JPH03197497A - トキソプラズマ・ゴンディ抗原、その調製およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、トキソプラズマ・ボンブイ （Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）抗原の同定お
よび遺伝子工学によるそれらの調製に関する。この寄生
虫のｃＤＮＡ発現遺伝子バンクが調製された。診断的に
興味がもたれる組換えクローンを、高力価ウサギ抗−ト
キソプラズマ・ボンブイ血清を用いて同定して、単離し
た。

［従来技術］ トキソプラズマ・ボンブイは、コクシジウム（ｃｏｃｃ
　ｉ　ｄ　ｉ　ｕｍ）に分類される偏性細胞内単細胞寄
生虫である。本寄生虫は、比較的広範囲の宿主域を有し
ており、きわめて多くの哺乳動物に加えてヒトにも感染
することができる。後者の場合、互いに生理学的に異な
る二つの型がある。タキシイト（ｔａｃｈｙｚｏ　ｉ　
ｔｅｓ）は、多くの異なる細胞型で無性的に繁殖する。

この型は、感染の急性の段階においてのみ見出される。

これに対して、ブラディゾイ）　（ｂｒａｃｌｙｚｏｉ
ｔｅｓ）は、心臓および骨格筋の細胞および中枢神経系
の細胞において被包性型で存続して、再感染に対する持
続免疫を担っている。世界的に５億人がトキソプラズマ
・ボンブイここ慢性的に感染していると推定される。

健康な成人においては、トキソプラズマ・ボンブイ感染
は通常無症状で、例外はリンパ節の僅かな腫脹である。

しかし、妊娠中および免疫抑制された患者において、は
、この寄生虫による感染は著しい問題を起こすかもしれ
ない。したがって、免疫によってトキソプラズマ・ボン
ブイからの防御を獲得していない妊婦においては、これ
らの寄生虫の子宮内移動の危険性がある。これによって
、胎児感染が引き起こされ、子供の奇形または胎児の排
出が起きるかもしれない。

免疫抑制された患者においては、被包した「ブラディゾ
イト」の再活性化の結果、しはしは急性のトキソプラズ
マ・ボンティ感染が起きる。はとんどの場合、これによ
って、大脳トキソプラズマ症（脳炎）か引き起こされ、
これは状況によっては致命的であるかもしれない。大脳
トキソプラズマ症に加えて、トキソプラズマ・ボンブイ
はまた、眼病（脈絡網膜炎）の原因とも既述されている
。

これらの場合も、「プラディゾイト」の再活性化が関与
し得る感染である。

トキソプラズマ症の臨床像は、しばしは、臨床医の鑑別
診断を困難にさせる。そのために診断の確立における研
究室分析による支持が求められる。

したがって、抗体の検出および力価または力価の動力学
の決定がトキソプラズマ症を診断するための必須の手段
となる。ＧおよびＭクラスのトキソプラズマ特異性免疫
グロブリンの決定方法、例えば間接的免疫蛍光法（ＩＦ
）、補体結合反応（ＣＦ）、間接的血球凝集反応（ＩＨ
Ａ）、ラテックス凝集（Ｌ　Ａ　）および酵素結合免疫
法（ＥＬＩＳＡ）は、血清診断の分野できわめてよく知
られたものであるが、しはしは誤りがある。

例えば、これらの試験法は、特異性および感受性に関し
て非常に大きく違っている。これらの違いは、血清学的
試験に用いられる抗原の調製物によって主として起きる
。はとんどの場合、非特異的細胞成分の多くを含み、誤
った陽性の試験結果を引き起こす原因となる全細胞抗原
が、調製される。

加えて、感染マウスから抗原を得ることは、研究室にお
いて働くヒトへの感染の危険性がある。

この型の診断の特異性および感受性を鑑みて、ＩｇＧ−
特異性とＩｇＭ−特異性抗−トキソブラスマ・ボンブイ
抗体とを識別することを加えて可能にするへき定義され
た免疫反応性抗原を用いることがしたがって望ましい。

診断的に興味がもたれる多くの抗原は、トキソプラズマ
・ボンブイについて文献に記述されている。例えは、Ｈ
ｕｇｈｅｓは総説（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２０．１０５−１３９．１９
８５）において、ＩｇＧクラスの抗−トキソプラズマ・
ボンブイ抗体の検出に適する可能性のある分子量４５．
３２．２７および２１キロダルトン（ｋＤ）の四つの主
要抗原を記述している。ｌｌａｎｄｍａｎら（Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ　、　４０．５７９−５８８．１９８０）および
Ｐｏｔａｓｍａｎら（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄ　ｉ　５ｅａｓｅｓ、１５４．６５０−６５７．１９
８６）は、急性感染トキソプラズマ・ボンブイ患者の病
気の経過を通して採取した血清をウェスタンプロットを
用いて分析して、３５ｋＤの膜抗原かＴｇＧ抗体ときわ
めて初期の段階で反応することを示した。Ｄｅｃｏｓｔ
ｅｒら（Ｃ１ｉｎｉｃ、　Ｅｘｐｅｒ、　１ｍｍｕｎｏ
１．７３．３７６−３８２、＋９８８）は、診断的に興
味かもたれる分子量１０５．９７．６６および２８．　
５ｋＤを有する四つの抗原について記述しているが、こ
れらは３５ｋＤの抗原と対照的に、培養培地から単離さ
れ得て、［排出分泌抗原］　　（ＥＳ抗原）と名付けら
れている。１０５．９７および２８．５ｋＤの抗原と反
応するＩｇＧ抗体は、慢性トキソプラズマ症のためのよ
いマーカーのよってある。３５ｋＤ抗原と同様に、９７
ｋＤ抗原および６６ｋＤ抗原は、きわめて初期の段階に
おいて急性感染患者のＩｇＭ抗体によって認識される。

これらの抗原は、通常−つの分子量域にいくつかのタン
パク質があるために、電気泳動分画後に分子量を得るこ
とによる充分な特徴付けがされていないということか指
摘されねばならない。

６ｋＤの抗原は、急性トキソプラズマ症のためのさらな
るマーカーである（　Ｅｈｒｌ　ｉｃｈら：　Ｉｎｆｅ
ｃｔ。

ｍｍｕｎ、　４］、６８３−６９０．１９８３）。Ｉｇ
Ｍウェスタンプロットにおいて、この抗原は、比較的強
く反応する。今日まで、この抗原の性質を明らかにする
データはきわめて僅かである。

これまでのところ、ごく僅かのトキソプラズマ・ボンブ
イ抗原が生化学的に特徴付けされているにすぎない。主
要な表面タンパク質Ｐ３０は、例外である。この抗原は
、糖脂質を介して膜に固定された糖タンパク質である（
Ｎａｇｅｌ　ら：Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．５５６９−５５７６
．１９８９）。Ｆ３０はまたＩｇＧクラスの非特異性抗
体と反応することから、この抗原の診断的重要性は議論
のあるところである（Ｐｏｔａｓｍａｎら：　Ｊ、　Ｃ
ｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

２４．１０５０−１０５４．１９８６）。

血清診断における使用のための各抗原の単離および精製
は、しはしはかなりの仕事量となる。抗原の分子量デー
タおよび免疫反応性の分類の双方は、各々の場合で、従
来精製された抗原においては実質的に異なり得る。その
ような抗原のクローニングおよび発現ならひに対応する
遺伝子の構造の研究は、精製抗原の収量を高めるばかり
ではなく、血清学的特徴付けに、したかって、抗原の診
断的関連の研究に、貢献するであろう。今までのところ
、二つの免疫学的に興味のあるトキソプラズマ・ボンテ
ィ抗原の遺伝子の構造が調べられている。これら抗原の
完全なヌクレオチド配列、すなわちＩ）　３０　（Ｂｕ
ｒｇら：　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１４１．３５８４３
５９］、　１９８Ｂ）および２８ｋＤ抗原（Ｐｒｉｎｃ
ｅら：Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ、　３４．３−１４．１９８９）が知られている。

［発明の詳細な説明］ 本発明の目的は、診断および予防に適する、トキソプラ
ズマ・ボンブイの定義された抗原を遺伝子工学によって
調製することである。高力価ウサギ抗−トキソプラズマ
・ボンブイ血清を用いて、λｇｔ　１１　ｃＤＮＡ発現
遺伝子バンクから適当なトキソプラズマ・ボンブイ遺伝
子産生物を同定することは成功し得た。８個のクローン
（Ｆ２、Ｆ２８、Ｆ２９、Ｆ３４、Ｆ４５、Ｆ６１、Ｆ
７４およびＦ７６）の部分的核酸配列、およびそれらに
由来するアミノ酸配列、が決定された。上記のクローン
の全部がウェスタンプロットにおいてヒト抗−トキソプ
ラズマ・ボンブイＩｇＧ血清と反応する。クローンＦ３
４、Ｆ６１およびＦ７６は、ＩｇＭクラスの特異的抗体
ともさらに反応する。

部分的ヌクレオチド配列は、表１〜８に示される通りで
あり、明かである限り、翻訳解読枠も示されている（表
１〜６）。

Ｆ６１（表１）は、分子量６６ｋＤを有するタンパク質
である。

Ｆ３４（表２）は、約６８ｋＤのタンパク質に属する。

Ｆ２９（表３）は、約３０ｋＤのタンパク質に属する。

Ｆ２８（表４）は、約２８ｋＤのタンパク質に属する。

Ｆ２（表５）は、約３０ｋＤのタンパク質に属する。

Ｆ７６（表６）は、約３５ｋＤのタンパク質に属する。

Ｆ４５（表７）は、約２９ｋＤのタンパク質に属する。

ｌＯ− Ｆ７４（表８）は、約６４ｋＤのタンパク質に属する。

記述された部分的配列を用いて、上記の部分的配列のた
めの完全な遺伝子が容易にクローニングできる。

したがって、表１．２および６に示された部分的配列を
、それらに属する遺伝子のコードｃＤＮＡ領域を完成す
るために用いた。この目的のために、ｃＤＮＡ　ＦＢＩ
、Ｆ１ａおよびＦ７６を放射性標識して、ｃＤＮＡ遺伝
子バンクのスクリーニングのためのプローブとして用い
た。表１からの配列、ＦＢＩ、をＰ６６タンパク質のｃ
ＤＮＡを単離するために用いた。表２からの配列、Ｆ１
ａ、をＰ６Ｂタンパク質のｃＤＮＡを単離するために用
いた。Ｐ３５タンパク質のｃＤＮＡの単離のために、表
６からの配列、Ｆ７６、を用いた。これらの配列との相
同性を有する組換えクローンを単離して、挿入されたト
キソプラズマ・ボンブイ特異性ｃＤＮＡ領域の配列決定
によって構造的に特徴付けした。Ｐ３５、１ｌ− Ｐ６６およびＰ６８タンパク質の構造遺伝子の完全な範
囲のヌクレオチド配列は、表９〜１１に示される通りで
ある。

免疫学的に反応性の部分領域（免疫原性部分）を、例６
および７においてＰ３５、Ｐ６６および′Ｐ６Ｂについ
て代表として記述する。他の免疫原性タンパク質領域を
、同様の方法で試験または決定する。

したがって、本発明は以下のことに関する。

（ａ）　　上記クローンの単離された挿入されたＤＮＡ
配列であって、それらの転写産物および特殊の構造遺伝
子を完成するための残りの配列を含む。

（ｂ）　　これらの配列の全部または一部を含む、ＤＮ
Ａ構造物およびベクター （Ｃ）　　この型のＤＮＡＩこよって形質転換された原
核または真核細胞。

（ｄ）　　この型の形質転換細胞によって発現されたポ
リペプチドまたはこれらの免疫原性部分であって、診断
および治療または予防のためのこれらの２ 使用を含む。

（ｅ）　　これらに属するアミノ酸配列。

（ｆ）　　（ｄ）に記述のポリペプチドに対する抗体で
あって、トキソプラズマ・ボンブイ感染の診断および治
療または予防のためのこれらの使用を含む。

（ｇ）　　（ｄ）に記述のポリペプチドまたはそれらの
免疫原性部分の、遺伝子工学による調製法。

本発明は、ざらに語例および特許請求の範囲に記述され
る通りである。

伜Ｌ１；□ トキソプラズマ・ボンブイのλｇｔｌｌ−ｃＤＮＡ発現
遺伝子バンクの構築 ■）ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの単離 コンフルエントなＨｅｐ−２細胞培養物を、Ｂｒａｖｅ
ｎｙら　（Ｔｒｏｐｅｎｍｅｄ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ
ｏｇｉｅ、　２９．４３２４３４、＋９７８）による記
載の方法でトキソプラズマ・ボンブイ寄生虫で感染させ
た。感染後４日目から、トロホゾイトを培養上清の遠心
分離によって集めた。沈澱させたトキソプラズマ・ボン
ブイ細胞の約５００ｍｇ（湿重量）／Ｊ）らの全ＲＮＡ
を、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋ　ｉおよび５ａｃｃｌ］１（
１９８７）　　（ＡｎａｌｙｔｉｃａＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、、１６２．１５６−１５９）の修飾法によっ
て以下のように単離した。細胞を２０ｍ１の溶液Ｄ（４
Ｍグアニジニウムイソチオシアネー！、０．５％サルコ
シル、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０
．１Ｍメルカプトエタノール）中で溶解して、２’ｍｌ
の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）、２０ｍ１のフェ
ノール（水で飽和乙こしたもの）および４ｍｌのクロロ
ホルムを添加した後、混合物を激しく振盪して、氷上で
２０分間冷却した。遠心分離工程（３０分間、４℃、１
５０００ｇ）の後、ＲＮＡを１容量のイソプロパツール
で１時間４℃で水相から沈澱させて、次いで遠心分離（
２０分間、４℃、１５０００　ｒｐｍ）によって沈澱物
が得られた。沈澱物を６００μｍのＤ溶液に再懸濁させ
て、次いてＲＮＡを５．７ＭＣｓＣｌ溶液（３ｍｌ）を
通して遠心分離した（１２時間、３５０００　ｒｐｍ、
　　１０℃）。沈澱物を５００μｍの再蒸留水（ＲＮＡ
ｓｅを含まない）に再懸濁させて、ＲＮＡを１／１０容
量の酢酸ナトリウムおよ３ −１４＝ び２容量のエタノールで２時間−２０°Ｃで再び沈澱さ
せて、遠心分離によって沈澱させた（エッペントルフ遠
心分廂機中で１０分間、１４０００ｒｐｍ、４℃）。ポ
リ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（ファル
マシア）カラム（１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、
０．５ＭＫＣｌ中の０．５ｇオリゴｄＴ−セルロース）
を次のようにして濃厚富化した。ＬｉＣ１（最終濃度０
．５Ｍ）を、ＲＮＡ溶液を変性（７０℃、１０分間）さ
せた後、加えて、混合物をオリゴｄＴ−セルロースカラ
ムに通した。カラムを２０ｍ１の結合緩衝液（１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７，５）、０．５ＭＫＣＩ）で洗浄し
た後、ポリ（Ａ）十ＲＮＡを１０ｍ１の再蒸留水’（ｄ
ｏｕｂｌｅ−ｄｉｓｔ、ｊｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ）で溶
出して、１／２０容量の８ＭＬｉＣ１および２．５容量
のエタノールで一２０℃で４時間沈澱させて、次いで遠
心分離’（６０００ｒｐｍ、　４°Ｃ１３０分間）によ
って沈澱させて、７０％エタノール中で洗浄して、乾燥
させた。

２）ｃＤＮＡ合成 １５− ｃＤＮＡの合成を、Ｇｕｂｌｅｒの修飾法（Ｕ。

Ｇｕｂｌｅｒ：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
１６．２７２６．１９８Ｂ）によりて行フた。５μｍの
トキソプラズマ・ゴンディボリ（Ａ）十ＲＮＡを変性（
５分間、７０℃）させた後、最初のＤＮＡ鎖の合成を、
５０ｍＭ）リス塩！　　（ｐ　Ｈ８，３）　　、　　７
５ｍＭＫＣｌ　、　　５０ｉｎＭＤＴＴ、１５ｍＭ　Ｍ
ｇＣＩ、、、０．　５　［ｍＭ］ｄＮＴＰ、５Ｍｇのオ
リゴｄＴブライマー（ベーリンガー、マンハイム）およ
び８００ユニツトの逆転写酵素（ＢＲＬ）の存在下で５
０μｍの混合物で３７°Ｃで１時間で行う。次いで、反
応を７０°Ｃで１０分停止させて、８７１ＩのＩＭ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）、３２μｍのＩＭＫＣＩ、１．６
μｍの１ＭＭｇＣ１２，１，６μｍのＩＭＤＴＴ。

５０ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリン
ガー、マンハイム）、３．５ユニツトのＲＮＡ５ｅＨ（
ベーリンガー、マンハイム）を最終容量３２０　／１１
で添加後、第二のＤＮＡ鎖の合成を始める。混合物を１
６℃で１時間および２２℃で１時間インキュベートする
。次いで、ｃＤＮＡ６− を２容量のエタノールおよび１／１０容量の酢酸ナトリ
ウムで一７０℃で１０分間で沈澱させて、遠心分離によ
って沈澱物を得て、乾燥させる。沈澱物を１００７１１
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（２０ｍＭ　（Ｎ　Ｈ
，ｌ）　２Ｓ　Ｏ４，５０ｍＭ）リス塩酸（１）Ｈ８，
８）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．５０１１ｍｄＮＴＰ）
に再懸濁させて、１０ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（ベーリンガー、マンハイム）を加えることによって
ｃＤＮＡ末端の埋填反応を開始する。混合物を３７℃で
１０分間インキユベートシて、１００μｍのフェノール
／クロロホルム（１：１）の添加後にフェノール処理す
る。次いて、ｃＤＮＡ溶液を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　
２００カラム（ファルマシア）を通して遠心分離する。

ｃＤＮＡを２容量のエタノールおよび１／１０容量の酢
酸ナトリウムを用いて溶出液から沈澱させて、遠心分離
して、乾燥させる。

３）ｃＤＮＡの、ＥｃｏＲＩアダプターとの連結乾燥さ
せたｃ　Ｄ　ＮＡ　（１ｔｔｇ）を３０μｍの連結緩衝
ｔｆ（３０ｍＭ）リス塩酸（ｐＦｔ７．ｓ）、１０ｍＭ
　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２、０．５ｍＭＡＴＰ、　ｌＯｍＭＤ
ＴＴ）に再懸濁して、４０　ｐｍｏｌのＥｃｏＲＩアダ
プター（プロメガ）および７．５ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加えて、混合物を１４℃で１５時間インキュ
ベートシた。リガーゼの不活化（１０分間、７０℃）の
後および４μｍのキナーゼ緩衝液（０，７Ｍ）リス塩酸
（ｐＨ７，６）、０．１ＭＭｇＣＩ２．５０ｍＭＤＴＴ
）、２／ｌＩの０．１ｍＭＡＴＰおよび１０ユニツトの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）の添加
、それに続くキナーゼ処理（３０分間、３７℃）の後、
ｃＤＮＡを再び５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　２００カラム
を通して遠心分離して、次いで、上記のようにエタノー
ルおよび酢酸ナトリウムで沈澱させる。

４）λｇｔｌｉＥｃｏＲＩ断片とのｃＤＮＡの連結、イ
ンビトロパッケージングおよびλｇｔｌｌのトランスフ
ェクション 連結反応のために、約５０ｎｇのキナーゼ処理したｃＤ
ＮＡを１０μｍの混合物（６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７
，６）、６．６ｍＭ　’ＭｇＣｌ　２．１ｍＭ１７ １８− ＡＴＰ、５ｍＭＤＴＴ）に入れた１７１ｇの脱燐酸化し
たλｇｔ　１１ＥｃｏＲＩ断片に加えて、３％Ｊｅ　ｉ
　ｓｓ小単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンカーマンハ
イム）の添加後、混合物を１４℃で１５時間インキュへ
一トシた。５μｍのこの混合物を、ノ＼ッケージングミ
ックス製造者（Ｇｉｇａ　Ｇｏｌｄ　Ｍｉｘ、Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）の説明書に従って行われたインビトロパ
ッケージング反応において用いる。

大腸菌Ｙ１０９０株のトランスフェクションの後、絹換
えファージの力価を決定した。全部で約１０６個の組換
えファージが得られた。

例」ＬＬ 高度免疫ウサギ抗−トキソプラスマ・ボンブイ血清を用
いる、入ｇ　ｔ、　ｉ　ｉ発現遺伝子バンクのスクリー
ニング イムノプロットにおける非特異的反応を減らすために、
抗−大腸菌抗体を先ず、ウサギ抗−トキソプラズマ・ボ
ンブイ血清から既知の方法（Ｌ、Ｓ。

０ｓａｋａ：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ、　
８９．２１３−２１９．１９８６、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ
ｉｏｔｅｃ、　ＰｒｏｔｏＢＩｏｔ　１ｍｍｕｎｏｓｃ
ｒｅｅｎ＋ｎｇ−１，９ Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ、
１９８６）にて吸着させた。この目的のために、入ｇｔ
ｌｌ野生型ファージを、全部で３０枚のＬＢ寒天プレー
トに９０ｍｍの寒天プレート当り、９ｍｌのＬＢ軟寒天
１０．４％マルトース／１０ｍＭＭｇＳＯ４に５Ｘ１０
４ＰＦＵの密度で分布させた。３７℃で２時間インキュ
ベートした後、各々の場合に１０ｍＭＩＰＴＧ（イソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）中で平衡にし
た乾燥円形ニトロセルロールフィルターでプレートを覆
って、さらに２時間インキュベートした。次いて、フィ
ルターを反転させて、寒天上で２時間再びインキュベー
トした。次いで、フィルターを５％脱脂粉乳／ＴＢＳ緩
衝液（ＴＢＳ：　　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ）
リス塩酸（ｐＨ８，０））中で室温で１０分間インキユ
ベートシて、５％脱脂粉乳／ＴＢＳ中で１／１００に希
釈した１００ｍ１のウサギ血清中に移した後、４時間室
温でインキュベートした。この前吸着させた希釈血清を
、スクリーニング実験およびウエスタンプロッＩ・の双
方に使用した。全部で６×０ １０５個のλｇｔ　１１　ｃＤＮＡバンクの組換えファ
ージを、この血清とともにＲ，Ｙ、　Ｙｏｕｎｇおよび
ＲｏＷ、　Ｄａｖｉｓ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０．１１９４．１９８３）の方
法によるスクリーニングに供した。この目的のために、
大腸菌に１２　　Ｙ１０９０株の培養細胞を、上記のよ
うに、組換えλｇｔｌｌファージ（３Ｘ　１０’フアー
ジ／１００μ１Ｙ１０９０培養液）でトランスフェクト
させて、軟寒天プレート（全部で２０プレート）上に分
布させた。

７℃で２時間インキュベートした後、プレートを、各々
に、１０ａ＋ＭＩＰＴＧに浸して乾燥させたニトロセル
ロースフィルターで覆って、さらに２時間インキュベー
トシた。寒天プレート上のフィル−ターの位置を印付け
した後、フィルターを注意深く引き上げて、２１５０ｍ
１の５％脱脂粉乳／ＴＢＳ緩衝液中で１０分間室温で振
盪した。次いで、フィルターを新鮮な脱脂粉乳／ＴＢＳ
緩衝液中に移して、４℃で一晩保持した。

フィルターを２５０ｍ１の脱脂粉乳／ＴＢＳ緩衝液中で
さらにインキュベートした後、これらを１００ｍ１の前
吸着させたウサギ抗−トキソプラズマ・ボンブイ血清と
室温で１時間軽く振盪した。次いて、フィルターを３回
、各々、２５０…１のＴＢＳで室温で１０分間洗浄して
、脱脂粉乳／ＴＢＳて１　／３００に希釈した２５０ｍ
１の抗−ウサギＩ　ｇＧ／アルカリホスファターゼ■ｇ
Ｇ抱合物（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ、　Ｍａｒｂｕｒ
ｇ）とともに室温でさらに１時間振盪した。フィルター
を洗浄（２５０ｍｌのＴＢＳで３回、各々１０分間室温
で振盪する）の後、これらを２５０ｍ１のアルカリホス
ファターゼのための基質溶液（２００ｇｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−インドキシホスフェート（ＸＰ）
　　（Ｂａｃｈｅｍ社製、注文番号：　Ｎ１２０５）の
ｐ−）ルイジン塩、５００７ｚｇ／ｍｌの４−ニトロテ
トラゾリウムクロリドブルー（シグマ社製：注文番号：
　Ｎ６８７６））中で１５分間再びインキュベートした
。ファージプラークの周りに形成される環の呈色域から
認められる血清陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）クロ
ーンを、ベトリ皿上の領域と照合して、パスツールピペ
ットを用いてくり抜き、１ｍｌの９Ｍ緩衝液中に再懸濁
させた。陽性１ ２ ファージプラークの各クローンを、２回のさらなるスク
リーニング工程で調製した。全部で８３個の血清陽性ク
ローンを単離した。これらクローンをさらに次のように
特徴付けした。

１）ｃＤＮＡクローンの免疫学的特徴付け２）クローニ
ングされたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物の構造的特徴付け ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡドツトプロット分析ｂ）転写解読枠
を調べるための、ｃＤＮＡ挿入物の部分的配列決定 ｃ）ｌａｃＺまたはＬａｃＺ’　　（部分的に欠失した
β−カラクトシダーゼ誘導体）との遺伝子融合物として
の、クローニングされたｃＤＮＡの発現３）血清陽性ｃ
ＤＮＡクローンの免疫学的特徴付は 遺伝子バンクの血清陽性クローンを、「クローン特異性
」血清（これはｃＤＮＡクローンの組換え融合タンパク
賃上の吸着によってポリクローナルウサギ血清から得ら
れた血清を意味する）を用いて免疫学的に特徴付けした
。これら血清を、３ １）ｚａｋｉら（Ｊ、　１ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ、
　８９．２１３−２１９．１９８６）の方法により、次
のように調製した。各々、５×１０’ＲＦＣの各ｃＤＮ
Ａクローンを、大腸菌Ｙ１０９０ｍ胞に吸着させた後に
、軟寒天中でＬＢプレートに分布させて、２時間インキ
ュベートした後、各々、１０ｍＭＩＰＴＧで前処理して
おいた１枚のニトロセルロースフィルターで覆って、例
２に記述のように処理を続けた。このようにして前処理
したクローン当り３枚のフィルターを、各々、前吸着さ
せたウサギ血清中で４時間インキュベートして、次いで
、５０ｍ１のＴＢＳで１０分間洗浄した（緩衝液を３回
交換）。フィルターに結合した抗体を全部で１５ｍ１の
０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２，５）を用い
て室温で５分間洗い出して、３ｍｌのＩＭ）リスで中和
した。

脱脂粉乳を最終濃度５％になるように加えた。

単一特異性血清を２０の各々のクローンから生じさせた
。すべての血清陽性クローンの組換えタンパク質に対す
るこれら血清の免疫反応性をドツトプロット実験におい
て試験した。組換えタンパ２４ り質が血清と交差反応したクローンを、クローン群に一
緒にグループ分けした。サザンドットプロット分析にお
いて、３２ｐ−標識した挿入ＤＮＡのみが上記の血清学
的データの結果として一つのグループに入れられたクロ
ーンＤＮＡと相同性を示した。一つのクローンを各グル
ープから選択して、ウェスタンプロットにおいてヒト抗
−トキソプラズマ・ボンブイ血清を用いて試験した。こ
の目的のために、クローンＤＮＡの挿入断片を、適当な
発現ベクター中にサブクローニングするかまたは、大腸
菌に１２　Ｙ１０８９株を特定の組換えλｇｔ１１誘導
体で溶原化させた。

伜り生ぶ− β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の発現免疫反応性
を調べるために、λｇ　ｔ　１１クローンＦ２、Ｆ２９
、Ｆ２８、Ｆ３４、Ｆ６１およびＦ７６のｃＤＮＡ断片
を、部分欠失したＬａｃＺ誘導体との遺伝子融合物とし
てｐＳＥＭシリーズ（Ｋｎａｐｐら：　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、　８．２８０．１９９０）のベクター中
にサブクローニングして、融合タンパク質の発現を大腸
菌Ｗ３１１０　１ａｃＩ’Ｌ８（ＢｒｅｎｔおよびＰｔ
ａｓｈｎｅ：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、７８．４−２０４−４２０８．１９８１）中
でＴＰＴＧの添加によって誘導した。クローンＦ４５お
よびＦ７４の融合タンパク質の発現のために、大腸菌Ｙ
　１０８９株を、双方のλｇｔｌｌ誘導体で溶原化させ
て、次いで、融合タンパク質を既知の方法（Ｈｕｙｎｈ
　ら：Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎｇＶｏｌｕ
ｍｅ　ｌ、４９−７８、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆ
ｏｒｄ、　１９８５）で誘導した。全細胞抽出物からの
タンパク質を、ＩＰＴＧ誘導後、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ　
（１０％）で電気泳動的に分画して、ニトロセルロース
に移した。組換えタンパク質の反応性を、ヒ）　Ｉ　ｇ
ＧおよびＩｇＭ血清を用いてウェスタンプロットにおい
て確認した。最後に、このようにして特徴付けしたクロ
ーンを配列決定した。

ｃＤＮＡ断片の配列決定 ｃＤＮＡ断片の配列決定を、ｒＫＳブライマー」（プロ
メガ）を用いてＳａｎｇｅｒのジデオキシ法５− ６− （Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　７４、５４６３、１．９７７）　　に　よって行った
。クローンＦ２、Ｆ２９、Ｆ３４、Ｆ２８、Ｆ４５、Ｆ
６１、Ｆ７４およびＦ７６の挿入断片を、ＥｃｏＲＩを
用いて組換えλｇｔｌｌＤＮＡから切り出して、ベクタ
ーブルースフリブ）ＫＳのＥｃｏＲｉ切断部位に挿入の
後、大腸菌Ｘ　Ｌ　１−ブルー株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）中に形質転換させた。これ
ら組換えプラスミドの１本鎖ＤＮＡを、ヘルパーファー
ジ■Ｃ８によるクローンの感染の後、既知の方法（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ、　５ａｎＤ＋ｅｇｏ）　テ単離した
。クローニングされた断片の位置方向によって、ｃＤＮ
Ａの５′または３′末端の配列が得られる。

表１〜８は、上記クローンの翻訳解読枠（表１〜６）お
よび部分的ヌクレオチド配列（表１〜８）を示す。

伜り仕≦− 組換えトキソプラズマ・ボンブイ抗原ｒＰ３５、ｒ　Ｆ
６６およびｒＰ６８の、診断的適合性抗原Ｐ３５、Ｆ６
６およびＦ６８の構造遺伝子７ の領域からの部分的配列を、大腸菌Ｗ３１１０中でｐＳ
ＥＭ発現ベクター（Ｋｎａｐｐら：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、８．２８０．１９９０）を用いて発現させた
。発現産物は、Ｃ末端に挿入特異性融合タンパク質を含
む３７５個のアミノ酸のＮ末端β−ガラクトシダーゼ誘
導体からなる。融合タンパク質の合成は、Ｋｎａｌｌｐ
ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８．２８０．１９９
０）による記述のようにＩＰＴＧによって誘導され得る
。ウェスタンプロット実験のために、組換え大腸菌Ｗ３
１１０誘導体の全細胞抽出物を、Ｉ　ＰＴＣ；誘導後、
５ＤＳＰＡＣ；Ｅて分画した。タンパク質をニトロセル
ロースペーパーにを移して、特異的血清サンプルおよび
抱合物（抗ヒ）ＩｇＣ／アルカリホスファターゼ）とと
もにインキュベートして、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
：　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ、　１９８９）に従って染色した。上記のトキ
ソプラズマ・ボンブイタンパク質の次の部分を発現させ
た。

ｒＰ３５：塩基対３６３−５２７木：バイブリド２８ プラスミドｐＰ５７６に含まれる 工゛Ｐ６８：塩基対１７６−１９２７＊：ハイブリドブ
ラスミドｐＰＳ３４に含まれる ｒＰ６６：塩基対１−２０７４＊：ハイブリドブラスミ
ドｐＰＳ６１に含まれる （木表９〜１１中のデータのヌクレオチド配列に対応す
る）。

急性または慢性トキソプラズマ・ボンブイ感染を有する
患者のヒト血清からの特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の
反応性を、ウェスタンプロット実験において調べた。こ
れら実験の結果は表１２に要約される通りである。この
ように、三つのバイブリドタンパク質、ｒＰ３５、ｒＰ
６ＢおよびｒＰ６８の全てが、特異的ＩｇＧ抗体の検出
に適している。ｒＰ３５については特に強調されるべき
である。２５／２Ｂ血清はＩｇＧウェスタンプロットに
おいてバイブリドタンパク質と反応した。

ｒＰ６８を用いて、特異的ＩｇＧ抗体は２７／３１血清
において認められた。ｒＰ３５およびｒ　Ｆ６８の両融
合タンパク質は、検出可能な特異的ＩｇＭ抗体力価を有
していた急性血清（ｎ２１）からのＩｇＧ抗−トキソプ
ラズマ・ボンブイ抗体と例外なく反応した。このために
、ｒ　Ｆ３５およびｒＰ６８の双方は、トキソプラズマ
症の急性期における１ｇＧ抗−トキソプラズマ・ボンブ
イ抗体の検出のためのマーカーとして、特に適している
。

ｒＰ６６はＩｇＭプロットにおいて試験された２１個の
血清のほとんどと反応し、したがって、この免疫グロブ
リンクラスの特異的抗体の検出のためのマーカーとして
適している。

作Ｌ７≦− 組換えトキソプラズマ・ボンブイタンパク質ｒ　Ｆ３５
およびｒＰ６８の、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおける適合性 特異的ＩｇＧ抗体との組換えトキソプラズマ・ボンブイ
タンパク質ｒＰ３５およびｒｐ６Ｂの反応性をＥＬ　Ｉ
　ＳＡにおいて調へた。二つのタンパク質を、−緒にま
たば各々別々にＥＬ、ＩＳＡプレートを被覆するための
固相抗原として用いた。二＝２９− ０ つのバイブリドタンパク質を、大腸菌から次のように単
離した。

プラスミドｌ）　Ｐ　Ｓ　７６またはｐＰＳ３４を含む
刊換え大腸菌Ｗ３１１０株の一晩培養物を、２１Ｊツト
ルのＬ−アロス／　１００　ｍｇ／ｍｌアンピシリン中
で１１５０に希釈して、激しく振盪しながら、０１）６
００＝０．７になるまで３７℃で増殖させた。ＴＰＴＧ
　（最終濃度１　ｍＭ）の添加後、培養物を３７℃でさ
らに３時間激しく振盪して、遠心分離して、細胞沈澱物
を１５０ｍＭ　ＮａＣＮａＣ１１５Ｏリス塩酸（１）Ｈ
８，Ｏ）／１ｍｇ／ｍ！リソチーム中で溶解して、３７
℃で１０分間インキュベートした。細胞破砕のために、
細胞懸濁液をフレンチプレスで２回処理した。破砕され
た細胞を遠心外ｍ、’　（１００００ｒｐｍ、　　１０
分間、４°Ｃ）３て、難溶性月人体として存在する融合
タンパク質を含む沈澱物を種々の濃度の尿素溶液（１Ｍ
〜６Ｍ尿素）で連続して洗浄した。この工程において、
最初に沈澱物を３０ｍ１のＩＭ尿素／１０ｍＭ）リス／
１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）（ＴＥ）中で室温で１時
１ 間攪拌した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間、
４℃）の後、沈澱物を上記のように２Ｍ尿素に溶解して
、インキュベートした。次いで、これらインキュベーシ
ョンは、３Ｍ、　４Ｍ、５Ｍおよび６Ｍ尿素で続けられ
た。遠心分離工程の後の上清を保存して、これに溶解性
のタンパク質を、５ＤＳＰＡＧＥで分析した。融合タン
パク質に加えて大腸菌タンパク質の僅かな混入を含むの
み（約７５％融合タンパク質）であるこれら上清を、Ｅ
ＬＩＳＡプレートの被覆にさらに用いた。これら上清を
１Ｍ尿素１０．１％ＳＤＳに対して４℃で７２時間透析
した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの被覆のために、透析し
たサンプルのタンパク質濃度をＰＢＳ　（ｉ）ｔ（７，
０）で２μｇ／ｍｌに調製した。被覆を、１００μｍ／
ウェルを用いて４℃で一晩行った。次いで、血清試料を
プレートに供する前に、プレートをＡＰ洗浄緩衝液（ベ
ーリング、注文番号：　１３５３１１５）を用いて３回
洗浄した。

血清サンプルにおける抗−大腸菌抗体の吸着：まず、抗
−大腸菌抗体を、血清サンプルから除去２− した。この目的のために、大腸菌Ｗ３１１０の一晩培養
細胞を遠心分離して、沈澱物を５ｍｌのＰＢＳ　（ｐＨ
７，０）中に再懸濁させた。細胞を超音波処理（音波処
理３回、Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒを７にセッ
ト）によって溶解させて、ＤＮＡ５ｅＩ（最終濃度１μ
ｇ／ｍｌ）を加えた後、３７℃で１０分間インキュベー
トした。

ヒト血清および溶解物抗原を、１：１の比で混合して、
ＰＢＳ　（１）Ｈ７−０）中で１１５０に希釈して、室
温で３０分間振盪した。遠心分離後、５％脱脂乳／ＰＢ
Ｓ　（ｐＨ７，０）を上清に加えて（最終濃度１％）、
その１００μｍ／ウェルをＥＬＩＳＡプレート上で３７
℃で１時間インキュベートして、これらを３回ＡＰ洗浄
緩衝液で洗浄した。

次いて、ＡＰ抱合物希釈緩衝液（ベーリング注文番号：
　１３３２１１５）中で１／７０に予備希釈した１００
μｍ／ウェルの抗−ヒｌ”１ｇＧ／ＡＰ抱合物（ヘーリ
ング注文番号：　０５Ｄ１１０４１０５）を、３７℃で
１時間インキュベートした。プレートを３回ＡＰ洗浄緩
衝液で洗浄して、１００μｍ／ウェルのＡＰ基質溶液（
ベーリングＡＰ基質錠剤、注文番号：　０５ＣＸ９６、
バーリング１０％ジェタノールアミン、注文番号：　０
２４３１１５、基質溶液：１０ｍ１の１０％ジェタノー
ルアミン中に２錠）とともに３７℃で３０分間インキュ
ベートして、基質溶液の吸光度を４０５　ｎｍで決、定
した。

血清変換された患者（患者ＡＩ）の９個の血清を、試験
に含めた。血清サンプルを、供与者から次の日に採取し
た。Ａ：１９８８年８月９日、Ｂ：１９８８年８月１８
日、Ｃ：　１９８８年８月２９日、Ｄ　：　１９８８年
１０月１２日、Ｅ　：　１９８８年１２月２日、Ｆ　：
　１．９８９年１月１３日、Ｇ　：　１９８９年２月２
８日、Ｈ：　１９８９年５月１２日、Ｉ　：　１９Ｂ９
年７月１７日。証明し得るような感染は１９８８年７月
３１日に起きた。表１３に見られるように、第１７日後
に採取されたヒト血清Ｂは、ｒＰ３５およびｒＰ６８に
対する特異的ｒｇｃ抗体を既に示している。これに対し
て、この血清サンプルは、古典的な非組換えＥＬ　Ｉ　
ＳＡシステム（ＩｇＧ検出）においては陰性であった。

３３ ３４− ざらに急性トキソプラズマ症の供与者の、特異的ＩｇＭ
抗体を含む、３０個のヒト血清を、ｒ　Ｐ　３’５およ
びｒｐ６８に対するＩｇＧ抗体についてＥＬ　Ｉ　ＳＡ
において分析した。これらヒト血清は、同相に組換え抗
原ｒＰ３５およびｒＰ６８の双方を含むＥＬ　Ｉ　ＳＡ
において例外なく反応した。さらに、供血者からの１５
０個の血清を、特異的ＩｇＧ抗−ｒＰ３５および抗−ｒ
Ｐ６８抗体について分析した。同じ抗血清を、Ｅｎｚｙ
ｇｎｏｓｔＲ）キラプラズマ症（ＩｇＧ、製造者：　Ｂ
ｅｌｌｒｉｎｇｗｅｒｋｅＡＧ）において特異的■ｇＧ
抗体について分析して、二つの試験の結果を互いに比較
した。これによって、ＥｎｚｙｇｎｏｓｔＲにおいて陽
性であった血清はｒＰ３５／ｒＰ６８ＥＬＩｓＡにおい
ても陽性であったことが示された。抗−トキソプラズマ
・ボンブイ陰性血清についてもまた、ｒＰ３５／ｒＰ６
８ＥＬＩＳＡからのデータは、ＥｎｚｙｇｎｏｓｔＲＥ
ＬＩＳＡからのものと一致した。

３５− 表１２ ウェスタンプロット評価 Ｔ、ｇｏｎｄ タンパク質 発現プラスミド ｇＧ １ｇＭ −Ｐ２９ ３５ １′ ６６ ｒ　−Ｐ６８ ｐＰＳ２９　　ｐＰＳ７６　　ｐＰｓ６１　　ｐＰＳ３
４５／１６　　２５／２６　２１／３１　　２７／３１
０／２１　　　２／２１　　１？／２１　　　０／２１
表１３ 組換えおよび非組換えトキソプラズマ・ボンブイＥＬＩ
ＳＡの比較

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表１〜１１に示されるアミノ酸配列を含むまたは該
   表のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質または
   その免疫原性部分。 ２、請求項１に記載のタンパク質をコードする、核酸配
   列。 ３、請求項２に記載の核酸配列を含む、プラスミド。 ４、請求項３に記載のプラスミドによって形質転換され
   た原核または真核細胞。 ５、請求項１に記載のタンパク質に対するモノクローナ
   ルまたはポリクローナル抗体。 ６、請求項３に記載のプラスミドによつて原核または真
   核細胞を形質転換させて、このプラスミドで挿入された
   ＤＮＡを発現させて、発現産生物を単離することを特徴
   とする、請求項１に記載のタンパク質の調製法。 ７、請求項１に記載のタンパク質を含んでなる、トキソ
   プラズマ症感染の検出のための診断剤。 ８、請求項１に記載の一つまたはそれ以上のタンパク質
   を含んでなる、ワクチン。 ９、請求項２に記載の核酸配列を含んでなる、診断剤。 １０、請求項５に記載の抗体を含んでなる、診断剤。 １１、Ｐ３５および／またはＰ６８または該タンパク質
   の免疫原性部分を各々含んでなる、請求項７に記載の診
   断剤。 １２、試験される体液を請求項７または１１に記載の診
   断剤を用いて試験することを特徴とする、トキソプラズ
   マ症感染の検出法。 １３、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載の
   核酸配列、または請求項５に記載の抗体の、トキソプラ
   ズマ症感染の検出のための使用。