JPH0328752A

JPH0328752A - 酵素固定化電極およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0328752A
Application number: JP1164797A
Authority: JP
Inventors: Teruyuki Omochi; 輝行尾持; Akinobu Miyawaki; 宮脇　明宣
Original assignee: Matsushita Electric Works Ltd
Current assignee: Panasonic Electric Works Co Ltd
Priority date: 1989-06-27
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1991-02-06
Anticipated expiration: 2010-05-31
Also published as: JPH0750058B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、グルコース等の基質検出用の電極などとし
て用いられる酵素固定化電極（「酵素電極」とも言う）
およびその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

酔素を白金等の電極本体（または電極素材。以下同様）
表面上に固定化した酵素固定化電極として、ゼラチンお
よび架橋剤としてのグルタルアルデヒドを含む希薄な酵
素溶液を白金電極に塗布し、電極本体表面上で製膜を行
うとともに、酵素を共有結合的に固定化して電極本体表
面上に酵素固定化膜を形成したものがある。ここで、ゼ
ラチンは、酵素固定化膜のマトリソクス威分となるもの
であって、希薄な．酵素溶液と架橋剤としてのグルタル
アルデヒドだけでは架橋反応により得られる酵素固定化
膜の強度が弱いので、膜強度を高めるために使用される
。たとえば、グルコースオキシダーゼの固定化膜では、
酵素に対して５〜１０倍程度のゼラチンを加えてグルタ
ルアルデヒドで架橋させて製膜するようにしている。

このような酵素固定化電極を用いるに際しては、試料溶
液中における被測定物質以外の多種多様の威分の妨害か
ら酵素固定化電極を保護する必要がある。そのため、電
極本体表面と酵素固定化膜の間などに妨害物質を除去す
る妨害物質除去膜（以下「妨害除去膜」と言う）を形威
した妨害不感型酵素固定化電極が提案されている。

たとえば、特開昭６２−８８９５３号公報では、電極本
体表面にグルコースオキシダーゼの固定化膜を設けたも
のを、ビロールおよびＮａ　Ｃｆｆを含む電解重合液中
に浸して電解重合処理を行い、前記固定化膜の上に電解
重合膜を備えた酵素固定化電極が記載されている。同電
解重合膜が妨害除去膜である。また、特開昭６３−３０
４１５０翼一公報では、電極本体表面に内側膜、中間膜
および外側膜をこの順に設けた酵素固定化電極が記載さ
れている。中間膜は、グルコースオキシダーゼの固定膜
である。外側膜は、ポリカーボネー１・フィルムであり
、未希釈の血液または血清中のグルコース分子に比べて
高分子物質の除去を行う。内側膜は、酢酸セルロースか
らなる膜であり、ボリヵーボ不−１−フィルムで除去さ
れなかった妨書物質（たとえば、アスコルビン酸および
尿酸）を除去する。

〔発明が解決しようとする課題〕

電極本体表面上で製膜された妨害除去膜を備えた妨害不
感型酵素固定化電極では、妨害除去膜が乾燥に弱いため
、湿度の変化により膜の収縮が生し、水溶液中での測定
および乾燥を繰り返セば、電極本体表面から妨害除去膜
および酵素固定化膜が剥離し、検出感度が低下するなど
して使用できなくなるという欠点がある。

また、第３図（ａ）にみるように、酵素を固定化してい
ない妨害除去膜５は、湿度が低ずぎると、電極本体ｌよ
り剥離するため、酵素の固定化作業をたとえば湿度８０
％以上の調湿器内で行わなければならない。

この発明は、このような事情に鑑みてなされたものであ
って、電極本体からの妨害除去膜の剥離が生しにくく、
出力感度の初期変動の小さい酵素固定化電極を提供する
ことを第１の課題とする。

さらに、この発明は、妨害除去膜の上に酵素固定化膜を
形或する場合に、雰囲気の調湿を行わなくてもよい酵素
固定化電極の製造方法を提供することを第２の課題とす
る。

〔課題を解決するための手段〕

発明者らは、妨害除去膜の電極本体からの剥離を防いだ
り、雰囲気の調湿を行わずに妨害除去膜の上に酵素固定
化膜を形戒したりするための手段を検討した。その結果
、妨害除去膜自体に保湿性を持たせればよいことを見出
し、この発明を完成させた。

したがって、上記第１の課題を解決するために、この発
明にかかる酵素固定化電極は、導電性材料からなる電極
本体に酵素固定化膜および妨害除去膜が設けられている
ものにおいて、前記妨害除去股が保湿剤を含んでいるこ
どを特徴とする。

上記第２の課題を解決するために、この発明にかかる酵
素固定化電極の製造方法は、導電性材料からなる電極本
体表面上に形成された妨害除去膜の上に酵素固定化膜を
形成するにあたり、前記妨害除去膜に保湿剤を含めてお
くことを特徴とずるこの発明の酵素固定化電極は、電極
本体表面上に少なくとも妨害除去膜および酵素固定化膜
を備えている。好ましくは、電極本体表面上に下地膜、
妨害除去膜および酵素固定化膜の３層を少なくとも備え
ている。

ここで、下地膜は、妨害除去膜の電極本体への密着性を
良くするために必要に応して用いられる。下地膜は、た
とえば、ゼラチン水溶液などの生体高分子水溶液に架橋
剤を添加したものを電極本体表面に塗布し、架橋反応を
行って形成された膜である。下地膜のマトリソクス戒分
はゼラチンに限定されない。架橋剤としては、たとえば
グルタルアルデヒド等のジアルデヒドが用いられる。

妨害除去膜は、マｌ・リソクス成分の少なくとも一部が
保湿剤であり、たとえば、アルブミン等のタンパク、ボ
リアリルアミン等の水溶性高分子、保湿剤および架橋剤
を含む溶液を電極本体または前記下地膜または酵素固定
化膜上に所定量を塗布し、架橋反応を行わせて、電極表
面上で製膜を行う。保湿剤としては、妨害除去膜の水分
を保ったりあるいは高めたりするものであれば特に限定
はないが、コラーゲン、ポリエチレングリコールアルキ
ル化合物などの界面活性剤、ポリビニルピロリドンやポ
リビニルアルコールなどの水溶性高分子があるが、妨害
除去膜の保湿性を保ち、かつ、妨害除去効果の低下が少
ないという点からは、コラーゲンを保湿剤として用いる
のが好ましい。コラーゲンとしては、酸処理コラーゲン
、アルカリ処理コラーゲン、酵素可熔性コラーゲンなど
のいずれも使用可能であり、コラーゲンのタイプも特に
限定はない。妨害除去膜を作製するための熔液（以下「
妨害除去膜作製液」と言う）では、コラーゲンの濃度は
、特に限定されないが、ｏ．ｏｉ〜０．１重量％の範囲
が好ましい。０．１重量％を越えると、膜の透過性が悪
くなり、応答速度が悪くなる。この発明にかかる酵素固
定化電極の応答性は、たとえば２０〜３０秒である。ま
た、妨害除去膜の架橋の程度によって除去されうる物質
の種類を適宜変えることも可能である。妨害除去膜のマ
トリックス戒分としては、保湿剤を含むのであれば、上
記のものに限定されない。架橋剤としては、たとえばグ
ルタルアルデヒド等のジアルデヒドが用いられる。

酵素固定化膜は、グルコースオキシダーゼおよびコレス
テロールオキシダーゼ等の酵素、ゼラチン等の生体高分
子、および、架橋剤を含む溶液（たとえば、水溶液）を
電極本体上または妨害除去膜上に所定量塗布し、架橋反
応を行わせて製膜を行うとともに固定化して作られる。

酵素は、１種類のみを用いるようにしてもよいし、失活
などの悪影響が生しないのであれば、２種類以上を用い
るようにしてもよい。酵素固定化膜のマトリソクス威分
としては、酵素の働きを損なわないのであれば、上記の
ものに限定されない。架橋剤としては、たとえばグルタ
ルアルデヒド等のジアルデヒドが用いられる。

このようにして得られるこの発明にかかる酵素固定化電
極は、保湿剤によって妨害除去膜の水分が保たれるため
、保湿性を保つことができ、乾燥による妨害除去膜の電
極本体からの剥離を防くことができる。また、測定溶液
中での膨潤率、乾燥させたときの収縮率が小さくなり、
酵素固定化電極として使用したときの感度のハラッキが
なく、安定した測定を行うことができる。

また、妨害除去膜作製用の水溶液の塗布性も良くなり、
電極表面上に膜厚が均一になるように製膜することがで
きる。

保湿剤を含まない従来の妨害除去膜では、電極本体に妨
害除去膜作Ｍ肢を塗布後、調湿器の外、たとえば、湿度
４０〜６０％程度の雰囲気下に５〜１０分間放置すると
、第３図（ａｌにみるように、妨害除去膜５が電極本体
１から剥離してしまう。

このため、調湿器内で湿度８０％の雰囲気下に保って第
３図（ｂ）にみるように妨害除去欣４を作製ずる必要が
あった。これに対し、この発明にかかる酔素固定化電極
の製造方法では、妨害除去膜の」二に酵素固定化膜を形
成するにあたり、あらかしめ前記妨害除去膜に保湿剤を
含ませておくので、調湿器の外、たとえば、湿度４０〜
６０％程度の雰囲気下に５〜ＩＯ分間放置しても、第３
図ｔｂ＋にみるように妨害除去膜４が形成され、剥離が
生しにくい。第ｌ〜３図中、３は、セラミソク、合威樹
脂等からなる絶縁性基板である。電極本体１は、たとえ
ば、この基板３の上に形成されているが、このようなも
のに限定されない。

なお、この発明にかかる酵素固定化電極は、１０００回
以上の連続測定も可能である。

〔作　　　用〕

坊害除去股が保湿剤を含んでいることにより、乾燥・湿
潤による収縮・膨潤の変化が小さくなり、剥離しにくく
なる。

また、妨害除去膜が保湿剤を含んでいることにより、同
妨害除去膜の上に酵素固定化膜を形威するときの雰囲気
の調湿を行わずにすみ、妨害除去膜が電極本体から剥離
するのが防がれるという利点も得られる。

〔実　施　例〕

以下に、この発明の具体的な実施例および比較例を示す
が、この発明は下記実施例に限定されない。

実施例ｌ〜５および比較例第１表にみるような組威の下地膜作製溶液、妨害除去膜
作製肢および酵素固定化ｆ６波を用いた。

９１０妨害除去膜のマトリックス成分としてポリアリルア主ン
およびアルブミンを、架橋剤としてグルタルアルデヒド
を、保湿剤としてコラーゲンをそれぞれ用いた。酵素固
定化膜のマトリソクス威分は、ゼラチン、ポリアリルア
ミン、アルブミンであり、架橋剤はグルタルアルデヒド
である。下地＋１Ｑ作製液を第１図にみるように、リー
ド部２を有し、基板３上に設けられた電極本体（白金電
極）１表面上に所定量塗布したのら架椙反Ｌｌ＞を行わ
−Ｗて下地膜をｆｉ１膜した。この下地膜の表面に第１
表に示す組成の妨害除去膜作製液６を塗布して（第２図
参照）架橋反応を行わせ、妨害除去膜４を形威した（第
３図（ｂｌ参照）。この妨害除去膜４の表面に第１表に
示ず組威の酵素固定化溶液を塗布して架橋反応を行わせ
、酵素固定化膜を形成した。

なお、比較例では、妨害除去映作製液を第２図にみるよ
うに塗布してから湿度４０〜６０％の雰囲気下に５〜１
０分間放置したところ、第３図（＝１）にみるように、
妨害除去膜５が電極本体１から剥離してしまった。この
ため、妨害除去映作製液を塗布して調湿器内に入れ、湿
度８０％以上の雰囲気下で妨害除去膜の作製（第３図（
ｂｌ参照）および酵素固定化膜の作製を行った。

上記実施例および比較例で用いたボリアリルアミンは平
均分子量約６００００であり、実施例で用いたコラーゲ
ンは■高研製の牛真皮・可熔性タイフ゛Ｉコラーゲン冫
容液（ｐ　Ｈ　３．　０、濃度０．３％）のものであっ
た。

実施例１〜５および比較例の各酵素固定化電極について
検出感度（測定感度）、保湿性および感度変動を調べて
結果を第１表に示した。感度は、酵素固定化電極をポー
ラ口アナライザ等の測定装置に接続し、電圧０．６Ｖ（
対Ａｇ電極）、サンプル量を２０μＣとして測定した。

サンプルは、１５０ｎｗ／ｄ１のグルコース溶液、１０
０■／ｄ１のコレステロール溶液、妨害物質として、ア
スコルビン酸（濃度２０■／ｄ１）、血岐の凝固防止な
どに使用されるＮａＦ（濃度５０■／ｄ！〉を用いた。

保湿性は、妨害除去膜作製液を塗布後、湿度４０〜６０
％の雰囲気下で５〜１０分間程度のうちにｌ１１２妨害除去膜が剥離しない場合を○、剥亜した場合を×で
示した。感度変動は、得られた酵素固定化電極を用いて
標準液で２０回測定したときの１回目の感度の測定値と
２０回目の感度の測定イ直との変化を下式により求めて
示した。

１３第１表からわかるように、実施例１〜３の酵素固定化電
極は、いずれもグルコースを感度良く検出することがで
き、実施例４および５の酵素固定化電極は、いずれもコ
レステロールを感度良く検出することができた。また、
実施例■〜５では、妨害物質はほとんどまたは全く検出
されなかった。これに対し、比較例の酵素固定化電極で
は、感度変動が実施例のもの（±２％以内）よりも大き
かった（±４〜５％）。また、比較例のものは、湿度４
０〜６０％ＲＨの雰囲気下では、第３図（ａｌにみるよ
うに、妨害除去膜５が電極本体１から剥離したが、実施
例のものでは、同し条件下で剥離しなかった。

なお、上記実施例では、固定化する酵素として、グルコ
ースオキシダーゼおよびコレステｒ：Ｉ−ルオキシダー
ゼを用いたが、この発明において使用できる酵素はこれ
らの２者に限定されるものではない。また、測定用の戒
も血渣に限るものではない。

〔発リ１の効果〕この発明にかかる酵素固定化電極は、導電性材料からな
る電極本体に酵素固定化膜および妨害除去股が設けられ
ているものにおいて、前記妨害除去膜が保湿剤を含んで
いることを特徴とするので、妨害除去膜の剥離がなく、
感度の良い、安定した測定を行うことができる。

この発明にかかる酵素固定化電極の製造方法は、導電性
材料からなる電極本体表面上に形成された妨害除去膜の
上に酵素固定化膜を形成するにあたり、前記妨害除去映
に保湿剤を含めておくことを特徴とするので、妨害除去
膜の上に酵素固定化膜を形成するときに、調湿する必要
がない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例および比較例に用いた白金電極のｍ雌
を表す斜視図、第２図は、同白金電極に妨害除去膜作製
液を塗布した状態を表す概略断面図、第３図＋８＋は、
比較例の酵素固定化電極における妨害除去膜形威後で酵
素固定化膜形成前の状態を表す概略断面図、第３図ｆｂ
ｌは、実施例の酵素固定化電極における妨害除去膜形成
後で酵素固定化１５１６膜形威前の状態を表す概略断面図である。１・・・電極本体　４・・・妨害除去欣第１図

Claims

【特許請求の範囲】１　導電性材料からなる電極本体に酵素固定化膜および
妨害物質除去膜が設けられている酵素固定化電極におい
て、前記妨害物質除去膜が保湿剤を含んでいることを特
徴とする酵素固定化電極。２　導電性材料からなる電極本体表面上に形成された妨
害物質除去膜の上に酵素固定化膜を形成する酵素固定化
電極の製造方法において、前記妨害物質除去膜に保湿剤
を含めておくことを特徴とする酵素固定化電極の製造方
法。