JP7623124B2

JP7623124B2 - 細胞外小胞の内包物の測定方法および測定キット

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Publication number: JP7623124B2
Application number: JP2020176175A
Authority: JP
Inventors: 洋一青木; 高敏彼谷; 貴紀村山
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2025-01-28
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: JP2022067460A

Description

本発明は、細胞外小胞の内包物を測定するための方法およびキットに関する。

細胞外小胞（extracellular vesicle、以下、「ＥＶ」と略す場合もある）とは、細胞により産生されて細胞外に放出される膜小胞の総称であり、そのサイズや発生起源、発生機序などによって、エクソソームやマイクロベシクル等と呼ばれるものである。細胞外小胞は、便宜上、サイズと沈降速度の違いに基づき、１０，０００×ｇで沈降する細胞外小胞をマイクロベシクル（あるいはlarge EV）、１０，０００×ｇで沈降しない細胞外小胞を主にエクソソーム（あるいはsmall EV）と称する。しかしながら、未だ明確な定義は定められておらず、これらを厳密に区別するのは困難である。

細胞はその種類や状態によって、異なる細胞外小胞を放出することが知られており、そのため、細胞外小胞は細胞間や臓器間のコミュニケーションを仲介すると考えられている。

癌や感染症といった様々な疾患の診断マーカーとして、血液や唾液といった体液中に分泌された細胞外小胞が着目されている。例えば、特許文献１には、腫瘍マーカーとなる細胞外小胞を検出するための分析方法、分析試薬および分析装置が開示されている。この方法では、細胞外小胞が有する抗原に対する抗体と、細胞外小胞を分泌する細胞が有する抗原に対する抗体とを使用し、アビジン－ビオチン相互作用に基づき、細胞外小胞を検出している。また、特許文献２には、凹凸構造を有する合成樹脂などからなるベース部の凹部に細胞外小胞に対する抗体を固定し、凹部に細胞外小胞を捕捉する、細胞外小胞分析用デバイスおよび細胞外小胞の捕捉方法が開示されている。

細胞外小胞はリン脂質二重膜を有し、その内側にタンパク質や、核酸といった多様な細胞成分を内包する。近年、細胞外小胞に含まれる内包物も、疾患マーカーとなり得る可能性が報告されている。細胞外小胞に含まれる内包物を測定するための方法としては、生物検体、例えば、細胞培養上清や血液等から細胞外小胞を抽出し、その後、細胞外小胞のリン脂質膜を溶解して内包物を放出させてから、ＥＬＩＳＡ法等で測定するのが一般的である。生物検体そのものを用いるのではなく、細胞外小胞を抽出してから測定する理由としては、検体中の夾雑物の除去や、細胞外小胞の濃縮等が挙げられ、細胞外小胞を抽出するための方法としては、超遠心法等の様々な方法が報告されている（例えば、非特許文献１）。

国際公開第２０１３／０９４３０７号特開２０１４－２１９３８４号公報

落谷孝広、吉岡祐亮編、「医療を変えるエクソソーム」、株式会社化学同人、２０１８年

上記のとおり、これまでに様々な細胞外小胞の内包物を検出する方法が研究されてきたが、いずれも少量の検体から高い感度で内包物を測定することは難しかった。従来の細胞外小胞の抽出方法（例えば、超遠心法）では、抽出物に含まれる不純物が多く、不純物が夾雑物として測定結果に影響し得る。また、細胞外小胞の純度を上げようとすると、細胞外小胞のロスが発生して、検体中の内包物を正確に測定することが難しくなる。

さらに、細胞外小胞の内包物を測定するためには、細胞外小胞から内包物を放出させる必要性があるが、このとき、検体に溶出液を加えて細胞外小胞から内包物を溶出させると、検体が希釈されることとなる。そのため、ＥＬＩＳＡ法等の従来法は、少量の検体または細胞外小胞濃度の低い検体を用いた内包物の測定においては、感度不足が問題となる。そこで、少量の検体または細胞外小胞濃度の低い検体を用いても、夾雑物の影響を受けることなく、高感度で内包物を測定するための方法が求められている。

本発明は、夾雑物の影響を受けることなく、少量の検体または細胞外小胞濃度の低い生物検体を用いても、高感度で簡便な方法で内包物を測定することができる、細胞外小胞の内包物の測定方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、生物検体から細胞外小胞の内包物を測定するためのキットを提供することも目的とする。

本発明の一実施形態に係るエクソソームの内包物の測定方法は、金属膜と、前記金属膜に固定化された、細胞外小胞の内包物に結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程と、検体に含まれる細胞外小胞から内包物を放出させる工程と、前記金属膜の上に前記内包物を提供して、前記検体に含まれる前記内包物を前記第１の結合物質に結合させる工程と、前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記内包物を、前記内包物に結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、前記蛍光物質で標識された前記内包物が前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、を含む。

本発明の一実施形態に係るエクソソームの内包物の測定キットは、細胞外小胞の内包物を前記細胞外小胞から溶出させるための溶出液と、金属膜と、前記金属膜に固定化された、前記内包物に結合する第１の結合物質とを含む測定チップと、前記内包物を蛍光物質で標識するための標識試薬と、を含む。

細胞外小胞の内包物を測定するための本発明の方法およびキットは、夾雑物の影響を受けにくいため、検体から細胞外小胞を抽出しなくとも、高感度で内包物を測定することが可能となる。また、細胞外小胞からの内包物の放出や、検体の希釈といった一連の操作を装置内で自動的に行っても、感度不足を生じることなく、簡便に内包物を測定することが可能となる。

図１は、本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法の一例を示すフローチャートである。図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。図３Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの一例を示す断面模式図である。図３Ｂは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの他の一例を示す斜視模式図である。図３Ｃは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの他の一例を示す断面模式図である。図４は、本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法の別の一例を示すフローチャートである。図５は、本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法のさらに別の一例を示すフローチャートである。図６は、実施例１の測定結果を示す棒グラフである。図７は、実施例２の測定結果を示す棒グラフである。図８は、比較例１の測定結果を示す棒グラフである。図９は、実施例３の測定結果を示す棒グラフである。図１０は、実施例４の測定結果を示す棒グラフである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

［細胞外小胞の内包物の測定方法］
細胞外小胞は、正常な細胞によっても、癌細胞などの疾患関連細胞によっても分泌されるものであり、その内包物は、細胞外小胞を分泌した細胞の種類や状態によって異なることが知られている。細胞外小胞の内包物を測定するためには、細胞外小胞のリン脂質膜を分解し、内包物を放出させてから測定しなければならない。

本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法においては、測定感度を向上させるために、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ」ともいう）を利用して内包物を測定する。ＳＰＦＳは、表面プラズモン共鳴（以下「ＳＰＲ」ともいう）により増強された電場により蛍光物質を励起して蛍光を放出させるため、一般的な蛍光免疫測定法よりも標的（本実施の形態では細胞外小胞の内包物）を高感度に検出することができる。

検体中の細胞外小胞の特定の内包物の存在および／または濃度を求めるために用いられていた従来の方法は、いずれも細胞外小胞の内包物を含む検体を準備するまでの工程において、細胞外小胞そのものや、その内包物のロスが発生したり、希釈によって濃度が低下したりすることがあった。例えば、細胞外小胞を含む検体に溶出液を加えて細胞外小胞から内包物を溶出させると、溶出液によって検体が希釈されることとなる。また、溶出液による検体の希釈を鑑みて、検体中の細胞外小胞の抽出や濃縮を実施すると、細胞外小胞のロスが発生しやすくなり、内包物の測定の再現性が低下し得る。

一方、本発明の測定方法はＳＰＦＳシステムに基づくものであることから、ＳＰＦＳ装置内で、溶出液を用いた検体中の細胞外小胞からの内包物の溶出と、検体の希釈とを自動化できるため、溶出処理および希釈によって生じ得る測定値のバラツキを抑制し、簡便に細胞外小胞の内包物を測定することが可能となる。

本発明者らは上記の考えのもとに、鋭意検討を重ねた結果、ＳＰＦＳで高感度に細胞外小胞の特定の内包物を測定できることを見出し、本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法を完成させた。

本発明の細胞外小胞の内包物の測定方法は、以下の工程１～５を含む。
金属膜と、前記金属膜に固定化された、細胞外小胞の内包物に結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程１と、
検体に含まれる細胞外小胞から内包物を放出させる工程２と、
前記金属膜の上に前記内包物を提供して、前記検体に含まれる前記内包物を前記第１の結合物質に結合させる工程３と、
前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記内包物を、前記内包物に結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程４と、
前記蛍光物質で標識された前記内包物が前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程５。

以下、本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法の工程１～５について、具体的に説明する。図１は、本実施の形態に係る細胞外小胞の測定方法の一例である、１次反応および２次反応を用いる測定方法を示すフローチャートである。

本発明において「細胞外小胞」とは、細胞により産生されて細胞外に放出される膜小胞の総称であり、そのサイズや発生起源、発生機序などによって、エクソソームやマイクロベシクルなどと呼ばれるものである。細胞外小胞は、エンドソーム由来のエクソソームと、形質膜由来のマイクロベシクルなどに大まかに分類されるものの、本発明においては、エクソソームおよびマイクロベシクルを含む、細胞外の膜小胞体全般を「細胞外小胞」とする。

本発明において「細胞外小胞の内包物」とは、検体中の細胞外小胞が内包する物質であって、疾患などのマーカーとなり得る物質を意味し、検体中に遊離状態で存在する物質とは区別されるものである。細胞外小胞の内包物としては、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸や、タンパク質（広義には、ポリペプチドやペプチドも包括的に含む）が知られており、これらの断片もまた、疾患マーカー等となり得る。尚、本発明においては、「細胞外小胞の内包物」を単に「内包物」とも呼ぶ。

細胞外小胞の内包物の具体例としては、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

（工程１：測定チップの準備）
金属膜と、細胞外小胞の内包物に結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する（図１の工程Ｓ０１）。ＳＰＦＳでは、金属膜に光（本実施の形態では励起光）を照射したときに生じるエバネッセント波と表面プラズモンとを結合させてＳＰＲを生じさせる。ＳＰＲを生じさせる手法としては、金属膜の一方の面上にプリズムを配置する手法（Kretschmann配置）や、金属膜に回折格子を形成する手法などが知られている。前者の手法を採用したＳＰＦＳは、プリズムカップリング（ＰＣ）－ＳＰＦＳと称され、後者の手法を採用したＳＰＦＳは、格子カップリング（ＧＣ）－ＳＰＦＳと称される。本実施の形態に係る細胞外小胞の測定方法は、ＰＣ－ＳＰＦＳおよびＧＣ－ＳＰＦＳのどちらを採用してもよい。

上述のとおり、金属膜は、励起光を照射されたときにＳＰＲを生じさせる。金属膜を構成する金属の種類は、ＳＰＲを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜を構成する金属の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。

第１の結合物質は、細胞外小胞の内包する、目的の物質に結合することができるものであって、金属膜上に固定化可能なものである限り特に限定はない。通常、第１の結合物質は、金属膜上の所定の領域（反応場）に均一に固定化されている。金属膜に固定化される第１の結合物質の種類は、内包物に結合することができるもの、即ち、内包物の有する第１の結合決定基に結合するものであれば特に限定されない。結合物質の例には、内包物に結合できる抗体、内包物に結合できる核酸、内包物に結合できる脂質、内包物に結合できるレクチン、および内包物に結合できるその他のタンパク質が含まれる。ここで、内包物が有する結合決定基とは、結合物質が内包物に結合する際に認識する内包物の一部分である。例えば、結合物質が抗体の場合、結合決定基は抗原の抗原決定基（エピトープ）であり、結合物質がリガンドの場合、結合決定基は対応する受容体の結合部位である。

例えば、内包物としてＨＳＰ７０を測定する場合、ＨＳＰ７０の結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。標的とする特定の内包物に固有の結合決定基に結合する物質を第１の結合物質として使用すると、第１の結合物質は特定の内包物にのみ結合するため、検体中の内包物を検出するのに有効である。

第１の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、金属膜に固定化される第１の結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、金属膜に固定化される第１の結合物質が抗体の場合、当該抗体は、１種類または２種類以上のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

尚、第１の結合物質は、蛍光標識と関連して説明する第２の結合物質との組み合わせを考慮して選択することが好ましい。第１の結合物質と第２の結合物質との好ましい組み合わせについては後述する。

結合物質の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜上に、結合物質（例えば抗体）を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１１－ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、結合物質（例えば抗体）に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜に固定化し、この高分子に結合物質（例えば抗体）を結合させてもよい。

測定チップは、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。説明の便宜上、これらの図において、各構成要素の大きさおよび形状は、正確ではない。また、これらの図では、第１の結合物質として内包物上の抗原決定基を認識する抗内包物抗体を使用する例を示している。

図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００は、プリズム１１０、金属膜１２０および内包物上の抗原決定基を認識する抗内包物抗体（第１の結合物質）１３０（の層）を有する。プリズム１１０は、励起光Ｌ１に対して透明な誘電体からなり、励起光Ｌ１が入射する入射面１１１と、励起光Ｌ１が反射する成膜面１１２と、反射光Ｌ２が出射する出射面１１３とを有する。プリズム１１０の形状は、特に限定されない。図２Ａに示される例では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、励起光に対する屈折率が１．４～１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。金属膜１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。

図２Ａに示されるように、金属膜１２０においてＳＰＲが生じるようにプリズム１１０を介して金属膜１２０に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜１２０近傍に生じる。このとき、金属膜１２０上の内包物上の抗原決定基を認識する抗体（第１の結合物質）１３０に蛍光物質１５０で標識された第２の結合物質１３１と反応した内包物１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。

図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００は、回折格子２１１の形成された金属膜２１０および内包物上の抗原決定基を認識する抗内包物抗体（第１の結合物質）１３０（の層）を有する。金属膜２１０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２１０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜２１０の厚みは、特に限定されないが、３０～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。回折格子２１１の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２１１は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。たとえば、１次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、互いに平行な複数の凸部が所定の間隔で形成されている。２次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２１１の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子２１１の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板（不図示）の上に金属膜２１０を形成した後、金属膜２１０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板（不図示）の上に、金属膜２１０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２１１を含む金属膜２１０を形成することができる。

図２Ｂに示されるように、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じるように金属膜２１０（回折格子２１１）に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に生じる。このとき、金属膜２１０（回折格子２１１）上の内包物上の抗原決定基を認識する抗内包物抗体（第１の結合物質）１３０に蛍光物質１５０で標識された第２の結合物質１３１と反応した内包物１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。

図３Ａ～３Ｃは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの一例を示す断面模式図である。３Ａに示されるように、測定チップ３００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、プリズム１１０の成膜面１１２に形成された金属膜１２０と、プリズム１１０の成膜面１１２または金属膜１２０上に配置された流路蓋３１０とを有する。図３Ａにおいて、入射面１１１および出射面１１３は、紙面の手前および奥にそれぞれ存在している。測定チップ３００は、さらに、流路３２０と、流路３２０の一端に接続された液体注入部３３０と、流路３２０の他端に接続された貯留部３４０も有する。本実施の形態では、流路蓋３１０は、両面テープなどの接着層３５０を介して金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接着されており、接着層３５０は流路３２０の側面形状を規定する役割も担っている。図３Ａでは省略しているが、流路３２０内に露出している金属膜１２０の一部の領域（反応場）には、内包物上の抗原決定基を認識する抗内包物抗体（第１の結合物質）１３０が固定化されている。液体注入部３３０は、液体注入部被覆フィルム３３１により塞がれ、貯留部３４０は、貯留部被覆フィルム３４１により塞がれている。貯留部被覆フィルム３４１には、通気孔３４２が設けられている。

流路蓋３１０は、蛍光Ｌ３に対して透明な材料で形成されている。ただし、蛍光Ｌ３の取り出しの妨げにならない限り、流路蓋３１０の一部は蛍光Ｌ３に対して不透明な材料で形成されていてもよい。蛍光Ｌ３に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋３１０は、接着層３５０を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接合されていてもよい。この場合は、流路３２０の側面形状は、流路蓋３１０により規定される。

液体注入部３３０には、ピペットチップが挿入される。このとき、液体注入部３３０の開口部（液体注入部被覆フィルム３３１に設けられた貫通孔）はピペットチップの外周に隙間なく接触する。このため、ピペットチップから液体注入部３３０内に液体を注入することで流路３２０内に液体を導入することができ、液体注入部３３０内の液体をピペットチップに吸引することで流路３２０内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において液体を往復送液することもできる。

液体注入部３３０から流路３２０内に流路３２０の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部３４０には流路３２０から液体が流入する。また、流路３２０内において液体を往復送液するときにも、貯留部３４０には液体が流入する。貯留部３４０に流入した液体は、貯留部３４０内で攪拌される。貯留部３４０内で液体が攪拌されると、流路３２０を通過する液体（検体や洗浄液など）の成分（例えば細胞外小胞、内包物や洗浄成分など）の濃度が均一になり、流路３２０内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。

図３Ｂおよび図３Ｃは、それぞれ、ウェル形状の測定チップの一例を示す模式図である。図３Ｂは、反応検出部が底面にあるウェル形状の測定チップ４００の模式図である（例えば、国際公開第２０１２／１５７４０３号を参照）。このチップにおいては、誘電体部材４１２が断面略台形形状の六面体（四角錐台形状）であり、ウェル部材４１８が誘電体部材４１２の形状に合わせて直方体に構成されている。そしてセンサ構造体２２の金属薄膜４１４上のリガンド固定領域４１６に検出対象となる内包物と結合する第１の結合物質を固定した状態で、内包物を含んだ試料溶液を貫通穴４２０内に供給し、供給された試料溶液を撹拌する。

また、図３Ｃは、反応検出部が側壁面にあるウェルである（例えば、国際公開第２０１８／０２１２３８号を参照）。測定チップ５００は、ウェル本体５１０および側壁部材５２０を有する。ウェル本体５１０は、その内部に収容部（ウェル）５１１を有している。収容部５１１は、液体を収容できるように構成された有底の凹部であり、上部に設けられた第１開口５１２および側部に設けられた第２開口５１３により外部に開放されている。側壁部材５２０は、光学素子としてのプリズム５２１、金属膜５２５および反応場５２６を有している。プリズム５２１は、励起光に対して透明な誘電体からなる光学素子であり、入射面（図示せず）、反射面５２３および出射面（図示せず）を有する。プリズム５２１は、収容部５１１を構成する側壁としても機能する。金属膜５２５上には捕捉領域があり、捕捉領域は、検体中の内包物を捕捉するための第１の結合物質が固定化される領域である。

（工程２：細胞外小胞からの内包物の放出）
実際の測定を行う前に、検体に含まれる細胞外小胞からその内包物を放出させる（工程Ｓ１０）。

検体の種類は、細胞外小胞を含むものである限り、特に限定されない。検体の例には、血液（血清、血漿、全血）、尿、汗、唾液、母乳、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙液等の体液、ならびにこれら体液を生理食塩水や緩衝液などで希釈した希釈液が含まれる。さらに検体は、培養細胞から放出された細胞外小胞を含む細胞培養上清およびその希釈液でもよい。本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法では、ＳＰＦＳを利用して内包物を検出するため、検体として全血も使用することができる。よって、入手の容易性等の観点から、細胞培養上清、血清、血漿、全血、尿、唾液、細胞ライセートまたはこれらの希釈物が、検体として好ましい。

また、検体は、体液等から単離した細胞外小胞であってもよい。単離した細胞外小胞を検体とすることで、体液中に存在する複数種の細胞外小胞の中から特定の細胞外小胞を選択し、その内包物のみを測定することが可能となる。また、検体中に遊離した内包物が存在し得る場合に、遊離した物質を検出することなく、細胞外小胞に内包されていた物質を選択的に測定することが可能となる。細胞外小胞を単離する方法に特に限定はないが、後述するように、細胞外小胞に特異的な結合物質を用いてＳＰＦＳの装置内に細胞外小胞を補足することができる。また、従来から知られている細胞外小胞の抽出方法を採用することもできる。例えば、超遠心分離法、免疫沈降法やポリマー沈殿法や、ＳＰＦＳの装置を用いて体液から細胞外小胞を単離し、抽出することもできる。

細胞外小胞から内包物を放出させるための方法は、細胞外小胞のリン脂質膜を分解するが、内包物を損傷しない方法である限り特に限定はない。最も一般的な方法は、溶出液を検体に加える方法である。溶出液は、目的の内包物を損傷することなく細胞外小胞のリン脂質膜を分解することできるものである限り特に限定はない。溶出液は測定対象となる内包物に応じて選択することができるが、生物・医学の分野で広く使用されている界面活性剤等の膜溶解剤が好ましい。界面活性剤は、内包物に対する影響を抑制する観点から、非変性界面活性剤であることが好ましく、具体例としては、非イオン性界面活性剤であるTｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（化合物名：ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）やＴｗｅｅｎ２０（化合物名：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）等、および陰イオン性界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。

溶出液の使用濃度は、細胞外小胞のリン脂質膜を分解するが、測定対象である内包物は分解しない濃度である限り、特に限定はない。実際、溶出液の種類や内包物の種類等、さらには処理時間（即ち、溶出液と検体とを接触させる時間）によっても異なる。例えば、界面活性剤がTｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００の場合、溶出液中のその濃度は０．１～２０質量％であり、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは、０．５～５質量％である。また、界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０の場合、溶出液中のその濃度は１０～３０質量％であり、好ましくは１５～２５質量％、より好ましくは、１５～２０質量％である。

溶出液と検体とを接触させる時間にも特に限定はなく、通常、０．５分～３０分、好ましくは３分～１０分である。０．５分以上であれば、細胞外小胞のリン脂質膜が溶解されて、内包物が検体中に放出されるのに十分である。

細胞外小胞からの内包物の放出は、試験管などの容器内で実施することもできるが、ＳＰＦＳの装置内で実施することもできる。特に溶出液を用いる場合、内包物の放出と、検体の希釈とを同時に装置内で行うことが好ましい。具体的には、内包物の放出が達成される界面活性剤等の濃度と、検体の希釈率とを考慮して、溶出液の濃度および添加量を調節することができる。

（工程３：１次反応）
次に、測定チップの金属膜上に、細胞外小胞の内包物が放出された検体を提供して、金属膜に固定化された第１の結合物質に、内包物を結合させる（図１の工程Ｓ２０）。検体を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に検体を提供すればよい。１次反応の反応時間に特に限定はないが、内包物と第１の結合物質との反応効率を上げるという観点からは、反応時間は長い方が好ましく、通常、５分以上１８０分以下、好ましくは６０分以上１５０分以下、より好ましくは１００分以上１２０以下である。通常は、１次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、第１の結合物質に結合していない成分を除去する（図１の工程Ｓ２１；洗浄）。
又、洗浄後には、光学ブランクを測定することができる（図１の工程Ｓ２２；光学ブランクを測定）。

（工程４：２次反応）
次に、測定チップの金属膜上に標識試薬を提供して、第１の結合物質に結合した内包物を、内包物に結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する（図１の工程Ｓ３０）。標識試薬の種類は、第１の結合物質に結合した内包物に蛍光物質で標識された第２の結合物質が反応できれば特に限定されない。たとえば、標識試薬は、内包物が有する第２の結合決定基に結合する、蛍光物質で標識された第２の結合物質である。あるいは、標識試薬は、内包物が有する第２の結合決定基に結合する第２の結合物質、および内包物に結合した第２の結合物質に結合する、蛍光物質で標識された別の第３の結合物質の両方を含む。

標識試薬を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に標識試薬を提供すればよい。通常は、２次反応および／または３次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、内包物に結合していない第２の結合物質（または他の結合物質）を除去する（図１の工程Ｓ３１）。

標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、蛍光物質で標識することができ、且つ内包物に結合することができれば特に限定されない。第２の結合物質の例には、内包物に結合できる抗体、内包物に結合できる核酸、内包物に結合できる脂質、内包物に結合できるレクチン、および内包物に結合できるその他のタンパク質が含まれる。

第２の結合物質が結合する、内包物が有する第２の結合決定基に特に限定はないが、内包物のマーカーとして知られる結合決定基が含まれる。例えば、内包物としてＨＳＰ７０を測定する場合、その結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第２の結合物質として使用することができる。標的とする特定の内包物に固有の結合決定基に結合する物質を第２の結合物質として使用すると、第２の結合物質は特定の内包物にのみ結合するため、たとえ金属膜上に内包物以外のもの（細胞外小胞など）が結合していても、標的の内包物のみを検出するのに有効である。

第２の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、蛍光物質で標識された抗内包物抗体は、１種類または２種類以上の抗内包物モノクローナル抗体または抗内包物ポリクローナル抗体である。この場合、蛍光物質で標識された抗内包物モノクローナル抗体および抗内包物ポリクローナル抗体は、金属膜に固定化されている１種類または２種類以上の抗内包物モノクローナル抗体とは異なるものであることが好ましい。

標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、金属膜に固定化される第１の結合物質の種類と同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、第１の結合物質および第２の結合物質が共に抗体であってもよいし、一方が抗体で、他方が抗体以外のタンパク質でもよい。

金属膜に固定化されている第１の結合物質と、標識試薬に含まれる第２の結合物質は、それぞれが標的とする内包物の有する結合決定基に結合するものであるが、第１の結合物質の結合する第１の結合決定基と、第２の結合物質の結合する第２の結合決定基とは異なることが好ましい。第１の結合物質と第２の結合物質とが同じ結合決定基を奪い合うのではなく、異なる結合決定基に結合することで、内包物の金属膜への固定および標識物質による標識をより確実に実施することが可能となる。また、第１の結合物質の結合する第１の結合決定基と、第２の結合物質の結合する第２の結合決定基とが異なることによって、第１の結合物質の結合に基づき検体から検出した内包物の中から、第２の結合物質の結合に基づきさらに測定すべき内包物を絞り込むことができる。

標識試薬に含まれる第３の結合物質は、蛍光物質で標識することができ、且つ第２の結合物質に結合できるものであれば特に限定されない。他の結合物質の例には、第２の結合物質として使用する抗体、核酸、脂質、レクチン、その他のタンパク質等に結合できる抗体、核酸、脂質、および抗体以外のタンパク質が含まれる。たとえば、１つの第２の結合物質に対して複数の第３の結合物質が結合するような第２および第３の結合物質の組み合わせを使用すると、第２の結合物質を直接蛍光標識して用いた場合よりも多くの蛍光物質を内包物に結合させて、測定感度を向上させることが可能となる。また、第２の結合物質を蛍光物質で直接標識するのが難しい場合や、蛍光標識によって第２の結合物質の内包物に対する結合性が変化、低下または失われる場合等にも、第３の結合物質を用いて内包物を標識することができる。

第２または第３の結合物質を標識するための蛍光物質の種類は、ＳＰＦＳで使用可能なものであれば特に限定されない。蛍光物質の例には、シアニン系色素、Thermo Scientific社のAlexa Fluor（登録商標）色素、およびBiotium社のＣＦ色素が含まれる。Alexa Fluor色素およびＣＦ色素は、市販されている蛍光色素の中では、ＳＰＦＳで使用する励起光の波長についての量子効率が高い。また、ＣＦ色素は、蛍光検出時における退色があまり生じないため、安定して蛍光検出を行うことができる。結合物質を蛍光物質で標識する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、結合物質（例えば抗細胞外小胞抗体）のアミノ基またはスルフヒドリル基に蛍光物質を結合させればよい。

なお、上記の説明では、金属膜に固定化された第１の結合物質に内包物を結合させてから内包物を標識試薬を用いて蛍光物質で標識したが、金属膜に固定化された第１の結合物質に内包物を結合させる前に内包物を標識試薬を用いて蛍光物質で標識してもよい。この場合は、検体を金属膜上に提供する前に、検体と標識試薬（第２の結合物質）とを混合すればよい。また、検体と標識試薬（第２の結合物質）との混合物に、さらに蛍光標識した別の（第３）の結合物質を加えることもできる。さらに、金属膜に固定化された結合物質に内包物を結合させる工程と内包物を蛍光物質で標識する工程を同時に行ってもよい。この場合は、検体と標識試薬（第２の結合物質、または第２および第３の結合物質）を金属膜上に同時に提供すればよい。

（工程５：蛍光測定）
次に、ＳＰＦＳにより内包物の量を示す蛍光を測定する（図１の工程Ｓ４０）。具体的には、蛍光物質で標識された内包物が金属膜に固定化された結合物質に結合している状態で、金属膜でＳＰＲが生じるように金属膜に励起光を照射し、これにより蛍光物質から放出される蛍光を測定する。通常は、測定された蛍光値から、予め測定された光学ブランク値を引いて、内包物の量に相関するシグナル値を算出する。必要に応じて、予め作成しておいた検量線などにより、シグナル値を内包物の量（個数／ｍｌ）や濃度（μｇ／ｍｌ）などに換算してもよい。

図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、プリズム１１０を介して金属膜１２０に照射される。これにより、金属膜１２０においてＳＰＲが生じ、金属膜１２０近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜１２０でＳＰＲが生じるように設定されるが、共鳴角または増強角であることが好ましい。ここで「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、反射光Ｌ２の光量が最小となるときの入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、金属膜１２０の上方（プリズム１１０の反対側）に放出される励起光Ｌ１と同一波長の散乱光（プラズモン散乱光）の光量が最大となるときの入射角を意味する。

図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、金属膜２１０（回折格子２１１）に直接照射される。これにより、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じ、金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜２１０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜２１０でＳＰＲが生じるように設定されるが、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光Ｌ１の最適な入射角は、回折格子２１１のピッチや励起光Ｌ１の波長、金属膜２１０を構成する金属の種類などに応じて適宜設定される。

励起光の種類は、特に限定されないが、通常はレーザー光である。たとえば、励起光は、出力が１０μＷ～３０ｍＷのレーザー光源から出射されたレーザー光である。励起光の照射エネルギーとしては、７．５μＷ／ｍｍ^２以上３０ｍＷ／ｍｍ^２以下であり、８．５μＷ／ｍｍ^２以上１０ｍＷ／ｍｍ^２以下が好ましく、９．５μＷ／ｍｍ^２以上５ｍＷ／ｍｍ^２以下がより好ましい。励起光の照射エネルギーを３０ｍＷ／ｍｍ^２以下とすることで、蛍光強度を高めてシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくし、より少量の内包物を検出することが可能となるため、検出限界を向上させることができる。励起光の波長は、使用する蛍光物質の励起波長に応じて適宜設定される。また、光量が３０ｍＷ／ｍｍ^２を超えると、照射熱による抗原抗体反応の解離が進むため、シグナル対ノイズ比が悪くなる。

蛍光の検出器は、測定チップに対して蛍光の強度が最も高い方向に設置されることが好ましい。たとえば、図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線方向であるので、検出器は、測定チップの直上に設置される。一方、図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線に対してある程度傾斜した方向であるので、検出器は、測定チップの直上ではない位置に設置される。検出器は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。

（細胞外小胞の単離）
本発明の測定方法においては、検体から細胞外小胞を単離する必要はないが、本発明の方法の工程２に関連して上述したように、ＳＰＦＳの装置を用いて生物検体から細胞外小胞を単離し、単離した細胞外小胞から内包物を溶出させることもできる。次に、ＳＰＦＳの装置を用いて生物検体から細胞外小胞を単離する方法について、具体的に説明する。図４は、ＳＰＦＳの装置を用いて生物検体から細胞外小胞を単離した後に、上述した工程３～５を実施する測定方法を示すフローチャートである。

ＳＰＦＳの装置を用いて生物検体から細胞外小胞を単離する方法は、本発明の内包物の測定方法の工程１と工程３に相当する、図４のＳ１０’（測定チップの準備）、Ｓ２０’（１次反応）およびＳ２１’（洗浄）を含む。使用する検体は、本発明の内包物の測定方法に使用する検体と同じである。

図４の工程Ｓ０１’、Ｓ２０’およびＳ２１’は、上述した本発明の内包物の測定方法の工程１および工程３と実質的に同様に実施することができるが、但し、第１の結合物質を、細胞外小胞に結合することができる物質に変更する。ここで使用する結合物質の例には、細胞外小胞に結合できる抗体、細胞外小胞に結合できる核酸、細胞外小胞に結合できる脂質、細胞外小胞に結合できるレクチン、および細胞外小胞に結合できるその他のタンパク質が含まれる。細胞外小胞が有する結合決定基とは、結合物質が細胞外小胞に結合する際に認識する細胞外小胞の一部分である。例えば、結合物質が抗体の場合、結合決定基は抗原の抗原決定基（エピトープ）であり、結合物質がリガンドの場合、結合決定基は対応する受容体の結合部位である。

第１の結合物質が結合する、細胞外小胞の有する第１の結合決定基に特に限定はないが、細胞外小胞のマーカーとして知られる結合決定基や、細胞外小胞を分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基が含まれる。細胞外小胞のマーカーとして知られる結合決定基としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、アネキシンＶ（Annexin V）、ＬＡＭＰ１等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。細胞外小胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合する第１の結合物質に上記の物質と反応する物質（例えば抗体）を使用する場合、細胞外小胞にのみ結合するため、検体中の細胞外小胞を検出するのに有効である。

細胞外小胞を分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基としては、カベオリン－１（Caveolin-1）、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－１（Grypican-1）、サバイビン（Survivin）、ＣＤ９１、Ｔｓｐａｎ８、ＣＤ１４７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ガラクチン（Galactin）、インテグリン（Integrin）等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体も市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。第１の結合物質として細胞外小胞を分泌する細胞マーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質（例えば抗体）を使用する場合は、特定の細胞およびそこから分泌された細胞外小胞にのみ結合するため、検体中の特定の細胞由来の細胞外小胞を検出するのに有効である。

さらに工程Ｓ２０’を実施する前に、検体に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで細胞外小胞の凝集を防止することが可能となる。界面活性剤は、生物・医学の分野で広く使用されている界面活性剤が好ましく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、およびTｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００が含まれる。界面活性剤は、細胞外小胞を破壊することはないが、その凝集を防止する程度の濃度で使用すればよい。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０の場合、０．００１％～５％以下、好ましくは０．００５％～１％以下、より好ましくは０．０１０％～０．０５％以下の濃度で使用することができる。また、デオキシコール酸ナトリウムの場合、０．００１％～０．０２５％以下、好ましくは０．００２％～０．０２０％以下、より好ましくは０．００３％～０．０１０％以下の濃度で使用することができる。また、Tｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００の場合、０．００１％～０．０１０％以下、好ましくは０．００２％～０．００７％以下、より好ましくは０．００３％～０．００５％以下の濃度で使用することができる。

図４の工程Ｓ０１’、Ｓ２０’およびＳ２１’を実施した後には、測定チップ上に固定化された第１の結合物質に結合した状態で、細胞外小胞が補足される。このようにチップに結合した状態の細胞外小胞を本発明の方法の工程２に付して、その内包物を放出させることができる（図４の工程Ｓ１０）。上述したような溶出液を用いて内包物の溶出を実施すると、溶出された内包物を含む溶出液が得られ、この溶出液を回収する（図４の工程Ｓ１１）。図３Ａに示した測定チップにおいては、液体注入部３３０内の溶出液をピペットチップに吸引することで、内包物を含む溶出液を回収することができる。回収した、内包物を含む溶出液は、次にＳＰＦＳによる内包物の測定のために、本発明の方法の工程３～５に付すことができる。

また、上述した方法で回収した、細胞外小胞から溶出した内包物を含む溶出液は、ＳＰＦＳ以外の方法による分析に用いるための検体として使用することもできる。例えば、内包物がｍｉＲＮＡの場合、回収した溶出液を検体としてＲＴ－ＰＣＲ法で分析し、ｍｉＲＮＡ濃度を測定することも可能である。

（細胞外小胞の回収）
さらに本発明の測定方法においては、ＳＰＦＳの装置を用いて検体から単離した細胞外小胞を回収し、検体として使用することもできる。次に、ＳＰＦＳの装置を用いて検体から細胞外小胞を単離・回収し、その内包物を測定する方法について、具体的に説明する。図５は、ＳＰＦＳの装置を用いて生物検体から細胞外小胞を回収した後に、上述した工程１～５を実施する測定方法を示すフローチャートである。

初めに、上述した図４の工程Ｓ０１’、Ｓ２０’およびＳ２１’と同様の工程を実施して、測定チップ上に固定化された第１の結合物質に結合する細胞外小胞を補足する。次に解離液を用いて、細胞外小胞を第１の結合物質から解離させ、解離液中に細胞外小胞を遊離させ（解離工程、図５のＳ５０’）、解離した細胞外小胞を含む解離液を回収して処理し（処理工程、図５の工程Ｓ６０’）、単離した細胞外小胞を得る。

（解離工程）
細胞外小胞を第１の結合物質から解離させ、解離液中に遊離させる（図５のＳ５０’）のための解離液は、第１の結合物質と細胞外小胞との結合を緩めて、細胞外小胞を第１の結合物質から解離させる液体である限り特に限定はない。解離液の種類は第１の結合物質の種類によっても異なるが、例えば、酸性溶液、塩基性溶液、塩溶液、界面活性剤溶液などが挙げられ、解離のし易さや、膜タンパク質へのダメージが少ないことから酸性溶液または塩溶液が好ましい。

酸性溶液に含まれる酸性物質としては、グリシンやクエン酸等が挙げられ、グリシンが好ましい。酸性溶液のｐＨは１．５～４．０であり、２．０～３．０が好ましい。ｐＨが４．０以下であれば、結合物質と細胞外小胞との十分な解離が可能となる。

塩溶液に含まれる塩類としては、ＮａＣｌやＫＣｌ等が挙げられ、ＮａＣｌが好ましい。塩溶液の塩濃度は０．１Ｍ～５．０Ｍであり、１Ｍ前後が好ましい。塩濃度が０．１Ｍ以上であれば、結合物質と細胞外小胞との解離が可能となる。

解離液を提供する方法は、特に限定されない。例えば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に解離液を提供すればよい。図３Ａに示した測定チップにおいては、ピペットチップから液体注入部３３０内に解離液を注入することで流路３２０内に解離液を導入し、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において解離液を往復送液することもできる。

解離液と、第１の結合物質に結合した細胞外小胞とを接触させる時間は、解離液の種類や濃度、さらには第１の結合物質の種類等によっても異なるが、通常、０．５分以上３０分以下であり、好ましくは５分以上１５分以下、より好ましくは１０分以上１５分以下である。条件にもよるが、接触させる時間が１０分以上であれば、十分なレベルで結合物質と細胞外小胞とを解離させることが可能となる。

（回収工程）
次に、解離した細胞外小胞を含む解離液を回収して処理し（図５の工程Ｓ６０’）、単離した細胞外小胞を得る。細胞外小胞は解離液に遊離していることから、解離液と共に回収する。図３Ａに示した測定チップにおいては、液体注入部３３０内の解離液をピペットチップに吸引することで、細胞外小胞の遊離した解離液を回収することができる。

解離液の成分は、長期的には細胞外小胞を損傷したり、細胞外小胞のさらなる解析の妨げになったりする可能性があることから、回収した解離液に対して、細胞外小胞に対する解離液の影響を除去または抑制するための処理を実施する。

解離液が酸性溶液の場合には、酸の細胞外小胞および続く解析への影響を抑制するために、回収した解離液を塩基性溶液で中和して、ｐＨ６．０～８．０、好ましくはｐＨ７．０～７．４とする。中和に使用する塩基性溶液に含まれる塩基性物質の種類は、解離液に含まれる酸性物質の種類によっても異なるが、通常、ＮａＯＨや炭酸バッファー等が挙げられる。塩基性溶液のｐＨは、通常、ｐＨ９．０～１２．０であり、１０．０～１１．０が好ましい。ｐＨが９．０以上であれば、解離液中の酸性物質の中和が可能となり、中和ができれば特にｐＨが高いことによる問題はない。

解離液が塩溶液の場合には、塩類の細胞外小胞および続く解析への影響を抑制するために、回収した解離液を希釈する。希釈に使用する希釈液は、細胞外小胞を損傷することなく、解離液中の塩物質の影響を抑制することのできる溶液である限り特に限定はないが、その後に実施し得るさらなる解析に影響しないものであることが好ましい。希釈液として、例えば、水、生理食塩水、バッファーなどが挙げられ、バッファーとしてはＰＢＳやＴＢＳ等が挙げられる。希釈液は回収した解離液と混合する。この時の希釈率は、解離液の塩濃度に応じて決定することができるが、通常、２倍～１０倍、好ましくは３～６倍、より好ましくは５倍である。希釈率が２倍以上であれば解離液中の塩物質の影響を抑制することが可能となる。また、希釈率は、回収した細胞外小胞の濃度や、次に実施し得る解析の感度などに応じて決定することもできる。

上記中和または希釈した解離液を、細胞外小胞の内包物を測定するための検体として、本発明の方法や他の分析方法に使用することができる。

［細胞外小胞の内包物の測定キット］
本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定キットは、細胞外小胞から内包物を溶出させるための上記の溶出液と、上記の測定チップと、上記の標識試薬（蛍光物質と、第２の結合物質とを含み、所望により第３の結合物質をさらに含むもの）と、をセットにしたものである。このように上記の溶出液、測定チップおよび標識試薬を予めセットとしておくことで、ユーザー（医療従事者など）が細胞外小胞の内包物の上記測定方法をより簡便に行うことが可能となる。

［効果］
以上のように、本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法および測定キットにおいては、ＳＰＦＳを利用して、検体から細胞外小胞を分離または濃縮する必要なしに、夾雑物の影響を抑制しながら、高感度に細胞外小胞の内包物を測定することが可能となる。また、細胞外小胞からの内包物の溶出や、検体の希釈といった一連の操作を装置内で自動的に行っても、感度不足を生じることなく、簡便に内包物を測定することが可能となる。

また、ＳＰＦＳは、検体として全血も使用することができるため、細胞外小胞の抽出といった工程を実施することなく、少ない手順で簡便に実施することが可能な、血液中の細胞外小胞の内包物に基づく診断方法や診断キット等を構築することが可能となる。

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

実施例１
検体としては、コスモバイオ社から購入した５６３７細胞由来エクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの（水和しているが、凍結乾燥品がＰＢＳで調製されているため、バッファー系となっている。以下、「バッファー系」と記載する）を用意した。検体のエクソソーム濃度は１．６×１０⁶粒子／μｌである。さらに、希釈液として、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを用意し、溶出液として、１％のTｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む希釈液を用意した。

図３Ａに示した測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として、抗ＨＳＰ７０抗体１（熱ショックタンパク質７０に対する抗体であって、後述する抗ＨＳＰ７０抗体２とは異なるエピトープを認識するもの）を固定化したものをＳＰＦＳ測定用に準備した。尚、抗ＨＳＰ７０抗体１は、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）に特異的に結合する抗体である。

上記検体について、エクソソームからその内包物であるＨＳＰ７０を溶出させて、ＨＳＰ７０の量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。具体的には、測定に関連する試薬を含む測定カートリッジの空のウェルに、溶出液（対照は希釈液）と検体とを加え、ウェル内でピペットチップを用いて吸引吐出を約３０秒間行い、ウェル内の検体と溶出液（希釈液）とを攪拌し、混合した。当該混合によって検体を希釈し（装置内希釈率は３倍）、さらに溶出液を用いた系においては、希釈と同時にエクソソームから内包物を溶出させ、測定用検体を得た。

次に、内包物の溶出および／または希釈した検体である測定用検体を、ピペットチップにより、液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素で標識された抗ＨＳＰ７０抗体２（熱ショックタンパク質７０に対する抗体であって、上述した抗ＨＳＰ７０抗体１とは異なるエピトープを認識するもの）を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部から流路内の標識試薬を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、細胞外小胞の内包物であるＨＳＰ７０の量に相関するシグナル値を算出した。結果を下記表１および図６に示した。

表１および図６の結果から明らかなように、希釈液に添加した界面活性剤によって細胞外小胞（エクソソーム）からその内包物が溶出され、ＳＰＦＳを用いて検出することができた。

実施例２
ヒト血清に５６３７細胞由来エクソソームを添加した、当該エクソソームの濃度が２．０×１０⁶粒子／μｌである検体を準備した。

上記検体を使用する以外は実施例１と同様に、エクソソームからその内包物であるＨＳＰ７０を溶出させて、ＨＳＰ７０の量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。結果を下記表２および図７に示した。

表２および図７の結果から明らかなように、血清中の多様な夾雑物に影響されることなく、ＳＰＦＳを用いて検体中の細胞外小胞（エクソソーム）から溶出させた内包物を測定することができた。

比較例１
実施例１と同じ検体、第１の結合物質、および第２の結合物質を用いて、ＥＬＩＳＡ法により検体中の細胞外小胞（エクソソーム）から溶出させた内包物を測定した。

実施例１と同様に、エクソソーム濃度が１．６×１０⁶粒子／μｌの検体を用意した。さらに、希釈液として、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを用意し、溶出液として、１％のTＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含む希釈液を用意した。

検体３５μｌに対して、溶出液７０μｌを加えて混合し、内包物（ＨＳＰ７０）を溶出させるために３７℃で３０分静置し、内包物測定用の検体を得た。尚、溶出液の代わりに、溶出液を含まない希釈液を添加した対照検体も用意した。

上記検体中のＨＳＰ７０（内包物）の測定を、ＥＬＩＳＡ法により実施した。具体的には、補足抗体（１次抗体）として抗ＨＳＰ７０抗体１をマイクロプレートのウェル内に固相化し、さらにウェル内へのＨＳＰ７０の非特異的結合を低減するためのブロッキング処理を施したマイクロプレートを用意した。用意したマイクロプレートのウェルに検体を加え、３７℃で１時間静置して、ＨＳＰ７０を補足抗体に結合させた。その後、検体を除去し、洗浄液でウェルを洗浄した。

検出抗体（２次抗体）として、ビオチンで標識した抗ＨＳＰ７０抗体２をウェルに加え、３７℃で１時間静置して、ＨＳＰ７０に検出抗体を結合させた。その後、検出検体を除去し、洗浄液でウェルを洗浄した。次に、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したストレプトアビジンをウェルに加え、ウェル内のビオチンを発色させ、十分に発色した時点で停止液を加えて比色反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで発色したウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を測定し、シグナル値を得た。結果を下記表３および図８に示した。

表３および図８の結果から明らかなように、ＳＰＦＳに基づく本発明の方法（実施例１）では測定可能な、エクソソーム濃度が１．６×１０⁶粒子／μｌの検体について、ＥＬＩＳＡ法では、内包物を溶出させても、溶出なしの対照と同様のシグナル値しか得られなかった。よって、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ法よりも測定感度が高いことがわかる。

実施例３
実施例１と同じ検体を準備し、ＳＰＦＳの装置を用いてエクソソームを単離し、単離したエクソソームの内包物を測定した。

検体としては、コスモバイオ社から購入した５６３７細胞由来エクソソーム（凍結乾燥品）を水和したもの（水和しているが、凍結乾燥品がＰＢＳで調製されているため、バッファー系となっている。以下、「バッファー系」と記載する）を用意した。検体のエクソソーム濃度は１．６×１０⁶粒子／μｌである。さらに、希釈液として、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを用意し、溶出液として、１％のTｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む希釈液を用意した。

図３Ａに示した測定チップを用意し、その流路内に露出している金属膜（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、エクソソーム結合物質として、抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化したものを準備した。

ピペットチップにより、液体注入部から流路内に検体を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部から流路内の検体を回収し、カートリッジの空きウェルに吐出し、その後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。

流路内の洗浄液を除去した後、液体注入部から流路内に溶出液（対照は希釈液）を導入し、往復送液させて、測定チップに補足したエクソソームからその内包物を溶出させた（溶出処理）。溶出処理の時間は１０分とした。流路内の、エクソソームの内包物を含んだ溶出液（対照は希釈液）を回収し、測定用検体とした。

抗ＨＳＰ７０抗体１を固定化した上記とは別の測定チップを用いて、上記で得られた測定用検体について、実施例１と同様に、ＨＳＰ７０の量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。結果を下記表４および図９に示した。

表４および図９の結果から明らかなように、ＳＰＦＳの装置を用いて細胞外小胞（エクソソーム）を補足し、流路内で補足した細胞外小胞から内包物を溶出させて、内包物を測定することができた。よって、本発明の方法においては、検体中の細胞外小胞の補足、細胞外小胞からの内包物の放出、および内包物の測定を連続的に実施することが可能となる。

実施例４
実施例１と同じ検体を準備し、そこにＨＳＰ７０抗原を１０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、エクソソームと遊離ＨＳＰ７０とを含む検体を得た。得られた検体からＳＰＦＳの装置を用いてエクソソームを単離し、単離したエクソソームの内包物を測定した。

上記検体を使用する以外は実施例３と同様にエクソソームを測定チップ上に補足し、補足したエクソソームから内包物を溶出させて、流路内の、エクソソームの内包物を含んだ溶出液（対照は希釈液）を回収し、測定用検体を得た。

上記で得られた測定用検体について、実施例１と同様に、ＨＳＰ７０の量に相関するシグナル値をＳＰＦＳで測定した。結果を下記表５および図１０に示した。

表５および図１０の結果から明らかなように、本発明の測定方法によって、検体中に遊離した内包物が存在しても、細胞外小胞の内包していた物質を選択的に測定することができた。

本実施の形態に係る細胞外小胞の内包物の測定方法および測定キットを用いることで、検体から細胞外小胞を抽出しなくとも、夾雑物の影響を抑制しながら、高感度で内包物を測定することが可能となる。また、細胞外小胞からの内包物の放出や、検体の希釈といった一連の操作を装置内で自動的に行っても、感度不足を生じることなく、簡便に内包物を測定することが可能となる。したがって、本発明に係る細胞外小胞の内包物の測定方法および測定キットは、新規な疾患マーカーや診断キットの開発などに有用である。

１００、２００、３００、４００、５００測定チップ
１１０プリズム
１１１入射面
１１２成膜面
１１３出射面
１２０金属膜
１３０抗内包物抗体（第１の結合物質）
１３１抗内包物抗体（第２の結合物質）
１４０内包物
１５０蛍光物質
２１０金属膜
２１１回折格子
３１０流路蓋
３２０流路
３３０液体注入部
３３１液体注入部被覆フィルム
３４０貯留部
３４１貯留部被覆フィルム
３４２通気孔
３５０接着層
４１２誘電体部材
４１４金属薄膜
４１６リガンド固定領域
４１８ウェル部材
４２０貫通穴
４２２センサ構造体
５１０ウェル本体
５１１収容部
５２０側壁部材
５２１プリズム
５２３反射面
５２５金属膜
５２６反応場
Ｌ１励起光
Ｌ２反射光
Ｌ３蛍光

Claims

第一の測定チップ、及び金属膜と、前記金属膜に固定化された、細胞外小胞の内包物に結合する第１の結合物質とを含む第二の測定チップを準備する工程と、
前記第一の測定チップ及び前記第二の測定チップを設置可能な装置を用意する工程と、
検体を、前記装置に設置された前記第一の測定チップに提供して、前記検体に含まれる細胞外小胞を単離する工程と、
前記装置に設置された前記第一の測定チップにおいて前記細胞外小胞から内包物を放出させる工程と、
前記装置に設置された前記第二の測定チップの前記金属膜の上に前記内包物を提供して、前記内包物を前記第１の結合物質に結合させる工程と、
前記装置にて、前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記内包物を、前記内包物に結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、
前記装置にて、前記蛍光物質で標識された前記内包物が前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、
を含む、細胞外小胞の内包物の測定方法。
前記検体が、細胞培養上清、血清、血漿、全血、尿、唾液、細胞ライセートまたはこれらの希釈物である、請求項１に記載の測定方法。
前記内包物が、核酸、タンパク質、またはそれらの断片から選ばれる少なくとも１種である、請求項１または２に記載の測定方法。
前記内包物の放出を、溶出液を用いて実施する、請求項１～３のいずれか一項に記載の測定方法。
前記溶出液が非変性界面活性剤を含む、請求項４に記載の測定方法。
前記非変性界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の測定方法。
前記第１の結合物質が、前記内包物の有する第１の結合決定基に結合するものであり、前記第２の結合物質が、前記内包物の有する第２の結合決定基に結合するものであり、前記第１の結合決定基と前記第２の結合決定基とは異なる、請求項１～６のいずれか一項に記載の測定方法。
前記励起光の照射エネルギーは、７．５μＷ／ｍｍ^２以上３０ｍＷ／ｍｍ^２以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の測定方法。
前記金属膜は、プリズムの上に配置されており、
前記励起光は、プリズムを介して前記金属膜に照射される、
請求項１～８のいずれか一項に記載の測定方法。
前記金属膜は、回折格子を含み、
前記第１の結合物質は、前記回折格子の上に固定化されており、
前記励起光は、前記回折格子に照射される、
請求項１～８のいずれか一項に記載の測定方法。
細胞外小胞の内包物を前記細胞外小胞から溶出させるための溶出液と、
第一の金属膜と、前記第一の金属膜に固定化された、前記細胞外小胞に結合する結合物質とを含む第一の測定チップと、
第二の金属膜と、前記第二の金属膜に固定化された、前記内包物に結合する第１の結合物質とを含む第二の測定チップと、
前記内包物を蛍光物質で標識するための標識試薬と、
を含む、
細胞外小胞の内包物の測定キット。
前記内包物が、核酸、タンパク質、またはそれらの断片から選ばれる少なくとも１種である、請求項１１に記載の測定キット。
前記溶出液が、非変性界面活性剤である、請求項１１または１２に記載の測定キット。
前記非変性界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、デオキシコール酸ナトリウム、およびＴｗｅｅｎ２０からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１３に記載の測定キット。