FR2674866A1

FR2674866A1 - Anticorps anti-ace et leurs applications a la detection specifique et eventuellement a la numeration des enterobacteries entieres, par une methode immunochimique.

Info

Publication number: FR2674866A1
Application number: FR9104243A
Authority: FR
Inventors: Hoegaerden Van Michel; Levasseur Stephane; Drocourt Jean-Louis
Original assignee: Chemunex SA
Current assignee: Chemunex SA
Priority date: 1991-04-08
Filing date: 1991-04-08
Publication date: 1992-10-09
Also published as: DE579720T1; WO1992017603A1; FR2674866B1; AU1688992A; EP0579720A1

Abstract

Nouveaux anticorps dirigés contre l'antigène commun des entérobactéries (ACE), capables de reconnaître l'ensemble des entérobactéries entières ainsi que leurs applications à la détection spécifique et éventuellement à la numération des entérobactéries entières. Fragments antigéniques de l'ACE qui se couplent spécifiquement auxdits anticorps. Lesdits anticorps sont constitués par des anticorps monoclonaux capables de reconnaître toutes les entérobactéries entières, c'est-à-dire n'ayant subi notamment aucune opération d'extraction, par liaison avec un déterminant antigénique de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface desdites entérobactéries entières et directement accessible auxdits anticorps, et sont sélectionnés, à partir d'hybridomes préparés de manière appropriée, par: (a) un premier tri de chaque surnageant d'hybride à l'aide d'une méthode ELISA, mettant en œuvre comme antigène, au moins deux entérobactéries vivantes, éventuellement traitées de manière appropriée, et au moins une bactérie n'appartenant pas à la famille des entérobactéries, puis (b) un deuxième tri, par immunofluorescence, du/des surnageant(s) sélectionné(s) en (a).

Description

La présente invention est relative à de nouveaux anticorps dirigés contre l'antigène commun des entérobactéries (ACE), capables de reconnaître l'ensemble des entérobactéries entières ainsi qu'à leurs applications à la détection spécifique et éventuellement à la numération des entérobactéries entières.

On entend par entérobactéries entières, au sens de la présente invention, des entérobactéries, vivantes ou mortes, n'ayant subi aucune extraction et ayant conservé l'ensemble de leurs déterminants antigéniques.

La présente invention est également relative aux fragments antigéniques de 1'ACE qui se couplent spécifiquement auxdits anticorps.

Les entérobactéries sont des bacilles à Gram négatif souvent polymorphes, mobiles grâce à une ciliature péritriche ou immobiles, dont un certain nombre sont des agents pathogènes qui peuvent être responsables d'intoxications graves, lorsqu'on les retrouve notamment dans les aliments ou l'eau potable. Leur détection et leur dénombrement dans les produits pharmaceutiques et agro-alimentaires sont ainsi de plus en plus sévèrement réglementés et contrôlés.

I1 est usuel dans l'industrie agro-alimentaire, de réaliser la détection des micro-organismes dans les produits alimentaires par des techniques microbiologiques classiques telles que la culture ; cependant, une telle méthode a pour inconvénient majeur d'être longue puisqu'elle nécessite de 24 à 72 heures pour donner des résultats utilisables.

En ce qui concerne plus particulièrement les entérobactéries, les techniques de dépistage actuellement utilisées en routine reposent sur des ensemencements de milieux de culture sélectifs tels que le bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVB), le Mossel, le DEV lactose peptone... L'inconvénient majeur de ces techniques de mi crobiologie classique réside, comme précisé ci-dessus, dans le délai de réponse, qui n'est jamais inférieur à 24 ou 48 heures selon le genre et l'espèce d'entérobactérie à rechercher.

Des tests, basés sur des ensemencements de milieux de culture sélectifs, mais de réalisation rapide ont été mis au point. On peut citer notamment le test "COLILERT", développé par la Société ACCESS ANALYTICAL
SYSTEMS, test colorimétrique, qui est mis en oeuvre en incubant pendant 24 heures l'échantillon à tester avec un milieu particulier. Ce test est simple à mettre en oeuvre mais ne peut être réalisé en moins de 24 heures et ne s'applique qu'à une famille d'entérobactéries : les coliformes.

On peut également citer le système "FLUOROCULT", développé par DIAGNOSTICA MERCK, qui est un test fluorimétrique sur bandelettes, qui repose sur l'utilisation d'un substrat fluorophore, appelé MUG, qui devient fluorescent sous l'action d'une enzyme produite par la bactérie. Ce test est rapide (1 à 2 heures), mais n'est applicable qu'à Escherichia coli.

Il s'est donc avéré nécessaire de pouvoir disposer de méthodes très sensibles et plus rapides. C'est ainsi qu'a été proposée l'application des méthodes immunologiques mises au point pour le diagnostic des maladies de l'Homme et des maladies de l'animal, à la détection de microorganismes toxiques dans les produits alimentaires.

Ces tests immunologiques, de manière générale, mettent en oeuvre des anticorps monoclonaux qui présentent une grande spécificité vis-à-vis de l'antigène qui a servi à leur production ; leur application aux entérobactéries a été possible, à partir de la mise en évidence, en 1962, par KUNIN et son équipe (Proc. Soc. Exp. Biol.

Met., 1962, 111, 160-166) de l'existence d'un antigène de surface commun aux entérobactéries sauvages, baptisé "antigène commun des entérobactéries'1 (ACE) ; cette mise en évidence a conduit à la mise au point de "marqueurs" de 1'ACE (sérums ou anticorps monoclonaux). AOKI et al.

(Proceedings of the Society for Experimental Biology and
Medicine, 1966, 121, 230-234) a évalué l'utilisation d'antisérum anti-ACE pour marquer les entérobactéries par immunofluorescence. Dans ce travail, AOKI et al. ont confirmé les travaux de KUNIN et al. et ont démontré la présence de l'ACE à la surface ou dans la paroi cellulaire des entérobactéries. Toutefois, il faut noter que de tels sérums anti-ACE ne présentent pas, dans le cadre d'un test de détection, une spécificité suffisante, pour une détection fiable d'une entérobactérie.

C. LUGOWSKI et al. (Carbohydrate Res., 1983, 118, 173-181) ont identifié une unité trisaccharidique répétée dans l'antigène commun des entérobactéries. L'ACE est un polysaccharide ; chez certaines bactéries, les mutants R, contenant le noyau R1 ou R4, 1'ACE est chimiquement lié à ce noyau et fait partie ainsi du lipopolysaccharide. En plus des constituants décrits précédemment, 2-acétamido-2-désoxy-D-glucose et acide 2-acétamido-2désoxy-D-manuronique, les Auteurs de cet Article ont mis en évidence un autre composant majeur de 1'ACE : le 4acétamido-4,6-didésoxy-D-galactose (D-Fuc4Nac) et ont montré que les unités trisaccharidiques constituent 70 % ou plus de cet antigène -+4)-ss-D-ManpNAcA-(1 < 4)-a-D-GlcpNAc-(1o3)-a-D-FuCp4NAc- (1 < .

Plusieurs techniques, mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux, notamment pour pallier les inconvénients des techniques précitées ont été décrites
- H. PETERS et al. (Infection and Immunity, 1985, 50, 2, 459-466) ont établi une lignée cellulaire hybride produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène commun des entérobactéries (ACE) et une sous-structure de l'enveloppe externe lipopolysaccharidique de différents Escherichia coli. Les anticorps anti
ACE dénommés 865 et 898 réagissent avec 1'ACE d'extraits d'E. coli chauffés et avec des préparations de LPS contenant de l'ACE lié au noyau R1 ou R4, aussi bien qu'avec un échantillon purifié d'ACE de Salmonella montevideo.

L'anticorps 865 est une immunoglobuline de type IgM et l'anticorps 898 est une immunoglobuline de type IgG2a.

Il est également spécifié, dans cet article, que les comportements de ces deux anticorps vis-à-vis des bactéries entières, c'est-à-dire intactes, indiquent que les épi topes reconnus par ces anticorps ne sont pas facilement accessibles aux anticorps.

- E.C. BOTTGER et al. (J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 2, 377-382) décrivent une détermination qualitative et quantitative de l'ACE par le même anticorps monoclonal 898 et précisent à nouveau que l'utilisation de la bactérie intacte n'est pas favorable, dans la mesure où les polysaccharides capsulaires aussi bien que les LPS de bactéries non encapsulées interfèrent constamment pour l'accessibilité de l'épitope de lACE reconnu par l'anticorps monoclonal 898.

- V. OBST et al. (Aqua, 1989, 38, 136-142) décrivent une méthode immunologique utilisant des anticorps monoclonaux, pour détecter des entérobactéries dans l'eau de boisson.

Le groupe de coliformes étant considéré comme un bon indicateur de la présence d'une entérobactérie, les Auteurs de cet article ont développé un test ELISA utilisant l'anticorps monoclonal 898 précité. Une quantité définie d'anticorps 898 est déposée sur les parois d'une plaque de microtitration. Il est spécifié que, dans la mesure où 1'ACE est un lipopolysaccharide polymérique, il présente plusieurs épitopes antigéniques identiques qui restent libres en dépit de la liaison avec les anticorps. Ces épitopes non liés peuvent donc réagir avec une quantité additionnelle d'anticorps anti-ACE 898, marqués à l'aide d'une enzyme appropriée, notamment de la ss-ga- lactosidase.

Les Auteurs décrivent donc une méthode sandwich, dans laquelle le même anticorps est utilisé pour capturer l'antigène et pour détecter l'antigène capturé.

La Demande EP 387 850, au nom de BOEHRINGER
MANNHEIM GmbH, décrit des anticorps monoclonaux antientérobactéries obtenus par immortalisation de lymphocytes B de patients ayant une infection due à une entérobactérie et par sélection des cellules qui fournissent l'activité souhaitée. I1 est en particulier précisé, dans cette Demande, que la sélection est réalisée par détection de la fixation des anticorps produits sur des préparations de lipopolysaccharides (LPS) des entérobactéries, qui contiennent des quantités non négligeables d'ACE, au moyen d'un test ELISA. Il est également précisé, à l'exemple 1 de cette Demande, que la sélection est réalisée au moyen d'un test ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, de 1'ACE purifié, isolé de Salmonella montevideo.

Aussi bien les tests de détection que les anticorps monoclonaux de l'Art antérieur, sélectionnés en utilisant des extraits d'ACE, ne permettent pas une détection fiable de n'importe quelle entérobactérie, dans un échantillon à contrôler ; en effet, un produit alimentaire peut être contaminé par une ou plusieurs entérobactéries différentes ; il faudrait donc pouvoir disposer, pour réaliser le test de détection immunologique, d'anticorps anti-entérobactéries qui reconnaissent notamment toutes les entérobactéries entières, directement dans l'échantillon à contrôler.

La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des anticorps monoclonaux, qui répondent à un besoin important, qui est celui de la détection de la présence d'une entérobactérie entière quelle qu'elle soit et notamment des entérobactéries contaminantes toxiques, dans différentes substances ou fluides, et notamment dans les produits alimentaires et qui permettent la réalisation d'un test immunologique spécifique et fiable, directement sur l'échantillon, éventuellement solubilisé, ne nécessitant pas l'intervention de spécialistes et, par suite, apte à être mis sous la forme d'une trousse de détection aisément utilisable.

La présente invention a pour objet des anticorps anti-entérobactéries, caractérisés
- en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux capables de reconnaître toutes les entérobactéries entières, c'est-à-dire n'ayant subi notamment aucune opération d'extraction, par liaison avec un déterminant antigénique de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface desdites entérobactéries entières et directement accessible auxdits anticorps, et
- en ce qu'ils sont sélectionnés, à partir d'hybridomes préparés de manière appropriée, par
(a) un premier tri de chaque surnageant d'hybride à l'aide d'une méthode ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, au moins deux entérobactéries vivantes, éventuellement traitées de manière appropriée, et au moins une bactérie n'appartenant pas à la famille des entérobactéries, puis
(b) un deuxième tri, par immunofluorescence, du/des surnageant(s) sélectionné(s) en (a).

Les hybrodomes sont préparés de manière connue en soi :
- soit conformément à la méthode de KOHLER et
MILSTEIN, par fusion de cellules myélomateuses appropriées et de cellules spléniques d'animaux choisis dans le groupe qui comprend les mammifères non humains convenables, immunisés à l'aide d'un surnageant d'une entérobactérie dont 1'ACE est immunogène
- soit à partir de lymphocytes B humains appropriés, immortalisés par fusion avec des cellules de myélome appropriées ou transformés par exemple par le virus d'Eptsein-Barr.

Selon un mode de réalisation avantageux desdits anticorps, le premier tri (a) est réalisé à l'aide d'au moins 5 entérobactéries vivantes.

Les anticorps monoclonaux conformes à l'invention sont notamment de type IgG2a et ont la propriété inattendue, notamment en raison de la sélection desdits anticorps à l'aide d'au moins deux entérobactéries entières différentes, et non à l'aide d'un produit d'extraction d'entérobactérie, de reconnaître une partie de 1'ACE correspondant à un déterminant antigénique présent uniquement à la surface des entérobactéries entières.

De tels anticorps ont notamment l'avantage de résoudre le problème de la détection de n'importe quelle entérobactérie, directement dans l'échantillon à analyser et ce, avec une excellente fiabilité.

Les anticorps conforme à l'invention conviennent donc particulièrement bien pour la détection d'une entérobactérie quelle qu'elle soit, susceptible notamment de contaminer les produits alimentaires, notamment par des techniques d'immunofluorescence, les techniques immunoenzymatiques, en particulier la méthode ELISA, et les techniques radioimmunologiques, directes ou indirectes.

Les entérobactéries pathogènes ou potentiellement pathogènes, reconnues par les anticoprs conformes à l'invention comprennent notamment les genres suivants
Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwînia, Esche richia, Hafnia, Kiebsiella, Levinea, Proteus, Providentia, Salmonella, Serratia, Shigella et Yersinia.

Les bactéries non reconnues sont notamment
Pseudomonas, Xanthomonas, Acinetobacter, Achromobacter,
Streptocoque, etc...

Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, lesdits anticorps monoclonaux sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides murines, résultant de la fusion de cellules de myélome de souris, de préférence non sécrétantes et de plasmocytes de souris immunisées à l'aide d'un surnageant convenablement préparé à partir d'une entérobactérie choisie dans le groupe qui comprend E. Coli 014:K7 et E.

Coli 0124:B17.

La présente invention a également pour objet des fragments antigéniques, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par les anticorps conformes à l'invention et en ce qu'ils sont constitués par un fragment de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface des entérobactéries entières, lequel fragment est directement accessible auxdits anticorps et constitue au moins un déterminant antigénique de 1'ACE.

La présente invention a également pour objet un réactif immunologique, utilisable pour la détection des entérobactéries entières, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps conforme à l'invention ou un fragment de celui-ci, l'un ou l'autre éventuellement modifié par marquage par tout marqueur approprié, notamment enzyme, fluorochrome, et/ou fixé sur un support solide.

En effet, les anticorps anti-ACE monoclonaux conformes à l'invention peuvent être marqués ou non, et ils peuvent éventuellement être fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyses fondées sur la réaction antigène-anticorps (techniques radioimmunologiques, d' immunofluorescence, enzymatiques notamment).

A cet effet, les anticorps conformes à l'invention sont modifiés par marquage, notamment avec un traceur radio-actif (tel que l'iode ou l'indium, par exemple), fluorescent (par exemple isothiocyanate de fluoresceine ou de rhodamine), chromogène, enzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline) ou colloldal (or par exemple)
L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif dans la réalisation de ce test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par fluorescence, par luminescence, par potentiométrie, etc...

Ledit support solide peut être réalisé en tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection, et éventuellement de numération, d'entérobactéries entières, éventuellement présentes dans un échantillon à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en présence ledit échantillon à analyser avec au moins un réactif immunologique conforme à l'invention, auquel se lient les entérobactéries entières, si ces dernières sont présentes dans l'échantillon à contrôler, puis à détecter les complexes anticorps-entérobactéries éventuellement formés par tout moyen approprié, notamment EIA, cytométrie en flux.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, préalablement à la mise en contact anticorps-échantillon, ce dernier est solubilisé de manière appropriée.

La présente invention a, en outre, pour objet un kit ou trousse de diagnostic pour la détection spécifique, et éventuellement la numération, d'entérobactéries, caractérisé en ce qu'il comprend au moins
- un réactif immunologique conforme à l'invention, éventuellement fixé sur un support solide approprié, et
- des quantités ou doses appropriées d'une substance de révélation, si nécessaire.

Bien entendu ces coffrets comprennent également les réactifs couramment utilisés dans les détections de ce type, à savoir
a) pour les tests par immunofluorescence, des anticorps couplés à un fluorochrome ainsi que des tampons et des supports appropriés
b) pour les tests par voie enzymatique : des anticorps couplés à l'enzyme, les agents révélateurs de l'activité enzymatique, les tampons et les supports apappropriés
c) pour les tests radioimmunologiques, des anticorps modifiés par un marqueur radioactif, ainsi que les tampons et supports appropriés.

La détection proprement dite des entérobactéries est réalisée soit cellule par cellule à l'aide d'un microscope ou d'un cytomètre, ou de tout autre système optique, ou de façon globale grâce à une réaction immunoenzymatique ou de bioluminescence.

Le procédé conforme à l'invention a l'avantage d'être spécifique de l'ensemble des Entérobactéries, et de permettre de reconnaître n'importe quelle entérobactérie, même présente en très petites quantités.

L'invention concerne également l'utilisation des anticorps anti-ACE tels que définis ci-dessus, dans la détection et éventuellement le dénombrement d'entérobactéries, en particulier dans des produits alimentaires.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple I : Préparation d'anticorps monoclonaux conformes à l'invention.

1. Immunisation
Le protocole d'immunisation des trois souris utilisées pour les fusions ayant donné naissance aux anticorps anti-entérobactéries conformes à l'invention, est le suivant a. Préparation de l'antigène
Des E. Coli 014:K7 cultivées 24 heures à 37 C en bouillon peptoné sont mises en suspension dans un tube contenant une solution aqueuse de NaCl à 9 g/l.

La suspension est alors portée à 100"C au bain-marie pendant 1 heure.

Le tube est centrifugé 10 minutes à 2 500 g et le surnageant est prélevé ; ce surnageant contient (entre autres) 1'ACE en solution. C'est ce surnageant qui est injecté aux souris.

b. Immunisation
Au jour JO, 100 1 de surnageant issu d'une suspension à 1010 bactéries/ml sont émulsionnés avec 100 1 d'adjuvant de Freund complet puis injectés par voie sous-cutanée aux souris.

A J28, 100 1 du même surnageant est émulsionné avec 100 tjl d'adjuvant de Freund incomplet puis injectés par voie sous-cutanée aux souris.

Après au moins 1 mois de repos (J > 56), la dernière immunisation est effectuée en injectant, par voie intraveineuse, 100 1 de surnageant issu d'une suspension à 109 bactéries/ml.

2. Fusion
La fusion cellulaire est effectuée trois jours et demi après.

Des cellules de myélome de souris Balb/c (NS1) sont utilisées pour la fusion.

Les cellules de myélome et les plasmocytes ont été ensuite fusionnés, en présence de 41 % de polyéthylèneglycol d'un poids de 1500 (Merck) selon la méthode de KOHLER et MILSTEIN (Nature, 256, 495-497, 1975), puis lavées dans le milieu RPMI et remises en suspension dans 100 ml du milieu RPMI complet.

3. Sélection
- Principe
Chaque surnageant d'hybride contenant un anticorps monoclonal est dilué volume à volume avec du milieu de culture (RPMI) puis analysé par la technique ELISA décrit ci-dessous.

Les bactéries sont introduites vivantes dans les plaques de microtitration ELISA et ne subissent pas d'autre traitement qu'un séchage.

Chaque surnageant est testé contre cinq entérobactéries de genres et d'espèces différents (E. Coli,
Citrobacter, Enterobacter, Proteus hauserli, Serratia marcescens) ainsi que, à titre de contrôle négatif, contre une bactérie à Gram - n'appartenant pas à la famille des Entérobactéries (Pseudomonas maltophila).

Pour être sélectionné, un surnageant (et donc l'hybride correspondant) doit être positif (même faiblement) contre les cinq entérobactéries et être totalement négatif contre la non-entérobactérie.

Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés sont ensuite testés quant à leur propriété de marquage spécifique des entérobactéries par immunofluorescence sur lame.

- ELISA
1) Les bactéries sont cultivées 24 heures à 37 C en bouillon peptoné puis lavées et remises en suspension dans une solution aqueuse de NaCl 0,15 M.

2) dans chaque puits de la plaque ELISA, 50 1 de suspension à 108 bactéries/ml sont introduits. On laisse évaporer une nuit à 37 C.

3) Les plaques sont saturées par 100 CL1 de
PGT : tampon phosphate (PBS) 10 mM, NaCl 0,15 M contenant 2,5 g/l de gélatine (réf. : G2625 ; SIGMA) et 0,1 % (V/V) de "TWEEN" 20. (PGT = PBS + "TWEEN" + gélatine).

4) 50 1 de surnageants d'hybrides, dilués au demi avec du milieu de culture RPMI, sont déposés dans les puits et laissés incuber pendant 2 heures à 37 C.

4 lavages sont effectués avec du PBST : tampon phosphate 10 mM, NaCl 0,15 M contenant 0,1 % de Tween 20.

5) 50 Rl de conjugué anti-Ig de souris-enzyme (à la dilution préconisée par le fabricant) sont déposés dans chaque puits et placés à 37 C pendant 1 heure.

6 lavages sont effectués avec du PBST.

6) Dans chaque puits sont ajoutés 100 1 de substrat chromogène adapté à l'enzyme du conjugué. La réaction colorimétrique s'effectue 15 à 30 minutes à température ambiante à l'obscurité.

7) La lecture des densités optiques se fait à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde adaptée au substrat chromogène choisi.

- Immunofluorescence sur lame
Les bactéries sont cultivées, lavées et conditionnées comme décrit dans le protocole ELISA.

1) 10 1 de suspension bactérienne à 108 cellules/ml sont déposés sur chaque puits de la lame.

Les lames sont portées à l'étuve à 37 C jusqu'à assèchement des puits.

2) Les bactéries sont fixées par addition d'une goutte d'éthanol à 70 % par puits.

Laisser agir 5 minutes puis retirer l'éthanol.

3) Les puits sont saturés par dépôt de 10 1 de PGT dans chaque puits. 30 minutes d'incubation à 37 C en atmosphère humide. Lavage à la pissette avec du PBST.

4) 10 1 de solution d'anticorps, diluée en
PGT, sont déposés dans les puits. 1 heure à 37 C en atmosphère humide. Lavage à la pissette avec du PBST.

5) 10 1 de solution de conjugué anti-Ig de souris-FITC, diluée en PGT, sont déposés dans les puits.

1 heure à 37 C en atmosphère humide à l'obscurité. Lavage à la pissette avec du PBST.

6) Dépôt d'une goutte de bleu Evans dans chaque puits. 5 minutes d'incubation à température ambiante. Lavage à la pissette avec du PBST.

Ce fluorochrome colore en rouge toutes les bactéries et facilite l'observation des bactéries non reconnues par l'anticorps.

7) L'observation se fait à l'aide d'un microscope à épi fluorescence avec les filtres adaptés aux fluorochromes (FITC et bleu Evans).

Plusieurs anticorps monoclonaux, dont celui dénommé Kun9/15A3, ont été en particulier sélectionnés pour leur reconnaissance de toutes les entérobactéries testées.

Les clones issus d'une culture primaire positive, ont été sélectionnés et injectés à des souris
Balb/c (production d'ascite), pour obtenir de grandes quantités d'anticorps. A cet effet, des souris femelles âgées Balb/c ont été stimulées par une injection intrapéritonéale de 0,3 ml de tétraméthyl-pentadécane.

Après 4 jours, 20 millions de cellules hybrides ont été injectées aux souris. Au bout de 15 jours, les liquides d'ascites ont été récoltés et leur activité anti-ACE a été testée.

4. Caractéristiques de l'anticorps monoclonal Kun9/15A3
Cet anticorps reconnaît toutes les entérobactéries entières et ne présente pas de réactions non spécifiques avec d'autres bactéries.

a. détection des entérobactéries
Les résultats sont représentés dans le Tableau
I ci-après montrant le spectre de reconnaissance de l'anticorps Kun9/15A3 ; toutes les bactéries reconnues, le sont de manière spécifique.

TABLEAU I

<tb> <SEP> Espèces <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> sou- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> résul
<tb> <SEP> ches <SEP> examinées <SEP> tats <SEP> positifs
<tb> Es <SEP> cheri <SEP> chia <SEP> coli <SEP> 14 <SEP> 14
<tb> E. <SEP> fergusonii <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> E. <SEP> hermannii <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> E. <SEP> vulneris <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> E. <SEP> adecarboxylata <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Salmonella <SEP> spp <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> Levinea <SEP> malonatica <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> L. <SEP> amalonatica <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Citrobacter <SEP> freundii <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> K. <SEP> oxytoca <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> K. <SEP> ozonae <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> K. <SEP> terrigena <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> K.<SEP> planticola <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> E. <SEP> amnigenus <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> E. <SEP> sakazakii <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> E. <SEP> agglomerans <SEP> 11 <SEP> 11
<tb> E. <SEP> intermedius <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> E. <SEP> asbuviae <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Hafnia <SEP> alvei <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> S. <SEP> liquefaciens <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> S. <SEP> fonticola <SEP> 9 <SEP> 9
<tb> S. <SEP> odorifera <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> S. <SEP> rubidaea <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> S. <SEP> plymuthica <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> S. <SEP> ficaria <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Proteus <SEP> mirabilis <SEP> 11 <SEP> 11
<tb> Prov.<SEP> vulgaris <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Morganella <SEP> morganii <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Pro <SEP> vi <SEP> den <SEP> cia <SEP>
<tb> rustigianii
<tb> P. <SEP> stuartii <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>

<tb> <SEP> Espèces <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> sou- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> résul
<tb> <SEP> ches <SEP> examinées <SEP> tats <SEP> positifs
<tb> Yersinia
<tb> enterocolitica <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Y. <SEP> aldovae <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Y. <SEP> pseudotuberculosis <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Y. <SEP> ruckeri <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Y. <SEP> frederiksenii <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Rahnella <SEP> aquatilis <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Buttiauxella <SEP> agrestis <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Kluyvera <SEP> ascorbata <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> K. <SEP> cryocrescens <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Edwardsiella <SEP> tarda <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Ed.<SEP> hoshinae <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Pragia <SEP> fontium <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> Budvicia <SEP> aquatica <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Pseudomonas
<tb> aeruginosa <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> fluorescens <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> aureofaciens <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> chloraphis <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> putida <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> mendocina <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> stutzeri <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> vesicularis <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> acidovorans <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> pseudomalei <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> pickettii <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> paucimobilis <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Xan <SEP> thomonas <SEP>
<tb> maltophilia <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> Acinetobacter
<tb> calcoaceticus <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> A. <SEP> haemolyticus <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> A. <SEP> junii <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> A. <SEP> johnsonii <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> A. <SEP> lwoffi <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> A.<SEP> baumanii <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> Achromobacter
<tb> xylososidans <SEP> 8 <SEP> 0
<tb>

<tb> <SEP> Espèces <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> sou- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> résul
<tb> <SEP> ches <SEP> examinées <SEP> tats <SEP> positifs
<tb> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> Pasteurella
<tb> haemolytica <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Ha <SEP> emophi <SEP> 1 <SEP> us <SEP>
<tb> influenzae <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Vibrio <SEP> sp <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Pleisomonas
<tb> shigelloldes <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Aeromonas <SEP> hydrophilia <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Bacteroides <SEP> fragilis <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> Streptocoque <SEP> hémoly
<tb> tique <SEP> A, <SEP> B, <SEP> C, <SEP> G <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Streptocoque <SEP> D <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Streptococcus
<tb> pneumoniae <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Staphyl <SEP> ococcus <SEP>
<tb> epidemidis <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
b. spécificité de l'anticorps Kun9/15A3
Deux photographies (figures l.a. et l.b.) illustrent la spécificité de l'anticorps Kun9/15A3. Elles montrent, dans un même champs de microscope, le marquage par immunofluorescence indirecte avec Kun9/15A3 sur lame, d'un mélange de E. Coli 014:K7 (bacilles courts) et de
Lactobacillus fermentum (bacilles allongés).

Les figures l.a. et l.b. illustrent la détection par immunofluorescence (vert) avec l'anticorps
Kun9/15A3 et une coloration non spécifique (rouge) par le bleu Evans.

La photo l.b. illustre la spécificité de reconnaissance de l'anticorps Kun9/15A3. En effet, on observe que seules les entérobactéries (petites bactéries ovales) sont colorées en vert, (filtre "BLUE" X1250), témoin de la réaction immunologique avec l'anticorps
Kun9/15A3. Les lactobacilles (longues bactéries) ne présentent pas ce marquage. Par contre, on observe une faible émission de fluorescence due au bleu Evans (en rouge). Ceci est dû à un recouvrement des spectres d'émission de fluorescence des deux fluorochromes. Le filtre d'émission utilisé n'est pas assez sélectif et ne peut être restreint à une seule longueur d'onde.

L'intérêt de cette photo réside dans la visualisation des deux populations bactériennes, l'une reconnue par l'anticorps et l'autre non reconnue.

Le champ de la photo l.a. est identique à celui de la photo l.b., seul le filtre change. Toutes les bactéries sont colorées en rouge (filtre "GREEN", X1250).

Comparée à la photo l.b., elle permet de vérifier que toutes les entérobactéries sont reconnues par l'anticorps
Kun9/15A3 et elles seules.

Exemple 2 : Procédé de détection conforme à l'invention recherche d'entérobactéries dans des produits alimentaires.

A) Extraction
Une extraction est nécessaire lorsque lon recherche des bactéries dans des produits non filtrables.

Le protocole décrit ci-dessous a été mis au point pour un fromage (le "Philadelphia") et pour du ketchup mais convient certainement pour beaucoup d'autres produits alimentaires.

Pour des produits filtrables, tels que l'eau minérale, on commence le protocole de détection directement à partir de l'étape de filtration.

1. A 5 g de "Philadelphia", on ajoute 45 ml de
Milieu MOSSEL, puis on homogénéise.

2. On prélève 10 ml de l'homogénat puis on le centrifuge 5 minutes à 1500 g.

3. On aspire et jette le surnageant puis on sèche la paroi du tube avec un papier absorbant.

4. On ajoute 14 ml d'un tampon de solubilisation convenable tel que PBS et on incube 8 minutes à 40 C.

5. On place l'échantillon dans un tube de 40 ml équipé d'un filtre de porosité 30 Rm. On centrifuge 5 minutes à 1500 g.

6. On élimine le surnageant par aspiration et on essuie le tube comme précédemment.

7. On ajoute 3 ml de NaCl à 9 g/l.

L'échantillon est prêt pour le marquage.

B) Marquage sur filtre
Les filtrations sont réalisées en provoquant un vide sous le filtre.

Tous les tampons et réactifs utilisés au cours de cette manipulation sont préalablement filtrés avec un filtre de porosité 0,2 Clam.

1. On filtre les 3 ml de suspension bactérienne préparée comme précédemment ou 250 ml d'eau minérale sur une membrane de porosité 0,4 pin.

2. On fait sécher le filtre dans une étuve à 37 C.

3. On fixe en déposant sur le filtre de l'éthanol.

4. On lave par filtration avec du PBS-Tween.

5. On dépose l'anticorps Kun9/15A3, dilué en
PBS-Tween-BSA.

6. On incube à 37 C.

7. On lave par filtration avec du PBS-Tween.

8. On dépose le second anticorps biotinylé, dilué en PBS-Tween-BSA.

9. On incube à 37 C.

10. On lave par filtration avec du PBS-Tween.

11. On dépose la streptavidine-FITC, diluée en
PBS-Tween-BSA.

12. On lave par filtration avec du PBS-Tween.

13. On observe avec un microscope à épifluorescence.

Si l'échantillon contient des entérobactéries, seules celles-ci apparaîtront vert fluorescent.

Exemple 3 : Comparaison anticorps 898 de l'art antérieur/anticorps Kun9/15A3 conforme à l'invention
1. Des photographies d'immunoempreintes figure 2.A. (ou "western blot") montre que l'antigène commun des entérobactéries n'est pas reconnu de la même façon par l'anticorps Kun9/15A3 (une seule bande importante reconnue) et par l'anticorps 898 (image en "échelle") ; il ressort de ce qui précède, que ces deux anticorps ne reconnaissent pas le même déterminant antigénique.

L'expérience a été effectuée dans les conditions décrites par PETERS et al. dans "Infection and
Immunity", vol. 50, n 2, p. 459 (1985). L'E. Coli 2506 présentée dans cet article (figure 2, page 464, ligne 2), est 1' E. Coli 014:K7 (voir tableau 2, page 460 du même article). La même bactérie a été utilisée pour l'expérience. Les images sont nettement différentes.

Le traitement des bactéries, l'électrophorèse et le transfert sur nitrocellulose ont été effectués comme cela a été décrit par PETERS et al. dans "Infection and Immunity", vol. 50, n 2, p. 459 (1985).

La figure 2.A. illustre la révélation effectuée en utilisant l'anticorps monoclonal Kun9/15A3, conforme à l'invention et comprend en colonne 1 : Pseudomonas maltophila, en colonne 2 : Citrobacter freundii, et en colonne 3 : E. Coli 014:K7.

On constate que le profil de la colonne 3 (1 seule bande) est nettement différent de celui présenté dans l'article cité ci-dessus (figure 2, colonne 2 image en "échelle").

La figure 2.B. illustre une coloration non spécifique (argent) de toutes les protéines et poly saccharides présents dans le surnageant d'entérobactérie introduit dans le gel ; la figure 2.C. correspond à des marqueurs de poids moléculaires du commerce, qui permettent de bien situer chaque bande dans le gel et sur le western blot.

La comparaison de la figure 2.B./2.C. avec la figure 2.A., illustre la spécificité de l'anticorps conforme à l'invention.

WESTERN BLOT
- Principe
Il permet de détecter des protéines après leur immobilisation sur une membrane de nitrocellulose à l'aide d'anticorps marqués à la peroxydase. Il s'agit de transférer les protéines sur la membrane après séparation dans un gel. On obtient donc la réplique exacte du gel et grâce à la propriété intrinsèque de la membrane, ces protéines sont immobilisées et gardent toutes leurs propriétés antigènes ou anticorps. On incube alors ces empreintes avec des anticorps spécifiques qui vont se fixer sur les protéines contre lesquelles ils sont dirigés. Ce lieu de fixation est repéré par le produit de la réaction enzymatique. L'électrophorèse et le transfert sont réalisés comme préconisé par le fabricant (LKB).

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS (b) un deuxième tri, par immunofluorescence, du/des surnageant(s) sélectionné(s) en (a). (a) un premier tri de chaque surnageant d'hybride à l'aide d'une méthode ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, au moins deux entérobactéries vivantes, éventuellement traitées de manière appropriée, et au moins une bactérie n'appartenant pas à la famille des entérobactéries, puis - en ce qu'ils sont sélectionnés, à partir d'hybridomes préparés de manière appropriée, par - en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux capables de reconnaître toutes les entérobactéries entières, c'est-à-dire n'ayant subi notamment aucune opération d'extraction, par liaison avec un déterminant antigénique de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface desdites entérobactéries entières et directement accessible auxdits anticorps, et

1') Anticorps anti-entérobactéries, caractéri ses :

2 ) Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce que le premier tri (a) est réalisé à l'aide d'au moins 5 entérobactéries vivantes.

3 ) Anticorps selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides murines, résultant de la fusion de cellules de myélome de souris, de préférence non sécrétantes et de plasmocytes de souris immunisées à l'aide d'un surnageant convenablement préparé à partir d'une entérobactérie choisie dans le groupe qui comprend E. Coli 014:K7 et E. Coli 0124:Bl7.

4 ) Fragments antigéniques, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par les anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et en ce qu'ils sont constitués par un fragment de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface des entérobactéries entières, lequel fragment est directement accessible auxdits anticorps et constitue au moins un déterminant antigénique de 1'ACE.

5 ) Réactif immunologique utilisable pour la détection des entérobactéries entières, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un fragment de celui-ci, l'un ou l'autre éventuellement modifié par marquage par tout marqueur approprié, notamment enzyme, fluorochrome, et/ou fixé sur un support solide.

6 ) Procédé de détection, et éventuellement de numération, d' entérobactéries entières, éventuellement présentes dans un échantillon à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en présence ledit échantillon à analyser avec au moins un réactif immunologique selon la revendication 5, auquel se lient les entérobactéries entières, si ces dernières sont présentes dans l'échantillon à contrôler, puis à détecter les complexes anticorps-entérobactéries éventuellement formés par tout moyen approprié, notamment EIA, cytométrie en flux.

7 ) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que préalablement à la mise en contact anticorps-échantillon, ce dernier est solubilisé de manière appropriée.

- des quantités ou doses appropriées d'une substance de révélation, si nécessaire.

- un réactif immunologique selon la revendication 5, et

8 ) Kit ou trousse de diagnostic pour la détection spécifique, et éventuellement la numération d'entérobactéries, caractérisé en ce qu'il comprend au moins

9 ) Utilisation des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans la détection spécifique, et éventuellement le dénombrement, d'entérobactéries, en particulier dans des produits alimentaires.