JPH0335799A - 腸内細菌に対する抗体の製造方法、新規細胞系および腸内細菌によつて惹起される感染を処理するための医薬 - Google Patents
腸内細菌に対する抗体の製造方法、新規細胞系および腸内細菌によつて惹起される感染を処理するための医薬Info
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- JPH0335799A JPH0335799A JP2062857A JP6285790A JPH0335799A JP H0335799 A JPH0335799 A JP H0335799A JP 2062857 A JP2062857 A JP 2062857A JP 6285790 A JP6285790 A JP 6285790A JP H0335799 A JPH0335799 A JP H0335799A
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- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
用
〔産業上の利用分野〕
本発明は、細胞糸ＥＣＡＣＣ８９０６０５１０か６゜
２゜
１゜
ヨヒＲＣＡＣＣ８９０５０６１１から得られる、腸内ａ
ｌｌに対する特異的抗体の製造方法、新規細胞系および
腸内細菌によって惹起される感染をＪＩＢ１理するため
の医薬に関する。
ｌｌに対する特異的抗体の製造方法、新規細胞系および
腸内細菌によって惹起される感染をＪＩＢ１理するため
の医薬に関する。
金包含する腸内細菌科には、大ｊｙｋ菌、エルウィニア
、セラチア（８ｅｒｒａＬｉａ） 、プロチウム（Ｐｒ
ｏ ｔ＋ｅｕａ ） 、サルモネラ訃よび赤痢阿のよう
な若干の病原性微生物がまとめられている。これらａ生
物にょシ惹起される感染は、殊に臨床領域にかいて非常
に強く増大され、さらにこれらの菌株は抗生物質に対し
て抵抗性を発揮するので、感染を処理するのは極めて困
難である。腸内細１感染は、一方では上行尿路ｔ”襲い
、他方では冑１腸系を襲う。殊にネズミチフスｗ１（食
中毒に対する代表的な菌株）によって、多数の死亡９１
１が惹起される。従って、これら微生物に対して有効な
抗血、清を見出すことが試みられた。
、セラチア（８ｅｒｒａＬｉａ） 、プロチウム（Ｐｒ
ｏ ｔ＋ｅｕａ ） 、サルモネラ訃よび赤痢阿のよう
な若干の病原性微生物がまとめられている。これらａ生
物にょシ惹起される感染は、殊に臨床領域にかいて非常
に強く増大され、さらにこれらの菌株は抗生物質に対し
て抵抗性を発揮するので、感染を処理するのは極めて困
難である。腸内細１感染は、一方では上行尿路ｔ”襲い
、他方では冑１腸系を襲う。殊にネズミチフスｗ１（食
中毒に対する代表的な菌株）によって、多数の死亡９１
１が惹起される。従って、これら微生物に対して有効な
抗血、清を見出すことが試みられた。
このための出発点は、すべての場内細菌に共通な、腸内
ａ菌共通抗原（ＢＣＡ）と呼ばれる抗原に出現する。完
全な微生物またはこの抗原で動物を免疫化し、引き続き
直接にポリクローナルモ 抗体または融合後にＩノクローナル抗体を得ることが試
みられた。しかし、こうして得られた抗体は、腸内１ｆ
Ｂ＃ｉｇ染に対する保護を示さなかった。それで、・Ｆ
ＦＪＪＳミクロパイオロゾイ・レタース（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ）’ 、第２７巻（１
９８５年）、第６０７頁〜第６１２頁には、家兎から得
た抗生ＣＡ血清はマウスに訃ける感染に対する保護を提
供しないことが記載されている。さらに、１イン７エク
シヨン・エンド・イムニテイ（Ｉｎｆｅｃｌｉｃｎ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｌ ｂｙ）” 、第２巻（１９７０−
ｆ−）、第１７５頁〜第１８２頁には、抗原の製造が記
載されているが、この抗原は極めて特定の個々の微生物
の共通抗原と反応するにすぎない。
ａ菌共通抗原（ＢＣＡ）と呼ばれる抗原に出現する。完
全な微生物またはこの抗原で動物を免疫化し、引き続き
直接にポリクローナルモ 抗体または融合後にＩノクローナル抗体を得ることが試
みられた。しかし、こうして得られた抗体は、腸内１ｆ
Ｂ＃ｉｇ染に対する保護を示さなかった。それで、・Ｆ
ＦＪＪＳミクロパイオロゾイ・レタース（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ）’ 、第２７巻（１
９８５年）、第６０７頁〜第６１２頁には、家兎から得
た抗生ＣＡ血清はマウスに訃ける感染に対する保護を提
供しないことが記載されている。さらに、１イン７エク
シヨン・エンド・イムニテイ（Ｉｎｆｅｃｌｉｃｎ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｌ ｂｙ）” 、第２巻（１９７０−
ｆ−）、第１７５頁〜第１８２頁には、抗原の製造が記
載されているが、この抗原は極めて特定の個々の微生物
の共通抗原と反応するにすぎない。
従って本発明の課題は、腸内細菌、殊にこの科の病原性
属に対する抗体を利用することである。さらに腸内細菌
感染の処理訃よび検出方法を提供することも本発明の課
題であった。
属に対する抗体を利用することである。さらに腸内細菌
感染の処理訃よび検出方法を提供することも本発明の課
題であった。
この課題は、腸内細歯に対する抗体を製造するため、腸
内細菌感染の立征された供血者の血液から、リンパ球を
得、該リンパ球を不死化し、所望の活性を有する抗体を
生産する細胞を選択し、培養し、これから抗体を得るこ
と’ｉｔ＃ｔａとする方法によって解決される。
内細菌感染の立征された供血者の血液から、リンパ球を
得、該リンパ球を不死化し、所望の活性を有する抗体を
生産する細胞を選択し、培養し、これから抗体を得るこ
と’ｉｔ＃ｔａとする方法によって解決される。
Ｓ異的なことに、適当なヒトのリンパ球を使用すること
によって、殊に腸内ｌａ閑に結合することのできる抗体
を生産することに成功した。
によって、殊に腸内ｌａ閑に結合することのできる抗体
を生産することに成功した。
骨
ヒト０Ｂ−ｙンパ球が〆髄腫細胞と融合することによっ
て得られた本発明による細胞系は、ＥＣＡとの特異的結
合を示すだけでなく、意外なことに腸内細菌科の微生物
にも結合する。
て得られた本発明による細胞系は、ＥＣＡとの特異的結
合を示すだけでなく、意外なことに腸内細菌科の微生物
にも結合する。
腸内細菌に対する抗体の製造のためには、腸内細菌感染
の検出された罹病者の血液から公知方法に従ってＢ−リ
ンパ球を得る０次にリンパ球を不死化する。不死化のた
めには、檀々の方法が利用される。ヒトのリンパ球を、
ケラ−（ＫＯｈｌｅｒ） ＆よびミルスタイン（Ｍｌ
ｌａ ｂｅｉｎ）の方法に従って、ヒトまたはマウスの
骨ｔ１暢細胞と融合させることができる。融合のために
は、異檀骨髄噛を使用することもできる。同様にＢ−リ
ンパ球をニジスタイン・パールウィルス（ｇＢＶ）で形
′Ｘ転換することも可能である。さらに、西ドイツ国特
許出順公開第６２４５６６５号明細４ｉｔたはヨーロッ
パ特許出ｄ公開第２５６５１２号明細誉に記載された方
法を適用することもできる。この場合、形質転換ＤＮＡ
を含有する細胞下小胞と融合させる。望ましくはＢ−リ
ンパ球をヒトの骨髄細胞系の細胞８ＫＯ−００７（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ ８０５５ ）との融合によって不死化する
。
の検出された罹病者の血液から公知方法に従ってＢ−リ
ンパ球を得る０次にリンパ球を不死化する。不死化のた
めには、檀々の方法が利用される。ヒトのリンパ球を、
ケラ−（ＫＯｈｌｅｒ） ＆よびミルスタイン（Ｍｌ
ｌａ ｂｅｉｎ）の方法に従って、ヒトまたはマウスの
骨ｔ１暢細胞と融合させることができる。融合のために
は、異檀骨髄噛を使用することもできる。同様にＢ−リ
ンパ球をニジスタイン・パールウィルス（ｇＢＶ）で形
′Ｘ転換することも可能である。さらに、西ドイツ国特
許出順公開第６２４５６６５号明細４ｉｔたはヨーロッ
パ特許出ｄ公開第２５６５１２号明細誉に記載された方
法を適用することもできる。この場合、形質転換ＤＮＡ
を含有する細胞下小胞と融合させる。望ましくはＢ−リ
ンパ球をヒトの骨髄細胞系の細胞８ＫＯ−００７（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ ８０５５ ）との融合によって不死化する
。
不死化細胞のうち、所望の活性を有する抗体を生産する
ものが選択される。選択法は、専門家に十分に知られて
かシ、ここで詳細な説明は不要でめる。たとえば腸内細
菌のリポ多糖ＩＩ’によるのが適当である。それという
のもたいていの市場で得られるＬＰ８ ｇ剤は実質的ｌ
のＩｎＣＡ ｋも含有するからである。
ものが選択される。選択法は、専門家に十分に知られて
かシ、ここで詳細な説明は不要でめる。たとえば腸内細
菌のリポ多糖ＩＩ’によるのが適当である。それという
のもたいていの市場で得られるＬＰ８ ｇ剤は実質的ｌ
のＩｎＣＡ ｋも含有するからである。
次に、所望の抗体を生産する細胞を培養し、抗体を自体
公知の方法で得る。
公知の方法で得る。
番号ＥＣＡＣＣ８９０３０５１０（Ｌ ５０ ） ＆よ
び８９０５０５１１ （ｇ２１ ）で寄託された、ＥＣ
Ａとｗｌ＃４的に反応するモノクローナル抗体を生産す
る細胞系も本発明の対象である。
び８９０５０５１１ （ｇ２１ ）で寄託された、ＥＣ
Ａとｗｌ＃４的に反応するモノクローナル抗体を生産す
る細胞系も本発明の対象である。
本発明のもう１つの対象は、腸内＊菌によう惹起される
感染に対する受動免疫化のために、特許請求の範囲に記
載された細胞系から得られモ たｌノクローナル抗体を使用することである。
感染に対する受動免疫化のために、特許請求の範囲に記
載された細胞系から得られモ たｌノクローナル抗体を使用することである。
本発明方法によって得られるモノクローナル抗体は特異
的に生湯内１１ｍＭに結合することができるので、該抗
体はヒトの組織内のこれら微生物を撲滅するのに使用す
ることができる。この場合、患者に予防のためモノクロ
ーナル抗体全投与することも、感染の行なわれた後に、
得られたモノクローナル抗体を治療のために使用するこ
とも可能である。受動免疫化のために適当な用量は、５
０〜２００Ｉｎ９の範囲内である。
的に生湯内１１ｍＭに結合することができるので、該抗
体はヒトの組織内のこれら微生物を撲滅するのに使用す
ることができる。この場合、患者に予防のためモノクロ
ーナル抗体全投与することも、感染の行なわれた後に、
得られたモノクローナル抗体を治療のために使用するこ
とも可能である。受動免疫化のために適当な用量は、５
０〜２００Ｉｎ９の範囲内である。
本発明方法によって得られるモノクローナル抗体は大体
にかいて腸内細菌科の植成と結合しつるので、抗体は腸
内ａＪ画の定性約１たは定量的検出のためにも適当であ
る。この場合、検出は自体公知の方法で免疫学的測定に
よって行なわれる。この種の方法は専門家には周知であ
シ、ここで詳述する必要はない。この場合、本発明によ
シ得られるモノクローナル抗体は、標誠化訃よび／また
は固定化レセプターとして使用することができる。
にかいて腸内細菌科の植成と結合しつるので、抗体は腸
内ａＪ画の定性約１たは定量的検出のためにも適当であ
る。この場合、検出は自体公知の方法で免疫学的測定に
よって行なわれる。この種の方法は専門家には周知であ
シ、ここで詳述する必要はない。この場合、本発明によ
シ得られるモノクローナル抗体は、標誠化訃よび／また
は固定化レセプターとして使用することができる。
さらに、本発明の対象は、本発明方法によって得られる
、渭ましくは細胞系ＥＣＡＣＣ８９０３０１０訃よび／
または８９０５０５１１から得られるモノクローナル抗
体を、常用の担持剤訃よび／または希釈剤と共に含有す
る、腸内細菌によって惹起される感染を処理するための
医薬である。
、渭ましくは細胞系ＥＣＡＣＣ８９０３０１０訃よび／
または８９０５０５１１から得られるモノクローナル抗
体を、常用の担持剤訃よび／または希釈剤と共に含有す
る、腸内細菌によって惹起される感染を処理するための
医薬である。
望ましくは、モノクローナル抗体は５０〜２００叩の用
量で使用される。
量で使用される。
本発明によれば、抗生物質に対して抵抗性の腸内細菌菌
株を撲滅することのできる医薬が提供される。
株を撲滅することのできる医薬が提供される。
次に、本発明をＴＡ付図面につき説明する。
第１図は、ＥＬ、ＩＳＡ法で做を滴定小円ｆｔＪ膜に吸
着させたＢＣＡ ？よび種々のＬＰ８試料と、種々の希
釈度の抗体Ｂ２１とインキュベートした後に得られる結
果を示し、曲縁は光度計中４０５ ｎｍにかける吸光（
ｍｇ）で表わされている。
着させたＢＣＡ ？よび種々のＬＰ８試料と、種々の希
釈度の抗体Ｂ２１とインキュベートした後に得られる結
果を示し、曲縁は光度計中４０５ ｎｍにかける吸光（
ｍｇ）で表わされている。
第２図にはａＪ溶性ＥＣＡまたは町溶注ＬＰＳ金、８・
モンテビデオからのＥＣＡで被覆されている微量滴定グ
レートと共にインキュベートした際の結果が示されてい
る。この場合、約１μｇ／ｍ（２）−度を育する抗体Ｂ
２１を、等量の町ｆ容性、ＥＣＡまたはＬＰ８と共に２
５℃で１時間インキュを ベートした。抗体と阻害剤との混合物Ｚｓ、モンテビデ
オからのＢＣＡで被覆された做ｔ （ｆ！４定プレート
上に塗布した０曲線は、 ＥＣＡに対する抗体の結合を
比較して得られた結果を示す。
モンテビデオからのＥＣＡで被覆されている微量滴定グ
レートと共にインキュベートした際の結果が示されてい
る。この場合、約１μｇ／ｍ（２）−度を育する抗体Ｂ
２１を、等量の町ｆ容性、ＥＣＡまたはＬＰ８と共に２
５℃で１時間インキュを ベートした。抗体と阻害剤との混合物Ｚｓ、モンテビデ
オからのＢＣＡで被覆された做ｔ （ｆ！４定プレート
上に塗布した０曲線は、 ＥＣＡに対する抗体の結合を
比較して得られた結果を示す。
第３図には、第２図に記載したようにして実施し７？：
（この場合微量滴定プレートは大腸菌（ｇ、コリ０１１
１Ｂ４）からのり、ＰＳで被覆されていた）実験で得ら
れた結果がプロットされている。
（この場合微量滴定プレートは大腸菌（ｇ、コリ０１１
１Ｂ４）からのり、ＰＳで被覆されていた）実験で得ら
れた結果がプロットされている。
デ
５ｇ４図は、イムノ１０ット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏ
Ｌ−Ａｎａｌｙｓｅ） ｆ示す。ＥＣＡ ＤよびＩ、
Ｐａは１４ ％ ８Ｄ８／ＰＡＧＥで分離した。上部の
ゲルは、ＬＰ８移動パターンを示すために鎌で漬色した
。ＥＣＡ ｔｒｉ銀試薬によって増色しなかった。抗体
１１８２１で現像したイムノプロットに対すると同じゲ
ルを使用した。
Ｌ−Ａｎａｌｙｓｅ） ｆ示す。ＥＣＡ ＤよびＩ、
Ｐａは１４ ％ ８Ｄ８／ＰＡＧＥで分離した。上部の
ゲルは、ＬＰ８移動パターンを示すために鎌で漬色した
。ＥＣＡ ｔｒｉ銀試薬によって増色しなかった。抗体
１１８２１で現像したイムノプロットに対すると同じゲ
ルを使用した。
例 １
ＢＣＡに対して高い確率で生体内前活性化されたリンパ
球を有する供血者の選択のためには次の方法を使用する
二数血症ないしは菌属症の患者から血濃′を採取し、公
知の細菌学的方法によシ血液培盪にかげる。この血液培
養からの？＃Ｂ菌金、ペルデイの系統的細繭字マニュア
ル （Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｂｌｃ Ｂａｃｂｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８
４手）、’Ｎ、Ｒ，Ｋｒ１ｅｇ、 Ｃｒ、 Ｈｏ１ｔ、
（ｓｄｓ、）Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎ
ｓ＊ Ｂａｌｔｊｍｏｒｅ）による鑑別装置上用いて確
認する。感染源として腸内細菌科からの、ｍｖＭが検出
されたような人だけ金、リンパ球の供血者として考慮す
る。これらの供血者から１００〜２００ばの血液上とシ
、これから単核細胞を単Ｉ４睦する。引き続きこの細弛
金慣用法（ｘ６ｈｘｅｒ ｊ、ｓよびＭｌｌｓｔｅｉｎ
’Ｎａｔｕｒｅ’第２５６巻（１９７５軍）第４９５
Ｍ〜第４９７！ｉ４）に従い、ヒトの骨髄棟細胞（ＳＫ
Ｏ−００７゜ＡＴＣＣＣＲＬ ８ Ｄ ３６ ） ｋ融
合させる。２〜３週間後、雑種細胞の培養上澄みを調べ
る。このため□サルモネラ・モンテビデオ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａｍｏｎｂｅｖｌｄｅｏ ）から単離し、精製
したＥＣＡを用で いＪ ＥＩＪ８Ａ試験を実施する。このために、ＩＢＬ
Ｉ８Ａ ｆ レー ト （９６ｗｅｌｌ Ｅ［、ｌ５
Ａ−ＰｌａＬｔｅ。
球を有する供血者の選択のためには次の方法を使用する
二数血症ないしは菌属症の患者から血濃′を採取し、公
知の細菌学的方法によシ血液培盪にかげる。この血液培
養からの？＃Ｂ菌金、ペルデイの系統的細繭字マニュア
ル （Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｂｌｃ Ｂａｃｂｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８
４手）、’Ｎ、Ｒ，Ｋｒ１ｅｇ、 Ｃｒ、 Ｈｏ１ｔ、
（ｓｄｓ、）Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎ
ｓ＊ Ｂａｌｔｊｍｏｒｅ）による鑑別装置上用いて確
認する。感染源として腸内細菌科からの、ｍｖＭが検出
されたような人だけ金、リンパ球の供血者として考慮す
る。これらの供血者から１００〜２００ばの血液上とシ
、これから単核細胞を単Ｉ４睦する。引き続きこの細弛
金慣用法（ｘ６ｈｘｅｒ ｊ、ｓよびＭｌｌｓｔｅｉｎ
’Ｎａｔｕｒｅ’第２５６巻（１９７５軍）第４９５
Ｍ〜第４９７！ｉ４）に従い、ヒトの骨髄棟細胞（ＳＫ
Ｏ−００７゜ＡＴＣＣＣＲＬ ８ Ｄ ３６ ） ｋ融
合させる。２〜３週間後、雑種細胞の培養上澄みを調べ
る。このため□サルモネラ・モンテビデオ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａｍｏｎｂｅｖｌｄｅｏ ）から単離し、精製
したＥＣＡを用で いＪ ＥＩＪ８Ａ試験を実施する。このために、ＩＢＬ
Ｉ８Ａ ｆ レー ト （９６ｗｅｌｌ Ｅ［、ｌ５
Ａ−ＰｌａＬｔｅ。
Ｇｒｅｉｎｅｒ社製品）に、１０ミリモルのリン酸ナト
リウム緩衝液Ｃ−７，５５）中のＫＣＡ靜液（ＩＩ］μ
ｇ／ＩＩ／）１００μｌをピペットで滴下し、室温で１
時間インキュベートした。微量滴定グレートをＰＳ８で
洗浄した後、非特異的結合個所をウシの血清アルデミン
で遮祈した。その後培養上ｄみ１００ｔｔｔを個々の小
円′ＷＪＩ１１４にピペットで入れ、室温で１時間イン
キュベートした。洗浄した後ペルオキシダーゼ１００μ
ｅをヒツジ抗ヒト＠頌樟鍼抗体（ｍａｒｋｌｅｒｔ、ｅ
Ｓｃｈａｆａｎｂｌ−Ｈｕｍａｎ−Ｉｅｌｃｈｋ−Ｋ
ｅ Ｌｂｅｎ−Ａｎｌｌｋｏｒｐｅｒ）に加え、再び室
温で１時間イノキュベートした。改めて抗質 浄した後、ペルオキシダーゼ基〆との４索反応（ＡＢＴ
Ｓ、 Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｌｍ、 Ｂ
ｅ５ｔ、 Ｎｒ。
リウム緩衝液Ｃ−７，５５）中のＫＣＡ靜液（ＩＩ］μ
ｇ／ＩＩ／）１００μｌをピペットで滴下し、室温で１
時間インキュベートした。微量滴定グレートをＰＳ８で
洗浄した後、非特異的結合個所をウシの血清アルデミン
で遮祈した。その後培養上ｄみ１００ｔｔｔを個々の小
円′ＷＪＩ１１４にピペットで入れ、室温で１時間イン
キュベートした。洗浄した後ペルオキシダーゼ１００μ
ｅをヒツジ抗ヒト＠頌樟鍼抗体（ｍａｒｋｌｅｒｔ、ｅ
Ｓｃｈａｆａｎｂｌ−Ｈｕｍａｎ−Ｉｅｌｃｈｋ−Ｋ
ｅ Ｌｂｅｎ−Ａｎｌｌｋｏｒｐｅｒ）に加え、再び室
温で１時間イノキュベートした。改めて抗質 浄した後、ペルオキシダーゼ基〆との４索反応（ＡＢＴ
Ｓ、 Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｌｍ、 Ｂ
ｅ５ｔ、 Ｎｒ。
１０２９４６）’ｆ：開始した。室温で２０〜６０分後
に、吸光を光度計中４０５ ｍｍで測定した。
に、吸光を光度計中４０５ ｍｍで測定した。
所望の抗体上生産するクローンをさらに培養する。
例 ２
細胞系ｇｃＡｃｃ ８９０３０５１１から得られたヒト
のモノクローナル抗体の、雑鴎細胞の培養上澄み中での
特異性を確めるために、例１に記載したようにＥＩＪＳ
Ａ ｖ：、験を実施した。この場合次の結果が得られた
： 表 下記を用いて得られるｍＦｉ 例 ６ 細胞系ｇｃＡｃｃ ８９０５０６１０ ｈよびＥＣＡＣ
Ｃ８９０５０５１１から得られるモノクローナル抗体を
、完全な細菌細胞との結合能を調べた。
のモノクローナル抗体の、雑鴎細胞の培養上澄み中での
特異性を確めるために、例１に記載したようにＥＩＪＳ
Ａ ｖ：、験を実施した。この場合次の結果が得られた
： 表 下記を用いて得られるｍＦｉ 例 ６ 細胞系ｇｃＡｃｃ ８９０５０６１０ ｈよびＥＣＡＣ
Ｃ８９０５０５１１から得られるモノクローナル抗体を
、完全な細菌細胞との結合能を調べた。
このため、フェノールで殺した細菌を９６査の微を滴定
グレートに、３７°Ｃで夜どかしインキエベートするこ
とによシ吸看させた。その後、プレートを２囲ＰＢ８で
ぼ浄し、１％のクロティた後、モノクローナル抗体を含
有する４液１００μｔを加え、室温で１時間インキュベ
ートした。
グレートに、３７°Ｃで夜どかしインキエベートするこ
とによシ吸看させた。その後、プレートを２囲ＰＢ８で
ぼ浄し、１％のクロティた後、モノクローナル抗体を含
有する４液１００μｔを加え、室温で１時間インキュベ
ートした。
ＰＢ８で６回洗浄した後、ペルオキシダーゼ憾識ヒツゾ
抗ヒト軽、鎖抗体１００μｔを加え、再び室温で１時間
インキュベートした。
抗ヒト軽、鎖抗体１００μｔを加え、再び室温で１時間
インキュベートした。
改めて洗浄した後、ベルオキ７ダー（！′接合体のＡＢ
ＴＳとの結合を検出し、呈色反応を光度針で定電した。
ＴＳとの結合を検出し、呈色反応を光度針で定電した。
結果は次の表２から認められる：この結果は、本発明に
よるモノクローナル抗体は多数の腸内ａ醒科の構成員と
結合するが、たとえばプソイドモナスのようなこの科に
属しない菌株とは結合しないことを示す。
よるモノクローナル抗体は多数の腸内ａ醒科の構成員と
結合するが、たとえばプソイドモナスのようなこの科に
属しない菌株とは結合しないことを示す。
例 ４
細胞系ｇｃＡｃｃ ８９０５０６１１から得られたモノ
クローナル抗体の免疫療法的効力を調べた。
クローナル抗体の免疫療法的効力を調べた。
このため４〜７週間生存のＮＭＲＩマウスに、細胞系Ｅ
ＣＡＣＣ８９０５０３１１から得た稍製せるモノクロー
ナル抗体の種々の鎗を静脈内注封で投与し、１５分後に
一定量の生細菌を榎嘆内注射で注射した。４８時間後に
、マウスの生存率を確かめた。
ＣＡＣＣ８９０５０３１１から得た稍製せるモノクロー
ナル抗体の種々の鎗を静脈内注封で投与し、１５分後に
一定量の生細菌を榎嘆内注射で注射した。４８時間後に
、マウスの生存率を確かめた。
表５は結果を示す。
表 ６
ＣＡ１３／１１ ： この記号のものは対照として使
用した。このものはＳ、ミネソタ（Ｓ。
用した。このものはＳ、ミネソタ（Ｓ。
ｍ１ｎｎｅｓｏは）のＯ−抗原と反応する。
例 ５
細胞系ＥＣＡＣＣ８９０３０５１１から得らｊした抗体
が特異的にＥＣＡと結合するか否か、または該抗体が腸
内細菌科の細菌の外膜にあるリポ多糖に対し親和注七臂
するか否かを調べた。このため、一方では高度に精製し
たＥＣＡを使用し、比較のため種々の種類から抽出した
リポ多糖に対する結合金満べた。ＥＣＡ ｅよびリポ多
糖（ＬＰＳ）は同じ濃度で微電滴定グレートに吸増させ
、情々の希釈度の抗体と共にインキュベートした。
が特異的にＥＣＡと結合するか否か、または該抗体が腸
内細菌科の細菌の外膜にあるリポ多糖に対し親和注七臂
するか否かを調べた。このため、一方では高度に精製し
たＥＣＡを使用し、比較のため種々の種類から抽出した
リポ多糖に対する結合金満べた。ＥＣＡ ｅよびリポ多
糖（ＬＰＳ）は同じ濃度で微電滴定グレートに吸増させ
、情々の希釈度の抗体と共にインキュベートした。
引き続き、結合した抗体の黛をＥＬＩＳＡ試験によって
測定した。第１図はその結果を示す、み区である。
測定した。第１図はその結果を示す、み区である。
与えられた各抗体希釈度に分いて同定ＥＣ’Ａを用い、
固定相結合のＬＰ８を用いるよシもはるかに高いＩＩ
ＳＡ倍信号発生した。反応性にかけるこの相違は、微量
滴定プレートに対する抗原の種々の吸漕力によっても惹
起させることができるので、付加的に競合的結合実験を
実施した。
固定相結合のＬＰ８を用いるよシもはるかに高いＩＩ
ＳＡ倍信号発生した。反応性にかけるこの相違は、微量
滴定プレートに対する抗原の種々の吸漕力によっても惹
起させることができるので、付加的に競合的結合実験を
実施した。
ｇｇｌの試験にかいては、抗体上極々の濃度の、８、モ
ンテビデオからのｇｃＡ Ｄよび種々の種類のＬＰＳ
（８，モンテビデオ、Ｅ、コリ０１１１．８．ミネソタ
ｐよびセラチア・マルセセンス）と共に予９４インキュ
ベートした。第２図は、可溶性ＥＣＡのみが固定相結合
のＥＣＡに対するモノクローナル抗体の結合を阻害する
こと金示す。第２の試験にかいては、ＥＣＡＤよび種々
のＬＰＳ試料の、Ｅ。
ンテビデオからのｇｃＡ Ｄよび種々の種類のＬＰＳ
（８，モンテビデオ、Ｅ、コリ０１１１．８．ミネソタ
ｐよびセラチア・マルセセンス）と共に予９４インキュ
ベートした。第２図は、可溶性ＥＣＡのみが固定相結合
のＥＣＡに対するモノクローナル抗体の結合を阻害する
こと金示す。第２の試験にかいては、ＥＣＡＤよび種々
のＬＰＳ試料の、Ｅ。
コ！Ｊ ＬＰＢに対する抗体Ｅ２１の結合ｆ：ｉ１ｉ合
的に阻害する能力を調べた。
的に阻害する能力を調べた。
第６図は、Ｅ、コＵ ＬＰＢに対するＥ２１の結合が非
常に僅かなりＣＡ ｆｉ度によって阻害され、これに対
して同じ組繊から単離したＬＰＳは約５０倍の高い濃度
にｐいてのみ結合の５０多阻害を示したにすぎないこと
を示す。むしろ異種ＬＰＳ試料はもつと僅かな阻害作用
を有していた。この結果は、モノクローナル抗体がＥＣ
Ａ （Ｄ場合、リポ多槽の場合よりもはるかに多く出現
する工ビトーｆｉｇ別すること金示す。
常に僅かなりＣＡ ｆｉ度によって阻害され、これに対
して同じ組繊から単離したＬＰＳは約５０倍の高い濃度
にｐいてのみ結合の５０多阻害を示したにすぎないこと
を示す。むしろ異種ＬＰＳ試料はもつと僅かな阻害作用
を有していた。この結果は、モノクローナル抗体がＥＣ
Ａ （Ｄ場合、リポ多槽の場合よりもはるかに多く出現
する工ビトーｆｉｇ別すること金示す。
例 ６
Ｓ、モンテビデオからの精製されたＥＣ’Ａ ＆よび種
々の種Ｍ（Ｓ、モンテビデオ金含めて）からのＬＰＢＶ
Ｃ１Ｅ３ＤＢｒＡ／′／を気泳ｍｅ行ない、ウニＸタン
・プロット法（Ｗｅｓｂｅｒｎ−Ｂｌｏｂｂｌｍｇ）
＞よび銀膚色によって可視的にした。結果は、第４図か
ら認められる。ＬＰＢは銀で増色した後典型的な梯子状
のパターンを生じ、これには異なり ＥＣＡは硝＃Ｉ銀
で着色することができないことが判明した。プロットさ
れた抗原は抗体ｇ２１でｕＪ視的にすると、ＥＣＡ分子
の連続的梯子状パターン金石し、該分子の分子量範囲は
非常に低い分子量から高い分子量にまで及ぶ。これとは
異な九モノクローナル抗体Ｅ２１は、主として低い分子
量の狭い帝城金臂するにすぎない、免疫血液中のＬＰＢ
と反応するにすぎない。ＬＰＳの烏い分子を帯域は、十
分な賞で存在していたにも拘らず、そもそも反応しない
。
々の種Ｍ（Ｓ、モンテビデオ金含めて）からのＬＰＢＶ
Ｃ１Ｅ３ＤＢｒＡ／′／を気泳ｍｅ行ない、ウニＸタン
・プロット法（Ｗｅｓｂｅｒｎ−Ｂｌｏｂｂｌｍｇ）
＞よび銀膚色によって可視的にした。結果は、第４図か
ら認められる。ＬＰＢは銀で増色した後典型的な梯子状
のパターンを生じ、これには異なり ＥＣＡは硝＃Ｉ銀
で着色することができないことが判明した。プロットさ
れた抗原は抗体ｇ２１でｕＪ視的にすると、ＥＣＡ分子
の連続的梯子状パターン金石し、該分子の分子量範囲は
非常に低い分子量から高い分子量にまで及ぶ。これとは
異な九モノクローナル抗体Ｅ２１は、主として低い分子
量の狭い帝城金臂するにすぎない、免疫血液中のＬＰＢ
と反応するにすぎない。ＬＰＳの烏い分子を帯域は、十
分な賞で存在していたにも拘らず、そもそも反応しない
。
第１図は抗体の種々の希釈度ｖｃカける、ｇＬｒｓ人試
験で倣鷺滴定小円筒に吸着させた種々のＬＰＳ試料とＥ
ＣＡをインキュベートした場合の吸光（ｍＥ） Ｈ線図
でちや、第２図は抗体濃度約１μｇ／ｒ１１１で、可溶
性ＥＣＡまたは９痔性ＬＰＳ ｉ、Ｓ、モンテビデオか
らのＥＣＡで被覆した微量ｔｔ４定プレートと共にイン
キュベートした場合の、ＥｉＩＣＡに対する種々のＬＰ
Ｂの結合を、種々のｐｆｌ害剤潰度にかいて示す結合率
曲線図であシ、第３図は微量滴定グレートｆ：ｇ、コリ
０１１１Ｂ４からのＬＰＳで４覆した場合の、＠２図と
同様の結合率曲線図であシ、第４図はイムノプロット分
析の結果を示す図である。 ＦＩＧ、１ １／抗体希釈度
験で倣鷺滴定小円筒に吸着させた種々のＬＰＳ試料とＥ
ＣＡをインキュベートした場合の吸光（ｍＥ） Ｈ線図
でちや、第２図は抗体濃度約１μｇ／ｒ１１１で、可溶
性ＥＣＡまたは９痔性ＬＰＳ ｉ、Ｓ、モンテビデオか
らのＥＣＡで被覆した微量ｔｔ４定プレートと共にイン
キュベートした場合の、ＥｉＩＣＡに対する種々のＬＰ
Ｂの結合を、種々のｐｆｌ害剤潰度にかいて示す結合率
曲線図であシ、第３図は微量滴定グレートｆ：ｇ、コリ
０１１１Ｂ４からのＬＰＳで４覆した場合の、＠２図と
同様の結合率曲線図であシ、第４図はイムノプロット分
析の結果を示す図である。 ＦＩＧ、１ １／抗体希釈度
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、腸内細菌感染が検出された供血者の血液からＢ−リ
ンパ球を得、リンパ球を不死化し、所望の活性を有する
抗体を生産する細胞を選択し、培養し、これから抗体を
得ることを特徴とする腸内細胞に対する抗体の製造方法
。 ２、細胞系ＥＣＡＣＣ８９０３０３１１（Ｅ２１）。 ３、細胞系ＥＣＡＣＣ８９０３０３１０（Ｌ３０）。 ４請求項１記載の方法によつて得られたモノクローナル
抗体を常用の担持剤および希釈剤と一緒に含有する、腸
内細菌によつて惹起される感染を処理するための医薬。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3908520 | 1989-03-15 | ||
| DE3908520.1 | 1989-03-15 | ||
| DE3925161.6 | 1989-07-28 | ||
| DE3925161A DE3925161A1 (de) | 1989-03-15 | 1989-07-28 | Monoklonale, gegen eca gerichtete antikoerper und ihre verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0335799A true JPH0335799A (ja) | 1991-02-15 |
Family
ID=25878846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2062857A Pending JPH0335799A (ja) | 1989-03-15 | 1990-03-15 | 腸内細菌に対する抗体の製造方法、新規細胞系および腸内細菌によつて惹起される感染を処理するための医薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0387850B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0335799A (ja) |
| AT (1) | ATE123309T1 (ja) |
| CA (1) | CA2012079A1 (ja) |
| DE (2) | DE3925161A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2674866A1 (fr) * | 1991-04-08 | 1992-10-09 | Chemunex | Anticorps anti-ace et leurs applications a la detection specifique et eventuellement a la numeration des enterobacteries entieres, par une methode immunochimique. |
| PL404229A1 (pl) | 2013-06-06 | 2014-12-08 | Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością | Wyizolowany immunogenny antygen bakteryjny i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywołanych przez Gram-ujemne bakterie |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62270535A (ja) * | 1986-02-07 | 1987-11-24 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレ−シヨン | 交差防御性ヒト単クローン性抗体またはその結合フラグメントを含む医薬組成物 |
-
1989
- 1989-07-28 DE DE3925161A patent/DE3925161A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-03-13 CA CA002012079A patent/CA2012079A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-14 AT AT90104839T patent/ATE123309T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-14 DE DE59009169T patent/DE59009169D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-14 EP EP90104839A patent/EP0387850B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-15 JP JP2062857A patent/JPH0335799A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62270535A (ja) * | 1986-02-07 | 1987-11-24 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレ−シヨン | 交差防御性ヒト単クローン性抗体またはその結合フラグメントを含む医薬組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2012079A1 (en) | 1990-09-15 |
| ATE123309T1 (de) | 1995-06-15 |
| EP0387850B1 (de) | 1995-05-31 |
| EP0387850A1 (de) | 1990-09-19 |
| DE59009169D1 (de) | 1995-07-06 |
| DE3925161A1 (de) | 1990-09-27 |
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