rewritten into single-stranded cDNA.
  • the second strand was synthesized using E. coli DNA polymerase I.
  • Sall linkers were set up on the double-stranded cDNA with the aid of the enzyme T4-DNA ligase.
  • the commercially available plasmid pUC9 was linearized with the restriction enzyme Sall. Both DNAs were ligated together and transformed with the hybrid CaCl2-treated, competent cells of the E. coli strain HB101 thus obtained. The cells were plated on LB plates with 100 g / ml A picillin - and incubated overnight at 37 ° C.
  • oligonucleotide probes each comprising 17 bases of the tPA-DNA. They consist of the following sequences:
  • probes were labeled with j - 32p-ATP at the 5 'end. They were then incubated with the prehybridized filters in a solution containing 6 x SET, 0.1% SDS, 5 x Denhardt's and 10% dextran sulfate overnight at 42 ° C with gentle shaking. The filters are then washed several times in 6 x SET / 0.1% SDS at 42 ° C., dried and exposed to an X-ray film. Clones that gave a radioactive response during screening were isolated and grown up. A clone, hereinafter called pUCtPA, contained an approximately 2.1 kb insert which contained the coding region and 5 'and 3' non-coding regions (FIG. 2). Plasmid DNA from pUCtPA was prepared by lysozyme digestion and SDS-alkali treatment of the bacterial culture and subsequent CsCl gradient centrifugation.
  • the starting point was the plasmid pUCtPA described in Example 1. It was cut preparatively with the restriction enzyme Sall. The fragments obtained were separated by gel electrophoresis. The Sall fragment, which contained the DNA sequence encoding tPA, was eluted electrophoretically from the gel. 30 ng of this fragment were ligated at 4 ° C. with 100 ng of the Sall cut, commercially available cloning vector mpl9. The volume of the ligation mixture was 10 ⁇ l. The ligation was terminated by heating at 80 ° C. for ⁇ minutes.
  • the mPl9 plasmid which contained the cDNA of tPA in the orientation that the + strand is the tPA cDNA component of the phage genome when single-stranded M13 phages are formed, was designated as mptPA. 0
  • bacteria of the Sta ⁇ mies JM 101 or cells derived therefrom are transformed with the plasmid mptPA, single-stranded bacteriophages which contain the + strand of the tPA cDNA are released into the medium when these cells multiply.
  • the single-stranded DNA can then be isolated using 15 conventional and widely described methods.
  • oligonucleotide 21-27mer
  • the oligonucleotide was previously phosphorylated using the T polynucleotide kinase
  • the filters were washed at 6 ⁇ SET / 0.1% SDS at a temperature of 55-65 ° C. depending on the base composition and length of the oligonucleotide hybridization sample used. Hybridization was carried out in each case with the oligonucleotide which was used in the corresponding mutagenization batch. Positive clones were made autoradiographically visible. These substitutions had the effect that the tPA cDNA contained in mpl8 now codes for a polypeptide which contains the amino acid motif RGD and three further amino acid substitutions at one or more locations, the total number of amino acids of these polypeptides in each case being 527.
  • the mptPADNA described in Example 2 was generated using the oligonucleotides
  • This mutated mptPADNA was the starting point for the following examples 3.1 to 3.13.
  • the washing temperature was 60 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the washing temperature was 62 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD2. 10
  • the washing temperature was 60 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD3. 20th
  • the washing temperature was 60 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD4. 30
  • the washing temperature was 60 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD6.
  • the washing temperature was 65 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD7.
  • the washing temperature was 61 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD10.
  • the washing temperature was 65 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGDll. 10
  • the washing temperature was 55 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGDl2. 10
  • the washing temperature was 60 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGDl3. 20th
  • the washing temperature was 55 ° C in 6xSET / 0.1% SDS.
  • the resulting positive clones were named mptPA-RGD14. 30
  • DNA of the monkey virus SV40 was cut with the restriction enzymes Ba HI and Bell and the 0.24 kb fragment was prepared by gel electrophoresis (Fig. 5). The ends were filled with the Klenow fragment of the DNA polymerasel in the presence of the four deoxynucleotide triphosphates dATP, dCTP, dGTP and dTTP. Xhol linkers were then ligated.
  • the commercially available vector pUCl ⁇ was linearized with the enzyme Smal 1. Then Xhol linkers were also used. DNA of this vector (“pUCl ⁇ Xho") was inerted with Xhol 1, treated with alkaline phosphatase and ligated with the 0.24 kb XhoI-SV40 fragment (see above). PSVpA was created. pSVpA DNA was preparatively cleaved with Xhol and incubated as * above with Klenow polymerase in the presence of the four dNTPs. The 0.24 kb fragment was gel isolated.
  • the eukaryotic expression vector CL28XhoBPV created by ligation of CL28X and pB2-2 (according to Reddy et al. 1987, DNA 6, 461-72), was partially cut with the restriction enzyme Xbal, ie it was incubated for a limited time so that molecules arose that were split at only one of the two Xbal recognition sequences, i.e. linearized (Fig. 6). The approach was then implemented with Klenow polymerase and dNTPs as described. The linear molecules were then isolated by gel electrophoresis.
  • the linear pCL28XhoBPV fragments were then ligated with the pretreated 0.24 kb fragment from SV40. After transformation and screening of minilysates, a clone was isolated which carried the SV40 fragment in the former Xbal site approximately 0.15 kB 3 'to the Xhol site; this DNA (“pCL28XhoBPV-SVpolyA") carried the SV40 transcription stop signals of the "early" genes.
  • Plasmid DNA from pCL28XhoBPV-SVpolyA was linearized with the restriction enzyme Xhol and treated with alkaline phosphatase.
  • mptPARGDl-15 was cleaved with the restriction enzyme Sall and the 2.1 kb fragment was isolated. Both fragments were linked together using T4 ligase. After transformation and minilysates, a clone was isolated which contained the mutated tPA DNA simply and in the correct orientation: pCL28BPV-tPA-RGDl-15.
  • 25 BPV genomes contain, to recognize as collections transformed cells, so-called foci. .
  • Foci expressing the tPA muteins described above were identified by a casein agar overlay (see below). After 2-3 h incubation at 37 ° C; 7% C0 2 were in the cloudy casein agar lysis yards on the
  • the cell lines were kept in serum-free DMEM after reaching confluence.
  • the tPA mutein from the serum-free cell culture supernatant obtained in this way can now be characterized and purified.
  • the cells are washed twice in 60 mm petri dishes with serum-free medium. Then 2 ml of "overlay agarose" are carefully pipetted into the petri dishes. The petri dishes are left to cool and solidify the agarose at room temperature. It is then incubated for 2-3 hours in an incubator at 37 ° C. with the addition of 7% CO 2 and the size and number of the lysis yards are determined.
  • the tPA mutein was isolated from the serum-free cell culture supernatant obtained according to Example 5 by affinity chromatography on Erythrina trypsin inhibitor Sepharose (ETI-Sepharose, 1 cm x 3 cm). To produce the affinity matrix, 5 mg of ETI per 1 ml of CNBr-activated Sepharose 4B were coupled. The gel material was equilibrated with 20 mM Na phosphate, 0.15 M NaCl, 0.01% ⁇ Tween 80, pH 7.0 before applying the cell supernatant. After application, the gel material was treated with the same buffer in order to remove non-specifically bound material.
  • ETI-Sepharose Erythrina trypsin inhibitor Sepharose
  • the specifically bound mutein was then desorbed by elution with 0.1 M glycine, 0.1 M arginine / HCl, 0.01% ⁇ Tween 80, pH 3.0.
  • the eluate was combined and adjusted to pH 5.0 with 0.1 M sodium hydroxide solution.
  • the following polypeptides were obtained, which differ as follows from the tPA shown in Fig. La-d:
  • the numerals denote the amino acid positions in which the polypeptide differs from the tPA shown in Fig. La-d, while the letter stands for the 20 amino acid, which is in the mutein at the position indicated by the digit.
  • the oligosaccharide residues contain ⁇ -linked galactose residues which, according to 40 Fig. 8, are linked to ⁇ -linked subterminal galactose residues.
  • the ⁇ -galactose residues are preferably localized on the galactose ( T_ (numbering of the sugar residues see Fig. 8).
  • the other subterminal galactose residues are either substituted by sialic acid or other ⁇ -linked galactose.

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Description

tPA-ähnliche Polypeptide, ihre Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue tPA-ähnliche Polypeptide mit Plas inogenaktivatoraktivität, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
Der humane, gereifte Gewebe-Plasminogeπaktivator (tPA) ist ein Polypeptid aus 527 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 68 kD (Pennica et al. 1983, Nature 301, 214 - 221 und Ny et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 5355-5359) (vgl. Abb. la-lc). Das Molekül enthält mehrere distinkte Regionen, sog. Domänen, denen verschiedene Funktionen zugeordnet werden. Der N-Terminus wird durch eine Finger-Region gebildet, die dem Fibronektin homolog ist. Anschließend folgt eine Region, die Ähnlichkeit mit mehreren Wachstumsfaktoren besitzt. Im Anschluß daran folgen zwei Kringel-Domänen. Nach einer Spaltstelle, an der das einkettige Molekül in zwei Ketten gespalten werden kann, schließt sich die Protease-Do äne an; diese enthält das aktive Zentrum und besitzt Homologie zu anderen Serin-Proteasen.
Mehrere Eigenschaften machen den Gewebe-Plasminogenaktivator zu einem interessanten Molekül: tPA besitzt eine starke Affinität zu Fibrin, die Plasminogen-Aktivierung ist Fibrin-abhängig; als Protease spaltet tPA Plasminogen zu Plasmin, das wiederum Fibrin zu Spaltprodukten abbaut. tPA ist durch Plasminogenaktivator-Inhibitoren hemmbar. Ferner hat tPA eine relativ kurze Halbwertzeit; das Molekül wird in der Leber rasch abgebaut.
Diese Faktoren bewirken, daß tPA in vivo spezifisch an Blutgerinnseln Plasminogen zu Plasmin aktiviert und durch Abbau des Fibrins die Wieder¬ herstellung des Gefäßstromes bewirkt. tPA kann deshalb in der fibrinolytischen Therapie, z. B. nach einem Herzinfarkt, eingesetzt werden.
Es wurde nun gefunden, daß tPA-ähnliche Polypeptide, die die Aminosäure¬ sequenz des tPA oder davon abgeleitete Sequenzen aufweisen, worin jedoch 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind, verbesserte Eigen¬ schaften besitzen.
unter vom tPA abgeleiteten Sequenzen sind zu verstehen natürlich vor¬ kommende Allelvarianten und synthetische Varianten, die in ihrer Primär¬ struktur zu über 90 % mit dem natürlichen tPÄ übereinstimmen und Plasminogen-aktivierende Wirkung besitzen. Die neuen Polypeptide enthalten vorzugsweise ein oder mehrere RGD
(= Arg-Gly-Asp) Tripeptide anstelle von jeweils einem Tripeptid im tPA bei unveränderter Gesamtlänge des Moleküls.
Bevorzugt sind insbesondere solche Polypeptide, die das Tripeptid RGD in der Stellung 130-132 enthalten. Weiter sind bevorzugt Polypeptide, die zusätzlich zur RGD-Sequenz in Stellung 130-132 ein bis zwei weitere zusätzliche RGD-Tripeptide enthalten.
Die Erfindung betrifft weiter DNA-Sequenzen, die für die mutierten
Polypeptide codieren, sowie Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten.
Die neuen Polypeptide lassen sich gentechnisch nach bekannten Verfahren herstellen. Ausgangspunkt für die hier beschriebenen Konstruktionen ist 5 ein cDNA-Klon, im folgenden pUCtpa genannt, der die codierende Sequenz von tPA und noch 5'- und 3'- nicht translatierte Bereiche* enthält. Nach einer "leader"- und Prosequenz beginnt das reife Protein mit Ser(l) und endet nach Pro(527) .
0 pUCtPA wird wie folgt isoliert: Aus menschlichem Uterus-Gewebe wird RNA isoliert und in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Nach Einsetzen dieser cDNA in den kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor pUC9 wird eine cDNA-Biblϊothek angelegt. Die dabei verwendeten Methoden sind beispiels¬ weise in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSH-press, nachzulesen. Auch 5 das "screening" solcher Genbanken mit radioaktiv markierten Oligonukleo- tidsonden ist inzwischen eine vielfach verwendete und beschriebene Methode. Nach diesem Verfahren kann ein cDNA-Klon, der die kodierende Region und angrenzende Bereiche enthält, isoliert werden.
0 Teile der DNA-Sequenz von PUC9tPA sind mit Hilfe von Restriktionsenzymen leicht zugänglich. Diese Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten können benutzt werden, um die DNA-Sequenzen, die für die neuen Polypeptide codieren, zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen 5 DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide pBR322, pUCS oder 9, pUCl8 oder 19, Ml3mpl8 oder Ml3mpl9 erfolgt in bekannter Weise. Auch. önnen die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die der Proteine ermöglichen. Die Transformation bzw. Transfektion der so erhaltenen Hybridp.las ide in geeignete Wirtsorganismen ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben. Auch können die Hybrid¬ plasmide mit entsprechenden Signalsequeπzen versehen werden, die die Sekretion der Polypeptide ins Medium erlauben. Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die mutierte tPA-cDNA, unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promoters setzt. Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons und der Leader-/Prosequenz des tPA-Gens. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vorteilhaft sind z.B. die Integration und Expression des Fremd¬ gens auf der Basis des Rinderpapillo -Virus. In Verbindung mit prokaryon- tischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz codieren, ist der Aufbau sog. "shuttle"-Vektoren möglich. Konstruktion und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryonten- zellen, z.B. in die Maus-Fibroblastenzellinie C127. Es ist selbstverständ¬ lich, daß auch andere Zellsysteme, z.B. Hefe, Insektenzellen und andere Säugerzellen, wie z.B. CHO-, L- und 293-Zellen, für die Expression verwendet werden können.
Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu sezernieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre "Produkte posttrans- lational zu modifizieren.
So erhält der Gewebe-Plas inogenaktivator bei der Expression in Eukaryontenzellen noch Glykosidseitenketten an den Aminosäuren 117, 184 und 448 (Asn) . Bakterien sind nicht in der Lage, Glycosidseitenketten zu synthetisieren. Die meisten in Bakterien expri ierten eukaryontischen Proteine, wie auch tPA und die von ihr erfindungsgemäß abgeleiteten Polypeptide, fallen in der Zelle als denaturierte Einschlußkörper an und müssen proteinchemisch renaturiert werden. Ferner sind Bakterien oft nicht in der Lage, die Initiatoraminosäure Methionin vom fertigen Protein abzuspalten. Durch die Verwendung von Sekretionssystemen können diese Schwierigkeiten umgangen werden.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich, andere DNA-Sequenzen, z.B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschied- 1icher DNA-Sequenz für die Expression der neuen Polypeptide zu benutzen.
Die Reinigung der neuen Polypeptide erfolgt durch deren Abtrennung aus dem Kulturmedium durch Affinitäts- und Ionenaustausch-Chromatographie nach bekannten Verfahren.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Polypeptide besitzen in mindestens einem der im folgenden genannten Punkte verbesserte Eigenschaften: Gerinnsel- spezifität, Halbwertzeit, Inhibitorbindung, proteolytische Aktivität und können daher zur Thrombolyse eingesetzt werden. Sie zeigen dabei ver¬ besserte Eigenschaften gegenüber humanem Gewebe-Plasminogenaktivator. Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel, die mindestens eines der neuen Polypeptide enthalten, ggf. in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel. Die Arzneimittel können auch Kombinationen der neuen Proteine mit anderen Fibrinolytika, wie Prourokinase, Urokinase oder Streptokinase oder deren Derivate, sowie mit anderen Pharmaproteinen, z. B. Superoxiddis utase enthalten. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen näher beschrieben.
"für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Maniatis et al., Molecular Cloπing, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, verwiesen.
Beispiel 1
Isolierung eines cDNA-K-lones für humanen Gewebe-Plasminogenaktivator
a) RNA-Präparation
30 g tPA-produzierendes menschliches Uterus-Gewebe wurde in
6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumeitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-
Mercaptoethanol, 0,5 % Sarcosyl im Ultra-Turrax® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer wurden bei 3000 rp abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen über Nacht bei 45.000 rpm sedimentiert. Anschließend wurde die polyA+-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Cellulose abgetrennt.
b) Herstellung der cDNA-Bank
Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (AMV) und oligo(dT)12-18 als Starter wurde die polyA+-RNA in einzelsträngige cDNA umge¬ schrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E. coli- DNA-Polymerase I. An die doppelsträngige cDNA wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase Sall-Linker angesetzt. Das kommerziell erhält¬ liche Plasmid pUC9 wurde mit dem Restriktionsenzym Sall linearisiert. Beide DNAs wurden miteinander ligiert und mit dem so erhaltenen Hybrid CaCl2-behandelte, kompetente Zellen des E. coli-Stammes HB101 trans¬ formiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten mit 100 g/ml A picillin plattiert - und über Nacht bei 37°C inkubiert.
c) Screening der cDNA-Bank
Etwa 500.000 Kolonien wurden auf Nitroceϊlulose-Filter übertragen, Replika-plattiert, mit 0,5 N NaOH/1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2-stündiges Backen bei 80°C fest an den FϊTter gebunden. Die Filter wurden in 6 x SET-Puffer (1 x SET = 0,15 M NaCl, 15mM Tris/HCL pH 7,4, 1 mM EDTA), 0,1 % SDS und 5 x Denhardt's Lösung (100 x Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h, bei 68°C vorhybridisiert (AbSättigung unspezifischer Bindungsstellen für Nukleinsäuren).
Mit Hilfe eines DNA-Synthesizers wurden drei Oligonukleotid-Sonden, die jeweils 17 Basen der tPA-DNA umfassen, hergestellt. Sie bestehen aus folgenden Sequenzen:
5' TGCAGATCACTTGGTAA 3' 5' CCAGGCCCAGTGCCTGG 3' 5' TCCAGTCCGGCAGCTGC 3'
Diese Sonden wurden am 5'-Ende mit j--32p-ATP markiert. Sie wurden dann mit den vorhybridisierten Filtern in einer Lösung, die 6 x SET, 0,1 % SDS, 5 x Denhardt's und 10 % Dextransulfat enthält, über Nacht bei 42°C unter leichtem Schütteln iπkubiert. Die Filter werden danach mehrfach in 6 x SET/0, 1 % SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einem Röntgenfilm exponiert. Klone, die beim Screening eine radio- aktive Antwort gaben, wurden isoliert und weitergezüchtet. Ein Klon, im folgenden pUCtPA genannt, enthielt ein etwa 2,1 kb großes Insert, das die codierende Region, sowie 5'- und 3'-nicht-codierende Bereiche enthielt (Abb. 2). Plas id-DNA von pUCtPA wurde durch Lysozym-Auf- schluß und SDS-Alkali-Behandlung der Bakterienkultur sowie anschließende CsCl-Gradientenzentrifugation präpariert.
Beispiel 2
Herstellung von einzelsträngiger tPA-kodierender DNA
Ausgangspunkt war das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pUCtPA. Es wurde präparativ mit dem Restriktionsenzym Sall geschnitten. Die erhaltenen Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Sall-Fragment, das die tPA-kodierende DNA-Sequenz enthielt, wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. 30 ng dieses Fragmentes wurden bei 4°C mit 100 ng des Sall geschnittenen, kommerziell erhältlichen Klonierungsvektors mpl9 ligiert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 μl . Die Ligation wurde durch δminütiges Erhitzen auf 80°C beendet.
1/10 Volumen dieses Ligationsansatzes wurde zur Transformation von 100 μl kompetenten JM 101 Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformationsansatz 60 μl 0,2 MIPTG-Lösung und 120 μl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT-Agar- platten ausplattiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich. Klone, die die tPA-cDNA enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden. Mittels DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-67) wurde die Orientierung der 5 tPA cDNA innerhalb des Plasmids festgestellt.
Das mPl9 Plasmid, welches die cDNA von tPA in der Orientierung enthielt, daß bei der Bildung einzelsträngiger M13 Phagen der +-Strang der tPA cDNA-Bestandteil des Phagengenoms ist, wurde als mptPA bezeichnet. 0
Werden nun Bakterien des Staπmies JM 101 oder davon abgeleitete Zellen mit dem Plasmid mptPA transformiert, so werden bei der Vermehrung dieser Zellen einzelsträngige Bakteriophagen in das Medium entlassen, die den +-Strang der tPA cDNA enthalten. Die einzelsträngige DNA kann dann mit 15 herkömmlichen und vielfach beschriebenen Methoden isoliert werden.
Im übrigen wurden, falls nicht besonders beschrieben, die Empfehlungen der Hersteller der Enzyme und Plasmide für die Enzy spaituπg und Isolierung der Plasmide befolgt. 0
Beispiel 3
Einführung von Substitutionen in die cDNA von tPA
25 Im folgenden werden Substitutionen beschrieben, die alle bewirken, daß nach Expression der substituierten cDNA das Aminosäuremotiv RGD einmal oder mehrmals an unterschiedlichen Stellen des Polypeptids tPA enthalten ist. All diese Polypeptide haben eine Länge von 527 Aminosäuren. Ausgangs¬ punkt für die Substitutionen war das in Beispiel 2 beschriebene mptPA.
30
0,04 pmol der einzelsträngigen mptPA wurden mit 0,5 pmol eines Oligo- nukleotids (21-27mer), dessen Sequenz bis auf 1-3 Basenaustausche dem zu verändernden Bereich der mptPA DNA komplementär war, umgesetzt. Das Oligo- nukleotid wurde vorher mit Hilfe der T Polynukleotidkinase phosphory-
35 liert. Ein typischer Mutagenisierungsansatz sah wie folgt aus:
einzelsträngige mptPA DNA 1 μl (0,04 pmol) kinasiertes Oligonukleotid
(inklusive ATP aus Kinasierungsreaktion) 1 μl (0,5 pmol)
40 10 x Ligase-Puffer 5 μl
1 mM dNTPs 2,5 μl (50 μM Endkonzentration)
1 mM ATP 4 μl (100 μM Endkonzentration)
H20 36,5 μl Der Mutagenisierungsansatz wurde 15 min bei 37°C inkubiert, dann auf Raum¬ temperatur abgekühlt und schließlich mit 1 Einheit Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei Raum¬ temperatur wurden 200 Einheiten T -Ligase (Biolabs) zugegeben. Der Ansatz wurde danach 16 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 5 μl dieses Ansatzes zur Transformation von Komponenten JM 101 Zellen verwendet. Die daraus resultierenden Phagen-Plaques wurden auf Nitrozellulose übertragen. Danach wurden die Filter 5 min in 5XSSC gewaschen, an der Luft getrocknet und 2 h bei 80°C "gebacken". Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Waschen der Filter erfolgte bei 6xSET/0, 1 % SDS bei einer Temperatur von 55-65°C in Abhängig¬ keit von der Basenzusammensetzung und Länge der verwendeten Oligo- nukleotid-Hybridisierungsprobe. Hybridisiert wurde jeweils mit dem Oligo- nukleotid, das in dem entsprechenden Mutagenisierungsansatz eingesetzt wurde. Positive Klone wurden autoradiographisch sichtbar gemacht. Diese Substitutionen bewirkten, daß die in mpl8 enthaltene tPA-cDNA nun für ein Polypeptid kodiert, das an einer oder mehreren Stellen das Aminosäuremotiv RGD sowie drei weitere Aminosäuresubstitutionen enthält, wobei die Gesamt¬ zahl der Aminosäuren dieser Polypeptide jeweils 527 ist.
Die in Beispiel 2 beschriebene mptPADNA wurde mit Hilfe der Oligonukleotide
CB 5' AGCAGTCACT GGATCCCTCA GAGC 3' CXm 5' ACGTGGCCCG GGTATCTATT TC 3'
CA 5' AACTTTTGAC GGGCCCTGAG TGGCA 3' cxh 5' CAGGCCGCAG CTCGAGCAGG AGGG 3'
derart mutiert, daß zwischen den einzelnen Proteindomänen-kodierenden DNA-Abschnitten zusätzliche Erkennungssteilen für das Restriktionsenzym generiert wurden. Diese Erkennungsstellen erlauben das gezielte Heraus¬ schneiden der einzelnen Proteindomänen-kodierenden DNA-Abschnitte. Diese derart mutierte mptPADNA war der Ausgangspunkt für die folgenden Beispiele 3.1 bis 3.13.
Beispiel 3.1
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet:
5' TCTGCGTTTTATCACCTCTGCAGAT 3'
Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6xSET/0, 1 % SDS.
Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDl bezeichnet. Beispiel 3.2
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 5
5' CCACCCGGCTCGCCTCTGAGCACA 3'
Die Waschtemperatur betrug 62°C in 6xSET/0,l % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD2 bezeichnet. 10
Beispiel 3.3
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 15
5' ACCAGCAATAATCCCCCCGGTTGCT 3'
Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD3 bezeichnet. 20
Beispiel 3.4
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 25
5' CTGTGCTCCAATCGCCCCTGTAGC 3'
Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD4 bezeichnet. 30
Beispiel 3.5
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 35
5' GGTGCACTCGTCGCCTCTCTCCGCTG 3'
Die Waschtemperatur betrug 64°C in δxSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD5 bezeichnet. 40 Be i spiel 3.6
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet:
5' GATGCCGTCTCCCCTCCGCCCGC 3'
Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD6 bezeichnet.
Beispiel 3.7
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet:
5' CAGGAACCGATCTCCGCGCGACCTCC 3'
Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGD7 bezeichnet.
Beispiel 3.8
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet:
5' GCTCTCCTGGTCACCGCGGGACGAA 3'
Die Waschtemperatur betrug 61°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDlO bezeichnet.
Beispiel 3.9
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet:
5' GCTGCAGGTCCCCCCGGGGAAGGCA 3'
Die Waschtemperatur betrug 65°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDll bezeichnet. 10
Be ispi el 3. 10
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 5
5' AGTGTCTCCATTACACAGCATG 3'
Die Waschtemperatur betrug 55°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDl2 bezeichnet. 10
Beispiel 3.11
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 15
5' TGGGGCCCGTCGCCCCGAGTGTC 3'
Die Waschtemperatur betrug 60°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDl3 bezeichnet. 20
Beispiel 3.12
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 25
5' CGAATCGCCCCGGCAGGCGTC 3'
Die Waschtemperatur betrug 55°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDl4 bezeichnet. 30
Beispiel 3.13
Zur Mutagenisierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde ein Oligo- nukleotid mit folgender Sequenz verwendet: 35
5' GGTCGCATGTCGCCACGAATCCAG 3'
Die Waschtemperatur betrug 58°C in 6xSET/0, 1 % SDS. Die resultierenden positiven Klone wurden als mptPA-RGDlδ bezeichnet. 40 Be i spiel 4
Konstruktion von Vektoren für die Expression der modifizierten tPA-DNA
DNA des Affenvirus SV40 wurde mit den Restriktionsenzymen Ba HI und Bell geschnitten und das 0,24 kb-Fragment gelelektrophoretisch präpariert (Abb. 5). Die Enden wurden in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtri- phosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerasel aufgefüllt. Anschließend wurden Xhol-Linker anligiert.
Parallel wurde der kommerziell erhältliche Vektor pUClδ mit dem Enzym Smal 1inearisiert. Dann wurden ebenfalls Xhol-Linker angesetzt. DNA dieses Vektors ("pUClβXho") wurde mit Xhol 1 inearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem 0,24 kb XhoI-SV40-Fragment (s. o.) ligiert. Es entstand pSVpA. pSVpA-DNA wurde präparativ mit Xhol gespalten und wie* oben mit Klenow- Polymerase in Gegenwart der vier dNTPs inkubiert. Das 0,24 kb-Fragment wurde Gel-isoliert. Gleichzeitig wurde der Eukaryonten-Expressionsvektor CL28XhoBPV, entstanden durch Ligation von CL28X und pB2-2 (nach Reddy et al. 1987, DNA 6, 461-72), partiell mit dem Restriktionsenzym Xbal geschnitten, d. h. es wurde zeitlich derart limitiert inkubiert, daß Moleküle entstanden, die nur an einer der beiden Xbal-Erkennungssequenzen gespalten, also linearisiert sind (Abb. 6). Der Ansatz wurde dann wie beschrieben mit Klenow-Polymerase und dNTPs umgesetzt. Die linearen Moleküle wurden anschließend durch Gelelektrophorese isoliert.
Es erfolgte dann die Ligation der linearen pCL28XhoBPV-Fragmente mit dem vorbehandelten 0,24 kb-Fragment aus SV40. Nach Transformation und Screening von Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der das SV40-Fragment in der etwa 0,15 kB 3'-wärts der Xhol-Stelle gelegenen vormaligen Xbal-Stelle trug; diese DNA ("pCL28XhoBPV-SVpolyA" ) trug die SV40-Transkriptionsstopsignale der "frühen" Gene.
Plasmid-DNA von pCL28XhoBPV-SVpolyA wurde mit dem Restriktionsenzym Xhol linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Gleichzeitig wurde mptPARGDl-15 mit dem Restriktionsenzym Sall gespalten und das 2, lkb große Fragment isoliert. Beide Fragmente wurden mittels T4-Ligase miteinander verbunden. Nach Transformation und Minilysaten wurde ein Klon isoliert, der die mutierte tPA-DNA einfach und in der korrekten Orientierung enthielt: pCL28BPV-tPA-RGDl-15. Beispiel 5
Transfektϊoπ und Etablierung von Zellinien
5 C127I Zellen (J. Virol. 26 (1978) 292; ATCC catalogue of cell lines and hybrido as 5th edition, 1985, pl42) wurden mit BPV-Expressionsplasmiden transfiziert mit der Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode (Virology 52 (1973)/ 456, DNA cloning; volume II; ed. D.M.Glover IRL Press, Seiten 1 3ff und 213 (1985)).
10 5 x 105 cl27l-Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) + 10 % FCS (Foetales Kalbsserum) in 60 mm Petrischalen eingesät. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt auf MEM (Modified Eagles Medium) mit 25mM Hepes + 10 % FCS. Mit 10 μg CsCl-gereinigter Plasmid DNA wurde ein Ca-Phosphat-Copräzipitat gebildet, welches vorsichtig auf die Cl27l-Zellen
15 aufgebracht wurde. Die Zellen wurden 4 h bei 37°C; 7 % C02 inkubiert. Durch eine anschließende Glycerin-Schock-Behandlung wurde die Effizienz der Transfektion erheblich gesteigert. Hierzu wurde 4 h nach Aufbringen des Präzipitates das Medium von den Zellen abgezogen. Die Zellen wurden 3 min. mit je 2 ml 15 % Glycerin/HBS (DNA cloning Vol. II, Seite 152) pro
20 60 mm Petrischale bei Raumtemperatur inkubiert. Die Glycerin/HBS-Lösung wurde abgezogen, der Zellrasen mit 3 ml DMEM + 10 % FCS gewaschen. Die Zellen wurden mit DMEM + 10 % FCS bei 37°C; 7 % C02 inkubiert. Dreimal in der Woche wurde das DMEM + 10 % FCS abgezogen und durch frisches ersetzt. Nach 2-3 Wochen waren transfizierte Zellen, die das
25 BPV-Genom enthalten, als Ansammlungen transformierte Zellen, sogenannte Foci, zu erkennen. .
Foci, die die oben beschriebenen tPA-Muteine exprimieren, wurden durch einen Casein-Agar-Overlay (siehe unten) identifiziert. Nach 2-3 h Inkubation bei 37°C; 7 % C02 waren im trüben Casein-Agar Lysehöfe an den
30 Stellen zu erkennen, an denen sich tPA-exprimierende Zellen befinden. Nach Entfernen des Casein-Agar wurden die sich an diesen Stellen befindenden Zellen nach der "cloning-cylinder"-Methode isoliert (DNA cloning Vol. II, S. 220). Die erhaltenen Zellinien wurden anschließend mit Standardmethoden in DMEM + 10 % FCS hochgezüchtet.
35
Zur Produktion wurden die Zellinien nach Erreichen der Konfluenz in serumfreiem DMEM gehalten. Das tPA-Mutein aus dem so erhaltenen serum- freieπ Zellkulturüberstand kann nun charakterisiert und aufgereinigt werden.
40 Für den oben erwähnten Agar Overlay Test werden folgende Lösungen benötigt:
Overlay-Agarose
1) 8 % Magermilchlösung in H20 werden 30 min bei 100°C gekocht und anschließend im 37°C Wasserbad abgekühlt.
2) Eine 2 %ige Lösung von Low-melting Agarose in PBS wird nach Autoklavieren im 37°C Wasserbad abgekühlt. Anschließend wird im Verhältnis 1:1 doppelt konzentriertes DMEM zugegeben.
3) 0,64 mg Plasminogen wird in 1 ml H20 gelöst. Durch Zusam enpipettieren von 16 ml Lösung 2, 4 ml Lösung 1 und 0,4 ml Plasminogen wird die Overlay Agarose hergestellt. Diese wird nach Mischen im 37°C Wasserbad gehalten.
Zur Durchführung des Tests werden die Zellen in 60 mm Petrischalen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen. Anschließend werden je 2 ml "Overlay- Agarose" vorsichtig in die Petrischalen pipettiert. Die Petrischalen werden zum Abkühlen und Erstarren der Agarose bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird 2-3 h im Brutschrank bei 37°C unter Zugabe von 7 % C02 inkubiert und die Größe und Anzahl der Lysehöfe bestimmt.
Beispiel 6
Isolierung eines neuen Polypeptids
Aus dem gemäß Beispiel 5 erhaltenen serumfreien Zellkulturüberstand wurde das tPA-Mutein nach Sterilfiltration und Zugabe von 0,01 % ©Tween 80 durch eine Affinitätschromatographie an Erythrina-Trypsin-Inhibitor-Sepharose (ETI-Sepharose, 1 cm x 3 cm) isoliert. Zur Herstellung der Affinitäts¬ matrix wurden 5 mg ETI pro 1 ml CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt. Das Gelmaterial wurde vor dem Auftragen des Zellüberstands mit 20 mM Na-phosphat, 0,15 M NaCl, 0,01 % ©Tween 80, pH 7,0 äquilibriert. Nach dem Auftragen wurde das Gelmaterial mit demselben Puffer behandelt, um un¬ spezifisch gebundenes Material zu entfernen. Die Desorption des spezifisch gebundenen Muteins erfolgte anschließend durch Elution mit 0, 1 M Glycin, 0,1 M Arginin/HCl, 0,01 % ©Tween 80, pH 3,0. Das Eluat wurde vereinigt und mit 0,1 M Natronlauge auf pH 5,0 eingestellt. So wurden folgende Polypeptide erhalten, die sich wie folgt von dem in Abb. la-d dargestellten tPA unterscheiden:
6.01 8G, 9D, 46G, 177S, 263S
56.02 28G, 29D, 46G, 177S, 263S
6.03 31G, 32D, 46G, 177S, 263S
6.04 103D, 46G, 177S, 263S
6.05 109R, 111D, 46G, 177S, 263S
6.06 131G, 46G, 177S, 263S 106.07 301R, 303D, 46G, 177S, 263S
6.08 384G, 385D, 46G, 177S, 263S
6.09 398R, 399G, 46G, 177S, 263S
6.10 458R, 46G, 177S, 263S
6.11 463G, 464D, 46G, 177S, 263S 156.12 475R, 46G, 177S, 263S
6.13 523G, 524D, 46G, 177S, 263S
Die Ziffern bezeichnen die Aminosäurepositionen, in der das Polypeptid von dem in Abb. la-d gezeigten tPA abweicht, während der Buchstabe für die 20 Aminosäure steht, die in dem Mutein an der mit der vorgestellten Ziffer bezeichneten Stelle steht.
Beispiel 7
25 Charakterisierung des Oligosaccharid-Anteils
5 - 10 μg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Muteins wurden durch SDS-Gel- elektrophorese aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Nach dem Absättigen mit PBS-Puffer (2 mM Phosphat,
30 150 mM NaCl, pH 7,4), der 0,1 % ©Tween 20, pH 7,4 enthielt, wurde die Membran 2 h mit an Peroxidase gekoppeltem Lektin von Griffonia Si plicifolia inkubiert. Nach dem Entfernen ungebundenen Materials mit Hilfe von TBS-Puffer (10 M Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) wurde die Nitro¬ zellulose 5 - 10 min in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,02 % H202 und 0,5 mg/ml
354-Chlor-l-naphthol inkubiert. Positive Reaktionen wurden durch Blaufärbung der Proteinbande innerhalb von 5 min sichtbar. Die Reaktion wurde dann durch Transferieren der Nitrozellulose-Membran in Wasser gestoppt.
Die Oligosaccharid-Reste enthalten α-gebundene Galaktose-Reste, die gemäß 40 Abb. 8 mit ß-gebundenen subterminalen Galaktose-Resten verknüpft sind. Dabei sind die α-Galaktose-Reste bevorzugt an der Galaktose (T_ (Numerie¬ rung der Zuckerreste siehe Abb. 8) lokalisiert. Die anderen subterminalen Galaktose-Reste sind entweder durch Sialinsäure oder weitere α-gebundene Galaktose substituiert.

Claims

Patentansprüche
1. tPA-ähnliche Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Amino¬ säuresequenz des tPA oder davon abgeleitete Sequenzen aufweisen, worin jedoch 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind.
2. DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.
3. Vektoren, die Gensequenzen enthalten, die für die Polypeptide gemäß Anspruch 1 kodieren.
4. Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Peptidsequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wirtsorganismus ein Gen zur Expression bringt, das für die Peptidsequenzen nach Anspruch 1 kodiert.
5. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel .
6. Arzneimittel nach Anspruch 5, enthaltend die Kombination aus mindestens einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 und einem anderen Fibrinolytikum.
7. Verfahren zur Herstellung von tPA-ähnlichen Polypeptiden, die die
Aminosäuresequenz des tPA oder davon abgeleitete Sequenzen aufweisen, worin jedoch 1-6 Tripeptide durch das Tripeptid RGD ersetzt sind, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Wirtsorganismus ein Gen zur Expression bringt, das für die Peptidsequenzen kodiert.
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