JPH02170053A - 微生物の検出方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 産業上の利用分野 本発明は、抗原抗体反応の利用および光学的測定によっ
て、検体中の１」的微生物を検出または同定する方法お
よび装置に関する。

従来の技術 従来、微生物の検出および同定は培養検査により行なわ
れている。これは検出されそうな微生物か増殖するのに
適した複数の培地を準備し、これに試料を接種して培養
を行ない、生育してきた微生物の性質を形態学的検査や
生化学的検査などの各種試験により調べる方法である。

また、近年各種微生物に特異的な抗体を用いて抗原抗体
反応による凝集を肉眼で確認する凝集法が開発されてい
る。

しかしながら、培養法は培養に時間がかかることや多項
目の試験を行なう必要かあり、通常検査が終了するまで
に最低でも２〜３日を要するため、感染症の診断などで
は検査結果が出る頃には患者が死亡しているような症例
もある。また、微生物の種類によっては死滅しやすく培
養の難しいものもあり、検出されない場合もある等の問
題点がある。

また凝集法は死滅した微生物でも検出でき、操作も比較
的簡便で迅速に検査できる方法であるが、抗原抗体反応
による微生物の凝集を肉眼で確認する方法であるため、
少量の微生物の検出かできす、また測定者の主観が入り
やすいため、測定者か異なると検査結果が異なる場合も
ある。さらに測定結果を数値やグラフなとに客観的に表
示できず、データの保存もてきないという問題がある。

〔発明の概要〕

本発明は、上述の問題点を解決することを目的とし、抗
原抗体反応によって微生物を検知可能な状態に変換し、
この変換物、すなわち抗原抗体反応物、について光学的
反作用を順次連続的に測定してこのｉ’ｌ１ｌＩ定値を
パターン化することによってこの目的を達成しようとす
るものである。

すなわち、本発明による微生物の検出方法は、検体中の
目的微生物に該微生物に特異的に結合する抗体を反応さ
せてから該反応処理検体の光学的反作用を順次測定する
過程と、該測定で得られた測定値の統計を上記抗体を反
応させない未処理検体の光学的反作用の測定値の統計と
比較することにより検体中の上記抗体に特異的に結合す
る微生物を検知する過程とを含むこと、を特徴とするも
のである。

また、本発明による微生物の検出装置は、検体中の目的
微生物に該微生物に特異的に結合する抗体を反応させた
反応処理検体を順次被検部を通過させるための手段と、
該被検部に光を照射する手段と、上記検体からの光学的
反作用を測定する測定手段と、該測定で得られた測定値
の統計を上記抗体を反応させない未処理検体の光学的反
作用の測定値の統計と比較することにより検体中の上記
抗体と特異的に結合する微生物を検知する手段とを有す
ること、を特徴とするものである。

効果 本発明による微生物の検出方法および装置は、抗原抗体
反応によって微生物を検知可能な状態に変換し、この変
換物、すなわち該反応処理検体の抗原抗体反応物、につ
いて光学的反作用を順次連続的に、たとえばフローサイ
トメトリを利用して順次連続的に７１１１１定してこの
測定値をパターン化し、この統計パターンを未処理検体
における統計パタンと比較することにより目的微生物を
検知するものであり、検体中に存在する一種または複数
種の目的微生物を、高濃度に存在する場合はもちろん、
低濃度の場合であっても、簡便、迅速かつ正確に検出・
同定することができる。また、客観的なデータが得られ
るため、測定者間の誤差を無くすことができる。更にデ
ータの保存も可能となり、データの比較、再確認等が容
易にできる。

〔発明の詳細な説明〕

検出方法 本発明による微生物の検出方法は、抗原抗体反応によっ
て微生物を検知可能な状態に変換してこの変換物の光学
的反作用を順次測定する過程と、この測定値の統計パタ
ーンを対照の統計パターンと比較することにより微生物
を検知する過程とを含むものであることは前記したとこ
ろであり、前者の過程において、目的とする微生物と該
微生物に特異的に反応する抗体とを反応させて該微生物
を光学的反作用、または光学的反作用の変化、を生じう
る状態に変換させ、この反応処理検体について、生成し
た微生物と抗原との反応物の光学的反作用を順次連続的
に測定し、後者の過程において、該測定で得られた測定
値の統計処理による統計パターンを、前記抗体と反応さ
せない未処理検体の測定値の統計パターンと比較するこ
とにより目的微生物の有無を検知することを基本原理と
するものである。

従って、上記反応処理検体における測定値の統計パター
ンと未処理検体における測定値の統計パターンを比較し
た際に、目的微生物が存在する検体においては両者の統
計パターンが相互に異なるか、１」的微生物が存在しな
い検体においてはこの両者の統計パタンに差異か見られ
ないことになる。

上記の順次連続的に測定する方法としては、微生物を抗
原抗体反応によって光学的反作用、または光学的反作用
の変化、を生しうる状態に変換させた抗原抗体反応物、
および抗体を反応させない未処理検体について、光学的
反作用を両者の差違を感知した状態で順次連続的に測定
できる方法であれば任意の方法か可能であり、好ましい
例としてフローサイトメトり法がある。

フローサイトメトυ法とは、粒子、すなわち本発明にお
いては目的微生物と抗体との抗原抗体反応物、を］個ず
つ流し、この粒子にレーザ光や紫外線等の光を照射して
、その結果生ずる光学的反作用、例えば散乱光や螢光を
測定することにより、粒子の大きさ、形態、性質等を調
べる方法である。

本発明においては、これによって得られた測定値は統計
処理してパターン化されることになる。

統＝１処理によるパターン化の表現としては、後記実施
例において詳述するように、ヒストグラムやサイトダラ
ム等が用いられる。

本発明においては、粒子の散乱光を測定する方法や螢光
を測定する方法、又は散乱光と螢光を同時に測定する方
法も使用できる。

また、本発明において、螢光強度の測定によって微生物
の検出、同定をする場合には、目的微生物と反応する抗
体に予め螢光物質による標識をしておく方法、又は微生
物と抗体の結合物に該抗体に結合する螢光物質を結合さ
せる方法、が使用できる。勿論両者の方法を共に行なっ
ても良い。

Ｌ１的微生物に特異的な抗体とは、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体のいずれをも含むものであり、こ
のような抗体は微生物抗原による動物免疫による方法、
必要とする抗体の抗体産生細胞の細胞融合による方法、
必要な抗体をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的方
法など、任意のｈ゛法によって得ることができる。

抗体に結合させる蛍光物質としては、従来周知の物質が
使用可能であり、例えばフルオレセイン・イソチオンア
ネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン・エックス・イソチオ
シアネート（ＸＲＩＴＣ）、テトラメチル・ローダミン
・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）あるいはフィコ・
エリトリン（ＰＥ）なとか挙げられる。これらの蛍光物
質による上記抗体の標識化はいずれも公知手段によって
行なうことができ、例えば、適当な濃度に調整した抗体
液（リン酸緩衝液）を炭酸ナトリウム緩衝液でＰＨ９，
１〜９．５に調整し、これに必要量のＦＩＴＣ粉末を添
加した後、撹拌しながら低温で６時間程度反応させ、そ
の後ゲルろ過等で未反応の蛍光色素を除くと共に、ＤＥ
ＡＥ−セルロスなどのカラムクロマトグラフィーで精製
するなどの方法によって標識化抗体を得ることができる
。

なお、上記特異抗体に反応する抗体を蛍光標識化し、こ
れと上記特異抗体を結合させ、間接的に上記特異抗体を
標識化することもできる。

又、微生物を検出、同定できる被検試料、すなわち本発
明における検体、としては、血液、尿、喀痰あるいは組
織なとの生体成分、食品、河川水等や、微生物の培養液
あるいは微生物の懸濁液等がある。

測定できる微生物は、抗原性を有すると共に、前記反応
処理検体における測定値の統計パターンが未処理検体に
おける測定値の統計パターンと異なるような抗原抗体反
応、すなわち凝集反応、を示すような微生物であり、細
菌、酵母、真菌、リッケッチアなと種々のものがある。

このような微生物の具体例としては、シュードモナス・
エルギノーサ（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｃｒｕｇ
ｉｎｏｓａ　）　、スタフィロコッカス−アウレウス（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｃｕｓ）　、エシ
ェリヒアΦコリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ＋１ａＣ０１１
）、エンテロバクタ ・クロアカニ クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　Ｉａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　、セラチア・マルセセンスラ
クトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕ
ｓｃａｓｅｉ　）などがある。

検出装置 本発明による微生物の検出装置は、検体中の目的微生物
に該微生物に特異的に結合する抗体を反応させた反応処
理検体を順次被検部を通過させるための手段と、該被検
部に光を照射する手段と、上記検体からの光学的反作用
をｆｌｌｌｌ定する手段と、該測定で得られた測定値の
統計を上記抗体を反応させない未処理検体の光学的反作
用のδ１り定値の統計と比較することにより検体中の」
１記抗体と特異的に結合する微生物の有無を検知する手
段とを有するものであることは前記したところであり、
上述の検出方法を基本原理とするものである。

この検出装置に関する更に詳細な説明は後記実施例に記
載されている。

実施例 以下は、本発明による微生物の検出方法および装置に係
る実施例を示すと共に、本発明を更に具体的に説明する
ものである。

〔実施例１〕 第１図は本発明に係る実施例の微生物検出装置の構成図
を示し、フローセル１の中央部には、シスフロ一方式に
よって細菌等の目的微生物が浮遊する試料液（本発明に
おける検体を含む）が紙面垂直方向に通過する流通部２
が設けられている。

この流通部２の流れ方向と直交する方向にはレーザ光源
３が配置され、レーザ光源３からの照射光を流通部２に
照射するため、光軸δ１上にはレサビームＬを任意の長
径、短径から成る楕円形状のスポットに調整する結像レ
ンズ４が配置されている。結像レンズ４の例としてはシ
リンドリカルレンズの組合せ等か用いられる。レーザビ
ームが照射される流通部２の被検部を細菌等の被検物が
通過すると、被検物より散乱光が発する。また予め被検
物を螢光標識しておくと螢光が発生する。

散乱光の内、レーザ照射光の光軸前方方向に発するある
所定角度成分の前方散乱光は対物レンズ６で集光され、
光電検出器７にて強度検出される。

一般に前方散乱光強度からは被検物のサイズに関する情
報か得られる。ストッパ５はレーザビームの強力な直接
光や透過光か光電検出器７に入射するのを防ぐ役割をし
、散乱光のみが光検出器７にて検出される。なお、本実
施例では透過光を検出しない形態としたが、ミラー等で
検出光路を設け、透過光を検出して新たなΔＩ１１定パ
ラメータとしても良い。

又、側方散乱光および螢光を検出するために、被検部か
らレーザ照射光光軸０１に対して直交方向の光軸０２上
には、対物レンズ８、集光レンズ９、絞り１０、集光レ
ンズ１１、ダイクロイックミラー１２．１３、およびミ
ラー１４が順次配置され、ダイクロイックミラー１２の
反射方向にはバリアフィルタ１５、側方散乱光検出用の
光電検出器１６が配置され、ダイクロイックミラー１３
の反射方向にはバリアフィルタ１７、赤色螢光検出用の
光電検出器］８が、又ミラー１４の反射方向にはバリア
フィルタ１９、緑色螢光検出用の光′小検出器２０が配
置されている。これらの光電検出器１６．１８．２０に
は微弱光を増強して検出可能とするフォトマルチプライ
ヤが用いられる。

光電検出器７、］δ６］８．２０で検出された電気信号
は第１の記憶部２１に入力されて記憶される。また第２
の記憶部２２には予め記憶部２］のデータが転送されて
記憶されており、比較演算部２３にて第１の記憶部２１
と第２の記憶部２２のデータ内容が比較され、パターン
認識処理技術を用いて互いのデータの統計パターンの一
致の有］　４ 無が検知される。データの統計処理にはヒストグラムや
サイトグラム等が用いられる。これらのヒストグラムや
サイトグラム等の統計処理結果や比較演算結果は表示部
２４に表示される。

上述の装置を用いて微生物の検出同定を行なう方法か以
下に説明されている。

ます、微生物を含む被検液に抗体を加えない未処理の試
料（未処理検体）を上述の装置で測定し、測定によって
第１の記憶部２１に蓄えられた測定データを第２の記憶
部２２に転送し基準データとして記憶しておく。次の特
定の微生物と特異的に反応するモノクローナル抗体を」
１記被検液と反応させた試料（反応処理検体）を上述の
装置で測定する。この測定データは第１の記憶部２］に
蓄えられる。被検液にモノクローナル抗体を加えること
により、目的とする微生物が存在する場合には抗原抗体
反応が起きて微生物同志がモノクローナル抗体を介して
凝集し、凝集塊となる。これにより見掛は主機生物のサ
イズが増大し、散乱光強度あるいは透過光強度の変化と
なって現われる。又、抗体を標識する場合は、微生物サ
イズが大きくなることにより標識される螢光量も多くな
り、測光される螢光強度も増大する。演算部２３におい
ては、基準データが記憶される第２の記憶部２２と、δ
Ｉ１１定デー少データされる第１の記憶部２１の内容を
比較し、ヒストグラムやサイトグラム等のデータの統計
のパターンが一致するか否かを検知する。

抗原抗体反応が起きた場合には基準パターンに対して測
定パターンが変化するため、目的とする微生物の存在が
確認される。又、目的とする微生物か存在しない場合は
抗原抗体反応か起きず、パターンの変化は起きない。演
算部２３で行なわれるこれらの処理手順が第６図のフロ
ーチャートに示されている。

なお、上述のように微生物の存在の有無を検出するだけ
ではなく、予め作成しておいた検量線と測定データを比
較することにより、微生物の定量的な測定も可能である
。

以下は上述の装置を用いた検体中の細菌の検出・同定の
例を示すものである。

患者の血液を培養して得た１つのコロニーをかきとり、
１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）添加したリン酸緩衝生
理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に懸濁し、室温に１時間放置し
たものを検体１とした。試験管に検体１を０．５ｍｌと
り、特開昭５９−２９６２２号公報記載の方法に従って
調製した抗緑膿菌モノクローナル抗体液（０、］、　ｍ
ｇ　／　ｍｌ　）　０　、　５　ｍｌを添加混合し室温
で１時間反応させた。次にこれを３５００回転／分で１
０分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿物を０．　１％
　ＢＳＡ添加ＰＢＳ２ｍｌに懸濁して反応物１を得た。

この検体１および反応物１を上述の装置を用いて散乱光
を測定して分析した結果、緑膿菌（Ｐｓｅｕｒｌｏｍｏ
ｎａｓａｃｒｕｇｉｎｏｓａ　）が検出された。

第２図（ａ）、（ｂ）の横軸は散乱光強度、縦軸は粒子
数を示し、第２図（ａ）は検体１の測定結果、第２図（
ｂ）は反応物１の測定結果である。

第２図（ａ）に比べて第２図（ｂ）では、ヒストグラム
が右方向に移行し、散乱光強度の強い粒子の増加が認め
られる。これは、緑膿菌と抗緑膿菌モノクローナル抗体
との混合により、緑膿菌が凝集して見掛は上の緑膿菌サ
イズが増大し、より強い散乱光が発生したためである。

また別の生化学的性状試験により緑膿菌であることを確
認した。

〔実施例２〕 試験管に先の実施例１て得た検体１を０．５ｍｌとり、
抗緑膿菌モノクローナル抗体液０．５ｍｌを添加混合し
室温で１時間反応させた。次に３５００回転／分で１０
分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿物を１％ＢＳＡ添
加ＰＢＳ　　２ｍｌに懸濁し、３５００回転／分で１０
分間遠心分離し、上清を除去した（洗浄操作）。この洗
浄操作を３回繰り返した後、沈殿物をＦＩＴＣ標識化抗
マウスイムノグロブリン抗体液に懸濁し室温で１時間反
応させた。次に洗浄操作を行なった後、０．］％ＢＳＡ
添加ＰＢＳ　　２ｍｌに懸濁し反応物２を得た。この検
体］および反応物２を上述の装置を用いて螢光を測定し
て分析した結果、緑膿菌が検出された。

第３図（ａ）は検体１の測定結果、第３図（ｂ）］　８ は反応物２の測定結果である。第３図（ａ）および（ｂ
）に示すように、検体１中に螢光を示す粒子がほとんど
存在しないのに対し、反応物２中には強い螢光を示す粒
子の増加が認められた。これは緑膿菌と抗緑膿菌モノク
ローナル抗体を混合することにより生成した結合物に、
抗緑膿菌モノクローナル抗体と結合するＦＩＴＣ標識化
抗マウスイムノグロブリン抗体かさらに結合し、この結
合物がＦＩＴＣによる螢光を発したためである。また別
の生化学的性状試験により緑膿菌であることを確認した
。

〔実施例３〕 患者の血液を培養して得た１つのコロニーをかきとり、
１％ＢＳＡ添加ＰＢＳに懸濁し、室温で１時間放置した
ものを検体２とした。試験管に検体２を０，５ｍｌとり
、抗キャンディダ・アルビカンスモノクローナル抗体液
（０，、１ｍｇ／ｍ１）（Ｉｎｆｃｃｔ、　　１ｍｍｕ
ｎ、　５４．　Ｎｏｔ、　ｐ２２２〜２２７．１．９８
Ｂ　。

記載の方法に従って調製）０．５ｍｌを加え、室温で１
時間反応させた。次に洗浄操作を３回繰り返した後、Ｆ
ＩＴＣ標識化抗マウスイムノグロブリン抗体に懸濁し、
室温で１時間反応させた。更に洗浄操作を行なった後、
０，１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ　　２ｍｌに懸濁し反応物３
を得た。この検体２および反応物３を前述の装置を用い
て螢光を測定して分析した結果、キャンディダ・アルビ
カンス（Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉｅａｎｓ）が検出
された。第４図（ａ）は検体２の測定結果、第４図（ｂ
）は反応物３のｌ１ｌ１１定結果である。第４図（ａ）
、　　（ｂ）に示すように、検体２と反応物３を比べる
と、反応物３は螢光強度の強い粒子の増加が認められた
。

これはキャンディダ・アルビカンスと抗キャンデイダ・
アルビカンス抗体の結合物に、抗キャンディダ・アルビ
カンス抗体と結合するＦＩＴＣ標識化抗マウスイムノグ
ロブリン抗体が更に結合し、この結合物がＦＩＴＣによ
る螢光を発したためである。また別の生化学的性状試験
によりキャンディダ・アルビカンスであることを確認し
た。

〔実施例４〕 実施例２の検体１および反応物２を、上述の装置を用い
て散乱光および螢光を測定して分析した結果、緑膿菌が
検出された。

第５図（ａ）、　　（ｂ）の横軸は螢光強度、縦軸は散
乱光強度を示し、第５図（ａ）は検体１の測定結果、第
５図（ｂ）は反応物２の測定結果である。

１９・・バリアフィルタ、１６．１８．２０・・・光電
検出器、２１．２２・・記憶部、２３・・演算部、２４
・・・表示部。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による微生物検出装置の構成図、第２図
は散乱光を用いた緑膿菌検出の実施例の説明図、第３図
は螢光を用いた緑膿菌検出の実施例の説明図、第４図は
螢光を用いたキャンディダ・アルビカンス検出の実施例
の説明図、第５図は散乱光と螢光を用いた緑膿菌検出の
実施例の説明図、第６図は演算部における演算手順を示
すフローチャート、をそれぞれ示す。 図中の主な符号は、下記に示す通りである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体中の目的微生物に該微生物に特異的に結合する
   抗体を反応させてから該反応処理検体の光学的反作用を
   順次測定する過程と、該測定で得られた測定値の統計を
   上記抗体を反応させない未処理検体の光学的反作用の測
   定値の統計と比較することにより検体中の上記抗体に特
   異的に結合する微生物を検知する過程とを含むことを特
   徴とする、微生物の検出方法。 ２、上記光学的反作用が、検体からの光散乱および（ま
   たは）螢光発生である、請求項１記載の微生物の検出方
   法。 ３、微生物に特異的に結合する抗体が螢光物質で標識化
   されている、請求項１記載の微生物の検出方法。 ４、上記微生物が緑膿菌である、請求項１記載の微生物
   の検出方法。 ５、検体中の目的微生物に該微生物に特異的に結合する
   抗体を反応させた反応処理検体を順次被検部を通過させ
   るための手段と、該被検部に光を照射する手段と、上記
   検体からの光学的反作用を測定する手段と、該測定で得
   られた測定値の統計を上記抗体と反応させない未処理検
   体の光学的反作用の測定値の統計と比較することにより
   検体中の上記抗体と特異的に結合する微生物を検知する
   手段とを有することを特徴とする、微生物の検出装置。