JPH02142487A - 糸状菌からの多糖の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 背景 本発明は生体高分子、殊に多糖、の製造のための固定化
系における糸状菌の使用に関する。さらに、本発明は真
菌を多孔性非粒状支持体の表面上に固定し、つなぎとめ
て固定化細胞系を形成させる多糖の製造のために糸状菌
を使用することに関する。

多糖、殊にスクレログルカン、は典型的には糸状菌から
バッチかくはんタンク発酵装置中の液内培養により製造
された。しかし、細胞増殖および生成物形成の結果であ
る系における高い粘度が発酵法の転化効率を制限する。

発酵系の粘度がバッチ操作の間に上昇するのでグルコー
スの多糖への転化が低下する。高い粘度およびバイオマ
スが多くの運転問題を生じ、高い製品コストを生ずる。

従って、糸状菌からの生体高分子、殊に多糖、の製造に
対する新規な一層有効な方法を見出すことは有益である
。

糸状菌の培養は生ずるバイオマスおよび生成物に関連す
る粘度のために、それに関連する多くの困難を有する。

糸状菌に対する典型的な細胞固定化技術はカルシウムア
ルギナートカラゲナンなどを用いる取込法である。アト
キンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）ほかに対する米国特許第
４，５８２．６００号には実質的空隙率を有する網状多
重支持体構造中の取込によるバイオマスの増殖装置が記
載されている。これらの典型的な方法は、粘性真菌系に
おいて小多重支持体が増殖過度になり発酵中に不十分な
物質移動を生ずるので糸状菌での利用性が限定されてい
る。さらに、グルコースの比例的に高い割合がその系中
でバイオマスに転化される。

その結果、生存系における生化学物質の製造および生化
学物質の変換に対する固定化技術の採用に関心があった
。固定化技術が微生物からの生体高分子の製造に使用さ
れた、米国特許第４．３８４．０４４号参照。しかし、
糸状菌からの高分子量生体高分子の製造に対する固定化
技術の良好な使用が存在しなかった。

本発明により固定支持体上の糸状菌の受動的固定化が生
体高分子の製造に十分適することが見出された。多孔性
非粒状支持体の使用が、栄養培地にさらされるがしかし
その中に含まれない菌糸表面を与える。さらに、本発明
の方法において、真菌フィラメントが支持体の表面に固
定され、従ってバイオマスからの粘度寄与が低下され、
生体高分子生成物が自由に培地中へ分泌される。系の全
体の粘度は非固定化系におけるよりも低く、バイオリア
クター内に高い細胞濃度があり、高い総括生産性を生ず
る。

本発明の目的は真菌が支持体に固定される固定化細胞系
中で糸状菌から生体高分子を製造することである。本発
明の他の目的は固定化系中の糸状菌に対する増殖条件を
最適化することである。本発明の他の目的は固定した固
定化バイオリアクター系中の糸状菌から低い総括粘度で
多糖、殊にスクレログルカン、を製造することである。

本発明の他の目的は剛性固定化系をバッチ、半バッチお
よび連続発酵モデルで用いてプロセス効率を最適化する
ことである。

これらおよび他の目的並びに公知方法にまさる利点は以
下の記載から明らかになり、こ＼に記載され特許請求さ
れる発明により達成される。

発明の概要 バイオリアクター中で糸状菌により作られた生成物を回
収する方法が見出された。

さらに、多糖、殊にスクレログルカン、を糸状菌から回
収するために、真凹が固定化細胞リアククー系中の多孔
性非粒状不活性固定支持体の表面に付着し、水性栄養培
地が固定化細胞バイオリアクターを通過し、多糖含有培
地がバイオリアクターから回収され、そして（または）
それを通して再循環される方法が見出された。

本発明の方法は、バイオリアクター内の糸状菌であるバ
イオマスの大部分を固定化することによりバイオリアク
ターの粘度を有意に低下し、従って生成物回収を改良す
る。

本発明の方法は、糸状菌から製造された多糖が工業およ
び食品用途において粘性付与剤、結合剤、増粘剤および
安定剤として有用である点で有用である。

発明の詳細な説明 本発明の方法は糸状菌により作られる生成物を製造する
ための固定支持体上の糸状菌の固定化を含む。この方法
は一般に、液体培地中で好気性条件下に増殖したときに
生成物殊に細胞外水溶性高分子を生ずる糸状菌に適用で
きる。

本発明の方法に使用される典型的な糸状菌は属スクレロ
チウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）　、スクレロチニア（
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、コルチカム（ＣＯｒｔｉＣ
ｕｍ）、ヘロチウム（ｌｌｅｌｏｔｉｕｍ）　、スクロ
マチニア（Ｓｔｒｏｍａｔ−ｉｎｉａ）　、クラビセプ
ス（Ｃ１ａｖｉｃｅｐｓ）などに属する。

本発明の方法により多糖を生成する生物体にはスクレロ
チウム・グルカニカム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍｇｌｕｃ
ａｎｉｃｕｍ）　、スクレロチウム・デルフィニイ（Ｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　　ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ）、スクレ
ロチウム・コフェイコラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　　
ｃｏｆｆｅｉｃｏｌｕｍ）、シゾフィラム・コムーネ（
Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　　ｃｏｍｍｕｎｅ）、ス
クレロチウム・ロルフシイ　（Ｓ（１６ｒｏｔｉｕｍｒ
ｏｌｆｓｉｉ）、コルチシウム・ロルシイ　（Ｃｏｒｔ
ｉｃｉｕｍｒｏｌｓｉｉ）　、スクレロチニア・グラト
ド（Ｓｃｌｅｒｏｔｉ−ｎｉａ　　ｇｌａｄｏｄ　）　
、ストロマチニア・ナルシッシ（Ｓｔｒｏｍａｔｉｎｉ
ａ　　ｎａｒｃｉｓｓｉ）などが含まれ、しかしそれら
に限定されない。ハレック（Ｈａｌｌｅｃｋ）に対する
米国特許第３，３（１０）．８４８号中に挙げられた生
物体は本発明に使用される生物体として包含される。

本発明の方法を用いて糸状菌により製造される生成物に
は生体高分子、タンパク質、二次代謝産物、多糖などが
含まれる。

本発明により製造される典型的な多糖はグルカンなどで
ある。一般に、グルカンは１−３結合Ｄ−グルコシル単
位に特徴があり、単位の若干が１−６結合により結合さ
れた側鎖を含む。

本発明の方法により製造される好例のグルカン生成物に
はスクレログルカン、シゾフィラムなどが含まれ、しか
しそれらに限定されない、スクレログルカンは属スクレ
ロチウムの糸状菌により、殊にスクレロチウム・ロルフ
シイ、スクレロチウム・グルカニカム、スクレロチウム
・デルフイニイ、スクレロチウム・コフェイコラムなど
により生成される。シゾフィラン、細胞外多糖、は属シ
ゾフィラムの真菌により、殊にシゾフィラム・コムーネ
により生成される。スクレログルカンおよびシゾフィラ
ンは次のように確認される：多糖は１−３接合Ｄ−グリ
コジル単位の直鎮であり、直鎖の約３０〜約３５％が１
−６結合により結合された１個のＤ−グリコジル単位を
含む。平均分子量は５Ｘ１０’以上である。それらは非
イオン性ホモ多糖である。連鎖は三重らせん配列に自己
会合する。それらは水に溶解して擬似塑性溶液を形成す
る。スクレログルカンまたはシゾフィラン溶液は約ｐＨ
１，５〜約ｐＨ１０の広いｐＨ範囲内、約１０〜約２０
％の塩濃度の範囲内、および約０〜約１２１℃の温度で
安定である。

普通の方法が本発明の方法による糸状菌の培養に使用さ
れる。本発明の方法による糸状菌の培養に使用される典
型的な培養法にはバッチ発酵、流加、半連続発酵、連続
発酵などが含まれ、しかしそれらに限定されない。

バイオリアクターは容器内に収容された固定マトリック
ス支持体材料を含む。マトリックスは液体栄養培地中に
浸漬される。マトリックスは糸状菌を上に固定する１つ
またはそれ以上の非粒状支持体を含む。支持体材料は非
分解性であることができ、好ましくは非分解性である。

支持体材料は非粒状である。マトリックスの大きさは事
実上固定化バイオリアクターの運転条件により決定され
る。支持体マトリックスの個々の成分は約１／１６イン
チ以上〜１インチ以上の奥行、６インチ以上〜１００フ
ィートの高さ、２インチ以上〜５０フィート以上の幅の
範囲にわたることが認められた。

支持体材料は剛性または非剛性材料であることができる
。非剛性シートは適当な材料例えば針金、棒、架設アン
グル、スクリーンなどにより支持することができ、次い
でそれが適所に固定される。

個々の非粒状支持体材料はマトリックス中に固定され、
それらが運転可能であり、表面を横切って培地を通させ
る限り任意の配置に配列される。

−ｉに、支持体材料の細孔は０．１　鶴以上であるべき
である。支持体材料の細孔大きさは２５０孔／インチ以
下で、４孔／インチ以上、最も好ましくは約１０孔／イ
ンチである。

糸状菌はバイオリアクター中の支持体材料上に付着し、
落着く。支持体は固定される。支持体材料は使用条件の
もとて化学的および（または）生物学的に不活性である
。支持体に適する適当な材料には合成開細孔重合体例え
ば開細孔網状フオーム、ポリウレタン網状フオーム、ナ
イロン土壌浸食制御ブランケット、繊維性コーティング
、圧縮繊維材料、セラミック材料、ポリウレタンなどが
含まれ、しかしそれらに限定されない。好ましい材料は
開細孔網状フオームおよびポリウレタン網状フオームで
ある。

容器中に収容された支持体は、所望真菌生物体を接種さ
れる栄養増殖培地中に懸吊される。容器に充填された接
種され、支持体を含む増殖培地は次いで生物体の増殖を
与える適当な条件下にインキュベートされ、それにより
通気培地がバイオリアクター中に連続的再循環されて真
菌の付着および増殖に対する条件を与える。バイオリア
クター中に接種された糸状菌は固定支持体マトリックス
と相互作用し支持体に付着し、それに取込まれる。

固定された真菌は成長し、支持体マトリックスの表面上
に菌叢を生ずる。液体培地および空気がハウジング全体
に通され、好ましくは支持体材料の全表面が栄養培地お
よび空気の流動流を利用できる。菌糸は酸素、栄養素の
供給および画表面からの生成物生体高分子の除去に十分
な速度の通気培地の流れにより連続的に浴される。溶性
多糖生成物は培地流により運び出される。付着および多
糖の生成後に新鮮な培地をバイオリアクターに添加する
ことができる。培地流は再循環または処理してバッチ、
半連続または連続的に多糖生成物を回収することができ
る。多糖は普通の回収技術により培地から回収される。

さらに多糖は常法により精製することができる。

水性栄養培地は真菌による多糖の製造に対して基質を与
えるべきである。水性栄養培地は通常同化性炭素および
窒素源、有機物質並びに必要であれば微量有機および無
機栄養素例えば微量塩、微量元素、ビタミン、アミノ酸
などを含む。

種々の炭素源が、殊に菌の増殖およびグルカンの生成に
対して基質炭素に関して特殊培養基を必要としない属ス
クレロチウムの種に対し有用である。典型的な炭素源に
はグルコース、マル十−ス、ガラクトース、スクロース
、マンノース、フルクトース、セロビオース、アラビノ
ース、キシロース、ラクトースなどが含まれ、しかしそ
れらに限定されない。グルコースは好ましい炭素源であ
る。

適当な窒素源には有機および無機窒素物質例えば酵母エ
キス、コーンステイープリカー、コーンミール、大豆粉
、尿素、ペプトン、気体アンモニア、アンモニウム塩、
カゼイン氷解物、硝酸ナトリウムなどが含まれ、しかし
それらに制限されない。

無機栄養素の例には含リン、リン酸塩、リン酸二カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩
化コバルト、硫酸第一マンガン、リン酸二ナトリウムな
どが含まれ、しかしそれらに限定されない。

本発明の他の態様は、グルコースまたはグルコースオリ
ゴマーが約１．０〜約１０．０重量％、好ましくは約２
．０〜約４．５％、最も好ましくは約２．１〜約３．５
重量％の濃度で培地中に使用されるときに本発明の方法
で改良されたグルカン合成があることを見出したことで
ある。これらのグルコース濃度範囲内で菌の増殖が低く
、合成されて蓄積されるグルカンの生成が高い。

本発明の方法は基質の高割合が生成物合成に使用されて
バイオマスの生成に向けられないことができる点で有利
である。この方法は低いバイオマス粘度を生じ、従って
生成物濃度が単位粘度当りに高い。フィラメントは支持
体マトリックスに固定され、多糖溶液は菌のバイオマス
を比較約合まない。従って、系の全体の粘度が低下され
る。この方法は多糖グルカン生成物の回収および分離を
簡単にし、また菌に対する培地栄養素の良好な移動を容
易にする。本発明の方法は他の系に比べて単位粘度当り
で高い生成物濃度、低いバイオマス、従って川下処理の
縮少を生ずる。

特定の態様 以下の実施例はさらに本発明を例示する。これらの態様
は例として与えられ、発明の範囲の限定としてではない
。さらに、変形および改変が当業者により発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく行なわれることができる
ものと思われる。

物質および方法 抹胞よ堕堰殖条且 スクレロチウム・ロルフシイＡ　Ｔ　ＣＣ１５２０６は
サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）のデキストロース寒天
平板上の栄養増殖後に発生した菌核として保存培養中に
維持された。菌核を次の、水１１当り、約４５ｇグルコ
ース；約２．０ｇＮａＮ０＋　　：約１．０ｇＫＨｚ　
ＰＯ２；約１．５ｇＭεＳＯ４；および約２．５ｇコー
ンステイープソリッドからなる培地上の約４日の初期増
殖期により培養に移行させた。この培地を全増殖系に用
いた。培地のｐＨは約ｐＨ４，５であった。スクレロチ
ウム・ロルフシイ菌糸を無菌ワーリング・プレンダー（
Ｗａｒｉｎｇ　Ｂｌｅｎｄｅｒ）中に細胞の容積の約２
倍の容積の無菌培地とともに入れ、約２０秒間低速でせ
ん断した。生じた接種材料をフラスコ中に全フラスコ容
積に対して約Ａまたはそれ未満の容積が含まれるまで入
れ、約２８℃で約２５ＯＲＰＭの回転振とうで約７２時
間インキュベートした。インキュベート期の終りに培養
を約２７．０００Ｘ　ｇで約２０℃で約３０分間遠心分
離した。上澄みを捕集し、細胞ペレットを秤量し、かく
はんタンク発酵装置または固定化バイオリアクターの継
代培養に８％重量／容量（以下ｒｗ／ｖＪとして示す）
の標準割合で使用した。

バイ第１アクタ−および 開１０孔毎インチ網状ポリウレタンフォーム〔レクチセ
ル・フオーム社（Ｒｅｃｔｉｃｅｌ　Ｆｏａｍ　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｃｈａｒｄｏｎ、　０ｈｉｏ）か
ら入手可能）をＳ、ロルフシイの受動吸着に対するマト
リックスとして用いた。ポリウレタンフォームのシート
を平板ポリカーボネート装置中にしっかりと収容した。

フオームをアセンブリー中に配置した後、装置をボルト
で固定し、約１２１℃で約３０分間オートクレーブ処理
により滅菌した。滅菌した入口および出口配管を、外部
培地溜めとして役立つ約２１のフラスコに連結した。外
部溜めとフラットプレートアセンブリーとの間の培地の
再循環のためにポンプを用いた。バイオリアクターはフ
オームマトリックスを適所に配置して培地約１．ｅの容
積を有した。さらに１１の培地が一般に外部溜め中に保
持された。

装置は、培地および空気が平板アセンブリーに入る前に
混合され、次いで平板アセンブリー中へ平板アセンブリ
ーの両側上、底近くの入口口を通してポンプで送られる
配置で運転した。培地およびガスは再循環の間のアセン
ブリーの両側上、頂部近くに配置された出口口を通して
移動させた。

新無菌培地を含む平板装置に、前記のように予め増殖さ
せたスクレロチウム・ロルフシイ約８％ｗ　／　ｖを接
種した。平板装置は約２４時間培地の循環なく通気し、
約１２〜約９６時間支持体上に真菌を吸着および定着さ
せた。バイオリアクターを約２２℃の室温で運転した。

培地のバッチを系中で約２４〜約４８時間循環した。次
いで排液し、新無菌培地約２．５１バッチを再装填した
。バイオリアクター系中の培地の循環は平板装置の成分
から上部へ約１６０ｍｆｆ１／分で生じた。

系の性能を測定するために、ブロスを少くとも１日１回
試料採取した。約５０−のブロスを溜めからピペットで
とり、約２７，０ＯＯＸ　ｇで約１５分間約２００℃で
遠心分離して細胞砕片を除き、次いでブロスを基質濃度
、生成物濃度および粘度のモニターに用いた。

光醍装皿 スクレロチウム・ロルフシイの継代培養接種材料を上記
のように調製し、２１のブラウン・バイオスタート（［
１ｒａｕｎ　Ｂｉｏｓｔａｔ）　Ｍ発酵装置容器に加え
た。通気は空気１容量対培地１容量で開始した。

インペラー速度は約８０ＯＲＰＭに七ソトシた。

発酵装置培養は約４０時間行なった。

遠心分離したプロス約５１ｎ１を濃塩酸約２０ミクロリ
ツトルで酸性にした。次いでアセトン約１０−を加え、
溶液を激しく渦動させた。沈殿したスクレログルカンを
ガラス棒上に巻きつけることにより捕集し、予め秤量し
たアルミニウム秤量ボートに入れた。試料を強制通風炉
中で約７０℃で約７２時間乾燥した。試料を秤量し、ス
クレログルカン乾燥重量を、乾燥試料を含む予め秤量し
たボートと試料ないボートとの間の重量の差として決定
した。

猪度皿定 粘度は小試料アダプターを備えたブルックフィールドＬ
ＶＴＤ粘度計を用いて約２５℃で測定した。遠心分離し
たブロス約１５ｎ＋Ｉｌを、適当なスピンドルを取付け
た粘度計の試料アダプター中へ流し込んだ。各試料に対
し、６０．３０．１２および６回転毎分の４つの異なる
スピンドル速度で約２５℃で約１２０スピンドル回転で
読みをとった。

次いで特定スピンドル／速度の組合せで得られた読みを
、定数であり、ブルックフィールド工学研究所（Ｂｒｏ
ｏｋｆｉｅｌｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）により提供された因子をかけて溶液の
粘度（ｃｐｓ）を得た。

バイオマス　燥 バイオマスを約２０℃で約３０分間約 ２７、ＯＯＯＸｇで遠心分離することによりブロスから
分離した。次いでベレット化したバイオマスを約７０℃
で約９６時間強制通風炉中に置き、次いで秤量した。次
いでバイオマス乾燥重量を算出した。

五止二ニス皿定 グルコースは炭水化物カラムおよび屈折率検出器を備え
た高速液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ。

ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、
　Ｍ＾）から入手できる］を用いて測定した。移動相は
約８０：２０のアセトニトリル：水で構成した。試料は
バイオマスを除くために遠心分離により調製し、次いで
１：２の試料対アセトニトリル希釈物を調製し、それに
よりアセトニトリルがグルカンを沈殿させ、次いで溶液
を約０．２ミクロンシリンジフィルターに通して濾過し
た。グルコースピーク量を、未知グルコ−スピーク量ク
積を、試験して面積をインチグレークー／プリンター中
に蓄えたグルコース校正標準と比較することにより定量
化した。

実施例　１ ポリカーボネートアセンブリー中に収容した約１０孔毎
インチ網状ポリウレタンフォームの約８’Ｘ１１“×３
７４“片を前記のようにＳ、ロルフシイとともにインキ
エベートした。

生物体の増殖は、マトリックス上の菌細胞塊の増加によ
り証明されるように良好であった。この増殖の期間中、
系の粘度は徐々に上昇した。その結果、第１バツチの培
地プロス（レザバーと称す）の粘度は１００ｃｐｓ　　
（ｉ　０．３秒−１で）を越えなかった。排液し、新培
地（すなわちレザバー２〜１２）で置換したときに粘度
の上昇はレザバー１より大きかった。レザバーの排液お
よび新培地による系の再装填の実施は次の約２１日間行
なった。

２つの別々の実験の結果が表■および■中に示される。

各レザバー使用の持続期間に対する粘度上昇は表■およ
び■中に示される。

表 ■ 表 ■ ７２．０ ６６．５ ２９．５ ２５．０ ４７．０ ４２．５ ３０．０ ２４．０ ２４．０ ４２．０ ４６．５ ５４．５ １４、８２ ２０、４７ ２２、１８ ２１．１０ ２８、１８ ２９、９３ ２４、２５ １ｇ、　１２ １７、７２ ２１．４４ ２３、８２ １４、７６ ０、２０？ ０、３０８ ０、７５２ ０．８４４ ０、６００ ０．７０４ ０、８０８ ０、７６６ ０、７３６ ０．５１０ ０．５１０ ０、２７０ ０．８７ ０．５１ Ｏ４５０ ０，５３ ０，７０ ０，７５ ０，６１ Ｏ６４５ ０，４４ ０，５４ ０，６０ ０，８７ ２７，８１ ２９、９６ ３２，９１ １６、４７ ２３，５０ ３６、２３ ２０、５３ ２７、４５ ３１，５０ １６、，６８ ０、８１２ ０、６３７ ０、６７２ ０、５４９ ０、５００ ０、９０６ ０、６４２ ０゜６５４ ０、６０６ ０、４１７ ０．６２ ０．６７ ０．７３ ０．３７ ０．５２ ０．８１ ０．４６ ０．６１ ０．７０ ０．３７ 表 ■ 表 ■ この２１日間の連続運転の間に、菌バイオマスの大部分
はマトリックスにしっかり付着および吸着して保持され
た。その結果、培地ブロスは細胞砕片を比較約合まず、
低速遠心分離により容易に清澄化することができた。

比較例 発酵を２１かくはんタンク発酵装置（ブラウン・バイオ
スタートＭ）中で行なった。生産性はアセトン沈殿グル
カン乾燥型Ｉにより測定し、結果は表Ｖ中に示される。

平均生産性は０．３０２ｇ／ｌ／時であった。バッチ運
転発酵は標準８％（ｗ／ｖ）Ｓ、ロイフシイ接種材料で
開始した持続時間で２８〜４４時間であった。

表　　　　Ｖ 持続時間　　　スクレログルカン生産性２８時間　　　
　０．２１ｇ／β／時 ４０時間　　　　０．３８ｇ／β／時 ４３時間　　　　０．３５ｇ／ｌ／時 ４４時間　　　　０．２７ｇ／Ｉ／時 実施例　２ ポリカーボネートアセンブリー中に収容した約１０孔毎
インチ網状ポリウレタンフォームの約８“×１１“Ｘ３
／４”片を前記のようにＳ、ロルフシイで接種した。

再循環の開始約４８時間後に培地の約１７容量％を取出
し、約４５ｇ毎ｌのグルコースを含む新党全培地を系に
再装填した。約２４時間後、さらに培地の１５容量％を
取出し、置換した。約１５〜２０％の培地交換の前記方
法に従って次の５日間行なった。この期間中に粘度は約
２１０ｃｐｓ（１０，３秒−１で）に上昇した。この粘
度に達したとき、系中のグルコース濃度は、培地の取出
しおよびグルコースを含まない栄養培地による置換によ
り約４“０グラム毎リツトルから約２０グラム毎リツト
ルに低下された。グルコース濃度は次の８日間約２０グ
ラム毎リツトルに維持された。このグルコース濃度の維
持は系の粘度に有意な低下を生じた。約１１ｃｐｓ　　
（１０，３秒−１で）の低水準に達した後、系は濃グル
コース溶液を用いて再装填され、それが全グルコース濃
度を約４５グラム毎リフドルに上昇させた。表■に示さ
れるように、系の粘度は非常に徐々ではあるが上昇した
。

またグルコース濃度を約２０グラム毎リツトルで維持し
たときにマトリックス上および系中の菌バイオマスの量
が増加した。増加したバイオマスが不十分な流れおよび
培地循環特性を生じ、それがバイオリアクターアセンブ
リー中に流れない分離した領域を生じた。グルコース濃
度を約２０グラム毎リツトルから約４５グラム毎リツト
ルに増加させたときに菌バイオマスの増殖の減退がみら
れ、グルカン合成の尺度である系の粘度が上昇した。

スー　　　ＶＩ− 実施例　３ この実験に用いた方法および装置は前記に類似するが、
しかし次の変更を挿入した。１０孔毎インチを有する２
つの８″Ｘｌｌ“×３７８“網状ポリウレタンフォーム
片からなるマトリックスを背中合せに同次元のポリプロ
ピレン大細孔フィルター片に接着した。このマトリック
ス中のポリプロピレンシートはフオームの支持および剛
性を与える働きをした。

約９６時間の吸着および増殖期が終った後、系中の培地
を排出させ、約４５グラム毎リツトルのグルコースを含
む完全培地で置換させた。次いで系中の培地を少くとも
２４時間毎に１回試料採取し、グルコース濃度および粘
度を調べた。グルコース濃度はこの間隔中濃グルコース
溶液の添加により約４５グラム毎リツトルに維持された
。運転第９日後に装置中の増殖は安定化したと思われ、
２５０ｃｐｓ　　（１０，３秒−′）のブロス粘度が維
持された。次いでグルコース濃度を調節し、約２７〜約
３６グラム毎リツトルのグルコースの範囲内に保持した
。グルカン含有培地約２５０〜約４５０ミリリツトルを
約２４時間毎に取出して置換させ；約７〜約１２グラム
毎リツトルのグルコースが約２４時間の間に消費された
。系はこのグルコース濃度で９日間運転した。

１８日の連続運転後、系中のブロスは４５０ｃｐｓ（１
０，３秒−１）以上の粘度に達した。グルコース濃度を
再び変更し、このときは４０グラム毎リットル以上に上
げた。次の６日間、グルコースの濃度をこの水準で維持
した。この間隔の間、ブロスの粘度はグルコースの濃度
が約３０グラム毎リツトルであった前の６日の運転から
１０〜１５％以上変動しなかった。この６日の間、装置
中のバイオマスは一定に保たれ、あるとしても非常に少
ない増加を示したと思われる。

吸着された菌バイオマスが、粘度の上昇により測定して
いかに速くグルカンを合成できたかを決定するために、
系中のブロスを排出し、約３０グラム毎リツトルグルコ
ースを含む新培地で置換した。系中のブロスを置換した
ときに粘度は約５．０ｃｐｓに低下した。しかし、約２
４時間内に粘度が激しく上界したことが認められ、培地
の置換後約４８時間内にブロスの粘度が置換前の水準で
安定化した。

約８週間続けた残りの実験の間、培地のグルコース濃度
は約２７〜約３５グラム毎リツトルの範囲内に維持した
。グルカン含有培地約２５０〜約４００ミリリツトルを
約２４時間毎に採取した。

マトリックス上および系中のバイオマスの量はこの試験
の過程中に激しい増加が見られなかった。

マトリックス上の過度増殖および実施例２で遭遇したレ
ザバー中の懸濁細胞物質の問題はこ＼に用いた条件のも
とで遭遇されなかった。

表■は実験の結果を示し、粘度はこの系中のグルカン合
成の尺度であると思われる。

手 続 補 正 書 （方式） １、事件の表示 平成１年特許願第１５４３７９号 ２発明の名称 糸状菌からの多糖の製造 ３、？１１ｉ正をする者 事件との関係

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）糸状菌から多糖を製造する方法であって、固定化
   細胞バイオリアクターに糸状菌を接種し、糸状菌を、バ
   イオリアクター中に浸漬された多孔性、非粒状の固定さ
   れた支持体材料の表面上に受動的に付着、固定させ、真
   菌をバイオリアクター中で少くとも２時間、水性栄養培
   地をバイオリアクター全体に循環しながらインキュベー
   トし、増殖培地を供給し、バイオリアクターから多糖含
   有培地を回収することを含む方法。
2. （２）多糖含有培地がバイオリアクターを通して再循環
   され、バッチ、流加、半バッチまたは連続方式で運転さ
   れる、請求項（１）記載の方法。
3. （３）糸状菌がスクレロチウム、シゾフィラム、スクレ
   ロチニア、コルチカム、ヘロチウム、クラビセプスおよ
   びストロマチニアからなる属から選ばれる、請求項（１
   ）記載の方法。
4. （４）糸状菌がスクレロチウム・グルカニカム、スクレ
   ロチウム・デルフィニイ、スクレロチウム・コフェイコ
   ラム、シゾフィラム・コムーネ、スクレロチウム・ロル
   フシイ、コルチシウム・ロルシイ、スクレロリニア・グ
   ラドドおよびストロマチニア・ナルシッシからなる群か
   ら選ばれる、請求項（３）記載の方法。
5. （５）製造される多糖がスクレログルカンまたはシゾフ
   ィランである、請求項（１）記載の方法。
6. （６）糸状菌により製造される生成物が生体高分子、タ
   ンパク質、二次代謝産物およびそれらの組合せである、
   請求項（１）記載の方法。
7. （７）支持体材料が非粒状であり、細孔が０．１ｍｍよ
   り大きい、請求項（１）記載の方法。
8. （８）支持体材料が約１／１６インチ以上〜１インチ以
   上の奥行、６インチ以上〜１００フィート以上の高さ、
   および２インチ以上〜５０フィート以上の幅の範囲であ
   る、請求項（１）記載の方法。
9. （９）支持体材料の細孔大きさが２５０孔／インチ以下
   で４孔／インチ以上である、請求項（１）記載の方法。
10. （１０）回収多糖が培地から回収され、分離される、請
    求項（１）記載の方法。
11. （１１）回収多糖が精製される、請求項（１０）記載の
    方法。
12. （１２）支持体材料の細孔大きさが約１０孔／インチで
    ある、請求項（１）記載の方法。
13. （１３）支持体材料が合成開細孔重合体から選ばれる、
    請求項（１）記載の方法。
14. （１４）支持体材料が網状フォーム、ポリウレタン網状
    フォーム、ナイロン土壌浸食制御ブランケット、繊維性
    コーティング、圧縮繊維材料、セラミック材料、ポリウ
    レタンおよびそれらの組合せから選ばれる、請求項（１
    ）記載の方法。
15. （１５）支持体材料が網状フォームおよびポリウレタン
    網状フォームから選ばれる、請求項（１４）記載の方法
    。
16. （１６）水性培地が通気される、請求項（１）記載の方
    法。
17. （１７）水性栄養培地が同化性炭素、窒素源、有機物質
    並びに、微量元素、ビタミンおよびアミノ酸から選ばれ
    る微量有機栄養素を含む、請求項（１）記載の方法。
18. （１８）水性栄養培地が約１．０〜約１０．０重量％の
    グルコースを含む、請求項（１）記載の方法。
19. （１９）水性栄養培地が約２．０〜約４．５重量％のグ
    ルコースを含む、請求項（１８）記載の方法。
20. （２０）水性栄養培地が約２．１〜約３．５重量％のグ
    ルコースを含む、請求項（１９）記載の方法。
21. （２１）糸状菌から多糖を製造する方法であって、固定
    化細胞バイオリアクターに糸状菌を接種し、糸状菌を、
    バイオリアクター中に浸出された多孔性、非粒状の固定
    された支持体材料の表面上に付着、固定させ、真菌をバ
    イオリアクター中で少くとも２時間、水性栄養培地をバ
    イオリアクター全体に循環しながらインキュベートし、
    培地は約２０〜約４５重量％のグルコースを含み、バイ
    オリアクターから多糖含有培地を回収することを含む方
    法。
22. （２２）グルコース濃度が約１．０〜約１０．０重量％
    である、請求項（２１）記載の方法。
23. （２３）グルコース濃度がグルコース約２．０〜約４．
    ５重量％である、請求項（２２）記載の方法。
24. （２４）グルコース濃度がグルコース約２．１〜約３．
    ５重量％である、請求項（２３）記載の方法。
25. （２５）多糖が回収培地から回収され、分離される、請
    求項（２１）記載の方法。