JPH03228684A - 有機化合物に関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列、朽特異性プロモーターおよ
びその用途に関するものである。

こ従来の技術］ 雄性不ねん性栽培植物は、多数の植物種間で増殖を行な
い、新栽培種を産生の際育種家を妨害する自家受粉を妨
げるため、その創出は長い間経済的に関心がもたれてい
た。

雄性不ねん性は特にハイブリッド種子の製造において関
心からたれている。例えば、穀物、野菜、鑑賞植物のよ
うな多数の単子葉および双子葉栽培植物がハイブリッド
種として市販されている。これらのハイブリッド種の製
造は、２種の親ラインの１種の雄性不ねん性によ、りか
なり容易となる。

選択により得られた雄性不ねん性を有する栽培植物は既
に知られている。しかしながら、上記植物を得ることは
困難である。

ｗｕｎ　ｌ遺伝子」と呼ばれるＤＮＡ配列の遺伝子は、
ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）か
ら単離され、ザ・プラント・セル（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ
　Ｃｅ１ｌ）、第１巻、第１５１−１５８頁（１９８９
年）、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシーズ・イン・ニーニスエイ
（Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、第８５巻、
第１１３６−１１４０頁（１９８８年２月）およびドイ
ツ特許公開第ＤＥ−Ｏ８３８３７７５２号のような文献
から知られている。ｗｕｎ　ｌ遺伝子は傷害または病原
微生物感染の場合に遺伝子産生の発現を導くことが知ら
れている。ｒｗｕｎｌ遺伝子」の場合、１０２２ｂｐ長
さ（＋　Ｉ　７９ｂｐ（塩基対）ｗｕｎ　ｌの５°非翻
訳領域）のプロモーター領域は、実際の構造遺伝子領域
か別の構造遺伝子（例えば、ＣＡＴ、ＧＵＳ）に置き換
わっている場合にさえ傷害誘発活性を維持する。

このようにして、傷害誘発ｗｕｎ　ｌプロモーター活性
を、形質転換したたばこ植物の葉、茎および根で検出す
ることができる。

傷害刺激ＤＮＡ配列およびその用途に関するドイツ特許
公開第ＤＥ−Ｏ９３８３７７５２号とは異なって、本発
明は約特異性発現ＤＮＡ配列およびそれらの用途に関す
る。ＤＮＡ配列が確認され、それにより構造遺伝子が的
中で特異的に発現することが可能になる。

すでに述べた文献から知られているｗｕｎ　１遺伝子、
傷害および／または感染誘発ＤＮＡ配列として使用され
得るだけでなく、ｗｕｎ　１遺伝子のプロモーターが短
縮されているならば朽特異性発現ＤＮＡ配列を到達する
ことができることが知られた。

この特徴を区別するのに必要な領域は、１２０１塩基対
（ｂｐＸｗｕｎ　１プロモーターの１０２２　（ｂｐ）
＋５゛非翻訳領域の＋１７９ｂｐ）にわたっている。１
２０１塩基対長が、例えば５゛末端てｗｕｎ　１プロモ
ーターの４５１ｂｐの除去により減少するならば、この
短縮プロモーターは的中てまた活性である。

このことは、短縮ブロモ−クーに結合する場合、レポー
ター遺伝子、すなわち形質転換細胞または植物中で表現
型の選択可能または視覚選択可能な変化を起す遺伝子で
証明される。例えば変色のような表現型の変化は、花粉
および朽の口辺細胞（Ｓｔｏｍｉｕｍ）以外の植物のど
んな部分でも見ることができない。

このようにして、ＧＵＳをレポーター遺伝子として使用
し、例えば４５１ｂｐ（−５７１ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ）
をｗｕｎ　１プロモーターの５°末端で除去し、この切
断プロモーターを例えば形質転換したたばこ植物で試験
するならば、傷害または非傷害の葉、茎および根では何
らの活性も見ることができない。

しかしながら、切断プロモーターは朽中では驚くべきこ
とに構成型な活性を示す。

便宜上、１０２２ｂｐのプロモーター領域およびプロモ
ーター領域の３°末端で結合した１７９ｂｐの５°非翻
訳領域をここでは一１０２２ｗｕｎｌと称する。Ｘ（例
えば４５１）ｂｐの長さたけ５′末端で短縮されたその
フラグメントは（−１０２２＋ｘ）＋ｖｕｎ１（例えば
−５７１ｗｕｎｌ）と称する。ＵＳ遺伝子の５°末端で
結合した上記プロモーター（例えば５７１ｗｕｎｌ）を
有するベクターは（−１０２２＋Ｘ）ｗｕｎｌ−ＧＵＳ
（例えば−５７１ｗｕｎｌ　−ＧＵＳ）と称する。

５７１ｗｕｎｌ　−ＧＵＳで見られる同様な表現作用は
、例えば−８６ｗｕｎｌ−ＧＵＳのような他のｗｕｎ　
１プロモーターフラグメントでも見られる。

それ教本発明は、ｗｕｎ　ｌ遺伝子の５°上流領域のＤ
ＮＡ分画のＤＮＡ配列、それに相同なＤＮＡ配列および
その部分であり、上記ＤＮＡ配列は構成型葯特異性プロ
モーター活性を有するものである、ＤＮＡ配列を提供す
るものである。

本発明の構成型葯特異性プロモーターのＤ　Ｎ　Ａ配列
に同族的であるＤＮＡ配列の用語は、ある数のヌクレオ
チドか除去および／または加えられているが、それでも
なお適当なハイブリッド化条件下で本発明の構成型葯特
異性プロモーターのＤＮＡ配列に相捕的なヌクレオオド
配列にハイブリット化することができる本発明の構成型
約特異性プロモーターのＤＮＡ配列を意味する。本発明
の目的上、適当なハイブリッド化条件は、好都合に５×
標準くえん酸生理食塩水（Ｓ　Ｓ　Ｃ）、０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×デンハルト溶液、
５０％ホルムアミドおよび１００μ９／Ｍ（１担体ＤＮ
Ａからなる緩衝液系（以下、緩衝液系と称する）中で４
２℃１６時間インキュベートし、その後ｌＸ５ＳＣおよ
び０．１％ＳＤＳからなる緩衝液で６５℃および約１時
間毎３回洗浄することを含む。

本発明の目的のハイブリッド化条件は、４９℃１６時間
緩衝液系中でインキュベートし、０．　１ｘｓｓｃおよ
び０．１％ＳＤＳからなる緩衝液で５５°Ｃｉ１時間毎
３回洗浄することを含むのが好ましい。本発明の目的の
ハイブリッド化条件は５５°Ｃ１６時間緩衝液系中でイ
ンキュベートし、０゜ｌＸ５ＳＣおよびＯ１％ＳＤＳか
らなる緩衝液で６５°Ｃ約１時間毎３回洗浄することか
最も好ましい。

構成型葯特異性プロモーター活性を有する本発明による
プロモーター要素の適当な例は、ｗｕｎ　ｌ遺伝子、そ
のＤＮＡ配列同族体およびその部分のａ）−５７１から
＋１７９まで、 ｂ）−５７１から＋１まで、 ｃ）−８６から＋１７９まで、 ｄ）−８６から＋１まで、 ｅ）−８６から＋１７９配列に３′結合した５７１から
−２１まで、 およびｆ）−８６から＋１配列に３°結合した５７１か
ら−１１１まで の塩基配列である。

構成型葯特異性プロモーター活性を有する他のＤＮＡ配
列は、その塩基対を除去し、例えばＧＵＳのようなレポ
ーター遺伝子を使用する本明細書中に記載されｆコ方法
に類似の既知方法で構成型葯特異性プロモーター活性に
ついて上記短縮プロモーターをスクリーニングすること
により、−１０２２ｗｕｎ＋プロモーターから誘導する
ことができる。

本発明のプロモーターは的中で遺伝子産生物の選択発現
を可能にするという点で有益である。本目的では、本発
明のプロモーターは、例えば的中での細胞発達を阻害し
または影響を与えることのように、的中での遺伝子産生
物の選択的発現が目的とされている遺伝子または鑑賞目
的のための遺伝子に機能し得るように結合する。

従って本発明は、遺伝子に機能し得るように結合してい
る本発明の構成型葯特異性プロモーターを含む形質転換
ベクターを提供する。

葯特異発現が有用な遺伝子の例としては、雄性下ねん性
を含めた発達異常を起す遺伝子、例えばｒｏｌｃ遺伝子
、または植物細胞生理を不活化する遺伝子産生物をコー
ド化する遺伝子、例えばチオニン遺伝子、ＤＮＡを分解
することのできる遺伝子産生物をコード化する遺伝子、
例えばＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼの合成をコード化
する遺伝子または朽成育に必須遺伝子の不活化によるも
の、例えばｗｕｎ　ｌアンチセンス遺伝子が含まれる。

上記遺伝子の葯特異発現は雄性不ねん性植物をもたらす
。

Ｆｌ雑種種子の製造では、Ｆｌ雑種作物がその果実また
はその種子を目的として育成されるならば回復系の有効
性が必要なものとなる。本発明の用途では、上記回復系
は、形質転喚した植物に雄性不ねん性を誘発させる遺伝
子に対するアンチセンス遺伝子を使用することにより作
ることができる。アンチセンス阻害を達成する方法は当
業者では既知であり、△ｗｕｎ　１−　ｒｏｌ　Ｃ構築
物が雄性不ねん性を作るために使用されたならば、例え
ばアンチセンスｒｏｌｃ遺伝子を含むことができる。同
様な方策をチオニン遺伝子に使用することができ、エン
ドヌクレアーゼ誘導雄性下ねん性の場合、アンチセンス
法を使用することができるだけでなく、エンドヌクレア
ーゼ誘導雄性下ねん性に対する回復剤を作る対応メチラ
ーゼ遺伝子の挿入も使用できる。

適当な回復遺伝子を含む雄性ラインと、母ラインにおけ
る遺伝子操作によ多雄性不ねん性の組み合せは、果実ま
たは種子の標準量を収穫することのできるねん性Ｆｌ雑
種産生をもたらす。

遺伝子技術によりもたらされる雄性不ねん性は、明確な
遺伝子を植物の遺伝子コードに組み入れることにより、
植物の残りの特性が変化しないという利点をもたらす。

このことは、例えば組織培養および形質転換に適する双
子葉植物のような比較的よく遺伝的に操作することので
きる培養植物に特に適合する他の栽培植物にも適合する
。

雄性不ねん性を誘導しないが例えばアントノアニン生合
成系路に影響して白色または異なる色を有する花弁をも
つ在中の色づけされた杓を得る遺伝子産生物のような育
種家に関心のある他の特性を有する、朽特異的発現遺伝
子も、もちろん可能である。後者の可能性は観賞植物の
育種家に大変関心かある。

本発明は、本発明による構成型葯特異性プロモーターを
含む雄性不ねん性植物または植物材料をも提供する。

上記植物または植物材料は、好都合な形質転換技術を使
用し、所望ならば、その後、得られた形質転換植物を好
都合に繁殖させる既知方法で得ることができる。

以下の記載は、上記記載の文献から知られており、朽特
異性発現を導（ｗｕｎ　ｌプロモーターの除去を示す。

［図面の説明］ 第１図は、遺伝子クローンｗｕｎｌ−８５中のｗｕｎｌ
の配置を示す図である。ｓｕｎ　１プロモーター１゜Ｏ
ｋｂ、ｗｕｎｌ遺伝子コード化領域０．８ｋｂおよび３
°末端の２．Ｏｋｂは遺伝的クローンの４ｋｂＥｃ。

Ｒ１フラグメント上に存在する。この４ｋｂフラグメン
トはｐＵＣ８（ｐＬＳｏｏ　０）のＥｃｏＲＴ切断部位
にクローン化した。

第２図は、ｓｕｎ　１遺伝的クロ一ンｗｕｎｌ−８５の
欠失分析を示す図である。遺伝的クローンｗｕｎ　１８
５の非対照ＸｈｏＩ切断部位に基づいて、４ｋｂフラグ
メントはＭｌ　３ｍｐｌ　８（８５ＭＰ；８５＊ＭＰ１
８）の両方の配向で検出される。様々な大きさのＤＮＡ
フラグメント鵜；キソヌクレアーゼ■で連続消化により
得られる。

第３図は、ｗｕｎ　１転写開始点の決定を示す図である
。痛んだジャガイモ塊茎からのｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡは
ｐＬｓＯＯＯの１　、２　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　／　Ｘｈ
ｏｌフラグメントに対してハイブリッド化した。このこ
とは１本鎖特異Ｓｌヌクレアーゼに対して保護するＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドに導く。変性ポリアクリルアミ
ドゲル（レーンＴＵ）が示すようにヌクレアーゼ保護Ｄ
ＮＡフラグメントの長さは１６２−１７９ｂｐである。

転写の実際の出発はＸｈｏＩ切断部位から離れた１６２
−１７９ｂｐ５°である（Ａ、Ｃ，Ｇ、ＴはＤＮＡフラ
グメントの大きさで決定した配列ダイアグラムである）
。

第４図は、ｗｕｎ　ｌおよびｗｕｎｌ−８５の側面領域
のヌクレオチドを示す図である。ＣＡＡＴ−ホックス、
ＴＡＴＡ−ボックスおよびポリＡ−ングナルは黒い背景
で示す。転写の始終は矢印で示される。

第５図は、ｗｕｎ　ｌ遺伝子の重要な領域の配置および
位置を示す図である。ｗｕｎ　ｌプロモーターは黒で示
され、ｗｕｎ　ｌ遺伝子は直線で示される。重要な認識
配列は枠で示され、ｍＲＮＡは波線て示され、蛋白−コ
ード化領域は交差斜線で示されている。個々の領域の大
きさは（ｂｐ）で与えられる。

第６図は、安定なたばこ形質転換の発現分析についての
ｗｕｎｌ−ＧＵＳ５°欠失の構築を示す図である。ベク
ターｐＰＲ６９の左右のＴ　　ＤＮＡホーダー配列の間
にＮＰＴ　　Ｉｔ遺伝子はツバリン合成プロモーター（
ｎｏｓ）の制御下にある。このことはカナマイシンによ
る選択のために必要である。

ＧＵＳ遺伝子はｎｏｓ終結配列をもち、ｗｕｎ　１プロ
モーターの様々な５′欠失フラグメントにより調節され
ている。それぞれの５°欠失フラグメントの末端部位は
それぞれの構築と一緒に与えられる。

Ｒ−逆配向中のプロモーターのクローニング。

第７図は、温室の形質転換した植物のたばこの葉につい
て、様々な５°プロモーター要素によるそれらのＧＵＳ
活性を分析し１こしのを示す図である。横軸上の９モル
Ｍ　Ｕ　／　ｒｘ９蛋白／分の単位は酵素活性を示す。

縦軸はそわぞれ６−１２の様々の試験植物中の３例を示
す。これらの植物はそれぞれの試験植物の傷害後の最大
、平均および最小活性を反映する。

第８図は、構築ｐＬｓＯ３４−５７１の花粉の発芽を示
す図である。花粉中および花粉管中の青い着色は酵素活
性部分を示す。

［材料および方法コ 次の文献を参照した。

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年）、サーマリー・スタビライズド・ヘリ−・シン（０
，０１−０，３ｍｍ）ポリアクリルアミド・ケルズ・フ
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Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　）、第２０２巻、第４５−５
３頁 （２）Ｗ　アンツルシュ、Ｒ，ベイカー（１９８４年）
、ノステム・フォア・ＤＮＡ・シーエンノング・ウィズ
・レソリューション・オブ・アップ・トウ・６００・ベ
ース・ペアス、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
・アンド・バイオフィジカル・メソッズ（Ｊ　、　Ｂ　
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｅｔｈ、　）、
第９巻、第３３４７頁。

（３）Ｊ、ベツドプルツク（１９８１年）、ア・ブラン
ト・ヌクレアー・ＤＮＡ・プレパレーンヨン・プロノー
ツヤ−１Ｐ、Ｍ、Ｓ、ニュースレター（Ｎｅｗｓｌｅｔ
ｔｅｒ）　Ｕ、第２４巻。

（４）Ｃ、ヘノイスト、Ｋ、オハレ、Ｒ，ブレスナバ、
Ｐ、シャンホン（１９８０年）、ザ・オバルミン・ノー
ン・ンークエンス・オブ・ビュータテイブ・コントロー
ル・ジージャンズ、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、第８巻、第１２７−１４
２頁。

（５）Ｗ、Ｄ、ベントンおよびＲ，Ｗ、ディヴイス（１
９７７年）、スクリーニング・ラムダ・ジ−ティー・リ
コンビナント・クローンズ・パイ・ハイブリダイゼイシ
ョン・ツウ・シングル・プラークス・イン・シトウ、サ
イエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、第１９６巻、第１８０
頁。

（６）Ａ　、パークおよびＰ、Ａ、シャープ（１９８７
年）、スプライスト・アーリー・ｌｌｌＲＮＡズ・オブ
・ＳＶ４０、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・イン・ニーニ
スエイ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第７５
巻、第１２７４−１２７８頁。

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　　バクテリウム・ベクター・ファア・プラント・トラ
ンスフォメイション、ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、第１２巻、第
８４１１−８７２１頁。

（８）Ｐ、Ｒ，エバート、Ｓ、Ｂ、バー、Ｇ、アン（１
９８７年）、アイデンティフィケイション・イブ・アン
・エセンンヤル・アップストリーム・エレメント・イン
・ザ・ツバリン・ノンセイズ・プロモーター・パイ・ス
テイブル・アンド・トランジェント・アッセイ、プロシ
ーデインゲス・イブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・イ
ブ・サイエンソーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第
８４巻、第５７４５−５７４９頁。

（９）Ｆ、Ｗ、フィケッ、ト（１９８２年）、レコグニ
ション・イブ・プロティン・コーディング・ジージョン
ズ・イン・Ｄ　Ｎ　Ａ・シークエンシーズ、ヌクレイツ
ク・アノソズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、　）、第１Ｏ巻、第５３０３−５３１８頁。

（１０）Ａ、　Ｍ、フラインヤフ、Ｈレーラッハ、Ａポ
ウストカおよびＮ、ムレイ（１９８３年）、ラムダ・リ
プレイスメント・ベクターズ・キャリング・ポリリンカ
ー・ンークエンンーズ、ジャーナル・イブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、第
１７０巻、第８５７−８４２頁。

（１１）　Ｓ　　ヘニコフ（１９８４年）、ユニディレ
クンヨナル・ディノエスション・ウィズ・エクソヌクレ
アーゼ■・クリエイツ・ターゲッテド・ブレイクポイン
ツ・フォア・ＤＮＡ・シークエンンーズ、ノーン（Ｇｅ
ｎｅ）、第２８巻、第３５１−３５９頁。

（１２）Ａ、ホエケマ、Ｐ、ヒルツユ、Ｐ　ホーイカー
ス、Ｒ，ンリルペロールト（１９８３年）、ア・バイナ
リ−・プラント・ベクター・ストタテジー・ベイスト・
オン・セパレーノヨン・オア・ビル−アンド・Ｔ−リー
ジョン・イブ・Ａ、ツメファシェンス、ネイチャー（Ｎ
　ａｔｕｒｅ）、第３０３巻、第１７９−１８０頁。

（１３）Ｂ、ホーンおよびに、ムレイ（１９７７年）、
パッケージング・リコンビナント・ＤＮＡ・モレキュラ
ーズ・イントウ・バクテリオファージ・パーティクルズ
・イン・ヒドロ、プロシーデインゲス・イブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・イブ・サイエンンーズ・イン・ニ
ーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　
Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）、第７４巻、第３２５９−３２６
３頁。

（１４）Ｒ，Ａ、ジェファーソン（１９８７年）、アッ
セイイング・キメリック・ジーンズ・イン・プランツ：
ザ・ＧＵＳ・ジーン・フュージョン・システム、プラン
ト・モレキュラー・バイオロジー・レポート（Ｐｌａｎ
ｔ　　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

Ｒｅｐ、　）、第５巻、第３８７−４０５頁。

（１５）Ｃ，Ｐ、ジョン（１９８７年）、アン・インス
ベクンヨン・イブ・ザ・ドメイン・ピトウィーン・ビュ
ータテイブ・ＴＡＴＡ・ボックス・アンド・トランスレ
ーション・スタート・サイド・イン・７９・プラント・
ジーンズ、ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ（ＮＬＩ
ＣＩＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、第１５巻、第６６４
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（１６）Ｈ，レーラッハ、Ｄ、ダイアモンド、Ｊ、Ｍ。

ウォズニーおよびＨ，ボートカー（１９７７年）、ＲＮ
　Ａ・モレキュラー・ウェイト・デタミネイションズ・
パイ・ゲル・エレクトロフオリシス・アンダー・デナチ
ュアリング・コンディションズ・ア・クリティカル・リ
イグザミネイション、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、第１６巻、第４７４３頁。

（１７）Ｓ　　リプハルト（１９８８年）、デゼルタチ
ン・アン・デル・ユニヘルジテート・ツ・ケルン （１８）Ｊ、ローブマン、Ｊ、シェルおよびり、ウィル
ミッツェル（１９８７年）、インプルード・メソッド・
フォア・ザ・アイソレーション・オブ・ＲＮＡ・フロム
・プラント・ティンユーズ、アナルズ・オブ・バイオケ
ミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、第１
６３巻、第１６−２０頁。

（１９）Ｔ、マニアティス、Ｅ、Ｆ、フリッシュ、Ｊ。

サムプルツク（１９８２年）、モレキュラー・クローニ
ング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラホラトリー、コールド・スプリン
グ・ハーバ−ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
　　Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ　　Ｙ　ｏｒｋ）、第２１
１−２２７頁。

（２０）Ｊ、メシング、Ｄ、ゲラフチイー、Ｎ、Ｔ。

ツー、Ｊ、クリトルおよび■　ルーベンスタイン、プラ
ント・ノーン・ストラフチャーイン：Ｆ　コスゲ、Ｃ，
Ｐ　　メレディス、Ａホランデル（著者）、ジェネティ
ック・エンジニアリング・オブ・プランツ。プリーナム
・ブレスｏニューヨーク（Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ
　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）、第２１１−２２７頁。

（２１）Ｔ、ムラシゲ、Ｆ、スクーグ（１９６２年）、
ア・ラピッド・メソッド・フォア・ラピッド・グロース
・アンド・バイオアッセイ・ウィズ・タバコ・ティツク
≦−・カルチャーズ、フィジオロジカル・プラント（Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、　ＰＩａｎｔ）、第１５巻、第４７３−
４９７頁。

（２２）Ｍ、　Ｇ、ムレイ、Ｗ、Ｆ、　　トムソン（１
９８０年）、ラピッド・アイソレーション・オブ・ハイ
・モレキュラー・ウェイト・プラント・ＤＮＡ、ヌクレ
イツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅｓ、　）、第８巻、第４３２１−４３２５頁。

（２３）Ｂ、レイス、Ｒ，スプレンジエル、Ｈ，ウィル
、Ｈ，ンヤラー（１９８４年）、ア・ニュー・アンド・
センシティブ・メソッド・フォア・クワリタティブ・ア
ンド・クワンティタティブ・アナリシス・オブ・ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ・イン・クルード・セ
ル・エキストラクツ、ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）、第３０巻
、第２１７−２２３頁。

（２４）　Ｆ　　サンガー、Ｓ、ニクレン、Ａ、Ｒ，コ
ルソン（１９７７年）、ＤＮＡ・シークエンソング・ウ
ィズ・チェインーターミネイティング・インヒビターズ
、プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第７４
巻、第５４６３−５４６７頁。

（２５）Ｅ、　Ｍ、サザン（１９７５年）、デイテクシ
ョン・オブ・スペシフィック・シークエンソングズ・ア
マング・ＤＮＡ・フラグメンツ・セパレイテッド・パイ
・ゲル・エレクトロフォリシス、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、　）、第９８巻、第５０３−５１７頁。

（２６）Ｅ、ファン・ホーテ、Ｈ，ジョーズ、Ｍ、マズ
、Ｇ、ワレン、Ｍ　ファン・モンタグ、Ｊ。

シェル（１９８３年）、インタージェニック・トランス
ファー・アンド・イクスチェンジ・リコンビネーシジン
・オブ・レストリクジョン・フラグメンツ・クローンド
・イン・Ｉ）ＢＨ３２２ニア・ノベル・ストラブジー・
フォア・リバースト・ジェネティックス・オブ・Ｔｉ−
プラスミズ・イブ・アグロバクテリウム・ツメファシェ
ンス、Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｏ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、
第２巻、第４１１−４１８頁。

（２７）Ｊ、ヴイエラ、Ｊ、メシング（１９８２年）、
ザ・ｐＵＣ・プラスミド、アン・Ｍ１３ｎｐ７ドライブ
ド・システム・フォア・インサージョン・ミュータゲネ
シス・アンド・シークエンソング・ウィズ・シンセティ
ック・ユニバーサル・プライマーズ、ジーン（Ｇｅｎｅ
）、第１９巻、第２５９−２６８頁。

（２ｇ）Ｍ、ワッセンガ−（１９８８年）、デゼルタチ
オン・アン・デル・ウニへルジテート・ツ・ケルン （２９）Ｌ、ウイルミッツェル、Ｓ　シュマレンバッハ
およびＪ、シェル（１９８１年）、トランスクリプショ
ン・オブ・Ｔ−ＤＮＡ・イン・オクトパイン・アンド・
ツバリン・クラウン・ゴール・ツーモアズ・イズ・イン
ヒビテッド・パイ・ロウ・コンセントレイジョン・オブ
・アルファーアマニチン、ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、第
９巻、第１９頁。

（３０）　Ｃ、ヤニシューペロン、Ｊ、ビエイラ、Ｊ。

メシング（１９８５年）、インブルーブト・Ｍ２Ｓ・フ
ァージ・クローニング・ベクターズ・アンド・ホスト・
ストレインズ：ヌクレオタイド・シーエンシング・オブ
・ザ・Ｍ１３ｍｐ１８・アンド−ｐｕｃ　ｌ　９ベクタ
ーズ、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第３３巻、第１０３−１１
９頁。

（３１）Ｐ、ザムブリスキー、Ｊ、ジョーズ、Ｃ，ゲネ
テロ、Ｊ、リーマンズ、Ｍ、ファン・モンタグ、Ｊ、シ
ェル（１９８３年）、Ｔｉ−プラスミド・ベクター・フ
ォア・ザ・インダクション・オブ・Ｄ　Ｎ　Ａ・イント
ウ・プラント・セルズ・ウィズアウト・アルタレイジョ
ン・オブ・ゼイア・ノーマル・キャパシティー、ＥＭＢ
Ｏ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、第１巻、第１４７−
１５２頁。

材料 培地 細菌培養に使用した培地はマニアナイス等（１９８２年
）によるデータからとった。

植物培地 実施培地はムラシゲおよびスクーグ（１９６２年）によ
る培地（ＭＳ）に由来する。

３ＭＳ　　　：　ＭＳ＋３％Ｓ＋３％サッカロース　　
：　ＭＳ＋３％サッカロース、５００μ９／１１２クラ
ホラン ＭＳＣ１５：　ＭＳ＋２％サッカロース、５００μ９／
ｍＱクラホラン、 １００μ９／３酎硫酸カナマイシン ＭＳ　Ｃ１６：　ＭＳ＋０．５ｐ９ｈ（１，ＢＡＰ＋０
．１μ９／ｘ（２ＮＡＡ十１００μ９／ＩＩＱ硫酸カナ
マイシン＋５００μ９／Ｍ（ｌクラホラン 固体培地用に、さらに８９／ａバクト寒天を加え１こ。

株およびベクター Ｅ、ｃｏｌｉ株： ＢＭＨ７１−１８：△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｔｈｉ
、５ｕｐＥ；Ｆ”　（ｌａｃｌ’、ＺｄｅｌｔａＭ１５
ｐｒｏＡ“Ｂ”） （メジング等（１９７７年）） Ｃ６００：　　　ＣＲ３４として既知（マニアナイス等
（１９８２年）） アゲロバクチリア 株：　　　　ＬＢＡ４４０４：　（ホエケマ等（１９８
３年））プラスミド：ｐＵＣ（ヴイエイラおよびメシン
グ（１９８２年）ｐＰＲ６９（ｂｉｎ１９の誘導体、デ
バン（１９８２年））ファージ：　ＥＭＢＬ４（フリシ
ャラフ等（１９８３年））Ｍ１３ｍｐ１８（ヤニシュー
ベロン等（１９８５年））Ｍ１３ｍｐ１９（）） 植物：　　ジャガイモＡＭ８０１５７９３（単相体）ニ
コチアナ・タバクム・ライスコンシン３ｇ（Ｗ３８）万
成 別にことわらなければ、（全て標準的な分子生物学的方
法）例えば制限分析、プラスミド単離、プラスミド−Ｄ
ＮＡのミニ製造、細胞の形質転換などをマニアナイス等
（１９８２年）に記載のように実施した。

ＲＮＡ単離 ノヤカイモおよびたばこの様々な組織からのＲＮＡ単離
をロゲマン等（１９８７年）に記載のように実施した。

「ノーザン・プロット」分析 ＲＮＡを１．５％ホルムアルデヒドアガロースゲルの電
気泳動により分離した（レーラッヒ等（１９７７年））
。ウィルミッツエル等（１９８２年）に記載されたよう
に、ＲＮＡを引きつづきニトロセルロース上で転移し、
固定し、３２ｐ放射性標識ＣＤＮＡてハイブリッド化し
、洗浄および暴露した。

ＤＮＡ単離 核ＤＮＡをジャガイモの葉からベットプルツク（１９８
１年）の方法により採取し、ラムダファージＥＭＢＬ４
中でクローニングに使用した。形質転換した組織からの
ＤＮＡはトリトンｘｔｏｏ、ＳＤＳおよびプロテアーゼ
にとの結合溶菌により精製した（ワッセンガー（１９８
８年））。

「サザン・プロット」分析 Ｄ　Ｎ　Ａを０．８−１．２％アガロースゲルの電気泳
動により分離し、ニトロセルロース上で転移し、固定し
くサザン（１９７，５年））、ハイブリッド化し、ウィ
ルミッツェル等（１９８１年）に記載されたように洗浄
した。

ゲノムバンクの確立および研究 ゲノムＤＮＡの単離 使用したゲノムジャガイモＤＮＡはＡＭ８０１５７９３
の単相体種の葉ＤＮＡであり、ベツドプルツク（１９８
１年）の方法により単離した。このＤＮＡは全てＥｃｏ
ＲＩで消化された。

ファージＤＮＡの単離 Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　４　Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲＩで３つの
フラグメントに分け、それにより２種のベクターアーム
をその後のフラグメント単離を伴うゲル電気泳動分離に
より中間のフラグメントから分離することができた。さ
らに、商業的に入手可能な精製Ｅ　Ｍ　ＢＬ４アームも
使用された（アメルシャム社製）。

連結反応およびパッケージング ＥＣ０ＲＩ消化ゲノムＤＮＡとのＥＭＢＬ４アームの連
結反応につづき、連結した高分子量ＤＮＡをインビトロ
でファージヘッド中にパッケージングした（ホーンおよ
びムライ（１９７７年）、ホーン（１９７９年））。パ
ッケージング材料はアメルノヤム社製「ラムダ・インビ
トロ・パッケージング・キット」に由来する。ゲノムバ
ンクはプレート（２５Ｘ　２５ｃｍ）あたり２５０００
プラークの濃度で塗布した。

プラークハイブリッド化 ｃＤＮＡ同族体ラムダクローンの発見は、放射性標識ｃ
ＤＮＡを使用したベントンおよびデイヴイス（１９７７
年）によるプラークハイブリッド化により行った。陽性
ハイブリッド化プラークを単離、再試験した。

組換えファージのＤＮＡ製造 遠心分離後の無菌上清を得るために、Ｃ６００で溶解し
た細菌培養２０ｘＱをクロロホルムに混合した。上清か
らファージ沈澱物を１０００　Ｏｒｐｍで４時間遠心分
離により得た。ファージ沈澱物を５００μＣ７ｙ−ジ緩
衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ８０、ｌ　ＯｍＭ　
ＭｇＣｉｔ）にとり、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼで処
置した。数回のフェノール化によりＤＮＡを抽出後、′
ファージＤＮＡをＥｔＯＨ沈澱させ７０％ＥｔＯＨで洗
浄し、ＴＥにとった。

試験されるべきフラグメントは両配向でＭ１３ｍｐ１９
でクローン化した。エキソヌクレアーゼ■は５°突端を
消化するが、３゛突端端は残すので、分析されるべきＤ
ＮＡ２０μ９はクローン化フラグメントの一方で５°お
よび３°末端を製造する２種の制限酵素で消化した。５
′末端がフラグメントの方へ回るためフラグメントのエ
キソヌクレアーゼ消化を実施した。この反応の連続停止
により２００ｂｐより小さいフラグメントを単離するこ
とができ、その突端はっづ＜Ｓｔ処理により連結可能な
平滑末端に形質転換した。最後に、このＤＮＡ＋７）Ｂ
ＭＨ７ｔ　ｌ　８細胞への形質転換、つづいて１本鎖Ｄ
ＮＡ単離を行なった。

ｙ歿止 １本鎖ＤＮＡの配列化はサンガー等（１９７７年）の鎖
終結方法により実施した。反応生成物の分離を６％およ
び８％配列化ゲルで実施した（アンソーシュおよびデ・
メイヤー（１９′８０年）、アンソーシュおよびバーカ
ー（１９８４年））。

Ｓ１分析 転写の出発点の決定はパークおよびシャープ（１９８７
年）により行なった。本目的では、１．２ｋｂフラグメ
ントをＥｃｏＲＩおよびＸ　ｈｏ　Ｉでプラスミドｐｉ
、５ｏｏｏから単離し、ホスファターゼによる処理によ
り脱りん酸した。次いで、５°ＯＨ末端の放射性標識化
をポリヌクレオチドキナーゼおよびｙ−”Ｐ−ＡＴＰの
結合により行なった。

ＤＮＡフラグメント変性後、全ＲＮＡ５０μ９でハイブ
リッド化した（ハイブリッド化緩衝液：８０％ホルムミ
アミド、０．４Ｍ　ＮａＣ１，４０ｍＭＰＩＦＥＳ、ｐ
Ｈ６，４および１ｍＭＥＤＴＡ）。

この条件は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに比べてＲＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリッドが好ましい（カセイおよびデイ
ヴイッドソン（１９７７年））。ハイブリッド化の出発
温度は８０°Ｃで、−晩で４０℃まで下げた。続いて９
１％’７レアーゼ消化（＋２０Ｕ／ｘのでは非対鎖を除
去する。（ｗｕｎ　１遺伝子の５°未翻訳領域でみられ
る）放射性標識Ｘｈｏｌ切断部位はｍＲＮＡの同族体に
より保護されることが予期された。最後に、Ｓｔ保護さ
れたＤＮＡ鎖は連続ゲルの電気泳動により分離し、それ
により既知ＤＮＡフラグメントの連鎖を長さの比較に使
用した。

アゲロバクチリアのＤＮＡ転移 形質転換 Ｅ、ｃｏｌｉ中でクローン化したＤＮＡはファン・ホー
テ等（１９８３年）に記載された方法によって、共役に
よりＡ、ツメファシェンスＬＢＡ４４０４（ホエケマ等
（１９８３年））に形質転換した。

ＤＮＡ分析 アグロバクテリウムのＤＮＡの転移の同一性は、エバー
ト等（１９８７年）に記載された方法によるアグロバク
テリウムＤ　Ｎ　Ａの単離により行なわれた。ＤＮＡの
制限開裂、ニトロセルロースへの転移および対応する放
射性サンプルでのハイブリッド化はアグロバクテリウム
のＤＮＡ転移がうまく行えたことを証明した。

たばこの形質転換 アグロバクテリウム培養 感染に必要な適当なＬＢＡ４４０４ベクターを含むアグ
ロバクテリウム株を、選択的抗生物質培地で成育させ（
ザンブリスキー等（１９８３年））、遠心分離で沈澱さ
せ抗生物質の存在しないＹＥＢ培地で洗浄した。３ＭＳ
培地でのさらに沈澱、吸収後、細菌を感染に使用するこ
とができた。

葉片の感染 葉片の感染には、たばこ種ＳＮＮおよびＷ２Ｂの無菌葉
が使用された。約１ｃｍ”の大きさの葉片を上記記載の
アグロバクテリウム懸濁液に浸し、続いて３ＭＳ培地上
に移した。１６時間光をあてて２５−２７℃２日間イン
キュベーション後、葉片をカルスおよびショット導入に
よりＭＳＣＩ６に転移した。４−６週間後表れたショッ
トを切断し、ＭＳＣ１５培地上でインキュベートした。

形質転換植物の分析 ゲノムＤＮＡの単離 植物からのＤＮＡはムレイおよびトムソン（１９８０年
）の変法により単離し、制限酵素で切断し、ゲルで分離
した。本ＤＮＡのニトロセルロース上での転移後、試験
下、植物のゲノムに特異的な本ＤＮＡが存在することを
示す放射性標識サンプルでハイブリッド化した。

ＧＵＳ活性の検出 形質転換から再生した植物は酵素β−グルクロニダーゼ
（ＧＵＳ）の活性を減少させるジェファーソン（１９８
７年）の方法を使って試験した。付加的な組織化学試験
（ジェファーソン（１９８７年））は組織の局在を示す
。本目的では、植物の薄部分を基質Ｘ　−Ｇ　ｌｕｃ、
　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニ
ドとインキュベートした。

青い沈澱物が酵素活性部位で形成した。

結果 単相体ジャガイモのゲノムバンクの確立単相体ジャガイ
モ栽培種ＡＭ８０１５７９３のゲノム中の少数のｗｕｎ
　ｌ遺伝子は、ＥｃｏＲＩで消化されたゲノムＤＮＡか
らなるゲノムバンクを構築する。

ＡＭ８０１５７９３からＤＮＡを開裂したＥｃ。

ＲＩ　　１０μ９をＥＭＢＬ４アームを開裂したＥ、Ｍ
ＢＬ４と連結し、Ｃ６００細菌地に塗布した。およそ５
００，０００プラークが得られ、統計的にとられ、ジャ
ガイモのゲノムが現れた。

宥ｕｎｌ同族体ＥＭＢＬ４クローンの同定ニトロセルロ
ース上のこれらのプラークの転移後、放射性標識ｗｕｎ
ｌｃＤＮＡのプラークハイブリッド化技術を使用するこ
とにより、２種のゲノムクローン（ｗｕｎ　１−２２お
よびｗｕｎｌ−８５）を同定、精製することができた。

ｗｕｎｌ−２２、ｗｕｎｌ−８５および制限マツピング
および放射性ｗｕｎｌｃ−ＤＮＡ上のハイブリッド化か
らの組換えＥＭＢＬ４ＤＮＡの単離で次のデータが得ら
れた。

ｗｕｎ　１−８５のｗｕｎｌ−ｃＤＮＡ当量フラグメン
トは、４ｋｂの大きさを有する。すなわちそれは、単相
体ジャガイモからＤＮＡを消化し、ｗｕｎｌ　−ｃＤＮ
Ａでハイブリッド化しｒこＥＣ０ＲＩのフラグメントの
大きさに正確に一致する。ｃＤＮＡクローンの５°領域
の非対称Ｘｈｏｌ切断部位およびｃＤＮＡクローンの５
′領域をカバーするだけの放射性ＣＤＮＡサンプルの用
途に基づき、４ｋｂフラグメントの遺伝子の配向を決定
することができた。従って、ｗｕｎ　１遺伝子の５゛は
およそｌｋｂの大きさのプロモーター領域であるが、遺
伝子からの３°ではおよそ２ｋｂの非同族体部分である
（第５図）。ｖｕｎｌ−８５中に付加的に含まれる８ｋ
ｂの大きさのＥｃｏＲＩフラグメントは、ｗｕｎ　１遺
伝子のより詳しい分析に参照できない。ＥｃｏＲＩによ
るジャガイ７モＤＮＡの消化に基づくと、その後の連結
反応中に、グループをなさない２種のフラグメントがＥ
ＭＢＬ４ベクターに取り入れられ、どちらも互いに機能
的関係にはいらない可能性がある。

ゲノムクローンｗｕｎｌ−８５の配列分析法に、ｗｕｎ
　１コード化遺伝子のゲノム分析を行なった。制限作用
ではｗｕｎｌ−８５およびｗｕｎ　１２２の間に相異が
なかったので、ｗｕｎｌ−８５の４ｋｂフラグメントを
さらに分析するためｐＵＣ８で開裂したＥｃｏＲＩに連
結させた（第１図）。ｗｕｎｌプロモーターおよびｗｕ
ｎ　ｌ遺伝子、を配列するため、さらにＭ１３ｍｐ１８
のＥｃｏＲ１切断部位に４ｋｂフラグメントの再クロー
ニングを行った。その配向の決定が、非対称ＸｈｏＩ切
断部位での対照消化を使って行なわれた。クローン８５
＊ｍｐ１８および８５ｍｐ１８は共にフラグメントの配
向を表す（第６図）。Ｓ　ｐｈ　ＩおよびＸｂａｌによ
るこれらのプラスミドの切断はエキソヌクレアーゼ■を
使用してクローン８５ｍｐ１８の場合はｗｕｎ　１遺伝
子の３″末端、および実施されるクローン８５ｍｐ＊１
８の場合ｗｕｎ　１遺伝子の５゛末端の連続的消化を可
能にした。

様々なフラグメントの大きさで、生じるクローン欠失は
、配列化に用いられた。全部で、ｗｕｎ　１遺伝子は二
方向性に配列し、付加的におよそ４０Ｏｂｐの３゛末端
は一方向性に分析される（第４図）。

転写出発点の決定 ｗｕｎ　１遺伝子の正確な転５出発を同定するためにＳ
ｌヌクレアーゼ・マツピング方法を使用した。

この方法の原理は、ｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡでのｗｕｎ　
１遺伝子の５゛領域からの１本鎖ＤＮＡのハイブリッド
化の結果として、２本鎖を形成することのできるそれら
の同族体のため、その領域のみが１本鎖特異ヌクレアー
ゼＳ１の減少から保護されるという事実に基づく。保護
ＤＮＡフラグメントの大きさは配列化ゲル上で決定する
ことができ、転写の出発はあとに続くことができる。

切断部位ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩの助けにより、１．
２ｋｂのフラグメントがｐｉ、５ｏｏｏから単離され、
それはプロモーターおよびｗｕｎ　１遺伝子の５′未翻
訳領域部分が含まれる。このフラグメントをＸｈｏＩ部
位の５゛末端でポリヌクレオチドキナーゼと３！Ｐで放
射性標識化し、傷害ジャガイモ塊茎からの総ＲＮＡ５０
μ９をハイブリッド化した。ハイブリッド化Ｓ１処理後
、保護フラグメントの大きさを配列化ゲル上で決定し、
１６２−１７９ｂｐの間の値であった（第３図）。最長
フラグメントから出発した場合、転写の出発はＸｈｏ１
部位から１７９ｂｐ上流、すなわちＡＣＣＡＴＡＣの配
列から始まる。この配列は転写の出発のＣＴＣＡＴＣＡ
に対してジョシ等（１９８７年）により決定された共通
配列と中心領域（ＣＡＴ）が一致した。

さらに、情報は転写の出発位置から提供された（第４．
５図）。

ｌ）転写の出発からみられる一３３位置ではＴＡＴＡｂ
ｏｘＣＴＡＴＡＴＴがみられ、これはジョシ等（１９８
７年）により決定された共通配列ＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴ
ＡＧに一致する。

２）−６０から−８０の領域でベノイスト等（１９８０
年）に記載されたＣＡＡＴボックスが一５８位置（ＣＡ
ＡＣＴ）でｖｕｎ　１プロモーター中に見ることができ
る。

３　）ｗｕｎ　１遺伝子の５°未翻訳領域は２１７ｂｐ
に拡大され、それ故比較的大きい。

４）ｗｕｎｌ−ｍＲＮＡコード化遺伝子は、「ノーザン
・プロット」分析に基づく、ｗｕｎｌ　−ｍＲＮＡの大
きさの決定によく一致する７９４ｂｐを含む。

５　）ｗｕｎ　Ｉ遺伝子の５°未紐訳領域の９７ｂｐは
ｃＤＮＡクローンｗｕｎｌ−２５Ａ２中で欠失している
。

６　）ｃＤ　Ｎ　Ａクローン中にすでに決定されたオー
プン読み枠とは別にゲノムクローンの５°未翻訳領域中
には側鎖はみられない。

７　）ｗｕｎ　Ｉ遺伝子はその配置でイントロンがない
。

ベクターｐＰＲ６９の誘導体の確立 ５７１ｂｐ、−１１１ｂｐおよび一８６ｂｐの末端点で
のエキソヌクレアーゼ■により製造したプロモーター欠
失フラグメントおよび５′領域の一１０２２ｂｐ領域ま
てのプロモーターをベクターｐｐＲ６９に再クローンし
た（第６図）。優先的再クローンではＸ　ｈｏ　Ｉ切断
部位をこえた欠失フラグメントをＭＩ３ｍｐ１８外て切
断した。逆配向中にベクターをもつ対照を製造するため
に、切断部位の５重複末端をＤ　Ｎ　Ａ−ポリメラーゼ
Ｉのフレノウフラグメントで満たし、ベクター中にクロ
ーン化し１こ。ベクター中の欠失フラグメントの吸収を
放射性標識ｔｖｕｎ　１プロモーターサンプルでハイブ
リッド化および制限分析により試験した。

たばこのｗｕｎｌ　−ＧＵＳの安定形質転換および分析 形質転換した植物中の様々なｗｕｎ　１プロモーターを
組織特異性および痛み誘発性について試験した。本目的
では、プラスミドｐＬｓＯ３４−１０２２、−５７１，
−１１１−８９、−１０２２Ｒをアガロバクテリア株Ｌ
ＢＡ４４０４に形質転換し、た。これらのアガロバクテ
リアは、葉片感染方法によりたばこ栽培種ライスコンシ
ン３８（Ｗ２Ｂ）の形質転換に利用した。カナマイシン
選択下、植物で製造したカルスを再生し、植物ゲノム中
へのｐＬＳＯ３４−ＤＮＡの正しい組込みがサザン・プ
ロットで試験された。

形質転換しｆコたばこ植物の機能的分析は温室植物のＧ
ＵＳ活性の決定にも拡大した。

異なる構築の独立形質転換体を様々な組織てＧＵＳ活性
について分析した。非形質転換たばこ植物を対照（Ｋ）
としｆこ。

たばこの葉のＧＵＳ活性の比較では、対照植物活性のレ
ベルくらいの構築ｐＬ　Ｓ　０３４−８６．１１１およ
びｐＬｓＯ３４−１０２２Ｒに対し植物の活性をほとん
ど示さない。これに比べてｐＬＳＯ３４−５７１のＧＵ
Ｓ活性はおよそ４倍高いが、全プロモーターの活性は最
短構築（ｐＬ　Ｓ　０３４−８６）の１１３７０倍であ
る（第７図参照）植物の様々な組織の酵素活性は、組織
化学反応液分析により分析した。ここては組織の薄片を
酵素、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルク
ロニド（Ｘ　−Ｇ　１ｕｃ）の基質と３７°Ｃ−晩生イ
ンキユベートした。青い沈澱物が酵素活性部位に形成す
る。分析では、構築ｐＬｓＯ３４−８６，１１１、−５
７１および一１０２２Ｈの植物では葉、茎、根では検出
てきる活性がないことを示している。

これらの構築で十分なｗｕｎ　Ｉプロモーターを実施す
る植物は上記組織すべてに活性を示す。

別の図では花の分析間てみられる。様々な構築の花の交
差片では、次の酵素活性分布を示す。構築ｐＬｓＯ３４
−１０２２の植物は朽のストミウムおよび花粉粒中でＧ
ＵＳ活性を示す。花粉粒の３０％かＸ−Ｇｌｕｃとイン
キュベーノヨン後、青色を示す。ｐＬｓＯ３４−５７１
および−８６の朽も同じような活性を示すが、強度が少
ない（第８図）。構築ｐＬｓＯ３４−１１１およびｐＬ
ｓｏ３４−１０２２Ｒの植物のような対照植物ではスト
ミウム中では青色は検出されず、花粉粒の色は０．７５
％に減少する。

様々な構造からの杓の測定ＧＵＳ活性の比較では、ｐＬ
ｓＯ３４−５７１よりｐＬｓＯ３４−１０２２か２−１
０倍強い活性を示す。朽での充分なプロモーターでの平
均酵素活性は２７６ｐモルＭＵ／ＩＲ９／分である。構
築ｐＬｓ０３４−５７１の杓はｐＬｓＯ３４−８６の朽
より２倍高い活性である。平均酵素活性はそれぞれ２１
７ｐモルＭＵ／ｍρ／分、９７ｐモルＭＵ／ｆｆＱ／分
である。

カリフラワーモザイクウイルスの３５９プロモーターは
め中で活性であることか知られている。

その活性は５００２モルＭ　Ｕ　／　ｍρ／分テある。

ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターが植物に活性である強い
プロモーターであるので、ｗｕｎｌプロモーターの欠失
フラグメントはこの活性範囲内のすべてに広がる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、遺伝子クローンｗｕｎｌ−８５中のｗｕｎ１
の配置を示す図である。 第２図は、ｗｕｎ　ｌ遣伝的クローンｗｕｎｌ−８５の
欠失分析を示す図である。 第３図は、ｗｕｎ　１転写開始点の決定を示す図である
。 第４図は、ｗｕｎ　１およびｗｕｎｌ−８５の側面領域
のヌクレオチドを示す図である。 第５図は、ｗｕｎ　１遺伝子の重要な領域の配置および
位置を示す図である。 第６図は、安定なたばこ形質転換の発現分析についての
ｗｕｎｌ−ＧＵＳ５゜欠失の構築を示す図である。 第７図は、温室の形質転換した植物のたばこの葉につい
て、様々な５゛プロモーター要素によるそれらのＧＵＳ
活性を分析したものを示す図である。 第８図は、構築ｐＬｓＯ３４−５７１の花粉の発芽を示
す図である。 図面の浄書（内容に変更なし） ＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＣＴ＾
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Ｇ＾＾＾Ｃ＾＾ＣＡ＾＾ＣＡＡＡＧＧＧＧＭＱＩ 図面の浄書（内容に変更なし） ｌ３０５ ｌ４８５ ｌ６０５ 】７２５ Ｉ７８５ ＴＡＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＴ＾＾＾ＴＴＣＧＡ
Ｔ＾＾ＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＣ＾＾ＴＴＣＣＴＴＣＡＴ
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Ｋ　　Ｆ　　Ｄ　　Ｎ　　Ａ　　Ｓ　　Ｆ　　Ｑ　　Ｆ
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ＣＣＣＡＧＧＴＴＡＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＡＣ
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ＣＧＴＴＴＴＧＧＧ＾＾＾ＴＣＧＧＡＴＡＴ丁ＴＣＣＴ
ＣＡＡＴＴＡＣＧＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＬ　　Ｔ
　　Ｖ　　Ｔ　　Ｒ　　Ｆ　　Ｇ　　Ｋ　　Ｓ　　Ｄ　
　Ｉ　　Ｓ　　Ｓ　　Ｉ　　Ｔ　　Ｔ　　Ｌ　　ＩＩ　
　Ｃ　　ＰＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＡＧＴＡＧＣ
ＴＴＡＣＣＡ＾＾ＴＣＧＧＧＴＣＧＧ＾＾＾＾ＴＣＴ（
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ＴＴＡＡＴＣＴ　２３６８図面の浄書（内容に変更なし
） ＦｊＧ．８

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｗｕｎ１遺伝子の５′上流領域のＤＮＡ配列、そ
   れに相同なＤＮＡ配列およびその部分であって、上記Ｄ
   ＮＡ配列が、構成型葯特異性プロモーター活性を有する
   ものである、ＤＮＡ配列。
2. （２）ｗｕｎ１遺伝子の５′上流領域が、ｗｕｎ１プロ
   モーター領域の１０２２塩基対およびプロモーター領域
   の３′末端に結合した１７９塩基対の５′ｗｕｎ１非翻
   訳領域からなる１２０１塩基対長ＤＮＡ分画に由来する
   ことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. （３）ｂｐ範囲が、ｗｕｎ１プロモーターの−５７１か
   ら、ｗｕｎ１遺伝子の５′非翻訳領域の＋１７９、それ
   に相同なＤＮＡ配列およびその部分である請求項２記載
   のＤＮＡ配列。
4. （４）ｂｐ範囲が、 ａ）ｗｕｎ１プロモーターの−５７１からｗｕｎ１遺伝
   子の５′非翻訳領域＋１７９、それに相同なＤＮＡ配列
   または、 ｂ）ｗｕｎ１プロモーターの−５７１から５′非翻訳領
   域の＋１まで、それに相同なＤＮＡ配列、または、 ｃ）ｗｕｎ１プロモーターの−８６から５′非翻訳領域
   の＋１７９まで、それに相同なＤＮＡ配列、または、 ｄ）ｗｕｎ１プロモーターの−８６から５′非翻訳領域
   の＋１まで、それに相同なＤＮＡ配列、または、 ｅ）ｗｕｎ１プロモーターの−８６から５′非翻訳領域
   の＋１７９までのＤＮＡ配列、それに相同なりＮＡ配列
   と３′結合したｗｕｎ１プロモーターの−５７１から−
   １１１まで、または、 ｆ）ｗｕｎ１プロモーターの−８６から５′非翻訳領域
   の＋１までのＤＮＡ配列、それに相同なＤＮＡ配列と３
   ′結合したｗｕｎ１プロモーターの−５７１から−１１
   １まで である請求項３記載のＤＮＡ配列。
5. （５）花粉／葯特異発現を得るための請求項１−４の何
   れか１項記載のＤＮＡ配列の用途。
6. （６）鑑賞価値を高める植物または雄性不ねん性植物を
   製造するための請求項５記載の用途。
7. （７）遺伝子に構成し得るように連結した請求項１−４
   の構成型葯特異性プロモーターを含む形質転換ベクター
   。
8. （８）請求項１−４の構成型葯特異性プロモーターを含
   む植物または植物性材料。