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JP7505984B2 - サイトカインをコードするｒｎａを用いた治療 - Google Patents

サイトカインをコードするｒｎａを用いた治療 Download PDF

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JP7505984B2 JP2020565536A JP2020565536A JP7505984B2 JP 7505984 B2 JP7505984 B2 JP 7505984B2 JP 2020565536 A JP2020565536 A JP 2020565536A JP 2020565536 A JP2020565536 A JP 2020565536A JP 7505984 B2 JP7505984 B2 JP 7505984B2
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Description

本開示は、対象において免疫応答を誘導するための方法および組成物であって、ワクチン接種に使用されるペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡならびに薬物動態修飾基に結合したＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／または薬物動態修飾基に結合したＩＬ７をコードするＲＮＡを対象に同時投与することを含む方法および組成物に関する。ワクチンは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤をさらに投与する場合に特に有効である。本開示はさらに、標的器官または標的組織へのサイトカインの標的特異的送達を含む方法に関する。
免疫系は、病原体関連疾患だけでなく癌、自己免疫、アレルギーにおいても重要な役割を果たす。Ｔ細胞は抗腫瘍免疫応答の重要なメディエータである。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞を直接溶解することができる。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む様々な免疫サブセットの腫瘍への流入を媒介することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のプライミングのために樹状細胞（ＤＣ）をライセンス化することができ、ＩＦＮγを介したＭＨＣの上方制御と成長阻害によって腫瘍細胞に直接作用することができる。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、ワクチン接種によって誘導することができる。ｍＲＮＡに基づくワクチンプラットフォームの文脈において、ｍＲＮＡは、さらなるアジュバントを必要とせずに、リポソーム製剤（ＲＮＡ－ＬＰＸ）によって二次リンパ器官に位置する抗原提示細胞に送達され得る（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６（２０１５）；Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６））。
腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１の上方制御またはＰＤ－Ｌ１を発現する免疫細胞の誘引によってＴ細胞媒介攻撃を回避することが公知である。Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用は、それらの抗腫瘍機能を阻害する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸をブロックする抗体は、既存のＴ細胞応答の可能性増加と相関する高い変異負荷を有する患者のサブセットにおいて強力な腫瘍制御を誘導することが示された（Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１２４－１２８（２０１５））。
したがって、Ｔ細胞ワクチンは、Ｔ細胞のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント遮断を介した再活性化から恩恵を受ける可能性がある。一方、チェックポイント遮断は、既存のＴ細胞応答がない患者でＴ細胞ワクチンから恩恵を受ける可能性がある。ｍＲＮＡワクチン接種と抗ＰＤ－Ｌ１チェックポイント遮断の組合せは、現在臨床試験中である（ＲＯ７１９８４５７）。
サイトカインは免疫において重要な役割を果たす。例えば、インターロイキン‐２（ＩＬ２）は、Ｔ細胞の分化、増殖、生存およびエフェクタ機能を支持することが公知である（Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０－７（２００３））。例えば、組換えＩＬ２は、後期悪性黒色腫の治療において数十年間使用されてきた（Ｍａａｓ，Ｒ．Ａ．，Ｄｕｌｌｅｎｓ，Ｈ．Ｆ．＆Ｄｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６，１４１－８（１９９３））。インターロイキン－７（ＩＬ７）は、Ｔ細胞およびＢ細胞のリンパ球生成および生存ならびに記憶Ｔ細胞形成において重要な役割を果たすことが示されている（Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１－１１９８（２００３）；Ｆｒｙ，Ｔ．Ｊ．＆Ｍａｃｋａｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９，３８９２－３９０４（２００２）；Ｐａｌｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，７９－８９（２００８））。これらのサイトカインは、単独では効果のない癌治療法である。しかし、癌ワクチンおよび免疫チェックポイント遮断などの免疫療法にサイトカインを追加すると、優れた抗腫瘍効果につながるＴ細胞応答をさらに増強することが約束される。
樹状細胞（ＤＣ）およびＴ細胞などの細胞成分と、サイトカインおよびケモカインなどの可溶性成分との間の複雑な相互作用が、免疫がどちらかと言えば炎症誘発性であるかまたは主に寛容原性であるかを制御する。したがって、関心対象の細胞に対するそれらの活性を制限し、毒性作用を防ぐために、サイトカイン発現の厳しい時空間的調節が存在する。インターロイキン－１２（ＩＬ１２）などのいくつかのサイトカインは、リンパ節または脾臓でのＴｈ１ Ｔ細胞応答のプライミング中に決定的に必要（すなわち癌／ウイルス免疫にとって重要）であるが、全身投与した場合は好ましくないか、さらには毒性が高い（Ｌａｓｅｋ，Ｗ．，Ｚａｇｏｚｄｚｏｎ，Ｒ．＆Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋ，Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６３，４１９－３５（２０１４））。ＩＬ７のような他のサイトカインは、血液および組織におけるＴ細胞の維持のために全身的に必要である（Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１－８（２００３）；Ｆｒｙ，Ｔ．Ｊ．＆Ｍａｃｋａｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９，３８９２－３９０４（２００２）；Ｐａｌｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，７９－８９（２００８））。ＩＬ２などの他のサイトカインもやはり、Ｔ細胞のプライミング中だけでなく、血液および組織における維持の間、または癌免疫の場合は、腫瘍中のＴ細胞のエフェクタ機能中にも二次リンパ器官で必要である（Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０－７（２００３））。
Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６（２０１５） Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６） Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１２４－１２８（２０１５） Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０－７（２００３） Ｍａａｓ，Ｒ．Ａ．，Ｄｕｌｌｅｎｓ，Ｈ．Ｆ．＆ Ｄｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６，１４１－８（１９９３） Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１－１１９８（２００３） Ｆｒｙ，Ｔ．Ｊ．＆ Ｍａｃｋａｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９，３８９２－３９０４（２００２） Ｐａｌｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，７９－８９（２００８） Ｌａｓｅｋ，Ｗ．，Ｚａｇｏｚｄｚｏｎ，Ｒ．＆ Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋ，Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６３，４１９－３５（２０１４） Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１－８（２００３）
癌ワクチンは、腫瘍細胞によって発現される抗原に対する免疫系を刺激するために使用することができる。これらの治療法は有望な結果を示しているが、その有効性は依然として限られている。
ワクチン、特に癌ワクチンの有効性を高めるための新規戦略が必要である。
本発明者らは、驚くべきことに、ワクチン接種に使用されるペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ（抗原をコードするＲＮＡ）の有効性が、薬物動態修飾基に結合したＩＬ２をコードするＲＮＡ（以下、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２と称する）および／または薬物動態修飾基に結合したＩＬ７をコードするＲＮＡ（以下、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ７」と称する）を同時投与することによって増加され得ることを見出した。ワクチンは、延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡが、全身アベイラビリティのために肝臓を標的とする場合に特に有効である。肝細胞は効率的にトランスフェクトすることができ、大量のタンパク質を生産できる。抗原をコードするｍＲＮＡは、好ましくは二次リンパ器官を標的とする。さらに、ワクチンは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤がさらに投与される場合に特に有効である。
一態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む方法に関する。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ７は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ７部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。
一実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。
一実施形態では、方法は、対象に、
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することをさらに含む。
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体または抗体断片である。一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ、前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、ならびに任意で免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する。
一実施形態では、方法は、対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；ならびに
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む。
一実施形態では、方法は、対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；ならびに
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む。
一実施形態では、方法は、対象に、
ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；および
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む。
一実施形態では、治療は、抗原に特異的なＣＤ１２７陽性Ｔ細胞の数を増加させる。一実施形態では、治療は、短命なエフェクタ細胞の数を減少させる。一実施形態では、治療は、制御性Ｔ細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞の比率を増加させる。
一実施形態では、方法は、対象における癌を治療または予防するための方法であり、ここで抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を投与しない。
さらなる態様では、本発明は、対象における癌を治療または予防するための方法であって、対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む方法に関する。
一実施形態では、癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される。
対象における癌を治療または予防するための方法の実施形態は、対象において免疫応答を誘導するための方法について上述したとおりである。
さらなる態様では、本発明は、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を含む医薬製剤に関する。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ７は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ７部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。
一実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。
一実施形態では、医薬製剤は、
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
をさらに含む。
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体または抗体断片である。一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする。
一実施形態では、医薬製剤は、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；ならびに
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を含む。
一実施形態では、医薬製剤は、
ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；および
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を含む。
一実施形態では、医薬製剤はキットである。一実施形態では、医薬製剤は、各ＲＮＡを別々の容器に含む。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＲＮＡを含まない容器内にある。一実施形態では、医薬製剤は、癌を治療または予防するための医薬製剤の使用説明書をさらに含み、ここで抗原は腫瘍関連抗原である。
一実施形態では、医薬製剤は、ＲＮＡを含む医薬組成物である。一実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む。
医薬製剤の一実施形態では、ＲＮＡは、液体形態、固体形態、またはそれらの組合せから選択される形態で存在する。一実施形態では、固体形態は、凍結形態または脱水形態である。一実施形態では、脱水形態は、凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である。
さらなる態様では、本発明は、医薬用途のための本明細書に記載の医薬製剤に関する。一実施形態では、医薬用途は、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む。
さらなる態様では、本発明は、対象における癌を治療または予防するための方法で使用するための本明細書に記載の医薬製剤に関し、ここで抗原は腫瘍関連抗原である。
一実施形態では、本明細書に記載の癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される。
一実施形態では、医薬製剤は、腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を含まない。
さらなる態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘導するための方法で使用するためのＲＮＡに関し、この方法は、対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ７は融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ７部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。
一実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。
ＲＮＡの一実施形態では、方法は、対象に、
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することをさらに含む。
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体または抗体断片である。一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする。
一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ、前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、ならびに任意で免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する。
ＲＮＡの一実施形態では、方法は、対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；ならびに
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む。
ＲＮＡの一実施形態では、方法は、対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；ならびに
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む。
ＲＮＡの一実施形態では、方法は、対象に、
ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ；および
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む。
ＲＮＡの一実施形態では、治療は、抗原に特異的なＣＤ１２７陽性Ｔ細胞の数を増加させる。ＲＮＡの一実施形態では、治療は、短命なエフェクタ細胞の数を減少させる。ＲＮＡの一実施形態では、治療は、制御性Ｔ細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞の比率を増加させる。
ＲＮＡの一実施形態では、方法は、対象における癌を治療または予防するための方法であり、ここで抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を投与しない。
さらなる態様では、本発明は、対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む、対象における癌を治療または予防するための方法で使用するためのＲＮＡに関する。
一実施形態では、癌は、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される。
一実施形態では、ＲＮＡは、前記方法で投与されるＲＮＡの１つ以上であるか、またはそれを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ、延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ、および前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡからなる群より選択される１つ以上であるか、またはそれを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡであるか、またはそれを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡであるか、またはそれを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡであるか、またはそれを含む。
一実施形態では、ＲＮＡは、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／もしくは延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡ
であるか、またはそれを含む。
一実施形態では、ＲＮＡは、
ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ；および
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードするＲＮＡ
であるか、またはそれを含む。
本明細書に記載されるすべての態様の一実施形態では、延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡは、コードされるタンパク質の発現のために肝臓に送達される、および／または肝臓への送達用に製剤化される。本明細書に記載されるすべての態様の一実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、コードされるタンパク質の発現のためにリンパ系に送達される、および／またはリンパ系への送達用に製剤化される。
ｍＩＬ２をコードする構築物の検証。 Ａ ｍＩＬ２をコードする構築物の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のＥＬＩＳＡ分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡで、またはｍＲＮＡなしで（モック）リポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡ分析に使用した。 Ｂ ｍＩＬ２をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のウェスタンブロット分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡでリポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、抗ｍＩＬ２抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用した。 Ｃ ｍＩＬ２をコードする構築物の生物学的活性を分析するためのＣＴＬＬ－２増殖アッセイ。ＣＴＬＬ－２細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下で７２時間培養した。組換えＩＬ２の存在下でのＣＴＬＬ－２増殖を対照として使用した。ｍＲＮＡの非存在下でリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７（モック）の上清を対照として使用した。Ｒｅｃ．ＩＬ２：組換えインターロイキン－２、ｍＡｌｂ：マウス血清アルブミン、ｍＩＬ２：マウスインターロイキン－２、ｍＩＦＮβ：マウスインターフェロンβ、ｒｅｃ：組換え体。 ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉをコードする構築物の検証。 Ａ ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉをコードする構築物の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のＥＬＩＳＡ分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡで、またはｍＲＮＡなしで（モック）リポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡ分析に使用した。 Ｂ ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉをコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のウェスタンブロット分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡでリポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、抗ｍＩＬ１５抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用した。 Ｃ ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉをコードする構築物の生物学的活性を分析するためのＣＴＬＬ－２増殖アッセイ。ＣＴＬＬ－２細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下で７２時間培養した。組換えｈＩＬ１５ｓｕｓｈｉの存在下でのＣＴＬＬ－２増殖を陽性対照として使用した。ｍＲＮＡの非存在下でリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７（モック）の上清を対照として使用した。Ｒｅｃ ｈＩＬ１５ｓｕｓｈｉ：インターロイキン－１５受容体αに融合した組換えヒトＩＬ１５、ｍＡｌｂまたはＭｍＡｌｂ：マウス血清アルブミン、ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉまたはＭｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉ：インターロイキン－１５受容体αに融合したマウスインターロイキン－１５。 ｍＩＬ７をコードする構築物の検証。 Ａ ｍＩＬ７をコードする構築物の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のＥＬＩＳＡ分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡで、またはｍＲＮＡなしで（モック）リポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡ分析に使用した。 Ｂ ｍＩＬ７をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のウェスタンブロット分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡでリポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、抗ｍＩＬ７抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用した。 Ｃ ｍＩＬ７をコードする構築物の生物学的活性を分析するためのＴ細胞増殖アッセイ。２人の異なるドナー（ドナーＮｏ．５９ 上のパネル、ドナーＮｏ．８００ 下のパネル）のＰＢＭＣ細胞を抗ＣＤ３抗体（ドナーＮｏ．５９ ０．０５μｇ／ｍｌ、ドナーＮｏ．８００ ０．１μｇ／ｍｌ）で活性化し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下で９６時間培養した。組換えＩＬ７の存在下でのＴ細胞増殖を陽性対照として使用した。Ｔ細胞の増殖を、抗ＣＤ４－ＰＥおよび抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７染色後にフローサイトメトリを使用したＣＦＳＥモニタリングによって分析した。ｍＲＮＡの非存在下でリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７（モック）の上清を対照として使用した。Ｒｅｃ ＩＬ７：組換えインターロイキン－７、ｍＡｌｂまたはＭｍＡｌｂ：マウス血清アルブミン、ｍＩＬ７またはＭｍＩＬ７：マウスインターロイキン－７。 ｍＩＦＮβおよびｓｅｃ－ｎＬＵＣをコードする構築物の検証。 Ａ ｍＩＦＮβをコードする構築物の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のＥＬＩＳＡ分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡで、またはｍＲＮＡなしで（モック）リポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡ分析に使用した。 Ｂ ｍＩＦＮβをコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のウェスタンブロット分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡでリポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、抗ｍＩＦＮβ抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用した。 Ｃ ｍＩＦＮβをコードする構築物の生物学的活性を評価するために、得られたｍＲＮＡの能力を、マウス結腸癌細胞（ＣＴ２６）におけるＭＨＣクラスＩ発現のｍＩＦＮβ依存性上方制御によって分析した。ＣＴ２６細胞を、ｍＩＦＮβをコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下で２４時間培養した。組換えＩＦＮβを対照として使用した。処理後のＣＴ２６細胞上のＭＨＣクラスＩの表面レベルを、ＦＩＴＣ結合Ｈ２Ｋｂ抗体によるＭＨＣクラスＩ染色およびその後のフローサイトメトリ分析によって評価した。 Ｄ ｓｅｃ－ｎＬＵＣをコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７の上清中で、ｓｅｃ－ｎＬＵＣの発現および得られた遺伝子産物のルシフェラーゼ活性を測定した。示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現後の上清中のルシフェラーゼ活性をプロットしている。ｍＲＮＡの非存在下でリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７（モック）の上清を対照として使用した。Ｒｅｃ ＩＦＮβ：組換えインターフェロンβ、ｍＡｌｂ：マウス血清アルブミン、ｍＩＦＮβ：マウスインターフェロンβ、ｍＩＬ２：マウスインターロイキン－２、ｓｅｃ－ｎＬＵＣ：分泌型ナノルシフェラーゼ。 ｍＡｌｂに融合され、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡにコードされた場合、サイトカインの全身アベイラビリティが延長される。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群および時点あたりｎ＝３）に、ＴｒａｎｓＩＴを用いて製剤化した３μｇの未改変またはｍＡｌｂ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ（示されているとおり）を静脈内注射した。注射後６、２４および４８時間目ならびに５日目に血液を採取し、血清を調製した。注射後６、２４および４８時間目ならびに５日目に血液中でサイトカイン濃度を測定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。ｍＡｌｂ：マウス血清アルブミン、ｍＩＬ２：マウスインターロイキン－２、ｍＩＦＮβ：マウスインターフェロンβ。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は脾臓の免疫細胞サブセットを拡大する。 ｍＲＮＡの注射後５日目に、図５に記載されているように処置したＣ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を単離し、免疫細胞サブセットの絶対細胞数をフローサイトメトリによって測定した。脾臓あたりのＴ細胞サブセット、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の絶対細胞数（Ａ）、ならびに脾臓重量（Ｂ）を示す。一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した（表１参照）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂは脾臓の免疫細胞サブセットを活性化する。 ｍＲＮＡ注射の２４時間後に、図５に記載されているように処置したＣ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を単離し、免疫細胞サブセットの活性化状態（ＣＤ４０、ＣＤ６９およびＣＤ８６発現）をフローサイトメトリによって測定した。中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した（表２参照）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＡｌｂ融合は、血液、腫瘍および腫瘍排出リンパ節におけるタンパク質のアベイラビリティを高め、延長する。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群および時点あたりｎ＝３匹のマウス）に、１００μｌのＰＢＳ中の５×１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下接種し、２４日目にＴｒａｎｓＩＴを用いて製剤化した３μｇのｓｅｃ－ｎＬＵＣ、ｍＡｌｂに融合したｓｅｃ－ｎＬＵＣ（ｓｅｃ－ｎＬＵＣ－ｍＡｌｂ）を静脈内注射するか、または未処理のまま（対照）にした。注射後２、６、２４、４８および７２時間目に血清を調製し、６、２４、４８および７２時間目に組織を採取した。生物発光強度を、５０μｌの血清または組織溶解物に由来する３０μｇの総タンパク質から定量化した。対照群から得たデータを、時点０でのベースラインとして使用した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、ｍＲＮＡワクチン接種およびＰＤ－Ｌ１遮断の腫瘍制御を強力に増強する。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝８）に、１００μｌ ＰＢＳ中の５×１０５ ＣＴ２６－ＷＴ腫瘍細胞を皮下注射した。１０日後、マウスをｇｐ７０ ｍＲＮＡリポプレックスワクチン接種（２０μｇ ｉ．ｖ．）および抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体（最初の処置時に２００μｇ ｉ．ｐ．、その後１００μｇ ｉ．ｐ．）で処置した。２日後、様々なサイトカイン（図に示されている）をコードする１μｇのヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを、肝臓を標的とするナノ粒子製剤中で静脈内注射した。対照として、マウスアルブミン（ｍＡｌｂ）ＲＮＡを投与した。上のパネルに示すように、処置スケジュールを毎週繰り返した。個々のマウスの成長曲線を示す。ｍＩＬ２：マウスインターロイキン－２、ｍＩＦＮβ：マウスインターフェロンβ、ｍＩＬ７：マウスインターロイキン－７、ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉ：インターロイキン－１５受容体αに融合したマウスインターロイキン－１５。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は、ワクチンが誘導するＴ細胞応答を容易に増加させる。 図９に示したＣＴ２６－ＷＴ腫瘍担持マウスを、最初の処置の７日後（腫瘍接種後１７日目）の血液中のｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。血液１μｌあたりの絶対数（左）およびＣＤ８＋Ｔ細胞中の四量体＋細胞の割合（右）を示す。一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、抗原特異的Ｔ細胞の高い力価を維持する。 図９で紹介したマウスの腫瘍接種後１７、２４および３１日目の血液１μｌあたりのｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋細胞の数を示す。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は主に腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を拡大する。 最初の処置の７日後の、図９で紹介したｍＡｌｂ処置対照動物のＣＤ８＋四量体陽性またはＣＤ８＋四量体陰性Ｔ細胞数の中央値に対する倍数増加を示す。一元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 腫瘍サイズは腫瘍抗原特異的Ｔ細胞力価と逆相関する。 図９で紹介したマウスからの血液１μｌあたりの四量体陽性細胞の数を、１７日目（Ａ）、２４日目（Ｂ）および３１日目（Ｃ）の腫瘍サイズに対してプロットしている。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数に基づいて有意性を決定した。 腫瘍サイズは腫瘍抗原特異的Ｔ細胞力価と逆相関する。 図９で紹介したマウスからの血液１μｌあたりの四量体陽性細胞の数を、１７日目（Ａ）、２４日目（Ｂ）および３１日目（Ｃ）の腫瘍サイズに対してプロットしている。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数に基づいて有意性を決定した。 腫瘍サイズは腫瘍抗原特異的Ｔ細胞力価と逆相関する。 図９で紹介したマウスからの血液１μｌあたりの四量体陽性細胞の数を、１７日目（Ａ）、２４日目（Ｂ）および３１日目（Ｃ）の腫瘍サイズに対してプロットしている。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数に基づいて有意性を決定した。 ＩＬ７－ｍＡｌｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の割合を減少させつつ、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を強力に増加させる。 フローサイトメトリによるＣＤ４＋（絶対数）およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合）Ｔ細胞の定量化。マウス（図９で紹介した）の血液を、腫瘍接種後３１日目に分析した。一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＩＬ７－ｍＡｌｂおよびｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は、長命のＣＤ１２７＋記憶前駆細胞のために短命の抗原特異的エフェクタ細胞の割合を減少させる。 腫瘍接種の３１日後に、図９で紹介したマウスの血液を、短命エフェクタ細胞（ＳＬＥＣ、ＫＬＲＧ１＋／ＣＤ１２７－）およびＣＤ１２７＋細胞（記憶前駆体エフェクタ細胞；ＭＰＥＣ、ＫＬＲＧ１－／ＣＤ１２７＋）（ＫＬＲＧ１＋／ＣＤ１２７＋）のマーカについて分析した。ＣＤ１２７：インターロイキン７受容体、ＫＬＲＧ－１：キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー１。二元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定は、ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂによるＳＬＥＣの有意な減少とＣＤ１２７＋細胞の増加を明らかにした（表３参照）。 短命のエフェクタ細胞の頻度は腫瘍体積と正の相関があり、一方高いＣＤ１２７＋抗原特異的Ｔ細胞の頻度は腫瘍サイズの縮小に付随する。 ｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋細胞のうちのＳＬＥＣ（Ａ）またはＣＤ１２７＋（Ｂ）細胞の割合を、図９で紹介したマウスの３１日目の腫瘍サイズに対してプロットしている。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数に基づいて有意性を決定した。 短命のエフェクタ細胞の頻度は腫瘍体積と正の相関があり、一方高いＣＤ１２７＋抗原特異的Ｔ細胞の頻度は腫瘍サイズの縮小に付随する。 ｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋細胞のうちのＳＬＥＣ（Ａ）またはＣＤ１２７＋（Ｂ）細胞の割合を、図９で紹介したマウスの３１日目の腫瘍サイズに対してプロットしている。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数に基づいて有意性を決定した。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂとｍＲＮＡワクチン接種およびＰＤ－Ｌ１遮断との組合せは、完全な腫瘍根絶をもたらす。 ＣＴ２６－ＷＴ腫瘍担持マウス（ｎ＝１１）を図９に記載されているように処置した。マウスに、ｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸおよび抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体の注射を毎週行った。２日後、ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂまたはその両方（各１μｇ）をコードするヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを投与した。腫瘍接種後１３日目に処置を開始した（上のパネル参照）。個々のマウスの成長曲線を示す。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、長期持続性ワクチンが誘導するＴ細胞応答の増強において相乗作用する。 図１７に示すマウスの血液を、腫瘍接種後１９、２７および３４日目にフローサイトメトリによってｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）ならびにそれらのＫＬＲＧ１およびＣＤ１２７（Ｂ）の発現について分析した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、長期持続性ワクチンが誘導するＴ細胞応答の増強において相乗作用する。 図１７に示すマウスの血液を、腫瘍接種後１９、２７および３４日目にフローサイトメトリによってｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）ならびにそれらのＫＬＲＧ１およびＣＤ１２７（Ｂ）の発現について分析した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、ｍＡＬｂ－ｍＩＬ２によって増加した腫瘍促進性制御性Ｔ細胞の数を正常化する。 腫瘍接種後５７日目に、図１７に示した残りのマウスを、血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の割合について分析した。一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＩＬ１２をコードする構築物の検証。 ｍＩＬ１２をコードするｍＲＮＡの生物学的活性を分析するためのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２ルシフェラーゼアッセイ。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下で２４時間培養した。組換えヒトＩＬ１２を対照として使用した。ｍＲＮＡの非存在下でリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７（モック）の上清を対照として使用した。Ｒｅｃ ｈＩＬ１２：組換えヒトインターロイキン－１２、ｍＡｌｂ：マウス血清アルブミン、ｍＩＬ１２：マウスインターロイキン－１２、ＳＥＡＰ：分泌型胚性アルカリホスファターゼ。 二次リンパ器官におけるＤＣに限定されたｍＲＮＡにコードされるタンパク質の発現。 Ａ ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、２０μｇのＬＵＣをコードするＲＮＡ－ＬＰＸまたはＬＵＣ ｍＲＮＡ単独を静脈内注射し、インビボイメージングによって注射の６時間後に生物発光を測定した。 Ｂ 鼠径部リンパ節および骨を、１００μｇのＬＵＣ ＲＮＡ－ＬＰＸまたはＬＵＣ ｍＲＮＡ単独の注射の２４時間後にＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）から単離し、エクスビボイメージングによって生物発光を定量化した。 ＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウス（群あたりｎ＝３）に、１００μｇのＬＵＣ ＲＮＡ－ＬＰＸの注射の１２時間前に４ｎｇ／ｇ体重のＤＴを腹腔内投与し、インビボで脾臓および鼠径部リンパ節の生物発光を定量化し、注射の６時間後にエクスビボＬＵＣアッセイによって骨髄単細胞懸濁液の生物発光を定量化した。未処置の器官または細胞のバックグラウンド生物発光について補正したデータ。平均±ＳＤ。ＤＴ：ジフテリア毒素；ＬＵＣ：ルシフェラーゼ；ＢＭ：骨髄；ＬＮ：リンパ節。Ｌｅｎａ Ｋｒａｎｚの許可を得て（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６））から部分的に導出されたデータ。 肝臓に限定されたｍＲＮＡにコードされるタンパク質の発現。 ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５μｇのポリマー／脂質製剤化ＬＵＣ ｍＲＮＡ（ｎ＝３）またはポリマー／脂質（ＴｒａｎｓＩＴ）単独（ｎ＝２）を静脈内注射し、インビボイメージングによって注射後の示されている時点で生物発光を測定した。ＬＵＣ：ルシフェラーゼ。Ｋａｔａｌｉｎ Ｋａｒｉｋｏの許可を得て（Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３（７）：８１５－８１７（２０１７））から導出されたデータ。 二次リンパ器官を標的とする、ｍＩＬ１５をコードするｍＲＮＡの毒性を伴わない高い有効性。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５）に、２００μｌ ＰＢＳ 中の４×１０５ ＣＴ２６－Ｂ２ＭＫＯ腫瘍細胞（表面に機能的ＭＨＣクラスＩを欠くＣＴ２６細胞）を静脈内注射した。４日後および７日後、全身アベイラビリティのために、ＲＮＡ－ＬＰＸによって二次リンパ器官（４０μｇ）または肝臓（３μｇ ｉ．ｖ．）のいずれかに送達されるｍＩＬ１５ ｍＲＮＡでマウスを処置した。対照として、同じ量の無関係なｍＲＮＡをコードするＬＵＣおよびＰＢＳを使用した。腫瘍接種の１２日後、肺を採取し、腫瘍結節を数えた。肝臓を標的とする（全身性）ｍＩＬ１５ ｍＲＮＡを投与されたすべてのマウスは、２回目の処置で死亡し、分析することができなかった（ｎ．ｄ．、未決定）。ｍＩＬ１５：マウスＩＬ１５受容体αに融合したマウスＩＬ１５。 生理学的機能に従って標的とされるＩＬ１２とＩＬ２の組合せは、腫瘍特異的Ｔ細胞療法および治療効果を増強する。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１１）に３×１０５のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種した。腫瘍接種の８日後、マウスを腫瘍サイズに従って層別化し、１０μｇの分化抗原チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２１８０－１８８）および１０μｇのＭＨＣクラスＩＩ拘束性ネオ抗原Ｂ１６＿Ｍ３０９を含むＲＮＡ－ＬＰＸベースのＴ細胞ワクチンｉ．ｖ．、または無関係なｍＲＮＡ（２０μｇの挿入物のないワクチン骨格）のいずれかを投与した。すべてのマウスに２００μｌ ＰＢＳ 中の２００μｇ（１００μｇでの連続処置）の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン６Ｅ１１、ｍＩｇＧ２Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を腹腔内投与した。マウスに、ＲＮＡ－ＬＰＸとして送達される（二次リンパ器官に送達）３μｇ（４回目の処置からは１μｇ）のｍＩＬ１２ ｍＲＮＡまたは無関係なｍＲＮＡを静脈内に同時注射した。およそ４８時間後、ｍＩＬ２－ｍＡｌｂをコードする１μｇのｍＲＮＡ、またはＴｒａｎｓＩＴを用いて製剤化した１μｇのｍＡｌｂ対照（全身アベイラビリティのために肝臓に送達）を静脈内注射した。処置スケジュールを週に１回、７週間繰り返した。マウスの生存率（Ａ）、ならびに抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびｍＩＬ１２をｍＡｌｂ－ｍＩＬ２、ｍＩＬ１２単独またはｍＡｌｂ－ｍＩＬ２単独と組み合わせたｍＲＮＡワクチンによる処置に応答して目の周りに白斑の徴候を示した代表的なマウス（Ｂ）を示す。 二次リンパ器官ではなく肝臓を標的とするｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は、ワクチンが誘導するＴ細胞応答を容易に増加させる。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、０日目と７日目にｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸワクチン接種（２０μｇ ｉｖ）および抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体（１００μｇ ｉｐ）で処置し、２日後にＴｒａｎｓＩＴ中で（ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２（ＴｒａｎｓＩＴ））またはリポプレックスとして（（ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２（ＲＮＡ－ＬＰＸ）））ｍＡＩｂ－ｍＩＬ２をコードする１μｇのｍＲＮＡを投与した。７日目および１４日目に、ｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリによって血液を分析した。一元配置分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｈＩＬ２をコードする構築物の検証。 Ａ ＥＬＩＳＡによるｈＩＬ２構築物のヒトＩＬ２受容体α（ＣＤ２５）への結合。プレート結合組換えヒトＣＤ２５を、ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７における３μｇのｈＩＬ２コードｍＲＮＡのリポフェクションからのｈＩＬ２含有上清と共にインキュベートし、結合タンパク質をＨＲＰ結合抗ヒト血清アルブミン抗体によって検出した。示されているデータは、ｎ＝２の技術的複製物の平均±ＳＤである。 Ｂ ｈＩＬ２をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のウェスタンブロット分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡでリポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、抗ｈＩＬ２抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用した。 Ｃ ｈＩＬ２構築物の生物学的活性を測定するＣＴＬＬ－２増殖アッセイ。ＣＤ２５ｈｉｇｈマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ－２を、ｈＩＬ２含有上清の段階希釈液と共に７２時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイを使用してＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。ｈＡｌｂをコードするｍＲＮＡでリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞の上清を陰性対照として使用した。示されているデータは、ｎ＝２の技術的複製物の平均±ＳＤである。ＲＬＵ＝相対発光単位。 Ｄ ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｈＩＬ２構築物の生物学的活性。ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、準最適濃度の抗ＣＤ３抗体およびｈＩＬ２含有上清の段階希釈液と共に４日間インキュベートした。ｈＡｌｂをコードするｍＲＮＡでリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞の上清を陰性対照として使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原非特異的増殖のｈＩＬ２を介した増強をフローサイトメトリによって測定した。１人の代表的なドナーからのデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４ソフトウェアを使用して計算した分裂細胞％の平均値として示す。エラーバー（ＳＤ）は実験内の変動を示す（３つの複製物）。 ｈＩＬ７をコードする構築物の検証。 Ａ ｍＲＮＡにコードされたｈＩＬ７構築物の発現。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を３μｇのｍＲＮＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ １μＬあたり４００ｎｇ ｍＲＮＡ複合体）でリポフェクトした。２０時間のインキュベーション後、無細胞上清中のｈＩＬ７レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。示されているデータは、ｎ＝２～３の複製物の平均±ＳＤである。 Ｂ ｈＩＬ７をコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清のウェスタンブロット分析。ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、示されているタンパク質をコードするｍＲＮＡでリポフェクトし、２４時間の発現後に上清を採取し、抗ｈＩＬ７抗体を用いたウェスタンブロット分析に使用した。 Ｃ ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｈＩＬ７構築物の生物学的活性。ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、準最適濃度の抗ＣＤ３抗体およびｈＩＬ７含有上清の段階希釈液と共に４日間インキュベートした。ｈＡｌｂをコードするｍＲＮＡでリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞の上清を陰性対照として含め、組換えｈＩＬ－７タンパク質を陽性対照として含めた。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原非特異的増殖のｈＩＬ７を介した増強をフローサイトメトリによって測定した。１人の代表的なドナーからのデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４ソフトウェアを使用して計算した分裂細胞％の平均値として示す。エラーバー（ＳＤ）は実験内の変動を示す（３つの複製物）。 活性タンパク質内のサイトカインおよびアルブミン部分のそれぞれの順序は、インビボでの安定性、薬物動態プロフィールまたは機能のいずれにも影響を及ぼさない。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群および時点あたりｎ＝３）に、１μｇのｈＡｌｂのＮ末端（ｈＩＬ２－ｈＡｌｂ）もしくはＣ末端（ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２）に融合したｈＩＬ２またはＴｒａｎｓＩＴ ｉ．ｖ．を用いて製剤化したｈＡｌｂをコードする対照ｍＲＮＡを静脈内注射した。 Ａ サイトカインレベルを、ｈＩＬ２シングルプレックスアッセイによって注射の６、２４、４８および７２時間後に血清中で測定した。 Ｂ 絶対Ｔリンパ球数を、フローサイトメトリによって注射の９６時間後に脾臓で測定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ．。 ｍＲＮＡワクチン接種とｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂの組合せによる腫瘍拒絶。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝１１）に、１００μｌのＰＢＳ中の５ｘ×１０５ ＣＴ２６－ＷＴ腫瘍細胞を皮下注射した。１０日後、マウスを、ｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸ（２０μｇ ｉ．ｖ．）、および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化し、静脈内注射した３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂまたはこの２つの組合せで処理した（肝臓標的化）。対照として、ｈＡｌｂ ＲＮＡを投与した。上のパネルに示すように、処置スケジュールを毎週繰り返した。 Ａ 個々のマウスの成長曲線を示す。 処置群の生存率パーセントを示す。 ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ－ｈＩＬ２とｈＩＬ７－ｈＡｌｂの組合せは、抗原非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答よりもワクチン誘導性の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強する。 実施例２１に記載されるＣＴ２６腫瘍担持マウスを、３回の連続処置のそれぞれ７日後（腫瘍接種後１７、２４および３１日目）の血液中のｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。 Ａ 最初のワクチン接種後の腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数（左）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのその割合（右）を示す。 Ｂ 経時的な各ワクチン接種後の腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示す。 Ｃ 経時的な各ワクチン接種後の腫瘍抗原非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示す。 Ｄ 最初の処置の７日後のｈＡｌｂ処置した対照動物の抗原特異的または非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数の中央値に対する倍数増加を示す。一元配置分散分析（Ａ）または二元配置分散分析（Ｂ）とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、および二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定（Ｃ、Ｄ）を使用して統計的有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ。 ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂは、経時的にＴ ｒｅｇ細胞レベルを制御する。 実施例２１に記載されるＣＴ２６腫瘍担持マウスを、３回の連続処置のそれぞれ７日後（腫瘍接種後１７、２４および３１日目）の血液中のＴｒｅｇ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。 Ａ 最初のワクチン接種後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の絶対数（左）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのその割合（右）を示す。 Ｂ 経時的な各ワクチン接種後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の絶対数。一元配置分散分析（Ａ）または二元配置分散分析（Ｂ）とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ。 ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂはどちらもＴｒｅｇ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大する。 実施例２１に記載し、実施例２２および２３で分析するＣＴ２６腫瘍担持マウスからのＴｒｅｇ細胞（Ｂ）に対する腫瘍抗原特異的（Ａ）または非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数の比率を示す。二元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して統計的有意性を決定した。平均±ｓ．ｅ．ｍ。
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。
「約」という用語はおよそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個々に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に必須の特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわちこの実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
以下において、本開示のすべての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。未定義の用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上、および最大約５０、約１００または約１５０までの、ペプチド結合によって互いに連結された連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１アミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
「治療用タンパク質」は、治療有効量で対象に提供された場合、対象の状態または病状に対してプラスのまたは有利な作用を及ぼす。一実施形態では、治療用タンパク質は治癒的または緩和的特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状の重症度を改善する、緩和する、和らげる、逆転させる、発症を遅延させる、または重症度を軽減するために投与され得る。治療用タンパク質は予防特性を有し、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「治療用タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチド全体を含み、治療的に活性なその断片を指すこともできる。それはまた、タンパク質の治療的に活性な変異体を含み得る。治療的に活性なタンパク質の例には、サイトカインが含まれるが、これに限定されない。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、例えばオープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくはアミノ酸配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、すべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、コンフォメーション変異体、アイソフォーム変異体および種ホモログ、特に細胞によって天然に発現されるものを含む。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最適な配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
「同一性パーセント」という用語は、最適なアラインメント後に得られる、比較する２つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を示すことが意図されており、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動のほかに、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ ＡｐｐＭａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８、または少なくとも９９％の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、当業者によって、例えば組換えＤＮＡ操作によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
一実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片または変異体は、好ましくは「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価の任意の断片または変異体に関する。サイトカインに関して、１つの特定の機能は、断片もしくは変異体が由来するアミノ酸配列によって、および／または断片もしくは変異体が由来するアミノ酸配列が結合する受容体（１つまたは複数）への結合によって示される１つ以上の免疫調節活性である。
指定されたアミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適したサイトカイン（例えばＩＬ２またはＩＬ７）は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在するまたは天然の配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
本開示において、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基のすべてまたは大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されることなく、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（１つまたは複数）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書ではまた、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることが企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体とみなされる。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３'非翻訳領域（３'－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ここで、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
一実施形態では、ＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを有し得る。修飾リボヌクレオチドの例には、限定されることなく、５－メチルシチジン、プソイドウリジンおよび／または１－メチルプソイドウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５'キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５'－三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５'キャップ類似体によって修飾され得る。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められる構造を指し、一般に独特の５'－５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、５'キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに付加され得る。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'－ＵＴＲ）に存在し得る。５'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の、５'末端に位置する。５'－ＵＴＲは５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。３'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終結コドンの下流の、３'末端に位置するが、「３'－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'－ＵＴＲはポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは３'－ポリ（Ａ）配列を含む。「ポリ（Ａ）配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関する。本開示によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約８０、または少なくとも約１００、および最大約５００、最大約４００、最大約３００、最大約２００、または最大約１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含む。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列の集合体に指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
本開示によれば、「ＲＮＡがコードする」という用語は、ＲＮＡが、標的組織の細胞内などの適切な環境に存在する場合、翻訳過程中にそれがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の集合体に指令できることを意味する。一実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。細胞は、コードされたペプチドもしくはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質内および／もしくは核内で）産生することができ、コードされたペプチドもしくはタンパク質を分泌することができ、またはそれを表面上で産生し得る。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
本明細書で使用される場合、「半減期」は、例えば分解および／または天然の機構によるクリアランスもしくは隔離のために、インビボでペプチドまたはタンパク質の血清または血漿濃度が５０％減少するのに要する時間を指す。本明細書での使用に適した延長ＰＫインターロイキン（ＩＬ）は、インビボで安定化しており、その半減期は、例えば血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＭＳＡ）への融合によって増加し、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する。半減期は、薬物動態分析などによる、それ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は当業者に明らかであり、例えば一般に、適切な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与する工程；前記対象から定期的な間隔で血液試料または他の試料を収集する工程；前記血液試料中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する工程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓなどの標準的なハンドブックおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）に提供されている。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，２ｎｄ Ｒｅｖ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８２）も参照されたい。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要である小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）のカテゴリである。サイトカインの放出は、それらの周りの細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤としてオートクリンシグナル伝達、パラクリンシグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれるが、一般にホルモンまたは成長因子は含まれない（用語が一部重複しているにもかかわらず）。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびマスト細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々な間質細胞を含む、幅広い細胞によって産生される。所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である；サイトカインは体液性免疫応答と細胞性免疫応答のバランスを調整し、特定の細胞集団の成熟、成長、および応答性を調節する。一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。
インターロイキン－２（ＩＬ２）は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ２の生物学的活性は、細胞膜にまたがる３つのポリペプチドサブユニットのマルチサブユニットＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒ）を介して媒介される：ｐ５５（ＩＬ２Ｒα、αサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても知られる）、ｐ７５（ＩＬ２Ｒβ、βサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても知られる）およびｐ６４（ＩＬ２Ｒγ、γサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても知られる）。ＩＬ２に対するＴ細胞応答は、（１）ＩＬ２の濃度、（２）細胞表面上のＩＬ２Ｒ分子の数、および（３）ＩＬ２が占有するＩＬ２Ｒの数（すなわちＩＬ２とＩＬ２Ｒの間の結合相互作用の親和性）を含む様々な因子に依存する（Ｓｍｉｔｈ，「Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｑｕａｎｔａｌ」Ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７６６：２６３－２７１，１９９５））。ＩＬ２：ＩＬ２Ｒ複合体はリガンド結合時に内在化され、様々な成分が異なる選別を受ける。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして投与された場合、ＩＬ２は急速な全身クリアランスを有する（半減期が１２．９分の初期クリアランス期、続いて半減期が８５分のより遅いクリアランス期）（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２００９－２０１７，１９９０）。
癌患者における全身性ＩＬ２投与の結果は理想からほど遠い。患者の１５～２０％は高用量のＩＬ２に客観的に応答するが、大多数は応答せず、多くが吐き気、錯乱、低血圧、および敗血症性ショックなどの重篤で生命にかかわる副作用を経験する。高用量のＩＬ２治療に関連する重篤な毒性は、主にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性に起因する。用量を減らして投与レジメンを調整することによって血清濃度を低下させる試みがなされており、毒性は低くなるが、そのような治療は有効性も低かった。
本開示によれば、特定の実施形態では、ＩＬ２は薬物動態修飾基に結合される。以下、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２」と称する、得られた分子は、遊離ＩＬ２と比較して延長された循環半減期を有する。延長ＰＫ ＩＬ２の延長された循環半減期は、インビボでの血清ＩＬ２濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的にＴ細胞を含む多くの種類の免疫細胞の活性化の増強につながる。その有利な薬物動態プロフィールのために、非修飾ＩＬ２と比較すると、延長ＰＫ ＩＬ２はより少ない頻度で、より長期間投与することができる。
本開示によれば、ＩＬ２（任意で延長ＰＫ ＩＬ２の一部として）は、天然に存在するＩＬ２またはその断片もしくは変異体であり得る。ＩＬ２はヒトＩＬ２であり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。一実施形態では、ＩＬ２は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ２またはＩＬ２断片もしくは変異体は、ＩＬ２受容体、特にＩＬ２受容体のαサブユニットに結合する。
特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２のＩＬ２部分は、ヒトＩＬ２である。他の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２のＩＬ２部分は、ヒトＩＬ２の断片または変異体である。
本明細書に記載される特定の実施形態では、ＩＬ２は異種ポリペプチド（すなわちＩＬ２ではないポリペプチド）に融合される。異種ポリペプチドは、ＩＬ２の循環半減期を増加させることができる。以下でさらに詳細に論じるように、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであり得る。
ＩＬ７は、骨髄および胸腺の間質細胞によって分泌される造血成長因子である。またＩＬ７は、ケラチノサイト、樹状細胞、肝細胞、ニューロン、および上皮細胞によっても産生されるが、正常なリンパ球からは産生されない。ＩＬ７は、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生に重要なサイトカインである。ＩＬ７サイトカインと肝細胞増殖因子は、プレプロＢ細胞増殖刺激因子として機能するヘテロ二量体を形成する。マウスでのノックアウト試験は、ＩＬ７がリンパ系細胞の生存に必須の役割を果たすことを示唆した。
ＩＬ７は、ＩＬ７受容体αと共通のγ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ７受容体に結合する。結合は、胸腺内でのＴ細胞の発生と末梢内での生存に重要なシグナルのカスケードをもたらす。ＩＬ７受容体が遺伝的に欠損しているノックアウトマウスは、胸腺萎縮、Ｔ細胞発生の二重陽性段階での停止、および重度のリンパ球減少を示す。マウスへのＩＬ７の投与は、胸腺から血中に移行したばかりのＴ細胞の増加、Ｂ細胞とＴ細胞の増加、およびシクロホスファミド投与後または骨髄移植後のＴ細胞の回復の増加をもたらす。
本開示によれば、特定の実施形態では、ＩＬ７は薬物動態修飾基に結合される。以下、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ７」と称する、得られた分子は、遊離ＩＬ７と比較して延長された循環半減期を有する。延長ＰＫ ＩＬ７の延長された循環半減期は、インビボでの血清ＩＬ７濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的にＴ細胞を含む多くの種類の免疫細胞の生存の増強につながる。その有利な薬物動態プロフィールのために、非修飾ＩＬ７と比較すると、延長ＰＫ ＩＬ７はより少ない頻度で、より長期間投与することができる。
本開示によれば、ＩＬ７は、天然に存在するＩＬ７またはその断片もしくは変異体であり得る。ＩＬ７はヒトＩＬ７であり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。一実施形態では、ＩＬ７は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ７またはＩＬ７断片もしくは変異体は、ＩＬ７受容体に結合する。
特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ７のＩＬ７部分は、ヒトＩＬ７である。他の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ７のＩＬ７部分は、ヒトＩＬ７の断片または変異体である。
本明細書に記載される特定の実施形態では、ＩＬ７は異種ポリペプチド（すなわちＩＬ７ではないポリペプチド）に融合される。異種ポリペプチドは、ＩＬ７の循環半減期を増加させることができる。以下でさらに詳細に論じるように、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであり得る。
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス、細菌、寄生虫、およびまた腫瘍細胞などのいくつかの病原体の存在に応答して、宿主細胞によって生成および放出されるシグナル伝達タンパク質の群である。典型的なシナリオでは、ウイルスに感染した細胞がインターフェロンを放出し、近くの細胞に抗ウイルス防御を高めさせる。
ＩＦＮβタンパク質は、線維芽細胞によって大量に産生される。それらは、主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。２種類のＩＦＮβ、すなわちＩＦＮβ１とＩＦＮβ３が記述されている。ＩＦＮβ１の天然型と組換え型は、抗ウイルス、抗菌、および抗癌特性を有する。インターフェロンβ１ａ（商品名：ＡｖｏｎｅｘおよびＲｅｂｉｆ）とインターフェロンβ１ｂ（商品名：Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ／Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ）が薬剤として使用されている。
本開示によれば、ＩＦＮ－βは、天然に存在するＩＦＮ－βまたはその断片もしくは変異体であり得る。ＩＦＮ－βはヒトＩＦＮ－βであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。一実施形態では、ＩＦＮ－βは、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列または配列番号３もしくは４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるサイトカイン、例えばＩＬ２またはＩＬ７などのインターロイキンは、循環半減期を増加させる延長ＰＫ基に融合させ得る。延長ＰＫ基の非限定的な例については以下で説明する。サイトカインまたはその変異体の循環半減期を増加させる他のＰＫ基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンドメイン（例えばマウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）である。
本明細書で使用される場合、「ＰＫ」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ基」は、生物学的に活性な分子に融合されるかまたは一緒に投与された場合、生物学的に活性な分子の循環半減期を増加させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。延長ＰＫ基の例には、血清アルブミン（例えばＨＳＡ）、ＦｃまたはＦｃ断片およびその変異体、トランスフェリンおよびその変異体、ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バインダー（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および同第２００７／０００３５４９号に開示されている）が含まれる。他の例示的な延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１；２２：８６８－８７６に開示されている。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ ＩＬ」は、延長ＰＫ基と組み合わせたインターロイキン（ＩＬ）部分を指す。一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬは、ＩＬ部分が延長ＰＫ基に連結または融合されている融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質は、ＩＬ２部分がＨＳＡと融合しているＨＳＡ／ＩＬ２融合物である。別の例示的な融合タンパク質は、ＩＬ７部分がＨＳＡと融合しているＨＳＡ／ＩＬ７融合物である。
特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、サイトカイン単独（すなわち延長ＰＫ基に融合されていないサイトカイン）と比較して増加する。特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、サイトカイン単独の血清半減期と比較して少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、または１０００％長い。特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、サイトカイン単独の血清半減期より少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍長い。特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミン、またはその断片、または血清アルブミンもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、そのすべてが「アルブミン」という用語に含まれる）を含む。本明細書に記載されるポリペプチドは、アルブミン（またはその断片もしくは変異体）に融合されてアルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００７００４８２８２号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）と、治療用タンパク質、特にＩＬ２またはＩＬ７（またはその断片もしくは変異体）などの少なくとも１分子のタンパク質との融合によって形成されるタンパク質を指す。アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンをコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合している核酸の翻訳によって生成され得る。治療用タンパク質およびアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」、または「部分」（例えば「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と称され得る。非常に好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療用タンパク質（治療用タンパク質の成熟形態を含むがこれに限定されない）および少なくとも１分子のアルブミン（アルブミンの成熟形態を含むがこれに限定されない）を含む。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、投与されたＲＮＡの標的器官の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞によってプロセシングされ、循環中に分泌される。ＲＮＡの発現に使用される宿主細胞の分泌経路で発生する新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合の形成、適切な折り畳み、炭水化物の付加とプロセシング（例えばＮ－結合型およびＯ－結合型グリコシル化など）、特異的タンパク質分解切断、および／または多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にそのＮ末端にシグナルペプチドを有する非プロセシング形態のＲＮＡによってコードされ、細胞による分泌後、好ましくは、特にシグナルペプチドが切断されたプロセシング形態で存在する。最も好ましい実施形態では、「プロセシングされた形態のアルブミン融合タンパク質」は、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指し、本明細書では「成熟アルブミン融合タンパク質」とも称される。
好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、典型的には、治療用タンパク質がインビボで投与され、血流に運ばれたときから、治療用タンパク質が分解され、血流から腎臓または肝臓などの器官へとクリアランスされ、最終的に治療用タンパク質が体内からクリアランスされるときまでの期間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して計算される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当技術分野で公知の一般的なアッセイによって容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば生物学的活性）を有する、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンもしくはその断片もしくは変異体、特にヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子の変異体を指す。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、雌鶏およびサケが含まれるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物由来であり得る。
特定の実施態様では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片もしくは変異体、例えば米国特許第５，８７６，９６９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、および国際公開第２０１１／０５１４７８９号に開示されているものである。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書では互換的に使用される。「アルブミンおよび「血清アルブミン」という用語はより広範であり、ヒト血清アルブミン（およびその断片と変異体）ならびに他の種由来のアルブミン（およびその断片と変異体）を包含する。
本明細書で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの断片は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の血漿安定性が非融合状態での血漿安定性と比較して延長または拡張されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミン断片を指す。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の全長を含んでもよく、または治療活性もしくは血漿安定性を安定化もしくは延長することができるその１つ以上の断片を含んでもよい。そのような断片は、１０個以上のアミノ酸の長さであってもよく、またはアルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０個以上の連続するアミノ酸を含んでもよく、またはアルブミンの特定のドメインの一部もしくは全部を含んでもよい。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにわたるＨＳＡの１つ以上の断片を使用し得る。好ましい実施形態では、ＨＳＡ断片は、ＨＳＡの成熟形態である。
一般的に言えば、アルブミン断片または変異体は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。
本開示によれば、アルブミンは、天然に存在するアルブミンまたはその断片もしくは変異体であり得る。アルブミンはヒトアルブミンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。一実施形態では、アルブミンは、配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミン、およびＣ末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてアルブミンを含み、Ｎ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端とＣ末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。一実施形態では、異なる治療用タンパク質は、同じまたは関連する疾患、障害、または状態を治療または予防するために有用であり得る。一実施形態では、異なる治療用タンパク質は両方ともサイトカインであり、好ましくは、異なる治療用タンパク質の一方はＩＬ２またはＩＬ７であり、他方はＩＦＮβなどのインターフェロンである。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端に融合したＩＦＮβおよびＣ末端に融合したＩＬ２を有する。
一実施形態では、治療用タンパク質（１つまたは複数）は、ペプチドリンカー（１つまたは複数）を介してアルブミンに結合される。融合部分の間のリンカーペプチドは、部分間のより大きな物理的分離を提供し、したがって、例えばその同族受容体への結合のための治療用タンパク質部分のアクセス可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかまたはより剛性であるように、アミノ酸で構成され得る。リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部または断片を指す。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば上部、中間および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはその変異体、部分もしくは断片の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわちヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えばＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに例えばヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、天然のＦｃおよびＦｃ変異体分子を包含する。本明細書に記載されているように、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子の天然のＦｃドメインとは異なるように任意のＦｃドメインを修飾し得ることは、当業者には理解されるであろう。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクタ機能（例えばＦｃγＲ結合）が低下している。
本明細書に記載されるポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、Ｆｃドメインもしくはその断片、またはＦｃドメインもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、そのすべてが「Ｆｃドメイン」という用語に含まれる）を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本開示での使用に適したＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から入手し得る。特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯動物種（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長動物種（例えばチンパンジー、マカク）を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。
さらに、Ｆｃドメイン（またはその断片もしくは変異体）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えばマウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）は、公的にアクセス可能な寄託物の形で入手可能である。特定のエフェクタ機能を欠き、および／または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なＦｃドメイン配列（例えばヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその断片もしくは変異体）は、当技術分野で広く認められている技術を使用してこれらの配列から得ることができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００５／０２８７１５３号、米国特許出願第２００７／０００３５４９号、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２００７／０２６９４２２号、米国特許出願第２０１０／０１１３３３９号、国際公開第２００９／０８３８０４号、および国際公開第２００９／１３３２０８号に記載されているものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１７６，２７８号および米国特許第８，１５８，５７９号に開示されているように、トランスフェリンである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を作製する方法もまた、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されている。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわちヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。
特定の態様では、本開示による使用に適した、延長ＰＫ ＩＬなどの延長ＰＫサイトカインは、１つ以上のペプチドリンカーを使用することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の線状アミノ酸配列中の２つ以上のドメイン（例えば延長ＰＫ部分とＩＬ２またはＩＬ７などのＩＬ部分）を接続するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、ＩＬ２部分をＨＳＡドメインに接続し得る。別の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、ＩＬ７部分をＨＳＡドメインに接続し得る。
例えばＩＬ２またはＩＬ７に延長ＰＫ基を融合するのに適したリンカーは、当技術分野で周知である。例示的なリンカーには、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、グリシン－プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン－アラニンポリペプチドリンカーが含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、すなわちグリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。
本開示による使用に適したペプチドおよびタンパク質抗原は、典型的には、免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を含む。ペプチドまたはタンパク質またはエピトープは、標的抗原、すなわちそれに対して免疫応答が惹起されるべき抗原に由来し得る。例えば、ペプチドもしくはタンパク質抗原またはペプチドもしくはタンパク質抗原内に含まれるエピトープは、標的抗原または標的抗原の断片もしくは変異体であり得る。
本開示に従って投与されるＲＮＡによってコードされるペプチドおよびタンパク質抗原、すなわちワクチン抗原は、好ましくは、ＲＮＡが投与される対象においてＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。前記刺激された、プライミングされたおよび／または拡大されたＴ細胞は、好ましくは標的抗原、特に疾患細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち疾患関連抗原に対して向けられる。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原、またはその断片もしくは変異体を含み得る。一実施形態では、そのような断片または変異体は、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「抗原の断片」または「抗原の変異体」という用語は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす作用物質を意味し、刺激、プライミングおよび／または拡大されたＴ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官によって提示された場合、抗原、すなわち疾患関連抗原を標的とする。したがって、本開示に従って投与されるＲＮＡによってコードされるワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る、疾患関連抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得る、または疾患関連抗原もしくはその断片と相同である抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る。本開示に従って投与されるＲＮＡによってコードされるワクチン抗原が、疾患関連抗原の断片または疾患関連抗原の断片に相同であるアミノ酸配列を含む場合、前記断片またはアミノ酸配列は、疾患関連抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープ、または疾患関連抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープと相同である配列を含み得る。したがって、本開示によれば、投与されるＲＮＡによってコードされる抗原は、疾患関連抗原の免疫原性断片、または疾患関連抗原の免疫原性断片と相同であるアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞を刺激、プライミング、および／または拡大することができる抗原の断片に関する。ワクチン抗原は（疾患関連抗原と同様に）、Ｔ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、抗原提示細胞などの細胞によって提示され得ることが好ましい。本開示に従って投与されるＲＮＡによってコードされるワクチン抗原は、組換え抗原であり得る。
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的作用の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的作用を発揮することを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化のために使用される抗原または抗原変異体の免疫学的作用または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列に結合するＴ細胞または参照アミノ酸配列を発現する細胞などの対象の免疫系に暴露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ作用を発揮する。
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞への分化を引き起こす過程を指す。
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の文脈で使用される。好ましくは、クローン拡大はリンパ球の分化をもたらす。
「抗原」という用語は、免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞によって提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのそのプロセシング産物は、一実施形態では、Ｔ細胞もしくはＢ細胞受容体によって、または抗体などの免疫グロブリン分子によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応し得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
「疾患関連抗原」という用語は、疾患に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して細胞性抗原特異的免疫応答および／または疾患に対する体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。したがって、疾患関連抗原またはそのエピトープは、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連し得るか、または癌、典型的には腫瘍に関連し得る。
「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。腫瘍抗原は、典型的には癌細胞によって選択的に発現され（例えば非癌細胞上よりも癌細胞においてより高いレベルで発現される）、一部の場合には、癌細胞によってのみ発現される。腫瘍抗原の例には、限定されることなく、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β‐カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ－１が含まれる。
「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。
「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含んでもよく、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約１０～約２５アミノ酸の長さであり得、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語には、Ｔ細胞エピトープが含まれる。
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方を表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」という用語または類似の用語は、特にＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。Ｔ細胞が抗原を発現する標的細胞を死滅させる場合、Ｔ細胞は抗原に特異的であるとみなされる。Ｔ細胞の特異性は、様々な標準的技術のいずれかを使用して、例えばクロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内で評価し得る。あるいは、リンホカイン（インターフェロンγなど）の合成を測定することができる。
一実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原であり、エピトープを含むペプチドもしくはタンパク質またはその断片（例えばエピトープ）は、腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、様々な癌で発現されることが一般的に公知の「標準」抗原であり得る。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、それまで免疫系によって認識されていなかった「ネオ抗原」であり得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。腫瘍抗原がネオ抗原である場合、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質は、好ましくは１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ネオ抗原のエピトープまたは断片を含む。
癌の変異は各個人によって異なる。したがって、新規エピトープ（ネオエピトープ）をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的な標的である。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡは、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達するために使用できる。脾臓に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、免疫原性エピトープまたは腫瘍エピトープなどの抗原のＲＮＡ発現に特に関係のある抗原提示細胞である。複数のエピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物における治療効果を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速な配列決定は、本明細書に記載のＲＮＡによってコードされ得る個別化ワクチンのための複数のエピトープを、例えばエピトープが任意にリンカーによって分離されている単一のポリペプチドとして提供し得る。本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０のエピトープをコードする。例示的な実施形態は、少なくとも５つのエピトープ（「ペンタトープ」と呼ばれる）をコードするＲＮＡおよび少なくとも１０のエピトープ（「デカトープ」と呼ばれる）をコードするＲＮＡを含む。
ペプチドおよびタンパク質抗原は、例えば５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、または５０アミノ酸を含む２～１００アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５０個を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１００個を超えるアミノ酸であり得る。
ペプチドまたはタンパク質抗原は、ペプチドまたはタンパク質に対する抗体およびＴ細胞応答を発生させる免疫系の能力を誘導または増加させることができる任意のペプチドまたはタンパク質であり得る。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載される他の治療薬（例えば延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡならびにエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ）と組み合わせて使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、抗原のＴ細胞受容体認識の大きさおよび質を調節する共刺激および阻害シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ２８結合を置き換えるＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子の間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９の間の相互作用である。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を全面的または部分的に低減する、阻害する、妨げるまたは調節する分子を指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害性シグナル伝達を妨害する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイントブロッカータンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片、または抗体模倣物、例えばＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を防げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３とそのリガンド、またはＴＩＭ－３とそのリガンドの間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント阻害剤はまた、分子（またはその変異体）自体の可溶性形態、例えば可溶性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１融合物の形態であってもよい。
「プログラムされた死１（ＰＤ－１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。ＰＤ－１は、インビボで以前に活性化されたＴ細胞上で主に発現され、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドに結合する。本明細書で使用される「ＰＤ－１」という用語は、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「プログラムされた死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞の活性化およびサイトカイン分泌を下方制御するＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの１つ（もう１つはＰＤ－Ｌ２）である。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することによって免疫系を下方制御する。本明細書で使用される「ＣＴＬＡ－４」という用語は、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）、ｈＣＴＬＡ－４の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＴＬＡ－４と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することによるリンパ球活性の阻害に関連する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を高め、ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞の機能を阻害する。本明細書で使用される「ＬＡＧ３」という用語は、ヒトＬＡＧ３（ｈＬＡＧ３）、ｈＬＡＧ３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）」は、ＴＨ１細胞応答の阻害によるリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、様々な種類の癌で上方制御されるガレクチン９である。本明細書で使用される「ＴＩＭ３」という用語は、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ３）、ｈＴＩＭ３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「Ｂ７ファミリー」は、未定義の受容体との阻害性リガンドを指す。Ｂ７ファミリーはＢ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４を包含し、どちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞で上方制御される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法での使用に適した免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、またはＴＩＭ３を標的とする抗体である。これらのリガンドと受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２：２５２－２６４，２０１２で総説されている。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する小分子である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＰＤ－１受容体とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を妨害する抗体は、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それによって免疫活性を増加させる。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＴＬＡ４を標的とし、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＬＡＧ３を標的とし、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の成分である。特定の実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーはＢ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４である。したがって、本開示の特定の実施形態は、Ｂ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。Ｂ７ファミリーは定義された受容体を有さないが、これらのリガンドは腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞で上方制御される。前臨床マウスモデルは、これらのリガンドの遮断が抗腫瘍免疫を増強できることを示している。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＩＭ３を標的とし、ガレクチン９とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
標的化が、例えばＴ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生の増加（例えばＩＦＮ－γ、ＩＬ２）に反映されるような抗腫瘍免疫応答などの免疫応答の刺激をもたらすことを条件として、他の免疫チェックポイント標的もまた、アンタゴニストまたは抗体によって標的とされ得ることが当業者に理解されるであろう。
本開示によれば、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むがこれらに限定されない様々な種に由来し得る。
本明細書に記載される抗体には、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体が含まれる。様々な実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体、より特定するとＩｇＧ１、カッパもしくはＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４、κ、λ）である。
抗体の「抗原結合部分」（もしくは単に「結合部分」）もしくは抗体の「抗原結合断片」（もしくは単に「結合断片」）という用語または類似の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ'）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）任意に合成リンカーによって連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号にさらに開示されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本開示によれば、本明細書に記載されるＲＮＡの投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは標的細胞によって翻訳されて、コードされたペプチドまたはタンパク質を生成する。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるＲＮＡ（例えば延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡならびにエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ）の特定の組織への標的化送達を含む。
一実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるＲＮＡが、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。
一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は脾臓の樹状細胞である。
「リンパ系」は循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
ＲＮＡは、カチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して注射可能なナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤によって脾臓に送達され得る。リポソームは、エタノール中の脂質の溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームとＲＮＡを混合することによって調製され得る。脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用し得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／もしくはＲＮＡ発現は起こらないか、または本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用し得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含む粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡの間の静電相互作用は、ＲＮＡリポプレックス粒子の複合体化と自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質とＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成し得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電したＲＮＡを脂質マトリックスに結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭基は、典型的には正の電荷を有する。カチオン性脂質の例には、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）－ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。
ＲＮＡリポプレックス粒子の正電荷と負電荷の全体的な比率および物理的安定性を調整するためにさらなる脂質を組み込んでもよい。特定の実施形態では、さらなる脂質は中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例には、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、さらなる脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロールおよび／またはＤＯＰＣである。
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。
本明細書に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する電荷とＲＮＡに存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。
生理的ｐＨでの本明細書に記載の脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、好ましくは、正電荷と負電荷の電荷比が約１．９：２～約１：２などの正味負電荷を有する。特定の実施形態では、生理的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷と負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。
ＲＮＡ送達システムは、肝臓への固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性のナノ粒子、特にリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲートの親油性リガンドなどの脂質ナノ粒子に関係する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質またはコレステロールコンジュゲート）によって引き起こされる。
肝臓へのＲＮＡのインビボ送達のために、薬物送達システムを使用して、その分解を防止することによってＲＮＡを肝臓に輸送し得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）被覆表面とｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルは、ナノミセルが生理的条件下でＲＮＡの卓越したインビボ安定性を提供するため、有用なシステムである。さらに、密なＰＥＧパリセードからなるポリプレックスナノミセル表面によって提供されるステルス特性は、宿主の免疫防御を有効に回避する。
本明細書に記載されるＲＮＡ、ＲＮＡ粒子およびさらなる作用物質、例えば免疫チェックポイント阻害剤は、治療的または予防的処置のための医薬組成物または薬剤中で投与されてもよく、任意の適切な医薬組成物の形態で投与されてもよい。
「医薬組成物」という用語は、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に、治療上有効な作用物質を含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を軽減するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。本開示の文脈において、医薬組成物は、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子および／または本明細書に記載のさらなる作用物質を含む。
本開示の医薬組成物は、好ましくは１つ以上のアジュバントを含むか、または１つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例には、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインが含まれる。ケモカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントには、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドが含まれる。
本開示による医薬組成物は、一般に「薬学的に有効な量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含み得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例には、限定されることなく、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が含まれる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする作用物質に関する。さらに、「希釈剤」という用語には、流体、液体もしくは固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上が含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロールおよび水が含まれる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体物質には、限定されることなく、滅菌水、リンガー液、乳酸リンガー液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
医薬用途のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準製薬法に関して選択することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、胃腸管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与を含み得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈注射などによる、胃腸管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。別の好ましい実施形態では、全身投与は静脈内投与による。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物（例えば延長ＰＫインターロイキンをコードするＲＮＡ（例えば延長ＰＫ ＩＬ２をコードするＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードするＲＮＡ）、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡおよび任意に免疫チェックポイント阻害剤）を同じ患者に投与する工程を意味する。延長ＰＫインターロイキンをコードするＲＮＡとエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。投与が連続的に行われる場合、延長ＰＫインターロイキンをコードするＲＮＡは、エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡの投与の前または後に投与され得る。投与が同時に行われる場合、延長ＰＫインターロイキンをコードするＲＮＡとエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、同じ組成物内で投与される必要はない。延長ＰＫインターロイキンをコードするＲＮＡおよびエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは１回以上投与されてもよく、各成分の投与回数は同じであっても異なっていてもよい。さらに、延長ＰＫインターロイキンをコードするＲＮＡおよびエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、同じ部位に投与される必要はない。
本明細書に記載されるＲＮＡ、ＲＮＡ粒子およびさらなる作用物質、例えば免疫チェックポイント阻害剤は、様々な疾患、特に対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質を前記対象に提供することが治療効果または予防効果をもたらす疾患の治療的または予防的処置に使用され得る。例えば、ウイルスに由来する抗原またはエピトープを提供することは、前記ウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の治療において有用であり得る。腫瘍抗原またはエピトープを提供することは、癌細胞が前記腫瘍抗原を発現する癌疾患の治療において有用であり得る。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように対象にＲＮＡを投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するための方法に関する。例示的な実施形態では、免疫応答は癌に対するものである。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、苦痛、社会問題、もしくは死を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型のバリエーションを含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリとみなされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした、対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは除去するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、ここで、予防は、疾患、状態または障害と闘う目的での個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長（増加）させる任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を除去し、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体における症状の頻度もしくは重症度を減少させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的治療」または「防止的治療」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的治療」または「防止的治療」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患もしくは障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患もしくは障害を有していてもよくまたは有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
本開示の一実施形態では、目的は、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。
エピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを含む医薬組成物を対象に投与して、治療的であり得るまたは部分的もしくは完全に保護的であり得る、対象における前記エピトープを含む抗原に対する免疫応答を惹起し得る。当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫することによって疾患に対する免疫防御反応が生じるという事実に基づくことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置において有用である。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。細胞性免疫応答には、限定されることなく、抗原を発現し、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子による抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答が含まれる。細胞応答はＴリンパ球に関連し、Ｔリンパ球は、免疫応答を制御することによって中心的な役割を果たすヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）、または感染した細胞もしくは癌細胞におけるアポトーシスを誘導するキラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＣＴＬとも称される）として分類され得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物を投与することは、１つ以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激を含む。特定の実施形態では、腫瘍抗原はクラスＩ ＭＨＣ分子と共に提示される。
本開示は、防御的、防止的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を企図する。本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、特定の抗原に対する免疫応答が誘導前に存在しなかったことを示し得るか、または誘導前に特定の抗原に対する基礎レベルの免疫応答があり、これが誘導後に増強されたことを示し得る。したがって、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」には、「免疫応答を増強する（または増強すること）」が含まれる。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の治療に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫または抗原ワクチン接種を含む。
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療的または予防的理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する工程を表す。
一実施形態では、本開示は、脾臓組織を標的とする、本明細書に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子などのＲＮＡ製剤が投与される実施形態を想定する。ＲＮＡは、例えば本明細書に記載されるような、例えばエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする。ＲＮＡは、樹状細胞などの脾臓内の抗原提示細胞によって取り込まれ、ペプチドまたはタンパク質を発現する。抗原提示細胞による任意のプロセシングおよび提示に続いて、エピトープに対する免疫応答が生じ、エピトープまたはエピトープを含む抗原が関与する疾患の予防的および／または治療的処置がもたらされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡによって誘導される免疫応答は、樹状細胞および／またはマクロファージなどの抗原提示細胞による抗原またはエピトープなどのその断片の提示、ならびにこの提示による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を含む。例えば、ＲＮＡまたはそのプロセシング産物によってコードされるペプチドまたはタンパク質は、抗原提示細胞上に発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示され得る。次に、ＭＨＣペプチド複合体はＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞によって認識され、それらの活性化をもたらすことができる。
したがって、本開示は、抗原が関与する疾患、好ましくは癌疾患の予防的および／または治療的処置に使用するための、本明細書に記載されるＲＮＡに関する。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって生成される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内の外来病原体を非特異的に飲み込み、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化的攻撃によって死滅させる。分解されたタンパク質からのペプチドは、Ｔ細胞によって認識され得るマクロファージ細胞表面に表示され、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化と免疫応答のさらなる刺激をもたらす。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初は未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用と低いＴ細胞活性化能を特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体の周囲環境を絶えずサンプリングしている。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、タンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用して細胞表面でそれらの断片を提示する。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化の共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここでそれらは抗原提示細胞として機能し、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞、ならびに非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってＢ細胞も活性化する。したがって、樹状細胞はＴ細胞またはＢ細胞関連の免疫応答を積極的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面で）少なくとも１つの抗原または抗原性断片を表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を生成する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が含まれる。
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
「抗原が関与する疾患」または「エピトープが関与する疾患」という用語は、抗原またはエピトープが関係する任意の疾患、例えば抗原またはエピトープの存在を特徴とする疾患を指す。抗原またはエピトープが関与する疾患は、感染症、または癌疾患もしくは単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり得、エピトープはそのような抗原に由来し得る。
「感染症」という用語は、個体から個体へ、または生物から生物へ伝染する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる（例えば普通の風邪）任意の疾患を指す。感染症は当技術分野で公知であり、例えばウイルス性疾患、細菌性疾患、または寄生虫性疾患が含まれ、これらの疾患はそれぞれウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる。これに関して、感染症は、例えば肝炎、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ、およびインフルエンザであり得る。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
癌治療における併用戦略は、結果として生じる相乗効果のために望ましい場合があり、これは単剤療法アプローチの影響よりもかなり強力であり得る。一実施形態では、医薬組成物は免疫療法剤と共に投与される。本明細書で使用される場合、「免疫療法剤」は、特定の免疫応答および／または免疫エフェクタ機能（１つまたは複数）の活性化に関与し得る任意の作用物質に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を企図する。理論に拘束されることを望むものではないが、抗体は、アポトーシスを誘導する、シグナル伝達経路の成分をブロックする、または腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、様々な機構を通して癌細胞に対する治療効果を達成することができる。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して細胞死を誘導し得るか、または補体タンパク質に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られる直接的な細胞傷害性をもたらし得る。本開示と組み合わせて使用し得る抗癌抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）の非限定的な例には、アバゴボマブ（ＣＡ－１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ－００９）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ－７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ １９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、クローディキシマブ（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ－１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンανβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ－β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ－１）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬΙβ）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ－１）、イゴボマ（ＣＡ－１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ １５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナマツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ－Ｒ ａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ－１２５）、オキセルマブ（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（ＭＵＣ１）、ペルツズマ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（α－フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ティガツズマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＴＮＸ－６５０（ＩＬ１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４－１ ＢＢ）、ボロキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ １６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）が含まれる。
別の態様では、本発明は、対象の標的器官または標的組織にサイトカインを送達する方法であって、前記標的器官または組織へのＲＮＡの選択的な送達のための製剤中でサイトカインをコードするＲＮＡを対象に投与することを含む方法を提供する。サイトカインは、任意のサイトカイン、特にサイトカイン断片および変異体を含む、ならびにまた、本明細書に記載されるもののような延長ＰＫサイトカイン、特に延長ＰＫインターロイキンなどのサイトカイン、サイトカイン断片およびサイトカイン変異体の融合タンパク質を含む、任意の治療上有用なサイトカインであり得る。
一実施形態では、標的器官はリンパ系、特に二次リンパ系器官、より具体的には脾臓であり、標的組織はリンパ系の組織、特に二次リンパ系器官の組織、より具体的には脾臓組織である。そのような標的組織へのサイトカインの送達は、特に、この器官または組織におけるサイトカインの存在が望ましい（例えば免疫応答を誘導するために、特にサイトカインがＴ細胞プライミング中に必要とされる場合、または常在免疫細胞の活性化のために）が、サイトカインが全身的に、特に有意の量で存在することは望ましくない（例えばサイトカインが全身毒性を有するため）場合に好ましい。
したがって、別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に、
ａ．サイトカインをコードするＲＮＡおよび
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含み、サイトカインをコードするＲＮＡおよびエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡがリンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓に送達される、方法を提供する。
一実施形態では、サイトカインをコードするＲＮＡおよびエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、リンパ系を標的とするための（共通または別個の）製剤、特に二次リンパ器官を標的とするための製剤、より具体的には脾臓を標的とするための製剤中で投与される。そのような製剤は、本明細書で上記に記載されている。適切なサイトカインの例には、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ－α、またはＩＦＮ－β、その断片および変異体、ならびに本明細書に記載されるもののような延長ＰＫサイトカインなどの、これらのサイトカイン、断片および変異体の融合タンパク質が含まれる。適切なサイトカインの特に好ましい例は、Ｔ細胞プライミングに関与するサイトカインである。
対象の標的器官または標的組織にサイトカインを送達する方法の別の実施形態では、標的器官は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。そのような標的組織へのサイトカインの送達は、特に、この器官もしくは組織におけるサイトカインの存在が望ましい場合、および／または大量のサイトカインを発現することが望ましい場合、および／またはサイトカインの全身的な存在、特に有意の量での存在が望ましいかもしくは必要とされる場合に好ましい。
一実施形態では、サイトカインをコードするＲＮＡは、肝臓を標的とするための製剤中で投与される。そのような製剤は、本明細書で上記に記載されている。適切なサイトカインの例には、ＩＬ２またはＩＬ７、その断片および変異体、ならびに本明細書に記載されるもののような延長ＰＫサイトカインなどの、これらのサイトカイン、断片および変異体の融合タンパク質が含まれる。適切なサイトカインの特に好ましい例は、Ｔ細胞の増殖および／または維持に関与するサイトカインである。
本開示はまた、１つ以上のサイトカインを送達する方法を含み、この方法では、サイトカインは対象の第１の標的器官または標的組織に送達され、これは、前記第１の標的器官または組織へのＲＮＡの選択的送達のための製剤中でサイトカインをコードするＲＮＡを対象に投与することを含み、および同じまたは異なるサイトカインは、対象の第２の標的器官または標的組織に送達され、これは、前記第２の標的器官または組織へのＲＮＡの選択的送達のための製剤中でサイトカインをコードするＲＮＡを対象に投与することを含む。一実施形態では、第１の標的器官はリンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓であり、第１の標的組織はリンパ系の組織、特に二次リンパ器官の組織、より具体的には脾臓組織であり、第２の標的器官は肝臓であり、第２の標的組織は肝臓組織である。サイトカインを第１の標的器官または標的組織に送達するための投与およびサイトカインを第２の標的器官または標的組織に送達するための投与は、同時、本質的に同時、または連続的であり得る。リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓、およびリンパ系の組織、特に二次リンパ器官の組織、より具体的には脾臓組織の選択的標的化のためのサイトカイン、ならびに肝臓および肝臓組織の選択的標的化のためのサイトカインは、上記のとおりである。１つ以上のサイトカインを異なる標的器官または組織に送達する方法は、リンパ系におけるＴ細胞プライミングに関与する第１のサイトカイン、ならびに全身的にＴ細胞の増殖および／または維持に関与する第２のサイトカインを提供し得る。１つ以上のサイトカインを異なる標的器官または組織に送達する方法はまた、上記のように、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡの投与を含み得る。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関するすべての記述は、申請者が入手できる情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さについての承認を構成しない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の機器、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書で説明され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲が与えられるべきである。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む方法。
２． 前記延長ＰＫ ＩＬ２が融合タンパク質を含む、１．に記載の方法。
３． 前記融合タンパク質が、ＩＬ２部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、２．に記載の方法。
４． 前記延長ＰＫ ＩＬ７が融合タンパク質を含む、１．～３．のいずれか一つに記載の方法。
５． 前記融合タンパク質が、ＩＬ７部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、４．に記載の方法。
６． 前記血清アルブミンがマウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む、３．または５．に記載の方法。
７． 前記免疫グロブリン断片が免疫グロブリンＦｃドメインを含む、３．または５．に記載の方法。
８． 前記対象に、
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することをさらに含む、１．～７．のいずれか一つに記載の方法。
９． 前記免疫チェックポイント阻害剤が、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする、８．に記載の方法。
１０． 前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体または抗体断片である、８．または９．に記載の方法。
１１． 前記抗体または抗体断片がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする、１０．に記載の方法。
１２． 延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ、前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ、ならびに任意で前記免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する、１．～１１．のいずれか一つに記載の方法。
１３． 前記対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む、８．～１２．のいずれか一つに記載の方法。
１４． 前記対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む、８．～１２．のいずれか一つに記載の方法。
１５． 前記対象に、
ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む、８．～１４．のいずれか一つに記載の方法。
１６． 前記治療が、前記抗原に特異的なＣＤ１２７陽性Ｔ細胞の数を増加させる、１．～１５．のいずれか一つに記載の方法。
１７． 前記治療が短命なエフェクタ細胞の数を減少させる、１．～１６．のいずれか一つに記載の方法。
１８． 前記治療が、制御性Ｔ細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞の比率を増加させる、１．～１７．のいずれか一つに記載の方法。
１９． 対象における癌を治療または予防するための方法であって、前記抗原が腫瘍関連抗原である、１．～１８．のいずれか一つに記載の方法。
２０． 腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を投与しない、１９．に記載の方法。
２１． 対象における癌を治療または予防するための方法であって、前記対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む方法。
２２． 前記癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される、１９．～２１．のいずれか一つに記載の方法。
２３． ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を含む医薬製剤。
２４． 前記延長ＰＫ ＩＬ２が融合タンパク質を含む、２３．に記載の医薬製剤。
２５． 前記融合タンパク質が、ＩＬ２部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、２４．に記載の医薬製剤。
２６． 前記延長ＰＫ ＩＬ７が融合タンパク質を含む、２３．～２５．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
２７． 前記融合タンパク質が、ＩＬ７部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、２６．に記載の医薬製剤。
２８． 前記血清アルブミンがマウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む、２５．または２７．に記載の医薬製剤。
２９． 前記免疫グロブリン断片が免疫グロブリンＦｃドメインを含む、２５．または２７．に記載の医薬製剤。
３０． ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
をさらに含む、２３．～２９．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
３１． 前記免疫チェックポイント阻害剤が、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする、３０．に記載の医薬製剤。
３２． 前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体または抗体断片である、３０．または３１．に記載の医薬製剤。
３３． 前記抗体または抗体断片がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする、３２．に記載の医薬製剤。
３４． ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を含む、３０．～３３．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
３５． ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を含む、３０．～３４．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
３６． キットである、２３．～３５．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
３７． 各ＲＮＡを別々の容器に含む、３６．に記載の医薬製剤。
３８． 前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記ＲＮＡを含まない容器内にある、３６．または３７．に記載の医薬製剤。
３９． 癌を治療または予防するための前記医薬製剤の使用説明書をさらに含み、前記抗原が腫瘍関連抗原である、３６．～３８．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
４０． 前記ＲＮＡを含む医薬組成物である、２３．～３５．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
４１． 前記医薬組成物が、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、４０．に記載の医薬製剤。
４２． 前記ＲＮＡが、液体形態、固体形態、またはそれらの組合せから選択される形態で存在する、２３．～４１．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
４３． 前記固体形態が凍結形態または脱水形態である、４２．に記載の医薬製剤。
４４． 前記脱水形態が凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である、４３．に記載の医薬製剤。
４５． 医薬用途のための、２３．～４４．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
４６． 前記医薬用途が、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む、４５．に記載の医薬製剤。
４７． 前記抗原が腫瘍関連抗原である、対象における癌を治療または予防するための方法で使用するための、２３．～４６．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
４８． 前記癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される、３９．および４２～４７．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
４９． 腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を含まない、２３．～４８．のいずれか一つに記載の医薬製剤。
５０． 対象において免疫応答を誘導するための方法で使用するためのＲＮＡであって、前記方法が、前記対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む、ＲＮＡ。
５１． 前記延長ＰＫ ＩＬ２が融合タンパク質を含む、５０．に記載のＲＮＡ。
５２． 前記融合タンパク質が、ＩＬ２部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、５１．に記載のＲＮＡ。
５３． 前記延長ＰＫ ＩＬ７が融合タンパク質を含む、５０．～５２．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
５４． 前記融合タンパク質が、ＩＬ７部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、５３．に記載のＲＮＡ。
５５． 前記血清アルブミンがマウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む、５２．または５４．に記載のＲＮＡ。
５６． 前記免疫グロブリン断片が免疫グロブリンＦｃドメインを含む、５２．または５４．に記載のＲＮＡ。
５７． 前記方法が、前記対象に、
ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
を投与することをさらに含む、５０．～５６．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
５８． 前記免疫チェックポイント阻害剤が、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする、５７．に記載のＲＮＡ。
５９． 前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体または抗体断片である、５７．または５８．に記載のＲＮＡ。
６０． 前記抗体または抗体断片がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする、５９．に記載のＲＮＡ。
６１． 延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび／または延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ、前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ、ならびに任意で前記免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する、５０．～６０．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６２． 前記方法が、前記対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む、５７．～６１．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６３． 前記方法が、前記対象に、
ａ．延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡおよび任意で延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む、５７．～６１．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６４． 前記方法が、前記対象に、
ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｃ．前記免疫チェックポイント阻害剤
を投与することを含む、５７．～６３．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６５． 前記治療が、前記抗原に特異的なＣＤ１２７陽性Ｔ細胞の数を増加させる、５０．～６４．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６６． 前記治療が短命なエフェクタ細胞の数を減少させる、５０．～６５．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６７． 前記治療が、制御性Ｔ細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞の比率を増加させる、５０．～６６．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６８． 前記方法が、対象における癌を治療または予防するための方法であり、前記抗原が腫瘍関連抗原である、５０．～６７．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
６９． 腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を投与しない、６８．に記載のＲＮＡ。
７０． 対象に、
ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび／または延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
を投与することを含む、前記対象における癌を治療または予防するための方法で使用するためのＲＮＡ。
７１． 前記癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される、６８．～７０．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
７２． 前記方法で投与される前記ＲＮＡの１つ以上であるか、またはそれを含む、５０．～７１．のいずれか一つに記載のＲＮＡ。
７３． 延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ、延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ、および前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードする前記ＲＮＡからなる群より選択される１つ以上であるか、またはそれを含む、７２．に記載のＲＮＡ。
７４． 延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡであるか、またはそれを含む、７２．または７３．に記載のＲＮＡ。
７５． 延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡであるか、またはそれを含む、７２．または７３．に記載のＲＮＡ。
７６． 前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードする前記ＲＮＡであるか、またはそれを含む、７２．または７３．に記載のＲＮＡ。
７７． ａ．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび／もしくは延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；ならびに
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ
であるか、またはそれを含む、７２．または７３．に記載のＲＮＡ。
７８． ａ－１．延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ；
ａ－２．延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ；および
ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ
であるか、またはそれを含む、７２．または７３．に記載のＲＮＡ。

実施例１：構築物の設計および検証
構築物の設計およびｍＲＮＡの作製
ｍＲＮＡをコードするサイトカインのインビトロ転写は、ｐＳＴ４－Ｔ７－ＧＧ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０プラスミド骨格および派生ＤＮＡ構築物に基づいた。これらのプラスミド構築物は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５'リーダー配列、３'ＦＩエレメント（Ｆはスプリットのアミノ末端エンハンサーの１３６ヌクレオチド長の３'－ＵＴＲ断片であるｍＲＮＡであり、Ｉはミトコンドリアにコードされた１２Ｓ ＲＮＡの１４２ヌクレオチド長の断片であり、両方ともヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）において同定されている；国際公開第２０１７／０６０３１４号）および１００ヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部と、７０ヌクレオチドの後にリンカーを含む。サイトカインおよびＡｌｂコード配列はハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に由来し、得られたアミノ酸配列に変化は導入されなかった（ｍＩＬ２：ＮＰ＿０３２３９２．１；ｍＩＦＮβ：ＮＰ＿０３４６４０．１；ｍＩＬ７：ＮＰ＿０３２３９７．１；ｍＩＬ１５Ｒα：ＮＰ＿０３２３８４．１；ｍＩＬ１５：ＮＰ＿０３２３８３．１）。コードされるタンパク質は、それぞれのタンパク質の天然シグナルペプチドであるＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）を備える。融合タンパク質の場合、Ｎ末端部分のＳＰのみが維持され、さらなる部分については成熟部分（ＳＰのないタンパク質）のみがコードされた。終止コドンは、ほとんどのＣ末端部分についてのみ維持された。サイトカインおよびＡｌｂ融合構築物の異なるタンパク質部分は、グリシンおよびセリン残基をコードする３０ヌクレオチド長のリンカー配列によって分離された。マウス（ｍ）ＩＬ１５ｓｕｓｈｉの場合は、ｍＩＬ１５Ｒαの最初の１０３アミノ酸（ＳＰを含む）のコード配列とｍＩＬ１５の成熟ドメインの間の融合タンパク質を使用した。この融合タンパク質では、ｍＩＬ１５Ｒα部分がＮ末端を規定し、グリシンおよびセリン残基をコードする６０ヌクレオチドのリンカーによって分離されている。分泌型ナノルシフェラーゼ（ｓｅｃ－ｎＬＵＣ）の配列を購入し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、上記のプラスミド骨格にサブクローニングした。ｓｅｃ－ｎＬＵＣとｍＡｌｂの融合のために、ｓｅｃ－ｎＬＵＣの終止コドンを欠失させ、ｍＡｌｂの成熟ドメインを、グリシンおよびセリン残基をコードする３０ヌクレオチド長のリンカー配列によって分離されたｓｅｃ－ｎＬＵＣのＣ末端に融合した。ｍＲＮＡは、通常ヌクレオシドウリジンを１－メチルプソイドウリジンに置き換えて、Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１５７７－８７（２００７））に記載されているようにインビトロ転写によって生成した。得られたｍＲＮＡはキャップ１構造を備えており、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）分子はセルロース精製によって枯渇させた。精製したｍＲＮＡをＨ２Ｏに溶出させ、さらに使用するまで－８０℃で保存した。記載されているすべてのｍＲＮＡ構築物のインビトロ転写は、ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＲＮＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＧｍｂＨによって行われた。
構築物の検証
生成したｍＲＮＡからのサイトカイン発現を、ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞へのｍＲＮＡのリポフェクション、およびその後の上清の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）分析によって制御した（図１Ａ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｍＲＮＡを無菌のＲＮアーゼ不含条件下で製剤化した。ここで、１２５または２５０ｎｇ ｍＲＮＡ／μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを複合体化し、約８０％の集密度のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞のリポフェクションのために１ｃｍ２の培養皿ごとに使用した。上清を無菌条件下で２４時間の発現後に収集し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。それぞれの細胞培養上清中のサイトカインの存在を、それぞれのサイトカインに特異的な市販のＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。ＥＬＩＳＡ分析を製造者のプロトコルに従って実施した。タンパク質が天然の折り畳み状態のままである限り、ＥＬＩＳＡ抗体のエピトープはしばしば融合タンパク質中でアクセスできないように見えるため、変性条件下でタンパク質濃度を半定量的に決定するために同じ上清をウェスタンブロット分析に使用した（図１Ｂ、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ）。したがって、適切なＶｉｖａＳｐｉｎカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ ＡＧ）を使用して総タンパク質を濃縮し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＴＬソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色での試料の分離後に、著明なバンドの定量化によって濃度を評価した。ウェスタンブロット法のために、均一なタンパク質の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、セミドライまたはウェットブロットプロトコルでニトロセルロース膜に転写した。ブロットした後、ニトロセルロース膜をブロックし（１×ＰＢＳ－Ｔ中の５％脱脂粉乳）、続いて適切な希釈の一次抗体（抗ｍＩＬ２：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（ＢＬＤ－５０３７０１）、抗ｍＩＬ１５：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＡＢ４４７－ＳＰ）、抗ｍＩＦＮβ：Ａｂｃａｍ（ａｂ１５１６０５）；抗ｍＩＬ７：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＰＡ５－４６９４４））および二次抗体と共にインキュベートした。二次抗体のインキュベーションの前と後に膜を洗浄した（１×ＰＢＳ－Ｔ）。Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＴｒｉｄｅｎｔ ｆｅｍｔｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ）の添加後に発生した化学発光シグナルを、ＬＡＳ ４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して記録した。発現されたサイトカインの生物学的活性を適切な活性アッセイによって試験した。ｍＩＬ２およびｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉの活性を、マウスＣＴＬＬ－２細胞（マウスＣ５７ｂ１／６ Ｔ細胞、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のサイトカイン依存性増殖を分析することによってアッセイした（図１Ｃ、図２Ｃ）。ＣＴＬＬ－２増殖を、それぞれのサイトカインｍＲＮＡの発現後またはＡｌｂのみをコードするｍＲＮＡの発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下でのＣＴＬＬ－２培養時に、２つのサイトカインのいずれかに依存して観測した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、７２時間のそれぞれの処理後に細胞の量を測定した。組換えヒト（ｈ）ＩＬ２およびＩＬ１５ｓｕｓｈｉタンパク質を対照として使用した。ｍＩＬ７をコードするｍＲＮＡの発現後に採取したＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下での培養時に、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した抗ＣＤ３活性化ＰＢＭＣ集団においてＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導する能力を分析することによって、ｍＩＬ７をコードするｍＲＮＡの生物学的活性を試験した（図３Ｃ）。Ｔ細胞の増殖を、抗ＣＤ４－ＰＥおよび抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７染色後にフローサイトメトリを使用したＣＦＳＥモニタリングによって分析した。組換えｍＩＬ７タンパク質を対照として使用した。マウスのＩＦＮβ部分を有するｍＲＮＡの生物学的活性を、マウス大腸癌細胞（ＣＴ２６）でＭＨＣクラスＩ発現を上方制御する、それぞれ発現されたタンパク質産物の能力を調へることによって確認した（図４Ｃ）。ｍＩＦＮβをコードするｍＲＮＡの発現後に採取したＨＥＫ２９３Ｔ－１７上清の存在下でＣＴ２６細胞を培養した。組換えｍＩＦＮβを対照として使用した。処理の前後のＣＴ２６細胞上のＭＨＣクラスＩの表面レベルを、ＦＩＴＣ結合Ｈ２－Ｋｂ抗体によるＭＨＣクラスＩ染色およびその後のフローサイトメトリ分析によって評価した。製造者のプロトコルに従ってＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｓｅｃ－ｎＬＵＣをコードするｍＲＮＡの２４時間の発現後に、ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７の上清中でｓｅｃ－ｎＬＵＣの発現および得られた遺伝子産物のルシフェラーゼ活性を測定した（図４Ｄ）。ｍＲＮＡの非存在下でリポフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ－１７（モック）の上清を対照として使用した。
実施例２：アルブミンに融合し、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ上にコードされたサイトカインの全身アベイラビリティ。
アルブミン融合サイトカインと比較した未改変サイトカインの全身バイオアベイラビリティの強度と持続時間を、血液循環中のサイトカインレベルを測定することによって検討した。雌性Ｃ５７ＢＬ／６（９週齢）（群および時点あたりｎ＝３匹のマウス）をＥｎｖｉｇｏから購入し、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｒｕｓ）を用いて製剤化した３μｇの未改変またはｍＡｌｂ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。マウスに、ｍＩＬ２もしくはｍＡｌｂに融合したｍＩＬ２（ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２）、マウスインターフェロンβ（ｍＩＦＮβ）もしくはｍＡｌｂに融合したｍＩＦＮβ（ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ）、ｍＩＦＮβに結合したｍＩＬ２（ｍＩＦＮβ－ｍＩＬ２）もしくはｍＩＦＮβに結合し、ｍＡｌｂに融合したｍＩＬ２（ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２）、またはｍＡｌｂのみをコードする対照ｍＲＮＡを投与した。注射後６、２４および４８時間目ならびに５日目に血液を採取し、血清を調製した。４５０ｎｍでの光学密度を、製造者の指示に従って標準的なＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を使用して基質活性を測定した。図５に示すように、ｍＡｌｂのｍＩＬ２またはｍＩＦＮβへの融合は、全身アベイラビリティを高め、延長する。ｍＡｌｂとＩＦＮβおよびｍＩＬ２の二重融合物は、ｍＩＬ２の存在を増強しないが、循環中のより多量のｍＩＦＮβを促進する。
実施例３：ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２による脾臓における免疫細胞サブセットの拡大。
免疫細胞サブセットの組成に対する、延長されたサイトカイン、特にｍＩＬ２のアベイラビリティの影響を、主要な免疫関連器官として脾臓において決定した。実施例２に記載された実験設定に従って、ｍＲＮＡ注射の５日後に脾臓を採取し、重さを量り、細胞ストレーナおよび赤血球の低張溶解によって器官をすりつぶして単細胞懸濁液を調製した。フローサイトメトリによる単一細胞分析のために、固定可能な生存性色素（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して５×１０６の脾細胞を２～８℃で１５分間、生存性について染色し、続いてＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５およびＮＫ１．１（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ならびにＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に特異的な抗体を使用してＴ、ＢおよびＮＫ細胞を２～８℃で３０分間染色した。絶対細胞数を決定するために、細胞をＴｒｕｃｏｕｎｔ（登録商標）チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。フローサイトメトリデータをＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。免疫細胞サブセットは、ダブレットおよび死細胞を除外し、その後のＮＫ１．１＋ＣＤ１９－（ＮＫ細胞）、ＮＫ１．１－ＣＤ１９＋（Ｂ細胞）、ＮＫ１．１－ＣＤ１９－ＣＤ８＋（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＮＫ１．１－ＣＤ１９－ＣＤ４＋（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、およびＮＫ１．１－ＣＤ１９－ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）のゲーティングによって決定した。ゲート内の細胞を、それらの細胞数を同じ試料で測定されたＴｒｕｃｏｕｎｔ（登録商標）ビーズの数に関連付けることによって定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して結果を描画し、統計（一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）を分析した。図６Ａでは、脾臓あたりの絶対細胞数を視覚化しており、図６Ｂは脾臓の重量を示す（平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．））。ｍＡｌｂのｍＩＬ２への融合物は、ｍＡｌｂに比べてＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を有意に拡大することができたが、一方、未改変のｍＩＬ２は細胞数を増加させたが、その差は有意ではなかった。予想されたように、マウスＩＦＮ－β（ｍＩＦＮβ）もｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂも、これらの細胞サブセットの増殖を誘導しなかった。当然のことながら、ｍＩＦＮβのｍＩＬ２への融合物は、細胞サブセットの中間的な拡大をもたらし、ｍＩＦＮβはｍＩＬ２およびｍＡｌｂ－ｍＩＬ２の両方の増殖能力を制限した。これに対応して、脾臓は、ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２で処置した群では高度に拡大し、ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２で処置した群ではより小さな程度に拡大したが、有意ではなかった。
実施例４：脾臓における免疫細胞サブセットの活性化
抗原に加えて適切な刺激環境を提供することは、堅固で長続きするＴ細胞免疫を開始するための１つの重要な前提条件である。我々は以前に、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）が、ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を介したオートクリンまたはパラクリンシグナル伝達によって脾臓免疫細胞サブセットを活性化することができ（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６））、抗原提示樹状細胞（ＤＣ）およびエフェクタ細胞に一連の活性化マーカを選択的に上方制御させることを示した。ｍＩＦＮβの存在の増加によって媒介されるマーカ発現の変化を測定するために、実施例２に記載されている実験からの未改変またはアルブミン融合サイトカインの注射の２４時間後に得られた脾細胞を、固定可能な生存性色素（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して２～８℃で１５分間、生存性について染色し、続いてＣＤ１１ｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＮＫ１．１（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に特異的な抗体を用いてＤＣ、ＮＫおよびＴ細胞を染色した。フローサイトメトリデータをＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。免疫細胞サブセットを、ダブレットおよび死細胞を除外し、その後のＮＫ１．１＋ＣＤ３－（ＮＫ細胞）、ＮＫ１．１－ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、およびＮＫ１．１－ＣＤ３－ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂｉｎｔ（ＤＣ）のゲーティングによって決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して結果を描画し、統計（一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）を分析した。図７に示すように、ｍＩＦＮβを含むすべてのｍＲＮＡにコードされたタンパク質は、ＤＣ上の活性化マーカＣＤ４０、ＣＤ６９およびＣＤ８６の類似で有意な上方制御を誘導することができた。ｍＩＦＮβおよびｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂは、ｍＩＦＮβ－ｍＩＬ２またはｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２と比較して、ＮＫおよびＴ細胞上でのＣＤ６９発現の媒介において優れていた。
実施例５：ｍＡｌｂとの融合による血液、腫瘍および腫瘍排出リンパ節におけるタンパク質アベイラビリティの延長。
サイトカインのｍＡｌｂへの融合がどのように生体内分布を変化させ、特に腫瘍組織および腫瘍排出リンパ節でのアベイラビリティを変化させたかを視覚化するために、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｓｅｃ－ｎＬＵＣ）の分泌変異体をｍＡｌｂに融合するかまたは融合せず、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡにコードした。酸素の存在下で、その基質であるフリマジンは、フリマミド、二酸化炭素および光に変換され、後者は、従来のルミネセンスリーダによって測定することができる。雌性ＢＡＬＢ／ｃ（６～９週間齢）マウス（群および時点あたりｎ＝３匹のマウス）をＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから購入し、１００μｌ ＰＢＳ中の５×１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３８ロット番号５８４９４１５４）を右側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。２４日目に、マウスを、すべてＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｒｕｓ）で製剤化した３μｇのｓｅｃ－ｎＬＵＣ、ｍＡｌｂに融合したｓｅｃ－ｎＬＵＣ（ｓｅｃ－ｎＬＵＣ－ｍＡｌｂ）でｉ．ｖ．処置するかまたは未処置のままにした（対照）。注射後２、６、２４、４８および７２時間目に血液を採取し、血清を調製した。肝臓、腫瘍、腫瘍排出鼠径リンパ節および非腫瘍排出鼠径リンパ節を単離し、重さを量り、１．４ｍｍおよび２．８ｍｍのセラミックボール（Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が入った２ｍｌプラスチックチューブに移し、注射の６、２４、４８および７２時間後に液体窒素に浸したイソペンタン中で凍結保存した。対照群を２時間目に犠死させ、この群から得たデータを時点０に使用した。組織溶解物を、－８０℃で保存した試料から調製した。簡単に述べると、組織試料を２０～２５℃で解凍した。１×Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＰＢＳ－Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）を添加し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４Ｄｕａｌホモジナイザ（Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して組織をホモジナイズした。溶解物を遠心分離によって清澄化し、上清を清浄な冷却したエッペンドルフチューブに移し、氷上で保存した。溶解物中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従って使用して測定した。その後、溶解物を液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、製造者の指示に従って３０μｇのタンパク質または５０μｌの血清を用いてＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。生物発光強度を図８に示す。未改変ｓｅｃ－ｎＬＵＣは、選択したどの時点でもほとんどまたは全く検出されなかった。しかし、ｍＡｌｂの融合は、全身（血清）および腫瘍内のアベイラビリティを高め、延長させて、注射後７２時間でも高レベルのレポータタンパク質がまだ存在した。同様に、ｍＡｌｂとの融合は、腫瘍排出リンパ節におけるタンパク質の蓄積をもたらした。肝臓での発現は、増加されるのではなく主に延長された。標的器官におけるｍＡｌｂの存在は最初は無関係であると考えられる；注入されたｍＲＮＡの翻訳の程度は、製剤およびそのトランスフェクション率のみに依存するが、ｍＡｌｂは、翻訳されたタンパク質を安定化し、末梢での高いアベイラビリティを保証する。
実施例６：ｍＲＮＡワクチン接種およびＰＤ－Ｌ１遮断と組み合わせたアルブミン融合サイトカインの治療効果。
選択したサイトカインアルブミン融合構築物の治療効果をマウス大腸癌モデルＣＴ２６で試験した。６～９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから購入し、２００μｌ ＰＢＳ ｓ．ｃ中の５×１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３８ロット番号５８４９４１５４）を右側腹部に皮下注射した。１０日後、マウスをｇｐ７０ ｍＲＮＡリポプレックス（ＲＮＡ－ＬＰＸ）（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６（２０１５）；Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６））ワクチン接種（２０μｇ ｉ．ｖ．）および抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体（クローン６Ｅ１１、ｍＩｇＧ２Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；最初の処置時は腹腔内（ｉ．ｐ．）に２００μｇ、２回目から最後の処置までは１００μｇ ｉ．ｐ．）で処置した。各ワクチン接種／抗体処置の２日後、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｒｕｓ）に製剤化した１μｇのアルブミン融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを静脈内注射した。マウスに、マウスインターロイキン－２に融合したアルブミン（ｍＡｌｂ－ＩＬ２）、マウスインターフェロンβに融合したアルブミン（ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ）、インターフェロンβと結合したインターロイキン－２に融合したアルブミン（ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２）、マウスインターロイキン－７に融合したアルブミン（ｍＩＬ７－ｍＡｌｂ）、インターロイキン－１５受容体αに融合したマウスインターロイキン－１５に融合したアルブミン（ｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉ－ｍＡｌｂ）、またはマウスアルブミンのみをコードする対照ｍＲＮＡ（ｍＡｌｂ）を投与した。図９の上のパネルに示すように、処置スケジュールを毎週繰り返した。腫瘍体積をキャリパーで２また３日ごとに測定し、式（Ａ×Ｂ２）／２（Ａは腫瘍の最大径、Ｂは腫瘍の最小径）を使用して計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して描画した。図９に示すように、構築物ｍＡｌｂ－ＩＬ２、ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、ワクチン接種およびＰＤ－Ｌ１遮断の治療効果を高め、それぞれ６３％、５０％および７５％のマウスで腫瘍拒絶をもたらすことができた。
実施例７：ワクチン誘導Ｔ細胞の存在率に対するサイトカインアルブミン融合物の影響
次に、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの注射が、ＣＴ２６腫瘍に特異的なワクチン誘導性Ｔ細胞応答を促進するかどうかを分析した。図９に示したＣＴ２６－ＷＴ腫瘍担持マウスを、最初の処置の７日後（腫瘍接種後１７日目）の血液中のｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。このために、マウスの末梢血を眼窩洞から採取した。５０μｌの血液を、Ｈ－２Ｌｄ／ＡＨ１４２３－４３１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）四量体（ＭＢＬ）とＣＤ４５およびＣＤ８（ＢＤ）に特異的な抗体を用いて２～８℃で３０分間染色した。溶解液（ＢＤ ＦＡＣＳ（商標））を使用して血液を溶解した。絶対細胞数を決定するために、細胞をＴｒｕｃｏｕｎｔ（登録商標）チューブ（ＢＤ）に移した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩまたはＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメータ（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。Ｇｐ７０ ＡＨ１特異的Ｔ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ８＋四量体＋リンパ球をゲーティングすることによって定量化した。ゲート内の細胞を、それらの細胞数を同じ試料で測定されたＴｒｕｃｏｕｎｔ（登録商標）ビーズの数に関連付けることによって定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して結果を描画し、統計（一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）を分析した。図１０には、血液１μｌあたりの絶対数（左）およびＣＤ８＋Ｔ細胞中の四量体＋細胞のフラクションの割合（右）を示している（平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．））。ｍＡｌｂ－ＩＬ２投与は、非常に迅速に最初のワクチン接種の７日後に、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞数および頻度を有意に数倍高めることができた。図１１に示すように、反応速度はより緩やかであるが、ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂおよびｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉ－ｍＡｌｂも、経時的にｇｐ７０特異的Ｔ細胞数を増加させることができた。図１１に示す測定は、図１０について説明したのと同様に実施した。注目すべきことに、図１２に示すように、ｍＡｌｂ－ＩＬ２のみが、非特異的四量体陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも特にｇｐ７０特異的Ｔ細胞数を増加させた（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂおよびｍＩＬ１５ｓｕｓｈｉ－ｍＡｌｂは、四量体陰性および四量体陽性細胞を同程度に増加させた。一元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して、図１２の統計的有意性を決定した。各測定日の腫瘍サイズに対して血液１μｌあたりの四量体陽性細胞の数をプロットすると、統計的に有意な（ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数）負の相関を示す（図１３）。これは、ｇｐ７０腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数が多いほど、より少ない腫瘍体積、すなわち腫瘍制御の改善をもたらすことを示す。
実施例８：制御性Ｔ細胞の存在率に対するサイトカインアルブミン融合物の影響
ＩＬ２は、エフェクタＴ細胞の機能と増殖を支持することに加えて、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の公知の誘導因子である。Ｔｒｅｇは、抗腫瘍ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の機能を抑制することが公知のＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．＆Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，１－７（２０１４））。続いて、サイトカインアルブミン融合物をコードするｍＲＮＡがＣＤ４＋Ｔ細胞の数を変化させるかどうか、およびそれらの中で望ましくないＴｒｅｇの割合を変化させるかどうかを試験した。図９のマウスの末梢血を、腫瘍接種の３１日後に眼窩洞から採取した。５０μｌの血液を、ＣＤ４５、ＣＤ８（ＢＤ）、ＣＤ２５およびＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に特異的な抗体を用いて２～８℃で３０分間染色した。次に、溶解液（ＢＤ ＦＡＣＳ（商標））を使用して血液を溶解した。ＦｏｘＰ３の細胞内染色のために、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの固定化／透過化緩衝液（Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット）を使用した。透過処理後、ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）特異的抗体を２～８℃で３０分間添加した。Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（登録商標）チューブ（ＢＤ）を使用して絶対細胞数を決定した。ＦＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して結果を描画し、統計（一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）を分析した。血液１μｌあたりのＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂによって有意に増加した（図１４、左）。ｍＡｌｂ－ＩＬ２群では、わずかな有意でない増加のみが観察された。他のすべての群は、ｍＡｌｂ対照群と同様のＣＤ４ Ｔ細胞レベルを示した。予想されたように、ｍＡｌｂ－ＩＬ２はＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの割合を有意に増加させた（図１４、右）。重要な点として、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂはＴｒｅｇの割合を減らすことができた。同様に、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂはＣＤ４＋Ｔ細胞数を強力に増加させ、Ｔｒｅｇの割合を減少させるので、エフェクタＴ細胞の割合が増加すると想定できる。注目すべきことに、ＩＦＮβをｍＡｌｂ－ＩＬ２に結合すると（ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２）、Ｔｒｅｇの頻度をベースラインレベルに正常化することができた。
実施例９：長命のＣＤ１２７＋記憶前駆細胞の割合に対するサイトカインアルブミン融合物の影響
抗原特異的Ｔ細胞は、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ１２７－短命エフェクタＴ細胞（ＳＬＥＣ）および記憶Ｔ細胞の前駆体である長命ＣＤ１２７＋Ｔ細胞に細分することができる（Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１－１１９８（２００３）；Ｊｏｓｈｉ，Ｎ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７，２８１－２９５（２００７））。どちらのサブセットも同等の細胞傷害性を示すが、生存能力が異なる（Ｙｕｚｅｆｐｏｌｓｋｉｙ，Ｙ．，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｆ．Ｍ．，Ｋａｌｉａ，Ｖ．＆Ｓａｒｋａｒ，Ｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４００－４０８（２０１５））。ＣＤ１２７＋Ｔ細胞は、ＫＬＲＧ－、ＣＤ１２７＋のいわゆる記憶前駆エフェクタ細胞（ＭＰＥＣ）と、これまでに特徴付けられていないＫＬＲＧ＋、ＣＤ１２７＋Ｔ細胞に細分することができる。後者は、数回増殖したか、またはＫＬＲＧ－、ＣＤ１２７＋ＭＰＥＣへの移行段階のＭＰＥＣであり得る。
我々は、アルブミンサイトカイン融合タンパク質が記憶前駆Ｔ細胞とＳＬＥＣの比率を変化させるかどうかに関心があった。例えば、ＩＬ２とＩＬ７は、それぞれＴ細胞の生存と記憶形成に重要な役割を果たすことが示されている（Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０－７（２００３）；Ｋａｅｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１１９１－１１９８（２００３）；Ｆｒｙ，Ｔ．Ｊ．＆Ｍａｃｋａｌｌ，Ｃ．Ｌ．Ｂｌｏｏｄ ９９，３８９２－３９０４（２００２）；Ｐａｌｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，７９－８９（２００８））。腫瘍接種の３１日後、図９に示すマウスの血液を、ｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫＬＲＧ１およびＣＤ１２７の発現について分析した。フローサイトメトリ分析のための血液の染色を、実施例７に記載されているように実施した。二元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、Ｔ細胞サブタイプの割合の有意差を決定した。ＳＬＥＣ画分は、ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂを除くすべての構築物で有意に減少した（図１５）。ＳＬＥＣの最も強力な減少は、ｍＡｌｂ－ＩＬ２およびＩＬ７－ｍＡｌｂ処置後に達成された。ＩＬ７－ｍＡｌｂのみが、ＫＬＲＧ－、ＣＤ１２７＋ＭＰＥＣを有意に増加させることができた。ＫＬＲＧ＋、ＣＤ１２７＋細胞は、ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２、ｍＩＦＮβ－ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびＩＬ７－ｍＡｌｂを投与された群で有意に増加した。重要な点として、ｇｐ７０特異的ＳＬＥＣ細胞の割合は腫瘍サイズと正の相関があった（図１６Ａ）。対照的に、ＣＤ１２７（ＩＬ７受容体）陽性のｇｐ７０特異的Ｔ細胞のより高い割合は、より小さな腫瘍サイズと強く相関した（図１６Ｂ）。
実施例１０：ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂとｍＲＮＡワクチン接種およびＰＤ－Ｌ１遮断との組合せは、完全な腫瘍根絶をもたらす。
ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびＩＬ７－ｍＡｌｂ構築物はどちらも、独自の長所を有していた。ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は、高い抗原特異的Ｔ細胞数を非常に早く（図１０）、選択的に（図１２）達成したが、加えてＴｒｅｇの頻度を増加させた（図１４、右）。しかし、ＩＬ７－ｍＡｌｂは、ＣＤ４＋エフェクタＴ細胞を強力に増加させ、Ｔｒｅｇの割合を減少させ（図１４）、ＣＤ１２７＋記憶前駆Ｔ細胞の支持に特に有効であった。したがって、両方の構築物との併用処置が抗腫瘍効果を相乗的に高め得ると結論付けた。
実施例６に記載されているように、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μｌ ＰＢＳ中の５×１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞を右側腹部に皮下注射した。図９と比較して、より大きな腫瘍を得るために１３日目に処置を開始した。再び、マウスにｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸおよび抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の注射を毎週行った。２日後、Ａｌｂ－ｍＩＬ２、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂまたはその両方（各１μｇ）をコードするヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを投与した（図１７、上のパネル）。Ａｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂの両方の処置群が、対照群（ｍＡｌｂ）と比較して腫瘍増殖の低下を示した。対照群の１８％とは対照的に、Ａｌｂ－ｍＩＬ２は５５％のマウスで、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂは３６％のマウスで完全な腫瘍拒絶を誘導した。驚くべきことに、Ａｌｂ－ｍＩＬ２とｍＩＬ７－ｍＡｌｂの組合せは、１００％のマウスで完全な腫瘍拒絶を生じさせた（図１７）。
実施例１１：ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、長期持続性ワクチンが誘導するＴ細胞応答の増強において相乗作用する
実施例７および実施例９に記載されているように、図１７に示すマウスの血液を、腫瘍接種後１９、２７および３４日目にフローサイトメトリによってｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１８ａ）ならびにそれらのＫＬＲＧ１およびＣＤ１２７の発現（図１８ｂ）について分析した。図１０および図１１におけるように、Ａｌｂ－ｍＩＬ２処置は抗原特異的Ｔ細胞数を非常に早く増加させた。Ａｌｂ－ｍＩＬ２とｍＩＬ７－ｍＡｌｂはどちらも、ｍＡｌｂ対照よりも抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させた。Ａｌｂ－ｍＩＬ２とｍＩＬ７－ｍＡｌｂの組合せは、特により後の時点で、最も高い抗原特異的Ｔ細胞数を誘導した（図１８Ａ）。同様に、ＳＬＥＣの最も強力な減少とＣＤ１２７＋ｇｐ７０特異的Ｔ細胞の増加が、腫瘍接種後３４日目に併用群で観察された（図１８ｂ）。
実施例１２：ｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、ｍＡＬｂ－ｍＩＬ２によって増加した制御性Ｔ細胞数を正常化する。
図１４の結果に基づいて、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂはＡｌｂ－ｍＩＬ２によって増加する制御性Ｔ細胞の割合を減らすことができると仮定した。実施例８に記載されているように、図１７に示すマウスの血液中のｇｐ７０特異的Ｔ細胞を、５７日目にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の割合について分析した。やはり、Ｔｒｅｇの頻度はＡｌｂ－ｍＩＬ２によって有意に増加し、ｍＩＬ７－ｍＡｌｂによって減少した。仮定したように、両方の組合せは、ｍＡｌｂ対照と同様のＴｒｅｇ頻度をもたらした（図１９）。
実施例１３：構築物の設計および検証
構築物の設計およびｍＲＮＡの作製
以下の実施例で使用される構築物は、実施例１に記載されるように設計し、ｍＲＮＡを生成した。マウスインターロイキン－１２のコード配列を、３９ヌクレオチド長のエラスチンリンカーによって分離された２つのサブユニットｐ４０とｐ３５の間の融合タンパク質としてクローニングした。
構築物の検証
生成されたｍＲＮＡからのサイトカイン発現とｍＩＬ１２の生物学的活性を、それぞれのｍＲＮＡのＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞へのリポフェクション、およびその後のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用した上清のｍＩＬ１２活性の分析によって制御した。ここで、２５０ｎｇ ｍＲＮＡ／μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを複合体化し、約８０％の集密度のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞のリポフェクションのために１ｃｍ２の培養皿ごとに使用した。上清を無菌条件下で２４時間の発現後に収集し、さらに使用するまで８０℃で保存した。ｍＩＬ１２をコードするｍＲＮＡの生物学的活性を、製造者のプロトコルに従ってＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して試験した。これらの細胞はＩＬ１２Ｒ（ＩＬ１２受容体）を発現し、ＩＬ１２のＩＬ１２Ｒへの結合は、ＳＴＡＴ４誘導性の分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータ遺伝子の発現を誘導する。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞を上記のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７上清の存在下で２４時間培養した。組換えヒトＩＬ１２を対照として使用し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００装置（Ｔｅｃａｎ）を使用してアルカリホスファターゼの存在を決定した。ｍＩＬ１２のみを含む上清とｍＡｌｂに融合したｍＩＬ１２を含む上清でのレポータ遺伝子ＳＥＡＰの発現の増加は、これらの構築物の生物学的活性が組換えタンパク質と同様であることを確認した（図２０）。
実施例１４：リンパ組織常在ＤＣにおけるｍＲＮＡにコードされたタンパク質の選択的翻訳。
抗原特異的免疫の誘導のために、抗原提示はリンパ組織、特に抗原提示ＤＣで行われる必要がある。しかし、抗原送達だけでは十分な免疫応答を開始するには不十分であるが、病原性の脅威の性質に応じてＴ細胞応答を調節するにはサイトカインが存在する必要がある。ＩＬ１２などのサイトカインは、高度に増殖するＴ細胞とＩＦＮγの産生を特徴とするＴｈ１免疫を強力に促進する。Ｔ細胞のプライミング中、そのような強力なサイトカインの発現は厳しく制御されており、全身的な有害作用を回避するために、外因性の供給を関心対象の微小環境に限定する必要がある。そのようなサイトカインをそれらの生理的機能に応じて送達するために、抗原をコードするｍＲＮＡの翻訳をリンパ系組織、特にＤＣのみに指令する製剤の開発を目指した。
我々は、わずかに負に帯電したリポソームｍＲＮＡ製剤が、脾臓、リンパ節および骨髄のＤＣを特異的にトランスフェクトするのに最も適することを見出した。インビボでこの製剤によって送達された抗原発現の生体内分布を視覚化するために、６～９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから購入）に２０μｇのＬＵＣをコードするＲＮＡ－ＬＰＸまたはＬＵＣ ｍＲＮＡ単独を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、注射の６時間後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したインビボイメージングによって生物発光を測定した（エクスビボリンパ節および骨髄イメージング：１００μｇのＬＵＣ ＲＮＡ－ＬＰＸのｉ．ｖ．注射の２４時間後）。簡単に述べると、Ｄ－ルシフェリンの水溶液（２５０μｌ、１．６ｍｇ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、１０分後に生存動物または抽出した組織の放出光子を露光時間１分で定量化した。関心領域（ＲＯＩ）を平均放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ、カラーバーで表される）として定量化した（ＩＶＩＳ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０）。図２１Ａに示すように、ＲＮＡ－ＬＰＸとして製剤化し、ｉ．ｖ．注射した場合、ＬＵＣ ｍＲＮＡはもっぱらリンパ組織、主に脾臓で翻訳されたが、鼠径リンパ節、大腿骨および脛骨でも翻訳された（図２１Ｂ）。裸のｍＲＮＡの翻訳は、血管系に入ると急速に分解するため、これらの組織のいずれにおいても、また他の組織においても検出されなかった。
製剤化されたｍＲＮＡの細胞標的としてＣＤ１１ｃ＋ＤＣを確認するために、ＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウスでＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣを枯渇させた。ＣＤ１１ｃ＋細胞の枯渇のために、ＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウス（群あたりｎ＝３）に、１００μｇのＬＵＣ ＲＮＡ－ＬＰＸを投与する１２時間前に、２００μｌ ＰＢＳで希釈した４ｎｇ／ｇ体重のジフテリア毒素（ＤＴ）を腹腔内投与した（ＣＤ１１ｃ＋ＤＴＲ＋細胞の枯渇効率：＞９７．２％）。ＣＤ１１ｃ＋細胞の枯渇は特異的であり、他の細胞は影響を受けなかった。上記のように、注射の６時間後にインビボで脾臓および鼠径リンパ節の生物発光を定量化した。骨髄単細胞懸濁液の生物発光をエクスビボＬＵＣアッセイによって定量化した。単細胞懸濁液は、注射の６時間後にマウスの大腿骨と脛骨の骨髄から調製し、５×１０６細胞を９６ウェルのＮｕｎｃ白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。細胞懸濁液を等量のＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェリン試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、マイクロプレートシェーカで３分間インキュベートし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を使用して積分時間１秒で生物発光を測定した。未処置マウスから得た細胞で測定されたバックグラウンド発光は、１秒あたり１５±５カウント（ｃｐｓ）の範囲内であった。図２１Ｃに示すように、ＣＤ１１ｃ＋細胞のアブレーションは、脾臓、外植した鼠径リンパ節および骨髄でＬＵＣシグナルの有意の減少を生じさせ、ＲＮＡ－ＬＰＸとして製剤化されたｍＲＮＡの標的細胞としてＣＤ１１ｃ＋ＤＣを強く指し示した。
実施例１５：特に肝臓における製剤化されたｍＲＮＡの翻訳。
ＩＬ２またはＩＬ７などのサイトカインがその生理学的機能、すなわちＴ細胞の増殖と維持の誘導を実行するためには、全身アベイラビリティが鍵となる。タンパク質プロデューサのプールとしての肝細胞のトランスフェクションのためにサイトカインをコードするｍＲＮＡを肝臓に標的化することは、ポリマー／脂質製剤で製剤化されたｍＲＮＡの静脈内注射によって達成された。肝臓におけるｍＲＮＡにコードされたタンパク質の選択的で高い発現を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５μｇのポリマー／脂質製剤化ＬＵＣ ｍＲＮＡ（ｎ＝３）またはポリマー／脂質（ＴｒａｎｓＩＴ）単独（ｎ＝２）を静脈内注射し、実施例１４に記載されているように、注射の６、２４、４８、９６および１２０時間後にインビボイメージングによって生物発光を測定した。図２２に示すように、生物発光はすべての時点で肝臓においてのみ検出された。驚くべきことに、翻訳された活性タンパク質は、注射後１２０時間まで検出可能であった。強力な肝臓トランスフェクションの結果として、血液、腫瘍および腫瘍排出リンパ節におけるタンパク質のアベイラビリティが増強および延長することは、実施例２および実施例５に記載されている。
実施例１６：肝臓を標的とするサイトカイン産生と比較して、二次リンパ器官を標的とする、ｍＩＬ１５をコードするＲＮＡの高い有効性と低い毒性。
ＩＬ１５およびＩＬ１２のような特定のサイトカインは、全身投与された場合非常に毒性である。この毒性は、例えば胃腸および肝臓機能障害を媒介する二次ＩＦＮγ放出に大きく依存することが公知である（Ｇｕｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５，２３５３－６４（２０１５）；Ｃａｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｅｎｇ，Ｖ．Ｍ．，Ｌｉｐｍａｎ，Ｊ．Ｍ．＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｄ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７，５８－６３）。しかし、それらの治療効果は、二次リンパ組織において最も一般的であるＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＤＣなどの免疫細胞サブタイプの活性化に依存する。
ｍＩＬ１５を二次リンパ器官に標的化することは、治療効果を保持しつつ、全身毒性を減少させるはずであると仮定した。これを試験するために、６～９週齢のＢＡＬＢ／ｃ（群あたりｎ＝５、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから購入）に２００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の４×１０５ ＣＴ２６－Ｂ２ＭＫＯ結腸癌細胞を静脈内接種した。ＣＴ２６－Ｂ２ＭＫＯ細胞はＭＨＣクラスＩの表面発現を欠いており、ｍＩＬ１５によって活性化され得るＮＫ細胞による認識の改善をもたらす。腫瘍接種の４日後および７日後に、マウスを、ＲＮＡ－ＬＰＸによって二次リンパ器官（４０μｇ ＲＮＡ－ＬＰＸ ｉ．ｖ．）（実施例１４に記載されたように）または肝臓（ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｒｕｓ）に製剤化した３μｇ ＲＮＡ ｉ．ｖ．）（実施例１５に記載されたように）のいずれかに送達されるｍＩＬ１５ ＲＮＡ（マウスインターロイキン－１５受容体α鎖に融合したマウスインターロイキン－１５）で処置した。腫瘍接種の１２日後、肺を青色インクで染色し、フェケテ溶液で固定し、腫瘍結節を他の場所で説明されているように計数した（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５２０，６９２－６９６）。仮定したように、ｍＩＬ１５の全身アベイラビリティをもたらす肝臓を標的とする送達は、重篤な毒性につながる。この群のすべてのマウスは、非常に低用量にもかかわらず、２回目のｍＲＮＡ投与後に死亡した。対照的に、二次リンパ器官にのみ送達されるｍＲＮＡを投与されたマウスは、１３回以上ｍＲＮＡを投与しても生存したままであった。二次リンパ器官に送達されるｍＩＬ１５ ｍＲＮＡで処置されたすべてのマウスは腫瘍を有していなかったが、対照動物では最大数百までの腫瘍結節が検出された（図２３）。
実施例１７：生理学的機能に従って標的化されたｍＩＬ１２とｍＩＬ２の組合せによる腫瘍特異的Ｔ細胞療法および治療効果の増強
同様に、ＩＬ１２の二次リンパ器官への標的化は、堅固な治療効果を示しながら、耐容できる毒性をもたらすと仮定した。ＩＬ１２は、Ｔ細胞のプライミング中にＤＣによって放出され、ナイーブＴ細胞のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍性または抗ウイルス性Ｔｈ１型への分化を媒介する重要なサイトカインである。この理由から、ＩＬ１２は、二次リンパ器官に送達された場合、特にＴ細胞ワクチンの効果を増強するはずである。関心対象のもう１つのサイトカインであるＩＬ２は、Ｔ細胞プライミング中のリンパ組織だけでなく、二次リンパ器官を離れて新たにプライミングされたＴ細胞の増殖を促進する末梢で選択的にその生理学的機能を発揮し、腫瘍微小環境での機能維持を促進する。これら２つのサイトカインについて得られた時空間要件を念頭に置いて、ｍＲＮＡワクチン接種およびチェックポイント遮断の状況で、ｍＩＬ１２のリンパ組織への送達と、ｍＩＬ２のわずかに遅れた全身送達とを組み合わせることを意図した。Ｅｎｖｉｇｏから購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１１）に、１００μｌ ＰＢＳ中の３×１０５ Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を皮下接種した。腫瘍接種の８日後、マウスを腫瘍サイズに従って層別化し、１０μｇの分化抗原チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２１８０－１８８）および１０μｇのＭＨＣクラスＩＩ拘束性ネオ抗原Ｂ１６＿Ｍ３０９を含むＲＮＡ－ＬＰＸベースのＴ細胞ワクチンｉ．ｖ．、または無関係なｍＲＮＡ（２０μｇの挿入物のないワクチン骨格）のいずれかを投与した。すべてのマウスに２００μｌ ＰＢＳ 中の２００μｇ（１００μｇでの連続処置）の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン６Ｅ１１、ｍＩｇＧ２Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を腹腔内投与した。マウスに、ＲＮＡ－ＬＰＸとして送達される（二次リンパ器官に送達）３μｇ（４回目の処置からは１μｇ）のｍＩＬ１２ ｍＲＮＡまたは無関係なｍＲＮＡを静脈内に同時注射した。およそ４８時間後、ｍＩＬ２－ｍＡｌｂをコードする１μｇのｍＲＮＡ、またはＴｒａｎｓＩＴを用いて製剤化した１μｇのｍＡｌｂ対照（全身アベイラビリティのために肝臓に送達）を静脈内注射した。処置スケジュールを週に１回、７週間繰り返した。ＩＬ１２処置は免疫療法を強く改善し、６０日間超にわたってマウスの８０％の生存をもたらした（図２４Ａ）。ｍＩＬ１２またはｍＩＬ２のいずれかを除いた場合、それぞれマウスの４５％または６４％のみが６０日目まで生存した。この時点で、ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた対照ｍＲＮＡを投与された対照マウスの９％のみが生存していた。さらに、ＰＤ－Ｌ１抗体およびｍＡｌｂ－ｍＩＬ２と組み合わせたｍＩＬ１２、ｍＩＬ１２単独またはｍＡｌｂ－ｍＩＬ２単独を含むｍＲＮＡワクチン接種を受けたマウスの大部分は、白斑の徴候、すなわち処置に起因したＴＲＰ－２含有細胞に対する強力な自己免疫の結果としての眼の周囲の毛皮の色素沈着の喪失を示した（図２４Ｂ）。倫理上の理由により、耐容できない毒性を示すために肝臓に送達されるＩＬ１２の投与を試験する対照群は、この実験には加えなかった。
Figure 0007505984000001
Figure 0007505984000002
Figure 0007505984000003
実施例１８：二次リンパ器官ではなく肝臓を標的とするｍＡｌｂ－ｍＩＬ２は、ワクチン誘導性Ｔ細胞応答を容易に増加させる。
実施例１６および１７で観察されるように、二次リンパ器官へのサイトカインＲＮＡの標的化は、強力な治療効果を有することができ、ＩＬ１２などの特定のサイトカインの毒性を減少させることができる。しかし、他のサイトカイン、例えばＩＬ２およびＩＬ７については、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞に対する強力で長期的な効果のためには高い量のサイトカインの全身アベイラビリティが必要である。この理由から、ＴｒａｎｓＩＴで送達されたまたはＲＮＡ－ＬＰＸとして製剤化されたｍＡｌｂ－ｍＩＬ２ ＲＮＡの、ｇｐ７０特異的Ｔ細胞の数に対する効果を比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、０日目と７日目にｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸワクチン接種（２０μｇ ｉ．ｖ．）と抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体（１００μｇ ｉ．ｐ．）で処置し、２日後にＴｒａｎｓＩＴ中でまたはＲＮＡ－ＬＰＸとして、ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２をコードする１μｇのｍＲＮＡを投与した。実施例６に記載されるように、Ｇｐ７０特異的Ｔ細胞応答を血液中で測定した。図２５に示すように、肝臓を標的とするｍＡｌｂ－ｍＩＬ２（ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２（ＴｒａｎｓＩＴ））のみが、最初のワクチン接種（左）または２回目のワクチン接種（右）の７日後にｇｐ７０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有意に増加させることができたが、二次リンパ器官を標的とするｍＡｌｂ－ｍＩＬ２（ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２（ＲＮＡ－ＬＰＸ））は、有意に増加させることができなかった。
実施例１９：構築物の設計および検証
構築物の設計およびｍＲＮＡの作製
実施例１に従って、ヒトサイトカインをコードするｍＲＮＡのインビトロ転写のためのＤＮＡプラスミド構築物を設計した。サイトカインとＡｌｂをコードする配列はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）に由来し、得られたアミノ酸配列に変化は導入されなかった（ｈＩＬ２：ＮＰ＿０００５７７．２；ｈＩＬ７：ＮＰ＿０００８７１．１；ＮＣＢＩタンパク質リソース；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／）。ｈＡｌｂをサイトカインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加した。実施例１に記載されるように、ｍＲＮＡをインビトロ転写によって生成し、キャップし、精製した。
構築物の検証
生成したｍＲＮＡからのサイトカイン発現を、ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞へのｍＲＮＡのリポフェクション、および得られた上清の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用したその後の分析によって分析した。リポフェクションの１日前に、１．２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞を、６ウェルプレート中の３ｍＬ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号３１９６６－０２１）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、カタログ番号Ｓ０１１５）に播種した。リポフェクションのために、３μｇのｍＲＮＡを無菌のＲＮアーゼ不含条件下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ０１５）１μＬあたり４００ｎｇ ｍＲＮＡを使用して製剤化し、１０ｃｍ２の培養皿ごとに約８０％の集密度でＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞に適用した。２０時間の発現後、無細胞上清を無菌条件下で収集し、さらに使用するまで－２０℃で保存した。細胞培養上清中のｈＩＬ２サイトカインの存在を、組換えヒトＣＤ２５へのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ２－ｈＡｌｂの結合をＥＬＩＳＡで分析することによって決定した。ここで、１μｇ／ｍＬの組換えヒトＣＤ２５（Ｃ－Ｆｃ、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎカタログ番号ＣＪ７８）を、１００μＬ ＤＰＢＳ中で高タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３９４５４）に被覆した。ｈＩＬ２を含有する上清を被覆したＣＤ２５に１：４希釈で適用し、結合タンパク質をＨＲＰ結合抗ヒト血清アルブミン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ８９４１）によって検出した。一般的なＥＬＩＳＡ試薬と手順を、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ａｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ００８）のプロトコルに従って使用した。ｈＩＬ７の場合、細胞培養上清中のサイトカインレベルは、市販のＨｕｍａｎ ＩＬ－７ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２０７）を製造者のプロトコルに従って使用して決定した。
ｈＩＬ２またはｈＩＬ７を含有する細胞培養上清をウェスタンブロット分析にも使用して、変性条件下で選択した構築物のサイトカイン発現を半定量的に確認した。したがって、適切なＶｉｖａＳｐｉｎカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ ＡＧ）を使用して総タンパク質を濃縮し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＴＬソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色での試料の分離後に、著明なバンドの定量化によって濃度を評価した。ウェスタンブロット法のために、均一なタンパク質の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、セミドライまたはウェットブロットプロトコルでニトロセルロース膜に転写した。ブロッティング後、ニトロセルロース膜をブロックし（１ｘＰＢＳ－Ｔ中の５％脱脂粉乳）、続いて適切な希釈の一次抗体（抗ｈＩＬ２：Ａｂｃａｍ（ａｂ９２３８１）、抗ｈＩＬ７：Ａｂｃａｍ（ａｂ１９３３５８））および二次抗体と共にインキュベートした。二次抗体のインキュベーションの前と後に膜を洗浄した（１×ＰＢＳ－Ｔ）。Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＴｒｉｄｅｎｔ ｆｅｍｔｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ）の添加後に発生した化学発光シグナルを、ＬＡＳ ４０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して記録した。
ｈＩＬ２およびｈＩＬ７の生物学的活性を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の抗原非特異的増殖のサイトカイン媒介性増強を分析することによって評価した。さらに、ｈＩＬ２の生物学的活性を、ＣＤ２５を高発現しているマウスＣＴＬＬ－２細胞（マウスＣ５７ＢＬ／６ Ｔ細胞株、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２１４）のｈＩＬ２依存性増殖によって評価した。ＣＴＬＬ－２増殖分析のために、細胞を採取し、ＤＰＢＳで２回洗浄して残留ＩＬ２を除去し、１０％ＦＢＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１１３６００７０）を添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号６１８７００１０）に再懸濁した。合計５，０００細胞／ウェルを白色９６ウェル平底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、カタログ番号１００７２１５１）に播種し、４倍に段階希釈したｈＩＬ２含有上清と共にインキュベートした。３日間の培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９２４２）を使用して、ＡＴＰ量で生細胞を定量することによって増殖を測定した。発光をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）で記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で用量反応曲線をプロットした。ヒトＴ細胞の増殖を測定するために、ＰＢＭＣを健常ドナーのバフィーコートからＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号１７－１４４０－０３）密度勾配分離によって取得した。１．６μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５６４）を使用してＰＢＭＣを標識した。７５，０００個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、ウェルごとに、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号７３４－１７９７）中の５％血漿由来ヒト血清（ＰＨＳ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ ｌｎｃ．、カタログ番号Ａ２５７６１）を添加したｌｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１２４４０－０５３）に播種し、準最適濃度の抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１００；最終濃度０．０３μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。並行して、ｈＩＬ２およびｈＩＬ７を含有する上清の４倍連続希釈液を、５％ＰＨＳを添加したＩＭＤＭで生成した。播種した細胞を上清と１：１で混合し（播種した細胞の培地の容量を参照）、３７℃、５％ＣＯ２で４日間刺激した。ｈＩＬ－７の場合、ＰＢＭＣを採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＤ－ＰＢＳ）ですべて１：１００に希釈した以下の試薬で染色した：抗ヒトＣＤ４－ＰＥ（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５０－００４９）、抗ヒトＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０－００８８）および７－ＡＡＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ０７７０４）。フローサイトメトリ分析を、増殖読み出しとしてＣＦＳＥ希釈を用いてＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。取得した増殖データをＦｌｏｗＪｏ １０．４ソフトウェアを使用して分析し、分裂細胞％のエクスポート値を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で用量反応曲線をプロットした。
ｈＣＤ２５結合ＥＬＩＳＡおよびｈＩＬ７ ＥＬＩＳＡでは、両配向のｈＡｌｂ－ｈＩＬ２とｈＩＬ２－ｈＡｌｂまたはｈＡｌｂ－ｈＩＬ７とｈＩＬ７－ｈＡｌｂがそれぞれ比較可能なシグナルをもたらし、試験されたすべてのサイトカインが細胞培養上清中に十分に発現されたこと、および配向はサイトカイン発現に影響を及ぼさないことを示した（図２６Ａ、図２７Ａ）。さらに、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂのサイトカイン発現はウェスタンブロット分析によって確認された（図２６Ｂ、図２７Ｂ）。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ２－ｈＡｌｂは、ＣＴＬＬ－２細胞の増殖を誘導し、ならびにヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原非特異的増殖を用量依存的に増強した。両方の配向が同等に機能し、分子内のｈＡｌｂの位置はｈＩＬ２の生物学的活性に影響を及ぼさないことを示した（図２６Ｃ、Ｄ）。同様に、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ７およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂは、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原非特異的増殖を用量依存的に増強した。２つの異なる配向は同様に機能したが、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂはｈＡｌｂ－ｈＩＬ７よりも、有意ではないがわずかに生物学的活性が高いようであった（図２７Ｃ）。これらの結果に基づいて、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂをさらなる実験のために選択した。
実施例２０：活性タンパク質内のサイトカインおよびアルブミン部分のそれぞれの順序は、インビボでの安定性、薬物動態プロフィールまたは機能性に影響を及ぼさない。
薬物動態修飾基の位置は、サイトカインに関してＮ末端またはＣ末端に位置し得る。どちらかの位置が安定性、全身バイオアベイラビリティまたは機能性に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）をヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）のＮ末端（ｈＩＬ２－ｈＡｌｂ）またはＣ末端（ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２）に融合し、血液循環中でサイトカインレベルを測定した。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１２～１５週齢）（群および時点あたりｎ＝３匹のマウス）をＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから購入し、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｒｕｓ）を用いて製剤化した１μｇのｈＩＬ２－ｈＡｌｂもしくはｈＡＬｂ－ｈＩＬ２をコードするｍＲＮＡ、またはｈＡｌｂのみをコードする製剤化した対照ｍＲＮＡを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。注射後６、２４、４８および７２時間目に血液を採取し、血清を調製した。製造者の指示に従ってＭＥＳＯ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ１２０装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）でＶ－Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を使用して、サイトカイン濃度を測定した。潜在的な機能の違いを検討するために、Ｔリンパ球数を、実施例３に記載されているように調製して染色した脾細胞の単細胞懸濁液のフローサイトメトリ分析によって、注射の９６時間後に脾臓で決定した。フローサイトメトリデータをＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメータ（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。図２８Ａに示すように、２つの異なるｈＩＬ２融合タンパク質の薬物動態プロフィールは同一であり、翻訳されたタンパク質の初期レベルおよび経時的な全身アベイラビリティは非常に類似していた。Ｔリンパ球サブセットのＣＤ４＋、ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔ細胞数は、対照動物と比較して、両方のｈＩＬ２融合タンパク質で同様に拡大した（図２８Ｂ）。これらのデータセットは、薬物動態修飾基、この場合はｈＡｌｂの、サイトカインに関してＮ末端またはＣ末端の位置が、適切なサイトカインの機能性に無関係であることを示す。
実施例２１：ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂとｍＲＮＡワクチン接種の組合せは、ほぼ完全な腫瘍根絶をもたらす。
実施例１０において、ｍＡｌｂ－ｍＩＬ２およびｍＩＬ７－ｍＡｌｂは、特に組み合わせて適用した場合に、ワクチン誘導性抗腫瘍免疫を増強することが示された。これらの所見をヒトサイトカイン融合物で確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝１１）に、２００μｌ ＰＢＳ中の５×１０５ ＣＴ２６腫瘍細胞を右側腹部に皮下注射し、マウスに、腫瘍接種後１０日目から、２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸ ｉ．ｖ．および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化し、静脈内注射した（肝臓標的化）３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂまたはその２つの組合せを４週間ごとの投与でワクチン接種した。対照動物には、ｍＲＮＡワクチン接種およびＬＮＰ ｉ．ｖ．として製剤化したｈＡｌｂを投与した。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２またはｈＩＬ７－ｈＡｌｂのいずれかを投与された両方の群は、対照群（ｈＡｌｂ）と比較して腫瘍増殖を減少および減速させ、確立された腫瘍でさえも拒絶した（図２９Ａ）。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２の場合、処置下にある間、腫瘍は増殖せず、６４％のマウスで高い腫瘍拒絶をもたらしたが、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂで処置した場合は、１８％のマウスで腫瘍が拒絶された。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２とｈＩＬ７－ｈＡｌｂの組合せは、マウスの対応物と極めて類似しており、対照群では生存マウスが存在しなかったのと比較して、９１％のマウスで腫瘍拒絶と無腫瘍生存をもたらした（図２９ＡおよびＢ）。
実施例２２：ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂは、高レベルのワクチン誘導性腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強および維持する。
実施例７および１１に沿って、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡのワクチン誘導性Ｔ細胞応答の拡大に対する効果を、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂに対する応答で検討した。実施例２１に記載されるＣＴ２６腫瘍担持マウスを、３回の連続処置のそれぞれ７日後（腫瘍接種後１７、２４および３１日目）の血液中のｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。このために、実施例７に記載されているようにマウスの末梢血を収集し、ｇｐ７０ ＡＨ１四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞について染色した。フローサイトメトリデータをＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。実施例７に記載されているように、Ｇｐ７０ ＡＨ１特異的Ｔ細胞をゲーティングし、定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して統計（一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）を分析した。
腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数およびＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのその割合によって明らかにされるように、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２処置は、最初のワクチン接種後すぐに腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ（図３０Ａ）、有意により高いレベルを経時的に維持した（図３０Ｂ）。ｈＩＬ７－ｈＡｌｂは対照群を超えて抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大しなかったが、ｈＡｌｂ－ｈＩｌ２とｈＩＬ７－ｈＡｌｂの組合せは、経時的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大において相乗作用し、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２単独よりも優れていた（図３０Ａ、Ｂ）。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂはどちらも、ワクチン接種された腫瘍抗原に特異的ではないＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させ、この場合もやはり、２つのサイトカインの組合せは単一処置よりも優れていた（図３０Ｃ）。マウスの対応物について前述したように（実施例８）、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ－ｈＩＬ２とｈＩＬ７－Ａｌｂの組合せは、抗原非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大することができた（図３０Ｄ）。
実施例２３：ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２はＴｒｅｇ細胞を最初だけ拡大するが、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂは全体を通して低い数のＴｒｅｇ細胞を維持する。
実施例８に沿って、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの望ましくないＴｒｅｇの拡大に対する効果をｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＩＬ７－ｈＡｌｂに対する応答で検討した。実施例２１に記載されるＣＴ２６腫瘍担持マウスを、３回の連続処置のそれぞれ７日後（腫瘍接種後１７、２４および３１日目）の血液中のＴｒｅｇ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。このために、実施例８に記載されているようにマウスの末梢血を収集し、Ｔｒｅｇ細胞について染色した。フローサイトメトリデータをＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。実施例８に記載されているように、Ｔｒｅｇ細胞をゲーティングし、定量化した。
ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２は、最初はＴｒｅｇ細胞を有意に拡大するが（図３１Ａ）、Ｔｒｅｇ細胞の数は連続的な処置で正常化し、対照レベル未満に減少する（図３１Ｂ）。マウスの対応物と同様に、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂでの処置は、最初の処置時にＴｒｅｇ細胞を拡大せず、Ｔｒｅｇ細胞数はさらなる処置全体を通して制御されたままである（図３１Ａ、Ｂ）。２つのサイトカインの組合せは、２回目のワクチン接種以降、対照と同様にＴｒｅｇ細胞数を等しく減少させる（統計的に有意ではない）。その結果、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ－ｈＩＬ２とｈＩＬ７－ｈＡｌｂの組合せは、Ｔｒｅｇ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大する（図３２）。特に、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２およびｈＡｌｂ－ｈＩＬ２とｈＩＬ７－ｈＡｌｂの組合せは、Ｔｒｅｇ細胞よりも抗原特異的および非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を大幅に増加させ（図３２Ａ）、一方で、ｈＩＬ７－ｈＡｌｂは、ワクチンが対象としない非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大する（図３２Ｂ）。

Claims (15)

  1. 対象における癌を治療または予防するための方法で使用するための医薬製剤であって、
    ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
    ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
    を含み、
    前記抗原が腫瘍関連抗原である、医薬製剤。
  2. 対象において免疫応答を誘導するための方法で使用するためのＲＮＡであって、前記方法が、前記対象に、
    ａ．延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－２をコードするＲＮＡおよび延長薬物動態（ＰＫ）インターロイキン（ＩＬ）－７をコードするＲＮＡ；ならびに
    ｂ．前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ
    を投与することを含み、
    前記使用するためのＲＮＡが、
    延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡ、
    延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ、および
    前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するための前記エピトープを含むペプチドもしくはタンパク質をコードする前記ＲＮＡを含む、使用するためのＲＮＡ。
  3. 前記延長ＰＫ ＩＬ２が融合タンパク質を含み、
    前記融合タンパク質が、ＩＬ２部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、請求項１に記載の医薬製剤または請求項２に記載の使用するためのＲＮＡ。
  4. 前記延長ＰＫ ＩＬ７が融合タンパク質を含み、
    前記融合タンパク質が、ＩＬ７部分ならびに血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、およびＦｎ３、またはそれらの変異体からなる群より選択される部分を含む、請求項１または３に記載の医薬製剤あるいは請求項２または３に記載の使用するためのＲＮＡ。
  5. 前記血清アルブミンがマウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む、あるいは、
    前記免疫グロブリン断片が免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項３または４に記載の医薬製剤あるいは請求項３または４に記載の使用するためのＲＮＡ。
  6. ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
    をさらに含む、請求項１および３～５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  7. 前記方法が、前記対象に、
    ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
    を投与することをさらに含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の使用するためのＲＮＡ。
  8. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、（ｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＤ８６の間の相互作用を標的とする、ならびに／あるいは、
    前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体または抗体断片であって、前記抗体または抗体断片がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４を標的とする、請求項６に記載の医薬製剤または請求項７に記載の使用するためのＲＮＡ。
  9. キットであり、各ＲＮＡを別々の容器に含む、ならびに／あるいは
    前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記ＲＮＡを含まない容器内にある、ならびに／あるいは
    前記キットが癌を治療または予防するための前記医薬製剤の使用説明書をさらに含み、前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１、３～６および８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  10. 前記ＲＮＡを含む医薬組成物であり、
    前記医薬組成物が、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項１、３～６および８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  11. 前記ＲＮＡが、液体形態、固体形態、またはそれらの組合せから選択される形態で存在し、
    前記固体形態が凍結形態または脱水形態であり、
    前記脱水形態が凍結乾燥形態または噴霧乾燥形態である、請求項１、３～６および８～１０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  12. 医薬用途のためのものであり、前記医薬用途が、疾患または障害の治療的または予防的処置のための方法における使用を含む、請求項１、３～６および８～１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  13. 前記方法において、延長ＰＫ ＩＬ２をコードする前記ＲＮＡおよび延長ＰＫ ＩＬ７をコードする前記ＲＮＡ、前記対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする前記ＲＮＡ、ならびに免疫チェックポイント阻害剤を同時にまたは連続的に投与する、請求項２～５、７および８のいずれか一項に記載の使用するためのＲＮＡ。
  14. 前記方法が、疾患の治療的または予防的処置のための方法であり、
    前記治療が、前記抗原に特異的なＣＤ１２７陽性Ｔ細胞の数を増加させる、ならびに／あるいは
    前記治療が短命なエフェクタ細胞の数を減少させる、ならびに／あるいは
    前記治療が、制御性Ｔ細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞の比率を増加させる、請求項２～５、７、８および１３のいずれか一項に記載の使用するためのＲＮＡ。
  15. 前記方法が、対象における癌を治療または予防するための方法であり、前記抗原が腫瘍関連抗原である、
    腫瘍抗原に対する治療用抗体または抗体断片を投与しない、ならびに／あるいは
    前記癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、中皮腫、腎細胞癌、および脳の癌からなる群より選択される、請求項１２に記載の医薬製剤または請求項２～５、７、８、１３および１４のいずれか一項に記載の使用するためのＲＮＡ。
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