JPH03197492A - Ｂｕ―４０６１ｔ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、本明細書においてＢＵ−４０６１Ｔと命名さ
れた新規な抗腫瘍抗生物質、その製造法及び実質的に純
粋なりＵ−４０６１Ｔの単離精製法に関する。

（従来技術） 米国特許出願第１６５．３３７号（１９８８年３月７日
出願）には、次式： のＢＵ−３８６２１と命名された醗酵産物の抗腫瘍抗生
物質が開示されている。本ＢＵ−４０６１Ｔは、上記抗
生物に幾分かの構造上の関連性を有している。

（課題の解決） 本発明は、ＢＵ−４０６１Ｔと命名された新規な抗腫瘍
抗生物質に関する。本発明はまたＢＵ−４０６１Ｔの醗
酵による製造法に関し、特に、本明細書においてＱ９９
６−１７（ＡＴＣＣ−５３９０４）株と命名された新規
な放線菌に属する菌を用いての製造法に関する。本発明
は更にＢＵ−４０６１Ｔの醗酵法による製造に用いる新
規な微生物、そのＢＵ−４０６１Ｔの抗血瘍剤としての
用途、そしてＢＵ−４０６１Ｔを有効成分として含有す
る医薬組成物に関する。

本発明を以下に更に詳しく説明する。

本微生物 ＢＵ−４ｏ６ｘＴは、放線菌に属する菌株Ｑ９９６−１
７またはそのＢＵ−４０６１Ｔ産生変株または変異株を
醗酵せしめることにより得られる。

その好ましい産生株で、Ｑ９９６−１７と命名されたも
のは、インド国アンドーラ　ブ２デシュ州（Ａｎｄｈｒ
αＰｒａｄａｓｈ　５ｔａｔｅ、Ｉｎｄｉａ）で採取さ
れた土壌サンプルより分離せしめられた。

本菌の培養特性及び生理学的特性は、５ｈｉｒｌｉ％ｇ
＆３１３−３４０．１９６６）及びＧ、ｒｄ、ｆｓほか
（Ｊ。

＝５− 方法によって調べられた。全細胞の加水分解物中のアミ
ン酸及び糖の分析は、Ｌｓｃｈａｖａｌｉｇｒほか（Ｂ
ｉｏＣＡｇｍ。

によって行なった。メナキノン（惧＃％ａｑｕｉ％ｏｓ
ｓ　）のサン１００　；　２２１−２３０．１９７７）
の方法によって調製され、質量分析器で分析した。ミコ
ール酸及びグリコール酸の検出試験は、それぞれにｆｓ
％％ｉｋｉ％ほか（Ｊ、Ｇｍｎ。

２５；１６９−１８３．１９７９）の方法によって行な
った。

形態学的性状 基生菌糸は、長く、良く分枝し、桿状形態または球状形
態のものへは断片化しない。気菌糸は通常の判定用培地
で− （よ形成されない。不完全な気菌糸が、一部の特別な培
地、例えばラビット　ドウング寒天（ｒａｂｂｉｔ　　
ｔｈｂｎｇ　　ａｇａｒ）またハビタミンＢ複合体を補
った麦芽エキス−酵母エキス寒天でまれに生ずる。これ
らの気菌糸は、次第に細くなる先端を持つ分生子柄束（
基底で２−３０μ洛の幅）になっている。分生子柄束の
菌糸の先端あるいはその菌糸の部位での胞子の形成は見
られない。

培養特性及び生理学的特性（表１及び２）：基生菌糸の
色は、有機培地中ではグレーイツシューオＩＪ−フＴｌ
−ア’）、合成培地では無色又はライトイエローである
。メラノイド色素は産生されない。生育温度範囲は、１
９℃〜４５℃である。４８℃ではいかなる生育も見られ
ない。

細胞全部を加水分解したものには、メン−ジアミノピメ
リン酸、ガラクトース、マンノース、リボース及びラム
ノースを含有していることから、本菌は細胞壁タイプ■
及び糖パターンＣＫ輌すものである。そのリン脂質とし
ては、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチ
ジルグリセロール及びホスファチジルイノシトールがあ
げられることから、それはタイプＰ−■に分類される。

主要メナキノンはＭＫ　−９（Ｂａ）及びＪ［−１０（
１１４）である。ミコレトは存在しない。グリコレート
試験は陰性であった。

分類学上の位置 Ｑ９９６−１７株は、好気性中温性放線菌であり、胞子
を形成しない。化学的な分類では、本菌は、ストレブト
アｎｏｓｙ％％ｍｔｎａ）に関連したものである。しか
しながら、本菌は胞子形成の形態的特性で特徴付けされ
てないので、上配属のいずれにも分類することができな
い。かくして、本菌Ｑ９９６−１７は、同定されていな
い放線菌として記載するのが最もよい。

本放線菌株Ｑ９９６−１７の生物学的に純粋な培養物は
、４ｎｇｒｉｃａｎ　ＴｙｐａＣ％１ｔｓｒａ　Ｃｏ１
１ａｃｔｉｏｓ＋　ＲｏｃｋｍｉｌｌｅｒＭａｒｙＬａ
ｎｄ＋　Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託されており、ＡＴＣＣ−５
３９０４として微生物の永久保存株となっている。

本発明は、その特定の菌株あるいはその記載された性状
の微生物の使用のみに限定されるものではないことは理
解されるべきである。本発明は、通常の方法、例えばＸ
−線、紫外線、ナイトロジエンマスタード類、ファージ
にさらすこと等での処理によって作ることのできる上記
微生物のその他のＢＵ−４０６１Ｔ生産菌の変種または
突然変異体をも含むことを特に意図している。

ＢＵ−４０６１Ｔは、水性栄養培地中法部好気条件下放
線ＦＭＱ９９６−１７（ＡＴＣＣ−５３９０４）株また
はそのＢＵ−４０６１Ｔ生産変種株または突然変異株な
培養することにより生産することができる。該微生物は
、資化性の炭素源、例えば、トレハロース、Ｄ−キシロ
ース、Ｄ−ンルビトール、可溶性でんぷん、Ｄ−リボー
ス％　Ｄ−メ’）ビオース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マン
ニトール、マルトース、ラクトース、Ｄ−フルクトース
、グリセロール等を含有する栄養培地中で生育せしめら
れる。該栄養培地は、さらに資化性の窒素源、例えば、
魚肉ミール、ペプトン、大豆フラワー、ビーナツツミー
ル、Ｍ実ミール、コーンステイープリカー、酵母エキス
あるいはアンモニウム塩を含んでいるべきである。無機
塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、炭酸カルシウム、リン酸塩等が必要なら加えら
れる。微量元素、例えは銅、マンガン、−１〇− 鉄、亜鉛等が、所望なら培地中に加えられるか、あるい
はそれらは培地の他の成分の不純物として供給されたも
のであってもよい。

ＢＵ−４０６１Ｔの生産は、その産生菌の満足しつる生
育がなしつるいかなる温度、例えば、１９−４５℃でも
効率的になすことができるが、２５−３５℃で醗酵を行
なうのが好ましく、最も好ましくは２７−３２℃で行な
うのがよい。−船釣には抗生物質の生産は約３〜７日間
で行なわれる。

本醗酵は、各種の大きさのフラスコまたは実験用あるい
は工業用のノアメンテ−ター中で行なうことができる。

タンク醗酵が行なわれる場合、斜面培養、フィルカルチ
ャー（５ｏｉｌ　　ｃｓｌｔ％ｒｇ）または凍結されて
いる培養物の菌体を小皺の培養用培地に接種して栄養プ
ロス中の休止期の接種物を生産することが好ましい。こ
のような方法で活性な接種物な得た後、ＢＵ−４０６１
Ｔの大蓋生産のための醗酵タンク培地中に無菌的に移す
。その休止期の接種物を作る場合の培地は、その生産菌
が良好に生育する限り、タンクにおけるものと同一でも
あるいは異なっていてもよい。

醗酵中の撹拌は機械式の撹拌機によってなすことができ
、消泡剤、例えばラード油またはシリコン油が必要なら
加えられることができる。

醗酵培地中でのＢＵ−４０６１Ｔの生産は、薄層クロマ
トグラフィーまたは細胞毒性アッセイによって醗酵途中
に容易に見ることができる。

醗酵培地からのＨＵ−４０６１Ｔ抗生物質の単離及びＢ
Ｕ−４０６１Ｔの精製は、通常の溶媒抽出法やクロマト
グラフィー法によって行なうことができる。好ましい単
離精製法は、下記実施例２に具体的に示されたものであ
る。

ＢＵ−４０６１Ｔの物理化学的性状 ＢＵ−４０６１Ｔは、白色の無定形粉末として得られる
。

そのものは、メタノール、メチレンクロライド及び酢酸
エチルに非常によく溶け、水に冥質的に不溶である。Ｂ
Ｕ−４０６１１は、ヨウ素蒸気、モリブデン酸アンモニ
ウム硫酸溶液及びＲｙｄｏｎ−δｎ１ｔｈ試薬に陽性を
示し、ニンヒドリン及びアンスロン試薬に陰性である。

ＢＵ−４０６１１の物理化学的性状は表ＩＫまとめて示
しである。本抗生物質は特徴的なＵＶ吸収な示さなかっ
た。そのＩＫスペクトル（ＫＢデ錠剤、図１）は、強い
１６４０及び１５４０硼−１での吸収を示しており、そ
れは、ＢＵ−４０６１Ｔがペプチド系抗生物質に属する
ことを示唆している。ＢＵ−４０６１Ｔ　ｆ）’Ｈ−Ｎ
ＭＲｘヘクｌ−Ａ／及び１３Ｇ”−ＮＭＲ：ｘ、ベクト
ルはそれぞれ図２及び図３に示されている。ＢＵ−４０
６１Ｔ　（１）”Ｃ−ｆｉ！ＭＲスペクトルは、次のも
のを含む２８個の炭素原子の存在を示している：１３− １Ｏ個のメチル（δ：１０．５．１１１．１５．５．１
５．６．１６．８．１７．８．２１．１．２２１．２３
３．３２１）、４個のメチレン（２４，６，２４，７，
３９，５，５２４）、８個のメチン（２５，１，３１，
９，３６，２，５０，６，５６４，５＆０．６１．５．
６６５）、１個の第四級体（５９，２）及び５個のカル
ボニル炭素（１７０，６，１７０，８，１７１７，１７
２，１，２０ＪＩＬ３）。

ＢＵ−４９６１Ｔの分子式は、ＩＨ−ＮＭＲ，１３Ｃ−
ＮＭＲ。

マイクロアナリシス及びＳＩＭＳ（嘱／ｇ　　５７７（
Ａｆ＋Ｎａ）　　、　５５５　（ｈｔ十ｇ　）”）によ
りＣ２１１Ｈ５ＯＮ４０７とされた。

＋ 構造の研究 封管中で１７時間ＢＵ−４０６１Ｔを６　Ｎ　ＭＣＩで
もって１０５℃で加水分解した。その加水分解物を水で
希釈し、エーテルで抽出した。分離せられた水性相を減
圧下ｌ！！１ｔ、、凍結乾燥し、１５８Ｉ９の無色油状
残留物を得、これはＴＬＣ１４− によって三つのニンヒドリン陽性物質を會んでいた。そ
れらのうちの二つは、七のＴＬＣ及びアミノ酸分析の挙
動よりスレオニン及びイソロイシ／と同定された。この
残留物をＤｏｗａｚ　５ＱＷｘ　４（Ｈタイプ、１００
−２００メツシユ、φ１．５Ｘ２０ｃｍ）のカラムにか
け、・七のカラムを順次０．０３Ｎ、０．０６＃、０．
ＩＮ、０．３Ｎ、０．６Ｎ、ＩＮ及び３Ｎの塩酸で溶出
した。０．０６ＮＨＣｌｌで溶出され集められたニンヒ
ドリン陽性の分画を磯縮し、さらにＳεｐｈａｄａｚ１
／−２０（φ２．２Ｘ１００ｃｍ）のカラムのクロマト
グラフィーにかけ、１２〜のスレオニン塩酸塩の無色シ
ロップを得た。０．３　Ｎ　ＨＣ’／３での溶出液を減
圧上濃縮し、インロイシ／及び未同定の−／ヒドリン陽
性物質の混合物な得た。

ＩＪｏｗｇｚ　５０Ｆ　Ｘ　４　（ピリジンタイプ、１
００−２００メツシユ、φ２．ＯＸ　７５（：Ｉｎ）Ｑ
カラムクロマトグラフィー法によりそれらを分離した。

未知のアミノ酸が０．１　Ｎビリジン−ギ酸緩衝液（ｐ
Ｈ３，ｉ）で溶出された。溶出液を減圧上濃縮し、Ｓａ
ｐ肩ｄａｚ　Ｌｌｌ　−２０のクロマトグラフィー法に
まり脱塩した。適切な分画を溶媒蒸発処理し、１２５■
の白色粉末を得た。この物質は表２に示されるようその
５ＩＮＳスペクトル（想／ｇ　：　１６８（Ａｆ十Ａ’
α）、１４６（Ｍ十Ｈ））及びＩＨ−ＮＭＲスペクトル
及び”Ｃ−ＮＭＲスペクトルによりＮ−メチルイソロイ
シンであると決定された。０．２Ｎピリジンーギ酸緩衝
液（ｐＨ３，１）で溶出されたインロイシ／含有分画を
減圧下に溶媒蒸発し、残留物をエタノール水浴液から再
結晶し、５．０〜の無色針状晶を得た。スレオニ／及び
インロイシンのキーラリティは、キーラルＨＰＬＣ（Ｔ
ＳＫゲル　ＥｎＡＮＴＩＯＬｘ、移動相：ｌＳＭＣ，Ｌ
ＳＯ４、検出：２５４％愼、温度：５０℃）を用いて決
定された。この結果はそれら両方はＬ配置であることを
明確に示している。ＢＵ−４０６ＬＴのＩ　Ｈ−ＮＭＲ
及び１３Ｃ−＃ｔＭＲ及びＩＩＩ−−’ＨＣ０５Ｙスペ
クトル（表３）の分析は、Ｌ−トレオニ７、Ｌ−インロ
イシ／及びＮ−メチルイソロイノンに加えて次なる部分
構造が存在していることを示している： 鳥 ＼ −０ ／ これらの７ラグメントの配列は、ＢＵ−＋ｏ６１Ｔの”
Ｃ−’　Ｈｏ　７りＶ７シＣ’Ｏ５Ｙ　及ヒＥ　Ｉ　−
Ｍ　Ｓ　スヘクトｌｖを分析しＣ明らかにされ、下記に
示す構造が、本抗生物質のものとして決められた。

性状 Ｍ、Ｐ。

：白色粉末 ：　　１０７−１０９℃ Ｍ、０Ｈ Ｕｌｌｌ、、ａ、ｓｔａ　　　　、末端吸収ＩＲｖＫＢ
’ｃｍ−’　　　：３３００，２９５０．１７２０，１
６４０，１５４０常ａｚ ＳＩＭＳ実測＠　ｍ７ｇ　：　　５７７（＃＋Ａ’ｃＬ
）＋、５５５（Ａｆ＋Ｂ）”マイクロアナリシス　： 計算値Ｃｔａ７ｉ！５゜Ｎ、０．　　：　Ｃ６０，６２
Ｈ９，０９Ｎ　１０．１０実測値 ：　Ｃ６０，４５Ｈ９，１５Ｎ　１０．１８１８− ７一 表　２ １１１−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル二Ｎ−表 ＩＨ−ＮＭＲスペクトル：ＢＵ−４０６１Ｔ３．４８．
１Ｈ（ｄ、４．０） １．９３．ｌ＃（常） Ｎ−礪 ０．９４　、３Ｈ（ｔ　、　７．３　）０．９７．３＃
（ｄ、６．９） ２．７０．３Ｈ（ｓ） ■ １７３．５．Ｊｌ ６９．３　、　ｄ ３６．６　、　ｄ １１．９　＋　ｑ １５、ｌ、ｑ ３３．４．ｑ ７．３６ ２９ ６．９３ ４．６８ ４．５２ ４６ ４．２６ ４．２４ ２．９８ ２．１１ ０８ １．９６ １．６４ １．３６−１．５５ １．５１ １．１４−１．３６ １．１０ 多重度 ｄ　（７，７） ｄ（８，１） ｄ　（７，７） ｄ　（１１，４） ｄｄ ｄｄ（２９，７，７） ｄｄ ｄｑ（２，９，６５） Ｎ−リｔ ＣＯ−Ｃ，も− ＣＨ Ｄ Ｄ ＣＨ 〉Ｃ−リ（ ＣＨ。

ＣＨ。

９− ２０− 多重度 ０．９４−１．０２　　　　２８　　　濯　　　　　　
　ＣＨ。

０．９２　　　　　　　３Ｈｄ（３７）　　　　Ｃ１ｌ
。

０．９０　　　　　　　３Ｈｄ（３７）　　　　ＣＨ。

０．８２−０．８４　　１２Ｈ惰　　　　　　Ｃ’Ｈ，
Ｘ４生物活性 マウス及びヒトのセルラインに対するｉｎ　ｖｉｔｒｏ
細胞毒活性及びマウスに対するｉｎ　ｖｉｖｏの活性に
ついてＢＵ−４０６１１の試験を行なった。

Ｂ１６−７”１０（マウスメラノーマ）細胞及びＭｏ５
ｅデ（ヒト結直腸癌）細胞は、胎児牛血清（／（？、Ｓ
、ＩＱ％）及びカナマイシン（６０μ９７Ｉｌｌ）を補
なわれた富化Ｅａｇ１ｇ最小必須培地において対数期ま
で生育させ、−万ＨＣＴ−１１６（ヒト結腸癌）は、Ｆ
Ｃ，５（１０％）、ペニシリン（ｌｏｏμ／ａｕ）及び
ス）Ｌ／ブトマイシン（ｌｏｏ、ｕＰ／ｍＡ）２１− を補なわれたＭ（：　Ｃｏ１５５Ａ培地中で生Ｗさせた
。Ｂ１６−Ｆｌｏ、ＭＢ２．、及びＨＣＴ−１１６の各
細胞ヲ収穫Ｌ、それぞれ３Ｘ１０’、６Ｘ１０’及び６
Ｘ１０’細胞／αの接種量で試験化合物な入れた９６−
ウェルのマイクロタイターの各ウェル中に植え込んだ。

それらを、５％ＣＯ７及び９５％の空気の湿度付与した
雰囲気中で７２時間３７℃でインキュベーションした。

腫瘍細胞に対する細胞毒性活性は、生細胞を染色した後
５４０　ｎｍでの比色測定によって測定した。ＢＵ−４
０６１Ｔは、それぞれＢ　ｌ　６−ＦＩＱ細胞及びＨＣ
”Ｔ−１１６細胞に対して非常に良好な細胞毒性活性を
示し、ＩＣ，。値０．００４７及び０．００６７μり／
ａである◇一方Ｍｏｓｇｒ細胞に対する細胞毒活性は、
Ｂ１６−Ｆｌｏ及びＨＣＴ−１１６の細胞に対するそれ
よりも弱いものであった（表４）。

巨大分子（ＤＮＡ％ＲＮＡ及びタンパク質）合成におけ
２２− るＢＵ−４０６１Ｔの阻害作用は、培養Ｂ１６−Ｆ１０
メラノーマ細胞中で測定された。Ｂ１６−ＦＩＯ細胞（
］０５細胞／ｄ）は、該化合物と共に３７℃で４，５時
間ＤＮＡ合成）または４時間（ＲＮＡ及びタンパク質合
成）インキュベーショ／した。標識前駆体３Ｈ−チミジ
ン、１４Ｃ−ウリジン、または３Ｈ−ロイシンを培養物
中に加え、さらに３０分間（ＤＮＡ合成）または６０分
間（ＲＮＡ及びタンパク質合成）インキュベーションす
る。冷却した５％トリクロロ酢酸溶液で洗った後、腫瘍
細胞の酸不溶性の分画中への放射活性の取り込みを液体
シンチレーションカウンターによって測定した。表５に
示されているように、１）ＮＡ合成及びＲＮＡ合成に対
してかなりの阻害作用を有しているが、１０μｙ７ｒｎ
ｔの濃度（最高の試験濃度）においてもタンパク質の分
画へのロイシンの取り込みを有意には阻害しなかった。

ＢＵ−４ｏｂｌＴのｉｎ　ｇｉｖｏでの抗腫瘍活性を測
定するため、雄のＢ　ＤＦ、　　マウスにＱ、５ｒＬｌ
のｌＯ％黒色メラノーマＢ１６ブライ（ｂｒａｉ　）を
腹膜内接種し、雌ＣＤＦ、マウスに０．４紅の希釈した
１０６個のリンパ球性白血病細胞１３８８を含有する腹
水を腹膜内接種した。表６及び７に示すように、両実験
においてマイトマイシンＣｆ対照化合物として比較して
用いた。試験化合物は、マウスに第１日目、第５日目及
び第９日目（Ｑ４Ｄｘ３）または第１日目から第９日目
まで（ＱＩＤｘ９）腹膜内投与された。ＢＵ−４０６１
１は、Ｑ４Ｄｘ３及びＱＩＤ×９のスケジュールのいず
れの処理でもＬ１６メラノーマに対して顕著に優れた抗
腫瘍活性な示した。ＱＩＤ×９の処理スケジュールで試
験した場合、その化合物は最小有効投与量及び最大のＴ
ＺＣ値で見た場合に１３８８システムにおけるよりＢ１
６システムでより大きな治療活性を示した。

表４ マウス及びヒトの腫瘍細胞に対するｉｎ　ｖｉｔｒ。

ＩＣ５ｏ　（μｆ／ｄ） ＢＵ−４０６１Ｔ ０．００４７ ０．００６７ ０．１７ 表　５ Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞における巨大ＩＣ！ｔｏ
（μ！／ｍｌ＞ −２５＝ 治療学的用途 上記したようにＢＵ−４０６１Ｔは哺乳動物の悪性腫瘍
に対して顕著な抗腫瘍活性を有し′Ｃいる。

本発明の一つの目的は、ＢＵ−４０６１Ｔに感受性を有
する悪性腫瘍の影響を受けている哺乳動物宿主にＢＵ−
４０６１Ｔまたはその医薬組成物を投与して治療するに
ある。

本発明の別の目的は、活性成分としてＢＵ−４ｏ６１Ｔ
を含有し、更には不活性な医薬として１・容しうる担体
または希釈とからなる医薬組成物、特には腫瘍阻止用の
医薬組成物に関する。このような組成物はその他の抗腫
瘍剤な含有していてもよ（、所望の投与形態に適したあ
らゆる形態にされていてもよい。そのような組成物の例
としては、経口投与用の固体の組成物、例えば錠剤、カ
プセル剤、丸剤、粉末剤及び顆粒剤、あるいは経口投与
用の液体の組成物、例えば溶液剤、懸濁剤、シロップ剤
またはエリキシル剤、さらには非経口投与のための調製
物、例えは無菌溶液、懸濁剤、または乳濁化剤があげら
れる。それらはまた、使用直前に無菌水、生理的食塩水
またはその他の注射することのできる媒体中に溶解され
ることのできる無菌の固体組成物の形態のものであって
よい。

ある哺乳動物宿主のための最適なりＵ−４０６１Ｔの投
与量等は、当業者にとしては容易に確認できるようなも
のである。実際のＢＵ−４０６１Ｔの使用投与量は、特
定の製剤化された組成物５投与の方法、処理さるべき部
位、宿主及び病状にしたがって変えられることは勿論賞
揚されよう。年令、性別、体重、食事、投与時間、投与
径路、排泄の速度等、患者の病状、薬物の組合せ、反応
性の感度及び病状の深ごく度といった点を考慮して該薬
物の作用を修飾する多（の因子が決められる。

次なる具体的な記載は、単に本発明を説明するためのも
のであって１本発明の範囲を限定する意図はない。

Ａ、　７ラスコ醗酵 良好に生育した寒天斜面培地の放線菌Ｑ９９６−１７株
を、可溶性でんぷん（Ｎｉｃｈｉｄｇｎ　Ｋａｇαｋｇ
　）　２％、大豆ミール（Ｎｉｋｋｏ　５ｇ１ｙｓ）１
％及びＣａＣＯ３０，５％から成る種菌用培地（殺菌前
のｐＨ７）１００ＩＭを含有する５００ａのエルシンマ
イヤーフラスコ中に接種した。接種されたフスラコを回
転式振とう機（２００ｒｐｔｒｃ）上で４日間３２℃で
インキュベーションした。５ａの培養物な、種菌用培地
と同じ組成を有する生産用培地１００−を含有する５０
ＯＮのエルレノマイヤーフラスコに移した。醗酵を回転
式振とう機上で６日間〜７日間２８℃で行なった。

＝３０− 醗酵ブロス中での抗生物質の生産を８１６メラノーマ細
胞に対する（ｎマｉ　ｔｒｏ細胞毒性活性によってモニ
ターした。６日間の培養でその生産は最大値に遅し、そ
の細胞毒性活性は、ＭＢＣ（最小有効濃度）で×２５６
倍希釈に達した。

Ｂ、タンク醗酵 大量醗酵を、単一コロニー単離法を用いてＱ９９６−１
７株から誘導せしめられたＱ９９６−１７−Ａｌ単離体
な用いタンク７アーメンテーター中で行なった。タンク
醗酵用の種菌用培養物として、回転式振どう機（２００
ｒｐｍ）上で３日間３２℃で２５個のエルレンマイヤー
フラスコ（５００ａ６）を培養した。２１の種菌用培養
物な、前記生産培地の１２０１を含有する２００ノのタ
ンクファーメンテ−ターに移した。醗酵を１２０１　／
５ｉｔｆ）通気及び２５０ｒｐｓの撹拌下２８℃で行な
った。醗酵プロス中の細胞毒３１− 性活性は、１３８時間の醗酵後Ｘ１０２４倍希釈の、ｉ
ｉ　Ｅ　Ｃに達した。

実施例１の方法に従って得られた醗酵培地全部（４５１
、ｐＨ８，３）な激しく撹拌しなからｎ−ブタノール（
１６１）で抽出した。その有機相を連続遠心及び減圧濃
縮を用いて分離した。次に濃縮物（１１）をそれぞれ０
，７１の酢酸エチルで２回抽出した。−緒にされた抽出
液を減圧下に濃縮し、油状残留物とし、それを撹拌下２
１のｎ−へキサン中に滴下して加えた。沈降した沈殿物
を沖過して集め、乾燥して、ＢＵ−＋ｏ６１．ｒの粗製
固体（２９，９））を得た。

水中に懸濁された固体（１００ｄ）をダイアイオン（１
）ｉａｉｏｎ）　ＨＰ　−２０（ｔ’ｄｉｔｓｘｂｉｓ
ｈｉ　Ｃｈｕｒｎ。

１ｎｄｓｃｓｔｒｉａｓｌＴｏｋｙｏ、　　φ４．０Ｘ
７０ｃＩｎ）にかけた。水（３１）、３０％メタノール
水溶液（３））、５０５Ａメタノール水溶液（３））及
び８０％メタノール水溶液で、順次溶出した。ＢＵ−４
０６１７を含有する分画な、Ｂ１６メラノーマ細胞に対
する細胞毒活性によって検出を行なった。８０％メタノ
ール水溶液で溶出された活性を有する分画を減圧上濃縮
しく４．４８Ｆ）、残留物なシリカゲルカラム（φ４．
ｏｘ５０ｃｒｎ）上のクロマトグラフィーにかけ、メチ
レンクロライド／メタノール（９８：２嘗／督）で溶出
した。活性な分画な集め、減圧下に＠縮して、淡黄色固
体４４２〜を得た。この固体を少量の酢酸エチルに溶解
して、シリカゲルカラム（φ２．２　Ｘ　５０ｃｍ　）
にかけ、そのカラムを酢酸エチルで展開して、はぼ純粋
な固体な得た。このものをざらに逆相シリカゲル（φ２
．２　ｘ、　３０ｃｍ　）のクロマトグラフィーにθ）
けた。５５−６０％のメタノール水浴液で溶出して、は
ぼ均一な固体のＢＵ−４０６１Ｔ（ｘ２４■）な得た。

最終的な精製はメタノール溶出によるＳｅ麟ａｄａｚＬ
Ｈ−２０カラムクロマトグラフイーによって行なった。

目的分画を＠縮して均一な白色粉末のＢＵ−４０６１Ｔ
（ｘｏｏｒＩｋｇ）を得た。

【図面の簡単な説明】

図１は、ＢＵ　−４０６１Ｔ　（ＫＢｒ錠剤）の赤外吸
収スペクトルな示すものである。 図２は、ＢＵ−４０６ＬＴのＩＨ−ＮＭＲスペクトルを
示すものである。 図３は、　ＢＵ　−４０６１Ｔ１７）ｌＩＣ−ＮＭＲス
ペクトルな示すものである。 ３４− 手 続 補 正 書 平成２年８月３０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式を有し、ＢＵ−４０６１Ｔと命名された化合物
   。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、放線菌属に属するＢＵ−４０６１Ｔ生産菌を培養し
   、培養物からＢＵ−４０６１Ｔを採取することを特徴と
   する次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するＢＵ−４０６１Ｔの製造方法。 ３、放線菌Ｑ９９６−１７（ＡＴＣＣ−５３９０４）株
   またはそのＢＵ−４０６１Ｔ産生変異株または変種株を
   、深部好気条件下、炭素及び窒素の資化源を含有する水
   性栄養培地中で実質的な量のＢＵ−４０６１Ｔが該培地
   中に該微生物によつて産生されるまで培養し、次に培養
   液から該ＢＵ−４０６１Ｔを採取するものである請求項
   ２に記載の方法。 ４、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ５、有効成分のＢＵ−４０６１Ｔと不活性で医薬として
   許容される担体または希釈剤を含んでいる請求項４に記
   載の組成物。 ６、炭素及び窒素の資化源を含有する水性栄養培地で培
   養すると、回収可能な量の抗生物質ＢＵ−４０６１Ｔを
   産生することのできる放線菌属に属するＡＴＣＣ−５３
   ９０４菌。