JPH02502514A

JPH02502514A - エイ・シンプレックスでのステロイド２１‐エステル類の１，２‐脱水素化

Info

Publication number: JPH02502514A
Application number: JP63501937A
Authority: JP
Inventors: コミネック，レオ・エイ; ウルフ，ホリー・ジョー; スタイエルト，ポーラ・エス
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1987-03-12
Filing date: 1988-02-19
Publication date: 1990-08-16
Anticipated expiration: 2012-11-19
Also published as: DK630988D0; DE3883973D1; KR890700679A; EP0350488A1; US5225335A; EP0350488B1; KR960013094B1; HK153896A; BG50389A3; WO1988007092A1; ATE94212T1; HUT50881A; AU1340888A; HU204305B; JP2680870B2; DK630988A; DK175173B1; DE3883973T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エイ・シンプレックスでのステロイド２１−エステル類の１．２−脱水素化発明の胃景１、発明の分野本発明はアルトロバクター・シンプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｉｍ−ｐｌｅχ）またはバクテリウム・シクロオキシダンス（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｙｃｌｏ−ｏｘｙｄａｎｓ）である種のΔ４−３−ケトＣＨ−ヘミエステルステロイド類を１．２−脱水素化して、改良されｔ；収率およびより短い生物転換時間でもって、対応するΔ１・６−３−ケトＣ３１ヘミエステルまたは遊離アルコールを生成する方法に関する。

２、関連技術の記載セプトミキサ・アフイニス（Ｓｅｐｔｏｍｙｘａ　ａｆｆｉｎｉｓ）、エイ・シンプレックス（Ａ、　５ｒｒｎｐｌｅｘ）８よび他の微生物でのΔ４−３−ケトステロイド類の対応するΔ１・６−３−ケトステロイ・ド類への１．２−脱水素化は当該分野でよく知られており、価値ある商業的重要性を有す米国特許第２８３７４６４号はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ）（アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ））シンプレックス（ｓｉｍ−ｐｌｅｘ）またはコリネバクテリウム・ホアギイイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｏａｇｉｉ）を用いることによってΔ６−３−ケトプレグネン類をＣ２１ヒドロキシル基が遊離されたまたはモノカルボン酸でエステル化されたΔ１・◆− プレグナジェン類へ１，２−脱水素化する方法を特許請求している。

米国特許第２９０２４１０号および第２９０２４１１号はセブトミキサ・アフィニスで１．２−飽和ステロイド類を１．２−デヒドロステロイド類へ１．２−脱水素化する方法を特許請求している。

米国特許第３３６０４３９号は、前もって低級アルカノールまたはアルカノンで処理したエイ・シンプレ７クス細胞を用い、Δ峨−３−ケトステロイド類を対応するΔ１・４−３−ケトステロイド類へ１．２−脱水素化する方法を開示している。本発明の方法は細胞の素化は当該分野でよく知られており、価値ある商業的重要性を有する。

米国特許第２８３７４６４号はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍＸアルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ））シンプレックス（ｓｉｍ−ｐｌｅｘ）またはコリネバクテリウム・ホアギイイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｏａｇｉｉ）を用いることによってΔ４−３−ケトプレグネン類をＣ２１ヒドロキシル基が遊離されたまたはモノカルボン酸でニスチル化されたΔ１−−プレグナシエン類へ１．２−脱水素化する方法を特許請求している。

米国特許第２９０２４１０号および第２９０２４１１号はセプトミキサ・アフィニスで１．２−飽和ステロイド類を１．２−デヒドロステロイド類へ１．２−脱水素化する方法を特許請求している。

米国特許第３３６０４３９号は、前もって低級アルカノールまｔ；はアルカノンで処理したエイ・シンプレ７クス細胞を用い、Δ４−３−ケトステロイド類を対応するΔ１・６−３−ケトステロイド類へ１．２−脱水素化する方法を開示している。本発明の方法は細胞の前処理を必要とせず、発酵ブロス中で生きた細胞を用いて行うことができる。別法として、風乾まＩ；は加熱乾燥によっであるいはアセトンのごとき低級アルカノンへ暴露する二とによってＵ処理した細胞を用いることもできる。これらの生物のステロイド−１−デヒドロゲナーゼを細胞−遊離形態で用いることもできる。

米国特許第３７７０５８６号は、アシル基が炭素原子３〜１２個のジカルボン酸のものであるそのΔ６−３−ケト２１−ヘミエステル基質のアルカリ金属塩をニス・アフイニスを用いることによって１．２−脱水素化する１２β、２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４，１７（２０）−１−リュンー３−オン（実施例１）８よび１１β、２１−ジヒドロキシ−６０−メチルプレグナ−１，４゜１７（２０）−トリエン−３−オン（実施例５）の改良された製法を＃ｆ許請求している。振盪フラスコ、濃度５．０ｇ／Ｑの１１β。

２１−ジヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３−オン２１−へミスクシネートカリウム塩および培地１を用い、所望のΔ１・６−生成物が５日後（ニー　１００％収率で製造されている（実施例８）。実施例１はより大きい攪拌タンクを用い、より低い収率を示している。培地２、および２．０−７．０ｇ／Ｑの１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３− オン２１−ヘミスクシネートカリウム塩により、９１．１−９６．６％の収率が６日後ｌ；得られている。

米国特許第４５２４１３４号および茅４７０４３５８号は、各々、アルトロバクター・シンプレックスおよびバタテリウム・シクロオキシダンスの風乾したまたは加熱乾燥した細胞を用いて対応する１、２−飽和Δ４−３−ケトステロイドから１．２−脱水素化ステロイドを製造する微生物的方法を開示している。

本発明の方法は改良された収率を提供するものであり、同時に基質濃度の増大および反応時間の減少を可能とする。

発明の要約 Δ１−３−ケト２１−ヘミエステルステロイド（１）：［ここに、（Ｄ　−１）　Ｒ＋ａｌ；ｉ　Ｒ１１−１：　Ｒｒｂ−：であってＲ１７はＲ１７−１：　Ｒ＋ｙ−ｘ、ここにＲ，、−、およびＲ１６−１のうち一方は−Ｈであって他方はＲ，、−。

まＩ：はＲ１７−１のうち一方と一緒になってＣ，，８よびＣ３７間に第２の結合を形反し、およびＲｊ７−１ｓよびＲ１７−２のうち他方は−ｃｏ−ＣＨｘ　　ＯＣｏ　　（Ｘ＋）−ＣＯＯＲｘｌ−ｓｌ、：：ｌ：）（、およびＲ３−１は後記で定義するに岡じ；（Ｄ−１１）Ｒ，＃はａ−Ｈ：β−Ｈ５Ｈよび：：ｌ：Ｒ＋ｙは−ＣＨ−ＣＨｚ −０−ＣＯ（Ｘ＋）−ＣＯＯＲ２１−＋、ココにＸ、およびＲ、−。

は後記で定義するに同じ：（Ｄ　　ｎ［）ＲＩＧは−ＣＨ，または６　　Ｒ＋ｓ−ｓ　：β−Ｒ１６−６％　ここにＲ１６−５は−Ｈ，−ＯＨまたは一〇Ｈ，、Ｒ１６−１は−Ｈまｌ；は −ＣＨ，、を二だしＲ１，４まにはＲＩＧ−１のうち一方は−Ｈ１およびここｔ：　Ｒｌ　７はａ　　Ｒｒｔ−ｓ：β−ＣＯ−ＣＨｚ−０−ＣＯ−（Ｘ＋）　　ＣＯＯＲ２１−＋、ここにＲ１７−８は−Ｈまたは一○Ｈ１およびここにＸ、およびＲ２＋−１は後記で定義するに同じ、およびここにＲ，、Ｒ，８よびＲ１１は後記するに同じ〕をアルトロバクター・シンプレックスまＩ；はバクテリウム・シクロオキシダンスのステロイド−１−デヒドロゲナーゼと接触させることを特徴とするΔｌ−− ３−ケト２１−へミニステルステロイド（Ｂ−１）Ｒ，ｌ；！−ＣＨ！ｔたはＲ６−、が−Ｈ，−Ｒ８よび−ＣＨ。

であるａ　−Ｒ６−１：β−Ｈ５Ｒ７はａ−Ｈ：β−Ｈ；（ｓ−ｎ）ＲｓはＲ＠ −３：Ｒ６−４であってＲ２はＲ、−、：　Ｒ、−、、ここにＲ，−３およびＲ，−４のうち一方はＲ２−１およびＲ７−４のうちの一方と一緒になってＣ１および０７間に第２の結合を形成し、Ｒｘ−ｓｈよびＲ６−０のうち他方は−ＣＨ，であってＲｙ−３８よびＲ７−４のうち他方は−Ｈ。

（ＣＩ）Ｒ＋＋はｌｌ　　Ｒｓ＋−Ｉ：β−Ｒ１＋−４、ここにＲ、、−、およびＲ３１，のうち一方はＲ９と一緒になってＣ１およびＣ８，の間に第２の結合を形成し、およびＲｌ、−＋８よびＲ１１−ｆｆのうち他方は−Ｈ；（Ｃ−Ｉ［）Ｒｓは−Ｈ，−Ｆ、−ＣＩまＩ；は−ＢｒであってＲ１１は一〇または＃−Ｒ＋＋−ｓ：β−Ｒ１１−４％　ここにＲＩ＋−！およびＲｌｌ−４のうち一方は −ＨであってＲ３□−３およびＲＩ＋−４のうち他方は−Ｈまｔ二は−　ｏ　Ｈ；（Ｃ−Ｉ［＋）Ｒ１１はａ−Ｈ：β−０−、ココニβ−０−はＲｊと一緒Ｉ：なってＣ９およびＣ１１間にβ立体配置であるニボキシドを形成し；（Ｄ　−１）　Ｒ１１はＲ＋ａ−＋　：　ＲＩｂ−２であってＲエフはＲＩｔ− ｒ　：　Ｒ１７−：％Ｒ，，−，およびＲ１６−”のうち一方は−Ｈであって他方はＲｊ７−１まｔ；はＲ１７−：のうち一方と一緒になってＣ，、およびＣ１０の間に第２の結合を形成し、およびＲ１７−１およびＲ，、−：のうち他方は −Ｃｏ−ＣＨ。

０−　Ｒ２１１ココ”　Ｒ２＋バー　Ｈ，−ＣＯ−（Ｘ　＋）　−ＣＯＯＲＫ＋ −１、ここにＸ、は−ＣＨ−ＣＨ−およびｎ、が１〜８である”−（ＣＨ２）ｎ＋−１およびここＬ；Ｒｘ、−ｒは−Ｈまミニはカチオン；（Ｄ−Ｉ［）Ｒ，、はａ−Ｈ：β−Ｈ１およびここにＲｊ７はＲ２，が前記で定義した！＝同じである一ＣＨＣＨｘ　−ＯＲｘ　ｒ　；（Ｄ−Ｉ［１）　Ｒ，、は−ＣＨ，またはｃ！　−Ｒｒｓ−ｓ　：β−Ｈ＋６−４、ここにＲ１＠−％は−Ｈ，−ＯＨまたは −ＣＨ，、Ｒ４−１は−Ｈまたは−ＣＨ，、ただしＲＩＭ−！まミニはＲ１６− ６のうち一方は−Ｈ１およびここにＲ１７はａ　　Ｒｒｔ−ｓ：β−Ｃｏ−ＣＨ，−０−Ｒ，、、ここにＲ５ｔ−ｓは−Ｈまたは一〇Ｈ，ここにＲ２＋は前記で定義したに同じ］の製法を開示する。

発明の詳細な記載本発明の方法は、式ＣＩ）のΔ４−３−ケト２１−ヘミエステルステロイドをエイ・シンプレックスまＩ；はビイ・シクロオキシダンスからのステロイド−１− デヒドロゲナーゼ、あるいはステロイド−１−デヒドロゲナーゼを含有するエイ・シンプレックスまｔ；はビイ・シクロオキシダンスの細胞と接触させて対応するΔ工・４−３−ケトステロイド（ｎ）を２１−ヘミエステルおよび／または遊離の２１−ヒドロキシ化合物として生成させることよりなる。

該Δ４−３−ケトステロイド２１−ヘミエステル（Ｉ）出発物質は当業者に公知であるかまたは当業者に公知の方法によって公知の化合物から容易に調製できる。例えば、米国特許第３０２５３１１号および３２０９０００号および３７７０５８６号参照。該Δ４−３−ケｌ−２１−ヘミエステル（１）は単純なよく知られた置換反応によって対応するΔ−１３−ケト２１−ハロまたはΔ４−３−ケト２１−ヒドロキシステロイドいずれがから製造できる。該Δ１−３−ケト２１− ハロ、好ましくは２１−クロロステロイドを所望の二酸の塩と反応させてΔ６− ３−ケトステロイド２１−ヘミエステル（１）を得る。別法として、Δ″−３− ３−ケト２１−ヒドロキシステロイドの二酸の過当な無水物まｌ：は酸ハロゲン化物と反応させてΔ−３−ケトステロイドの２１−ヘミエステル（１）を得る。

Δ６−３−ケト２１−ヘミエステル（Ｉ）に関しては、Ｒ８−１が−Ｈ，−Ｆ、 −ＣＨ，８よび−ＣＨ，であるのが好ましい。Ｃ環はΔ用″であるか、あるいはｌ】ａ−ＯＨ，１１β−ＯＨを有するかまたはＣ１１位に２個の水素原子を有するのが好ましい。Ｄ環に関しては、ＣＩｔ　ｌ：おける置換が−ＣＨ−ＣＨｚ− ０−Ｃｏ　　（Ｘ＋）−ＣＯＯ−Ｒ、、，８よびａ−ＯＨ：β−ＣＯ−ＣＨ！− ０−ＣＯ−（Ｘ　＋）　　ＣＯＯＲ２，−、ｆあるのが好ましい、Ｘ、は−ＣＨ −ＣＨ−ま１；はｎ、が２〜４、より好ましくは２である−（ＣＨ）ｎ＋−であるのが好ましい。Ｒ：Ｉはスクシネートおよび７マレートであるのが好ましい。

カチオンは一価であってナトリウムまたはカリウム、アンモニウムまｌ；は−Ｈｏよりなる群から選択されるのが好ましい。

ヘミエステルの好ましいステクィド部分は、１７ａ、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，９０１）−ジエン−３，２０−ジオン、１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３−オン、１１β、１７ａ、２１−１−リヒドロキシー６ａ−メチルブレグンー４−エン− ３，２０−ジオン、１１β、２１へジヒドロキシ−６σ−メチルプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３−オン、１１β、１７ａ、２１−トリヒドロキシブレダン−４−エン−３゜２０−ジオン、１７ａ、２１−ジヒドロキシ−６０−メチルプレグナ−４，９（１１）−シュン −３，２０−ジオン、１７σ、２１−ジヒドロキシ−１６β−メチルプレグナ− ４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオン、６α−２ルオロ−２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１）。

１６−ドリエンー３．２０−ジオン、２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１）、１６−＋−リニンー３．２０−ジオン、１７σ、２１−ジヒドロキシ−１６α−メチルプレグナ−４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオンよりなる群から選択されるのが好ましい。

最も好ましいのは２１−ヘミスクシネートとしての１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−Ｃ１７（２０）−シュン−３−オンである。

微生物エイ・シンプレックスおよびビイ・シクロオキシダンスはよく知られている。米国特許第２８３７４６４号、第４５２４１３４号および第４７０４３５８Ｊｉ！ｒ参照。本発明の方法はいくつかの形態のうちいずれかであるいずれかの生物からのステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性を用いて行うことができる。

し１ずれかの生物からの酵素を用いることができるが、エイ・シンプレックスを微生物源として用いるのが好ましい。生物転換は絽胞−遊離ステロイドー１−デヒドロゲナーゼまたは微生物の細胞いずれかで行うことができる。ｔＥ−ましくは、発酵ブロス中の微生物細胞全部を本発明の実旌で用いてさらなる製造工程を回避する。ｊｉｔ離した細胞を用いる場合、こｉｔらは遠心、凝集と濾過、沈澱と濾過まグ；は限外ａ過のごとき常法Ｉ；よって栄！ｉ［培地から収集または濃縮した後ｌこ用いることができる。ｊ＃離しグニ細胞ｊ＝湿った状態で用いることができるか、まツニはメンノズ・イン・・ユンザイモロジーαｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）。

巻ＸＬＩＶ、１１〜３１７頁、（１９７６）、アカデミツク・プレス・インコーホレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）、ニコーヨ〜りに記載されているごとくコラーゲン、アルルギン酸塩またはカラジーチン中１；捕獲するような標準的な技術によって固定するか、あるいは米国特許第３３６０４３９号ｌこ記載されているごどくアセトンのような低級アルコールまたはアルカノンでの処理ｌ：よって、米国特詐第４５２４１３４号および第４７０４３５８号に記載されているごとく熱して真空乾燥することによって、凍結乾燥することによって、熱して空気乾燥することによって、または’ＸＨ乾燥することによって、乾燥することができる。細胞−遊離形態のステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性を溶液中で、または固定化酵素として用いてステロイド−１−脱水素化を触媒作用させることもできる。主題たる方法は、Δ′−３−ケト２１−へミニステルステロイドＣＩ）を対応するΔ１・４−３−ケトステロイド（ＩＩ）へステロイド生’ｆｌＤＥ換するｔ；めのエイ・シンプレックスまミニはビイ・シクロオキシダンスからのいずれの形態のステロイド−１−デヒドロゲナーゼ調製物の使用も網羅するものであることが理解されるべきである。

該生物転換はステロイド基質、Δ′−３−ケト２１−へミニステルステロイド（１）を、６ないし１０．好ましくは７ないし８のｐＨ範囲の主として水性系中にステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性を含有する調製物に！露することによって達成される。該水性系には水混和性有機溶媒を約５％以内含有させることができる。適当な水混和性有機溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メ、タノール、エタノール、ア七トン等を包含する。

Ｗｒ望により、水非混和性有機溶媒を約２−約５０％の量で添加Ωすることもできる（ただし、ステロイド−１−デヒドロゲナーゼ活性に対して非雪性であるに限る）。過当な水非混和性有機溶媒はトルエン、ベンゼン、酢酸ブチル、ヘプタン、塩化メチレン等を包含し；好ましいのはトルエンである。有機溶媒はその／それらのステロイド−１−デヒドロゲナーゼ調製物への添加に先立ってΔ４−３ −ケト２１−へミニステルステロイド基質（１）まｊ；は外因性電子キャリアを溶解または懸濁させるのに用いることができる。ステロイド基質の接触は外因性電子キャリアの存在下で起こるのが好ましい。

当業者に公知のごとく外因性電子キャリアをすべてのΔ４−３−ケト２１−ヘミエステル基質（Ｉ）と−緒に存在させる必要はないが、そうする方が好ましい。

該生物転換を、細胞を遊離させてまたは乾燥した細胞で実行するのが特に好ましい。該外因性電子キャリアを添加してステロイド−１−脱水素化を刺激しおよび／またはこれらの活性が以前に誘導されていない調製物中で他のステロイド−分解活性を防ぐことができる。外因性電子キャリアはメナディオン、メナディオン重亜流酸塩、１．４−ナフトキノン、フェナジンメトスルホネート、フェナジンエトスルホネート、ジクロｏ７二ノールインドフニノール、およびチトクロームＣよりなる群から選択されるのが好ましい。外因性電子キャリアはメナディオン、メナディオン重亜流酸塩まＩ；は１．４−ナフトキノンであるのがより好ましい。

外因性電子キャリアは、過酸化水素蓄積が最小化される条件下で、米国特許第４５２４１３４号に記載されているような約０．０１ｇ／Ｃから約３．０ｇ／Ｑの触媒量で用いる。約０．１０ｇないし約１．０ｇ／Ｑを用いるのが好ましい。生物転換法の間、混合物は好ましくは分子状酸素に接触させ、攪拌する。温度は約５および約４５＠の間、好ましくは約２５−約３５″の範囲に維持する。

特異的Δ６−３−ケト２１−へミニステルステロイド基質（Ｄを脱水素化するｔ；めｊ；用いる生物転換法のタイプは、個々のステロイドの構造および性質に応じて変更する。例えば、実施例Ｉに記載する基質は発酵ブロス中の全細胞を用いて完全に生物転換されるが、その転換は等量のエイ・シンプレックスの加熱乾燥細胞を用いると寅質的に劣る。酵素調製物の最適のタイプおよび濃度、最適な基質濃度、基質温調の時間および生物転換の持続は、当業者の専門的技術の範囲内で、通常の予備的実験によって、各個々のステロイド−１−説水素化度応に８いて容易ｌ二決定することができる。はとんどのΔ４−３−ケト２１−へミニステルステロイド基質（Ｉ）は約９５％またはそれ以上ｌ：水性である系ｌ；おいてのみよく生物転換される。Δ４−３−ケト２１−ヘミエステルステロイド（Ｉ）＋７１スべてが前記全ての条件下でよく作用するのではない。あるものは、水性系でのみ、あるものは水混和性もしくは水非混和性有機溶媒でよく作用し：あるものは発酵Ｐ！！胞でよく作用し、他のものは乾燥した細胞でよく作用するなどである。

発酵ブロス中におけるエイ・シンプレックス細胞での公知のステロイド−１−脱水素化方法は、Ｃ２，位に２１−ヒドロキシまたは２１−モノカルボン酸エステル官能基、好ましくは酢酸ニスチルを有するΔ４−３−ケトステロイド基質を用いる。発酵培地中でのこれらの２１−ヒドロキシまたは２１−アンルオキシーΔ ４−３−ケトステロイドの基質濃度は米国特許第２８３７４６４号に記載されているごとく約１．５ないし約５ｇ／リットルとする。Δ４−３−ケトステロイド２１−ヘミエステル（Ｉ）を１−脱水素化する公知の方法は２１−エステル重量に基づいて約２〜１０ｇ／リットル、または２１−ヒドロキシステロイド親に基づいて約１．４〜約７．１ｇ／リットルの基質濃度を用いる。米国特許第３７７０５９６号参照。

エイ・シンブレックスを用いる本発明の方法は、２１−ジカルボン酸エステルΔ ４−３−ケト２１−へミニステルステロイド基質（Ｉ）を用いる発酵ブロスで行う生物転換において、高濃度の基質の有利な使用、およびより短時間での完全な反応を可能とする。

本発明の方法は、より短い反応時間という有利な結果を伴いつつより高い基質濃度の有利な使用を可能とする。本発明の方法は、ニスチル化されていないΔ６− ３−ケトステロイドに基づいて約４〜約３０ｇ／ＱのΔ４−３−ケト２１−へミニステルステロイド（Ｉ）濃度の使用を可能とする。約４ｇ／Ｑ以下も使用できるが、商業的ｌ；は重要でない。約３０ｇ／Ｑを珀えると、残りは反応をより低い基質濃度で行うのが好ましい点まで増加する。Δ６−３−ケトステロイド（Ｉ）濃度は親２１−ヒドロキシステロイドに基づいて約４〜約１２ｇ／Ｑに等しいのが好ましい。

本発明の方法は改良された収率および以前に要したよりも短い時間でΔ１−−３ −ケトステロイド（ＩＩ）を提供する。Δ１・′−３−ケトステロイド（Ｉｔ）を生成する反応は約４〜約７２時間で完了する。

本ステロイド−１−説水素化方法はニス・アフィニスとともにヘミエステルを用いて、通常、平均約１２０時間である。米国特許第３７７０５８６号参照。

Δ４−３−ケト２１−へミニステルステロイド出発物質が対応するΔ工・番−３ −ケトステロイド（ＩＩ）生成物に転換されると、当業者によく知られ！：方法で単離する。

該Δ１・４−３−ケトステロイド（ＩＩ）生成物はステロイド医薬の製造の中間体として有用である。

定義および約束以下の定義および説明は明細書および請求の範囲を共に包含する全出願書類を通じて使用する用語についてのものである。

１０式についての約束および変数の定義明細書および請求の範囲において種々の化合物および分子フラグメントを表わす化学式は、はっきりと定義された構造特徴に加えて変数置換基を含有することができる。これらの変数置換基は文字ま１；は数添字がそれｌ；統く文字、例えば「Ｚｌ」またはｉが整数である「Ｒ５」によって同一性が判断される。これらの変数置換基は一価または二価いずれかである。すなわち、それらは１個ま１；は２個の化学結合によって式に結合している基を表わす。例えば、基ｚｌは、弐ＣＨ＊　−Ｃ（−Ｚ　＋）　Ｈ１ｍ結合しているならば二価の変数を表わす。基Ｒ１およびＲ１は、弐〇　Ｈｚ　　ＣＨ２ −Ｃ（Ｒｌ）　　（Ｒｒ　）　Ｈｘに結合しているならば一価の変数置換基を表す。化学式を前記のごとく直線状に描く場合は、括弧に入れられｔ；変数置換基は括弧に入れられた変数置換基の直ぐ左の原子に結合している。２または３個の連続した変数置換基が括弧に入れられている場合は、該連続した又数置換基の各々は括弧に入れらていない直ぐ前の原子に結合している。かくして、前記の式ｌ二おいては、Ｒ１およびＲ１は共に前の炭素原子に結合している。また、ステロイドのごとき炭素原子ナンバリングの確立された系でのいずれの分子についても、これらの炭素原子は「ｌ」が炭素製子番号Ｉ；対応する整数であるＣ３で示される。

例えば、Ｃ６はステロイド化学分野の当業者によって伝統的に示されているごとくステロイド核における６位または炭素原子番号を表わす。同様に、「Ｒ６」なる語はＣ５位ｔ；おける（−価または二価いずれかの）変数置換基を表わす。

直線状に描いＩ；化学式まｔ；はその部分は直鎖状の原子群を表わす。

記号「＝」は、一般ｌ；、鎖における２つの原子間の結合を表わす。

かくして、ＣＨ，−〇−〇Ｈｘ−ＣＨ（Ｒ１）　　ＣＨ３は２−置換−１−メトキシプロパン化合物を表わす。同様ｌ；、記号「−」は二重結合、例えばＣＨ， −Ｃ（Ｒ，）−０−ＣＨＸを表わし、および記号「ミ」は三重結合、例えばＨＣミＣ−ＣＨ（Ｒ，）−ＣＨｚ−ＣＨｓを表わす。カルボニル基は、−Ｃｏ−または−Ｃ（−０）いずれがで表わすが、前者の方が簡明で好ましい。

環状（，１ｍり化合物まｔ；は分子フラグメントの化学式は直線状で表わすことができる。かくして、化合物４−クロロ−２−メチルビリジンは、星印付きの原子は相互に結合し、その結果環を形成するという約束の下でＮ＊−Ｃ（ＣＨ３） −ＣＨ−ＣＣ］　−ＣＨ−ＣＩＨによって直線状で表わすことができる。同様に、環状分子フラグメント、４−（エチル）−】−ピペラジニルは−Ｎ＊−（ＣＨｘ）ｘ−Ｎ　（Ｃ，Ｈｓ）−ＣＨ，−ＣＩＨ，ｔこよって表わすことができる。

本明細嘗中におけるいずれの化合物ｌこついての環状（環）構造も該環状化合物の各炭素原子に結合しｔ；置換基について環平面に対する配位が定義される。かかる化合物を描く式において、環の平面下にある炭素原子に結合した置換基はアルファ（１）立体配置であるとされ、炭素原子に結合した破線、ダッシュ線または点線、すなわちｒ−−−Ｊまたは「・・・」によって示される。該環平面の上方に結合した対応する置換基はベータ（β）立体配置であるとされる。変数置換基が二価である場合、結合手は、変数の定義により、−緒になっているか別々であるか、あるいはその双方である。例えば、−Ｃ（−Ｒ，）−のごとく炭素原子に結合した変数Ｒ１は二価になることができ、オキソまｊ；はケト（かくして、カルボニル基（−ＣＯ−）を形成する）として、あるいは２つの別々ｌ；結合しｔ；−価の変数置換基（！−Ｒ＋−ｈおよびβ−Ｒ、−にとして定義される。二価の変数Ｒ１が２つの一価変数置換基よりなると定義される場合、二価の変数を定義するのに用いる約束は、形式ｒａ−Ｒ，−１：β−Ｒ１−ｋ」まｔ；はそれをいくらか変形しｊ；ものである。かかる場合、σ−Ｒ，−８およびＲ１−＆はともｌ二次素原子に結合して−ｃＣａ　　ｕ＋−＞）（β−Ｒ，−ｋ）−を生じる。例えば、二価変数Ｒ６、−Ｃ（＝Ｒａ）−が２つの一価変数置換基よりなると定義される場合、２つの一価変数置換基はσ−Ｒａ−１：β−Ｒ％−２＋・・・σ−Ｒｈ−＊：β−Ｒ，−２゜等であり、−ＣＣａ　　Ｒｉ−＋）　　（β− ＲＩ−２）−９−−Ｃ（ｇ−Ｒｉ−ｓ）　　（β−Ｒ６−、。）−等を生じる。

同様に、二価の変数Ｒ１＋、−Ｃ（−Ｒ＋＋）については、２つの一価変数置換基はσ−Ｒ１＋−１：β−Ｒ１１−４である。環については、σおよびβ立体配置を分ける置換基は（例えば、環ｌ；おける炭素二重結合の存在のため）存在せず、環の一部でない炭素原子に結合した置換基については前記約束をなお使用するが、ａおよびβ表示は省略する。

Ｔ度二価変数が２つの別々の一価変数置換基として定義されたようｌ：、２つの別々の一価変数置換基は一緒になって二価変数を形成すると定義できる。例えば、式−Ｃ，（Ｒ，）Ｈ−Ｃ，（Ｒ，）Ｈ−（Ｃ工およびＣ７は、各々、任意に茅 −および第二の炭素原子と定義される）において、Ｒ１８よびＲ，は−緒になって（１）ＣＩおよびＣ３間に第二の結合を形成する、または（２）オキサ（−０ −）のごとき二価の基を形成すると定義され、それにより該式はエポキシドを記載する。Ｒ１およびＲ□が一緒Ｃ；なって基−Ｘ−Ｙ−のごときもっと複雑な原子団を形成する場合、該原子団の配位は前記式中の０１がＸに結合し、Ｃ２がＹに結合するといった具合である。かくして、約束により、「・・・Ｒ１およびＲ５は一緒になって−ＣＨ２−ＣＨ２−〇−ＣＯ−・・・」なる表示は、該カルボニルが０２に結合したラクトンを意味する。しかしながら、「・・・Ｒ１およびＲ１は一緒になって、−ＣＨ，−ＣＨ，−０−Ｃｏ−を形成する・・・」と表示された場合、約束は該カルボニルがＣ１に結合したラクトンを意味する。

変数置換基の炭素含有量は２つの方法のうち１つで示される。第一の方法では、「ｌ」および「４」がともに変数における最大および最小炭素原子数を表わす整数である’Ｃ＋−ＣａＪのごとく変数の名称全体を二対する添字を用いる。該添字はスペースを置いて変数から離す。例えば、ｒｃ、−ｃ、アルキル」は、（特に断りのない限りその異性体を包含する）１ないし４個の炭素原子のアルキルを表わす。この単一の添字が付与されグ；場合は常に、該添字は示されている変数の全炭素原子含有量を示す。かくして、Ｃ，−Ｃ，アルコキシカルボニルはｎが０．１または２である基ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−０−ＣＯ−を記載する。第二の方法によると、ｒＣ，−ＣｌＪ表示を括弧に入れて、定義されている定義部分の直前（スペースを置かず）に置くことによって、定義の各部分のみの炭素原子含有量が別々に示される。この所望による約束によって、（ｃ＋　　Ｃ））アルコキシカルボニルはＣ２−Ｃ，アルコキシカルボニルと同一の意味を有する。

なぜならば、該ｒ（、−Ｃ，Ｊはアルコキシ基の炭素原子含有量のみを官うからである。同様ｌこ、Ｃｘ　−Ｃｓアルコキシアルキルおよび（Ｃ＋　　Ｃ３）アルコキシ（Ｃ＋−Ｃｉ）アルキルは２ないし６個の炭素原子を含有するアルコキシアルキル基を定義するが、２つの定義は異なる。前者の定義は該アルコキシまｊ；はアルキル部分いずれかを単独で４または５個までの炭素原子を含有させることができるのに対し、後者の定義はこれらの基のうちいずれも３個の炭素原子までｌ：限定するからである。

請求の範囲がかなり複雑な（環状）置換基を含む場合、その特定の置換基を命名する／示す節の終わりにおいて、やはりその特定の置換基の化学構造式を記載するチャートの１つにおける同一の名称／表示に対応する括弧に入れた表示を行う。

■、定義すべての温度は摂氏単位である。

ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーである。

ＤＭＦはジメチルホルムアミドをいう。

溶媒対を用いる場合、用いる溶媒の比は用量／用量（Ｖ／Ｖ）である。

エイ・シンプレックスはアルトロバクター・シンプレックス（、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｉｍｐｌｅｘ）をいう。

ビイ・シクロオキシダンスはバクテリウム・シクロオキシダンス（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｄａｎｓ）をいう。Δ１−３−ケト２１−ヘミ、！ステルスロイド基質（１）の濃度はグラム／リットルで表示し、重量（ｇ）は対応する２１−ヒドロキシステロイドの量で表示する。

実施例当業者ならば、さらに技巧を凝らすことなく、これまでの記載を利用して本発明を最大限に突流できると信する。以下の実施例は各種化合物の調製の仕方および／または本発明の各種方法の突流の仕方を記載するものであるが、単に例示的なものであって、これまでの關示を何ら限定するものではない。当業者ならば、反応体ならびに反応の条件および技術双方ｌ；関する手法から変法を直ちに認識するであろう。

実施例１　１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン− ３−オン２１−ヘミスクシネートカリウム塩（１）のエイ・シンプレックス生物変換Ａ、第一の微生物の種発生工程栄養寒天斜面上に維持しｔ；アルトロバクター・シンプレックス（ＵＳ５８２、ＡＴＴＣ６９４６）の培養物からの細胞を滅菌水（５ｍ（２）に懸濁し、接種前に先立って１２０６で３０分間滅菌した栄養ブロス（ディフコ商品の１２　ｇ／リットル）よりなる第一の種培地３００ｍＱを接種するのに用いた。

混合物を回転振盪器（２５Ｏｒｐｍ、行程２インチ）上の２８゜の１リツトル振盪フラスコ中で２日間インキュベートしツ；。

Ｂ、第二の種発生種工程微生物の第二の増殖に用いた増殖培地は以下の栄養物質の水性混合物よりなる。

成分濃度　　　　　配給業者乾燥コーン・ステイープ・　　　２０ｇ／Ｑ　　　　　　　ロケット・７レレスリツカー　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ　Ｆｒｅｒｅｓ）（ンルラス（Ｓｏｌｕｌｕｓ）Ａ　）カー　ド油　（Ｎｏ、　　２）　　　　　　　　　　１　５ｇ／Ｑ　　　　　　ジェオ・７アウ・アンド−サン（Ｇｅｏ、Ｐｆａｕ　　＆　　５ｏｎ）シリコ　ンＭ泡剤　　　　　　　　　　　　　０−１　　ｍＱ　　／ρ　　　　ユニオン・カーバイＦ（Ｓ　Ａ　Ｇ　−４７１）　　　　　　　　　　　　　　（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ）フルチゾンアセテー　ト　　　　　　　　０．１ｇ／Ｑ　　　　　　ジ・アフブジＶン・カンパニー（丁ｈｅ　　Ｕｐｊｏｈｎ　　Ｃｏｍｐａｎｙ）前記したごとく、滅菌に先立って試薬グレードの水酸化ナトリウムで培地のＰＨを７．０に調整する。前記した第一工程からの２つの振盪フラスコ（３００ｍ１２）を用いて２５０リツトルの第二の種培地を接種する。約２８’ ｌ：：おいて、回転速度２８Ｏｒｐｍ、ニアレージ！ン速度１分当たり１００標準リツトル（ｓｌｍ）、逆圧５ｐｓｉでファーメンタ−を運転する。第二の種工程物を２日間インキュベ−卜する。

Ｃ９本発明の方法の発酵（反応）工程！燥コーンーステイープＯリッカー（ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）　（ツルラス（Ｓｏｌｕｌｕｓ）Ａ）　２０　ｇ／Ｑ　、ラード油Ｎｏ、２　２０ｇ／Ｑ、コルチゾンアセテートＯ，１ｇ／１２およびシリコン消泡剤（ＳＡＧ− ４７１、ユニオンカーバイド）０．２ｍＭ／ｆｆを含有する水性培地を、混合物の滅菌に先立って水酸化ナトリウムでｐＨ６，０に調整する。得られた培地を、２５０リツトルの作業容量を有するファーメンタ−中、１２１”にて３０分間滅菌する。タンク中の培地を温度２８°、回転速度２８Ｏｒｐｍ、エアレージ２ン速度２５５１ｍおよび逆圧５ｐｓｉにて攪拌する。ファーメンタ−内容物をアルトロバクター・シンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）の４８時間増殖（前記からの第二種培地）の最終発酵容量の５パーセント容量で接種する。得られた培ｇ！混合物を３６＃間増殖せしめ、その時点でｐＨを７．５に調整し、硫酸または水酸化ナトリウムの自動添加によって維持する。ｐＨ調整の後にメナディオンを終濃度０．１７ｇ／Ｑまで添加した。Δ４−３−ケト２１−ヘミエステルステロイド基質（Ｉ）、１１β、２１−ヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン −３−オン２１−ヘミスクシネートカリウム塩（１）をＤＭＦ中に添加して終濃度１１．３５ｇ／Ｑ　（これは、対応する２１−ヒドロキシム６−３−ケトステロイドの８ｇＩＱに等しい）とする。この混合物を４８時間インキュベートする。

反応の完了はＨＰＬＣアッセイによって決定する。生成物、１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４，１７（２０）−トリエン−３−オン（ＩＩ）および１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４，１７（２０）−トリエン−３− オン２１−ヘミスクシネートＣｎ）の混合物を塩基Ｉ：よって１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４，１７（２０）−トリエン−３−オン（Ｉｔ）まで加水分解する。これに続き、混合物を濾過し、そこでΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）をフィルターケーキ中に保持し、引き続いて水性アセトンで抽出し、当該分野でよく知られた手順によって結晶化する。アセトニトリル／水／酢酸（４０／６０１０．１）の移動相で溶出するシリカベースのＣ−８カラム、２５　ｃ　ｍｓ上のＨＰＬＣによって公知の試料と比較することにより生成物を同定しｔ；。

２１−ヒドロキシ化合物の保持時間は１２．５分であり、２１−ヘミスクシネートの保持時間は２８．５分である。

実施例２−２０実施例１の一般的手順により、かつ以下のＡ欄のΔ４−３−ケト２１−へミニステルステロイド（１）で出発する以外は限定的変形を行うことなく、対応するΔ １・４ステロイド（ＩＩ）を遊離２１−アルコールまたは２１−ヘミエステルあるいはその混合物いずれかとして得る。

５！施例　　　　　　　　　Ａ　欄２　１７σ、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，９（１１）−ジエンー３．２０ −ジオン２１−ヘミスクシネート３　１１β、１７ａ、２１−トリヒドロキシ− ６α−メチルプレダン−４−エン−３，２０−ジオン２１−ヘミスクシネートカリウム塩４　１１β、２１−ジヒドロキシ−６σ−メチルプレグナ−４，１７（２０）− ジエン−３−オン２１−ヘミスクシネートナトリウム塩５　　１１β、１７σ、２１−トリヒドロキシプレダン−４−エン−２，３０− ジオン２１−ヘミスクシネートトリエチルアミン塩６　　１７σ、２１−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−４、９（１１）− ジエン−３，２０−ジオン２１−ヘミスクシネート７　１７σ、２１−ジヒドロキシ−１６β−メチルプレグナ−４，９（１１）− ジエン−３，２０−ジオン２１−ヘミスクシネートナトリウム塩８　　６ａ−フルオロ−２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１）、１６−ドリエンー３，２０−ジオン２１−ヘミスクシネートカリウム塩リュンー３．２０−ジオン２１−へミスクシネート１０１７σ９，２１−ジヒドロキシ−１６ｆｆ−メチルプレグナ−４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオン２１−ヘミスクシネート１１１１β、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３−オン２１−へミツマレート１２　１７ｅ、２１−ジヒドロキシプレグナ−４，９（１１）−ゲニン−３，２０−ジオン２１−へミオキシレート１３１１β、１７σ 、２１−トリヒドロキシ−６σ−メチルブレダン−４−エン−３，２０−ジオン２１−へミマレエートナトリウム塩１４　１１β、２１−ジヒドロキシ−６σ−メチルプレグナ−４，１７（２０） −ジエン−３−オン２１−へミグルタレートナトリウム塩１５１１β、１７σ、２１−）リヒドロキシブレグンー４−エン−３，２０−ジオン２１−へミアジペートトリエチルアミン塩１６　１７σ、２１−ジヒドロキシ−６σ−メチルプレグナ−４、９（１１）− ジエン−３，２０−ジオン２１−へミツマレートナトリウム塩１７　１７ａ、２１−ジヒドロキシ−１６β−メチルプレグナ−４，９（１１） −ジエン−３，２０−ジオン２１−へ（１１）、１６−ドリエンー３，２０−ジオン２１−へミグルタレート１９　２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１）、１６−ドリニンー３．２０ −ジオン２１−へミオキシレート２０１７σ、２１−ジヒドロキシ−１６ｉ−メチルプレグナ−４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオン２１−へミマレート実ＮｆＲ２１６ａ−フルオロ−２１−ヒドロキシプレグナ−４゜９　（１１）、１６　（１７）−）リニンー３．２０−ジオン２１−ヘミスクシネート（１）のエイ・シンプレックス（乾燥細胞）生物転換米国特許第４５２４１３４号の一般的手順に従い、限定的な変形を行うことなく、乾燥したエイ・シンプレックス細胞１．０グラムをリン酸カリウム緩衝液（０，０５Ｍ、ｌ　００ｍｆｆ、ｐＨ７，５）に懸濁する。メナディオン（８，６ｍｇ）をエタノール（１ｍＱ）に溶解し、該細胞懸濁液に添加する。Δ４−３−ケト２１−ヘミエステルステロイド基質（Ｉ）、６ａ−フルオロ−２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１）、１６　（１７）−トリエン−３，２０−ジオン２１−ヘミスクシネート（Ｉ）をＤＭＦに溶解し、振盪フラスコに添加し、（対応する２１−ヒドロキシステロイドに基づいて）最終ステロイド濃度４．０ｇ／Ｑおよび最終ＤＭＦ濃度約５パーセントとする。同様の多くのフラスコを３１″にてロークリ振盪器上で３日間インキュベートする。ＨＰＬＣによる生物変換混合物の分析は、９９パーセントのΔ４−３−ケトステロイド２１−ヘミニスチル基質（Ｉ）が対応するΔ１生成物まで脱水素化され、２１−ヘミスクシネート（Ｉｔ）および２１−ヒドロキシ形（ＩＩ）の混合物として存在することを示す。アセトニトリル／ＴＨＦ／水／酢酸（９／３１／６０１０．３）で溶出するシリカベースのＣ−８カラム上のＨＰＬＣによって公知の試料と比較することによって該生成物を同定し、該２１−ヒドロキシ化合物の保持時間は８．１９分、該２１ −ヘミスクシネートの保持時間は１２．５１分であって該基質の保持時間は１６．２５分である。

寅旅例２２１１β、　　１ｅａ、２１−トリヒドロキシ−６ａ−メチルプレグナ −４−エン−３，２０−ジオン２１−へミスクシ不−トフハク酸塩（１）のビイ・シクロオキシダンス生物転換米国特許第４７０４３５８号の一般的な手順に従い、１１β。

１７σ、２１−トリヒドロキシ−６σ−メチルプレグナ−４−エン−３，２０− ジオン２１−ヘミスクシネート（Ｉ）で出発し、ビイ・シクロオキシダンスを用いる以外は限定的な変形を行うことなく、表記化合物を得る。該生物転換は、クロロホルム／メチルセルソルブ／９５％エチルアルコール（８７，５１５／７．５）溶媒系でのシリカゲル（蛍光）プレート上の酢酸ブチル抽出物および公知の標品の薄層クロマトグラフィーによってモニターする。

チャートＡ国際調査報告ｉ−１１−−１−１−１ｌ−−１−１−１ｎ１１ｊｌｂ、ＰＣＴ／ＩｊＳεＢ１００４０５国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、（Ｄ−Ｉ）Ｒ１６はＲ１６−１：Ｒ１６−２であってＲ１７はＲ１７−１：Ｒ１７−２、ここにＲ１６−１およびＲ１６−２のうち一方は−Ｈであって他方はＲ１７−１またはＲ１７−２のうち一方と−緒になってＣ１６およびＣ１７間に第２の結合を形成し、およびＲ１７−１およびＲ１７−２のうち他方は−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（Ｘ１）−ＣＯＯＲ２１−１、ここにＸ１およびＲ２１−１は後記で定義するに同じ；（Ｄ−ＩＩ）Ｒ１６はα−Ｈ：β−Ｈ、およびここにＲ１７は＝ＣＨ−ＣＨ２− Ｏ−ＣＯ−（Ｘ１）−ＣＯＯＲ２１−１、ここにＸ１およびＲ２１−１は後記で定義するに同じ；（Ｄ−ＩＩＩ）Ｒ１６は−ＣＨ２またはα−Ｒ１６−５：β−Ｒ１６−６、ここにＲ１６−５は−Ｈ、−ＯＨまたは−ＣＨ２、Ｒ１６−６は−Ｈまたは−ＣＨ３ただしＲ１６−５またはＲ１６−６のうち一方は−Ｈ、およびここにＲ１７はα −Ｒ１７−５：β−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（Ｘ１）−ＣＯＯＲ２１−１、ここにＲ１７−５は−Ｈまたは−ＯＨ、およびここにＸ１およびＲ２１−１は後記で定義するに同じ、およびここにＲ６、Ｒ９およびＲ１１は後記するに同じ］のΔ４−３−ケド２１−ヘミエステルステロイドをアルトロバクタ−・シンプレックスまたはバクテリウム・シクロオキシダンスのステロイド−Δ１−デヒドロゲナーゼと接触させることを特徴とする式（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、（Ｂ−Ｉ）Ｒ６は＝ＣＨ２またはＲ６−１が−Ｈ、Ｆ−３よび−ＣＨ３であるα−Ｒ６−１：β−Ｈ、Ｒ７はα−Ｈ：β−Ｈ；（Ｂ−ＩＩ）Ｒ６はＲ６−３：Ｒ６−４であってＲ７はＲ７ −３：Ｒ７−４、ここにＲ６−３およびＲ６−４のうち一方はＲ７−３およびＲ７−４のうちの一方と一緒になってＣ６よびＣ７間に第２の結合を形成し、Ｒ６ −３およびＲ６−４のうち他方は−ＣＨ３であってＲ７−３およびＲ７−４のうちの他方は−Ｈ；（Ｃ−Ｉ）Ｒ１１はα−Ｒ１１−１：β−Ｒ１１−２、ここにＲ１１−１およびＲ１１−２のうち−方はＲ９と一緒になってＣ９およびＣ１１間に第２の結合を形威し、およびＲ１１−１およびＲ１１−２のうち他方は−Ｈ；（Ｃ−ＩＩ）Ｒ９は−Ｈ、−Ｆ、−Ｃ１または−ＢｒであってＲ１１は＝Ｏまたはα−Ｒ１１− １：β−Ｒ１１−４、ここにＲ１１−３よびＲ１１−４のうち−方は−ＨであってＲ１１−３およびＲ１１−４のうち他方は−Ｈまたは−ＯＨ；（Ｃ−ＩＩＩ）Ｒ１１はα−Ｈ：β−Ｏ−、ここにβ−Ｏ−はＲ９と−緒になってＣ９およびＣ１１間にβ立体配置であるエポキシドを形成し；（Ｄ−１）Ｒ１６はＲ１６−１：Ｒ１６−２であってＲ１７はＲ１７−１：Ｒ１７−２、ここにＲ１６−１およびＲ１６−２のうち一方は−Ｈであって他方はＲ１７−１およびＲ１７−２のうち一方と一緒になってＣ１６およびＣ１７間に第２の結合を形成し、およびＲ１７−１およびＲ１７−２のうち他方は−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ２１、ここにＲ２１は−Ｈ、−ＣＯ−（Ｘ１）−ＣＯＯＲ２１−１、ここにＸ１は−ＣＨ＝ＣＨ−およびｎ１が１〜８である−（ＣＨ２）ｎ１−、およびここにＲ２１−１は−Ｈまたはカチオン；（Ｄ−ＩＩ）Ｒ１６はα−Ｈ： β−Ｈ、およびここにＲ１７はＲ２１が前記で定義したに同じである＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ２１；（Ｄ−ＩＩＩ）Ｒ１６は＝ＣＨ２またはα−Ｒ１６−５：β −Ｒ１６−６、ここにＲ１６−５は−Ｈ、−ＯＨまたは−ＣＨ２、Ｒ１６−６は −Ｈまたは−ＣＨ３、ただしＲ１６−５またはＲ１６−６のうち一方は−Ｈ、およびここにＲ１７はα−Ｒ１７−５：β−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ２１、ここにＲ１７−６は−Ｈまたは−ＯＨ、ここにＲ２１は前記で定義したに同じである〕の Δ１，４−３−ケト２１−ヘミエステルステロイドの製法。
２．該方法を外因性電子受容体の有効量の存在下で行う請求の範囲第１項記載の Δ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
３．該外因性電子キャリアがメナディオン、メナディオン重亜硫酸塩、１，４− ナフトキノン、フェナジンメトスルフェート、フェナジンエトスルフェート、ジクロロフェノールインドフェノール、チトクロームｃよりなる群から選択される請求の範囲第２項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
４．該外因性電子受容体がメナディオン、メナディオン重亜硫酸塩および１，４ −ナフトキノンである請求の範囲第３項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
５．尺６−１が−Ｈ、−Ｆ、−ＣＨ２および＝ＣＨ２である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
６．Ｒ１１−３およびＲ１１−４の一方が−Ｈであって他方が−Ｈまたは−ＯＨである請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
７．Ｒ１１が、Ｒ１１−１および１１−２のうち一方がＲ９と一緒になってＣ９およびＣ１１間に第２の結合を形成し、かつＲ１１−１およびＲ１１−２のうち他方が−Ｈであるα−Ｒ１１−１：β−Ｒ１１−２である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
８．Ｒ１７が＝ＣＨ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（Ｘ１）−ＣＯＯ−Ｒ２１−１である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
９．Ｒ１７がα−ＯＨ：β−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（Ｘ１）−ＣＯＯＲ２１ −１である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１０．Ｘ１が−ＣＨ＝ＣＨ−である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１１．Ｘ１が−（ＣＨ２）ｎ１−である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３− ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１２．ｎ１が２〜４である請求の範囲第１１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１３．ｎ１が２である請求の範囲第１１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１４．該カチオンが１価である請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１５．該１価のカチオンがナトリウムまたはカリウム、アンモニウムまたは−Ｈである請求の範囲第１４項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１６．該Δ−３−ケト２１−ヘミエステルステロイド（Ｉ）が以下のΔ４−３− ケトステロイド；１７α，２１−ジヒドロキシプレグナ−４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオン、１１β，２１−ジヒドロキシプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３−オン、１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン、１１β，２１−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−４，１７（２０）−ジエン−３−オン、１１β，１７α，２１−トリヒドロキシプレグン−４−エン−３，２０−ジオン、１７α，２１−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−４，９（１１）−ジエン −３，２０−ジオン、１７α，２１−ジヒドロキシ−１６β−メチルプレグナ− ４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオン、６α−フルオロ−２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１），１６−トリエン−３，２０−ジオン、２１−ヒドロキシプレグナ−４，９（１１），１６−トリエン−３，２０−ジオン、１７α，２１−ジヒドロキシ−１６α−メチルプレグナ−４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオンのＣ２１におけるヘミエステル（−ＣＯ−Ｘ１−ＣＯＯＲ２１−１）よりなる群から選択される請求の範囲第１項記載の製法。
１７．該接触をエイ・シンプレックスまたはビイ・シクロオキシダンスの細胞とで行う請求の範囲第１項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１８．エイ・シンプレックスまたはビイ・シクロオキシダンスととの該接触をエイ・シンプレックスまたはビイ・シクロオキシダンスの乾燥した細胞とで行う請求の範囲第２項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
１９．該乾燥した細胞が風乾または加熱乾燥したものである請求の範囲第１８項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
２０．エイ・シンプレックスまたはビイ・シクロオキシダンスとの該接触を水性栄養培地中、好気性発酵条件下で生きている再生細胞とで行う請求の範囲第１項記数のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。
２１．ステロイドΔ１−デヒドロゲナーゼが細胞遊離調製物の形態である請求の範囲第２項記載のΔ１，４−３−ケトステロイド（ＩＩ）の製法。