CN109266717A - 一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法，将细菌样品取一定量和一定量抗生素稀释液混合安置在载玻片上，利用盖玻片盖住并利用密封剂四边密封，形成一个板式微生化反应系统，细菌和抗生素稀释液在其中发生生化反应。通过相差显微镜进行平面扫描观察和定位细菌，再通过激光扫描所定位的细菌得到拉曼光谱，通过分析可以取得细菌耐药性情况。本发明还提供了实现上述方法的装置，包括一个板式微生化反应系统、相差显微镜、高倍光学显微镜、拉曼光谱激发系统和拉曼光谱收集系统。通过相差显微镜和高倍光学显微镜观察定位细菌，然后使用拉曼光谱激发系统和拉曼光谱收集系统获得细菌拉曼光谱的变化，从而检测细菌耐药性。

Description

一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法和装置

技术领域

本发明涉及物理领域，尤其涉及光学检测技术，特别是一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法和装置。

背景技术

据浙江大学医学院有关教授综合分析多项数据后发现，我国抗生素每年总使用量约为15万吨～20万吨，使用量约占世界总使用量的50％。同时受人口密集，制药业、农业、养殖业分布等因素影响，中国东部流域的抗生素使用量和排放量密度高于西部流域6倍以上。大规模经常不必要的抗生素使用意味着越来越多的病原体对药物不敏感，以前可治疗的感染可能会危及生命。

抗生素大量使用造成了环境中抗生素残留的广泛存在与细菌耐药的传播扩散，进一步影响生态环境与人类健康，抗生素环境污染与细菌耐药问题越来越受到社会广泛关注。2016年8月26日国家卫生计生委等14部门联合印发的《遏制细菌耐药国家行动计划(2016—2020)》明确提出：“加强抗菌药物应用和耐药控制体系建设”和“完善抗菌药物应用和细菌耐药监测体系”。2018年三月国家卫健委再次发出《关于持续做好抗菌药物临床应用管理有关工作的通知》，强调进一步加强抗菌药物临床应用管理，限制抗生素的使用再次升级，防止出现针对细菌“无药可用”“束手无策”的情况。

目前大多临床诊断并不开展病原体精细化检测，尤其在诊治一些严重感染如败血症时，不能够快速精准用药往往造成生命危险。为了更好地服务于临床，精细化用药具有非常重要意义。不仅可以大幅减少抗生素的使用量，节约资源保护环境。更可以有效精准治疗疾病，及时挽救病人生命，具有重大社会意义。

现有技术中检测细菌耐药性的方法包括：

1：传统的鉴定方法

主要是通过病原体的形态学、生物化学、免疫学等检查。由于每个病原体的个体数量少，不利于进行生理生化和免疫学的鉴定，需要经过体外培养使其数目达到一定程度后，再进行鉴定。传统的病原体检测方法大多只针对特定的、可培养的细菌，并且耗时较长。对于可培养细菌约需2d的检测时间，对于生长较慢的菌种需要7d左右，对于实验室无法培养的细菌则无能为力。而且传统方法难以区分某一传染是由一个还是多个菌病原体所引起的。正常情况下从病原体准备到最后获得结果要2～3天时间。这些方法的优点是准确，缺点是费时费力，样品容易被污染。

2：自动化仪器检测

根据病原体不同的生物学性状和代谢产物的差异，逐步发展了微量快速培养基和微量生化反应系统，使原来缓慢、烦琐的手工操作变得自动化。目前已有多种病原体自动鉴定及药敏测试系统问世，如VITEK-AutoMicrobicSystem(AMS)、PHOENIXTM、MicroScan、Sensititre、ABBott(MS-2System)、AUTOBACIDXSys-tern等。这些自动化系统具有先进的微机系统，广泛的鉴定功能，适用于临床微生物实验室、卫生防疫和商检系统，主要功能包括细菌鉴定、细菌药物敏感性试验及最低抑菌浓度(MIC)的测定等，其准确性和可靠性均已大大提高。

虽然这些设备被一些场所使用，但存在一些缺点：(1)：它们只适用于可以体外培养的常见病原体，样品体外培养仍然需要花费很长时间；(2)：只能从单方面了解微生物物种，一些表现出独特的生化特性的微生物不能正确判别。

3：分子生物鉴定方法

现在一些新的分子鉴定方法逐渐发展起来，是基于高通量基因测序数据的分析和生物分子质谱分析来鉴定病原体。

(1)基因测序分析

细菌产生耐药性的遗传基础是基因突变或获得耐药基因，通过针对性检测基因突变或相关耐药基因是细菌耐药性检测和监测的重要手段和途径。目前最新一代基因测序仪厂家主要有Illumina、罗氏、ABI等三。Illumina将Genome Analyzer II升级到GenomeAnalyzer IIx，实现单次运行获得95GB数据的宏伟目标。罗氏诊断公司推出了性能更优的第二代基因组测序系统Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。ABI推出了SOLiD3新一代测序平台。它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。这些仪器价格昂贵，基本由国外仪器厂垄断。

基因测序优点是能在分子水平上进行细菌鉴定，克服了传统培养方法的多种局限性，对于罕见细菌、慢生长细菌、未培养细菌等的鉴定尤为重要，数据的分析更加精准。其缺点是基因测序方法多基于16S rRNA基因开展细菌鉴定与分类，难以区分某些相近的种属，对于测序结果的解读也较为复杂，速度慢且成本高。整个检验过程需要十分精细的操作，耗时也非常的长。分子生物检验的试剂十分的昂贵，由于标本量少，常常也会将标本积攒起来一起检验，以节约成本。另外，虽然基因测序技术鉴定耐药基因来间接推测病原体耐药性是可行的。但该技术依赖于已知的耐药基因参照序列，无法分析未知的耐药性，而且基因型耐药和表型耐药经常存在差异。即使目前美国FDA批准的几种基因诊断方法，也必须在严格的限制条件下使用。

(2)质谱分析方法

质谱分析技术是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是先将生物分子电离，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同形成蛋白质指纹谱，然后经软件与数据库中标准指纹图谱进行对比，从而达到鉴别的目的。该技术最初应用于菌种鉴定，具有灵敏度高、快速、准确的特点，后逐渐应用于细菌耐药检测和耐药机制研究。MALDI-TOF MS技术主要是通过检测抗菌药物的修饰和水解情况来检测细菌耐药相关酶存在情况，或检测耐药株、敏感株指纹图谱的改变来判断耐药株和敏感株，从而达到检测细菌耐药性的目的。用于微生物鉴定的质谱仪包括法国生物梅里埃的Vitek-MS和德国布鲁克公司的Biotyper。Vitek-MS最初来自日本岛津公司推出的一款质谱仪Axima，其微生物数据库SARAMIS由德国Anagnos Tec公司开发。Biotyper系统是布鲁克公司独立研发的产品。这些仪器价格昂贵，基本由国外仪器厂垄断。

但该技术在细菌鉴定方面仍存在一定缺陷。由于质谱技术的理论支撑是根据样本电离后粒子的质荷比得到的图谱进行分析，所以其可靠性取决于质荷比的唯一性。然而，同样的细菌，由于培养条件或化学提取方法的不同会产生不同的质谱，从而导致分析结果的误差。即使严格控制以上条件，质谱法仍不能完全准确的测定出细菌种类。另外，与传统药敏试验相比，MALDI-TOF MS技术只能区分敏感株和耐药株，无法获得准确的MIC值，且该技术判断耐药株和敏感株需要先利用已知敏感株和耐药株建模。目前，该技术设备和配套试剂昂贵、检测耐药种类有限，制约了其在临床和基层大范围推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法和装置，所述的这种用一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法和装置要解决现有技术中测细菌耐药性的耗时长、样品准备方法复杂、易干扰的技术问题。

本发明提供了一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法，包括如下步骤：

1)从已知包含或可能包含细菌细胞的体液中通过离心或者过滤或者浓缩或者沉淀或者萃取获得细菌样品；

2)将细菌样品和抗生素稀释液同时或分步滴在载玻片上，利用盖玻片盖住并利用密封剂四边密封，形成一个板式微生化反应系统，细菌和抗生素稀释液在其中发生生化反应；

3)生化反应完全后，将所述的板式微生化反应系统安置在载物台上，通过电机带动载物台运动，采用相差显微镜进行平面扫描，观察和定位细菌；

4)利用电机带动载物台运动，将所述的板式微生化反应系统中需要分析的细菌定位在高倍光学显微镜视场中，然后通过高倍光学显微镜进一步定位，并导引激光扫描视场中所定位的细菌进行拉曼光谱成像，逐个完成显微镜视场中所需分析的细菌；

5)利用电机带动载物台运动，重复步骤4，完成所述的板式微生化反应系统中需要分析的另外细菌的拉曼光谱成像，最后通过数据分析得到所述细菌耐药性结果。

进一步的，所述板式微生化反应系统载玻片厚度小于2.5毫米，盖玻片厚度小于2.0毫米，载玻片和盖玻片的间距在1微米到5毫米之间，优选5微米到10微米之间。

进一步的，所述密封剂采用凡士林、石蜡、胶布、封口膜或油脂或密封胶。

进一步的，所述拉曼光谱扫描成像分辨率小于20微米。

本发明还提供了一种实现上述方法的装置，其包括板式微生化反应系统，所述的板式微生化反应系统包括载玻片和盖玻片，所述的盖玻片设置是所述的载玻片的上侧，所述的板式微生化反应系统设置在载物台上，所述的载物台和一个电机连接；

还包括有一个拉曼光谱激发系统，在所述的拉曼光谱激发系统中沿着激光照射方向上依次设置有一个拉曼光谱激发光源、一个第一光束整形器、激光扫描装置、一个第二光束整形器、一个第三分束镜、一个第二分束镜和物镜；

还包括有一个拉曼光谱采集系统，在所述的拉曼光谱采集系统中沿着背向拉曼散射光收集光的方向上依次设置有一个物镜、一个第二分束镜、一个滤光片、一个耦合透镜和光谱仪，所述的光谱仪、耦合透镜、滤光片、第二分束镜和物镜设置在同轴光路上；

还包括一个相差显微镜系统，在所述的相差显微镜系统成像方向上依次设置有一个第一照明光源、一个环形光阑、一个聚光器、一个相位物镜、一个第一分束镜、一个第一成像镜和第一CCD摄像头，所述的第一照明光源、环形光阑、相位物镜设置在同轴光路上，所述的第一成像镜和第一CCD摄像头设置在第一分束镜的45度的光路上；

还包括有一个高倍光学显微镜系统，所述的第三分束镜的下端设置有一个第二成像镜和第二CCD摄像头，所述的板式微生化反应系统的上端设置有一个第二照明光源，所述的第二照明光源、所述的物镜、所述的第二分束镜、所述的第三分束镜、所述的第二成像镜和所述的第二CCD摄像头构成一个高倍光学显微镜系统，所述的第二分束镜、所述的物镜、所述的第二照明光源在一个中轴线上。

进一步的，所述相位显微镜相位物镜放大倍数在20—100倍之间，优选40倍；

进一步的，所述的高倍光学显微镜物镜放大倍数在40—100倍之间，优选60倍；

进一步的，所述拉曼光谱激发系统、拉曼光谱采集系统和高倍光学显微镜系统中的激光聚焦透镜、拉曼散射光收集透镜和光学成像透镜采用同一个物镜。

进一步的，所述耦合镜至少由一个透镜组成，可以消除成像相差，用于将拉曼散射光聚焦进入光谱仪。

进一步的，所述的盖玻片和载玻片构成的空间的四周采用密封剂密封。

进一步的，所述的激光扫描装置和一个光束整形系统连接，所述的激光扫描装置和第二光束整形器设置在所述的第二分束镜的45度的光路上。

进一步的，所述的物镜、第二分束镜、第三分束镜、第二成像镜和第二CCD摄像头设置在板式微生化反应系统的下端。

进一步的，所述的第一照明光源、一个环形光阑、一个聚光器设置在板式微生化反应系统的上端，所述的相位物镜、一个第一分束镜、一个第一成像镜和第一CCD摄像头设置在板式微生化反应系统的下端。

相差显微镜的成像原理：镜检时光源通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检细胞时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的衍射。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的明暗差。

拉曼光谱分析原理是：药物和病原体细胞发生生化作用后，病原体细胞分子结构会发生变化，立即在病原体的拉曼光谱上出現反应，而对药物有抗药性的病原体细胞並不会有分子结构的变化，病原体细胞光谱维持不变。从而可以快速的反应出病原体对施加的药物有无抗药性。同时还可以获得关于多少药物浓度可以完全抑制病原体生长，知道医生精准用药。

本发明的一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法是将细菌样品取一定量和一定量抗生素稀释液混合安置在载玻片上，利用盖玻片盖住并利用密封剂四边密封，形成一个板式微生化反应系统，细菌和抗生素稀释液在其中发生生化反应。通过相差显微镜进行平面扫描观察和定位细菌，再通过高倍光学显微镜进一步定位所需要测量的细菌，利用激光扫描所定位的细菌得到细菌拉曼光谱的变化，通过分析这些细菌的拉曼光谱变化可以得到细菌耐药性情况。本发明通样品处理简单、测量速度快，是未来替代现有技术的最好选择。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明的细菌耐药性拉曼光谱检测技术可以实现对细菌快速识别鉴定、药物敏感测试等应用。而且这项技术在真菌、衣原体、病毒等耐药性检测领域也大有作为。通过后续逐步完成相关产品的研发与成果转化，可以满足精准医疗领域中对病原体临床快速、现场的需求。为医生提供一个强大的工具，在临床治疗决策中更快速的诊断疾病、更精准的使用抗生素，实现高效安全精准治疗。本发明利用相差显微镜观察定位未经染色的活的细胞。相差显微镜是依据细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过细胞时产生干涉现象，从而使原来透明的细胞表现出明显的明暗差异，能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。再通过拉曼光谱实时动态监测生物分子细胞发生的变化，研究疾病、药物或毒素的细胞反应。确定细菌药敏特性。本发明具有的极低样品消耗量、非侵入性等优点,使其在细菌、真菌、病毒和衣原体分析以及药物敏感性筛选等应用广泛。

附图说明

图1是本发明的一种通过单细胞分析检测细菌耐药性装置的结构示意图。部件名称如下：

11：第一照明光源；12：环形光阑；13：聚光器；14：载物台；15：相位物镜；16：第一分束镜17：第一成像镜；18:第一CCD摄像头；21：光谱仪；22：耦合镜；23：滤光片；24：第二分束镜；25：物镜；26：细菌样品；27：第二照明光源；31：第二CCD摄像头；32：第二成像镜；33：第三分束镜；41：拉曼光谱激发光源；42：第一光束整形器；43：激光扫描装置；44：第二光束整形器；51：盖玻片；52：密封剂；53：载玻片；54：抗生素稀释液；61：电机。

图2是40倍物镜光学显微镜下大肠杆菌图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，本发明提供了一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，包括一个板式微生化反应系统，所述的板式微生化反应系统设置有载玻片53和盖玻片51，并利用密封剂52四周密封，板式微生化反应系统安置在载物台14上，电机61与载物台14连接，带动载物台14相对运动。

还包括有一个拉曼光谱激发系统，在所述的拉曼光谱激发系统中沿着激光照射方向上依次设置有一个拉曼光谱激发光源41、一个第一光束整形器42、激光扫描装置43、一个第二光束整形器44、一个第三分束镜33、一个第二分束镜24和物镜25。

具体的，所述的激光扫描装置43和一个第二光束整形器44连接，所述的激光扫描装置43和第二光束整形器44设置在所述的第二分束镜24的45度的光路上。

还包括有一个拉曼光谱采集系统，在所述的拉曼光谱采集系统中沿着背向拉曼散射光收集光的方向上依次设置有一个物镜25、一个第二分束镜24、一个滤光片23、一个耦合镜22和光谱仪21，所述的光谱仪21、耦合镜22、滤光片23和物镜25设置在同轴光路上。

还包括一个相差显微镜系统，在所述的相差显微镜系统成像方向上依次设置有一个第一照明光源11、一个环形光阑12、一个聚光器13、一个相位物镜15、一个第一分束镜16、一个第一成像镜17和第一CCD摄像头18，所述的第一照明光源11、环形光阑12、相位物镜15设置在同轴光路上，所述的第一成像镜17和第一CCD摄像头18设置在第一分束镜16的45度的光路上；

具体的，所述的第一照明光源11、一个环形光阑12、一个聚光器13设置在板式微生化反应系统的上端，所述的相位物镜15、一个第一分束镜16、一个第一成像镜17和第一CCD摄像头18设置在板式微生化反应系统的下端。

还包括有一个高倍光学显微镜系统，采用倒置显微镜设置，在所述的高倍光学显微镜成像方向上依次设置有一个第二照明光源27、物镜25、第二分束镜24、第三分束镜33、第二成像镜32和第二CCD摄像头31，所述的第三分束镜33的下端设置有一个第二成像镜32和第二CCD摄像头31，所述的第二分束镜24、物镜25、第二照明光源27在一个中轴线上；

具体的，所述的第二照明光源27设置在板式微生化反应系统的上端，所述的物镜25、第二分束镜24、第三分束镜33、第二成像镜32和第二CCD摄像头31设置在板式微生化反应系统的下端。

本发明的观察和定位细菌的过程为：通过电机61带动载物台14运动，使用相差显微镜系统扫描板式微生化反应系统，观察和定位细菌。需要测量拉曼光谱的细菌定位后，利用电机61带动载物台14运动将所需要分析的细菌定位在高倍光学显微镜视场中，利用第二照明光源27照亮细菌样品26，然后通过物镜25和第二成像镜32放大成像到第二CCD摄像头31，进一步定位细菌样品26。

本发明的拉曼光谱扫描成像过程为：首先采用拉曼光谱激发光源41发射激光，通过第一光束整形器42整形，然后通过激光扫描装置43、第二光束整形器44、第三分束镜33、然后经过第二分束镜24反射，最后通过物镜25聚焦在细菌细胞样品26上产生拉曼散射光，一部分背向拉曼散射光又通过物镜25准直原光路返回，并通过第二分束镜24、滤光片23和耦合镜22聚焦进入光谱仪21，用于细胞拉曼光谱测量。拉曼光谱激发光源41发射的激光通过激光扫描装置43扫描以收集整个细菌细胞拉曼光谱图像。拉曼光谱激发光源41使用1064nm激光激发源，通过60倍/NA0.95物镜25将约70mW的总激光强度聚焦到细胞样品上。使用0.7μm步长扫描整个细菌细胞，整个细胞拉曼光谱积分时间为3秒。

具体的，所述的第一光束整形器42可以使横向高斯光强分布的激光变为横向均匀光强分布的激光，可以避免激光聚焦时中心激光强度过强而损伤细胞。

具体的，所述的第二光束整形器44为2.0倍扩束镜。

具体的，所述耦合镜22为焦距15mm直径20mm的非球面透镜。

本发明分析检测细菌耐药性的过程是：首先取得病人的血液，通过离心分离、0.25um滤芯过滤和每分钟650转离心浓缩，取得含菌浓缩液，采用微量注射器将含一定浓度的环丙沙星稀释液54取350微升滴在载玻片(1.2mm，石英玻璃)上，然后取300微升含菌浓缩液滴入环丙沙星稀释液54中。使用盖玻片(0.5mm，石英玻璃)盖住。使用凡士林密封，形成一个板式微生化反应系统。然后放置在保温箱中37度下保温，细菌和抗生素在其中发生生化反应。

60分钟后，开始拉曼光谱测量。首先使用相差显微镜系统扫描样品，观察和定位细菌。第一照明光源11发射照明光，通过环形光阑12和聚光器13使透过聚光器13的光线形成空心光锥，焦聚到细胞样品26上。细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过细胞时产生干涉现象，从而使原来透明的细胞表现出明显的明暗差异。利用相位物镜15和第一成像镜17，细胞样品26成像在第一CCD摄像头18，能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。

需要测量拉曼光谱的细菌定位后，利用电机61带动载物台14运动，将所需要分析的细菌定位在高倍光学显微镜视场中，然后通过高倍光学显微镜进一步定位，利用第二照明光源27照亮细菌样品26，然后通过物镜25和第二成像镜32放大成像到第二CCD摄像头31。图2显示了使用40倍物镜大肠杆菌的光学显微镜成像。最后导引激光扫描高倍光学显微镜视场中所定位的需要检测的细菌进行拉曼光谱成像。采用拉曼光谱激发光源41发射激光，通过第一整形器42整形，然后通过激光扫描装置43、第二光束整形系统44、第三分束镜33、然后经过第二分束镜24反射，最后通过物镜25聚焦在细菌细胞样品26上产生拉曼散射光，一部分背向拉曼散射光又通过物镜25准直原光路返回，并通过第二分束镜24、滤光片23和耦合镜22聚焦进入光谱仪21，用于细胞拉曼光谱测量。拉曼光谱激发光源41发射的激光通过激光扫描装置43扫描以收集整个细菌细胞拉曼光谱图像。利用电机61带动载物台14运动，将所需要分析的另外细菌定位在高倍光学显微镜视场中，逐个完成各个高倍光学显微镜视场中所需分析的细菌。最后通过分类统计、数据平均和拉曼光谱图谱分析得到所述细菌耐药性结果。

测量结果如下表所示，表1是将本发明用于用大肠杆菌和环丙沙星作用的MIC测量对比。测定的MIC值与标准方法获得的MIC完全一致。

注：BMD：传统微量肉汤稀释法；E-TEST:美国利飞驰抗生素敏感测试条；VITEK-2:法国梅里埃自动鉴定及药敏测试系统；测量时间：VITEK-2和E-TEST，16—24小时；Raman：90分钟。

拉曼光谱可以在分子水平上进行细菌耐药性鉴定，尤其对罕见细菌、慢生长细菌、未培养细菌等鉴定具有无与伦比的优势。尤其可以分析混合细菌的每个细菌种类和分布情况。

尽管描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以在本发明中进行各种修改和变化。因此，本发明旨在覆盖落入所附权利要求及其等同物的范围内的本发明修改和变化。

Claims (13)

1.一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)从已知包含或可能包含细菌细胞的体液中通过离心或者过滤或者浓缩或者沉淀或者萃取获得细菌样品；

2)将细菌样品和抗生素稀释液同时或分步滴在载玻片上，利用盖玻片盖住并利用密封剂四边密封，形成一个板式微生化反应系统，细菌和抗生素稀释液在其中发生生化反应；

3)生化反应完全后，将所述的板式微生化反应系统安置在载物台上，通过电机带动载物台运动，采用相差显微镜进行平面扫描，观察和定位细菌；

4)利用电机带动载物台运动，将所述的板式微生化反应系统中需要分析的细菌定位在高倍光学显微镜视场中，然后通过高倍光学显微镜进一步定位，并导引激光扫描视场中所定位的细菌进行拉曼光谱成像，逐个完成显微镜视场中所需分析的细菌；

5)利用电机带动载物台运动，重复步骤4)，完成所述的板式微生化反应系统中需要分析的其余细菌的拉曼光谱成像，最后通过数据分析得到所述细菌耐药性结果。

2.如权利要求1所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法，其特征在于，所述板式微生化反应系统载玻片厚度小于2.5毫米，盖玻片厚度小于2.0毫米，载玻片和盖玻片的间距在1微米到5毫米之间，优选5微米到10微米之间。

3.如权利要求1所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法，其特征在于，所述密封剂采用凡士林、石蜡、胶布、封口膜或油脂或密封胶。

4.如权利要求1所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法，其特征在于，所述拉曼光谱扫描成像分辨率小于20微米。

5.一种实现权利要求1所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法的装置，其特征在于，包括板式微生化反应系统，所述的板式微生化反应系统包括载玻片和盖玻片，所述的盖玻片设置是所述的载玻片的上侧，所述的板式微生化反应系统设置在载物台上，所述的载物台和一个电机连接；还包括有一个拉曼光谱激发系统，在所述的拉曼光谱激发系统中沿着激光照射方向上依次设置有一个拉曼光谱激发光源、一个第一光束整形器、激光扫描装置、一个第二光束整形器、一个第三分束镜、一个第二分束镜和物镜；还包括有一个拉曼光谱采集系统，在所述的拉曼光谱采集系统中沿着背向拉曼散射光收集光的方向上依次设置有一个物镜、一个第二分束镜、一个滤光片、一个耦合镜和光谱仪，所述的光谱仪、耦合镜、滤光片、第二分束镜和物镜设置在同轴光路上；还包括一个相差显微镜系统，在所述的相差显微镜系统成像方向上依次设置有一个第一照明光源、一个环形光阑、一个聚光器、一个相位物镜、一个第一分束镜、一个第一成像镜和第一CCD摄像头，所述的第一照明光源、环形光阑、相位物镜设置在同轴光路上，所述的第一成像镜和第一CCD摄像头设置在第一分束镜的45度的光路上；还包括有一个高倍光学显微镜系统，所述的第三分束镜的下端设置有一个第二成像镜和第二CCD摄像头，所述的板式微生化反应系统的上端设置有一个第二照明光源，所述的第二照明光源、所述的物镜、所述的第二分束镜、所述的第三分束镜、所述的第二成像镜和所述的第二CCD摄像头构成一个高倍光学显微镜系统，所述的第二分束镜、所述的物镜、所述的第二照明光源在一个中轴线上。

6.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述相位显微镜相位物镜放大倍数在20—100倍之间，优选40倍。

7.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述高倍光学显微镜物镜放大倍数在40—100倍之间，优选60倍。

8.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述拉曼光谱激发系统、拉曼光谱采集系统和高倍光学显微镜系统中的激光聚焦透镜、拉曼散射光收集透镜和光学成像透镜采用同一个物镜。

9.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述耦合镜至少由一个透镜组成，用于将拉曼散射光聚焦进入光谱仪。

10.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述的盖玻片和载玻片构成的空间的四周采用密封剂密封。

11.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述的激光扫描装置和一个光束整形系统连接，所述的激光扫描装置和第二光束整形器设置在所述的第二分束镜的45度的光路上。

12.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述的物镜、第二分束镜、第三分束镜、第二成像镜和第二CCD摄像头设置在板式微生化反应系统的下端。

13.根据权利要求5所述的通过单细胞分析检测细菌耐药性的装置，其特征在于，所述的第一照明光源、一个环形光阑、一个聚光器设置在板式微生化反应系统的上端，所述的相位物镜、一个第一分束镜、一个第一成像镜和第一CCD摄像头设置在板式微生化反应系统的下端。