JPH02261372A - 溶菌成分採取装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、溶菌成分採取装置、特に、菌を含む懸濁液か
ら溶菌成分を採取するための溶菌成分採取装置に関する
。

〔従来の技術〕

臨床診断や研究の分野において、生物試料中の細菌の種
類を同定したり、その構成成分を分析するために、細菌
を種々の方法で溶菌させて各種分析処理に付すことが従
来から行われている。

生物試料の中でも糞便等の水不溶性固形分（食物残渣や
腸内剥離細胞等）を含む試料について細菌の溶菌成分を
得る従来の方法では、試料の懸濁液を培地につけて数日
間培養を行い、得られたコロニーを採取し、これを遠心
分離に付して菌体を分離回収する。そして、これを液中
で酵素もしくは界面活性剤あるいは苛性ソーダを用いて
溶菌させたり、液中で超音波によって細菌を破壊したり
またはガラスピーズとミルで細菌を破壊することによっ
て溶菌成分を得る。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記従来の溶菌成分を得る構成では、培養に長時間を要
するため、溶菌成分を迅速に得ることが困難である。

そこで、本願発明者は、特願平１−１０１６１号におい
て、孔径が比較的大きい直径約５ｃｍのフィルター装置
と、それとは別に構成された孔径が比較的小さい直径約
５ｃｍのフィルター装置とを用いて、試料中の水不溶性
固形分と細菌とを分離し、分離した細菌を溶菌液により
溶かして菌成分を得る方法を提示している。

しかし、その構成では、２つの独立した直径約５ｃｍの
フィルター装置を用いるため、１つの試料に対して必要
となるフィルター装置が大型化せざるを得ない、したが
って、多種類の試料を、−度に処理することが困難であ
る。

本発明の目的は、小型で、−度に多数の試料の処理が簡
便に行える溶菌成分採取装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

（１）第１の発明に係る溶菌成分採取装置は、菌を含む
懸濁液から溶菌成分を採取するための装置である。

この装置は、懸濁液から不溶性固形分を分離するための
粗い第１フィルターと、懸濁液から菌を分離するための
細かい第２フィルターと、両フィルターを互いに間隔を
隔てるように配置して収容するカラムと、カラムの第２
フィルター側に配置され、懸濁液を第１フィルターから
第２フィルターへと通過させるようにカラム内を吸引す
る吸引装置とを備えている。

（２）第２の発明に係る溶菌成分採取装置は、菌を含む
懸濁液から溶菌成分を採取するための装置である。

この装置は、懸濁液から不溶性固形分を分離するための
粗い第１フィルターと、懸濁液から菌を分離するための
細かい第２フィルターと、両フィルターを互いに間隔を
隔てるように配置して収容するカラムと、カラムの第２
フィルター側開口に隣接して配置されたヒートブロック
と、ヒートブロックを温度制御するための制御部とを備
えている。

〔作用］ （１）第１の発明に係る溶菌成分採取装置では、菌を含
む懸濁液をカラム中に通し、カラム内に配置された粗い
第１フィルターで不溶性固形分を分離する。同時に、細
かい第２フィルターによって懸濁液から菌を分離する。

この場合の分離動作は、吸引装置による吸引によって行
われる。

この場合には、−度に不溶性固形分の分離と菌の分離と
を行うべく１つのカラム内に２種類のフィルターが配置
されているので、装置の小型化が図れる。また、装置が
小型化することから、多数の装置を用いて一度に多数の
試料の処理をすることが容易になる。

（２）第２の発明に係る溶菌成分採取装置では、菌を含
む懸濁液をカラム中に通し、カラム内に配置された粗い
第１フィルターで不溶性固形分を分離する。同時に、細
かい第２フィルターによって懸濁液から菌を分離する。

次に、第２フィルターに溶菌液を通して溶面成分を得る
。この場合には、カラムの第２フィルター側開口に隣接
してヒートブロックが配置されている。このヒートブロ
ックを制御部で温度制御し、ヒートブロックによってフ
ィルターを加熱する。これにより、溶菌効率が高まる。

この場合には、−度に不溶性固形分の分離と菌の分離と
を行うべく２種類のフィルターが１つのカラム内に配置
されているので、装置の小型化が図れる。また、カラム
に隣接して配置されているヒートブロックによって溶菌
効率を上げることができる。したがって、この装置を用
いれば、−度に多数の試料の処理を容易に行うことがで
きる。

〔実施例〕

本発明の一実施例を第１図に示す。

第１図において、溶菌成分採取装置は、減圧容器１と、
減圧容器１の上端を塞ぐための蓋体２と、減圧容器ｌ内
に配置されたヒートブロック３と、蓋体２に保持されか
つ減圧容器１内に突出する多数のフィルター装置４とを
主として有している。

減圧容器１は、上端が開口した箱状の部材である。減圧
容器１には、トラップ５を介して吸引ポンプ６が接続さ
れており、これによって減圧容器１内を減圧状態とし得
るようになっている。

蓋体２は、減圧容器１上に載置され、減圧容器１の上端
開口を気密状態で塞ぎ得るものである。

蓋体２の両側部は、１対の駆動機構７に支持されており
、これによって蓋体２は上下方向及び第１図の左右方向
に駆動されるようになっている。第２図に示すように、
蓋体２には複数列状に配置された多数の孔８が形成され
ており、孔８内にフィルター装置４が圧入状態で挿入さ
れることにより保持されている。

ヒートブロック３は、たとえばアルミニウム製の鋳造物
であり、内部に温度制御用の水路（図示せず）を有して
いる。温度制御用の水路には、配管９を介して、温度制
御装置１０が接続されている。温度制御装置１０による
水温の変更及び水の流通によって、ヒートブロック３は
温度制御され得る。ヒートブロック３には、第１図の左
側から順にＰＣＲＣ用法１１と、上下に貫通したパイプ
挿入用孔１２と、上下に貫通した洗浄用孔１３とが、多
数組配置されている。これら穴１１．孔１２．１３は、
第２図に示すように、フィルター装置４の各列方向にも
多数配置されている。すなわち、穴１１．孔１２．１３
はヒートブロック３にマトリクス状に配置されているこ
とになる。各孔１２内には、下方から上方に貫通する液
供給パイプＩ４がそれぞれ挿入されている。液供給パイ
プ１４は、減圧容器１の側壁面を貫通して外部に導出さ
れ、シリンジ状ポンプ１５に接続されている。

シリンジ状ポンプ１５には、電磁切り換え弁１６を介し
て２つの試薬瓶１７．１８が接続されている。これら試
薬瓶１７．１８のうち何れか一方のみがポンプ１５側に
接続されるよう、切り換え弁１６が作動する。試薬瓶１
７内には、たとえばエンド−Ｎ−アセチルムラミニダー
ゼ溶液が貯留される。また、試薬［１８には、たとえば
Ｎａ　ＯＨ溶液が貯留される。　　′ フィルター装置４は、第３図に示すように、蓋体２から
下方に突出し、穴１１．孔１２．１３のいずれかに上方
から挿入され得るようになっている。このフィルター装
置４の詳細を第４図に示す。

第４図において、フィルター装置４は、上方から順にテ
フロン製チューブ３１と、目の粗い第１のフィルター３
２と、テフロン製チューブ３３と、目の細かい第２のフ
ィルター３４と、テフロン製のチューブ３５と、それら
を外周側から覆うテフロン製の熱収縮チューブ３６とを
有している。なお、第４図は分解図であり、実際には熱
収縮チューブ３６内にチューブ３１等が収納された状態
にある。また、熱収縮チューブ３６の収縮によって、そ
れらのチューブ３１等が一体的に固定された状態にある
。ここで、チューブ３１等の内容物は直径がたとえば５
ｍｍであり、熱収縮チューブの内径は収縮前においてた
とえば６ｍｍである。

チューブ３１，３３．３５は、長いテフロン製のチュー
ブを輪切りにして作成したものである。

第１のフィルター３２のうち上側のフィルター３７は、
たとえば８０μｍメツシュのフィルターである。中間の
部材は、粗いメツシュからなる円板状スペーサ３８であ
る。下側のフィルター３９は、たとえば１０μｍメツシ
ュのフィルターである。この第１のフィルター３２は、
少なくとも菌体（細胞）１個を通過させ得るだけの孔径
を有している必要がある。フィルター３９の孔径として
は、０．４５〜１０μｍのものが好ましい、０゜４５μ
ｍ未満では、懸濁液中の菌体を通過させることが実質的
に困難となる。この第１のフィルタ−３２ではスペーサ
３８を介して２種類のフィルター３７．３９が配置され
ているので、目詰まりが生じにくい、なお、フィルター
３７．３９としては、テトロンメツシュ、グラスウール
等が用いられる。第２のフィルター３４は、３層のガラ
ス繊維濾紙４０．４１．４２から構成されている。

上側の濾紙４０は、たとえば２．７１１ｍの孔径を有し
ている。中間の濾紙４１は、たとえば１．６μｍの孔径
を有している。下側の濾紙４２は、たとえば１．２μｍ
の孔径を有している。下側の濾紙４２としては、０．２
〜１．６μｍの孔径を有するものが好ましく、０．２〜
１．２μｍの孔径を有するものがより好ましい。濾紙４
２の孔径が０．２μｍ未満では、夾雑成分の濾過除去効
率が低下する。また、孔径が１．６μｍを越えると、フ
ィルターの細菌保持効率が低下する。

第１図において、蓋体２の上方には、洗浄液注入ノズル
４５が配置されている。ノズル４５は、下方に向けて洗
浄液を放出し得るようになっており、ノズル移動機＃１
４６によって水平面方向及び上下方向に移動可能となっ
ている。ノズル４５には、シリンジ型のポンプ４７を介
して試薬瓶４８が連結されている。試薬瓶４８内には、
たとえば、ＴＥＳが貯留されている。ここでＴＢＳとは
、１０ｍＭ−ＴｒｉｓＨＣｆ　（ｐＨ８，０）、１ｍＭ
−ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ−ＮａＣ１（ｐＨ８゜０）の混
合溶液を言う。

さらに、本実施例に係る溶菌成分採取装置は、第５図に
示すようなマイクロコンピュータ５０を備えている。マ
イクロコンピュータ５０は、ＣＰＵ５１．ＲＡＭ５２．
ＲＯＭ５３等を備えており、外部接続用のＩ１０ポート
５４を有している。■１０ボート５４を介して、マイク
ロコンピュータ５０には、上述のポンプ６、駆動機構７
、温度制御装置１０、ポンプ１５、切り換え弁１６、移
動機構４６、ポンプ４７が接続されている。したがって
、これらの構成部材は、マイクロコンピュータ５０によ
り駆動制御されることになる。

次に、上述の溶菌成分採取装置の動作及びその使用法を
説明する。

まず、フィルター装置４を組み立てる。この場合には、
第４図に示すように３種類の高さのチューブ３１，３３
．３５を用意し、その外径と同一の直径を有するフィル
ター３７．３９、スペーサ３８及び濾紙４０．４１．４
２を用意する。また、それらを重ね合わせたときの高さ
とほぼ同じ高さを有する熱収縮チューブ３６を用意する
。チューブ３１，３３．３５及びフィルター３７等を熱
収縮チューブ３６内に挿入し、第１図に示す順番で上下
に重ね合わせる０次に、加熱装置（たとえばドライヤー
）により、熱収縮チューブ３６を加熱して収縮させる。

この結果、熱収縮チューブ３６によってチューブ３１，
３３．３５及びフィルター３７等が一体的に固定され、
フィルター装置４が組み立てられたことになる。

次に、フィルター装置４内に試料懸濁液を入れる。試料
としては、糞便等の生物試料が代表的であるが、これ以
外にも、比較的大きな水不溶性固形分と細菌とを少なく
とも含有する試料が適用で・きる、たとえば、血液、尿
や嘔吐物等を試料とすることができる。さらに、医療診
断以外の試料、たとえば食品等を対象とすることもでき
る。ここでは、まず試料の懸濁液が調整される０Ｍ濁液
を調整するための水系媒体としては、溶菌性を有さない
ものが適しており、たとえば希塩化ナトリウム水や中性
燐酸緩衝液等があげられる。この媒体には、細菌と固形
分との分離分散性を向上させるために、溶菌しない程度
の界面活性剤が含有されていてもよい、懸濁させる試料
の量としては、２ｍｇ程度で充分である。なお、懸濁液
は上方からテフロンチューブ３１内に注入される。

試料が注入されたフィルター装置４は、蓋体２の各孔８
内に正大状態で挿入されて保持される。

蓋体２は駆動機構７によって第１図に示す位置に配置さ
れており、フィルター装置４は減圧容器１内においてヒ
ートブロック３の孔１３内に配置される。

次に、ポンプ６を駆動して減圧容器１内を減圧状態とす
る。この結果、フィルター装置４内の懸濁液は、第１の
フィルター３２及び第２のフィルター３３を通過して減
圧容器１内に排出される。

次に、移動機構４６によりノズル４５が各フィルター装
置４の上方に順次配置され、ポンプ４７が駆動されるこ
とにより試薬瓶４８内のＴＥＳがフィルター装置４に上
方から注入される。このＴＥＳは、減圧容器１内が減圧
状態にあることから、第１のフィルター３２及び第２の
フィルター３３を通過して減圧容器１内に排出される。

これにより、フィルター装置４内の洗浄が済んだことに
なる。

次に、減圧容器１内を常圧に戻し、駆動機構７によって
蓋体２を移動させ、フィルター装置４をバイブ１４に嵌
合させる。すなわち、第６図に示すようにフィルター装
置４の下端部にバイブ１４の上部が嵌合した状態となり
、バイブ１４の上端開口は第２のフィルター３４の直下
に配置される。

また、この状態で蓋体２は、減圧容器１の上端開口を閉
じる０次に、切り換え弁１６によって試薬瓶１７をポン
プ１５側に連通させ、ポンプ１５を駆動することにより
、エンド−Ｎ−アセチルムラミニダーゼ溶液をバイブ１
４を通じて第２のフィルター３４に供給する。これによ
り、第２のフィルター３４はエンド−Ｎ−アセチルムラ
ミニダーゼ溶液によって湿潤状態になる。このとき、チ
ューブ３３が介在することから、第１のフィルター３２
へはエンド−Ｎ−アセチルムラミニダーゼ溶液は到達し
ない、なお、このときヒートブロック３でフィルター装
置４を加温することにより、酵素の作用効率が上げられ
る。

次に、再び蓋体２を駆動機構７によって移動させ、第１
図及び第３図の状態とする。そして、ポンプ６を駆動す
ることにより減圧容器１内を減圧状態とし、第２のフィ
ルター３４に染み込んだエンド−Ｎ−アセチルムラミニ
ダーゼ溶液を除去する。これにより、第２のフィルター
３４に捕捉された細菌の外周部（細胞壁等）が溶かされ
、容易にＤＮＡが溶出し得る状態となる。一方、切り換
え弁１６を切り換えることにより、ＮａＯＨ溶液が入っ
た試薬［１８とポンス１５とを連通状態とする。そして
、ポンプ１５を作動させることによりバイブ１４内に残
っていたエンド−Ｎ−アセチルムラミニダーゼ溶液を排
出し、それに代えてＮａＯＨ溶液をバイブ１４内に充満
させる。

次に、減圧容器１を常圧に戻し、再び蓋体２を駆動機構
７によって第６図に示す姿勢とする０次に、ポンプ１５
を駆動し、バイブ１４から第２のフィルター３４にＮａ
ＯＨ溶液を供給する。これにより、第２のフィルター３
４はＮａＯＨ溶液によって湿潤状態となる。一方、第１
のフィルター３２にはＮａＯＨ溶液は到達しない。この
ＮａＯＨ溶液による第２のフィルター３４の湿潤によっ
て、細菌内のＤＮＡが溶出し得る状態となる。このとき
、ヒートブロック３でフィルター装置４を加温すること
により、溶菌効率が向上する０次に、蓋体２を駆動機構
７によって駆動し、フィルター装置４をＰＣＲ法用法用
穴内ｌ内入する。このときの状態を第７図に示す、第７
図の状態では、蓋体２は減圧容器１の上端を閉じている
。次に、ポンプ６を駆動し、減圧容器１内を減圧状態と
する。

この結果、ＰＣＲ法用法用穴内１内細菌のＤＮＡを含む
溶菌成分が溜められる。

次に、減圧容器ｌを常圧に戻し、蓋体２を除去する。そ
して、ＰＣＲ法用法用穴内１内られた溶菌成分を含む溶
液に対し、Ｔｒ　１ｓＨｃｊ！　（ＬＭ。

ｐＨ８，０）、ＨＣ／！　（ＩＭ）溶液を用いて中和す
る。

得られた溶菌成分を含む溶液は、ヒートブロック３を温
度制御装置１０によって温度制御することにより、ポリ
メラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）に付し、特定国の特定
ＤＮＡの増幅を行う、このＰＣＲ法では、目標画のＤＮ
Ａに特異的にハイブリダイズするプライマーを選んで反
応を進めることにより、目標画のＤＮＡのみを増幅する
ことができる。したがって、ＰＣＲ法によれば、目標画
が最初に１〜１００個程度あれば、そのＤＮＡを増幅す
ることにより、目標画の検出を行うことが可能となる。

目標画のＤＮＡが増幅された溶菌液は、たとえばＥｔＢ
ｒ２％アガロースゲルを用いた電気泳動法等によって検
出される。なお、この検出は、その他の公知の方法を用
いて行うこともできる。また、それ以外にＤＮＡプロー
ブを用いて確認する方法を採用することもできる。

以上説明したように、上述の実施例では、２種類のフィ
ルターを熱収縮チューブを用いて一体的に構成したフィ
ルター装置４を使用しているので、フィルター装置４の
小型化が図れる。したがって、溶菌成分採取装置全体の
小型化が図れ、−度に多数の試料の処理が容易に行える
ようになる。また、減圧容器１内にヒートブロック３に
より、溶菌効率を上げることができる。しかも、溶菌成
分の抽出とＰＣＲ法の実施とを連続的に行えるようにし
たので、溶菌成分採取装置のコンパクト化が図れるよう
になる。

なお、前記実施例では、溶菌工程において酵素とアルカ
リとを別々に供給したが、酵素と界面活性剤との混合溶
液を用いて溶菌を一度に行うことも可能である。

〔発明の効果〕

第１の発明によれば、粗さの異なる２種類のフィルター
を１つのカラム内に収容し、それらと吸引装置とを組み
合わせたので、溶菌成分採取装置の小型化が図れる。ま
た、フィルタ一部分が小型化されるので、−度に多数の
試料の処理を行うことが容易になる。

第２の発明によれば、粗さの異なる２種類のフィルター
を１つのカラム内に収容し、ヒートブロックを設けたの
で、溶菌成分の採取が効率良く行え、しかも全体がコン
パクトな溶菌成分採取装置が得られる。また、フィルタ
一部分がコンパクトになり、−度に多数の試料の処理を
行うことが容易になる。

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明の一実施例の概略構成図、第２図はその
減圧容器及び蓋体部分の一部切欠き平面部分図、第３図
はその実施例の縦断面部分図、第４図はフィルター装置
の分解斜視図、第５図は制御部分のブロック図、第６図
及び第７図は動作状態を説明するための第３図に相当す
る図である。 １・・・減圧容器、２・・・蓋体、３・・・ヒートブロ
ック、４・・・フィルター装置、６・・・ポンプ、ＩＯ
・・・温度制御装置、１１・・・ＰＣＲ法用穴、３２・
・・第１のフィルター、３４・・・第２のフィルター、
３６・・・熱収縮チューブ、５０・・・マイクロコンピ
ュータ。 にｊ、７″、−一 第 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）菌を含む懸濁液から溶菌成分を採取するための溶
   菌成分採取装置であって、 前記懸濁液から不溶性固形分を分離するための粗い第１
   フィルターと、 前記懸濁液から菌を分離するための細かい第２フィルタ
   ーと、 前記両フィルターを、互いに間隔を隔てるように配置し
   て収容するカラムと、 前記カラムの前記第２フィルター側に配置され、前記懸
   濁液を第１フィルターから第２フィルターヘと通過させ
   るように前記カラム内を吸引する吸引装置と、 を備えた溶菌成分採取装置。
2. （２）菌を含む懸濁液から溶菌成分を採取するための溶
   菌成分採取装置であって、 前記懸濁液から不溶性固形分を分離するための粗い第１
   フィルターと、 前記懸濁液から菌を分離するための細かい第２フィルタ
   ーと、 前記両フィルターを、互いに間隔を隔てるように配置し
   て収容するカラムと、 前記カラムの第２フィルター側開口に隣接して配置され
   たヒートブロックと、 前記ヒートブロックを温度制御するための制御部と、 を備えた溶菌成分採取装置。