JPH0210160A - 固体表面への細胞の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固相免疫測定の混合凝集法あるいはアフィニテ
ィークロマトグラフィーやバイオリアクター等に用いら
れる細胞の固体表面への固定化方法に関する。

（従来の技術） 混合凝集法（ｍｉｘｅｄ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ
）は、抗原抗体反応を利用した免疫学的凝集反応の検出
方法の一つで、その原理は１９３９年ウイーつ−（讐１
ｅｎｅｒ）とバーマン（Ｈｅｒｍａｎ）（Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏ！、、（１９３９）３６．２５５）によって提唱
され、クームス（Ｃ，ｏｏｍｂｓ）らによって発展確立
されたＩ：Ｃｏｏｍｂｓ、　Ｒ，Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　Ｂ
ＥＤＦＯＲＤ。

Ｄ、　（１９５５）　’Ｔｈｅ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　ａｎ
ｔｉｇｅｎｓ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ
　　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　　ｂｙ　　ｍｅａｎｓ
　　ｏｆ　　ｍ１ｘｅｄ　　ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ−
ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ、’　
　Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、＋　　５゜１１１゜ Ｃｏｏｍｂｓ　　　Ｒ，Ｒ，八、　　ＢＥＤＦＯＲＤ、
Ｄ、　　ａｎｄ　　ＲＯＵＩＬＬＡＲＤ、Ｌ、Ｍ。

（１９５６）、　　’Ａ　ａｎｄ　Ｂ　ｂｌｏｏｄ−ｇ
ｒｏｕｐ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　　ｅ
ｐｊｄｅｒｍａｌ　　ｃｅｌｌ　　ｄｅｍｏｎｓｔｒａ
ｔｅｄ　　ｂｙ　ｍ１ｘｅｄ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉ
ｏｎ’、　　Ｌａｎｃｅｔ、　　ｉ＋　　４６１）　。

さらに、それ以後応用が進みファーレウス（Ｆａｇｒａ
ｅｕｓ）　＋　エスプマーク（Ｅｓｐｍａｒｋ）　＋ジ
ョンソン（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ）らがガラス表面上で培養
細胞上の抗原を標識赤血球試薬を用いて検出している（
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｖ、９．　ＰＰ、　１６１〜１７５　（１９６２））。

またジュージ（Ｊｕｊｉ）、カノウ（Ｋａｎｏ）らによ
って血小板抗原の分析に応用された（Ｉｎｔ、　Ａｒｃ
ｈ、　Ａｔｔｅｒｇｙ＋　Ｖ、　４２．　ＰＰ、　４７
４〜４８４　Ｊｕｊｉ　Ｋａｎｏ　ａｎｄ　Ｍｉｌｇｒ
ｅｍ）。

さらに米国特許第４２７５０５３号および米国特許第４
３２８１８３号明細書で各種の血液型分析等に応用され
るに至った。混合凝集法において細胞等を安定に固体表
面に結合させることは非常に重要であり、種々の方法が
実施されている。

ジュージらはガラス試験管に吸着させているし、米国特
許第４２７５０５３号、米国特許第、１３２８１８３閃
明細書ではポリスチレン表面をフィブリノーゲンとポリ
リジンで処理したり、化学的に共有結合さ−υることが
できることを述べている。

（発明が解決しようとする課題） 細胞、オルガネラ等を固体表面に結合させる技術は、混
合凝集法の場合に限らず、アフィニテクロマトグラフィ
ーや、バイオリアクター等の分野でも用いられており、
一般に架橋法と包括法がある。架橋法には米国特許第４
２７．５０５３号明細書にも述べられているように反応
可能な固体表面をグルタルアルデヒドや臭化シアンで処
理して細胞を結合させることができる。

しかし、これら共有結合を形成する反応性の基は、強固
な結合を形成するものの、安定性に難点があるため、冷
蔵保存もしくはずみやかに使用しなければならない。ま
た求核性であるがために反応はｐ＋＋に大きく左右され
、一定した細胞の結合量をコントロールしにくいと言う
欠点をもっている。

また米国特許第４２７５０５３　月および米国特許第４
３２８１８３　月明細書で述べられているフィブリノー
ゲンとポリリジンによる処理も２段階の処理が必要であ
ったり、フィブリノーゲン、ポリリシン自体安定性に乏
しいために、処理後ずみやかに使用し２なければならな
いという欠点を持っている。

（課題を解決するだめの手段） そごで発明者らは安定かつ安価にしかも効率よく高速に
細胞を結合させることができる固体表面の処理方法を開
発すべく鋭意研究を行った結果、エチレンイミンポリマ
ー（Ｃ１１２ＣＩ１２Ｎ）Ｉ）。を吸着さ−）Ｊた固体
表面に生理的条件］ζて、細胞が表面の機能をそこなわ
ず効率良く結合できることを見い出した。

エチレンイミンポリマーは種々の有機プラスチック材料
に吸着するが、発明者等の横側ではヌンク（ＮＩＩＮＧ
）社製のＩｍｍｕｒｏｎで作られたポリスチレンマイク
ロプレーＩ・が好適である。

さらに特開昭６２−２９８７６３号公報に開示されてい
るよ・うに、エチレンイミンポリマーは、ガラス等無機
材料にも吸着し、前記有機材料同様細胞が効率良く結合
できることを見出し本発明を達成するに至った。

すなわち本発明は、固体表面にエチレンイミンポリマー
を結合させた後、細胞を吸着させ固定化することを特徴
とする固体表面への細胞の固定化方法に関するものであ
る。

エチレンイミンポリマー処理は水溶液の状態で固体表面
と接触させるだけで良く、その後、乾燥させても良く、
その際、室温で保存しても何ら性能に変化のない安定な
処理方法である。

またエチレンイミンポリマーは各種材料表面に化学的処
理を施した後化学的反応により導入することも可能であ
る。

（実施例） 本発明を次の実施例により説明する。

実施燃上 〈ガラスチューブへの赤血球の固定化〉ガラス試験管直
径１２ｍｍＸ長さ７５ｍｍ＜コーニング社製）に０．１
％エチレンイミンポリマー（分子量約７０．０００、平
井化学（１菊製）を２００顎添加し、室温で３０分反応
さセた。

精製水２ｍｐ、で３回洗浄した後、０．３％に調整した
赤血球の生理食塩水（以下生食と言う）浮遊液２００μ
！を添加し、＋０００ｒｐｍで１分間遠心した。

次いでｐＨ７，０の０．０１．Ｍ　リン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ）　２ｍｌで３回洗浄し、試験管底面に吸着固定化
した赤佃球を無処理ガラス試験管に一つき同様に行った
結果と比較した。得た結果を次の第１表に示す。

第１表 〈赤血球のプレー１−への固定化〉 ヌンク社製マイクロプレーｌ−（Ｎｏ、４６４３９４）
に０．１％エチレンイミンポリマー（半井化学■製）を
　１００　μｌ／ウェル分注し、室温で３０分インキュ
へ一トシた後に、０．０１Ｍ　ＰＢＳ（ｐｉｆ−７，０
）　３００〃１／ウェルで５回洗浄し、室温で乾燥させ
て、エチレンイミンポリマー処理プレートを作成した。

次に上記エチレンイミンポリマー処理プレートに赤血球
の固定化を試みた。オーツ（Ｏｒｔｈｏ）社製サージス
クリーン（Ｓｕｒｇｉｓｃｒｅｅｎ）　　２　（赤血球
）ロッ）　Ｎｏ、３ＳＳ８３７　３％懸濁液を生食で適
宜希釈して３％の他０．７５％、０．３％、０．１５％
の希釈懸濁液を作成し、各、懸濁液を２５μｌ／ウエル
ずつ分注し、室温で１０分間インキュベートした後０．
１％（牛血清アルブミン）　（ＢＳＡ）含有、０．０１
Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）２００　μｌ／ウェルで３
回ウェルを洗浄した。

また、エチレンイミンポリマー処理していないヌンク社
製マイクロプレートについても同様な操作を行った。

向上記サージスクリーンのアンチグラムは下記の通りで
ある： Ｄｏｎｏｒ　Ｎｏ、４１９０１　、Ｇｅｎｏ　Ｔｙｐｅ
　Ｒ２Ｊ、Ｄ（＋）、　Ｃ（ＯＬＥ（＋）、　ｃ（０）
、　ｅ（０）、　ｆ（０）、　Ｋ（０）、　ｋ（＋）、
　Ｆｙ’（＋）Ｆｙｂ（＋）、　ＪＫ”（０）、　ＪＫ
ｂ（＋）、　Ｘｇａ（＋）、Ｌｅ”（０）Ｉｅｂ（＋）
、　Ｓ（＋）、　５（０）、　Ｍ（＋）、　　Ｎ（０）
、　Ｐ、（＋）（＋）含有、（０）非含有 エチレンイミンポリマー処理、非処理プレートについて
、固定化された赤血球量を求めるため倍率２００倍で鏡
検して、単位面積あたりの赤血球数を算出した。得た結
果を第２表に示す。

第２表 赤血球は、作用血球濃度で差はあるがプレート表面に密
に結合してるがエチレンイミンポリマー非処理プレート
では、処理プレートに比べて、はとんど結合していない
と言える。従って、エチレンイミンポリマー処理によっ
て、赤血球が効率よくプレート面に結合させることがで
きると言える。

エチレンイミンポリマー濃度は０．００１％〜１％が好
適であった。

災施桝主 〈血小板のプレートへの固定〉 実施例２で作成したエチレンイミンポリマー処理プレー
トに血小板の固定を試みた。ＡＣＤ添加全血を軽遠心１
１００ｇ−６分行い、上清として多血小板血漿を得た。

更にこの上清を強遠心１５００ｇ−１５分行って血小板
を沈澱させ、生食で３回洗浄し、１．０ｍｌの懸濁液と
した（２Ｘ、１０９個／滅）。この懸濁液を生食で適宜
希釈し各種濃度の血小板懸濁液を作成し、エチレンイミ
ンポリマー処理プレートと非処理プレートに２５μ乏／
ウエルずつ分注し、室温で３０分インキヱベートした後
、０．１％ＢＳＡ含有０、ＯＬＭ　ＰＢＳ（ｐＨ＝７．
０）　２００μＩ！、／ウェルで３回洗浄した。

倍率２００倍で鏡検して固定された単位面積あたりの血
小板数を求めた。得た結果を第３表に示す。

第３表 上表に示すとおり、エチレンイミンポリマー処理したプ
レートの方が明らかに多くの血小板が固定化されており
、血小板固定プレート作成にもエチレンイミンポリマー
処理は有効であった。

失隻炎↓ 〈抗グロブリン試験（ｃｏｏｍｂｓ法）による不規則抗
体の検出〉 ０型セル（Ｃｅｌｌ）固相プレート 実施例２で実施したようにエチレンイミンポリマー処理
したマイクロプレー１・に０．３％サージスクリーン２
を吸着固定化させたものを用いた。

・抗ヒトＴｇＧ感作粒子 抗ヒトＩｇＧを感作させた血球の抗ヒｈ　ｉ　ｇ　Ｇセ
ルキット（商品名オリンパス光学工業■製）を使用した
。

・不規則抗体の検出 前記Ｏ型Ｃｅ１ｌ固相プレー１・にＬｉ５ｓ液６０μ！
、サンプルとしてオーツ社の抗Ｖ１抗に１抗Ｆｙ″抗Ｓ
の各抗血清３０７ｔ１．を添加し、３７°Ｃ２０ｍｉｎ
反応させた。０．ＯＩＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７，０）　２０
０μｌで４回洗浄し、次いで前記抗ヒ）ＩｇＧ感作粒子
を２５μβづつ添加し、室温で４時間静置し、マイクロ
プレート低面に成形される反応パターンを検出した。得
られた結果を第４表に示す。

第４表 同相ブレー１・の低面に一様に広がったものを士、中心
に集まったものを−と判定した。

結果は、１ノ・−ジスクリーンのアンチグラム（以下の
第５表）と一致した。

前記抗し）ＩｇＧ感作粒子が、前記Ｏ型Ｃｅ１１】　２ 実１１引１ 〈リンパ球のプレートへの固定〉 血液１０ｍ１にＡＣＤ液を１．５ｍＲ加えた。４００ｇ
−１０分遠心を行い、ハフィーコ−１・をピペットで約
１．５ｍβ吸引分取し、１．５　ｍｌの生食を加えて、
撹拌混和した。この懸濁液に分離用比重液（モノポリ・
レゾルピング・メジュー１８、Ｍ−ＢＲＭ（商品名）フ
ロー・ラボラ］・り一社製）を静かに積層した。６００
ｇ−１０分遠心し、リンパ球層を分取し、６０００ｇ−
］分遠心後沈渣を再び生食に懸濁し、１０００ｇ１分遠
心し」二清を吸引除去した。ハンクス液を加え、トロン
ビン（１００単位／ｍρ）を１滴加え、混和した。］、
００００ｇ３３秒心し、上清を再び１０００ｇ−１分遠
心し、沈渣を１　ｍｌの生食に懸濁させた。

２０００個／μ！。これを適宜生食で希釈し、実施例２
で作成したエチレンイミンポリマー処理プレートと、非
処理プレートに２５μｒ／ウエルずつ分注し、室温で３
０分インキユヘートした後、０．１％ＢＳ八含有へ、Ｏ
ＩＭ　ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）２００　μｌ／ウェルで
３回洗浄し、倍率２００でリンパ球のプレートへの固定
を単位面積あたりのリンパ球をはかって算出した。得た
結果を第６表に示す。

第６表 表に示すとおり、エチレンイミンポリマー処理プレート
の方が明らかに多くのリンパ球を固定することができた
。

失旌炭ｌ 〈ナイロンディスクへの赤血球の固定化〉ナイロンディ
スク（６，６ナイロン）を２Ｎ　ｔｉｃβ６０°Ｃ１５
時間加水分解した後、純水で洗浄し、次に０．１％グル
タルアルデヒドを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶
液に２５°Ｃで１時間反応させた。反応後、純水で洗浄
し、０，１％エチレンイミンポリマー水溶液を室温で２
時間反応させた。

反応後練水で洗浄し、０，１Ｍグリシン−Ｎａ叶緩衝液
（ｐＨ８，５）中にて室温で一夜放置し、残余アルデヒ
ド基をブロッキングした。

純水で洗浄し、エチレンイミンポリマー処理ナイロンデ
ィスクを得た。０．３％に調整した赤血球の生理食塩水
浮遊液をエチレンイミンポリマー処理ナイロンディスク
に滴下し、１５分室温静置した後、０．０１Ｍ　ＰＢＳ
（ｐＨ９，０）で洗浄、前記ディスク上に残った赤血球
をエチレンイミンポリマー無処理ナイロンディスクと比
較した。得た結果を第７表に示す。

第７表 （発明の効果） 本発明においては、固体表面にエチレンイミンポリマー
を結合させた後、そのまま細胞を吸着させ固定化するの
で安定かつ安価にしかも効率よく高速に細胞を結合させ
ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、固体表面にエチレンイミンポリマーを結合させた後
   、細胞を吸着させ固定化することを特徴とする固体表面
   への細胞の固定化方法。