JPH0228098B2 - Endotokishinkenshutsuho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 技術分野 本発明はエンドトキシン検出法に関する。さら
に詳しくは、リムルステスト法におけるゲル化反
応の測定法に関する。

(ロ) 従来技術 エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁中に含
まれるリポ多糖と云われており、熱に対してかな
り安定であり、ヒトに対して発熱作用が著しく
0.1μg程度の微量でも血管内に入ると発熱を生じ、
多量の場合は組織の破壊、シヨツク死等を起こす
と云われている。近年特に、エンドトキシン汚染
による透析液の副作用は大きな問題になつてい
る。エンドトキシンの微量検出法として、従来ウ
サギ発熱性試験等のin vivoでの方法が用いられ
てきたが、最近in vitroで試験できるリムルステ
スト法が開発された。このテスト法はカブトガニ
の血球抽出液（以下「ライセート」と略す）のゲ
ル化反応を利用するもので、従来法に比較し検出
時間が短く、しかも検出感度も高い。従つて、医
療器具、注射剤等の製造工程管理に用いられつつ
ある。また、血液の診断、食品中の細菌汚染の判
定等に用いる試みもなされている。

リムルステスト法にはそのゲル化反応を測定す
る方法として、試験管またはアンプル等の反応容
器内で生じたゲルの崩れ易さを容器を傾けて肉眼
で判定する試験管法、ゲル形成に伴つて濁度の増
加を光度計で測る比濁法、不溶性蛋白質の量を定
量して測定するclot蛋白法等が知られている。こ
れらのリムルステスト法は簡便でありもつとも普
及している方法である。

しかし、これ等の方法は高価なライセートを多
量に用いなければならず検出費用が嵩み、また被
検液も比較的多量に用いなければならない等の欠
点等がある。特にカブトガニ資源の保護のために
も使用ライセートの微量化が望まれている。

(ハ) 発明の目的 本発明の目的は、微量のライセートと被検液を
用いて、エンドトキシンを従来法に比較し鋭敏に
検出測定できる方法を提供するにある。

(ニ) 発明の構成 本発明に係るエンドトキシンの検出法は、エン
ドトキシンを含有する被検液とカブトガニの血球
抽出成分とを混和した液を透明細管内に保持し、
一定温度で反応せしめた後該細管を傾けて液の移
動の有無によりエンドトキシン濃度の測定を行な
うことを特徴とする。

(ホ) 発明の効果 本発明はエンドトキシンとライセートを含む液
が細管内でゲル化すると管内を移動しなくなると
いう知見に基づいて完成されたものであつて、従
来法に比較して、検出感度が高く、しかもライセ
ートおよび被検液の使用量が少なくてすむ点で優
れている。

(ヘ) 発明の構成の具体的説明 本発明で使用するのカブトガニ血球抽出成分は
通常、カブトガニの血球中に含まれるアメーバー
様細胞から低張液で抽出処理して得られる抽出
液、または、この抽出液の凍結乾燥物であるが、
抽出成分にエンドトキシンと反応してゲル化を起
こすものが含まれていれば、その形態は格別限定
されない。また、抽出成分に牛血清アルブミン等
の成分安定化剤あるいはCa⁺⁺、Mg⁺⁺等の活性化
剤を添加したものを用いてもさしつかえない。

エンドトキシンを含有する被検液は、エンドト
キシンが溶解したあるいはエンドトキシンを有す
る細菌が懸濁した水溶液であり、蛋白変性剤、界
面活剤性等のゲル化反応阻害剤を含まないものを
云う。また、液のPHが６〜８であるものを使用す
る。

被検液にライセートを溶解して得られる混和液
は、細管内で調整した液でもあるいは細管外で調
整のした液でもかまわない。予め細管内にライセ
ートの乾燥物を保持しついで被検液を導入して溶
解する方法によつて調製した混和液は、その量が
少なくてすみまた操作中の汚染を防ぐことができ
る点で都合がよい。また、混和液中のライセート
の濃度はエンドトキシンにより液がゲル化し得る
程度であればよく、試験管法で用いられている濃
度と同程度のものが用いらる。透明細管としては
水平に静置した時液を管内壁にに沿つて保持し、
管内の液が容易に流出しない程度の内径を有する
ものであればよく、好ましくは内径0.1〜５mmで
ある。また、その材質は管内に存在する液の状態
が観察できる程度の透明性を有するものであれば
無機質でも有機質でもよい。例えば、透明細管は
ガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレ
ン等である。

混和液を「透明細管内に保持する」とは液を管
内壁に沿つて静止した状態で存在させることであ
り、その管内における液長は0.1〜３cm程度が好
ましい。液長を長くすることは混和液を多量に必
要とすることを意味し、ひいてはライセートおよ
び被検液を多量に必要とする。また、短すぎると
再現性良く検出することが難かしくなる。

次に、「一定温度で反応せしめる」とは一定の
温度に保ちながらライセートとエンドトキシンと
のゲル化反応を行なうことである。その温度は反
応が進行する温度であればよいが、最適な反応温
度であれば反応時間も短く最も好都合である。通
常、最適温度は約37℃であり、この温度に保たれ
た恒温槽に細管を水平に静止することで行なわれ
る。「細管を傾けて反応液の移動の有無を判定す
る」とは、反応後、細管をほぼ垂直にし反応液が
管壁に沿つて落下するか否かによりエンドトキシ
ンの濃度を判定することである。落下しない時は
所定量のエンドトキシンが被検液中に含まれ、ま
た、落下した時は所定量のエンドトキシンが含ま
れていないことを意味する。

(ト) 実施例 以下、実施例について本発明の検出法を具体的
に説明する。

実施例 １ カブトガニの血球抽出物の凍結乾燥物（製造元
Associate of Cape Cod社、販売元和光純薬工
業）240mgを局方注射用蒸留水５mlに溶解する。
E.coli UKT−Ｂ株起源のエンドトキシン（販売
元和光純薬工業）500ngを局方注射用蒸留水５ml
に溶解する。さらにこれを1000倍に希釈して、
0.07ng／mlの被検液を調整した。カブトガニの血
球抽出物溶解液20μと被検液20μとを混合し、
直にエンドトキシンフリーのガラス管（内径1.6
mm、肉厚0.8mm、管長12cm）にこの混合液を移液、
しさらに管中央部まで液を移動し、この管を37℃
のふらん器内に水平に静置し反応を行なつた。
1.0時間後ふらん器内より取り出し、室温で管を
垂直に立てたが、反応液は静止して落下は見られ
なかつた。

一方、被検液として局方注射用蒸留水を用いて
同様な操を行なつた。この場合には反応液は静止
せず、管壁に沿つて急速に落下した。

実施例 ２ 実施例１で用いたカブトガニの血球抽出物溶解
液12.5μを実施例１と同じガラス管に導入し、
さらにその液を管中央部に移動し凍結乾燥を行な
つた。このガラス管に実施例１と同じ0.07ng／ml
の被検液を25μ導入して凍結乾燥物を溶解し、
以降実施例１と同様な操作を行なつた。

反応液の落下は見られなかつた。また被検液と
して局方注射用蒸留水を用いて同様な操作を行な
つた。この場合反応液は急速に落下した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エンドトキシンを含有する被検液とカブトガ
   ニの血球抽出成分とを混和した液を透明細管内に
   保持し、一定温度で反応せしめた後該細管を傾け
   て反応液の移動の有無を判定することことを特徴
   とするエンドトキシンの検出法。 ２ カブトガニの血球抽出成分として凍結乾燥品
   を用いる特許請求の範囲第１項記載のエンドトキ
   シン検出法。 ３ カブトガニの血球抽出成分と被検液との混和
   を透明細管内で行なう特許請求範囲第１項または
   第２項記載のエンドトキシン検出法。 ４ 透明細管として内径が0.1〜５mmのものを用
   いる特許請求範囲第１項、第２項または第３項記
   載のエンドトキシン検出法。 ５ 混和した液の透明細管内保持量が液長で表し
   た時0.1〜３cmであることを特徴とする特許請求
   範囲第１項から第４項までのいずれかに記載のエ
   ンドトキシン検出法。