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CN119391755A - GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用 - Google Patents

GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用 Download PDF

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CN119391755A
CN119391755A CN202411591846.7A CN202411591846A CN119391755A CN 119391755 A CN119391755 A CN 119391755A CN 202411591846 A CN202411591846 A CN 202411591846A CN 119391755 A CN119391755 A CN 119391755A
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CN
China
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gene
plant
ghpskr1
ghpskr
plants
Prior art date
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Application number
CN202411591846.7A
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Inventor
李召虎
李芳军
高先原
杜明伟
田晓莉
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China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
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Publication date
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Abstract

本发明属于植物育种技术领域，具体涉及GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用。本发明提供的所述GhPSKR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的研究结果证实了GhPSKR1基因沉默植株在盐胁迫处理下生长量抑制更加明显，盐害特征更显著，叶片和根中的钠离子积累增加，对盐胁迫更为敏感；并且在盐胁迫处理下GhPSKR1基因过表达转基因纯合植株的根长相比野生型拟南芥显著伸长，具有良好的抗逆性，由此表明GhPSKR1基因在调控植物盐胁迫中起到了正调控作用。

Description

GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用。
背景技术
盐碱地作为一种在全球范围内广泛分布的土壤类型，主要集中在干旱及沿海地区。棉花作为纺织工业的重要原料，其种植区域也逐渐向盐碱地扩展，以应对日益减少的优质耕地资源。然而，棉花并非是盐生植物，其耐盐能力相对有限，随着土壤盐度的增加，棉花生长将遭受严重的盐胁迫，具体表现为生长发育受阻、产量下降及纤维品质劣化的问题，当前较为缺乏对棉花耐盐机理的研究，特别是在分子水平上的研究。
盐胁迫对棉花生长威胁的具体表型为：生长受抑，表现为植株矮小、叶片减少且变小；颜色黄化，这是由于高盐影响了细胞水分吸收和营养运输；盐胁迫延迟花期，减少花朵数量，降低结实率，显著影响棉花产量；尤为关键的是，盐胁迫还显著缩短棉花根长，削弱了根系吸收水分和养分的能力，进一步阻碍了棉花的整体生长和产量形成。因此，在盐碱地种植棉花时，有必要进行进一步的研究，以减轻盐胁迫对棉花生长和产量的不利影响，保障棉花产业的可持续发展。
植物磺肽素是一种新型植物肽类生长调节因子，成熟的植物磺肽素是由5个酸构成的磺化短肽[Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln]，其中的酪氨酸被磺化修饰。植物磺肽素调控植物多种生理和生化反应，包植物细胞的体外分化、细胞的生长、根顶端分生组织细胞和静止中心细胞的调控、花粉管细胞的发育、植物体免疫的调控等。植物磺肽素在植物中通过细胞膜上的富含亮氨酸的类受体激酶蛋白家族成员PSKR作为受体向胞内传递信号。拟南芥中报道的植物磺肽素受体PSKR具有激酶活性和鸟苷酸环化酶活性双重信号感知作用。然而，目前关于PSKR在植物抗逆方面的研究鲜有报道。其中，植物磺肽素的英文名称为phytosulfokine，PSK。富含亮氨酸的类受体激酶的英文名称为leuine-rich receptorlike kinase protein，LRR-RLK。
目前，需要开发一种GhPSKR基因在棉花抗逆方面的产品新应用。
发明内容
为开发一种GhPSKR基因在棉花抗逆方面的产品新应用，本发明提供了一种GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
本发明的第一个方面提供了一种GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用，所述GhPSKR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明首次揭示GhPSKR基因在棉花耐盐中的正向调控作用，并为棉花耐盐栽培提供优良的调控靶标和理论指导。本发明提供的一种GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用，开发一种GhPSKR基因在棉花抗逆方面的产品新应用。
优选地，所述GhPSKR1基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，通过基因工程方法使植物中的所述GhPSKR1基因过表达，以改善植物的耐盐性。
优选地，所述基因工程方法为：利用所述GhPSKR1基因构建重组表达载体，将重组表达载体导入植物中，以改善植物的耐盐性。
优选地，重组表达载体导入植物中的方法包括通过Ti质粒、Ri质粒和植物病毒载体中的任意一种直接DNA转化；或者通过微注射、电导和农杆菌介导中的任意一种方式将所述重组表达载体导入植物中。本发明克隆了棉花GhPSKR1基因，并利用转基因技术构建了GhPSKR1过表达的转基因拟南芥植物和利用VIGS技术构建了GhPSKR1沉默植株，对GhPSKR1进行了功能验证，明确了GhPSKR1可以提高植物的耐盐性。有利于更深入的研究植物对盐胁迫信号的响应机制，为有效提高植物耐盐性奠定了良好的分子基础，对探究植物在盐胁迫下的信号调控网络具有重大价值。
本发明的第二方面提供了一种含有所述GhPSKR1基因的重组表达载体。
优选地，所述重组表达载体是将所述的GhPSKR1基因的DNA片段插入super1300-GFP载体的Sma I和Kpn I酶切位点得到的。
其中，对植物的RNA进行反转录获得模板DNA，并基于所述模板DNA通过如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对进行PCR扩增，从而获得所述GhPSKR1基因的DNA片段。
如SEQ ID NO.3所示的引物对中的引物为上游引物F1，其核苷酸序列如下所示：
5’-gtaccagattacgctcatatgATGGGGGCTCAAGGCTGCTG-3’。
如SEQ ID NO.4所示的引物对中的引物为下游引物R1，其核苷酸序列如下所示：
5’-actggcctccatggccatatgTCAAACACTAGATAACGATGTC-3’。
进一步的，含有所述GhPSKR1基因的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：
以测序正确的PGADT7-GhPSKR1质粒为模板进行扩增。
所得扩增产物经双酶切后与经Sma I和Kpn I双酶切的植物二元转化载体super1300-GFP载体进行连接，转化，提取验证正确的阳性克隆质粒，即为重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP。
其中，根据植物二元转化载体super1300-GFP的多克隆位点和所述GhPSKR1基因的编码区序列设计出扩增所述GhPSKR1基因整个编码区的正向引物：上游引物F1和反向引物：下游引物R1，得到35S::GhPSKR1-GFP重组表达载体，具体的构建方法如下：
以所述GhPSKR1基因为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR扩增，获得包含所述GhPSKR1基因的产物；利用Sma I和Kpn I分别酶切包含所述GhPSKR1基因的产物和super1300，分别得到酶切产物和载体框架并回收；将酶切产物和载体框架连接得到的重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP，即将super1300的Sma I和Kpn I酶切位点间的DNA片段替换为如SEQ ID NO.1的所述GhPSKR1基因后，且保持super1300的其他序列不变得到的载体。
其中，植物二元转化载体super1300-GFP为连接GFP基因的重组表达载体，该重组表达载体记载于博士学位论文“菟丝子离体生长过程中的代谢特征及其基因组中农杆菌mis基因的研究，张月霞，《中国农业大学》，2020”中，公众经作者同意后，可从中国农业大学李召虎课题组获得，以重复本发明中的实验，不可作为其它用途使用，本发明中将其称为“super1300”)。
重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP的结构如图3所示。
本发明的第三方面提供了一种改善植物耐盐性的方法，使植物中所述GhPSKR1基因过表达，或提高植物中所述GhPSKR1基因表达的蛋白的活性，或提高植物中所述GhPSKR1基因表达的蛋白的含量，以改善植物的耐盐性。
上述方法中，所述提高目的植物中蛋白GhPSKR1的基因的表达量和/或蛋白GhPSKR1的活性和或蛋白GhPSKR1的含量为在植物中过表达蛋白质GhPSKR1。
优选地，使植物中所述GhPSKR1基因过表达是用农杆菌介导的方式，使植物转化入所述GhPSKR1基因，以改善植物的耐盐性。
优选地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。更优选地，所述植物为十字花科和/或锦葵科植物。更优选地，所述植物为棉属和/或拟南芥属植物。最优选地，所述植物为拟南芥和/或棉花。
本发明的第四方面提供了一种耐盐植物的育种方法，使植物中所述GhPSKR1基因过表达，获得耐盐的转基因植物。
其中，所述植物为M1)或M2)或M3)或M4)或M5)。
M1)单子叶植物或双子叶植物。
M2)十字花科。
M3)拟南芥。
M4)棉属植物。
M5)棉花。
本发明的第五方面提供了一种蛋白质，所述蛋白质命名为棉花多肽受体GhPSKR1，简称为GhPSKR1蛋白，来源于棉花，是如下任一所示的蛋白质：
A1)包含或为氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质。
A2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
A3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
与上述GhPSKR1蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围，本发明还提供了与GhPSKR1蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明与GhPSKR1蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用，所述生物材料为如下任一所示：
C1)编码GhPSKR1蛋白的核酸分子。
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒。
C3)含有C1)所述核酸分子的重组表达载体、或含有C2)所述表达盒的重组表达载体。
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组表达载体的重组微生物。
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组表达载体的转基因植物细胞系。
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组表达载体的转基因植物组织。
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组表达载体的转基因植物器官。
C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组表达载体的转基因植株。
C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物。
C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。
C11)抑制上述GhPSKR1蛋白的基因的表达量和/或抑制上述GhPSKR1蛋白的活性和/或降低上述GhPSKR1蛋白的含量的重组表达载体或重组微生物。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA。
上述生物材料中，C1)所述核酸分子为如下任一所示：
B1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
B2)编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码GhPSKR1蛋白的DNA分子。
上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述生物材料中，C2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达GhPSKR1蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GhPSKR1基因转录的启动子，还可包括终止GhPSKR1转录的终止子。
进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：所述GhPSKR1基因自身的启动子，组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP"，Chao等人(1999)PlantPhysiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(中国专利CN101063139B)，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beach等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：GhPSKR1基因自身的终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tmL终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如，Odell等人(1985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell，64:671，Sanfacon等人Genes Dev，5:141，Mogen等人(1991)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcids Res.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。
上述生物材料中，C3)所述重组表达载体可含有SEQ ID NO.1所示的用于编码蛋白GhPSKR1的DNA分子。可用现有的植物表达载体构建含有所述GhPSKR1蛋白的基因或所述蛋白GhPSKR1的基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元表达载体等，如super1300、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用GhPSKR1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
在本发明具体的实施方式中，C3)所述重组表达载体为35S::GhPSKR1-GFP重组表达载体，所述35S::GhPSKR1-GFP重组表达载体将super1300的Sma I和Kpn I酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID NO.1的GhPSKR1基因后，且保持super1300的其他序列不变得到的载体。
上述生物材料中，C11)所述重组表达载体为重组表达载体pYL156-GhPSKR1，所述pYL156-GhPSKR1为在pYL156载体的EcoR I和BamH I酶切位点间的DNA片段替换为SEQ IDNO.1第1-311位所示的DNA分子，且保持pYL156载体的其它序列不变得到的重组表达载体。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌GV3101。
上述生物材料中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述生物材料中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明进一步提供了调控植物抗逆性的产品，含有上述GhPSKR1蛋白或与其相关的生物材料。
上述GhPSKR1蛋白或与其相关的生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
D1)在培育抗逆性增强的转基因植物中的应用。
D2)在制备培育抗逆性增强的转基因植物产品中的应用。
D3)在培育抗逆性降低的基因沉默植物中的应用。
D4)在制备培育抗逆性降低的基因沉默植物产品中的应用。
D5)在植物育种中的应用。
上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有GhPSKR1蛋白或与其相关的生物材料(例如GhPSKR1蛋白的编码基因GhPSKR1)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用。本发明的研究结果证实了GhPSKR1基因沉默植株(特别是棉花)在盐胁迫处理下生长量抑制更加明显，盐害特征更显著，叶片和根中的钠离子积累增加，对盐胁迫更为敏感；并且在盐胁迫处理下GhPSKR1基因过表达转基因纯合植株(特别是拟南芥)的根长相比野生型拟南芥显著伸长，具有良好的抗逆性，由此表明GhPSKR1基因在调控植物盐胁迫中起到了正调控作用。本发明首次揭示GhPSKR在棉花耐盐中的正向调控作用，并为棉花耐盐栽培提供优良的调控靶标和理论指导。本发明提供的一种GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用，开发一种GhPSKR基因在棉花抗逆方面的产品新应用。
附图说明
图1为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因的基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明实施例中所述的重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP的结构示意图。
图3为本发明实施例中所述的GhPSKR1蛋白的亚细胞定位图。
图4为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因的第2296-2596位扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图5为本发明实施例中VIGS-GhPSKR1沉默植株的沉默效率和盐胁迫表型；其中，图5中的(A)图为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因在棉花中的基因沉默效率鉴定结果图；图5中的(B)图为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因沉默植株的抗逆性验证的生长表型结果图。
图6为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因沉默植株的叶片和根系的钠离子含量示意图；其中，图6中的(A)图为盐处理后VIGS-GFP和VIGS-GhPSKR1叶片中的钠离子含量；图6中的(B)图为盐处理后VIGS-GFP和VIGS-GhPSKR1根系中的钠离子含量。
图7为本发明实施例中所述的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系的WesternBlot鉴定结果图。
图8为本发明实施例中所述的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系和野生型拟南芥在盐胁迫条件下的生长状况比较结果图；其中，图8中的从左到右的植株分别依次为野生型拟南芥(WT)、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE2。
图9为本发明实施例中所述的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系和野生型拟南芥在盐胁迫条件下的根长统计结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
病毒诱导的基因沉默作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定，病毒诱导的基因沉默可以在植株的不同部位成功沉默内源基因，为研究不同生长时期的基因功能提供了切实可行的手段。本发明的实施例中通过病毒诱导的基因沉默方法提供了GhPSKR1基因沉默植株，以证明该基因的功能。其中，病毒诱导的基因沉默的英文名称为Virus-induced gene silencing，VIGS。
本发明证实了GhPSKR1沉默棉花植株，在盐胁迫处理下生长量抑制更加明显，盐害特征更显著，叶片和根中的钠离子积累增加，对盐胁迫更为敏感；并且在盐胁迫处理下GhPSKR1过表达转基因纯合拟南芥植株的根长相比野生型拟南芥显著伸长，具有良好的抗逆性，由此表明GhPSKR1基因在调控植物盐胁迫中起到了正调控作用。
为此，本发明的第一方面的实施例提出一种GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用，
实施例1：GhPSKR1基因的发现、克隆、定位及GhPSKR1的过表达重组载体构建
1.1 GhPSKR1基因的发现
本实施例对VIGS cDNA文库盐相关基因进行筛选，利用棉花数据库进行检索。从棉花品种“国欣3号”中获得一个蛋白，将其命名为GhPSKR1蛋白，所述GhPSKR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MGAQGCWAMVIILGLLLQPQFLSSQNLTCNQKDWTALRYFMGNLTKTLEGWTTNSSADCCDWEGITCDPPSAGRVIKLELPNKRLSGKLSDSLYGLDQLKTLNLSHNFLKDSLPLSLFHMPNLEQLDLSYNDFSGLIPESINLPSIRSLNISANSLKGSLPSHICVNSTGIGFLSLAVNYFSGNISPGLGKCSSLEELYLGTNQLTGVVTEDIFELQNLRRLGLQDNNLGGKLSPGIANLSNLVRLDISSNNFSGEIPDVFSELKRFQYLIANSNNFSGGIPSSLSNSPTVSLLNLRNNSLEGSIYLNCSAMVTLNSLDLATNKFTGPVPDNLPLCRQLQDVNLARNNFSGQIPESFKQFHSLSYLSLSNSSLHNLSSALQILQQCRNLTALVLTLNFPVETLPDDPNLHFEKLKVLVIASCQLRGSIPQWLSKISSLQLLDLSWNHLNGALPPWLGSYRDLFYLDLSNNSFTGEIPKSLTELPSLIHGNISLEEPSPDFPFFMKRNESARGLQYNQIWSFPPTLELGHNFLSGPVWPEFGNLKKLIVFDLKFNNLSGPIPENLSEMSSLEILDLSHNDLTGTIPPSLESLSFLSIFNVAYNRLYGKIPSGGQFQTFPNSSFEGNNLCGDHRFSCQDNTSEHVSPKRSRRNKDIIIGMVVGIIFGTALLIGLMYLFVLRTHKRNEVDPEKEEPDTNDKNLEELSSRLVVLFQNWESYKELCIDDLLESTNNFDQANIIGCGGFGLVYRGTLPDGRKVAIKRLSGDCGQMDREFRAEVEALSRAQHPNLVHLQGYCMHKNDRLLIYSYMENGSLDYWLHEKVDGSSLLGWETRLKIAQGAARGLAYLHQSCEPHILHRDIKSSNILLDENFKAHLADFGLARLILPYDTHVTTDLVGTLGYIPPEYGQASVATYKGDVYSFGVVLLELLTGKRPMDMCKPKGTRDLISWVIRMKMENKESEVFDPFIYGKQHDKEMLRVLEIACLCLNESPKIRPTTQQLVYWLDKVTSLSSV。
上述GhPSKR1蛋白的编码基因命名为GhPSKR1基因，其开放阅读框的核苷酸如SEQID NO.1所示：
ATGGGGGCTCAAGGCTGCTGGGCTATGGTTATTATTCTTGGGTTGTTGTTGCAACCTCAGTTTCTCAGCTCTCAAAACCTGACATGCAATCAAAAGGACTGGACTGCTCTCCGGTATTTCATGGGCAATTTGACAAAAACACTTGAAGGTTGGACGACAAATTCCTCTGCTGATTGTTGTGACTGGGAAGGCATAACCTGTGATCCTCCATCTGCTGGTAGAGTAATCAAGTTGGAACTGCCCAATAAAAGGTTATCAGGCAAATTATCTGATTCTTTGTATGGTTTGGATCAGCTTAAAACTCTCAATCTTTCCCACAATTTCCTTAAAGATTCATTGCCACTTTCTTTGTTTCATATGCCGAATTTAGAGCAACTTGACTTGAGCTATAATGACTTCTCTGGACTAATCCCAGAAAGCATCAATCTGCCTTCAATTCGAAGTCTTAACATCTCTGCCAATTCCTTGAAGGGTTCCCTTCCTTCCCATATATGTGTTAACTCCACTGGAATTGGGTTCCTTAGTTTGGCAGTGAACTATTTCTCTGGTAATATTTCACCAGGGCTTGGAAAATGTTCTTCCTTGGAGGAACTGTATCTTGGCACAAATCAACTCACTGGTGTGGTGACTGAAGACATCTTTGAGCTTCAAAATTTGAGACGTCTGGGGCTTCAAGATAACAACTTGGGTGGGAAACTTAGTCCTGGTATTGCTAATCTCTCTAATCTTGTTCGTTTAGATATTTCTTCAAATAATTTTTCTGGAGAGATCCCGGATGTGTTTAGTGAGCTAAAGAGATTTCAGTATCTTATAGCAAATTCAAATAACTTTAGTGGTGGAATTCCCAGTTCACTGTCCAATTCTCCAACCGTTAGTTTGCTGAATTTGAGGAATAATTCATTGGAGGGTTCTATATATCTTAATTGCTCTGCTATGGTTACTTTGAATTCTCTGGATTTGGCTACCAATAAGTTCACTGGGCCTGTGCCTGATAATCTTCCCTTATGCAGACAATTGCAAGATGTCAACCTTGCCCGCAATAATTTCAGTGGCCAAATCCCTGAGAGCTTCAAACAATTCCATAGCCTCTCTTATCTTTCCCTCTCGAATTCGAGCCTCCATAATCTTTCCTCTGCTCTTCAAATTCTGCAGCAGTGTAGGAACCTAACTGCTTTGGTTCTCACCTTGAATTTCCCTGTTGAAACATTACCTGATGATCCTAATCTGCACTTTGAAAAGTTGAAGGTTCTTGTTATTGCAAGCTGTCAACTTAGAGGTTCAATTCCCCAATGGTTGAGCAAGATTTCTTCATTGCAGTTGTTGGATTTGTCATGGAACCATCTGAATGGAGCACTTCCACCATGGTTGGGAAGCTATAGGGATCTGTTTTACTTGGACTTATCGAACAATTCGTTTACTGGAGAGATCCCTAAGAGTTTAACTGAATTACCGAGCCTCATTCATGGAAATATCTCACTGGAGGAACCTTCACCAGATTTCCCTTTTTTCATGAAAAGGAATGAAAGTGCGAGGGGATTGCAGTATAATCAAATTTGGAGTTTTCCACCAACACTTGAACTTGGTCACAACTTTCTTAGTGGACCAGTTTGGCCTGAGTTCGGGAATCTGAAAAAGCTTATTGTTTTTGATTTGAAATTCAATAATCTCTCTGGACCGATTCCGGAAAATTTGTCTGAGATGAGCAGCTTGGAGATTCTGGATCTATCACATAATGACTTAACTGGGACCATACCACCTTCACTGGAAAGTCTCAGTTTTCTGTCTATCTTTAATGTTGCCTACAATCGACTTTATGGGAAGATTCCTTCTGGAGGTCAATTTCAGACATTCCCGAATTCAAGCTTTGAAGGAAACAATCTTTGTGGTGATCATCGGTTCAGTTGTCAAGATAATACAAGTGAACATGTGTCTCCAAAAAGATCAAGAAGGAACAAAGATATCATCATTGGAATGGTTGTTGGAATCATATTTGGGACAGCCCTTTTGATTGGCCTTATGTATTTGTTTGTTCTGCGTACACATAAACGCAACGAGGTCGATCCCGAGAAAGAGGAGCCTGACACCAATGATAAAAATTTAGAAGAACTCAGTTCAAGGCTAGTGGTGCTCTTCCAAAATTGGGAATCCTACAAGGAGCTTTGCATTGATGACCTTTTGGAATCAACCAACAATTTTGACCAAGCAAATATCATCGGTTGTGGTGGTTTTGGTCTGGTTTATAGAGGCACTCTCCCAGATGGTCGTAAGGTTGCCATTAAACGGCTTTCTGGTGATTGTGGTCAGATGGATAGAGAATTCCGTGCTGAAGTTGAAGCACTTTCAAGAGCTCAGCATCCAAATCTTGTCCATCTACAAGGATATTGCATGCATAAAAATGATAGGCTCTTAATATATTCTTACATGGAGAATGGTAGCTTGGACTATTGGTTGCATGAGAAGGTTGATGGATCATCCTTGCTTGGTTGGGAAACAAGGCTGAAAATTGCACAAGGGGCAGCTAGGGGTCTAGCTTATTTGCACCAGTCATGTGAGCCTCATATTCTTCACAGAGATATAAAGTCAAGTAACATTCTTTTAGATGAGAATTTTAAAGCTCACTTGGCCGATTTTGGTCTTGCAAGGCTCATACTTCCCTATGATACCCATGTCACCACTGATCTGGTAGGAACATTAGGCTACATTCCTCCTGAGTACGGACAAGCTTCAGTTGCAACCTATAAAGGTGATGTGTACAGTTTCGGGGTAGTGCTTTTGGAGCTTCTGACCGGGAAAAGGCCCATGGATATGTGCAAGCCAAAAGGTACCCGGGATTTGATCTCTTGGGTGATTCGCATGAAGATGGAAAACAAGGAGAGTGAGGTTTTTGACCCGTTTATCTATGGCAAGCAGCATGATAAGGAAATGTTGCGGGTTCTTGAAATCGCATGCCTTTGTTTAAACGAAAGCCCTAAAATTAGGCCTACAACGCAGCAGCTAGTTTATTGGCTTGACAAAGTGACATCGTTATCTAGTGTTTGA。
其中，筛选的方法参见“利用VIGS技术研究棉花抗逆基因功能，李芳军，《中国农业大学》，2014”。
棉花品种“国欣3号”详见“国欣3号抗虫棉栽培技术，冯素莲，《河北农业》，2011，06”。
1.2 GhPSKR1基因的克隆
本实施例通过反转录PCR对GhPSKR1基因进行了克隆扩增，电泳确认，并进一步对获得的克隆进行了测序。
(1)使用艾德莱试剂盒抽提棉花叶片RNA，并用M-mLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，所得的第一链cDNA作为模板用于扩增GhPSKR1基因全长。
其中，艾德莱试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。M-mLV反转录试剂盒购自Takara公司。
(2)设计两条特异性引物：上游引物F1和下游引物R1，进行PCR扩增，获得PCR产物。
其中，利用诺唯赞的Max Super-Fidelity DNAPolymerase试剂盒扩增GhPSKR1基因全长。
上游引物F1的核苷酸序列如如SEQ ID NO.3所示：
5’-gtaccagattacgctcatatgATGGGGGCTCAAGGCTGCTG-3’。
下游引物R1的核苷酸序列如如SEQ ID NO.4所示：
5’-actggcctccatggccatatgTCAAACACTAGATAACGATGTC-3’。
PCR扩增反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
PCR扩增反应程序如表2所示：
表2PCR扩增程序
温度/℃ 时间 循环次数
95 3分钟 1次
95 15秒 35次
52 15秒 35次
72 40秒 35次
72 5分钟 1次
(3)取PCR扩增反应产物在1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。
(4)电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，纯化。其中，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自康为生物科技有限公司。
(5)将回收获得的片段与pGADT7载体重组连接，重组反应体系如表3所示，于37℃反应30min。
表3连接反应体系
(6)取5μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆。其中，热击法参照“J.萨姆布鲁克，等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版”。
(7)挑取5个克隆送北京擎科测序公司测序，获得所需的全长基因CDS，即获得了GhPSKR1基因。
琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
测序结果表明，该GhPSKR1基因的序列全长3039bp、编码1012个氨基酸的完整的ORF阅读框。
1.4 GhPSKR1基因的亚细胞定位
利用烟草表皮细胞来研究GhPSKR1蛋白的亚细胞定位。
将表达有super100-GhPSKR1-GFP质粒的农杆菌在10ml含有50mg/ml Kan和25mg/ml Gen的YEP液体培养基中过夜培养。6000rpm离心10min去上清，用重悬液重悬至OD＝0.6。把重悬好的菌液注射至烟草叶片中。两天后取注射的烟草叶片在激光共聚焦显微镜下观察，GFP的激发光为488nm。
图3为本发明实施例中所述的GhPSKR1蛋白的亚细胞定位图。其表明了GhPSKR1定位在细胞膜上。
实施例2：VIGS方法获得GhPSKR1沉默植株及其在盐胁迫下的表型研究
本实施例通过VIGS方法构建VIGS-GhPSKR1沉默载体，进一步利用该VIGS-GhPSKR1沉默载体获得GhPSKR1沉默植株，并且对其在盐胁迫下的表型进行了研究。
2.1VIGS-GhPSKR1沉默载体的构建
(1)根据实施例1中的步骤提取棉花品种“国欣3号”叶片的总RNA并反转录为cDNA。
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用如下引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-gtgagtaaggttaccgaattcTGTGGTCAGATGGATAGAGA-3’。其中。序列中的下划线为EcoR I的酶切位点。
引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
5’-gagacgcgtgagctcggtaccAAGAATGTTACTTGACTTTA-3’。其中。序列中的下划线为BamHI的酶切位点。
(3)用限制性内切EcoR I和BamHI双酶切步骤(2)得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶EcoR I和BamHI双酶切pYL156载体，回收载体骨架。其中，pYL156载体又称为pTRV2:RNA2载体，其记载于非专利文献“Gao X，2013，Functionalgenomic analysis ofcotton genes with agrobacterium-mediated virus-inducedgene silencing.”中。
(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接，得到重组质粒pYL156-GhPSKR1，连接体系参见实施例中的步骤。
(6)对重组载体pYL156-GhPSKR1进行测序验证。
测序结果表明：重组质粒pYL156-GhPSKR1为将pYL156载体的EcoR I和BamHI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID NO.1第1-300位所示的部分GhPSKR1基因片段后，且保持pYL156载体的其他序列不变得到的载体，即VIGS-GhPSKR1沉默载体。
图5中的(A)图为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因在棉花中的基因沉默效率鉴定结果。
由图5可知，VIGS-GhPSKR1植株与VIGS-GFP植株相比，GhPSKR1基因确实得到了沉默。
2.1VIGS-GhPSKR1沉默植株的获得
(1)将pYL156-GhPSKR1、pYL156-GFP、pTRV-RNA1和pYL156-GhCLA1分别电击转化农杆菌GV3101，得到重组菌pYL156-GhPSKR1/GV3101、重组菌pYL156-GFP/GV3101、重组菌pTRV1/GV3101和重组菌pYL156-GhCLA1/GV3101。
其中，pYL156-GhPSKR1即为本实施例中的2.1步骤中构建的VIGS-GhPSKR1沉默载体。
pYL156-GFP、pTRV1(pTRV-RNA1)和pYL156-GhCLA1均记载于非专利文献“Gao X，2013，Functional genomic analysis of cotton genes with agrobacterium-mediatedvirus-induced gene silencing.”中。
(2)将重组菌分别在含有抗生素的LB液体培养基中28℃下摇床培养。
其中，含有抗生素的LB液体培养基的配方组成为：50μg/mL卡那霉素、25μg/mL庆大霉素、pH5.6的10mM MES、20μM乙酰丁香酮，溶剂为水。
(3)将重组菌用VIGS溶液分别重悬菌体并将菌液浓度调整到OD600＝1.5。
其中，VIGS溶液的配方为：pH5.6的10mM MES、10mM MgCl2、200μM乙酰丁香酮，溶剂为水)
(4)将特定浓度的重组菌pYL156-GhPSKR1/GV3101、pYL156-GFP/GV3101和pYL156-GhCLA1/GV3101分别与重组菌pTRV1/GV3101的菌液按照体积比1:1的比例混合，得到混合液1、混合液2和混合液3。
(5)用1mL无针头注射器将混合液1、混合液2和混合液3打满不同的棉花“欣试17号”子叶的下表面，培养2周，以分别获得VIGS-GhPSKR1沉默植株、VIGS-GFP对照植株和VIGS-GhCLA1指示植株。
(6)待注射混合液3的VIGS-GhCLA1指示植株出现白化表型约两周后，对注射混合液1和混合液2的植株分别提取叶片部位RNA，并反转录cDNA，通过荧光实时定量PCR进行基因沉默效率分析，相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。
其中，所用的引物对及PCR程序如下所示：
引物F2的核苷酸如SEQ ID NO.7所示：
5’-AAGATGTCAACCTTGCCCG-3’。
引物R2的核苷酸如SEQ ID NO.8所示：
5’-GGTGAGAACCAAAGCAGTTAGG-3’。
PCR程序：94℃变性30s；94℃变性5s、60℃退火35s、40个循环。
其中，以棉花Actin9基因作为对照，用于鉴定棉花Actin9基因的引物对如下：
引物F3的核苷酸如SEQ ID NO.9所示：
5’-GCCTTGGACTATGAGCAGGA-3’。
引物R3的核苷酸如SEQ ID NO.10所示：
5’-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3’。
图5中的(A)图为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因在棉花中的基因沉默效率鉴定结果图。
图5中(A)图的结果显示，注射混合液1的植株的GhPSKR1基因表达量显著低于注射混合液2的植株，即通过上述方法成功获得了沉默GhPSKR1基因的VIGS-GhPSKR1沉默植株以及VIGS-GFP对照植株。
其中，混合液1中含有pYL156-GhPSKR1/GV3101和pTRV1/GV3101菌液。
混合液2中含有pYL156-GFP/GV3101和pTRV1/GV3101菌液。
2.3VIGS-GhPSKR1沉默植株在盐胁迫下的表型研究
(1)对本实施例中的2.2步骤中获得的VIGS-GhPSKR1沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行250mM NaCl胁迫处理，并观察生长表型。
其中，胁迫处理的方法为：待棉花长至三叶期时，用250mM NaCl处理VIGS-GhPSKR1沉默植株和VIGS-GFP对照植株。
(2)对本实施例中的2.步骤中获得的VIGS-GhPSKR1沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行250mM NaCl胁迫处理，并取植株的叶片和根系，检测植株叶片和根系的钠离子含量。
图5中的(B)图为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因沉默植株的抗逆性验证的生长表型结果图。结果表明，在盐胁迫下，VIGS-GhPSKR1沉默植株与VIGS-GFP对照植株相比，植株生长量抑制更加明显，叶片更小，且叶缘处萎蔫卷曲等盐害特征更显著，对盐胁迫更为敏感；在未经NaCl处理的对照组中，VIGS-GhPSKR1沉默植株和VIGS-GFP对照植株生长特征并无差异。
图6为本发明实施例中所述的GhPSKR1基因沉默植株的叶片和根系的钠离子含量示意图。结果表明，VIGS-GhPSKR1沉默植株相较于VIGS-GFP对照植株，叶片和根中的钠离子积累增加。
综合上述结果，在棉花中利用VIGS基因沉默技术使GhPSKR1基因表达量显著降低，基因沉默效率达到73.9％；与VIGS-GFP对照植株相比，VIGS-GhPSKR1沉默植株在盐胁迫处理下生长量抑制更加明显，盐害特征更显著，叶片和根中的钠离子积累增加，对盐胁迫更为敏感。
上述实验结果表明：GhPSKR1基因在棉花盐胁迫等中起到正调控作用。
实施例3：GhPSKR1过表达载体构建、过表达转基因植株的获得及其在盐胁迫下的表型研究
3.1 GhPSKR1过表达载体构建
(1)以GhPSKR1基因为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR扩增，获得包含GhPSKR1基因的产物，扩增参见实施例1。其中，正向引物即上游引物F1；反向引物即下游引物R1。
(2)利用Sma I和Kpn I分别酶切包含GhPSKR1基因的产物和super1300-GFP载体，分别得到酶切产物和载体框架并回收。
(3)将酶切产物和载体框架连接得到的重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP重组载体，即GhPSKR1过表达载体，连接反应参见实施例1。
获得了将super1300的Sma I和Kpn I酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID NO.1的GhPSKR1基因后，且保持super1300的其他序列不变得到的重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP。其中，重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP的结构示意图如图3所示。
3.2 GhPSKR1过表达转基因植株的获得
(1)将3.1步骤获得的重组表达载体35S::GhPSKR1-GFP导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
(2)将(1)得到的重组农杆菌于28℃含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中摇床培养24h。
(3)在4000rpm下离心10min，收集重组农杆菌并用重悬液重悬，将重悬菌液浓度调整到OD600＝0.8。其中，重悬液的配方为：pH5.6的50mM MES、5wt％蔗糖，溶剂为水。
(4)向菌悬液加入500μl/L的silwetL-77，然后使用其蘸湿拟南芥未露白的花序，并将拟南芥用黑色塑料袋包住以保持湿度，平放，20℃暗培养24h后去掉塑料袋，恢复光照，按常规方法培养植株至结实，收获成熟T0代种子。
其中，silwetL-77购自：北京酷莱搏科技有限公司；货号：CS9791。
(5)采用含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基培养T0代种子并从中挑选阳性植株。其中，阳性植株表现为：真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中。
(6)对获得的阳性植株进行自交获得T1代种子，然后采用含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基培养T1代种子并从中挑选阳性植株。其中，筛选标准为阳性植株比例大于3：1。
(7)将(6)中所获阳性植株进行自交获得T2代种子，采用含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基培养T2代种子并从中挑选阳性植株。其中，筛选标准为该株系全部为阳性植株。
(8)将(7)所获阳性植株进行自交获得T3代种子，培育T3代种子，获得T3代转GhPSKR1拟南芥植株。
(9)T3代转GhPSKR1拟南芥植株生长至第四周时用打孔器取叶片样品，液氮磨碎叶片组织，加入SDS植物总蛋白提取液(250mM Tris-HCl pH 6.8，4％SDS，40％甘油，0.1％溴酚蓝，4％β-巯基乙醇)，混匀后95度以上变性10分钟，离心取上清即为变性后的总蛋白进行SDS-PAGE检测。
其中，SDS植物总蛋白提取液的配方组成为：pH 6.8的250mM Tris-HCl、4wt％SDS、40wt％甘油、0.1wt％溴酚蓝，4wt％β-巯基乙醇。
转GhPSKR1拟南芥植株即GhPSKR1过表达转基因拟南芥。
图7为本发明实施例中所述的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系的WesternBlot鉴定结果图。结果表明，通过本实施例成功获得了GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1和GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE2。
3.3GhPSKR1过表达转基因植株在盐胁迫下的表型研究
(1)将3.2步骤中获得的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE2、野生型拟南芥(WT)种子4℃春化72小时后，移入20℃温室中，16h光/8h暗，光强为60μmol/m2/s，湿度65±5％的培养室培养4天。
(2)然后将拟南芥幼苗转移至含有0mM或100mM NaCl的培养基中继续生长8天，并观察其生长表型，并统计其根长变化。
图8为本发明实施例中所述的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系和野生型拟南芥在盐胁迫条件下的生长状况比较结果图；其中，图8中的从左到右的植株分别依次为野生型拟南芥(WT)、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE2。
图9为本发明实施例中所述的GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系和野生型拟南芥在盐胁迫条件下的根长统计结果示意图。
结果表明，在作为正常对照组的MS培养基上，野生型拟南芥(WT)和GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE2的根长没有明显差异。而在盐胁迫处理时，GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1、GhPSKR1过表达转基因纯合株系OE2的根长相比野生型拟南芥拟南芥(WT)有显著的伸长。这表明了GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE1、GhPSKR1过表达转基因拟南芥纯合株系OE2具有良好的抗逆性。GhPSKR1基因在调控植物盐胁迫中起到了正调控作用。GhPSKR1基因能够在改善植物耐盐性中进行应用。
本发明克隆了棉花GhPSKR1基因，并利用转基因技术构建了GhPSKR1过表达的转基因拟南芥植物和利用VIGS技术构建了GhPSKR1沉默植株，对GhPSKR1基因进行了功能验证，明确了GhPSKR1基因可以提高植物的耐盐性，有利于更深入的研究植物对盐胁迫信号的响应机制，为有效提高植物耐盐性奠定了良好的分子基础，对探究植物在盐胁迫下的信号调控网络具有重大价值。
本发明首次揭示GhPSKR基因在棉花耐盐中的正向调控作用，并为棉花耐盐栽培提供优良的调控靶标和理论指导。本发明提供的一种GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用，开发一种GhPSKR基因在棉花抗逆方面的产品新应用。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改，这些变更和修改均落入本发明范围的所有变更和修改。

Claims (10)

1.GhPSKR1基因在调控植物耐盐性中的应用，其特征在于，所述GhPSKR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GhPSKR1基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过基因工程方法使植物中的所述GhPSKR1基因过表达，以改善植物的耐盐性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因工程方法为：利用所述GhPSKR1基因构建重组表达载体，将重组表达载体导入植物中，以改善植物的耐盐性。
5.一种含有权利要求1所述的GhPSKR1基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将所述GhPSKR1基因插入super1300-GFP载体的Sma I和Kpn I酶切位点得到的。
7.一种改善植物耐盐性的方法，其特征在于，使植物中如权利要求1所述的GhPSKR1基因过表达，或提高植物中如权利要求2所述的GhPSKR1基因表达的蛋白的活性，或提高植物中如权利要求2所述的GhPSKR1基因表达的蛋白的含量，以改善植物的耐盐性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使植物中所述GhPSKR1基因过表达是通过农杆菌介导的方式，使植物转化入所述GhPSKR1基因，以改善植物的耐盐性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括棉属和/或拟南芥属植物。
10.一种耐盐植物的育种方法，其特征在于，使植物中如权利要求1所述的GhPSKR1基因过表达，获得耐盐的转基因植物；
所述植物为棉花。
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