JPH02119775A - 細胞傷害性カリクレイン、その製造法および細胞傷害剤としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業１−の利用分野〉 本発明は、医学、生理学および免疫学的研究もしく　（
を病気の予防および冶ｆり（こ使用な細胞傷害性のカリ
９しイン（ｋａｌｌ＋ｌ〜ｒｅｉｎ）、その製造法およ
びキ■胞傷害剤とシ／゛この使用（こ関する。

〈従来の技術〉 カリ９しインは、活性部位ζこ反応性ヒスチジンＪ５よ
ひセ１ｊ：、−残Ｊ、（をイ１する蛋白質分解酵素（セ
リンフ）−ｒ　５２アーセ）であって　ヒトのキＩＩ　
Ｎ、お、Ｌひ面Ｗ４’４中にり、出され、特にキｆ１織
カリクレイシは脳動脈硬化ｆｊ１＼゛）高血圧Ｌ１’、
　ＯＪ　Ｊ′−防、））よひ／４１゛た（、１治療ζご
広く臨床利用さ）１．でいる１、一方、免投学的ζ７二
は、セノンフ１コテアー七はキ■胞傷害性′Ｆ袖胞やＮ
　Ｋ細胞等の細胞用害作用の重要か因子であることか示
唆されでおり、牛体のキ■胞性免疫に：Ｆ−；　Ｇ：ｌ
る季■胞傷害の機構を解明するためにもその分離が求め
られてきた。１ノかし、Ｊ：たその確認もされていなか
った。

〈発明か解決り、ようとする課題〉 このよう（ごカリクレインは、脳動脈硬化症や高血圧症
用の医療薬剤として才３よひ伺究用試薬として広＜Ｔ；
ザかある。従来の製造方法によると、医療用のものはフ
タの膵臓やヒトの尿からの分離枯製物が利用されている
。しかし、この方法では相科に制限があり、精製工程が
複雑であることから製品の不足と高価格が問題となって
いる。他の動物からの分離精製も試みられており、いく
つかの酵素が単離精製されてヒトのものとの異同も明ら
かになってきた。しかし、い１゛れも収率か低くに程か
複雑であるという難点がある。

一方、細胞傷害性のセリンブ［ｌテアーセについては、
■−記のようにその存在が確認されるに至っていなかっ
た。

本発明は、以りのような１＋’ｆｆ来技術の間頴点を解
決し、精製工程が簡単てあ・ってかつ細胞傷害性を有す
るカリクレインを動物組織からｔ）ることを可能にする
、製造法を提供するものである。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者は、細胞傷害性カリクしインをマウス顎Ｆ腺か
ら分離することに成功Ｌノた。その分離精製法は従来法
に較へて極めて容易であり、分離精製された物質がカリ
クレインであることを同定し・、これか細胞傷害性を有
することを確認した。

マウスは、例えばＢＡＩＢ／ｃマウスを用いろ。マウス
の顎下腺を摘出Ｌ／て計量し・、これに１０〜２０羞（
Ｗ／Ｖ）のイークル・−ミニマムエセンシＡ・ルメシウ
ム（卜ＩＥＭ）を加えてホモシフ−卜した後、・１°Ｃ
で１００．０ＯＯＸ　ｇて１時間遠心分離し、その−１
１清液の願下線抽出ン１ンを得る。この抽出液をセファ
デックス（Ｊ−５０ゲルクロマトクラフイーで分画して
第１図に示ずようなビークＢの画分を得る。このＢ画分
をざらに逆相高速液体り［１マドクラフイー（１円−Ｃ
）で分画して第２図に示ずようなビークＣの画分を得る
。

このビークＣの両分は、セリンプロテアーゼであること
、その中のカリクレインであること、さらに細胞傷害性
を有ずろこと、を次のようにして確認した。

（１）セリンブｌ＝１テアーセの基質であるｌ・シルア
ルキニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）ここよってセリン
プロテアーゼの活性が認められた。さらに、セリンプロ
テアーセ阻害剤であるシイソプロビルフルオルホスファ
ターセ（ＤＦＰ）およびファニルメチルスルフォニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）を用いてセリンプロテアーセ作
用が隋書されることを確認した。

（２）　　ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、分子ｉ　２７　、０００の牟−ハントを得た。ざら
にメルカプト」−タノールｌ呑ノ用ゲルを用いて、１７
．００（ｌおよび１０，０００の二つのバンドを得た。

（３）　　（２）の単一・ハンドのタンパク質のアミノ
酸配列を調へてこれがカリクレインと同一・であること
を確認した。

（１１）胸腺細胞を標的細胞として用いるトリバンブル
ー色素排除試験によって細胞傷害性を確認した。この他
に、標的細胞としては、牌細胞、Ｔリンパ球、］３リン
パ球、腫瘍化マウス線維等細胞（１９２９株）等を用い
て細胞傷害性が認められた。

以下に実施例を示す。特に記載がない限りパーセント表
示は重量パーセントを表す。

実施例１； Ｆｉ週令の雄のＢＡＬＤ／　Ｃマウスの顎丁腺を摘出し
て（４，０ｇ）、これニ２０％（ｗ／ｖ）　（７）ＭＥ
Ｍを加えテン０〜１３０分間ホモシネ−・１・した。得
られた均ｆｆｌ？１ｔ２（１，５ｇタノバク質ンを／１
　’Ｃ，：で１００．０００Ｘ　ｇて１時間遠心分離し
て、肖られた上清を、ｌｌＥＰＥｓｉ５０ｍＭ　ＮａＣ
ＩｔｌＮ衝液（ｐＨ７，２’）で平衡にしておいたセフ
ァデックスＣニー５０ゲルクロマトグラフィー　（ファ
ルマシア社製、φ４．Ｏｃｎ＋Ｘ　］０００ｃｍζこて
分画した。溶出は同緩衝液で行った。第１図ピーク１３
に相当する両分を集め、次いでこれを直接に、０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡にしておいたカラノ
、を用いた逆相１１ＰＬｃ　（ＴＯ８（１＋１製、＋’
１ＤＳ−１２０Ｔカラム、　φ２．］５ｃｍＸ３０ｃｍ
）に供して、分画した。溶出は０暑％’ｒト”Ａを含む
７０％（ｖ／ｖ、’）アセトニトリル配にて流速１ｍ１
／分て行った。第２図ピークＣに相当する両分を回収し
て、８４３０ノＪ．ｇタンパク質の精製分離物を得た。

得られた精製物の性質を次のような確認試験等を行って
確認した。

々　ｌ　　　　　　ゝ ＳｒｌＳポリケルアクリルアミドゲル濃度は、、ａｅｍ
ｍｌｉらの方法ｒ：Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａ
ｔｕｒｅ，　’２１：１（ｉ８０−６８５．（１９７０
）］　（ご′Ｃ行−った（アクリル−／ミド淵）朗２０
％、Ｓｌ）！ＪＪｊ度２％、ケルＰ５２１１１ｍ）。ざ
１．りこメルカフトエタノー・ル）不順試料の場合には
メルカーノト］−タノールＦ）％を加えた。試料な２％
５ｔ）Ｓを含む試料用緩衝液（５％メルカフトエタノ・
−ルｌ奈加ンＩＳたは無添加緩衝液）！こ各々溶解−５
分間煮沸処哩して電気泳動ζこ供した。泳動は５０〜（
ｉｏｍ八て１１−）人・。

分子積標準マーカー（こは、５Ｉ）Ｓ−６［シクマ比製
、ウシ面詰アルフミン（分子・ψ６Ｇ、０００）、卵白
アルフミン（同４５，０００）、パパイン（同３Ｌ７０
０）　ＰＭＳＩ・処理トリアジノ・−りン（＋１ｊｌ　
２４　、０００　）、β　ラクトり１７ブリン（同１８
９．り００）、リソチーム（同１４，３００）および炭
酸脱水素酵素（同２眠０００）を含む］、−Ｔ゛トクロ
ーｉＣ（同１２，４００）およびアブ［−１チニン〈同
（ｉ、５００）を用いた。・その結果、メルカプ゛ｌ・
エタノール無添加ケルここて分−（−ｉ−２７，０００
の牟−ハントか得られた。メルカプトＪ−夕７ノールを
奈加り゛ルＣ゛は分１’量２７．０００．　Ｖ７，００
０および１０　、０００の三つの単副ハントか１１＋ら
れた。これは、ＳＳ結合したサフユニツトからなるカリ
クレインの分子−構成と同一である。

アーミ＝Ｊ鍍配列−θし一定 ？ｉに法（ごて還元してカルオ、キシメチル化した試本
・Ｉの一／Ｓ〕酸配列を１ｌｃｔｓ＋ｃｌ、の方ｉ、！
′、ｃ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣＩ＋ｅ＋ｎ。

２別７！Ｊ９０−７！１９７　（＋り８１）］　！こて
液相アミノ酸シクエンザー（Ａ　円Ｊｌ　ｉ　ｃ〔ｌ　
Ｒｉ　ｏｓｙｓ　Ｌｅｍｓ？−１′製、４７０Ａ！ｔ２
）で調へた。

以トの分子量およびアミノ酸配列分析の結果から、精製
分離タンパ７質ａｔ力リクレイノ（ご属するものである
ことが６１１１月された。

組胞−イ■〜割性會舌−性謙−１ｕ’ｌ一定試トｌをＲ
１）ト１ｆ−１６４０−１Ｂ地（キップ！社製）て−噌
透析する。種）２の潤度に調製した透１１ｉ試料の各１
０７Ｊ、ｌを、胸Ｉ！細１抱の１０％加熱処理胎児ウシ
血清（ハイク１フーン社製）含有量培地？″′；＝遊液
仁こ最終容１１００７ｚ（細胞数約ｌＸｌ０）になる様
に加える。浮遊ｊ音は９（１−ウｊ：ルンイグロプレ−
１−（：２＝二シンク製）にｒめ分？４’、　ＬｙでＪ
′５＜。これを「逼％炭酸カスを含む加湿雰囲気中で１
３７°Ｃて３（４間培養ずろ。各培養の生細胞をトリパ
ンフルー色素排除試験で計数する。

細胞傷害活性は下記の式で示すＡ１１ｌ胞傷害活性（％
）で表した。

細胞傷害活性（％）＝ （１−試験培養の細胞数／対照培養の細胞数）Ｘ１００
その結果、本精製物（５０）１８／　ｍ　ｌ　）の活性
５０．２％が認められた。

セ１゛　ロー”　−゛Ｉ！１リ−しｔ セリンブＤテアーセ活性の測定は、Ｍｏｒｉｗａｋｉ（
＋）方法［薬学雑誌、９１４１３−４１６　（１９７１
）］に準しで′ｒ　Ａ　ｐ＋　１：、を基質に用いで行
った。試；ｊａｉｌ　Ｏ、１１ｎ＋ｎ　ｌを０．１ｍｌ
の０、団Ｔ　Ａ旨Ｅおよ０Ｏ６１ト１燐酸緩南液（１＋
ｌｌ　８．０）と混合し、；３０°（゛て３０分間イン
ギ：Ｌヘートする。反応を０．２ｍｌの１５％（ｗ／ｖ
）　Ｉ・リクＤル酢酸および帆１ｍｌの２％（ｗ／ν）
マンガンカリウノ、を加えて反応を停止［−させる、１
分後、０．１ｍｌの１０％（ＩＪ／ｖ）重炭酸ナトリウ
１、を加え、次いて４ｍｌの０．／１％クロモトローフ
酸の６７％硫酸溶液とよく混合する。混合液の吸光度を
５８Ｏｎｍて測定する。その結果、本精製物は特異的な
カリクレイン活性（８（ｉ、７７Ｊ、ｍｏｌｅｓ／ｍｉ
ｎ／ｍｇ）を有することか証明された。

宝　　−イーンー活オＬの一阻 ７七−イ１ユｊ１］ 試料（３，′７ｘｌＯ−’計１）をＤ　Ｆｌ）またはＰ
　Ｍ　Ｓ　Ｆ’の３．７×１０−２ｕｎｉ、３．７Ｘ　
ＩＱ−’ｍＭまたは３．７ｍＭｃ７）溶液（コ各々加え
て、３７℃で６０分間インキュベートシた。基質ＴＡ阻
：を用いて−１−記の方法でカリクレイン活性を測定し
た。ドロ害剤を加えかい対！！何と比較したカリクレー
イン活性をト１］害率（％）で表した。その結果、本精
製物のニス：Ｊ−ル分解作用はノｌリクレイン阻害剤（
こよって確実むこｒ口害されることか証明された（表１
）。

一−−−／ ／、−、、−、−、−−−− 表−１− セリンフロテアーセ阻害剤ζごよるセリンプ１−１テア
ーセ活性の阻害作用 団害剤　　試料／ド■１害剤比 阻害率 無しく月明）Ｏ ＤＦＰ　　　　　　　　　１０−”　　　　　　　　　
　　　：３．１１０　　’　　　　　　　　　　　　４
２．３１０−’　　　　　　　　　　　９５．４）’Ｍ
ＳＦ　　　　　　　　１０−／　　　　　　　　　　　
　Ｌ５１０−’　　　　　　　　　　　　３８．’Ｊ１
０’＝　　　　　　　　　　　８４．７実施例２： ＢＡＬＢ／　ｃ７１ブスの雌の５週令を用いて実施例と
同様に精製物を調製した。督られた調製物ｃｉ、セリン
ブロテアーセ活性が６．７μ…ｏｌｅｓ／ｍ団／ｎ１８
、細胞傷害性活性が３２．３％（２３７１ｇ／ｍｌ）で
あって、アミノ酸配列はカリクレインのｍ　Ｇ　Ｋ　−
（ｉと同・てあ・旬こ。

本発明の好ましい実施態様をここに詳細ζこ記述しＩた
が、腫／、７の変更が本発明の精神または添付した特許
請求の範囲に反するごとなく１テわれろことは当業者に
理解されよう。

く本発明の効果〉 以北のようζこ、本発明ζこよれは、細胞傷害性カック
レイ〉・をマウス顎Ｆ腺から容易に高収率で製造するこ
とかｉＪｉ能にん゛す、臨床用もしくは実験研究用の細
胞傷害性カリクレインを大量に安価に提供することかで
きる。

また、本発明もこまって製造されるカリクレインは高い
細胞傷害性活性をイ１することから、カリクレインを１
．Ｙ来の脳動脈硬化症や高血圧症の予防治療のみならず
、鞘Ｉ胞、例えば、自ｒｆｎ球、癌細胞、ウイルズ感染
斤■胞等の破壊にこれを使用することかでき、諸疾唐、
のｊ−防治療にきわめて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の細胞傷害性カリクレインの調製工程
ζこおけるケルクロマトクラ゛フィーの溶出パターンを
示す、説明図である。 第２図は、本発明の細胞傷害性）１リクレインの調製工
程における逆相高速？（１体り１コマトクラーノ７−の
溶出パターンを示す、説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マウス顎下腺から分離した細胞傷害性カリクレイン
   。 ２、マウス顎下腺をホモジネートして、遠心分離し、ゲ
   ルクロマトグラフィー分画の後、さらに逆相高速液体ク
   ロマトグラフィーで分画して精製することからなる、細
   胞傷害性カリクレインの製造法。 ３、請求項１に記載の細胞傷害性カリクレインの、細胞
   傷害剤としての使用。