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JP7788558B2 - キャップアナログ及びその使用 - Google Patents

キャップアナログ及びその使用

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JP7788558B2
JP7788558B2 JP2024536341A JP2024536341A JP7788558B2 JP 7788558 B2 JP7788558 B2 JP 7788558B2 JP 2024536341 A JP2024536341 A JP 2024536341A JP 2024536341 A JP2024536341 A JP 2024536341A JP 7788558 B2 JP7788558 B2 JP 7788558B2
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Description

本発明は、化学・生物工学分野に関し、より具体的には、インビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡ合成に有用な一連のキャップアナログ、及びｍＲＮＡ合成におけるキャップアナログの使用に関する。
インビトロ転写によるｍＲＮＡ合成は、外因性遺伝子を導入してタンパク質を発現するための重要なツールになっており、且つ疾患の治療や予防に広範に適用されている。外因性ｍＲＮＡに誘発される免疫反応は、異なる経路を介して標的タンパク質の発現に影響を与える。
Ｎ１－２’Ｏ－メチル化は、ＲＩＧ－Ｉ活性化の阻害にとって非常に重要であり、細胞内のＮ１－２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼのノックアウトも、内因性ＲＮＡの免疫刺激を引き起こす。２’Ｏ－メチル化とｍ７Ｇキャップの相乗効果により、ＲＮＡとＲＩＧ－Ｉの結合親和性は低下される。
ｍＲＮＡ転写の過程において、ＩＦＩＴ１と翻訳因子ＥＩＦ４ＥはｍＲＮＡテンプレートと競争的に結合できる。キャップ構造と２’Ｏ－メチル化を持つ内因性及び外因性ｍＲＮＡは、ＥＩＦ４Ｅに結合されることにより、転写を開始する。しかし、外因性ｍＲＮＡの一番目のシリボースに２’Ｏ－メチル化が欠けていると、ＩＦＩＴ１によって認識されるようになり、これで、細胞内の因子との結合が阻害され、転写の進行が阻害される。しかしながら、Ｎ１メチル化は単独で、全ての内因性ｍＲＮＡをＩＦＩＴ１から十分に保護することができず、Ｎ１とＮ２シリボースでの２’Ｏ－メチル化に対するＩＦＩＴ１の認識により、メチル基とこれらのタンパク質残基のコンフリクトは示される。
従って、本分野において、インビトロ転写で合成されるｍＲＮＡによる免疫反応の発生を有効に抑制できるように、新規なキャップアナログの開発は切望されている。
本発明は、一般式（Ｉ）で表される構造を持つ新規なキャップアナログ及びその使用の提供を目的とする。
本発明の第一の態様は、式（Ｉ）で表されるキャップアナログを提供する：

式中、Ｂ１とＢ２はそれぞれ天然の塩基又は修飾された塩基であり；
ＥとＦはそれぞれ０又は１であり；
Ｒ１はＨ、ＯＨ、アルキル基、Ｏ－アルキル基、ハロゲンであり、或いは酸素であり且つ前記酸素が３’及び５’位のＣと橋架け環を形成し；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、アルキル基、Ｏ－アルキル基又はハロゲンであり；
Ｒ３はＯ－Ｒ５－Ｒ６であり；
Ｒ４は水素、ヒドロキシ基、Ｏ－メチル基又はＯ－Ｒ５－Ｒ６であり；
Ｒ５は置換又は非置換のＣ１－２０アルキル基であり；
Ｒ６は置換又は非置換のＯ－アルキル基、置換又は非置換のＳ－アルキル基、置換又は非置換のＮＨ－アルキル基、置換又は非置換のＮ－ジアルキル基、置換又は非置換のＯ－アリール基、置換又は非置換のＳ－アリール基、置換又は非置換のＮＨ－アリール基、置換又は非置換のＯ－アラルキル基、置換又は非置換のＳ－アラルキル基、置換又は非置換のＮＨ－アラルキル基、又は水素（Ｒ５が置換又は非置換のＣ２－２０アルキル基である場合）であり；
Ｘ１、Ｘ２とＸ３はそれぞれＯ、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｙ１、Ｙ２とＹ３はそれぞれＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＢＨ３である。
もう一つの実施形態において、Ｒ３はＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
もう一つの実施形態において、Ｒ４はヒドロキシ基、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
もう一つの実施形態において、Ｂ１とＢ２はそれぞれアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、グアニン、ウラシル又はチミンである。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、又はｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、又はｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、又はｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵ、ｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＡ、ｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、又はｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、又はｍ７ＧｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２Ｏ－’ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、又はｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＧ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、又はｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＵ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログは、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン） ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ２’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ、ｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＡ、ｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、ｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＣ、又はｍ７Ｇ３’Ｏｍｅｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＵからなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記キャップアナログの構造は、式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）で表される：
式中、Ｂ１とＢ２はそれぞれ天然の塩基又は修飾された塩基であり；
Ｒ３はＯ－Ｒ５－Ｒ６である。
もう一つの実施形態において、Ｒ３はＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
もう一つの実施形態において、Ｂ１とＢ２はそれぞれアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、グアニン、ウラシル又はチミンである。
本発明の第二の態様は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）少なくとも一つのＯＲＦ領域；
（ｂ）少なくとも一つのＫｏｚａｋ配列の５’ＵＴＲ；
（ｃ）３’ＵＴＲ；及び
（ｄ）少なくとも一つの５’開始キャップを持つ上述のような本発明にかかるキャップアナログ
を含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明の第三の態様は、上述のような本発明にかかるポリヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
もう一つの実施形態において、前記担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）又はエマルション（ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）からなる群から選ばれる。
本発明の第四の態様は、下記の工程を含む上記のような本発明にかかるポリヌクレオチドの製造方法を提供する：
（１）ＤＮＡテンプレートを調製する：
（２）ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及び上記のような本発明にかかるキャップアナログを含む反応系中で、インビトロ転写反応を行うことにより、上記のような本発明にかかるポリヌクレオチドを得る。
もう一つの実施形態において、前記ヌクレオシド三リン酸は、天然塩基のヌクレオシド三リン酸であってもよく、修飾されたヌクレオシド三リン酸又は非天然のヌクレオシド三リン酸であってもよい；好ましくは、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、５ｍｅ－ＣＴＰ、５ｍｅ－ＵＴＰ、ＰｓｅｕｄｏＵＴＰ又はＮ１－ｍｅ－ＰｓｅｕｄｏＵＴＰである。
もう一つの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージ由来ＲＮＡポリメラーゼである。
もう一つの実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７、ＳＰ６又はＴ３からなる群から選ばれる。
もう一つの実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列が天然配列と同一であるファージ由来ＲＮＡポリメラーゼの変異体であってもよい。
本発明によれば、インビトロ転写で合成されるｍＲＮＡによる免疫反応の発生を有効に抑制できるように、新規なキャップアナログを提供できた。
実施例１にかかるキャップアナログの合成経路を示す。 実施例１にかかるキャップアナログの合成経路を示す。 実施例１にかかるキャップアナログの合成経路を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍＲＮＡのタンパク質発現状況を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍＲＮＡとＲＩＧ－Ｉの相対的結合能を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍＲＮＡとＩＦＩＴ１の相対的結合能を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍＲＮＡによる免疫原性誘導の計測結果を示す。 実施例で得られたキャップアナログｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ ｍＲＮＡのタンパク質発現状況を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ ｍＲＮＡとＲＩＧ－Ｉの相対的結合能を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ ｍＲＮＡとＩＦＩＴ１の相対的結合能を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ ｍＲＮＡによる免疫原性誘導の計測結果を示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログのキャッピング効率のＨＰＬＣスペクトルであり、ただし、Ａはｍ７ＧｐｐｐＡｐＧのことを、Ｂはｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧのことを、Ｃはｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧのことを、Ｄはｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧのことを、Ｅはｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧのことを、Ｆはｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧのことを、Ｇはｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ）のことを、Ｈはｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣのことを、Ｉはｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵのことを示す。 実施例で得られた異なるキャップアナログのキャッピング効率のＨＰＬＣスペクトルであり、ただし、Ａはｍ７ＧｐｐｐＡｐＧのことを、Ｂはｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ（対照）のことを、Ｃはｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧのことを、Ｄはｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧのことを示す。
本発明者らは、幅広く深く研究したところ、一連のトリオリゴ核酸ポリマーを合成してスクリーニングし、且つ、式（Ｉ）のキャップアナログを用いたＩＶＴで得られるｍＲＮＡは、それとＩＦＩＴ１の結合が大きく阻害されると共に、ＲＩＧ－Ｉの活性化の阻害においてもより大きな阻害がもたらされることで、免疫反応の発生をより厳格で且つ効果的に抑制できるようになることを初めて見出した。この知見に基づき、本発明を完成した。
本発明は、式（Ｉ）で表される構造を持つキャップアナログを提供する：
式中、Ｂ１とＢ２はそれぞれ天然の塩基又は修飾された塩基であり；
ＥとＦはそれぞれ０又は１であり；
Ｒ１はＨ、ＯＨ、アルキル基、Ｏ－アルキル基（Ｏ－メチル基が挙げられるが、それに限定されない）、ハロゲンであり、或いは酸素であり且つ前記酸素が３’及び５’位のＣと橋架け環を形成し；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、アルキル基、Ｏ－アルキル基（Ｏ－メチル基が挙げられるが、それに限定されない）又はハロゲンであり；
Ｒ３はＯ－Ｒ５－Ｒ６であり；
Ｒ４は水素、ヒドロキシ基、Ｏ－メチル基又はＯ－Ｒ５－Ｒ６であり；
Ｒ５は置換又は非置換のＣ１－２０アルキル基であり；
Ｒ６は置換又は非置換のＯ－アルキル基、置換又は非置換のＳ－アルキル基、置換又は非置換のＮＨ－アルキル基、置換又は非置換のＮ－ジアルキル基、置換又は非置換のＯ－アリール基、置換又は非置換のＳ－アリール基、置換又は非置換のＮＨ－アリール基、置換又は非置換のＯ－アラルキル基、置換又は非置換のＳ－アラルキル基、置換又は非置換のＮＨ－アラルキル基であり；
Ｒ５が置換又は非置換のＣ２－２０アルキル基である場合に、Ｒ６は水素であってもよく；
Ｘ１、Ｘ２とＸ３はそれぞれＯ、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｙ１、Ｙ２とＹ３はそれぞれＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＢＨ３である。
本発明の一つの実施形態において、Ｒ６は水素で且つＲ５は置換又は非置換のＣ２－５アルキル基であり、前記Ｒ３とＲ４はそれぞれ、Ｏ－エチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチル基、Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない；或いは、Ｒ４はヒドロキシ基であり、Ｒ３はＯ－エチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチル基、Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない。
本発明の一つの実施形態において、Ｒ５は置換又は非置換のＣ１－５アルキル基で且つＲ６は置換又は非置換のＣ１－５アルキル基であり、前記Ｒ３とＲ４はそれぞれ、Ｏ－メチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない；或いは、Ｒ４はヒドロキシ基であり、Ｒ３はＯ－メチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない。
本発明にかかる式（Ｉ）で表されるキャップアナログの中の代表的なトリオリゴ核酸ポリマーは、下表に示す：





本発明の一つの実施形態において、提供されるキャップアナログは、下記の式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）で表される構造を持ち、式（Ｉ－ａ）と式（Ｉ－ｂ）は異なる立体配座であり、ただし、式（Ｉ－ａ）はβ配座で、式（Ｉ－ｂ）はα配座である：
式中、Ｂ１とＢ２はそれぞれ天然の塩基又は修飾された塩基であり；
Ｒ３はＯ－Ｒ５－Ｒ６である。
Ｒ５は置換又は非置換のＣ１－２０アルキル基であり；
Ｒ６は置換又は非置換のＯ－アルキル基、置換又は非置換のＳ－アルキル基、置換又は非置換のＮＨ－アルキル基、置換又は非置換のＮ－ジアルキル基、置換又は非置換のＯ－アリール基、置換又は非置換のＳ－アリール基、置換又は非置換のＮＨ－アリール基、置換又は非置換のＯ－アラルキル基、置換又は非置換のＳ－アラルキル基、置換又は非置換のＮＨ－アラルキル基であり；
Ｒ５が置換又は非置換のＣ２－２０アルキル基である場合に、Ｒ６は水素であってもよい。
本発明の一つの実施形態において、式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）において、Ｒ６は水素で且つＲ５は置換又は非置換のＣ２－５アルキル基であり、前記Ｒ３はＯ－エチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチル基、Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない。
本発明の一つの実施形態において、式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）において、Ｒ５は置換又は非置換のＣ１－５アルキル基で且つＲ６は置換又は非置換のＣ１－５アルキル基であり、前記Ｒ３はＯ－メチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない；或いは、Ｒ４はヒドロキシ基であり、Ｒ３はＯ－メチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－メチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－メチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－エチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－プロピレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ブチレン－Ｏ－ペンチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－エチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－プロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソプロピル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－イソブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ｔ－ブチル基、Ｏ－ペンチレン－Ｏ－ペンチル基等であるが、それらに限定されない。
本発明はさらに、例えば下記の工程を含むオリゴヌクレオチド固相合成プロセスにより、式（Ｉ）、式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）で表される構造を持つキャップアナログを製造する製造方法を提供するが、それに限定されない：
（１）５’－Ｏ－ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳホスホロアミダイト（ｒＡＡｃ、ｒＣＡｃ、ｒＧｄｍｆ、Ｕ）、２’－Ｏ－ＭＯＥ－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト（Ａ２’Ｏ－ＭＯＥ Ａｃ、Ｃ２’Ｏ－ＭＯＥ Ａｃ、Ｇ２’Ｏ－ＭＯＥ ｄｍｆ、Ｕ２’Ｏ－ＭＯＥ）、及び２’－Ｏ－エチル－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト（Ａ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ Ａｃ、Ｃ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ Ａｃ、Ｇ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ ｄｍｆ、Ｕ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ）、ビス－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルＣＥＤホスホロアミダイト等の原料を用いて、固相合成装置によりｐＮｐＮジヌクレオチドを合成する；
（２）ｐＮｐＮジヌクレオチドとリン酸イミダゾレートである７ｍｅ－２’－Ｏ－４’－Ｃ－ロックド－グアノシン５’－二リン酸（ｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡＤＰＩｍ）又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アルファ－Ｌ－リボフラノシルグアノシン５’－二リン酸（ｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡＤＰＩｍ）又はＮ７－メチルグアノシン５’－二リン酸（ｍ７ＧＤＰＩｍ）とを反応させ、式（Ｉ）、式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）で表される構造を持つキャップアナログを生成する。
本発明の一つの実施形態において、例えばＤＥＡＥ－６５０ｓ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）及び半分取ＲＴ－ＨＰＬＣカラムにより、得られるキャップアナログを精製する工程をさらに含むが、それに限定されない。
本発明はさらに、提供される式（Ｉ）、式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）で表される構造を持つキャップアナログを利用して、インビトロ転写でｍＲＮＡを合成するが、下記の工程を含む：
第１の工程で、テンプレートＤＮＡを調製する；
第２の工程で、混合酵素を調製し、反応緩衝液を調製する；
第３の工程で、インビトロ転写反応を行う；
第４の工程で、脱リン酸化処理をする；
第５の工程で、反応液を精製する。
前記第１の工程において、テンプレートは通常、マルチクローニングサイトに標的配列が挿入された直鎖プラスミドからなり、且つ標的配列の前に、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター等の対応するポリメラーゼのプロモーターが存在する必要がある。プラスミドは使用前に直鎖化する必要があり、ＤＮＡは、例えば本分野で一般的に知られている適当な制限エンドヌクレアーゼで消化して直鎖化し、次いでフェノール－クロロホルムで処理した後エタノールで沈殿させる精製を行うことができるが、それらに限定されない。
プラスミドの直鎖化に一般的に使用される制限エンドヌクレアーゼとしては、末端が平滑であるものか、５’末端が突出するものが望ましい（３’突出を産生する酵素でテンプレートを直鎖化すると、異常な転写物が生じる）。
前記第２の工程において、混合酵素を調製するためのものは、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、ピロホスファターゼ等であってもよい。
前記第２の工程において調製される反応緩衝液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、ＭｇＣｌ２、スペルミジン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むが、それらに限定されない。
前記第３の工程において、本発明で提供されるキャップアナログを用いてインビトロ転写反応を行うことができる。
前記第４の工程において、脱リン酸化処理に適用できる試薬は、南極ＴＡＢ５ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、子牛アルカリホスファターゼ等を含むが、それらに限定されない。
前記第５の工程において、例えば高速液体クロマトグラフィー、塩化リチウム沈殿、酢酸アンモニウム沈殿等の本分野で慣用的な方法によって精製することができるが、それらに限定されない。
本発明はさらに、提供されるキャップアナログを含むポリヌクレオチドであって、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに前記の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物等を提供する。
特に断らない限り、明細書と特許請求の範囲に用いられる下記用語は下記の意味を有する。
本発明に用いられるように、「キャップアナログ」とは、真核生物において、転写後修飾によって形成される成熟ｍＲＮＡの５’末端にある構造、即ちメチルグアノシンキャップとしても呼ばれるｍ７ＧＰＰＰＮ構造を指す。このような構造は、ｍＲＮＡの５’末端からの分解を防止し、ＲＮＡ転写産物が核膜の選択的な孔を通過して細胞質に入るのを助け、翻訳を増強し、完全なスプライシングプロセスを完了させるのを助けることができる。
本発明に用いられるように、「塩基」及び「天然塩基」は互換的に使用することができ、両者もまた、核酸塩基、窒素含有塩基とも呼ばれ、ヌクレオチドの構成成分であるヌクレオシドを形成する窒素含有化合物である；それらは、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、ウラシル（U）、又はチミン（T）であってもよい。
「修飾された塩基」とは、天然塩基から一つ又は二つの水素が置換されて得られる物質を指し、例えばＮ６－メチルアデニン等を含むが、それに限定されない。
「アルキル基」とは、脂肪族炭化水素基を指す。アルキル基部分は飽和アルキル基（例えば炭素－炭素二重結合又は炭素－炭素三重結合のような不飽和ユニットを一切含まないもの）であってもよく、或いは、アルキル基部分は不飽和アルキル基（少なくとも一つの不飽和ユニットを含むもの）であってもよい。アルキル基部分は飽和でも不飽和でも、分岐鎖でも直鎖でもよい。１から８個の炭素原子があってもよい（ここに出現する場合、「１から８」のような数値範囲は、記載される範囲内の各整数を指し、例えば、「１から８個の炭素原子」とは、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子等から、８個の炭素原子までを含むアルキル基を指すが、現在の定義は、指定された数値範囲がない場合にも、用語「アルキル基」の出現を含む）。本文に記載の化合物におけるアルキル基は、「Ｃ１－Ｃ６アルキル基」若しくは類似のものに指定されてもよい。例を挙げると、「Ｃ１－Ｃ６アルキル基」とは、アルキル鎖に一つ、二つ、三つ、四つ、五つ又は六つの炭素原子があることを指す。典型的なアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を含むが、それらに限定されない。
「アラルキル基」とは、－アルキル基－アリール基を指し、ただし、アルキル基及びアリール基は本文で定義される通りである。
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を指す。
「アルコキシ基」とは、「Ｏ－アルキル基」を指し、アルキル基は本文で定義される通りである。
「芳香族」とは、４ｎ＋２個のπ電子を含む非局在化π電子系を有する平面環を意味し、ただし、ｎは整数である。芳香族環は、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十つ又はそれ以上の原子からなるものであってもよい。芳香族環は任意に置換される。用語の「芳香族」は、炭素環式アリール基（フェニル基等の「アリール基」）及び複素環式アリール基（又は「ヘテロアリール基」又は「芳香族複素環」）（ピリジン等）を含む。
「置換」とは、参照基が、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ脂肪族炭化水素、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、シアノ基、ハロ基、カルボニル基、チオカルボニル基、ニトロ基、ハロアルキル基、フルオロアルキル基、並びにモノ置換されたアミン基及びジ置換されたアミン基を含むアミノ基、並びにそれらの保護された誘導体からなる群から個々に独立して選択される１つ以上の追加の基によって置換されてもよいことを意味する。例を挙げると、置換基は、ハロゲン、ＣＦ３、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２Ｍｅ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、アルコキシ基、－Ｎ（ＣＨ３）２及びアルキル基からなる群から選ばれる。
用語の「薬学的に許容される担体」とは、ヒトに適用し、且つ十分な純度と十分な低毒性を有しなければならない１種または多種の相溶性固体または液体フィラー或いはゲル状物質を指す。ここで、「相溶性」とは、組成物における各成分が本発明の化合物の薬効を明らかに低下させることなく、それらと相互に配合できることを指す。薬理的に許容される賦形剤または担体の一部の例として、セルロース及びその誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース等）、ゼラチン、タルク、固体滑剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、硫酸カルシウム、植物油（例えば大豆油、ゴマ油、落花生油、オリーブ油等）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール等）、乳化剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標））、湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、着色剤、調味料、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、パイロジェンフリー水等が挙げられる。
本発明の主な利点は、本発明で提供されるキャップアナログが免疫反応の発生を有効に抑制できるということにある。
本発明の範囲内であれば、本発明の上記各技術的特徴および以下（例えば実施例）で具体的に開示される各技術的特徴は、互いに組み合わせて、新たな又は好ましい技術方案を構成してもよいことは理解されるべきである。ここでは便宜上、詳細な陳述を省略する。
以下の説明では、本発明の内容をより明瞭にするように、上記化合物、方法、医薬組成物の各具体的な方面、特性および利点を詳細に説明する。以下の詳細な説明および実例は、ただ参考のために具体的な実施例を説明したことを理解すべきである。本発明の説明の内容を読んだ後、当業者は本発明に各種の変更や修正をすることができるが、それらの変更や修正も同様に本発明の請求の範囲に含まれる。
以下の実施例で本発明をより具体的な解釈する。しかし、それらの実施例は例を挙げて本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲に何ら限定するものではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。特に断らない限り、部と百分率は重量部と重量百分率である。実施例の反応に使用した有機溶媒はいずれも、本分野で既知される乾燥法で処理された。
下記の実施例におけるキャッピング効率の計測に関与するＬＣ－ＭＳ分析方法は下記の通りであった：
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣオリゴヌクレオチドＢＥＨ Ｃ１８、２．１＊１５０ｍｍ
カラム温度：７５℃
移動相Ａ：２００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール＋８．１５ｍＭトリエチルアミン ｐＨ７．９
移動相Ｂ：メタノール
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
勾配：
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ ＳＱ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ２
イオン源：ＥＳＩ
イオン化モード：ＥＳ－
Ｍ／Ｚ：６００～３０００
実施例１
キャップアナログの合成経路の簡単な説明
キャップアナログの合成：原料の５’－Ｏ－ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳホスホロアミダイト（ｒＡＡｃ、ｒＣＡｃ、ｒＧｄｍｆ、Ｕ）及び２’－Ｏ－ＭＯＥ－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト（Ａ２’Ｏ－ＭＯＥ Ａｃ、Ｃ２’Ｏ－ＭＯＥ Ａｃ、Ｇ２’Ｏ－ＭＯＥ ｄｍｆ、Ｕ２’Ｏ－ＭＯＥ）及び２’－Ｏ－エチル－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト（Ａ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ Ａｃ、Ｃ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ Ａｃ、Ｇ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ ｄｍｆ、Ｕ２’Ｏ－Ｅｔｈｙｌ）はＨｏｎｇｅｎｅから入手し、ビス－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルＣＥＤホスホロアミダイトはＣｈｅｍＧｅｎｅｓから入手した。産業界で一般的なオリゴヌクレオチド固相合成プロセス（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｍｅｒｍａｄｅ １２固相合成装置）によりｐＮｐＮジヌクレオチドを合成した上で、それをリン酸イミダゾレートである７ｍｅ－２’－Ｏ－４’－Ｃ－ロックド－グアノシン５’－二リン酸（ｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡＤＰＩｍ）又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アルファ－Ｌ－リボフラノシルグアノシン５’－二リン酸（ｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡＤＰＩｍ）又はＮ７－メチルグアノシン５’－二リン酸（ｍ７ＧＤＰＩｍ）と反応させ、開始キャップオリゴヌクレオチド組成物を生成し、ＤＥＡＥ－６５０ｓ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）及び半分取ＲＴ－ＨＰＬＣカラムにより精製し、精製品を得た。合成プロセスは図１～３に示す。
実施例２
キャップアナログ含有ｍＲＮＡの合成
（１）テンプレートＤＮＡの調製
テンプレートは通常、マルチクローニングサイトに標的配列が挿入された直鎖プラスミドからなり、且つ標的配列の前に、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーターなどの対応するポリメラーゼのプロモーターが存在する必要がある。プラスミドは使用前に直鎖化する必要があり、ＤＮＡは、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化して直鎖化し、次いで、例えばフェノール－クロロホルムで処理した後エタノールで沈殿させる等の適切な方法により精製した。プラスミドの直鎖化に使用される制限エンドヌクレアーゼとしては、末端が平滑であるものか、５’末端が突出するものが望ましい（３’突出を産生する酵素でテンプレートを直鎖化すると、異常な転写物が生じる）。
（２）混合酵素の調製
（３）１０×反応緩衝液の調製
（４）Ｔ７インビトロ転写反応
キャップアナログはそれぞれ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ）、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵである。
３７℃で２時間反応させた。
ＤＮａｓｅ Ｉを１Ｕ加え、３７℃で３０分間反応させた。
（５）南極ホスファターゼによる処理：
Ｔｈｅｒｍｏ ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（登録商標）転写物洗浄キットを利用して反応液を精製し、精製されたｍＲＮＡに５Ｕ／ｕｌの南極ホスファターゼを２ｕｌ加え、均一に混合してから、３７℃で１時間処理した。
処理終了後、分光光度計でｍＲＮＡの産量を分析し、産量の結果は表１に示す。
（６）反応液の精製
ＨＰＬＣにより、バッファーＢ（０．１Ｍトリエチルアミン－酢酸 ｐＨ７．０及び２５％アセトニトリル）とバッファーＡ（０．１Ｍトリエチルアミン－酢酸 ｐＨ７．０）の勾配を３０％から６０％までのバッファーＡとし、１ｍｌ／ｍｉｎで約３０分間精製し、ＲＮＡを含有する画分を合併した後、イソプロパノールで沈殿させ、分光光度計で定量化した。
（７）キャッピング効率の計測
テストされた各種の開始キャップオリゴヌクレオチドにつき、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）による検出結果から、キャップｍＲＮＡの割合を解析した。この実験では、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡプローブを用い、ＲＮＡとＤＮＡがハイブリダイズすると、ＲＮａｓｅＨがＲＮＡのホスホジエステル結合を特異的に加水分解するため、ＲＮａｓｅＨの作用で３’末端が均一なＲＮＡ小断片が得られ、ＬＣ－ＭＳによりＲＮＡ小断片の分子量と百分率を解析し、転写反応におけるＲＮＡのキャッピング状況を決定する。５’末端のキャップの有無は分子量で見えるので、５’末端を含む短いＲＮＡの分子量と百分率を解析することにより、キャッピング効率を求めることができ、それに、分子量から算出できるように、付加されたキャップが上記実施例１の合成経路で得られたキャップヌクレオチドである。キャッピング効率の結果は表１及び図１２に示す。
（８）タンパク質発現の同定
本実施例において、異なる開始キャップ構造を持つルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（含まれる開始キャップヌクレオチドの構造は：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ）でＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をトランスフェクトし、２４時間後、マイクロプレートリーダーでルシフェラーゼのシグナル強度を検出し、その蛍光シグナル強度はタンパク質の発現存在度に正比例する。Ｈｅｌａ細胞を４×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングし、細胞密度が約８０％になる際にトランスフェクションを行った。各ウェルにつきｍＲＮＡを２ｕｇトランスフェクトし、トランスフェクション試薬をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、トランスフェクション工程は取扱説明書に参照して行った。トランスフェクトの２４時間後、マイクロプレートリーダーでルシフェラーゼのシグナル強度を検出した。ルシフェラーゼ蛍光の計測：まず、トランスフェクトされた細胞培養液を１．５ｍＬの遠心チューブに移して遠心し、細胞上澄を１０ｕｌ取って９６ウェルプレートに加え、且つそれに１０ｎｇ／ｍｌの基質を５０ｕｌ加え、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＩ（ＢｉｏＴｅｋ）装置でその蛍光強度を計測した。各ｍＲＮＡにつき、その発現の計測を６回繰返し、発現結果は、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧキャップの結果に対する相対値である。データは平均値±標準偏差として表示し、得られた結果は表１に示す。未精製ｍＲＮＡのタンパク質発現の同定も同時に完了させ、結果は表１及び図４に示す。
（９）ｍＲＮＡとＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１の結合能の計測
本実施例において、異なる開始キャップ構造を持つルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（含まれる開始キャップヌクレオチドの構造は：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ）でＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をトランスフェクトし、２４時間後、細胞を収集し、ＲＮＡ共免疫沈降法により、細胞内タンパク質であるＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１を、それらと結合したＲＮＡと一緒に共免疫沈降させ、最後にそれらのｍＲＮＡを逆転写して且つリアルタイム定量ＰＣＲに供したところ、それらの相対的存在度はそれらとＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１の結合能に正比例する。
Ｈｅｌａ細胞を４×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングし、細胞密度が約８０％になる際にトランスフェクションを行った。各ウェルにつきｍＲＮＡを２ｕｇトランスフェクトし、トランスフェクション試薬をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、トランスフェクション工程は取扱説明書に参照して行った。２４時間後、細胞を収集し、細胞に固定液を加えて室温で１０分間インキュベートし、その後に適当な濃度のグリシンを加えて反応を終了させ、細胞を遠心して収集した。細胞に適量の溶解液を加え、氷上で３０分間インキュベートし、遠心して上澄を収集した。上澄に適量（２～４ｎｇ）のＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１抗体（Ａｂｃａｍ）を加え、４℃のシェーカーで一晩インキュベートした。その後、それにプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを２０μｌ加え、４℃のシェーカーで２時間インキュベートした。ビーズを磁気格子で、毎回５分間で３回洗浄した。その後、ビーズにＴＲＩｚｏｌ試薬を１ｍＬ加えてＲＮＡを抽出し、且つＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。最後にリアルタイム定量蛍光ＰＣＲで関連遺伝子の発現を検出し、内部参照遺伝子をβ－ＡＣＴＩＮにした。各遺伝子につき、その検出を３回繰返し、各遺伝子の発現結果は、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧキャップの結果に対する相対値である。データは平均値±標準偏差として表示し、得られた結果は表２、図５及び６に示す。
（１０）免疫原性の計測
本実施例において、異なる開始キャップ構造を持つルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（含まれる開始キャップヌクレオチドの構造は：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ６－メチルアデニン）２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ、ｍ７Ｇ２’ＯｍｅｐｐｐＣ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＣ、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＵ）でＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をトランスフェクトし、２４時間後、細胞を収集し、細胞内の炎症因子の発現を検出し、その相対的存在度はｍＲＮＡの免疫原性に正比例する。
Ｈｅｌａ細胞を４×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングし、細胞密度が約８０％になる際にトランスフェクションを行った。各ウェルにつきｍＲＮＡを２ｕｇトランスフェクトし、トランスフェクション試薬をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、トランスフェクション工程は取扱説明書に参照して行った。２４時間後、細胞を収集し、ＴＲＩｚｏｌでＲＮＡを抽出し、且つＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。最後にリアルタイム定量蛍光ＰＣＲで細胞内の炎症因子の発現を検出し、内部参照遺伝子をβ－ＡＣＴＩＮにした。各遺伝子につき、その検出を３回繰返し、各遺伝子の発現結果は、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧキャップの結果に対する相対値である。データは平均値±標準偏差として表示し、得られた結果は表３及び図７に示す。
実施例３
キャップアナログｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧとｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧのｍＲＮＡの調製及び発現
（１）テンプレートＤＮＡの調製
テンプレートは通常、マルチクローニングサイトに標的配列が挿入された直鎖プラスミドからなり、且つ標的配列の前に、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーターなどの対応するポリメラーゼのプロモーターが存在する必要がある。プラスミドは使用前に直鎖化する必要があり、ＤＮＡは、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化して直鎖化し、次いで、例えばフェノール－クロロホルムで処理した後エタノールで沈殿させる等の適切な方法により精製した。プラスミドの直鎖化に使用される制限エンドヌクレアーゼとしては、末端が平滑であるものか、５’末端が突出するものが望ましい（３’突出を産生する酵素でテンプレートを直鎖化すると、異常な転写物が生じる）。
（２）混合酵素の調製
（３）１０×反応緩衝液の調製
（４）Ｔ７インビトロ転写反応
開始キャップオリゴヌクレオチドはそれぞれ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ（対照）、ｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧである。
５０℃で２時間反応させた。
ＤＮａｓｅ Ｉを１Ｕ加え、３７℃で３０分間反応させた。
（５）南極ホスファターゼによる処理：
Ｔｈｅｒｍｏ ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（登録商標）転写物洗浄キットを利用して反応液を精製し、精製されたｍＲＮＡに５Ｕ／ｕｌの南極ホスファターゼを２ｕｌ加え、均一に混合してから、３７℃で１時間処理した。
処理終了後、分光光度計でｍＲＮＡの産量を分析し、産量の結果は表４に示す。
（６）反応液の精製
ＨＰＬＣにより、バッファーＢ（０．１Ｍトリエチルアミン－酢酸 ｐＨ７．０及び２５％アセトニトリル）とバッファーＡ（０．１Ｍトリエチルアミン－酢酸 ｐＨ７．０）の勾配を３０％から６０％までのバッファーＡとし、１ｍｌ／ｍｉｎで約３０分間精製し、ＲＮＡを含有する画分を合併した後、イソプロパノールで沈殿させ、分光光度計で定量化した。
（７）キャッピング効率の計測
テストされた各種の開始キャップオリゴヌクレオチドにつき、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）による検出結果から、キャップｍＲＮＡの割合を解析した。この実験では、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡプローブを用い、ＲＮＡとＤＮＡがハイブリダイズすると、ＲＮａｓｅＨがＲＮＡのホスホジエステル結合を特異的に加水分解するため、ＲＮａｓｅＨの作用で３’末端が均一なＲＮＡ小断片が得られ、ＬＣ－ＭＳによりＲＮＡ小断片の分子量と百分率を解析し、転写反応におけるＲＮＡのキャッピング状況を決定する。５’末端のキャップの有無は分子量で見えるので、５’末端を含む短いＲＮＡの分子量と百分率を解析することにより、キャッピング効率を求めることができ、それに、分子量から算出できるように、付加されたキャップが上記のキャップヌクレオチドである。キャッピング効率の結果は表４及び図１３に示す。
（８）タンパク質発現の同定
本実施例において、異なる開始キャップ構造を持つルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（含まれる開始キャップヌクレオチドの構造は：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ）でＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をトランスフェクトし、２４時間後、マイクロプレートリーダーでルシフェラーゼのシグナル強度を検出し、その蛍光シグナル強度はタンパク質の発現存在度に正比例する。
Ｈｅｌａ細胞を４×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングし、細胞密度が約８０％になる際にトランスフェクションを行った。各ウェルにつきｍＲＮＡを２ｕｇトランスフェクトし、トランスフェクション試薬をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、トランスフェクション工程は取扱説明書に参照して行った。トランスフェクトの２４時間後、マイクロプレートリーダーでルシフェラーゼのシグナル強度を検出した。ルシフェラーゼ蛍光の計測：まず、トランスフェクトされた細胞培養液を１．５ｍＬの遠心チューブに移して遠心し、細胞上澄を１０ｕｌ取って９６ウェルプレートに加え、且つそれに１０ｎｇ／ｍｌの基質を５０ｕｌ加え、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＩ（ＢｉｏＴｅｋ）装置でその蛍光強度を計測した。各ｍＲＮＡにつき、その発現の計測を６回繰返し、発現結果は、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧキャップの結果に対する相対値である。データは平均値±標準偏差として表示し、得られた結果は表４に示す。未精製ｍＲＮＡのタンパク質発現の同定も同時に完了させ、結果は表４及び図８に示す。
（９）ｍＲＮＡとＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１の結合能の計測
本実施例において、異なる開始キャップ構造を持つルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（含まれる開始キャップヌクレオチドの構造は：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ）でＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をトランスフェクトし、２４時間後、細胞を収集し、ＲＮＡ共免疫沈降法により、細胞内タンパク質であるＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１を、それらと結合したＲＮＡと一緒に共免疫沈降させ、最後にそれらのｍＲＮＡを逆転写して且つリアルタイム定量ＰＣＲに供したところ、それらの相対的存在度はそれらとＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１の結合能に正比例する。
Ｈｅｌａ細胞を４×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングし、細胞密度が約８０％になる際にトランスフェクションを行った。各ウェルにつきｍＲＮＡを２ｕｇトランスフェクトし、トランスフェクション試薬をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、トランスフェクション工程は取扱説明書に参照して行った。２４時間後、細胞を収集し、細胞に固定液を加えて室温で１０分間インキュベートし、その後に適当な濃度のグリシンを加えて反応を終了させ、細胞を遠心して収集した。細胞に適量の溶解液を加え、氷上で３０分間インキュベートし、遠心して上澄を収集した。上澄に適量（２～４ｎｇ）のＲＩＧ－Ｉ及びＩＦＩＴ１抗体（Ａｂｃａｍ）を加え、４℃のシェーカーで一晩インキュベートした。その後、それにプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを２０μｌ加え、４℃のシェーカーで２時間インキュベートした。ビーズを磁気格子で、毎回５分間で３回洗浄した。その後、ビーズにＴＲＩｚｏｌ試薬を１ｍＬ加えてＲＮＡを抽出し、且つＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。最後にリアルタイム定量蛍光ＰＣＲで関連遺伝子の発現を検出し、内部参照遺伝子をβ－ＡＣＴＩＮにした。各遺伝子につき、その検出を３回繰返し、各遺伝子の発現結果は、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧキャップの結果に対する相対値である。データは平均値±標準偏差として表示し、得られた結果は表５、図９及び１０に示す。
（１０）免疫原性の計測
本実施例において、異なる開始キャップ構造を持つルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（含まれる開始キャップヌクレオチドの構造は：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、ｍ７ＧＢｅｔａ－Ｄ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ＭＯＥｐＧ及びｍ７ＧＡｌｐｈａ－Ｌ－ＬＮＡｐｐｐＡ２’Ｏ－ｅｔｈｙｌｐＧ）でＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をトランスフェクトし、２４時間後、細胞を収集し、細胞内の炎症因子の発現を検出し、その相対的存在度はｍＲＮＡの免疫原性に正比例する。Ｈｅｌａ細胞を４×１０５／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングし、細胞密度が約８０％になる際にトランスフェクションを行った。各ウェルにつきｍＲＮＡを２ｕｇトランスフェクトし、トランスフェクション試薬をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にし、トランスフェクション工程は取扱説明書に参照して行った。２４時間後、細胞を収集し、ＴｒｉＺｏｌでＲＮＡを抽出し、且つＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。最後にリアルタイム定量蛍光ＰＣＲで細胞内の炎症因子の発現を検出し、内部参照遺伝子をβ－ＡＣＴＩＮにした。各遺伝子につき、その検出を３回繰返し、各遺伝子の発現結果は、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧキャップの結果に対する相対値である。データは平均値±標準偏差として表示し、得られた結果は表６及び図１１に示す。
以上の説明は本発明の好ましい実施例だけで、本発明の実質の技術内容の範囲を限定するものではなく、本発明の実質の技術内容は広義的に出願の請求の範囲に定義され、他の人が完成した技術実体或いは方法は、出願の請求の範囲に定義されたものとまったく同じものであれば、或いは効果が同等の変更であれば、いずれもその請求の範囲に含まれるとみなされる。

Claims (8)

  1. 式（Ｉ－ａ）又は式（Ｉ－ｂ）で表されるキャップアナログ：



    式中、Ｂ１とＢ２はそれぞれ天然の塩基又は修飾された塩基であり；
    Ｒ３はＯ－Ｒ５－Ｒ６であり；
    Ｒ ５ は置換又は非置換のＣ １－２０ アルキル基であり；
    Ｒ ６ は置換又は非置換のＯ－アルキル基、又は水素（Ｒ ５ が置換又は非置換のＣ ２－２０ アルキル基である場合）である。
  2. Ｒ３はＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であることを特徴とする、請求項１に記載のキャップアナログ。
  3. Ｂ１とＢ２はそれぞれアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、グアニン、ウラシル又はチミンであることを特徴とする、請求項１に記載のキャップアナログ。
  4. 標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
    （ａ）少なくとも一つのＯＲＦ領域；
    （ｂ）少なくとも一つのＫｏｚａｋ配列の５’ＵＴＲ；
    （ｃ）３’ＵＴＲ；及び
    （ｄ）少なくとも一つの５’開始キャップを持つ請求項１～３のいずれかに記載のキャップアナログ
    を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
  5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドと薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
  6. 前記担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）又はエマルション（ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. （１）ＤＮＡテンプレートを調製する：
    （２）ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及び請求項１～３のいずれかに記載のキャップアナログを含む反応系中で、インビトロ転写反応を行うことにより、請求項４に記載のポリヌクレオチドを得る
    ことを含むことを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチドの製造方法。
  8. ＲＮＡポリメラーゼは、ファージ由来ＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3198727A1 (en) * 2020-10-20 2022-04-28 St Pharm Co., Ltd. Oligonucleotide for 5'-capped rna synthesis
CN118978560A (zh) * 2021-08-27 2024-11-19 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽类似物及其应用
CN113957108B (zh) * 2021-09-09 2025-01-10 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽rna的合成方法以及加帽rna转录反应液
KR102750248B1 (ko) * 2022-02-28 2025-01-03 광저우 헤노브컴 바이오사이언스 컴퍼니 리미티드 Rna 캡핑용 화합물 및 이의 용도
CN118974071A (zh) * 2022-03-31 2024-11-15 韩美精密化学株式会社 mRNA帽类似物及其用途
US12522630B2 (en) 2022-03-31 2026-01-13 Hanmi Fine Chemical Co., Ltd. MRNA cap analog and uses thereof
CN114540444B (zh) * 2022-04-23 2022-08-09 江苏申基生物科技有限公司 一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系
CN117430652A (zh) * 2022-07-22 2024-01-23 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的环状取代化合物及其应用
WO2024051696A1 (zh) * 2022-09-05 2024-03-14 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用
CN116143855B (zh) * 2022-11-08 2023-11-28 江苏申基生物科技有限公司 一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用
CN120584124A (zh) * 2023-01-19 2025-09-02 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用
WO2024185734A1 (ja) * 2023-03-03 2024-09-12 株式会社ナティアス ポリリン酸化ヌクレオシド、ポリリン酸化ヌクレオシドの合成に用いられるリン酸部活性化ヌクレオチド及びその合成方法、ならびにリン酸部活性化ヌクレオチドを用いたポリリン酸化ヌクレオシドの合成方法
CN116987137B (zh) * 2023-09-26 2024-01-02 江苏申基生物科技有限公司 一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用
TW202523360A (zh) * 2023-09-27 2025-06-16 南韓商韓美精密化學股份有限公司 ｍＲＮＡ端帽類似物以及其應用
CN117534719B (zh) * 2024-01-09 2024-05-14 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种c6'取代锁核酸修饰加帽类似物及其应用
WO2025187713A1 (en) * 2024-03-07 2025-09-12 Eisai R&D Management Co., Ltd. Polynucleotide and producing method thereof
EP4650358A3 (en) 2024-04-26 2026-01-14 Beijing Youcare Kechuang Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Ribose-modified cap analog and use thereof
CN118389495B (zh) * 2024-06-24 2024-10-01 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种核糖修饰的加帽类似物及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017510542A (ja) 2014-01-31 2017-04-13 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸生成及び送達のための方法及び製品
JP2017524357A (ja) 2014-07-16 2017-08-31 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． キメラポリヌクレオチド
CN111944864A (zh) 2020-08-20 2020-11-17 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法
WO2020264137A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 X-Chem, Inc. Recombinant transfer vectors for protein expression in insect and mammalian cells
JP2023523414A (ja) 2020-04-21 2023-06-05 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド キャッピング化合物、組成物、及びその使用方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI3906789T3 (fi) * 2015-09-21 2024-01-11 Trilink Biotechnologies Llc Initioivia huputettuja oligonukleotidialukkeita 5’-huputettujen RNA:iden syntetisoimiseksi
US11866754B2 (en) * 2015-10-16 2024-01-09 Modernatx, Inc. Trinucleotide mRNA cap analogs
US10487105B2 (en) * 2016-10-19 2019-11-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Trinucleotide MRNA cap analogs
BR112020026125A8 (pt) * 2018-03-15 2022-10-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Compostos oligonucleotídeos superiores ou 5'-cap- trinucleotídeo e seus usos na estabilização de rna, expressão de proteínas e em terapia
JP7407724B2 (ja) 2018-03-22 2024-01-04 フォームファクター， インコーポレイテッド 埋め込まれたスケートを有するプローブ先端部
CN113166737A (zh) * 2018-10-04 2021-07-23 新英格兰生物实验室公司 提高转录的rna的加帽效率的方法和组合物
JP2023533721A (ja) * 2020-07-02 2023-08-04 ライフ テクノロジーズ コーポレーション トリヌクレオチドキャップ類似体、それらの調製、及び使用
CA3198727A1 (en) * 2020-10-20 2022-04-28 St Pharm Co., Ltd. Oligonucleotide for 5'-capped rna synthesis
CA3170747A1 (en) * 2021-01-27 2022-08-04 Moritz THRAN Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
CN118978560A (zh) * 2021-08-27 2024-11-19 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽类似物及其应用
CN114853836B (zh) * 2022-06-24 2024-05-14 江苏申基生物科技有限公司 一种含gna结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017510542A (ja) 2014-01-31 2017-04-13 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸生成及び送達のための方法及び製品
JP2017524357A (ja) 2014-07-16 2017-08-31 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． キメラポリヌクレオチド
WO2020264137A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 X-Chem, Inc. Recombinant transfer vectors for protein expression in insect and mammalian cells
JP2023523414A (ja) 2020-04-21 2023-06-05 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド キャッピング化合物、組成物、及びその使用方法
CN111944864A (zh) 2020-08-20 2020-11-17 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法
CN113106133A (zh) 2020-08-20 2021-07-13 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种Cap2结构5`帽子类似物及其制备方法和应用
CN113278668A (zh) 2020-08-20 2021-08-20 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pawel J. Sikorski et al.，The identity and methylation status of the first transcribed nucleotide in eukaryotic mRNA 5' cap modulates protein expression in living cells，Nucleic Acids Research，2020年，Vol. 48, No. 4，pp. 1607-1626

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