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CN113603739B - 一种加帽类似物及其应用 - Google Patents

一种加帽类似物及其应用 Download PDF

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CN113603739B
CN113603739B CN202110995875.XA CN202110995875A CN113603739B CN 113603739 B CN113603739 B CN 113603739B CN 202110995875 A CN202110995875 A CN 202110995875A CN 113603739 B CN113603739 B CN 113603739B
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Shanghai Zhaowei Bioengineering Co ltd
Shanghai Hongene Biotech Corp
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Abstract

本发明公开了一种加帽类似物及其应用。所述加帽类似物的结构如式(I)所示：

Description

一种加帽类似物及其应用
技术领域
本发明涉及化学及生物工程领域；更具体地，涉及一系列用于体外转录(IVT)合成mRNA的加帽类似物及加帽类似物在mRNA合成中的应用。
背景技术
通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具，并广泛应用于疾病的治疗和预防中。外源mRNA诱导的免疫反应会从不同通路影响着目的蛋白的表达。
N1-2’O-甲基化对于阻断RIG-I的激活很重要，细胞内N1-2’O-甲基转移酶的敲除也会引起内源RNA的免疫刺激。而2'O-甲基化与m7G cap协同作用降低了RNA与RIG-I结合亲和力。
mRNA转录的过程中，IFIT1和翻译因子EIF4E能够竞争性结合mRNA模板。有帽子结构和2’-O-甲基化的内源和外源mRNA被EIF4E结合上启动转录。但是，如果外源mRNA在第一个核糖上缺少2’-O-甲基化，就会被IFIT1识别，从而阻止细胞内因子的结合，阻碍转录的进行。然而N1甲基化单独可能不足以保护所有内源性mRNA免受IFIT1的影响，IFIT1对N1、N2核糖上的2’-O甲基化的识别显示甲基与这些蛋白残基的冲突。
因此，本领域迫切需要开发一类新的加帽类似物，从而使体外转录合成的mRNA能够有效抑制免疫反应的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一类结构通式如(Ⅰ)所示的新型加帽类似物及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种式(I)所示的加帽类似物：
式中，B1和B2分别为天然的或修饰的碱基；
E和F分别为0或1；
R1为H、OH、烷基、O-烷基、卤素、或氧且所述氧与3’和5’位的C形成桥环；
R2为H、OH、烷基、O-烷基或卤素；
R3为O-R5-R6；
R4为氢、羟基、O-甲基或O-R5-R6；
R5为取代或未取代的C1-20烷基；
R6为取代或未取代的O-烷基、取代或未取代的S-烷基、取代或未取代的NH-烷基、取代或未取代的N-二烃基、取代或未取代的O-芳香基、取代或未取代的S-芳香基、取代或未取代的NH-芳香基、取代或未取代的O-芳烷基、取代或未取代的S-芳烷基、取代或未取代的NH-芳烷基、或氢(R5为取代或未取代的C2-20烷基时)；
X1、X2和X3分别为O、CH2或NH；
Y1、Y2和Y3分别为O、S、Se、或BH3。
在另一实施方式中，R3为OCH2CH3、OCH2OCH3或OCH2CH2OCH3。
在另一实施方式中，R4为羟基、OCH2CH3、OCH2OCH3或OCH2CH2OCH3。
在另一实施方式中，B1和B2分别为腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、或胸腺嘧啶。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7GpppA2’O-ethylpG、m7GpppA2’O-ethylpA、m7GpppA2’O-ethylpC、m7GpppA2’O-ethylpU、m7GpppC2’O-ethylpA、m7GpppC2’O-ethylpG、m7GpppC2’O-ethylpC、m7GpppC2’O-ethylpU、m7GpppG2’O-ethylpA、m7GpppG2’O-ethylpC、m7GpppG2’O-ethylpG、m7GpppG2’O- ethylpU、m7GpppU2’O-ethylpA、m7GpppU2’O-ethylpC、m7GpppU2’O-ethylpC、或m7GpppU2’O-ethylpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7G3’OmepppA2’O-ethylpG、m7G3’OmepppA2’O-ethylpA、m7G3’Ome pppA2’O-ethylpC、m7G3’OmepppA2’O-ethylpU、m7G3’OmepppC2’O-ethylpA、m7G3’ OmepppC2’O-ethylpG、m7G3’OmepppC2’O-ethylpC、m7G3’OmepppC2’O-ethylpU、m7G3’OmepppG2’O-ethylpA、m7G3’ OmepppG2’O-ethylpC、m7G3’OmepppG2’O-ethylpG、m7G3’OmepppG2’O-ethylpU、m7G3’OmepppU2’O-ethylpA、m7G3’ OmepppU2’O-ethylpC、m7G3’OmepppU2’O-ethylpC、或m7G3’OmepppU2’O-ethylpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7G2’OmepppA2’O-ethylpG、m7G2’ OmepppA2’O-ethylpA、m7G2’OmepppA2’O-ethylpC、m7G2’OmepppA2’O-ethylpU、m7G2’OmepppC2’O-ethylpA、m7G2’ OmepppC2’O-ethylpG、m7G2’OmepppC2’O-ethylpC、m7G2’OmepppC2’O-ethylpU、m7G2’OmepppG2’O-ethylpA、m7G2’ OmepppG2’O-ethylpC、m7G2’OmepppG2’O-ethylpG、m7G2’OmepppG2’O-ethylpU、m7G2’OmepppU2’O-ethylpA、m7G2’ OmepppU2’O-ethylpC、m7G2’OmepppU2’O-ethylpC、或m7G2’OmepppU2’O-ethylpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpG、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpA、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpC、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpU、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpA、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpG、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpC、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpU、m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpA、m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpC、m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpC、或m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-ethylpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7GpppA2’O-MOEpG、m7GpppA2’O-MOEpA、m7GpppA2’O-MOEpC、m7GpppA2’O-MOEpU、m7GpppC2’O-MOEpA、m7GpppC2’O-MOEpG、m7GpppC2’O-MOEpC、m7GpppC2’O-MOEpU、m7GpppG2’O-MOEpA、m7GpppG2’O-MOEpC、m7GpppG2’O-MOEpG、m7GpppG2’O-MOEpU、m7GpppU2’O-MOEpA、m7GpppU2’O-MOEpC、m7GpppU2’O-MOEpC、或m7GpppU2’O-MOEpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7G3’OmepppA2’O-MOEpG、m7G3’Ome pppA2’O- MOEpA、m7G3’OmepppA2’O-MOEpC、m7G3’OmepppA2’O-MOEpU、m7G3’OmepppC2’O-MOEpA、m7G3’OmepppC2’O-MOEpG、m7G3’OmepppC2’O-MOEpC、m7G3’OmepppC2’O-MOEpU、m7G3’OmepppG2O-’MOEpA、m7G3’OmepppG2’O-MOEpC、m7G3’ OmepppG2’O-MOEpG、m7G3’OmepppG2’O-MOEpU、m7G3’OmepppU2’O-MOEpA、m7G3’OmepppU2’O-MOEpC、m7G3’ OmepppU2’O-MOEpC、或m7G3’OmepppU2’O-MOEpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7G2’OmepppA2’O-MOEpG、m7G2’Ome pppA2’O- MOEpA、m7G2’Ome pppA2’O-MOEpC、m7G2’OmepppA2’O-MOEpU、m7G2’OmepppC2’O-MOEpA、m7G2’OmepppC2’O-MOEpG、m7G2’OmepppC2’O-MOEpC、m7G2’OmepppC2’O-MOEpU、m7G2’OmepppG2’O-MOEpA、m7G2’OmepppG2’O-MOEpC、m7G2’ OmepppG2’O-MOEpG、m7G2’OmepppG2’O-MOEpU、m7G2’OmepppU2’O-MOEpA、m7G2’OmepppU2’O-MOEpC、m7G2’ OmepppU2’O-MOEpC、或m7G2’OmepppU2’O-MOEpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物选自：m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpG、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpA、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpC、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O- MOEpU、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpA、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpG、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpC、m7G2’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpU、m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpA、m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpC、m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpC、或m7G3’Omeppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpU。
在另一实施方式中，所述加帽类似物的结构如式(I-a)或式(I-b)所示：
式中，B1和B2分别为天然的或修饰的碱基；
R3为O-R5-R6。
在另一实施方式中，R3为OCH2CH3、OCH2OCH3或OCH2CH2OCH3。
在另一实施方式中，B1和B2分别为腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、或胸腺嘧啶。
在本发明的第二方面，提供一种编码目标多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(a)至少一个ORF区；
(b)至少一个Kozak序列的5’UTR；
(c)3’UTR；和
(d)至少一个5’起始加帽的如上所述的本发明提供的加帽类似物。
在本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的本发明提供的多核苷酸和药学上可接受的载体。
在另一实施方式中，所述载体选自脂质纳米颗粒(LNPs)、脂质体(liposomes)、聚合物纳米粒子(polymeric nanoparticles)、固体脂质纳米粒(solid lipidnanoparticles)或乳剂(emulsions)。
在本发明的第四方面，提供一种如上所述的本发明提供的多核苷酸的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)制备DNA模板；
(2)进行体外转录反应得到如上所述的本发明提供的多核苷酸，所述反应体系中含有RNA聚合酶、核苷三磷酸和如上所述的本发明提供的加帽类似物。
在另一实施方式中，所述核苷三磷酸可以是天然碱基的核苷三磷酸、也可以是修饰性的核苷三磷酸或非天然的核苷三磷酸；优选ATP、CTP、GTP、UTP、5me-CTP、5me-UTP、PseudoUTP或N1-me-PseudoUTP。
在另一实施方式中，RNA聚合酶为来源于噬菌体的RNA聚合酶。
在另一实施方式中，所述RNA聚合酶选自T7、SP6、或T3。
在另一实施方式中，所述RNA聚合酶可以是源于噬菌体的RNA聚合酶的突变体，至少有80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的氨基酸序列和天然序列一致。
据此，本发明提供了一类新的加帽类似物，从而使体外转录合成的mRNA能够有效抑制免疫反应的发生。
附图说明
图1-3显示实施例1中加帽类似物的合成路径。
图4显示实施例获得的不同加帽类似物mRNA的蛋白表达情况。
图5显示实施例获得的不同加帽类似物mRNA与RIG-I的相对结合能力。
图6显示实施例获得的不同加帽类似物mRNA与IFIT1的相对结合能力。
图7显示实施例获得的不同加帽类似物mRNA诱导免疫原性的测定结果。
图8显示实施例获得的加帽类似物m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG mRNA的蛋白表达情况。
图9显示实施例获得的不同加帽类似物m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG mRNA与RIG-I的相对结合能力。
图10显示实施例获得的不同加帽类似物m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG mRNA与IFIT1的相对结合能力。
图11显示实施例获得的不同加帽类似物m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG mRNA诱导免疫原性的测定结果。
图12显示实施例获得的不同加帽核苷酸的加帽效率HPLC图；其中，
A为m7GpppApG的，B为m7G pppA2’Ome pG的，C为m7G3’OmepppA2’O-ethylpG的，D为m7G2’ OmepppA2’O-ethylpG的，E为m7G3’OmepppA2’O-MOEpG的，F为m7G2’OmepppA2’O-MOEpG的，G为m7Gppp(N6-methyladenine)2’O-MOEpG)的，H为m7G2’OmepppC2’O-ethylpC的，I为m7G3’OmepppA2’O-MOEpU的。
图13显示实施例获得的不同加帽核苷酸的加帽效率HPLC图；其中，
A为m7GpppApG的，B为m7G pppA2’Ome pG(对照)的，C为m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG的，D为m7GAlpha-L-LNApppA2’O-ethyl pG的。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，合成并筛选了一系列的三寡核酸聚合物，首次发现使用式(Ⅰ)加帽类似物通过IVT得到的mRNA使其与IFIT1的结合带来大的阻碍，也对于阻断RIG-I的激活带来更大的阻碍，从而能够更加严格有效地抑制免疫反应的发生。在此基础上完成了本发明。
本发明提供一种结构如式(I)所示的加帽类似物：
式中，B1和B2分别为天然的或修饰的碱基；
E和F分别为0或1；
R1为H、OH、烷基、O-烷基(例如但不限于，O-甲基)、卤素，或氧且所述氧与3’和5’位的C形成桥环；
R2为H、OH、烷基、O-烷基(例如但不限于，O-甲基)或卤素；
R3为O-R5-R6；
R4为氢、羟基、O-甲基或O-R5-R6；
R5为取代或未取代的C1-20烷基；
R6为取代或未取代的O-烷基、取代或未取代的S-烷基、取代或未取代的NH-烷基、取代或未取代的N-二烃基、取代或未取代的O-芳香基、取代或未取代的S-芳香基、取代或未取代的NH-芳香基、取代或未取代的O-芳烷基、取代或未取代的S-芳烷基、或取代或未取代的NH-芳烷基；
当R5为取代或未取代的C2-20烷基时R6可以为氢；
X1、X2和X3分别为O、CH2或NH；
Y1、Y2和Y3分别为O、S、Se、或BH3。
在本发明的一种实施方式中，R6为氢且R5为取代或未取代的C2-5烷基，所述R3和R4分别为但不限于，O-乙基、O-丙基、O-异丙基、O-丁基、O-异丁基、O-叔丁基、O-戊基等；或者R4为羟基，R3为但不限于，O-乙基、O-丙基、O-异丙基、O-丁基、O-异丁基、O-叔丁基、O-戊基等。
在本发明的一种实施方式中，R5为取代或未取代的C1-5烷基且R6为取代或未取代的C1-5烷基，所述R3和R4分别为但不限于，O-亚甲基-O-甲基、O-亚乙基-O-甲基、O-亚丙基-O-甲基、O-亚丁基-O-甲基、O-亚戊基-O-甲基、O-亚甲基-O-乙基、O-亚甲基-O-丙基、O-亚甲基-O-异丙基、O-亚甲基-O-丁基、O-亚甲基-O-异丁基、O-亚甲基-O-叔丁基、O-亚甲基-O-戊基、O-亚乙基-O-乙基、O-亚乙基-O-丙基、O-亚乙基-O-异丙基、O-亚乙基-O-丁基、O-亚乙基-O-异丁基、O-亚乙基-O-叔丁基、O-亚乙基-O-戊基、O-亚丙基-O-乙基、O-亚丙基-O-丙基、O-亚丙基-O-异丙基、O-亚丙基-O-丁基、O-亚丙基-O-异丁基、O-亚丙基-O-叔丁基、O-亚丙基-O-戊基、O-亚丁基-O-乙基、O-亚丁基-O-丙基、O-亚丁基-O-异丙基、O-亚丁基-O-丁基、O-亚丁基-O-异丁基、O-亚丁基-O-叔丁基、O-亚丁基-O-戊基、O-亚戊基-O-乙基、O-亚戊基-O-丙基、O-亚戊基-O-异丙基、O-亚戊基-O-丁基、O-亚戊基-O-异丁基、O-亚戊基-O-叔丁基、O-亚戊基-O-戊基等；或者R4为羟基，R3为但不限于，O-亚甲基-O-甲基、O-亚乙基-O-甲基、O-亚丙基-O-甲基、O-亚丁基-O-甲基、O-亚戊基-O-甲基、O-亚甲基-O-乙基、O-亚甲基-O-丙基、O-亚甲基-O-异丙基、O-亚甲基-O-丁基、O-亚甲基-O-异丁基、O-亚甲基-O-叔丁基、O-亚甲基-O-戊基、O-亚乙基-O-乙基、O-亚乙基-O-丙基、O-亚乙基-O-异丙基、O-亚乙基-O-丁基、O-亚乙基-O-异丁基、O-亚乙基-O-叔丁基、O-亚乙基-O-戊基、O-亚丙基-O-乙基、O-亚丙基-O-丙基、O-亚丙基-O-异丙基、O-亚丙基-O-丁基、O-亚丙基-O-异丁基、O-亚丙基-O-叔丁基、O-亚丙基-O-戊基、O-亚丁基-O-乙基、O-亚丁基-O-丙基、O-亚丁基-O-异丙基、O-亚丁基-O-丁基、O-亚丁基-O-异丁基、O-亚丁基-O-叔丁基、O-亚丁基-O-戊基、O-亚戊基-O-乙基、O-亚戊基-O-丙基、O-亚戊基-O-异丙基、O-亚戊基-O-丁基、O-亚戊基-O-异丁基、O-亚戊基-O-叔丁基、O-亚戊基-O-戊基等。
本发明的式(Ⅰ)所示的加帽类似物中具有代表性的三寡核酸聚合物如下表所示：
在本发明的一种实施方式中，提供的加帽类似物具有如下述如式(I-a)或式(I-b)所示结构，式(I-a)和式(I-b)为不同的立体构象，其中式(I-a)为β构象，式(I-b)为α构象：
式中，B1和B2分别为天然的或修饰的碱基；
R3为O-R5-R6。
R5为取代或未取代的C1-20烷基；
R6为取代或未取代的O-烷基、取代或未取代的S-烷基、取代或未取代的NH-烷基、取代或未取代的N-二烃基、取代或未取代的O-芳香基、取代或未取代的S-芳香基、取代或未取代的NH-芳香基、取代或未取代的O-芳烷基、取代或未取代的S-芳烷基、或取代或未取代的NH-芳烷基；
当R5为取代或未取代的C2-20烷基时R6可以为氢。
在本发明的一种实施方式中，式(I-a)或式(I-b)中R6为氢且R5为取代或未取代的C2-5烷基，所述R3为但不限于，O-乙基、O-丙基、O-异丙基、O-丁基、O-异丁基、O-叔丁基、O-戊基等。
在本发明的一种实施方式中，式(I-a)或式(I-b)中R5为取代或未取代的C1-5烷基且R6为取代或未取代的C1-5烷基，所述R3为但不限于，O-亚甲基-O-甲基、O-亚乙基-O-甲基、O-亚丙基-O-甲基、O-亚丁基-O-甲基、O-亚戊基-O-甲基、O-亚甲基-O-乙基、O-亚甲基-O-丙基、O-亚甲基-O-异丙基、O-亚甲基-O-丁基、O-亚甲基-O-异丁基、O-亚甲基-O-叔丁基、O-亚甲基-O-戊基、O-亚乙基-O-乙基、O-亚乙基-O-丙基、O-亚乙基-O-异丙基、O-亚乙基-O-丁基、O-亚乙基-O-异丁基、O-亚乙基-O-叔丁基、O-亚乙基-O-戊基、O-亚丙基-O-乙基、O-亚丙基-O-丙基、O-亚丙基-O-异丙基、O-亚丙基-O-丁基、O-亚丙基-O-异丁基、O-亚丙基-O-叔丁基、O-亚丙基-O-戊基、O-亚丁基-O-乙基、O-亚丁基-O-丙基、O-亚丁基-O-异丙基、O-亚丁基-O-丁基、O-亚丁基-O-异丁基、O-亚丁基-O-叔丁基、O-亚丁基-O-戊基、O-亚戊基-O-乙基、O-亚戊基-O-丙基、O-亚戊基-O-异丙基、O-亚戊基-O-丁基、O-亚戊基-O-异丁基、O-亚戊基-O-叔丁基、O-亚戊基-O-戊基等；或者R4为羟基，R3为但不限于，O-亚甲基-O-甲基、O-亚乙基-O-甲基、O-亚丙基-O-甲基、O-亚丁基-O-甲基、O-亚戊基-O-甲基、O-亚甲基-O-乙基、O-亚甲基-O-丙基、O-亚甲基-O-异丙基、O-亚甲基-O-丁基、O-亚甲基-O-异丁基、O-亚甲基-O-叔丁基、O-亚甲基-O-戊基、O-亚乙基-O-乙基、O-亚乙基-O-丙基、O-亚乙基-O-异丙基、O-亚乙基-O-丁基、O-亚乙基-O-异丁基、O-亚乙基-O-叔丁基、O-亚乙基-O-戊基、O-亚丙基-O-乙基、O-亚丙基-O-丙基、O-亚丙基-O-异丙基、O-亚丙基-O-丁基、O-亚丙基-O-异丁基、O-亚丙基-O-叔丁基、O-亚丙基-O-戊基、O-亚丁基-O-乙基、O-亚丁基-O-丙基、O-亚丁基-O-异丙基、O-亚丁基-O-丁基、O-亚丁基-O-异丁基、O-亚丁基-O-叔丁基、O-亚丁基-O-戊基、O-亚戊基-O-乙基、O-亚戊基-O-丙基、O-亚戊基-O-异丙基、O-亚戊基-O-丁基、O-亚戊基-O-异丁基、O-亚戊基-O-叔丁基、O-亚戊基-O-戊基等。
本发明还提供结构如式(I)、式(I-a)或式(I-b)所示加帽类似物的制备方法，例如但不限于，通过寡核苷酸固相合成工艺进行制备，步骤包括：
(1)使用原料5’-O-DMT-2’-O-TBDMS phosphoramidite(rAAc,rCAc,rGdmf,U)、2’-O-MOE-3’-O-phosphoramidite(A2’O-MOE Ac,C2’O-MOE Ac,G2’O-MOE dmf U2’O-MOE,)和2’-O-Ethyl-3’-O-phosphoramidite(A2’O-Ethyl Ac,C2’O-Ethyl Ac,G2’O-Ethyl dmf，U2’O-Ethyl,)、Bis-cyanoethyl-N,N-diisopropyl CED phosphoramidite等通过固相合成仪器合成pNpN二核苷酸；
(2)使pNpN二核苷酸和磷酸位咪唑盐的7me-2'-O-4'-C-Locked-Guanosine 5’-diphosphate(m7GBeta-D-LNADPIm)或2’-O,4’-C-methylene-alfa-L-ribofuranosylGuanosine 5’-diphosphate(m7GAlpha-L-LNADPIm)或N7-methylguanosine 5’-diphosphate(m7GDPIm)反应，生成结构如式(I)、式(I-a)或式(I-b)所示加帽类似物。
在本发明的一种实施方式中，还包括使获得的加帽类似物进行纯化的步骤，例如但不限于，通过DEAE-650s(Toyopearl)和半制备RT-HPLC柱进行纯化。
本发明还使用所提供的结构如式(I)、式(I-a)或式(I-b)所示加帽类似物进行体外转录合成mRNA，包括步骤：
第一步，制备模板DNA；
第二步，配制混合酶、配制反应缓冲液；
第三步，进行体外转录反应；
第四步，去磷酸化处理；
第五步，纯化反应液。
上述第一步中，通常模板由线性的质粒组成，该质粒在多克隆位点插入目标序列，并在目标序列前需要有相应聚合酶的启动子，如T7、T3或SP6启动子。质粒在使用前需要线性化，可以使用本领域通常了解的合适限制性内切酶消化使DNA线性化，然后进行纯化，例如但不限于用酚氯仿处理，再用乙醇沉淀。
一般用于使质粒线性化的限制性内切酶应该是平末端或5’端突出(用产生3’突出的酶使模板线性化将导致异常的转录本)。
上述第二步中用于配制混合酶的可以使RNA聚合酶、核酸酶抑制剂、焦磷酸酶等。
上述第二步中所配制的反应缓冲液包括但不限于，Tris-HCl(pH 7.9)、MgCl2、亚精胺、二硫苏糖醇(DTT)、Triton X-100。
上述第三步可以使用本发明提供的加帽类似物进行体外转录反应。
上述第四步中可以用于去磷酸化处理的试剂可以包括但不限于，南极TAB5磷酸酶、虾碱性磷酸酶、小牛碱性磷酸酶等。
上述第五步可以使用本领域常规的方法进行纯化，例如但不限于，高效液相色谱、氯化锂沉淀、醋酸铵沉淀等。
本发明还提供包含所提供的加帽类似物的编码目标多肽的多核苷酸，以及含有所述编码目标多肽的多核苷酸的药物组合物等。
除非有特别说明，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义：
如本发明所用，“加帽类似物”是指一种在真核生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5'端的结构，即m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子。这种结构可以具有防止mRNA在5’端发生降解、帮助RNA转录产物穿过核膜的选择性孔道而进入细胞质、增强翻译、帮助完成全部剪切过程等作用。
如本发明所用，“碱基”与“天然碱基”可以互换使用，都可又称核碱基、含氮碱基，是形成核苷的含氮化合物，核苷又是核苷酸的组分；可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、或胸腺嘧啶(T)。
“修饰碱基”是指天然碱基的一个或两个以上氢被取代而得到的物质，例如但不限于，N6-甲基腺嘌呤等。
“烷基”指脂肪烃碳氢基团。烷基部分可以是饱和的烷基(指不含有任何不饱和单元，如碳-碳双键或碳-碳三键)或烷基部分可以是不饱和烷基(指至少含有一个不饱和单元)。烷基部分，不管饱和还是不饱和，可以是支链或直链。可以有1到8个碳原子(只要在这里出现，一个数字范围如“1到8”指在给出范围中的每个整数，如“1到8个碳原子”指可以含有1个碳原子，2个碳原子，3个碳原子等直到包含8个碳原子的烷基，虽然目前的定义在没有指定数字范围的情况下，也包含了术语“烷基”的出现)。本文所述的化合物的烷基可以被指定为“C1-C6烷基”或类似的指定。举例说明“C1-C6烷基”指在烷基链中有一个，两个，三个，四个，五个或六个碳原子。典型的烷基包括但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，己基等。
“芳烷基”指-烷基-芳基，其中烷基和芳基如本文中定义。
“卤素”指氟、氯、溴、碘。
“烷氧基”基团指“O-烷基”基团，烷基如本文中定义。
“芳香的”指一个平面环具有离域的π电子系统，含有4n+2π个电子，其中n是整数。芳香环可由五个，六个，七个，八个，九个，十个或更多原子组成。芳香环被任选取代。术语“芳香的”包括碳环芳基(“芳基”如苯基)和杂环芳基(或“杂芳基”或“芳香杂环”)(如吡啶)。
“取代”指参考基团可以被一个或多个额外基团所取代，额外基团单独地且独立的选自于，烷基，环烷基，芳基，杂芳基，杂脂环烃，羟基，烷氧基，烷硫基，芳硫基，烷亚砜基，芳亚砜基，烷砜基，芳砜基，氰基，卤基，羰基，硫代羰基，硝基，卤烷基，氟烷基和氨基，包括单取代和双取代的氨基基团及其被保护的衍生物。举例说明，取代基选自于卤素，CF3，OH，CN，NO2，SO3H，SO2NH2，SO2Me，NH2，COOH，CONH2，烷氧基，-N(CH3)2和烷基。
术语“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的主要优点在于：本发明提供的加帽类似物能够有效抑制免疫反应的发生。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
在下面的说明中将会详细阐述上述化合物、方法、药物组合物的各个具体方面、特性和优势，使本发明的内容变得十分明了。在此应理解，下述的详细说明及实例描述了具体的实施例，仅用于参考。在阅读了本发明的说明内容后，本领域的技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些改动或修改同样属于本申请所限定的范围。
在下述实施例中更具体地解释本发明。然而，应当理解，这些实施例是为了举例说明本发明，而并不是以任何方式限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。实施例反应中用到的有机溶剂均经过本领域已知的干燥方法处理。
下述实施例加帽效率测定中涉及的LC-MS分析方法如下:
设备:Waters UPLC H-Class
柱子：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18,2.1*150mm
柱温：75℃
流动相A：200mM六氟异丙醇+8.15mM三乙胺pH7.9
流动相B：甲醇
流速:0.3mL/min
梯度:
时间(min) B％
0 5
1 5
13 25
17 40
25 5
MS设备:Waters SQ Detector 2
离子源:ESI
离子化模式:ES-
M/Z:600～3000
实施例1
加帽类似物的合成路径简述
加帽类似物的合成：原料5’-O-DMT-2’-O-TBDMS phosphoramidite(rAAcrCAc,rGdmf,U)和2’-O-MOE-3’-O-phosphoramidite(A2’O-MOE Ac,C2’O-MOE Ac,G2’O-MOE dmf U2’O-MOE,)和2’-O-Ethyl-3’-O-phosphoramidite(A2’O-Ethyl Ac,C2’O-Ethyl Ac,G2’O-Ethyl dmf，U2’O-Ethyl,)来自于Hongene，Bis-cyanoethyl-N,N-diisopropyl CED phosphoramidite来自于ChemGenes。使用业内常见的寡核苷酸固相合成的工艺(Bioautomation Mermade12固相合成仪器)合成pNpN二核苷酸，然后和磷酸位咪唑盐的7me-2'-O-4'-C-Locked-Guanosine 5’-diphosphate(m7GBeta-D-LNADPIm)或2’-O,4’-C-methylene-alfa-L-ribofuranosylGuanosine 5’-diphosphate(m7GAlpha-L-LNADPIm)或N7-methylguanosine 5’-diphosphate(m7GDPIm)反应，生成起始加帽寡核苷酸组合物，通过DEAE-650s(Toyopearl)和半制备RT-HPLC柱纯化获得纯品。合成过程见图1-3。
实施例2
含加帽类似物的mRNA的合成
(1)模板DNA的制备
通常，模板由线性的质粒组成，该质粒在多克隆位点插入目标序列，并在目标序列前需要有相应聚合酶的启动子，如T7、T3或SP6启动子。质粒在使用前需要线性化，用合适的限制性内切酶消化使DNA线性化，然后适当的方法进行纯化，如酚氯仿处理，然后再用乙醇沉淀。用于使质粒线性化的限制性内切酶应该是平末端或5’端突出(用产生3’突出的酶使模板线性化将导致异常的转录本)。
(2)配制混合酶
混合酶 最终浓度
T7 RNA聚合酶 100U/ul
无机焦磷酸酶 0.1U/ul
核酸酶抑制剂 20U/ul
(3)配制10×反应缓冲液
10×反应缓冲液 最终浓度
HEPES-氢氧化钠pH7.5@25℃ 400mM
氯化镁 200mM
亚精胺 10mM
二硫苏糖醇 100mM
(4)T7体外转录反应
10×反应缓冲液 2ul
100mM起始加帽寡核苷酸 2ul
100mM ATP 1ul
100mM GTP 0.5ul
100mM CTP 1ul
100mM N1-Me-ψUTP 1ul
混合酶 2ul
模板 1ul
H2O(无核酸酶污染) 9ul
总体积 20ul
加帽类似物为分别为m7GpppApG，m7G pppA2’Ome pG，m7G3’OmepppA2’O-ethylpG，m7G2’ OmepppA2’O-ethylpG，m7G3’OmepppA2’O-MOEpG，m7G2’OmepppA2’O-MOEpG，m7Gppp(N6-methyladenine)2’O-MOEpG)，m7G2’OmepppC2’O-ethylpC，m7G3’OmepppA2’O-MOEpU。
37℃反应2hs,
加入DNase I 1U,37℃反应30mins。
(5)南极磷酸酶的处理：
利用Thermo MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit对反应液进行纯化，纯化后的mRNA，加入2ul 5U/ul南极磷酸酶，混匀后37℃1h。
处理好后用分光光度计对mRNA的产量进行分析，产量结果见表1。
(6)反应液的纯化
通过HPLC纯化，Buffer B(0.1M三乙胺-醋酸pH7.0和25％乙腈)，Buffer A(0.1M三乙胺-醋酸pH7.0)，梯度从30％到60％Buffer A，大约30min，1ml/min，将含有RNA的组分合并后，进行异丙醇沉淀，并通过分光光度计定量。
(7)加帽效率的测定
对于测试的每种起始加帽寡核苷酸，将通过液相色谱质谱法(LC-MS)检测结果分析加帽mRNA的比例。在该实验中，一段DNA探针，与mRNA互补，当RNA和DNA杂交，RNaseH会特异性的水解RNA中的磷酸二酯键，这样在RNaseH的作用下，便得到了3’端均一的小片段RNA，通过LC-MS对小片段RNA的分子量及百分比进行分析，确定转录反应中RNA的加帽情况。由于5’端有帽子和没有帽子，在分子量上能够看出，因此可以通过对含有5’端的短的RNA进行分子量及百分比的分析获得加帽效率，同时从分子量可以计算得出，所加的帽子为通过上述实施例1合成路径获得的加帽核苷酸。加帽效率的结果见表1和图12。
(8)蛋白表达鉴定
本实施例中将具有不同起始加帽结构的荧光素酶mRNA(Gaussia luciferase)(含起始加帽核苷酸结构为：m7GpppApG，m7GpppA2’Ome pG，m7G3’OmepppA2’O-ethylpG，m7G2’ OmepppA2’O-ethylpG，m7G3’OmepppA2’O-MOEpG，m7G2’OmepppA2’O-MOEpG，m7Gppp(N6-methyladenine)2’O-MOEpG，m7G2’OmepppC2’O-ethylpC，m7G3’OmepppA2’O-MOEpU)转染Hela细胞(ATCCCCL-2)，24小时后通过酶标仪检测luciferase的信号强度，其荧光信号强度与蛋白表达丰度成正比。Hela细胞以4×105/孔的密度铺于6孔板，细胞密度大约为80％时进行转染。每孔转染2ug mRNA，转染试剂为Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)，转染步骤参照说明书进行。转染24小时后，利用酶标仪对荧光素酶的信号强度进行测定。荧光素酶荧光的测定：先将转染后的细胞培养液转移至1.5mL的离心管并离心，取10ul的细胞上清液加入96孔板中，并向其中加入50ul 10ng/ml的底物，在Synergy HI(BioTek)仪器上测定其荧光强度。每个mRNA的表达需要重复测定6次，表达结果为相对于m7GpppApG帽子结果的相对值。数据表示为平均值±标准差，所得结果见表1。同时完成未纯化mRNA的蛋白表达鉴定，结果见表1和图4。
表1：不同起始加帽核苷酸mRNA的数据统计
(9)mRNA与RIG-I和IFIT1结合能力的测定
本实施例中将具有不同起始加帽结构的荧光素酶mRNA(Gaussia luciferase)(含起始加帽核苷酸结构为：m7GpppApG，m7GpppA2’Ome pG，m7G3’OmepppA2’O-ethylpG，m7G2’ OmepppA2’O-ethylpG，m7G3’OmepppA2’O-MOEpG，m7G2’OmepppA2’O-MOEpG，m7Gppp(N6-methyladenine)2’O-MOEpG，m7G2’OmepppC2’O-ethylpC，m7G3’OmepppA2’O-MOEpU)转染Hela细胞(ATCCCCL-2)，24小时后收集细胞，利用RNA免疫共沉淀的方法将胞内蛋白RIG-I和IFIT1与其结合的RNA一起进行免疫共沉淀，最后对这些mRNA进行逆转录以及实时定量PCR，其相对丰度与其和RIG-I、IFIT1的结合能力呈正比。
Hela细胞以4×105/孔的密度铺于6孔板，细胞密度大约为80％时进行转染。每孔转染2ug mRNA，转染试剂为Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)，转染步骤参照说明书进行。24小时后收集细胞，在细胞中加入固定液室温孵育10分钟，之后加入合适浓度的甘氨酸终止反应，离心收集细胞。向细胞中加入适量的裂解液，冰上孵育30分钟，离心并收集上清。向上清中加入适量(2-4ng)的RIG-I和IFIT1抗体(Abcam)，4℃摇床孵育过夜。之后向其中加入20ul Protein A/G磁珠，4℃摇床孵育2小时。利用磁力架清洗beads 3次，每次5分钟。之后，向磁珠中加入1mL TRIzol试剂抽提RNA，并将RNA逆转录为cDNA。最后利用实时定量荧光PCR检测相关基因的表达，内参基因为β-ACTIN。每个基因的检测需要重复三次，每个基因的表达结果为相对于m7GpppApG帽子结果的相对值。数据表示为平均值±标准差，所得结果见表2、图5和6。
表2不同起始加帽核苷酸mRNA与RIG-I和IFIT1结合能力的数据统计
(10)免疫原性测定
本实施例中将具有不同起始加帽结构的荧光素酶mRNA(Gaussia luciferase)(含起始加帽核苷酸结构为：m7GpppApG，m7GpppA2’Ome pG，m7G3’OmepppA2’O-ethylpG，m7G2’ OmepppA2’O-ethylpG，m7G3’OmepppA2’O-MOEpG，m7G2’OmepppA2’O-MOEpG，m7Gppp(N6-methyladenine)2’O-MOEpG，m7G2’OmepppC2’O-ethylpC，m7G3’OmepppA2’O-MOEpU)转染Hela细胞(ATCCCCL-2)，24小时后收集细胞，检测细胞内炎症因子的表达，其相对丰度与mRNA的免疫原性呈正比。
Hela细胞以4×105/孔的密度铺于6孔板，细胞密度大约为80％时进行转染。每孔转染2ug mRNA，转染试剂为Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)，转染步骤参照说明书进行。24小时后收集细胞，利用TRIzol抽取RNA，并将RNA逆转录为cDNA。最后利用实时定量荧光PCR检测细胞内炎症因子的表达，内参基因为β-ACTIN。每个基因的检测需要重复三次，每个基因的表达结果为相对于m7GpppApG帽子结果的相对值。数据表示为平均值±标准差，所得结果见表3和图7。
表3不同起始加帽核苷酸mRNA免疫原性的数据统计
实施例3
加帽类似物m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L-LNApppA2’O-ethyl pG的mRNA制备及表达
(1)模板DNA的制备
通常，模板由线性的质粒组成，该质粒在多克隆位点插入目标序列，并在目标序列前需要有相应聚合酶的启动子，如T7、T3或SP6启动子。质粒在使用前需要线性化，用合适的限制性内切酶消化使DNA线性化，然后适当的方法进行纯化，如酚氯仿处理，然后再用乙醇沉淀。用于使质粒线性化的限制性内切酶应该是平末端或5’端突出(用产生3’突出的酶使模板线性化将导致异常的转录本)。
(2)配制混合酶
混合酶 最终浓度
热稳定T7 RNA聚合酶(NEB) 100U/ul
热稳定无机焦磷酸酶(NEB) 0.1U/ul
核酸酶抑制剂 20U/ul
(3)配制10×反应缓冲液
10×反应缓冲液 最终浓度
HEPES-氢氧化钠pH7.5@25℃ 400mM
氯化镁 200mM
亚精胺 10mM
二硫苏糖醇 100mM
(4)T7体外转录反应
10×反应缓冲液 2ul
100mM起始加帽寡核苷酸 2ul
100mM ATP 1ul
100mM GTP 0.5ul
100mM CTP 1ul
100mM N1-Me-ψUTP 1ul
混合酶 2ul
模板 1ul
H2O(无核酸酶污染) 9ul
总体积 20ul
起始加帽寡核苷酸为分别为m7GpppApG，m7G pppA2’Ome pG(对照)，m7GBeta-D- LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L-LNApppA2’O-ethyl pG。
50℃反应2hs,
加入DNase I 1U,37℃反应30mins。
(5)南极磷酸酶的处理：
利用Thermo MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit对反应液进行纯化，纯化后的mRNA，加入2ul 5U/ul南极磷酸酶，混匀后37℃1h。
处理好后用分光光度计对mRNA的产量进行分析，产量结果见表4。
(6)反应液的纯化
通过HPLC纯化，Buffer B(0.1M三乙胺-醋酸pH7.0和25％乙腈)，Buffer A(0.1M三乙胺-醋酸pH7.0)，梯度从30％到60％Buffer A，大约30min，1ml/min，将含有RNA的组分合并后，进行异丙醇沉淀，并通过分光光度计定量。
(7)加帽效率的测定
对于测试的每种起始加帽寡核苷酸，将通过液相色谱质谱法(LC-MS)检测结果分析加帽mRNA的比例。在该实验中，一段DNA探针，与mRNA互补，当RNA和DNA杂交，RNaseH会特异性的水解RNA中的磷酸二酯键，这样在RNaseH的作用下，便得到了3’端均一的小片段RNA，通过LC-MS对小片段RNA的分子量及百分比进行分析，确定转录反应中RNA的加帽情况。由于5’端有帽子和没有帽子，在分子量上能够看出，因此可以通过对含有5’端的短的RNA进行分子量及百分比的分析获得加帽效率，同时从分子量可以计算得出，所加的帽子为所述的加帽核苷酸。加帽效率的结果见表4和图13。
(8)蛋白表达鉴定
本实施例中将具有不同起始加帽结构的荧光素酶mRNA(Gaussia luciferase)(含起始加帽核苷酸结构为：m7GpppApG，m7G pppA2’Ome pG，m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG)转染Hela细胞(ATCC CCL-2)，24小时后通过酶标仪检测luciferase的信号强度，其荧光信号强度与蛋白表达丰度成正比。
Hela细胞以4×105/孔的密度铺于6孔板，细胞密度大约为80％时进行转染。每孔转染2ug mRNA，转染试剂为Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)，转染步骤参照说明书进行。转染24小时后，利用酶标仪对荧光素酶的信号强度进行测定。荧光素酶荧光的测定：先将转染后的细胞培养液转移至1.5mL的离心管并离心，取10ul的细胞上清液加入96孔板中，并向其中加入50ul 10ng/ml的底物，在Synergy HI(BioTek)仪器上测定其荧光强度。每个mRNA的表达需要重复测定6次，表达结果为相对于m7GpppApG帽子结果的相对值。数据表示为平均值±标准差，所得结果见表4。同时完成未纯化mRNA的蛋白表达鉴定，结果见表4和图8。
表4起始加帽核苷酸m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L-LNApppA2’O-ethyl pG mRNA的数据统计
(9)mRNA与RIG-I和IFIT1结合能力的测定
本实施例中将具有不同起始加帽结构的荧光素酶mRNA(Gaussia luciferase)(含起始加帽核苷酸结构为：m7GpppApG，m7G pppA2’Ome pG，m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG)转染Hela细胞(ATCC CCL-2)，24小时后收集细胞，利用RNA免疫共沉淀的方法将胞内蛋白RIG-I和IFIT1与其结合的RNA一起进行免疫共沉淀，最后对这些mRNA进行逆转录以及实时定量PCR，其相对丰度与其和RIG-I、IFIT1的结合能力呈正比。
Hela细胞以4×105/孔的密度铺于6孔板，细胞密度大约为80％时进行转染。每孔转染2ug mRNA，转染试剂为Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)，转染步骤参照说明书进行。24小时后收集细胞，在细胞中加入固定液室温孵育10分钟，之后加入合适浓度的甘氨酸终止反应，离心收集细胞。向细胞中加入适量的裂解液，冰上孵育30分钟，离心并收集上清。向上清中加入适量(2-4ng)的RIG-I和IFIT1抗体(Abcam)，4度摇床孵育过夜。之后向其中加入20ul Protein A/G磁珠，4度摇床孵育2小时。利用磁力架清洗beads 3次，每次5分钟。之后，向磁珠中加入1mL TRIzol试剂抽提RNA，并将RNA逆转录为cDNA。最后利用实时定量荧光PCR检测相关基因的表达，内参基因为β-ACTIN。每个基因的检测需要重复三次，每个基因的表达结果为相对于m7GpppApG帽子结果的相对值。数据表示为平均值±标准差，所得结果见表5、图9和10。
表5起始加帽核苷酸m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L-LNApppA2’O-ethyl pG mRNA与RIG-I和IFIT1结合能力的数据统计
(10)免疫原性测定
本实施例中将具有不同起始加帽结构的荧光素酶mRNA(Gaussia luciferase)(含起始加帽核苷酸结构为：m7GpppApG，m7G pppA2’Ome pG，m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L- LNApppA2’O-ethyl pG)转染Hela细胞(ATCC CCL-2)，24小时后收集细胞，检测细胞内炎症因子的表达，其相对丰度与mRNA的免疫原性呈正比。Hela细胞以4×105/孔的密度铺于6孔板，细胞密度大约为80％时进行转染。每孔转染2ug mRNA，转染试剂为LipofectamineMessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)，转染步骤参照说明书进行。24小时后收集细胞，利用TriZol抽取RNA，并将RNA逆转录为cDNA。最后利用实时定量荧光PCR检测细胞内炎症因子的表达，内参基因为β-ACTIN。每个基因的检测需要重复三次，每个基因的表达结果为相对于m7GpppApG帽子结果的相对值。数据表示为平均值±标准差，所得结果见表6和图11。
表6起始加帽核苷酸m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG和m7GAlpha-L-LNApppA2’O-ethyl pG mRNA免疫原性的数据统计
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围。

Claims (8)

1.一种加帽类似物，所述加帽类似物选自：m7G3’OmepppA2’O-MOEpG、m7G2’OmepppA2’O-MOEpG、m7Gppp(N6-甲基腺嘌呤)2’O-MOEpG或m7GBeta-D-LNApppA2’O-MOEpG。
2.一种编码目标多肽的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含：
(a)至少一个ORF区；
(b)至少一个Kozak序列的5’UTR；
(c)3’UTR；和
(d)至少一个5’起始加帽的如权利要求1所述的加帽类似物。
3.一种药物组合物，其特征在于，它含有如权利要求2所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自脂质纳米颗粒、脂质体、聚合物纳米粒子或乳剂。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为固体脂质纳米粒。
6.一种如权利要求2所述的多核苷酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)制备DNA模板；
(2)进行体外转录反应得到如权利要求2所述的多核苷酸，所述体外转录反应的体系中含有RNA聚合酶、核苷三磷酸和如权利要求1所述的加帽类似物；
所述核苷三磷酸选自ATP、CTP、GTP、UTP、5me-CTP、5me-UTP、PseudoUTP或N1-me-PseudoUTP。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，RNA聚合酶为来源于噬菌体的RNA聚合酶。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶选自T7、SP6或T3。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230382943A1 (en) * 2020-10-20 2023-11-30 St Pharm Co., Ltd. Oligonucleotide for 5'-capped rna synthesis
CN118978560A (zh) * 2021-08-27 2024-11-19 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽类似物及其应用
CN113957108B (zh) * 2021-09-09 2025-01-10 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽rna的合成方法以及加帽rna转录反应液
AU2022430003B9 (en) * 2022-02-28 2023-11-23 Guangzhou Henovcom Bioscience Co., Ltd. Compounds for rna capping and uses thereof
CN118974071A (zh) * 2022-03-31 2024-11-15 韩美精密化学株式会社 mRNA帽类似物及其用途
CN114540444B (zh) * 2022-04-23 2022-08-09 江苏申基生物科技有限公司 一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系
CN117430652A (zh) * 2022-07-22 2024-01-23 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的环状取代化合物及其应用
WO2024051696A1 (zh) * 2022-09-05 2024-03-14 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用
CN116143855B (zh) * 2022-11-08 2023-11-28 江苏申基生物科技有限公司 一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用
WO2024153245A1 (zh) * 2023-01-19 2024-07-25 广州市恒诺康医药科技有限公司 用于rna加帽的化合物及其应用
WO2024185734A1 (ja) * 2023-03-03 2024-09-12 株式会社ナティアス ポリリン酸化ヌクレオシド、ポリリン酸化ヌクレオシドの合成に用いられるリン酸部活性化ヌクレオチド及びその合成方法、ならびにリン酸部活性化ヌクレオチドを用いたポリリン酸化ヌクレオシドの合成方法
CN116987137B (zh) * 2023-09-26 2024-01-02 江苏申基生物科技有限公司 一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用
WO2025071359A1 (ko) * 2023-09-27 2025-04-03 한미정밀화학 주식회사 mRNA 캡 유사체 및 이의 용도
CN117534719B (zh) * 2024-01-09 2024-05-14 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种c6'取代锁核酸修饰加帽类似物及其应用
CN118389495B (zh) * 2024-06-24 2024-10-01 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种核糖修饰的加帽类似物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166737A (zh) * 2018-10-04 2021-07-23 新英格兰生物实验室公司 提高转录的rna的加帽效率的方法和组合物
CN116438306A (zh) * 2020-10-20 2023-07-14 St制药株式会社 用于5'-加帽的rna合成的寡核苷酸

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE065203T2 (hu) 2015-09-21 2024-05-28 Trilink Biotechnologies Llc Iniciáló, sapkával ellátott oligonukleotid primerek 5'-sapkával ellátott RNS-molekulák szintetizálására
WO2017066797A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Trinucleotide mrna cap analogs
EP3529255A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 Arcturus Therapeutics, Inc. Trinucleotide mrna cap analogs
US20210363172A1 (en) * 2018-03-15 2021-11-25 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 5'-cap-trinucleotide- or higher oligonucleotide compounds and their use in stabilizing rna, expressing proteins in therapy
WO2019183548A1 (en) 2018-03-22 2019-09-26 Formfactor, Inc. Probe tip with embedded skate
KR20230015914A (ko) * 2020-04-21 2023-01-31 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 캡핑 화합물, 조성물 및 이의 사용 방법
US20220002716A1 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 Life Technologies Corporation Trinucleotide cap analogs, preparation and uses thereof
CN113337561A (zh) * 2020-08-20 2021-09-03 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法和应用
WO2022162027A2 (en) * 2021-01-27 2022-08-04 Curevac Ag Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
CN118978560A (zh) * 2021-08-27 2024-11-19 上海兆维科技发展有限公司 一种加帽类似物及其应用
CN114853836B (zh) * 2022-06-24 2024-05-14 江苏申基生物科技有限公司 一种含gna结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166737A (zh) * 2018-10-04 2021-07-23 新英格兰生物实验室公司 提高转录的rna的加帽效率的方法和组合物
CN116438306A (zh) * 2020-10-20 2023-07-14 St制药株式会社 用于5'-加帽的rna合成的寡核苷酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The identity and methylation status of the first transcribed nucleotide in eukaryotic mRNA 5"cap modulates protein expression in living cells;Pawel J. Sikorski, et al.;《Nucleic Acids Research》;20200127;第48卷(第4期);第1607-1626页 *
Trinucleotide Cap Analogue Bearing a Locked Nucleic Acid Moiety: Synthesis, mRNA Modification, and Translation for Therapeutic Applications;Annamalai Senthilvelan, et al.;《Organic letters》;20210519;第23卷(第11期);第4133-4136页 *

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