JPH01268646A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なモノクローナル抗体Ａ１．２６７、ＡＩ
。

４１０またはＡ１．４２５を有効成分とする抗腫瘍剤に
関するものである。

更に詳しくは本発明は、Ｃ５７旧、／６マウス由来のＴ
細胞白血病細胞株［ＥＬ４でＡ系マウスを免疫すること
により得られる抗体産生細胞とＢａ１ｂ／ｃ系マウス骨
髄腫細胞ＮＳＩとを融合させることにより得られるハイ
ブリドーマが産生し、免疫グロブリンクラスが（ＩｇＧ
３、ｘ）であって、マウス及びヒトの腫瘍細胞の細胞表
面の種間共通の腫瘍関連抗原であるカングリオシトをＧ
Ｄ２＞ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）。

ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、　ＧＤｌｂ、　
ＧＴｌａ、　ＧＱｌｂ）ＧＴＩの順に強く認識するモノ
クロナール抗体Ａ１．２６７を有効成分とする抗腫瘍剤
に関する。

また、本発明は、　　Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細
胞白血病細胞株ＥＬ４でＡ系マウスを免疫することによ
り得られる抗体産生細胞とＢａ１ｂ／ｃ系マウス由来の
骨髄腫細胞株ＮＳＩとを融合させることにより得られる
ハイブリドーマが産生し、免疫グロブリンクラスが（Ｉ
ｇＧ３、ｘ）であって、細胞表面ガングリオシドＧＤ２
を認識するモノクローナル抗体Ａｌ。

４１０を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。

更に１本発明は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞白
血病細胞株ＥＬ４でＡ系マウスを免疫することにより得
られる抗体産生細胞とＢａ１ｂ／ｃ系マウス由来の骨髄
腫細胞株ＮＳＩとを融合させることにより得られるハイ
ブリドーマが産生し、免疫グロブリンクラスが（ＩｇＧ
３、ｘ）であって、細胞表面ガングリオシドＧＤ２を認
識するモノクローナル抗体ＡＩ。

４２５を有効威容とする抗腫瘍剤に関する。

なお、本発明においてガングリオシドの名前（ＧＤ２、
ＧＤ３など）は５ｖｅｎｎｅｒｈｏｌ　Ｌｌｌの命名法
（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　Ｌ、　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ
　Ｒｅｓ、　５．１４５−１５５（１９６４））による
二また、ＧＤ３のシアル酸誘導体は括弧の中に記した。

すなわち、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）。

ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（Ｎｅｕ
Ｇｃ、　ＮｅｕＡｃ）、およびＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　
Ｎｅｕ、Ｇｃ）はそれぞれ、■’　（ＮｅｕＡｃ）。

−ＬａｃＣｅｒ　、■’　（ＮｅｕＡｃ　ａ　２→８Ｎ
ｅｕＧｃ）−ＬａｃＣｅｒ、　ＩＩ’（ＮａｕＧｃ　ａ
　２→８ＮｅｕＡｃ）−ＬａｃＣｅｒ、　Ｉ’Ｉ　３（
ＮａｕＧｃ）２−ＬａｃＣｅｒを意味する。そのほかの
物質の名称はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ会！ｉ　（ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌＮｏｍａｎｃｌａｔｕｒｅ、　Ｌｉｐｉｄｓ
　１２．４５５−４６３（１９７７））による。

（従来の技術） にｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが抗体産生細胞と腫
瘍細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）を用いてモノク
ローナル抗体の作成する方法（Ｎａｔｕｒｅ、μｉ６．
４９５（１９７５）　）を確立して以来、腫瘍細胞表面
に存在する腫瘍特異抗原に対するモノクロナール抗体を
獲得しようとする試みがなされてきたａ　（Ｋｏｐｒｏ
ｗｓｋｉ、　ｔｌ、　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７５、３４０５（１９７ｇ）、Ｈｅｒｌｙｎ、　Ｍ、　
ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６、１４３８（１
９７９））　　これはモノクローナル抗体の抗原に対す
る高い特異性・鋭敏性を利用して、基礎医学においては
腫瘍特異抗原の解析を飛躍的に発展させること、臨床分
野においては癌の的確な診断や癌を狙い打ちにする治療
への応用が期待されたからである。

当初こうした研究は腫瘍抗原の抗原決定基として腫瘍細
胞蛋白質を対象として研究された。ところがこれらの抗
原に対するモノクローナル抗体は正常細胞とも反応し、
腫瘍細胞に対する特異性という観点からみると期待を裏
切るものであったのである。

しかしながらこのようなモノクローナル抗体の中に数は
少ないながらも比較的腫瘍細胞に対する特異性の高いも
のがみられた。そこでこれら特異性の高いモノクローナ
ル抗体の認識している抗原を調べたところ、腫瘍細胞表
面の糖脂質、糖蛋白質の如き複合糖質の糖鎖部分を認識
していることが判明した。この中でもとりわけガングリ
オシド即ちシアル酸を有する糖脂質が特異性が高いこと
が判った。（ｌｌａｋｏｍｏｒｉ、　Ｓ、　Ｃａｎｃｅ
ｒ　ｒｉｅｓ、　４５．２４０５−２４１４（１９８５
））。キして、ガングリオシドを認識するモノクローナ
ル抗体の中には、既にモノシアロガングリオシドＣＡ］
、９−９を認識する１、１１６Ｎｓ１９−９（Ｋｏｐｒ
ｏｗｓｋｊ、、　　ｔＬ　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｓｏｍ
ａｔｉｃ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

５．９５７（１９７９）、　Ｍａｇｎａｎｉ、　Ｊ、　
ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１２．。

５５（１９８１）））のように癌の診断に使用されてい
るものもある。

ガングリオシドに対するモノクローナル抗体には以上の
ほか、ＧＤ３に対しては［’ｕｋｅｌ　Ｃ，Ｓ、　ｅｔ
　ａｌ。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、月５５−．１１３３−１１４
７（１９８２）やＮｕｄｅｌｍａｎ。

ε、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ、　［３ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ
、　２５７．１２７５２−１２７５６（１９８２）、Ｇ
Ｄ２に対してはＣａｈａｎ、　Ｌ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ
。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　７９．７６２９−７６３３（１９８２）、Ｃｈｅｒ
ｅｓｈ、Ｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８］、　５７６７−５
７７１（１９８４）、Ｃｈａｕｎｇ　＋Ｎ、　Ｋ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５．　２６４
２−２６４９゜および５ａｉｔｏ　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　ｕＺ、　１−７（１９８５）、　０Ｍ
２に対してはＴａｉ、　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　８０．　５３９２−５３９
６　（１９８３）やＮａＬｏｌｉ、　Ｅ、Ｊ、　ｅｔ　
ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｓｓ。

４万、　４１６６−４１２０（＋９８６）、０Ｍ３に対
しては１１ｊｒａｂａｙａｓｈｊ、　　Ｙ、　　ｅｔ　
　ａｌ、　　　Ｊ、　　ロｉｏ１．　　Ｃｈｅｗ、　　
２６０゜１３３２８−１３３３３　（１９８５）のよう
な研究がある。しかしながら現在までガングリシドに対
するモノクローナル抗体はそれほど数多く作られていな
いのが現状である。

これまで腫瘍細胞表面ガングリオシドに対するモノクロ
ーナル抗体が作られてこなかった大きな要因として、モ
ノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを得るに際
し、ヒト腫瘍細胞で感作させたマウスの抗体産生細胞と
マウス骨髄腫細胞を融合する異種免疫の方法を用いてき
たことが挙げられる。即ち、抗〃ｘとして投与される腫
瘍細胞が異種であるヒト由来のものであるため、ヒトの
主要組織適応抗原系（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐ
ａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ）である）ＩＬＡを
認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
ばかりが得られ、目的とするハイブリドーマを得る確率
が非常に小さかった。

このような状況下で本発明者らは上記の方法に代えて、
マウスリンパ系腫瘍細胞で感作されたマウスの抗体産生
細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させる同種免疫の方法
を採ることにより、　　ＩＩＬＡを認識する七ツクロー
ナル抗体を産生ずる不要なハイブリドーマの生成が排除
され、マウスおよびヒトの腫瘍細胞の細胞表面の種間共
通の腫瘍関連抗原であるガングリオシド、特にＧＤ２を
特異的に認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマを極めて能率良く得ることができることを発見
した。そして本発明者らはこの発見に基づいて創製され
るモノクローナル抗体とそれを産生するハイブリドーマ
に関する発明について先に特許出願した（ＰＣＴ／ＪＰ
８７１００６９０）　。

一方、モノクローナル抗体の抗原に対する強い特異性を
利用して悪性腫瘍の治療に役立てようとする試みも精力
的になされてきた。その結果ガングリオシ　ドを抗原す
るモノクローナル抗体が腫瘍の治療に有用であることが
知られ始めた（Ｉ（ａｋ。

ｍｏｒｉ、　Ｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５．２
４０５−２４１４（１９８５））。

そしてこのようなガングリオシドを抗原とするモノクロ
ーナル抗体の一部は既に臨床応用の段階にまで進んで来
ている。例えば、Ｄｉｐｐｏｌｄらがヒトメラノーマ細
胞株ＳＫ−ＭＥＬ２８をマウスに免疫することにより作
り出しくＤｉｐｐｏｌｄ　Ｗ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、］、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　
　７７、　６１１４−６１１８（１９８０）　　）、Ｐ
ｕｋｅｌらがＧＤ３を認識することを示した（Ｐｕｋｅ
ｌ、　Ｃ。

Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５
５．１１３３−１１４７（１９８２））、抗ＧＤ３モノ
クローナル抗体Ｒ２４を、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらが転移性
腫瘍を持つメラノーマ患者１２例に２週間にわたり約８
回全身投与したところ、３例に顕著な腫瘍の縮小を認め
た（ｌｌｏｕｇｈｔｏｎ、　Ａ、　Ｎ、　ａｔ　ａｌ、
　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．１
２４２−１２４６　（１９８５））。

Ｒ２４については、これを使用してヒトの神経外胚葉性
悪性腫瘍と上皮性ガンの治療する方法に関する発明が、
特開昭６２−２８９５２４として出願されている。また
、Ｃｈｅｕｎｇがヒト神経芽細胞腫ＬＡＮ−１をマウス
に免疫して得られた抗ＧＤ２モノクローナル抗体３Ｆ８
を１２例の転移性腫瘍患者（メラノーマ６例、神経芽細
胞腫４例、骨肉腫２例）に全身投与して、３例に顕著な
効果が認められたと報告している（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｎ
、に、　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ａｖａ、　Ａｓ５
ｏｃ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２７．３１８（１９８６））
、１更にはＩｒ１ｅらはメラノーマ患者の末梢血リンパ
球をＥＢウィルスで株化することにより得られた細胞が
生産する抗ＧＤ２モノクローナル抗体Ｌ７２を８人の患
者の合計２１箇所の転移性メラノーマに補体と共に投与
したところ、１６箇所で退縮が認められ、このうち１０
箇所では完全に消退したと報告している（Ｉｒｉｓ、　
Ｒ，Ｆ。

ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．８６９４−８６０８（１９８
６））。

そして本発明者らは上に記した特許出１１’［（ＰＣＴ
／Ｊｌ”８７１００６９０）の実施例に記載したモノク
ローナル抗体の中の一つにそれ自身で強い抗腫瘍性を持
つものを見い出し、用途発明（抗腫瘍剤）として特許出
願を行なった（特願昭６３−２１３１７）。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らの先の出願（特願昭６３−２１３１７）は、
それまでのモノクローナル抗体を有効成分とする抗腫瘍
剤の殆どがメラノーマに対する効果であり、一部が神経
芽腫を退縮させるものであって、適用範囲はごく限られ
たものであったのに対し、白血病の如き悪性リンパ腫の
モノクローナル抗体による治療効果を見いだした点に大
きな意味がある。

しかしながら同一の名称で呼ばれる腫瘍であっても腫瘍
の多様性は大きく、一つの抗腫瘍剤があらゆる症例に対
して著効を示すとは限らず、又腫瘍自体が抗腫瘍剤の投
与を継続するうちに薬剤に対して抵抗性を示すようにな
る場合が多い。そのために、癌の治療に際して治療開始
から完癒まで単一の抗腫瘍剤で事足りることは少なく、
複数の薬剤が求められている。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは更に続けて先に出願した方法と同じ
でハイブリドーマを創製して、ハイブリドーマが産生ず
るモノクローナル抗体のうち抗腫瘍効果のあるものを探
索してきたところ、上述のモノクローナル抗体Ａ１．２
６７、Ａ１．４１０及びＡ１．４２５が強い抗腫瘍効果
を持つことを発見し１本発明を完成した。

即ち本発明者らはマウスＴ細胞白血病細胞株を移植され
たマウスにモノクローナル抗体Ａ１．２６７、Ａ１．４
１０又はＡ１．４２５を投与したところ、これらモノク
ローナル抗体がこの担癌マウスの寿命を著量に延長し、
或は腫瘍を完全に拒絶させることを認めたのである。

本発明はモノクローナル抗体Ａ１．２６７、　ＡＩ、４
１０又はＡ１．４２５を有効成分とする新規な抗腫瘍剤
である。

そして、本発明に係るモノクローナル抗体ＡＩ。

２６７を産生ずるハイブリドーマＡ　１　、２６７は微
工研にＦＥＰＭ　Ｐ−９９９２として寄託され、モノク
ローナル抗体Ａ１．４１０を産生ずるハイブリドーマ＾
１．４１０は微工研にＦＥＰＭ　Ｐ−９９９３として寄
託され、そして、モノクローナル抗体Ａ１．４２５を産
生ずるハイブリドーマＡ１．４２５は微工研にＦＥＰＭ
　Ｐ−９９９４として寄託されている。

本発明の抗腫瘍剤を上記モノクローナル抗体を有効成分
として製剤化するには公知の方法を適用すればよい。投
与方法としては悪性リンパ腫の治療に用いる関係上、点
滴注射による投与が好ましい。

注射薬の製剤には、生理的食塩水、滅菌水リンゲル液等
の水溶性溶剤、非水性溶剤、等張化剤、烈痛化剤、溶解
補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、緩衝剤、乳化剤
等を任意に使用し得る。

−例として、生理的食塩水（塩濃度約０．９％）にヒト
血清アルブミンを５％にモノクローナル抗体を適量含む
ものを調製して注射剤とする。

モノクローナル抗体は点滴注射製剤中ｏ、ｉμｇ〜１０
０＠ｇ／＠Ｑ、好ましくは１μｇ〜１　ｍｇ／社含有さ
れる。

点滴投与量は症状、腫瘍の進行１年齢、性別等に応じて
５０〜１，０００ＷＩＱであり、毎日或は適当に日をお
いて与える。

以下に本発明を実施例により具体的に説明する。

失施涜〔Ｌはヅブリドーでや作製） Ｃ５７ＢＬマウス由来のＴ細胞腫瘍株ＥＬ４を１０’細
胞／マウス、１回／週、４週間に亙りＡ系マウスの腹腟
内に接種し、最終接種後３日日に肺臓を摘出してこれを
常法により組織培養液ＲＰＭ１１６４０（Ｇ、ＩＢＣＯ
社製）中の細胞浮遊液として調製した。

一方融合の親細胞として１３ａｌｂ／ｃ系マウス由来の
骨髄腫細胞株ＮＳＩを培養して１０７細胞用意した。

これらの細胞の融合はにｏｅｈ　ｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｊｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５（１９７
５））に従い、以下のように行なった。

前述のようにして調製した肺臓の浮遊細胞と骨髄腫細胞
を細胞数で５＝１となるように遠心チューブ内で混合し
、５００ｒ、ｐ、ｍ、で５分遠心した後上清を捨て、Ｒ
ＰＭＩ１６４０で濃度４０％（ｖ／ｖ）に調製したポリ
エチレングリコール（メルク社爬；平均分子２着／１，
０００）を０．２＋ｎＱ加えて２分間よく撹拌混合した
。

その後これに５ｍｆｌのｌ’ｌＰＭＩ１６４０を１滴づ
つ３分間かけて添加して希釈し、　５００ｒ、ｐ、ｍ、
で５分遠心した後上清を捨てた。次いで細胞をｌ＋ＡＴ
培地（ＲＰＭ１１６４０培地に１０％（ν／ｖ）ウシ胎
児血清を加え、最終濃度でヒボキサンチン１０−４Ｍ、
アミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６　Ｘ　
１０−’Ｍを加えたもの）に浮遊させて１００μＱ／穴
の割合で９６穴マイクロプレートに分注した。

温度３７°Ｃ，Ｃｏ２：空気＝５：９５の気相でこれを
培養し、培養３［］目および６日日にＩＩＡＴ培養で培
地交換を行なった。それ以後は３日毎にＩＩＴ培地（ｌ
ｌＡＴ椿地からアミノプテリンのみを除いた培地）で培
地交換を行なった。

培養を続け、細胞のコロニーの形成が認められるように
なった時点（約１０−１４日１）で培養上清中の抗体活
性を測定してスクリーニングを行なった。

スクリーニングはウサギ血清補体を併用する細胞障害試
験法を用いた。具体的には、標的となるＣ５７１比マウ
ス由来のＴ細胞腫瘍株ＥＬ４の細胞浮遊液（、！Ｉ＋胞
濃度５ＸＩＯ’個／＋ｎｕ）２０μＱ、ウサギ血清補体
２０μＱおよび培養上清２０μＱを混合して時々撹拌し
つつ３７℃で４５分間反応させた。反応終了後水冷して
トリパンブルー水溶液５０μＱを加えた後、顕微鏡で観
察してトリパンブルーを取り込んだ細胞の有無により培
養上清の細胞障害活性を判断した。

スクリーニングを行なったハイブリドーマ４８６株のう
ち、細胞障害活性をもつ抗体を産生ずるものが１４個得
られ、そのうち１株のハイブリドーマについて、限界希
釈法によりクローン化した。更にクローニングを繰り返
して安定で単一の細胞由来のハイブリドーマＡ１．２６
７を得た。

同様にして、ハイブリドーマＡ１．．４１０を得た。

また、同様にして、ハイブリドーマＡ１．．４２５を得
た。

なお、オフタロニー法により各ハイブリドーマが産生ず
る各モノクローナル抗体の免疫グロブリンのクラスを調
べたところ、いずれも（ＩｇＧ：＋、に）であった。

失に性影はノ！−旦二土四五生旦、　２６７Δ情ス）−
Ｂａ１ｂ／ｃ系のヌードマウスの腹腔にブリステン０．
５ｆｆｌｆｌ投与し、７日後に実施例１により得られた
ハイブリドーマＡ１゜２６７（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９９２
）約５〜１ＯＸＩＯ’細胞を腹腔的接種して腹水化を行
なった。

１〜２週間後に腹水を採取し、３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、
、１５分間の遠心により上清−ヒ層部分のブリステンと
沈澱物である細胞塊を取り除いたモノクローナル抗体が
含まれる中間層の部分を回収した。

上記により回収された溶液１０ｍＱに硫酸アンモニウム
を赫終濃度５０％となるように加えて、塩析した。これ
を１０，０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間の遠心にかけ、
沈澱した分画をＰＩ（ｓ（ｐＨ７，２の０，０］−Ｍ燐
酸緩衝液に０．１５Ｍ　ＮａＣ１を加えた燐酸緩衝塩溶
液）　１０ｍＱに溶かした。この溶液をＰｕｓ　１，０
００ｍＱに対して３回透析を繰り返し、免疫グロブリン
分画とした。

次いで該免疫グロブリン分画を、０．０３Ｍ　ＮａＣＱ
を含むρ１１８　、０の燐酸緩衝液に対して十分に透析
した。

別にこれと同じ緩衝液で平衡化しておいたイオン交換樹
脂ＤＥ５２カラム（ワットマン社製）に該透析液をかけ
、ＤＥ５２カラムに吸着されなかった両分を回収した。

この回収された両分をＰＢＳに対して透析を行なったも
のを精製ＩｇＧ抗体とし、モノクローナル抗体Ａ１．２
６７を得た。

実施例良」孟工仁久ｐ−ナル抗体Ａ１．２６７ｑ狩濃」
ひモノクローナル抗体Ａ　１　、２６７が認識している
ガングリオシドを決定するために、薄層クロマトグラフ
ィー（以下ＴＬＣと称す）上での酸素免疫染色法を行な
った。

（１）ヒトメラノーマ細胞株Ｍ１４のガングリオシド分
画、ガングリオシド純品および中性糖脂質純品の調製 ヒトメラノーマ細胞株ＵＣＬＡＳＯ−Ｍ　１４　（以下
Ｍ１４という）はカルホルニア大学のＲ，Ｔｒｉｅ博士
より入手したもので、Ｍ’１４のガングリオシド分画の
調製はｒａｔ。

Ｔ、　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０．５３９２−５３９６（
１９８３）に従った。

ガングリオシドＧＭ１．　ＧＤｌａ、　ＧＤｌｂ、　Ｇ
Ｔｌｂはウシの脳から調製し、Ｋａｎｆｅｒ、　Ｊ、　
Ｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１．４．６６０−６６４（１，９６９）に従って精製し
た。ＧＱｌｂはヤトロン社から購入した。ヒト脳の０Ｍ
３はスウエーデンのＧｏｔｅｂｏｒｇ大学のり、　Ｓｖ
ｅｎｎｅｒｈｏ１ｍ博士から入手した。０Ｍ２とＣＤ２
はそれぞれ０Ｍ２とＧＤｌｂから、ウシ來丸β−ガラク
トシダーゼ（アメリカのミシガン大学のＪ、　ＩＪ、　
Ｊｏｕｒｄｉａｎ博士から入手）を用いて調製した。ヒ
トミニリンの０Ｍ４とヒト脳のＧＴｌａは東京都臨床医
学総合研究所の有賀博士から入手した。クマ赤血球のＧ
Ｄ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）、ＧＤ３　（Ｎｅｕ
Ａｃ　。

ＮｅｕＧｃ）、ＣＤ３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、
およびＧＤ３（ＮａｕＧｃ。

ＮｅｕＧｃ）は東京都臨床医学総合研究所の橋本博士と
鈴木明身傅士から入手した。ＬａｃＣａｒ、　ＧｇＯｓ
、Ｃａｒ。

およびＧｇ０ｓ４Ｃｅｒはそれぞれ０Ｍ３．０Ｍ２．　
ＧＭＩから弱酸で処理し、イアトロビーズカラムクロマ
トグラフィーで精製して調製した。ＧｌｃＣｅｒはＴａ
ｉ、　Ｔ。

ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０．５３９２−５３９６（＋９８
３）に従って調製した。ＧｂＯ８３ＣｅｒとＧｂＯ８４
Ｃｓｒは５ｕｐｅｌｃｏ社（アメリカ、ペンシルバニア
州、ベラフオンテ）から購入した。

（２）　ＴＬＣの方法 メルク社製のシリカゲルを塗布済みのＴＬＣプレート「
シリカゲル６０」（厚さ２００μＩ）と同じくメルク社
製のシリカゲルを塗布済みのＴＬＣプラスチックシート
を使用した。クロマトグラムの展開溶媒はクロロフォル
ム／メタノール１０．２２％ＣａＣ１□水溶液を容積比
５５／４５／１０としたものを用いた。なお。

ＴＬＣプレート上に展開されたガングリオシドを染色す
る場合にはレゾルシノール（ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　）
染色を、中性糖脂質の染色にはオルシノール（ｏｒｃｉ
ｎｏｌ）染色を用いた。

（３）　ＴＬＣプレート上でのモノクローナル抗体　Ａ
Ｉ、２６７による酵素免疫染色法 ガングリオシドのＴＬＣ終了後、ＴＬＣプレートをウシ
血清アルブミン１％とポリビニールピロリドン（ｐｏｌ
ｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）　１％とを含有す
る燐酸緩衝塩溶液に浸した。空気中で乾燥させた後、プ
レートをモノクローナル抗体Ａ１．２６７溶液（１０μ
ｇ１社）と２時間２５℃で反応させた６次に燐酸緩衝塩
溶液（以下ＰＢＳと称す）を５回交換しつつその中でク
ロマトグラムを洗浄した。そして西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを結合させたヤギ抗マウスＩｇＧおよび工ｇＭ抗
体をこのクロマトグラムと２５℃で２時間反応させた。

再びＰＢＳを５回交換しつつその中でクロマトグラムを
洗浄した。染色に当たっては４００μｙ；／ｍＱの０−
フェニレンジアミンと０．１２％の過酸化水素を含むク
エン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ５，０，８０ａ＋Ｍ）を用い
、　１５分間反応させて、発色させた。その抜水に浸し
て反応を停止させた。

（４）ガングリオシド純品混合物及びＭ１４のガングリ
オシドのモノクローナル抗体Ａ１．２６７と反応させた
ＴＬＣプレート上での酵素免疫染色法の結果第１図は左
のレーンから、ガングリオシド純品のｍ合物（ＧＭ３＋
ＧＭ２＋ＧＭＩ＋ＧＤ３＋ＧＤ２）を几ｃにかけテレゾ
ルシノールで染色したもの、ヒトメラノーマ細胞株旧４
のガングリオシド分画をＴＣＬにがけてレゾルシノール
で染色したもの、Ｍ１４のガングリオシド分画をＴＣＬ
にかけた後Ａ１．２６７で酵素免疫染色を行なったもの
である。（レーン番号３）この図のレーン番号３で示さ
れるように、モノクロナール抗体Ａ１．２６７はガング
リオシドＧＤ２とＧＤ３とに反応している。

その他のガングリオシド純品および中性糖脂質純品につ
いても各々ＴＣＬにかけた後モノクローナル抗体Ａ１．
２６７で酵素免疫染色を行なった。これらの結果につい
ては図には示さず、第１図の内容と合わせて、Ａ１．２
６７との反応性を表１に示す。

表　　１ ＧＤ３　　＋＋　　０Ｍ３　− ＧＤ２　　＋＋＋　　０Ｍ２　− ＧＤｌａ　　−ＧＭＩ　　− ＧＤｌｂ　　＋＋　　ＧｌｃＣｅｒ　　−ＧＴｌａ　　
＋＋　　ＬａｃＣｅｒ　　−ＧＴｌｂ　　＋　　Ｇｇ０
ｓ３Ｃｅｒ　−ＧＱｌｂ　　＋＋　　ＧｇＯｓ、Ｃｅｒ
　−−ＧＴ３　　　　ＧｂＯｓ、Ｃｅｒ− ＧＴ２　　　　ＧｂＯｓ、Ｃｅｒ　− ０Ｍ４　− 表１から分かるように本発明のモノクローナル抗体は七
ノーシアロシルーガングリオシド（０Ｍ４．０Ｍ３．０
Ｍ２およびＧＭＩ）、および中性糖脂質（ＧｌｃＣｅｒ
、ＬａｃＣｅｒ、ＧｇＯｓ、Ｃｅｒ、　ＧｇＯｓ、Ｃｅ
ｒ、　Ｇｇ０ｓ３ＣｅｒおよびＧｂＯｓ４Ｃａｒ）とは
反応しない。

即ち、Ａ１．２６７はＮｅｕＡｃ　ａ　２　→８Ｎｓｕ
Ａｃ　ａ　２−）　３Ｇａｌという三糖構造を持つＧＤ
３、ＧＤ２．　ＧＤｌｂ、　ＧＴｌａ、　ＧＴｌｂおよ
びＧＱｌｂと反応し、他のガングリオシドとは反応しな
い。最も強く反応するのがＧＤ２であり逆に最も反応が
弱いのはＧＴｌｂである。ＧＤ２にガラスダース１個が
付加されたＧＤｌｂは反応性が弱くなり、ＧＤＩｂに更
にシアル酸が末端ガラスドース残基に付加されたＧＴｌ
ｂはもっと反応性が落ちる。この知見からシアル酸が°
末端のガラクトース残基（ＧＤｌｂ）や末端のシアン酸
残基（ＧＴｌｂ）に付加することによって、抗原決定基
であるＮｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌは
マスクされることが示唆される。一方、ＧＴｌｂの末端
シアル酸残基にシアル酸が付加したＧＱｌｂはＧＤｌｄ
のレベルまで反応性が回復する。ＧＴｌａは反応性はＧ
Ｑｌｂと同程度であるから、ＧＱｌｂの認識部位は末端
の三糖であるはずである。以上から、Ａ１．２６７はガ
ラクトース残基（場所は内部、末端を問わない）に結合
したジシアロシル残基ｒＮｅｕＡｃα２→８ＮａｕＡｃ
α２→３」を認識していることが判明した。

次に４種類のＧＤ３（ＧＤ３（ＮａｕＡｃ、　ＮｅｕＡ
ｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮａｕＧｃ）、　ＧＤ３
（ＮａｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、およびＧＤ３（Ｎｅｕ
Ｇｃ、　ＮｅｕＧｃ））とモノクローナル抗体のＴＬＣ
プレート上で酵素免疫染色法の結果は第２図に示されて
いる。

第２図（Ａ）は４種類のＧＤ３をＴＬＣにかけ、レゾル
シノールで染色したものである。左からガングリオシド
純品の混合物（ＧＭ３＋ＧＭ１＋ＧＤ３）、レーン番号
１はＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）、レーン番号
２はＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＧｃ）、レーン番号
３はＧＤ３　（ＮｅｕＧｃ　。

ＮｅｕＡｃ）、レーン番号４はＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　
ＮｅｕＧｃ）である。第２図（Ｂ）はＡ１．２６７によ
るＴＬＣの酵素免疫染色の結果である。レーン番号とＧ
Ｄ３の種類は第２図（Ａ）と同じである。

Ａ１．２６７が反応したのはＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　Ｎ
ｅｕＡｃ）とＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）であ
る。この結果はＡ１．２６７のガングリオシドの認識に
は三糖の内部シアル酸が必須であり、かつ該シアル酸は
ＮｅｕＡｃ残基でなければならないことを示している。

内部シアル酸がＮａｕＡｃでなく、ＮｅｕＧｃの時は′
Ｌ２ｐ識されていない。−方、末端シアル酸残基はＮｅ
ｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃのいずれでも＾１．２６７に認識
されている。すると、　Ａ１．２６７の抗原決定基はＳ
ｉａ　ａ　２−＋８ＮｅｕＡｃ　ａ　２−’）３Ｇａｌ
残基となるはずである。

以上の結果をまとめると、モノクローナル抗体Ａ　Ｉ　
、　２６７の細胞表面ガングリオシドに対する認識の特
異性は。

ＧＤ２＞ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）＋　ＧＤ
３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）。

ＧＤｌｂ、　ＧＴｌａ、　’ＧＱ１ｂ＞ＧＴＩであると
考えられる。

この特異性のパターンは本発明者が先に出願したＰＣＴ
／ＪＰ８７１００６９０の実施例に記載のモノクローナ
ル抗体ＭｏＡ２と全く同じである。但しＭｏＡ２は免疫
グロブリンのクラスが（ＩｇＭ、に）であって、Ａ１．
２６７のクラス（ＩｇＧ、に）とは異なっている。

去傭＃１４　（％　／　’ｙ　ｏ　：ｊ」ｌ買はＡ１．
４１０ｑ８１　Ｎ）Ｂａｌｂ／ｃ系のヌードマウスの腹
腔にブリステン０．５ｍＱ投与し２７日後に実施例１区
より得られたハイブリドーマＡ１．．４１０（ＦＥＲＭ
　Ｐ−９！１９３　）約５〜１０ＸＩＯ’細胞を腹腟内
接種して腹水化を行なった。

１〜２週間後に腹水を採取し、３．００Ｏｒ、ｐ、＋ａ
、、１５分間の遠心により上清上層部分のブリステンと
沈澱物である細胞塊を取り除いたモノクローナル抗体が
含まれる中間層の部分を回収した。

に記により回収された溶液１０＠Ｑに硫酸アンモニウム
を最終濃度５０％となるように加えて、塩析した。これ
を１０，０００ｒ、ｐ、’ｌｆ１．．３０分間の遠心に
かけ、沈澱した分画をＰＢＳ（ｐ１１７．２の０．０１
Ｍ燐Ｍｉ１衝液に０．１５Ｍ　ＮａＣＱを加えた燐酸緩
衝塩溶液）　１０ｍＭに溶かした。この溶液をＰＢＳ　
１，０００ｍ１２に対して３回透析を繰り返し、免疫グ
ロブリン分画とした。

次いで該免疫グロブリン分画を、０，０３Ｍ　ＮａＣＱ
を含むｐＨ８，０の燐酸Ｈ１１Ｂ液に対して十分に透析
した。

別にこれと同じ緩衝液で平衡化しておいたイオン交換樹
脂ＤＥ５２カラム（ワットマン社製）に該透析液をかけ
、ＤＥ５２カラムに吸着されなかった両分を回収した。

この回収された両分をＰＢＳに対して透析を行なったも
のを精製ＩｇＧ抗体とし、モノクローナル抗体をＡ１．
４１０を得た。

実遣−夕Ｌ５（モノ先且二ｊ）吃疲体岐、４１０の杵天
４ｙモノクローナル抗体Ａ１．４１０が認識しているガ
ングリオシドを決定するために、薄層クロマトグラフィ
ー（以下ＴＬＣと称す）上での酵素免疫染色法を行なっ
た。

（１）ヒトメラノーマ株Ｍ１４のガングリオシド分画と
糖脂質純品の調製 Ｍ１４のガングリオシド分画の調製はＴａｉ、　Ｔ、　
ｅｔａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０．５３９２−５３９６（１９８
３）に従った。

ガングリオシドＧＭＩ、　ＧＤｌａ、ＧＤＩｂ、　ＧＴ
ｌｂはウシの脳から調製し、Ｋａｎｆｅｒ、　Ｊ、　Ｎ
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

旦、　６６０−６６４（１９６９）に従って精製した。

ＧＯＩｂはヤトロン社から購入した。ヒト脳のＧＭ３は
スウェーデンのＧｏｔｅｂｏｒｇ大学の１４．　Ｓｖｅ
ｎｎｅｒｈｏ１ｍ博士から入手した。０Ｍ２とＧＤ２は
それぞれ０Ｍ２とＧＤｌｂから、ウシ來丸β−ガラクト
シダーゼ（アメリカのミシガン大学のＪ、　Ｗ、　Ｊｏ
ｕｒｄｉａｎ博士から入手）を用いて調製した。ヒトミ
ニリンの０Ｍ４とヒト脳のＧＴｌａは東京都臨床医学総
合研究所の有賀博士から入手した。クマ赤血球のＧＤ３
（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｅ）、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ。

ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、
およびＧＤ３　（ＮｅｕＧｃ　＋ＮｅｕＧｃ）は東京都
臨床医学総合研究所の橋本博士と鈴木明身博士から入手
した。ＬａｃＣｅｒ、　ＧｇＯｓ、Ｃｅｒ。

およびＧｇ０ｓ４ＣｅｒはそれぞれＧＭ３．０Ｍ２．　
ＧＭＩから弱酸で処理し、イアトロビーズカラムクロマ
トグラフィーで精製して調製した＊　Ｇ］、ｃＣｅｒは
Ｔａｉ、　Ｔ。

ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８０．５３９２−５３９６（１９
８３）に従って調製した。　ＧｂＯｓ、ＣｅｒとＧｂＯ
ｓ、Ｃｅｒは５ｕｐｅｌｃｏ社（アメリカ、ペンシルバ
ニア州、ベラフオンテ）から購入した。

（２）　ＴＬＣの方法 メルク社製のシリカゲルを塗布済みのＴＬＣプレート「
シリカゲル６０」（厚さ２００μｍ）と同じくメルク社
製のシリカゲルを塗布済みのＴＬＣプラスチックシート
を使用した。クロマトグラムの展開溶媒はクロロフォル
ム／メタノール１０．２２％ＣａＣ１，水溶液を容積比
５５／４５／１０としたものを用いた。　　ＴＬＣプレ
ート上に展開されたガングリオシドの染色にはレゾルシ
ノール（ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　）染色を、中性糖脂質
の染色にはオルシノール（ｏｒｃｉｎｏｌ）染色を用い
た。

（３）　ＴＬＣプレート上での酵素免疫染色法ガングリ
オシドのＴＬＣ終了後、ＴＬＣプレートをウシ血清アル
ブミン１％とポリビニールピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎ
ｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）　１％とを含有する燐酸緩
衝塩溶液に浸した。空気中で乾燥させた後、プレートを
モノクローナル抗体溶液（１０Ｍｇ／ｍＱ）と２時間２
５℃で反応させた。次に燐酸緩衝塩溶液（以下ＰＢＳと
称す）を５回交換しつつその中でクロマトグラムを洗浄
した。そして西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた
ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体をこのクロマ１−
グラムと２５℃で２時間反応させた。

再びＰＢＳを５回交換しつつその中でクロマトグラムを
洗浄した。染色に当たっては４００μｇ／ａＱ（１）０
−フェニレンジアミンと０．１２％の過酸化水素を含む
クエン酸−燐酸緩衝液（ｐＨ５，０，８０ｍＭ）を用い
、１５分間反応させた。その役、水に浸して反応を停止
させた。

（４）　Ｍ１４のガングリオシドのモノクローナル抗体
とを反応させたＴＬＣプレート上での酵素免疫染色法の
結果 第１図は左のレーンから、ガングリオシド純品の混合物
（ＧＭ３４ＧＭ２＋Ｇ旧＋ＧＤ３＋ＧＤ２）をＴＬＣに
かけてレゾルシノールで染色したもの、ヒトメラノーマ
細胞株Ｍ１４のガングリオシド分画をＴＣＬにかけてレ
ゾルシノールで染色したもの、Ｍ１４のガングリオシド
分画をＴＣＬにかけた後Ａ１．４１０で酵素免疫染色を
行なったものである。（レーン番号５）この図のレーン
番号５で示されるように、モノクロナール抗体Ａ１．４
１０はＧＤ２にのみ反応している。

その他のガングリオシド純品および中性糖脂質純品につ
いても各々ＴＣＬにかけた後モノクローナル抗体Ａ１．
４１０で酵素免疫染色を行なった。これらの結果につい
ては図には示さず、第１図の内容と合わせて、Ａ１．４
１０との反応性を表２に示す。

表　　　２ ガングリオシド反応性　ガングリオシド反応性ＧＤ３　
　　　　　　　　　０Ｍ３　　　　−ＧＤ２　　　　　
＋＋＋　　　　　０Ｍ２　　　　−ＧＤｌａ　　　　　
　　　　　ＧＭＩ　　　　　−ＧＤｌｂ　　　　　　　
　　　ＧｌｃＣｅｒ　　　　−ＧＴ　１３　　　　　　
　　　　ＬａｃＣａｒ　　　　−ＧＴｌｂ　　　　　　
　　　　ＧｇＯｓ：１Ｃｅｒ　　　−ＧＱｌｂ　　　　
　　　　　　Ｇｇ０ｓ４Ｃｅｒ　　　−ＧＴ３　　　　
　　　　　　　ＧｂＯｓ、Ｃｅｒ　　　−ＧＴ２　　　
　　　　　　　　Ｇｇ０ｓ４Ｃａｒ　　　−ＧＭ４　　
　　− 表２から分かるように本発明のモノクローナル抗体ＡＩ
、４１０はモノ−シアロシル−ガングリオシド（ＧＭ４
．０Ｍ３．０Ｍ２およびＧＭＩ）、および中性糖脂質（
Ｇ１．ｃＣｅｒ、　　ＬａｃＣｅｒ、　０ｇ０ｓ３Ｃａ
ｒ％　Ｇｇ０ｓ４Ｃａｒ、　　ＧｂＯｓ、Ｃｅｒおよび
ＧｂＯｓ、Ｃｅｒ）とは反応しない。

次に４種類のＧＤ３（ＧＤ３（ＮａｕＡｃ、　ＮｅｕＡ
ｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（
ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、およびＧＤ３（ＮｅｕＧ
ｃ、ＮｅｕＧｃ））とモノクローナル抗体Ａ１．４１０
のＴＬＣプレート上で酵素免疫染色法の結果は第２図の
（Ｃ）に示されている。Ａ１．４１０はこれらの何れと
も反応しなかった。

以上のように、少なくとも反応性試験を行なったガング
リオシドの範囲内ではモノクローナル抗体Ａ１．４ＬＯ
は細胞表面ガングリオシドに対してはＧＤ２とのみ反応
した。

スー施朋６　モノクローナル　　Ａ１．４２５の　　ｙ
Ｂａｌｂ／ｃ系のヌードマウスの腹腔にブリステン０．
５ｍΩ投与し、７日後に実施例１により得られたハイブ
リドーマＡ１．４２５（Ｆ！ＥＲＭ　Ｐ−９９９４）約
５〜１０ｘｉｏ’細胞を腹腟内接種して腹水化を行なっ
た。

１〜２週間後に腹水を採取し、３　、０ＯＯｒ、３．ｍ
、、１５分間の遠心により上清上層部分のブリステンと
沈澱物である細胞塊を取り除いたモノクローナル抗体が
含まれる中間層の部分を回収した。

上記により回収された溶液１０ｍ１２に硫酸アンモニウ
ムを最終濃度５０％となるように加えて、塩析した。こ
れを１０，０ＯＯｒ、ｐ、＋ａ、、３０分間の遠心にか
け、沈澱した分画をＰＢＳ（ｐＨ７，２の０．０１Ｍ燐
酸緩衝液に０．１５Ｍ　ＮａＣ４を加えた燐酸緩衝塩溶
液）　１０＋＋＋Ｑに溶かした。この溶液をＰＢＳ　１
，０００ｍＭに対して３回透析を繰り返し、免疫グロブ
リン分画とした。

次いで該免疫グロブリン分画を、０，０３Ｍ　ＮａＣＱ
を含むＰＩ＋８．０の燐酸緩衝液に対して十分に透析し
た。

別にこれと同じ緩衝液で平衡化しておいたイオン交換樹
脂ＤＨ５２カラム（ワットマン社製）に該透析液をかけ
、　ＤＥ５２カラムに吸着されなかった両分を回収した
。この回収された両分をＰＢＳに対して透析を行なった
ものを精製ＩｇＧ抗体とし、モノクローナル抗体Ａ１．
４２５を得た。

失週−例７（モノクローナル抗体Ａ１．４２５（１）＃
踵（’ｌ）−モノクローナル抗体４１．４２５が認識し
ているガングリオシドを決定するために、薄層クロマト
グラフィー（以下ＴＬＣと称す）上での酵素免疫染色法
を行なった。

（１）ヒトメラノーマ株Ｍ１４のガングリオシド分画と
糖脂質純品の調製 Ｍ１４のガングリオシド分画の調製はＴａｉ、　Ｔ、　
ｅｔ’ａ１．、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａむ１．　　Ａｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、　　ＬＩＳＡ　　８０．　５３９２−５
３９６（１９８３）に従った。

ガングリオシドＧＭ１、ＧＤｌａ、　ＧＤｌｂ、　ＧＴ
ｌｂはウシの脳から調製し、Ｋａｎｆｅｒ、　Ｊ、　Ｎ
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

旦、　６６０−６６４（１，９６９）に従って精製した
。　ＧＱｌｂはヤトロン社から購入した。ヒト脳のＧＭ
３はスウェーデンのＧｏｔａｂｏｒｇ大学のり、　Ｓｖ
ｅｎｎｅｒｈｏ１ｍ博士から入手した。６阿２とＧＤ２
はそれぞれ０Ｍ２とＧＤｌｂから、ウシ來丸β−ガラク
トシダーゼ（アメリカのミシガン大学のＪ、　ＩＩ、　
Ｊｏｕｒｄｉａｎ博士から入手）を用いて調製した。ヒ
トミニリンの０Ｍ４とヒト脳のＧＴｌａは東京都臨床医
学総合研究所の有賀博士から入手した。クマ赤血球のＧ
Ｄ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）、　ＧＤ３（Ｎｅｕ
Ａｃ。

ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮａｕＧｃ、　ＮａｕＡｃ）、
およびＧＤ３　（ＮｅｕＧｃ　。

ＮｅｕＧｃ）は東京都臨床医学総合研究所の橋本博士と
鈴木明身博士から入手したｅ　ＬａｃＣｅｒ＋　ＧｇＯ
ｓ、Ｃｅｒ。

およびＧｇ０８４ＣｅｒはそれぞれＧＭ３．０Ｍ２．　
ＧＭＩから弱酸で処理し、イアトロビーズカラムクロマ
トグラフィーで精製して調製した。ＧｌｃＣｅｒはＴａ
ｉ、　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ　８０．５３９２−５３９６（１９１３
３）に従って調製した。ＧｂＯｓ３ＣｅｒとＧｂＯｓ、
Ｃｅｒは５ｕｐｅｌｃｏ社（アメリカ、ペンシルバニア
州、ベラフォンテ）から購入した。

（２）　ＴＬＣの方法 メルク社製のシリカゲルを塗布済みのＴ１．Ｃプレート
「シリカゲル６０」（厚さ２００μｍ）と同じくメルク
社製のシリカゲルを塗布済みのＴＬＣプラスチックシー
トを使用した。クロマトグラムの展開溶媒はクロロフォ
ルム／メタノール１０．２２％ＣａＣ１□水溶液を容積
比５５／４５／１０としたものを用いた。ＴＬＣプレー
ト上に展開されたガングリオシドの染色にはレゾルシノ
ール（ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　）染色を、中性糖脂質の
染色にはオルシノール（ｏｒｃｉｎｏｌ）染色を用いた
。

（３）　ＴＬＣプレート上での酵素免疫染色法ガングリ
オシドのＴＬＣ終了後、ＴＬＣプレートをウシ血清アル
ブミン１％とポリビニールピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎ
ｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）　１％とを含有する燐酸緩
衝塩溶液に浸した。空気中で乾燥させた後、プレートを
モノクローナル抗体溶液（１０μｇ／ｍＱ）と２時間２
５℃で反応させた０次に燐酸緩衝塩溶液（以下ＰＢＳと
称す）を５回交換しつつその中でクロマトグラムを洗浄
した。そして西洋ワサビベルオキシダ゛−ゼを結合させ
たヤギ抗マウスＩｇＧおよび丁ｇＭ抗体をこのクロマト
グラムと２５℃で２時間反応させた５再びＰＢＳを５回
交換しつつその中でクロマトグラムを洗浄した。染色に
当たっては４００μｇ／ｍＱのＯ−フェニレンジアミン
と０．１２％の過酸化水素を含むクエン酸−燐酸緩衝液
（ｐ１１５．ｏ、８０ｎ＋Ｍ）を用い、１５分間反応さ
せた。その後、水に浸して反応を停止させた。

（４）　８１４のガングリオシドのモノクローナル抗体
とを反応させたＴＬＣプレート上での酵素免疫染色法の
結果 第１図は左のレーンから、ガングリオシド純品の混合物
（ＧＭ３÷ａｉｚ÷ＧＭ１＋ＧＤ３＋ＧＤ２）をＴＬＣ
にかけてし。

ゾルシノールで染色したもの、ヒトメラノーマ細胞株Ｍ
１４のガングリオシド分画を丁ＣＬにかけてレゾルシノ
ールで染色したもの、Ｍ１４のガングリオシド分画をＴ
ＣＬにかけた後Ａ１．４２５で酵素免疫染色を行なった
ものである。（レーン番号６）この図のレーン番号６で
示されるように、モノクロナール抗体Ａ１．４２５はＧ
Ｄ２にのみ反応している。

その他のガングリオシド純品および中性糖脂質純品につ
いても各々ＴＣＬにかけた後モノクローナル抗体Ａ１．
４２５で酵素免疫染色を行なった。これらの結果につい
ては図には示さず、第１図の内容と合わせて、Ａ１．４
２５との反応性を表３に示す。

表　　３ ガングリオシド　反応性　　ガングリオシド　反応性Ｇ
Ｄ３　　　　　　　　　　　　ＧＭ３’　　　　　−Ｇ
Ｄ２　　　　　　＋＋＋　　　　　　６Ｍ２　　　　　
−ＧＤｌａ　　　　　−ＧＭＩ　　　　　　−ＧＤｌｂ
　　　　　　　　　　　ＧｌｃＣａｒ　　　　−ＧＴｌ
ａ　　　　　　　　　　　ＬａｃＣｅｒ　　　　−ＧＴ
ｌｂ　　　　　　　　　　　ＧｇＯｓ、Ｃｅｒ　　　−
ＧＱｌｂ　　　　　　　　　　　Ｇｇ０ｓ４Ｃｅｒ　　
　−ＧＴ３　　　　　　　　　　　　ＧｂＯｓ、Ｃｅｒ
　　　−ＧＴ２　　　　　　　　　　　　Ｇｇ０ｓ４Ｃ
ｅｒ　　　−０Ｍ４　　　　　− 表３から分かるように本発明のモノクローナル抗体Ａ１
．４２５はモノ−シアロシル−ガングリオシド（０Ｍ４
、ＧＭ３．６Ｍ２およびＧＭＩ）、および中性糖脂質（
ＧｌｃＣｅｒ、　ＬａｃＣｅｒ、　Ｇｇ０ｓ３Ｃａｒ、
　０ｇ０ｓ４Ｃａｒ％ＧｂＯｓ、ＣｅｒおよびＧｇ０ｓ
３Ｃａｒ）とは反応しない。

次に４種類のＧＤ３（ＧＤ３（ＮａｕＡｃ、　ＮｅｕＡ
ｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（
ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、およびＧＤ３（ＮｅｕＧ
ｃ、　ＮｅｕＧｃ））とモノクローナル抗体ＡＩ、４２
５のＴＬＣプレート上で酵素免疫染色法の結果は第２図
（Ｃ）に示されている。

第２図（Ａ）は４種類のＧＤ３をＴＬＣにかけ、レゾル
シノールで染色したものである。左からガングリオシド
純品の混合物（ＧＭ３＋ＧＭ　ｌ＋ＧＤ　１　）、レー
ン番号１はＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、’　ＮｅｕＡｃ）、レ
ーン番号２はＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮａｕＧｃ）、レ
ーン番号３はＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＡｃ）、レ
ーン番号４はＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　ＮｅｕＧｃ）であ
る。第２図（Ｃ）はＡ１．４２５によるＴＬＣの酵素免
疫染色の結果である。レーン番号とＧＤ３の種類は第２
図（Ａ）と同じである。この図の（Ｃ）から判るように
、　Ａ１．４２５はこれらの何れとも反応しなかった。

以上のように、少なくとも反応性試験を行なったガング
リオシドの範囲内ではモノクローナル抗体Ａｔ、４２５
は細胞表面ガングリオシドに対してはＧＤ２とのみ反応
した。

８　モノクローナルＪｉＡ１．２６７の実験動物として
はＣ５７［ＩＬ／６マウスを対照群は１４匹、試験群は
モノクローナル抗体の投与量により２群に分け、各々５
匹使用した。移植腫瘍にはＣ５７／ＢＬ６と同系（ｓｙ
ｎｇｅｎｅｉｃ）のＴ細胞白血病細胞株ＥＬ４を使用し
、２Ｘ１０’個腹腟内に接種した。翌日燐酸緩衝塩類液
０　、２ｍＲに溶かした１００μｇ又は５００μｇのモ
ノクローナル抗体Ａ１．２６７を試験群に、対照群には
同量の鱗酸緩衝塩類液のみを腹腔内に投与し、マウスの
生死を６０日１ａｍした。

結果を表４に示す。なお、抗腫瘍効果の判定にはＭＳＤ
（Ｍｅｄｉａｎ　５ｕｒｖｉｖａｌ　Ｄａｙ；生存日数
中央値）とＩＬＳ（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ｌｉｆｅ　５
ｐａｎ＝　（Ｔ−Ｃ）／Ｃ：延命率）を用いた。

また第３図には対称群とＡ１．２６７を５００μｇ投与
群について、腫瘍細胞移植後の日数経過に対して生残し
ているマウスの割合をグラフに示す６表　　　４ （接種細胞数２Ｘ１０’） 対照群　　　０　　２２．０　　　０　　　０／１４采
丈立１１− 対照群の動物数を９匹、接種細胞数をｌ　Ｘ　１０’個
、接種方法を皮下移植、モノクローナル抗体の投与量を
５００μｇだけとした他は実施例８と同じ条件で実験を
行なった６ 結果を表５に示す。抗腫瘍効果の判定は実施例８と同じ
値を使用した。

第４図は第３図と同様に対照群とＡ１．２６７を５００
μｇ投与群について、腫瘍細胞移植後の日数経過に対し
て生残しているマウスの割合をグラフに示したものであ
る。

表　　　５ （接種細胞数ｌＸ１０’） 対照群　　　０　　２２．５　　　０　　　０／９投与
群　　５００　　＞６０　　　＞１６６．７　　４１５
実施例８および実施例９の結果から判るように、モノク
ローナル抗体Ａ１．２６７の投与によりマウスＴ細胞白
血病の増殖は著しく抑制され、或は移植腫瘍は拒絶され
るに至ったことが示された。

実験動物としてはＣ５７ＢＬ／６マウスを対照群は１４
匹、試験群はモノクローナル抗体の投与量により２群に
分け、各々５匹使用した。移植腫瘍にはＣ５７／Ｂｌ、
６と同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）のＴ細胞白血病細胞株
１’：１４を使用し、２ｘｌＯ’個腹腔内に接種した。

翌日燐酸緩衝塩類液０　、２ｍ（ｌに溶かした１００μ
ｇ又は５００μｇのモノクローナル抗体Ａｔ、４１０を
試験群に、対照群には同量の燐酸緩衝塩類液のみを腹腔
内に投与し、マウスの生死を６０日間観察した。

結果を表６に示す。なお、抗腫瘍効果の判定にはＭＳＤ
（Ｍｅｄｉａｎ　５ｕｒｖｉｖａｌ　Ｄａｙ；生存日数
中央値）とＩＬＳ（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ｌｉｆｅ　５
ｐａｎ＝（Ｔ−Ｃ）／Ｃ；延命率）を用いた。

また第５図には対称群とＡ１．４１０を５００μｇ投与
群について、腫瘍細胞移植後の日数経過に対して生残し
ているマウスの割合をグラフに示す。

表　　　６ （接種細胞数２Ｘ１０’） 対照群　　　０　　２２．０　　　０　　　０／１４対
照群の動物数を９匹、接種細胞数をｔ　ｘ　ｔｏ’個、
接種方法を皮下移植、モノクローナル抗体の投与量を５
００μｇだけとした他は実施例１０と同じ条件で実験を
行なった。

結果を表７に示す。抗腫瘍効果の判定は実施例１０と同
じ値を使用した。

第６図は第５図と同様に対照群とＡ１．４１０を５００
μｇ投与群について、腫瘍細胞移植後の日数経過に対し
て生残しているマウスの割合をグラフに示したものであ
る。

表　　　７ （接種細胞数ｌＸｌ０’） 対照群　　　０　　２２．５　　　０　　　０／９投与
群　　５００　　６０．５　　６２．２　　１１５大週
−例１２　（モノクロ二丈ｐ皿木へＪ−リリ旦９−疲腫
−済蘇孟ユ） 対照群の動物数を８匹、接種細胞数をｉ　ｘ　ｔｏ５個
、接種方法を皮下移植とし、モノクローナル抗体の投与
方法を静脈投与（ｉｖ）と腹Ｊ控内投与（ｉｐ）の両方
で行なった。他は実施例１０と同じ条件で実験を行なっ
た。

結果を表８に示す。抗１１！Ｔ！瘍効果の判定は実施例
１０と同じ値を使用した６ 表　　　８ （接種細胞数ｌＸｌ０’） ２０２６．５１８．８０１５ １ν投与　　１００　　３１．５４１．３　　０１５５
００４４．５９９．６２１５ ２０２５゜５１４．３０１５ ｉｐ投与　　１００　　３７，５　　６８．２　　０１
５５００３９．５７７．１２１５ 実施例１０、実施例１１および実施例１２の結果から判
るように、モノクローナル抗体Ａ１．４１０の投与によ
りマウスＴ細胞白血病の増殖は著しく抑制され、或は移
植腫瘍は拒絶されるに至ったことが示された。

実験動物としてはＣ５７ＤＬ／６マウスを対照群は１４
匹、試験群はモノクローナル抗体の投与量により２群に
分け、各々５匹使用した。移植腫瘍にはＣ５７／ＢＬ６
と同系（Ｓｙｎｇｅｎ８ｉＣ）のＴ細胞白血病細胞株［
Ｅ＋、４を使用し、２ＸｌＯ”側腹腔内に接種した。翌
［１燐酸緩衝塩類液０．２ｍυに溶かした１００μｇ又
は５００μにのモノクローナル抗体Ａ１．４２５を試験
群に、対照群には同量の燐酸緩？＃塩類液のみを腹腔内
に投与し、マウスの生死を６０日間ＩＩＦ；％した。

結果を表９に示す、なお、抗腫瘍効果の判定にはＭＳＤ
（Ｍｅｄｉａｎ　５ｕｒｖｉｖａｌ　Ｄａｙ；生存日数
中央値）とＩＬＳ（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓ
ｐａ＋１＝（Ｔ−Ｃ）／Ｃ；延命率）を用いた。

また第７図には対照群とＡ１．４２５を５００μｇ投与
群について、腫瘍、細胞移植後の日数経過に対して生残
しているマウスの割合をグラフに示す。

表　　９ （接種細胞数２Ｘ１０４） 対照群　　　０　　２２．０　　　０　　　０／１４処
來丈攻フー） 対照群の動物数を９匹、接種細胞数をｌＸｌ０’個。

接種方法を皮下移植、モノクローナル抗体の投４量を５
００μｇだけとした他は実施例３と同じ条件で実験を行
なった。

結果を表１０に示す。抗腫瘍効果の判定は実施例１３と
同じ値を使用した。

第８図は第７図と同様に対照群とＡ１．４２５を５００
μｇ投与群について、腫瘍細胞移植後の日数経過に対し
て生残しているマウスの割合をグラフに示したものであ
る。

表　　１０ （接種細胞数ＩＸ］、０’） 対照群　　　０　　２２．５　　　０　　　０／９投与
群　　に００　　３９．５　　７５．６　　１１５実施
例１３、および実施例１／ｌの結果から判るように、モ
ノクローナル抗体Ａ１．４２５の投与によりマウスＴ細
胞白血病の増殖は著しく抑制され、或は移植腫瘍は拒絶
されるに至ったことが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は左のレーンから、、ガングリオシド純品の混合
物（ＧＭ３＋ＧＭ２＋ＧＭ１＋ＧＤ３＋ＧＤ２）をＴＬ
Ｃにかけてレゾルシノールで染色したもの、ヒトメラノ
ーマ細胞株Ｍ１４のガングリオシド分画をＴＬＣにかけ
てレゾルシノールで染色したもの、Ｍ１４のガングリオ
シド分画をＴＬＣにかけた後Ａ１．２６７、Ａ１．４１
０及びＡ１．／１２５で酵素免疫染色を行なったもので
ある。 第２図（Ａ）は４種類のＧＤ３をＴＩ、Ｃにかけ、レゾ
ルシノールで染色したものである。左からガングリオシ
ド純品の混合物（０Ｍ３＋Ｇ旧＋ＧＤ３）、レーン番号
１はＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＡｃ）、レーン番号
２はＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、　ＮｅｕＧｃ）、レーン番号
３はＧＤ３（ＮａｕＧｃ。 ＮｅｕＡｃ）、レーン番号４はＧＤ３（ＮｅｕＧｃ、　
ＮｅｕＧｃ）である。第２図はＡｔ、２６７、Ａ１．．
４１０及びＡ１．４２５＆、：よル’ｒＬＣの酵素免疫
染色の結果である。レーン番号とＧＤ３の種類は共通で
ある。 第３図、第５図及び第７図には、Ｃ５７／ｎＬ６マウス
を用い、移植腫瘍としてこれと同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉ
ｃ）のＴ細胞白血病細胞株ＥＬ４を使用し、２ＸｌＯ’
個腹腟内に接種したものに対して、対照群とＡ１．２６
７、Ａ１．４１０及びＡ１．４２５をそれぞれ５００μ
ｇ投与した群について、腫瘍細胞移植後の日数経過と生
残マウスの数の関係をグラフに示す。 第４図、第６図及び第８図は、接種細胞数を１ＸＩＯ’
個、接種方法を皮下移植とした他は第３図と同じ条件で
実験を行ない、対照群とＡ１，２６７、Ａ１．４１０及
びＡ１．４２５をそれぞれ５００μ＆投与した群につい
て、腫瘍細胞移植後の日数経過と生残マウスの数の関係
をグラフに示したものである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 （Ａ）　　　　　（Ｂ）　　　　　　　・・Ｓｔｃｌｓ
Ｍ１４　　１　　２　　３　　４　　５’　　　６経過
日数 経過日数 手続補正書（鏝） 昭和６３年　８月１８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞白血病細胞株Ｅ
   Ｌ４でＡ系マウスを免疫することにより得られる抗体産
   生細胞とＢａ１ｂ／ｃ系マウス由来の骨髄腫細胞株ＮＳ
   １とを融合させることにより得られるハイブリドーマが
   産生し、免疫グロブリンクラスが（ＩｇＧ３、ｘ）であ
   って、細胞表面ガングリオシドに対する認識の特異性の
   強さにおいて、 ＧＤ２＞ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＡｃ）、ＧＤ３（
   ＮｅｕＧｃ、ＮｅｕＡｃ）、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＱ
   １ｂ＞ＧＴ１ であるモノクローナル抗体Ａ１．２６７を有効成分とす
   る抗腫瘍剤。 ２、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞白血病細胞株Ｅ
   Ｌ４でＡ系マウスを免疫することにより得られる抗体産
   生細胞とＢａ１ｂ／ｃ系マウス由来の骨髄腫細胞株ＮＳ
   １とを融合させることにより得られるハイブリドーマが
   産生し、免疫グロブリンクラスが（ＩｇＧ３、ｘ）であ
   って、細胞表面ガングリオシドＧＤ２を認識するモノク
   ローナル抗体Ａ１．４１０を有効成分とする抗腫瘍剤。 ３、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞白血病細胞株Ｅ
   Ｌ４でＡ系マウスを免疫することにより得られる抗体産
   生細胞とＢａ１ｂ／ｃ系マウス由来の骨髄腫細胞株ＮＳ
   １とを融合させることにより得られるハイブリドーマが
   産生し、免疫グロブリンクラスが（ＩｇＧ３、ｘ）であ
   って、細胞表面ガングリオシドＧＤ２を認識するモノク
   ローナル抗体Ａ１．４２５を有効成分とする抗腫瘍剤。