JPH02167085A - 変異型ヒトリゾチーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術による変異型ヒトリゾチー
ムおよびその製造に関するものである。

さらに詳しくは、本発明は、天然型ヒトリゾチーム（以
下、単にヒトリゾチームともいう）のアミノ酸配列の第
１１０位のバリンか陽電荷を有する塩基性アミノ酸で置
き換えられた変異型ヒトリゾチ−ムをコードしている変
異ヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子と、シグナルペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列とを含有してなる
発現ベクター該発現ベクターで形質転換された形質転換
体、該形質転換体を用いてヒトリゾチーム活性を有する
タンパク質を製造する方法、並びにこのようにして製造
された変異型ヒトリゾチームに関するものである。

従来技術と発明が解決すべき課題 リゾチームはヒトをも含めた動物の各種組織、分泌液、
卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見出されて
いる酵素であって、細菌細胞壁のペプチドグリカンに作
用してＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサ
ミンのβ−１，４結合を加水分解することにより溶菌作
用を現す。

この溶菌作用により生成される少糖を同定することによ
って、細胞壁の化学構造に関する手懸かりが得られるの
で、リゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様
々な研究分野において有用な酵素である。リゾチームは
ニワトリの卵白から比較的容易に高純度で単離されるた
め、ニワトリリゾチームが様々な分野で利用されている
。例えば、食品保存の目的で、チーズ、ソーセージ、水
産食品などに添加されたり、牛乳のヒト母乳化の目的で
使用されている他、止血、抗炎症、組織再生、抗腫瘍活
性などの薬理活性を有することも知られており、消炎酵
素剤として市販されている。

しかしながら、上記のニワトリ卵白由来のりゾチームを
含有する物質、特に医薬においては、異種タンパクに対
する免疫応答によると思われる発疹、発赤などの過敏症
状がしばしば発現する。従って、ヒトの治療に用いる場
合、即ち医薬としてはヒトリゾチームを使用することが
好ましい。

しかしながら、ヒトの人乳や涙液から単離、精製し得る
ヒトリゾチームの量には限りがあり、上記のごとき治療
はもとより、その生体内機能等の研究に必要とされるヒ
トリゾチームを安定的に供給するには不充分である。

従って、遺伝子組換え技術を利用してヒｌ−ＩＪゾチー
ムを生産し、安定供給する試みがなされている。ヒトリ
ゾチームタンパク質は１３０個のアミノ酸からなり、そ
の配列は公知である［日本生化学会編：生化学データブ
ック巻１．１８９頁（１９７９）］。また、このアミノ
酸配列に基いて、ヒトリゾチームをコードするＤＮＡが
化学合成された［　１　ｋｅｈａｒａ、　Ｍ、ら、ケミ
カル・アンド・ファーマノニーティカル・プリテン（Ｃ
ｈｅｓ、　Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｂ　ｕｌ　１．　）旦」−
１２２０２（１９８６）コ。従って、このＤＮＡ配列を
利用し、適当な発現ベクターを構築して宿主に導入し、
得られた形質転換体を培養することにより、組換え型ヒ
トリゾチームを得ることができる。例えば、ムラキ（Ｍ
ｕｒａｋｉ）らは大腸菌を宿主としてヒトリゾチームの
直接発現を試みた［Ｍｕｒａｋｉ、Ｍ、ら、アグリカル
チユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａ
ｇｒｉｃ、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）戊０，７１３
（１９８６）］が、直接発現ではヒトリゾチーム活性を
有するタンパク質を得ることができなかった。他方、ジ
ガミらは、酵母を宿主とする分泌系発現で活性なヒトリ
ゾチームを得た［Ｊ　ｉｇａｍｉ、亡　ら、ジーン（Ｃ
；ｅｎｅ）４３．２７３（１９８６）］が、生生産量菌
体内外の総和）が少ない上、生産量中に占める分泌量の
比率も５５〜６５％であって、十分なものではなかった
。

本発明者らは、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチーム
の／グルコサミンに修飾を施し、形質転換された酵母宿
主内で発現された該タンパク質を効率よ（分泌させるリ
ーダー配列を得た（特願昭６２−０６９７６４号および
特願昭６２−６９７６５号）。次いで、本発明者らは、
天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列に修飾を施し、第
７７位と第９５位のシスティンをアラニンで置き換える
ことにより、分泌効率が高く、生産性の増大された変異
型ヒトリゾチームを得ることに成功した（特願昭６２−
２４５２８４号）。

さらに、本発明者らは、より高いヒトリゾチーム活性を
有する変異型ヒトリゾチームを得るために継続して検討
を市ねできた。

ヒトリゾチームの活性中心はアミノ酸配列３５位のグル
タミン酸と５３位のアスパラギン酸にあることか分かっ
ている。また、本発明者らは、バリン−プロリンの変換
実験を行った結果、１１０位のバリンを他のアミノ酸に
変えると、基質との結合の強さを変化させずに、比活性
のみを変化させ得ることを予想させる事実を見出した。

これらの事実に基いて、１１０位のアミノ酸が酵素活性
に影響を与えることが予測された。従って、このＶａｌ
ｌｌｏをＧｌｕ”と相互作用し易い他の適当なアミノ酸
で置換すれば、基質特異性に影響を及ぼすことなくヒト
リゾチーム活性を高め得る考えられる。そのようなアミ
ノ酸の例として、グルタミン酸が負電荷を有する酸性ア
ミノ酸であることから、陽電荷を有する塩基性アミノ酸
が考λられる。

課題を解決するための手段 本発明者らは上記の観点から、より活性の高い変異型ヒ
トリゾチームを得ることを目的として、天然型ヒトリゾ
チームのアミノ酸配列の１１０位のバリンが、陽電荷を
有する塩基性アミノ酸で置き換えられた変異型ヒトリゾ
チームをコードする変異遺伝子を得、該変異遺伝子を適
当な発現ベクターに組込んで組換え発現ベクターを構築
し、この発現ベクターで酵母宿主を形質転換して得られ
た形質転換体を培養することにより、培養物中に高活性
の、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分泌させ
ることに成功した。

即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列
の第１１０位のバリンが陽電荷を有する塩基性アミノ酸
で置き換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒ
トリゾチーム遺伝子を提供するものである。

また本発明は、変異りゾチーム遺伝子と、シグナルペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列とを含有し、真
核生物内で自律的に復製可能な発現ベクターを提供する
ものである。

さらに本発明は、上記発現ベクターで形質転換され、変
異型ヒトリゾチームを産生じ、分泌し得る形質転換体、
並びに、該形質転換体を培養し、培養液中に分ｉ、され
たヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離し、所
望により精製することからなる変異型ヒトリゾチームの
製造方法、およびこのようにして製造された変異型ヒト
リゾチームを提供するものである。

本発明の変異型ヒトリゾチームを得るために、天然型ヒ
トリゾチームの１１０位バリンと置き換え得る、陽電荷
を有する塩基性アミノ酸としては、アルギニンおよびリ
ジンを挙げることができる。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製、該遺伝子を
含有する発現ベクターの構築、該発現ベクターによる宿
主細胞の形質転換、および得られた形質転換体を用いる
変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本出願人の出願に
係る特願昭６２−２−＋　５２８４に開示した方法に準
じて行われた。

即ち、第１図に示すように、天然のヒトリゾチームのア
ミノ酸配列をフードしている合成遺伝子を含有する公知
のプラスミドｐｃＥＬ１２５［ヨンムラ（Ｋ　、　Ｙ　
ｏｓｈｉｍｕｒａ）バイオケミカル・バイオフィンカル
・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）土
工）、７１２（１９８７）］から、シグナルペプチドの
上流にのみＸｈ。

Ｉ認識部位を有するプラスミドｐＥＲ［８６０２を得る
。

次いで、プラスミドｐＥＲＩ８６０２から、シグナルペ
プチドとヒトリゾチームとをコードしているヌクレオチ
ド配列を含んだＸｈｏｌ−８ｍａｌ断片を切り出し、こ
れを、Ｍ１３ｍｐｌ　８ＲＦ［Ｍ１３ｍｐファージＤＮ
Ａの複製型（ＲＦ）］にＸｈｏｌ認識部位を挿入したフ
ァージＤＮＡの大きい方のＸｈａ　Ｉ　−Ｓ　ｍａ　Ｉ
断片と連結（ライゲー７ラン）することにより、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖
ファージＤＮＡである、Ｍ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭを得
る（第２図参照）。

このＭ１３＋ｐ１８ＸｈＬＺＭのＥｃｏＲｌ　−Ｘｈｏ
＋断片を、ｐＢＲ３２２ＸのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片
とライゲーンヨンし’ｔＴ）ＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ｂ
Ｃ）を構築する。ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構
築模式図を第３図に示す。

一方、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第１１０
位のバリンがアルギニンまたはリジンテ置換されたアミ
ノ酸配列部分をコードしている別個の２本鎖合成オリゴ
マーを合成し、これらの合成オリゴマーを、ｐＢＲ３２
２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）のＢａｍＨｌ−Ｃ１ａｌ断片とラ
イゲーションしてｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｒｇ”０
）およびｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ｌｙｓ”’）を得る
。ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｒｇ”’）の構築模式図
を第４図に、ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ｌｙｓ”’）の
構築模式図を第５図に示す。

各ＤＮＡから７グナルペプチドと変異型ヒトリゾチーム
をコードしでいるＸｈｏｌ　−３Ｉｌａｌ断片を切り出
し、上記プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の９５ｋｂ　
Ｘｈｏｌ−８ｓａＩ断片とライゲーションし、変異型ヒ
トリゾチーム発現ベクター、プラスミドｐＥＲＩ　　８
８５１およびプラスミドｐＥＲＩ８８５８を構築する。

プラスミドｐＥＲＩ　　８８５１の構築模式図、並びに
制限酵素切断地図を第６図に、プラスミドｐＥＲＩ　　
８８５８の構築模式図、並びに制限酵素切断地図を第７
図に示す。　以上に概説した一連の操作における個々の
操作は当業者によく、知られている。例えば、ＤＮＡの
クローニング等における大腸菌の形質転換は、コーエン
（Ｃ。

ｈｅｎ）らの方法［Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ　、　Ｎ　、ら、
プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）６９．２１１０（１９７
２）］によって行うことができる。

大腸菌宿主としてはＥ、ｃｏｌｉ２９４、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＤＨＬ　Ｅ、ｃｏｌｉＷ３１１０、Ｅ、ｃｏｌｉＣ６０
０などを用いることができる。

また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプラ
スミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽出法［Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，およびＤｏｌｙ、　Ｊ　、、ヌク
レイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、）７．１５１３（１９７９）］等を利用
することができる。次いで、プラスミドＤＮＡを適当な
制限酵素で処理することによって、挿入された該遺伝子
を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あるいは
ポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離する。

これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば「モレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏ
ｎｉｎｇ）（１９８２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｊに詳しく記載
されていＤＮＡの化学合成は、たとえばＣｒｅａらの方
法［Ｃｒｅａ、Ｒ，ら、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）７５．７６５（
１９７８）］などに従って行うことができる。

さらに、ＤＮＡの所望の部位に、特異的に変異を起こさ
せるためには、市販のキット（例えばアマー／ヤム社製
キットなど）が用いられ、その配列の確認には、ンデオ
キンヌクレオチド合成鎖停止法［Ｓ　ａｎｇｅｒ、　Ｆ
　、　　ら、プロシージング・オブ・ザ・す／ヨナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７４．５４６３（１９７７
）］が用いられる。

本発明の発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製
可能な発現ベクター群の内から選択されたベクターのプ
ロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードしてい
る遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入
することにより組立てられる。本明細書では、ＧＬＤプ
ロモーターを用い、天然型ヒトリゾチームをコードして
いる発現プラスミドｐＥＲ＋　　８６０２を使用して本
発明の発現プラスミドの構築例を示したが、その池、プ
ラスミドｐＰＨＯ１７、ｐｃ　Ｄ　Ｘ　［Ｏｋａｙａｍ
ａ、　ｆ（、おヨヒＢ　ｅｒｇ、　Ｐ、　、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ
ｌｆ、　Ｂ　ｉｏｌ、　）　３．２８０（１９８３）］
、ｐＫＳｖ−１Ｏ（ファルマシア社製）なども好適に使
用される。

酵母宿主の場合には、プロモーターとして、たとえばＰ
Ｈ０５プロモーター、ＧＬＤプロモータ、ＰＧＫプロモ
ーター、ＡＤＨプロモーターＰＨ○８１プロモーター、
ＧＡＬ　１プロモーターＧＡＬＩＯプロモーターなどが
、動物細胞宿主を用いた場合には、プロモーターとして
、たとえばＳＶ４０初期遺伝子プロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、ヒートショックプロモーターな
どがそれぞれ利用できる。なお発現にエンハンサ−の利
用も効果的である。

本発明のプラスミドｐＥＲＩ　　８８５１およびプラス
ミドｐＥＲＩ８８５８は、酵母宿主内で変異型ヒトリゾ
チームを発現させ、分泌させるのに好適である。と（に
好ましい宿主はサツカロマイセス０セレビシエ（Ｓ　ａ
ｃｃｈａｒｏ＋ｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　
ＡＨ２２Ｒ−である。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を、動物細胞用ベク
ターに挿入することにより、マウスＬ細胞、チャイニー
ズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）、さらには他の真核細
胞を宿主として用い得る。

真核細胞の形質転換方法は当業者既知であり、例えば酵
母の形質転換は、ヒ不ン（Ｈ１ｎｎｅｎ）らの方法［プ
ロシージンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、ｔＪｓＡ）７５，１９２７、（１９７８）］
により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋白質・核酸
・酵素・２８巻、１９８３年、“組み換え遺伝子の細胞
への導入と発現“（共立出版）」記載の方法で行うこと
ができる。

形質転換体の培養も、当業者既知の方法のいずれを用い
ても行うことができる。

酵母を使用する場合、培地としては、例えばバークホル
ダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［ボスチャン
（ＢｏｓＬｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、）ら、ブロン−ジンゲ
ス・オフ゛・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ
エンスｔＪ　Ｓ　Ａ、　７７．４５０５（１９８０）］
が挙げられる。

培養は通常１５°Ｃ〜４０°Ｃ１好ましくは２４℃〜３
７°Ｃで１０〜１４４時間゛、好ましくは２４〜９６時
間行い、必要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。

動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体を
使用する場合には、培地として例えばイーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）のＭＥＭ［ＨｌＥａｇｌｅ、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）土３０．４３２（１９５９）］、ダルベツコ
（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ）の改良イーグル培地（Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）［Ｏｒｇａ
ｄ　ＬａｕｂおよびＷｉｌｌｉａｍＪ　、　Ｒｕｔｔｅ
ｒｓ　ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）２５８．６
０４３（１９８３）］などが挙げられる。培養は通常３
０〜４２℃、好ましくは３５℃〜３７℃で約１〜１０日
間行う。

培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離す
る。本発明の発現ベクターによれば、生成した変異型ヒ
トリゾチームは効率良く分泌されるので、上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波Ｎｌｌ演法フレンチプレスなど
を利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解
酵素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する
。

さらに必要ならば、トリトン−Ｘ１００．デオキシコー
レートなとの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱
、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰ　ＬＣ，Ｆ　Ｐ　ＬＣ等）な
どに従って精製することができる。

このようにして得られた形質転換体培養物から分離した
培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを＃７Ｉ製単離
し、その活性を後述のアッセイ法で測定し、比活性を求
めたところ、天然型のヒトリゾチームをコードしている
発現ベクターを用いて調製された形質転換体の場合と比
較すると、本発明の変異型ヒトリゾチーム形質転換体は
、従来のものよりも高い比活性を有するタンパク質を生
産することが分かった。

即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺１云子を含んだ発
現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体
を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活
性を有するタンパク質を単離し、所望により常法にした
がって精製することにより、容易かつ簡便に一定した、
高活性の、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質（変
異型ヒトリゾチーム）を得ることができる。

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味
においても、本発明を制限するものではない。

実施例１　クローニングベクターｐＢＲ３２２Ｘの構築 大腸菌ベクターｐＢＲ３２２（５μｇ）に制限酵素Ｂａ
１ｌ（１，５ユニツト）を加え、４０μ９の反応液［１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、ｌＱｍＭＭ
ｇＣｌ、、１ｍＭジチオスレイトール］中で３７°Ｃ１
５時間反応させた後、常法通りフェノール抽出し、次い
で、ＤＮＡをエタノール沈殴させた。このＤＮＡにリン
酸化したＸｈｏｌリンカ−ｄ［ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ］［
二ニー・イングランド・バイオラボ（ＮＥＢ）社！２］
５０ｎｇを加え、常法に従ってＴ４ＤＮリガーゼで両者
を結合させた。

この反応液で大腸菌ＤＨＩ株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性、テトラサイクリン１耐性コロニーから
、アルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、［３ａｌｌ認
識部位がＸｈｏｌ認識部位に変換されたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２Ｘを得た。

実施例２　プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の構築’）
　　１．６ｋｂ、　　８．３ｋｂ断片の調製ＢａｍＨＩ
用緩衝液［６ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐＨ７９）
、１５０ｍＭＮａｃｌ、６　ＩＩＭ　ＭｇＣＩ−］　１
００μｇ中で化学合成したヒトリゾチーム遺伝子を含有
しているプラスミドｐＧＥＬ１２５［ヨシムラ（Ｋ　、
　Ｙ　ｏｓｈ　ｉｍｕｒａ）前掲コ４８．５μｇに６０
０のＢａｇｌ−１１（ベーリンガーマンハイム山之内製
）を加えて３７°Ｃで２時間反応させたのち、常法通り
、冷エタノールを加えてＤＮＡを集めた。このＤＮＡを
、上記Ｂａｍ１Ｈ用緩衝液（１００μの中で４０ＵのＸ
ｈｏｌ（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて３７
°Ｃで１５分間部分消化したのち、６０°Ｃで１５分間
加熱して反応を停止させた。この反応液を０．７％アガ
ロース電気泳動にかけ、１．６ｋｂ断片を含むゲルを切
り取り、電気泳動溶出によってケルから抽出した。

同様の方法で４８．５μｇのｐＧＥＬ１２５を６０Ｕの
ＢａｍＨＩで消化し、常法に従ってエタノールでＤＮＡ
を沈澱させた。このＤＮＡＩＺＢａｍＨＪ用緩衝液中で
８０ＵのＸｈｏｌを３７°Ｃで２時間作用させたのち、
前記１．６ｋｂ断片と全く同様の方法で、プラスミドｐ
ＧＥＬ１２５からプロモータ、シグナル配列、およびヒ
トリゾチームコード領域か除去された８、３ｋｂのＢａ
ｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片を調製した。

）Ｓｍａｌ認識配列を含む合成オリゴマーの調製ｐＧＥ
ＬＩ２５のヒトリゾチーム遺伝子の３”末端側のＸｈｏ
ｌ切断部位を５ＩＩｌａＩ切断部位に変換するために、
常法に従い、”ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ３″を合成した。

ｉｉｉ　）　　ｌ　、　６　ｋｂ断片と合成オリゴマー
の連結）で得た合成オリゴマー（ｌｏＯｎｇ）と１．６
ｋｂ断片（２μｇ）を２０μａのライゲーション用緩衝
液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、１０
ｍＭＭｇＣｌ、、２０ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、ｌ＊ＭＡＴＰ、ｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（ＮＥＢ製）８００　Ｕを加えて１４°Ｃで一夜反応さ
せ、ＤＮＡを結合させた。常法に従い、エタノールを加
えてＤＮＡを集めたのち、ｌ　００　ｕ（ｌのＢａｍＨ
Ｉ用緩衝液に溶かし、３６ＵのＢａｍＨＩを加えて３７
°Ｃで１時間反応させ、同様にエタ／−ルを加えてＤＮ
Ａを集めた。次にこのＤＮＡを５０μＱのＳ　ｍａ　Ｉ
用緩衝液［２０ｍＭＫＣｌ、ｌＱｍＭＴｒｉＳ−トＩＣ
１（ｐＨ８，０）、　１　０　ｍＭ　　ＭｇＣＬ、　１
ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ　］に溶かし、２１ＵのＳｍａｌ（宝／
７ｊ造製）を加えて３０°Ｃで１時間反応させた。これ
を０．７％アガロース電気泳動にかけ、常法通り所望の
部分を切り出し、電気泳動溶出によって１．６ｋｂのＢ
ａｍＨＩ　−Ｓｍａｌ断片を得た。

１Ｖ）８．３ｋｂ断片と合成オリゴマーの連結ｌ１１）
と全く同様にして、ｌμｇの８．３ｋｂ断片と１１００
ｎの合成オリゴマーとを連結したのち、同様にＢａｍＨ
Ｉ、およびＳ　ｍａ　Ｉで処理して電気泳動にかけ８．
３ｋｂのＢａｍＨＩ　−Ｓｍａｌ断片を得た。

ｖ）　　１．６ｋｂＢａｍＨＩ−Ｓｍａ＋断片と８．３
ｋｂＢａｍＨ１−Ｓｍａｌ断片七の連結 ｉｖ）で得た８、３ｋｂ断片（１２０ｎｇ）と１．６ｋ
ｔ）断片（３６０μｇ）を１００μＱのライゲーション
用緩衝液（（ｉｉｉ　）に同じ）中で８００ＵのＴ　４
　Ｄ　Ｎ　Ａリガーセ（Ｎ　Ｅ　Ｂ製）を加えて１４°
Ｃ−夜反応させた。

そのｌ１５ｆｆｉを用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌを形質
転換し、プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２を得た。

プラスミドｐＧＥＬ１２５およびプラスミドｐＥＲＩ８
６０２の制限酵素切断地図およびプラスミドｐＥＲ＋　
　８６０２の構築模式図を第１図に示す。

実施例３　　Ｍ１３ｍｐ１８ＸｈＬＺＭの構築）ヒトリ
ゾチーム遺伝子を含むＸｈｏｌ　−３ｅａｌ断片の調製 実施例２て調製したプラスミドｐＥＲ＋　　８６０２　
１１００ｎを実施例２記載の方法に従ってＸｈ。

ｌＳＳｍａ＋で切断し、シグナル配列コード領域および
ヒトリゾチーム遺伝子を含むＸｈｏｌ　−５ｅａｌ断片
を調製した。

）Ｍ１３ｍｐ１８へのＸｈｏｌ制限部位の導入Ｍ１３ｍ
ｐ１８の復製型（ＲＦ）（宝酒造１２）２．４μｇを３
０ａＱのＨｉｎｄｌｌｌ用緩衝液［５０ｍＭ　Ｎ　ａＣ
ｌ。

１０　ＩＩＩＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１（１）Ｉ−１７、
５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭＤＴＴ］中で２
７０のＨｉｎｄｌｌ！（ベーリンガーマンハイム山之内
製）と３７℃で２時間反応させたのち、常法通り冷エタ
ノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。

一方、常法に従って合成した２本のオリゴマー５°ＴＣ
ＧＡＧＧＣＣＡ”（１００ｎｇ）および”ＡＧＣＴ　Ｔ
　Ｇ　Ｇ　ＣＣ（１００ｎｇ）をＡＴＰを含まないライ
ゲーション用緩衝液（前出）２０μａ中で８０°Ｃ１５
分処理したのち、室を品まで徐々に冷却して二本鎖とし
た。この反応液に上で得たＨｉｎｄｌ［Ｉ処理したＭ１
３ｍｐ１８ＲＦ５００ｎｇとＡＴＰをＩｍＭとなるよう
に加え、１４°Ｃで一夜反応させた。次にこの１／１Ｏ
ｆｆｌをＥ、ｃｏｌｉＴＧ　ｌに感染させ、常法に従い
Ｘｈｏｌ切断部位をもったＭｌ：３＋ｐ１８ＲＦを得た
。この５μｇを実施例２、ｉｉｉ　）記載の方法でＸｈ
ｏｌおよび５ｅａｌで処理し、エタノールで沈澱させた
。

ｉｉｉ）Ｍ１３ｍＰｌ　８ＸｈＬＺＭの構築）で調製し
たＸｈｏｌ−３ｅａｌ断片３００　ｎｇと１）で調製し
たＭ１３ｍｐ１８を含む大きいＸｈｏｌＳｍａｌ断片１
００　ｎｇとを５０μｅのライゲーション用緩衝液（前
出）中４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ！２）と
１４°Ｃで一夜反応させ、その１１５量をＥ、ｃｏｌｉ
ＴＧ　１に感染させ、Ｍ１３ａｐ１８ＸｈＬＺＭＲＦを
得た。

Ｍｌ　３ＩＩｌｐｌ　８ＸｈＬＺＭの構築模式図を第２
図に示す。

実施例４　ヒトリゾチーム遺伝子へのＢａｍＨＩおよび
Ｃ１ａｒ認織部位の造成 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の１１０位バリン
を他のアミノ酸に変換するために、オリゴヌクレオチド
−ブイレフティノド、インピトロムタケ不ノスシステム
（アマ−ジャム社製キット）を用い、カセット式変異法
で、上記１１０位バリンをコードするコドンの両側にＢ
ａｍＨｌおよびＣＩａｌ認識部位を造成した。

）ＢａｍＨＩ認識部位およびＣ１ａｌ認識部位造成のた
めのオリゴマーの合成 常法に従って次のオリゴマー（５０マー）を合成した。

ＧＡＧＣＣＴＧＧＧ下ＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡす。

また、下線は、５′側から順番に、新たに造成されたＢ
ａｍＨＩ認識部位およびＣ１ａｌ認識部位を示す。

なお、この変換でもコードするアミノ酸の種類はもとの
ままである。

上線で示したＧＴＣコドンは、１１０位バリンをコード
している。

）アニーリングおよびライゲーション 実施例３で得たＭｌ　３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭの単鎖Ｄ
ＮＡ　１０μ９を含む溶液（５μＱ）、５゛をリン酸化
したオリゴマー（〜１　、６　ｐｍｏｌ／　ｕの（５μ
ｆり、緩衝液１（７μのおよび水（１７μのを混合し、
８０′Ｃで３分間処理したのち、室温で３０分間放置し
た。この反応液にＭｇＣｌ＊＋（１（ｌ　Ｏμ０、ヌク
レオチド混ｉ＆ｌ　（３８ａ（１）、水（１０，ｃｌ）
、クレノーフラグメント（１２Ｕ）、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（１２Ｕ）を加え、１４°Ｃで一夜反応させた。反応
液をニトロセルロースフィルターで濾過シ、未反応の単
鎖ＤＮＡを除去したのち、常法に従いエタノールでＤＮ
Ａを沈澱させ、５０μρの緩衝液２に溶解した。

山）変異ＤＮＡを含むプラスミドによる大腸菌の形質転
換 ｉｉ　）ｔ’得りＤ　Ｎ　Ａ溶液５０μ＋！＋；Ｄ内１
０μｇに、６５μＱの緩衝液３と５ＵのＮｃｉ＋を加え
３７°Ｃで９０分間反応させて変異していないＤＮＡに
二。

りを入れた。反応後さらに５００＋ｎＭ　ＮａＣＩ（１
２μの、緩衝液４（１０μρ）、エキソヌクレアーゼＩ
ＩＩ（５０Ｕ）（２μＱ）を加えて、３７°Ｃで３０分
間反応させ、ニックを入れたＤＮＡを消化した。

次に７０°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活させた。冷
却後、ヌクレオチドｌ昆液２（１３μｍ２）、ＭｇＣ＋
、液（５μｆり、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（３Ｕ）、Ｔ
４ＤＮＡｌ［−ゼ（２０）を加えて１４°Ｃｔ’４時間
反応させた。この反応１ｆｆ１２０μｇを用い、Ｅ、Ｃ
０１ｉＴＧｌを形質転換した。

ｉｖ）変異ＤＮＡの調製と変異の確認 １ｉｉ）で得た形質転換体をＹＴ寒天培地（バクトドリ
プトン８ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、　ＮａＣｌ２５ｇ
。

寒天１５ｇ、水ＩＯにまき、プラークを生じさせた。プ
ラークを採取し、Ｅ、ｃｏｌｉＴＧ　ｌに感染させ、こ
れをＹＴ培地で３７°Ｃにおいて一夜、液体培養し、培
養上清を集めた。この上清１ｍＱにＰＥＧ／ＮａＣ１（
２０％ポリエチレングリコール６０００．２，５ＭＮａ
Ｃ１）２００μＩ２を加え、よ（混合して１５分間放置
したのち、遠心分離して上清を除去した。沈澱にＴＥ緩
衝液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ＋、１ｍＭ　ＥＤＴＡＳ
ｐＨ８，ｏ）（１００μのおよび、ＴＥ緩衝液飽和フェ
ノール（５０μのを加えてよく攪拌したのち、遠心分離
し、水層を採取した。この水層に冷エタノールを加えて
、単鎖ＤＮＡを沈澱させた。この単離ＤＮＡを鋳型とし
てジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法によって塩基配
列を決定し、目的通り変異したＤＮＡを数種得た。

実施例５　変異したヒトリゾチーム遺伝子のｐＢＲ３２
２Ｘへの組み込み ）ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏｌ認識部位を末端にもツｐＢＲ３
２２Ｘの調製 実施例１で調製したｐＢＲ３２２Ｘ（３μｇ）に制限酵
素ＥｃｏＲ［（１５Ｕ）とＸｈｏｌ（１６Ｕ）とを加え
、ＥｃｏＲＩ緩衝ｌ夜（ベーりンガーマンノ＼イム社製
）１００μｇ中で３７℃において２時間反応させた後、
フェノール抽出、エタノール沈殿に付し、ＤＮＡ混合物
を得た。

得られたＤＮＡ混合物を１．０％アガロースゲル電気泳
動にかけて大きい断片を切り出し、電気泳動溶出によっ
てゲルから抽出した。

）Ｍｌ　３ｍｐｌ　８ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）からのＢａｍ
Ｈｌ、Ｃ１ａＩ認識部位を有するヒトリゾチーム遺伝子
の調製 上記Ｉ）と同様にして、制限酵素処理、電気泳動溶出を
行い、実施例３で得たＭ１３ｎｐ１８ＸｈＬＺＭ（ＢＣ
８２０μｇ）からヒトリゾチーム遺伝子を含むＥｃｏＲ
［−Ｘｈｏｌ断片を調製した。

ｉｉｉ）ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の調製）で得
たｐＢＲ３２２Ｘの大きい方のＥｃｏＲＩ−Ｘ　ｈｏ　
Ｉ断片（２５０ｎｇ）とｉｉ）で得たヒトリゾチーム遺
伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ［断片（１２０ｎｇ）と
をＴ４リガーゼ（８００Ｕ）の存在下、１４°Ｃで一夜
反応させてライゲート（連結）した。このライゲージジ
ン混合物を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、ブラスミ
ＦｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）を得た。プラスミド
ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構築模式図を第３図
に示す。

実ｍ例６　１１０位のアミノ酸がアルギニンに変換され
たヒトリゾチームの遺伝子の調製）ｔ、／ａ１１１０を
Δｒｇ１１０に変換するためのオリゴマーの合成 常法に従って、以下の２本のオリゴマーを合成した。

ｒｇ１１０ （１）　”ＧＡＴＣＣＧＡ　ＧＣＣＴＧＧ　ＡＧＧ　Ｇ
ＣＴ　ＴＧＧ　ＡＧＡ＾＾Ｔ（２）　　　　　ＧＣＴ　
ＣＧＧ　ＡＣＣＴＣＣＣＧＡ　ＡＣＣＴＣＴ　ＴＴＡ　
ＧＣ’）ｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）のＢａｍＨｌ
およびＣ１ａｌ処理 実施例５で得たｐＢＲ３２２ＸｈＬｚＭ（ＢＣ）（１０
０ｎｇ）を、Ｃ１ａｌ（６０Ｌ］）を含んだＴＡ緩衝液
（０’　Ｆ　ａｒｒｅｌｌら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇ　ｅｎ
、　Ｇ　ｅｎｅｔ、、１７９．４２　］−４３５（１９
８０））５００μＣ中、３７°Ｃで３時間反応させた後
、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。このＤＮＡに蒸留水
４４０μＱを加えて溶解させ、ＢａＩＩＩＨＩ緩衝液（
ベーリンガー社製）５０　ａＱ、　ＢａｎＨｒ　１０　
μｍ２（９０Ｕ）を加え、３０℃で一夜反応させた。こ
の半量を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方
の断片を切り出し、電気泳動溶出してｐＢＲ３２２Ｘｈ
ＬＺＭ（ＢＣ）の大きい断片を得た。

ｉｉｉ　）アニーリングおよびライゲーションｉ）で得
た合成オリゴマー（１）および（２）夫々５００ｎｇを
用い、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ２μｅ（１４Ｕ）、ＩＯｎ＋
ＭＡＴＰ３μＱ、１０×ライゲーシヨン緩衝液（前出）
３μＱを含む３０μＱ中で、３７°Ｃにおいて３０分間
反応させた後、６５°Ｃで１５分間加熱して反応を止め
た。

次いで、このようにして得たＤＮＡ断片１７ｎｇと１）
で得たｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の大きい断片５
０ｎｇとをタカラ（ＴＡＫＡＲＡ）ライゲーションキッ
ト（宝酒造製）中で１４°Ｃにおいて１時間反応させ、
この半量を使ってＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌを形質転換した
。このようにして得られたプラスミドを大腸菌から抽出
してｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｒｇ■０）と命名した
。この変異ヒトリゾチーム遺伝子を常法通りジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法でその塩基配列を決定し、所
望のＤＮＡが挿入されていることを確認した。プラスミ
ドｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬＺＭ（Ａｒｇ目’）の構築模式
図を第４図に示す。

実施例７　プラスミドｐＥＲＩ８８５１の構築実施例６
、ｉｉｉ　）で得たｐＢ　Ｒ３２２ＸｈＬ　ＺＭ（Ａｒ
ｇｌｌｌｌ）を大腸菌ＤＨＩから常法に従って調製した
後、実施例２、■）に記載の方法に従ってＸｈｏｌおよ
びＳ　ｍａ　Ｉで処理して、シグナル配列のコード領域
と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むＸｈｏＩＳｅａｌ
断片（ａ）を得た。一方ブラスミドｐＥＲＩ８６０２を
同様にＸｈｏｌおよびＳ　ｍａ　Ｉで処理したのち、常
法通り電気泳動によって９．５ｋｂのＸｈ。

１−３ｍａｌ断片（ｂ）を単離した。

次いで、これらのＤＮＡ断片（ａ）および（ｂ）のそれ
ぞれ、１０ｎｇと３０ｎｇを２０ｔｔＱのライゲーショ
ン用緩衝液中で実施例２．１ｉｉ）と同様に反応させて
連結し、この反応混合物でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌを形質
転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含有しているプラスミド数種を得、その−っをｐＥＲ
Ｉ　　８８５１と命名した。プラスミドｐＥＲＩ　　８
８５１の構築模式図を第６図に示す。

実施例８１１０位のアミノ酸がリジンに変換されたヒト
リゾチームの遺伝子の調製 ）ＶａｌｌｌｏをＬｙＳｌｌｏに変換するためのオリゴ
マーの合成 常法に従って、以下の２本のオリゴマーを合成した。

（２）　　　　　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＣＧ
Ａ　ＡＣＣＴＣＴ　ＴＴＡ　ＧＣ”）ｐＢＲ３２２Ｘｈ
ＬＺＭ（ＢＣ）のＢａｍＨｌおよびＣ１ａｌ処理 実施例５で得たｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）（１０
０ｎｇ）を、Ｃ１ａｌ（６００）を含んだＴＡ緩衝液（
０’　Ｆ　ａｒｒｅｌｌら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇ　ｅｎ、
　Ｇ　ｅｎｅＬ、、１７９．４２１−４３５（１９８０
））５００μρ中、３７°Ｃで３時間反応させた後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈殿させた。このＤＮＡに蒸留水４４
０μＱを加えて溶解させ、Ｂａ＠ＨＩ緩衝液（ベーリン
ガー社製）５０　ｕＱ、　ＢａｍＨＩ　Ｉ　Ｏ、ｃｌ（
９０Ｕ）を加え、３０°Ｃで一夜反応させた。この半量
を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方の断片
を切り出し、電気泳動溶出してｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ
（ＢＣ）の大きい断片を得た。

■）アニーリングおよびライゲーション）で得た合成オ
リゴマー（１）および（２）夫々５００ｎｇを用い、Ｔ
４ＤＮＡキナーゼ２μＱ（１４Ｕ）、ＩＯＩＩＩＭ　Ａ
ＴＰ３μｌｌ、ＩＯＸライゲー’ｙＢンｖ＆街液（前出
）３μｌｌｆ＆−含む３０μσ中で、３７°Ｃにおいて
３０分間反応させた後、６５°Ｃで１５分間加熱して反
応を止めた。

次いで、このようにして得たＤＮＡ断片１７ｎｇとｉｉ
）で得たｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の大きい断片
５０ｎｇとをタカラ（ＴＡＫＡＲＡ）ライゲーションキ
ット（宝酒造製）中で１４℃において１時間反応させ、
この半１を使ってＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩヲ形質転換した
。このようにして得られたプラスミドを大腸菌から抽出
してｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ｌ　ｙ　ｓ　Ｉ　’　Ｑ
　）と命名した。この変異ヒトリゾチーム遺伝子を常法
通りジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法でその塩基配
列を決定し、所望のＤＮＡが挿入されていることを確認
した。プラスミドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ｌｙｓ”’
）の構築模式図を第５図に示す。

実施例９　プラスミドｐＥＲＩ８８５８の構築実施例８
、ｉｉｉ　）　テ得たｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（Ｌｙｓ
目０）を大腸菌ＤＨＩから常法に従って調製した後、実
施例２、ｉｉｉ　）に記載の方法に従ってＸｈｏｌおよ
びＳ　ｍａ　ｌで処理して、シグナル配列のコード領域
と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むＸｈｏｌＳ　ｍａ
　＋断片（ａ）を得た。一方プラスミドｐＥＲＩ８６０
２を同様にＸｈｏＩおよびＳｍａｌで処理したのち、常
法通り電気泳動によって９．５ｋｂのＸｈ。

１−３＠ａｌ断片（ｂ）を単離した。

次いで、これらのＤＮＡ断片（ａ）および（ｂ）のそれ
ぞれ、Ｌｏｎｇと３０ｎｇを２０μＱのライゲーション
用緩衝液中で実施例２、ｉｉｉ　）と同様に反応させて
連結し、この反応混合物でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌを形質
転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含有しているプラスミド数種を得、その一つをｐＥＲ
Ｉ　　８８５８と命名した。ブラスミ、ドｐＥＲＩ　　
８８５８の構築模式図を第７図に示す。

実施例１０　　酵母形質転換体の調製 実施例７または実施例９で得た発現プラスミドｐＥＲＩ
　　８８５１またはｐＥＲｌ　　８８５８を用い、ヒネ
ンらの方法（前出）に従い、Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ
−を形質転換し、それぞれ、形質転換体Ｓ、セレビシェ
ＡＨ２２Ｒ〜／ｐＥＲＩ８８５１およびＳ、セレビシェ
ＡＨ２２Ｒ−／ｐＥＲｌ　　８８５８を得た。前者の菌
株は、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥ
ＲＭ　Ｐ１０２５８で寄託されている（受託日：昭和６
３年８月３１日）。

実施例１１　　形質転換体Ｓ、セレピ／工ＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲＩ８８５１およびＳ、セレビシェＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲ＋　　８８５８の培養実施例１０で得た形質転
換体Ｓ、セレビシェ八へ２２Ｒ−／ｐＥＲＩ　　８８５
１およびＳ、セレビシェＡＨ２２Ｒ〜／ｐＥＲＩ８８５
８を、別々に試験管中のパークホルダー（Ｂ　ｕｒｋｈ
ｏｌｄｅｒ）　［アメリカンージャーナルーオフ・ボタ
ニー（Ａ自ｅｒ、　Ｊ　、　Ｂｏｔ。

）旦麿、２０６（１９４３）］の改変培地１１１（ＩＱ
当たりＫＨｚＰＯ＋０．４ｇ、グルコース１０ｇ、アス
パラギン５ｇ、シュークロース８０ｇを含有）５−に接
種し、３０℃で７２時間振盪培養した。得られた各培養
液１−をそれぞれ上記培地■４−を含む試験管へ移し、
３０°Ｃで１日振盪培養した。各培養液２−を上記培地
［１８−を含む２０〇−容三角フラスコに移し、３０°
Ｃで振盪培養し、７２時間後に培養液を採取し、アッセ
イ用試料の調製に用いた。

実施例１２　アッセイ試料の調製 実施例１１で得た各培養液を遠心分離し、上清と菌体を
分離した。上清はアッセイに供し、菌体は１．２Ｍスク
ロースを含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐｌ−！７．
０）で洗浄した後、ライモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓ
ｅ）　［生化学工業（株）製］を０　、５　ＪＩｇ／　
ｍＱになるように加えた同バ・７フアーに懸濁し、室温
で２時間反応させた。これらの反応液に４倍量の５０ｍ
Ｍリン酸バッフ７　　（ｐＨ７，０）［１０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む］を加え、室温で１時間
反応させたのち、上清を集めてそれぞれ、菌体抽出液と
した。

実施例１３　変異型ヒトリゾチーム産生量の測定実施例
１２で得た上清と菌体抽出液とをそれぞれ、変異型ヒト
リゾチームのアッセイに供した。

ヒトリゾチーム活性の測定は、実質上ワーシントン・エ
ンザイム・マニュアル（Ｗｏｒｔｈｉｇｔｏｎ　Ｅ　ｎ
ｚｙｍｅ　Ｍａｎｕａｌ、ｐｌｏｏ、Ｗｏｒｔｈｉｇｔ
ｏｎ　Ｂ　１ｏｃｈｅ＋ｏｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　　ｌ　９７２）によった。

標準ヒトリゾチームとしてはングマ（Ｓ　ｉｇｕｍａ）
社製を使用した。ｌ単位は、０．１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ６，９）中でマイクロコツカス・ルテウス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）（生化学工業社製
）を基質として２５°Ｃで１分間反応させ、４５０ＪＩ
μの吸収を０００１減少させるに必要な酵素量とした。

各試料について同様の実験を３回行って得たヒトリゾチ
ーム活性で表した産生１は、以下の表Ｉに示す通りであ
った。なお、天然型のヒトリゾチームを産生ずる形質転
換体Ｓ、セレビンエＡＨ２２Ｒ／ｐＧＥＬ−ＣＬＩＯ（
ＦＥＲＩｖｔｐ−９２８５）を対照として同様に培養し
、本発明の形質転換体におけるヒトリゾチーム活性を有
するタンパク質の産生量と比較した。結果を表１に示す
。

表−十 ／ｐＥ　Ｒｌ　　８８５１　（Ｎｏ、　Ｉ）τ砥阿十１
　分泌された変異型ヒトリゾチームの精製 実施例７で得た形質転換体Ｓ、セレビンエＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲ［８８５１を実施例９に示した培地５１を含む
試験管に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。次に、
上記培地１８−を含有する２００１容三角フラスコに、
上の培養液２ｍ＆を移し、３０°Ｃで１日振盪培養した
。次に上記培地２５０ｍｆ！を含有するＩＱ容三角フラ
スコにこの培養液２０ｍｆｌ！を移し、３０°Ｃで３日
間培養した。この培養液を遠心分離機にかけ、上ｌ＾と
菌体を分離した。この上清く約ＩＱ）を５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化した陽イオン
交換樹脂（Ｉ　ｎｄｉｏｎ）カラム（０，７ｃｎＸ　１
５ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液３０ｍ１ｌで洗浄後、Ｑ
、５ＭＮａＣＱを含む同緩衝液で溶出した。溶出液を１
ｍＱずつ分取し、各フラクンヨンについて実施例１３に
従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチーム活性が最
大となるフラク／ｇンを取り、これを高速液体クロマト
グラフ　イー（Ａｓａｈｉｐａｋ５０２　Ｃ）により、
さらに精製した。５０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を含
む０．６Ｍ硫酸ナトリウム０−３０％の直線濃度勾配に
より３０分間溶出を行い、保持時間２５１２５分に現れ
る２８０ｎｍの吸収ピークを分取し、これをＲ１１０と
した。この溶出パターンを第８図に示す。

同様にして、実施例９で得た形質転換体Ｓ、セレビンエ
ＡＨ２２Ｒ−／ｐＥＲｌ　　８８５８を培養し、培養物
を処理して高速液体クロマトグラフィー（Ａｓａｈｉｐ
ａｋ５０２　Ｃ）にかけ、保持時間２４゜６９８分に現
れる２８０ｎｍの吸収ピークを分取して目的の変異型ヒ
トリゾチームＫ　１１０を得た。

Ｋ　口＋１の溶出パターンを第９図に示す。

及鞭鯉上互　精製変異型ヒトリゾチームＲＩＩＯおよび
に１１０の分析 実施例１４で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品、
Ｒ１１０およびＫ　１１０について比活性を測定した。

タンパク質の定量は市販のヒトリゾチーム（／グマ辻）
を標準としてＢＣＡプロティンアッセイ試薬（ピアス社
）を用いて行った。その結果、市販の天然型ヒトリゾチ
ームの比活性を１００としたとき、変異型ヒトリゾチー
ムＲ１１０の比活性は１．１３、Ｋ　ＩＩｏの比活性は
１２６と高いことが分かった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＥＲＩ８６０２の構築模式図、並
びにプラスミドｐＧＥＬ１２５およびプラスミドＰＥＲ
Ｉ　　８６０２の制限酵素切断地図、第２図はＭｌ　３
ｓｐｌ　８ＸｈＬＺＭの構築模式図、第３図はプラスミ
ドｐＢＲ３２２ＸｈＬＺＭ（ＢＣ）の構築模式図、並び
に制限酵素切断地図、第４図はプラスミドｐＢ　Ｒ３２
２ＸｈＬ　ＺＭ（Ａｒｇ”’）の構築模式図、並びに制
限酵素切断地図、第５図はプラスミドｐＢＲ３２２Ｘｈ
ＬＺＭ（Ｌｙｓ”’）の構築模式図、並びに制限酵素切
断地図、第６図はプラスミドｐＥＲＩ８８５１の構築模
式図、並びに制限酵素切断地図、第７図はプラスミドｐ
ＥＲＩ８８５８の構築模式図、並びに制限酵素切断地図
、第８図はＡｓａｈｉｐａｋ５０２　ＣによるＲ　１１
０の溶出状態を示すグラフであり、第９図はＡｓａｈｉ
ｐａｋ５０２ｃによるＫＩＩＯの溶出状態を示すグラフ
である。 特許出顎人　　株式会社蛋白工学研究所代　理　人　　
弁理士　青白　葆（外２名）第３図 第８図 イＡ（才今　時　間 （分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第１１０位
   のバリンが陽電荷を有する塩基性アミノ酸で置き換えら
   れたポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾチーム
   遺伝子。 ２、陽電荷を有する塩基性アミノ酸がアルギニンまたは
   リジンである請求項１記載の変異ヒトリゾチーム遺伝子
   。 ３、請求項１または２に記載の変異ヒトリゾチーム遺伝
   子と、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド
   配列とを含有し、真核生物内で自律的に複製可能な発現
   ベクター。 ４、プラスミドｐＥＲＩ８８５１またはプラスミドｐＥ
   ＲＩ８８５８である請求項３に記載の発現ベクター。 ５、請求項３または４に記載の発現ベクターで形質転換
   されており、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得
   る宿主細胞。 ６、形質転換体サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２
   Ｒ＾−／ｐＥＲＩ８８５１またはサッカロマイセス・セ
   レビシエＡＨ２２Ｒ＾−／ｐＥＲＩ８８５８である請求
   項５に記載の宿主細胞。 ７、請求項５または６のいずれかに記載の形質転換体を
   培養し、培養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有
   するタンパク質を分離し、所望により精製することから
   なる変異型ヒトリゾチームの製造方法。 ８、請求項７に記載の方法で製造された変異型ヒトリゾ
   チーム。