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JP7429404B2 - タウ関連疾患モデルの製造方法 - Google Patents

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Description

特許法第３０条第２項適用 ２０１８年９月７日に発行された、４８ＴＨ ＡＮＮＵＡＬ ＭＥＥＴＩＮＧ ＯＦ ＴＨＥ ＳＯＣＩＥＴＹ ＦＯＲ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥの予稿集で公開
特許法第３０条第２項適用 ２０１８年１１月６日に開催された、４８ＴＨ ＡＮＮＵＡＬ ＭＥＥＴＩＮＧ ＯＦ ＴＨＥ ＳＯＣＩＥＴＹ ＦＯＲ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥのプログラムで公開
本発明は、タウ関連疾患モデルの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、タウ関連疾患モデルの製造方法、タウ関連疾患モデル、タウ関連疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法に関する。
前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＦＴＤ）は、タウ関連疾患の１種であり、タウタンパク質をコードするＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子の変異に起因する神経変性疾患である。
ＭＡＰＴ遺伝子における５０以上の変異が前頭側頭型認知症を誘発すると報告されており、疾患の表現型は変異が異なる患者間で異なっていることが知られている。現在、前頭側頭型認知症患者に有効な治療法は知られておらず、治療技術の開発のためにタウ関連疾患モデルの開発が求められている。
例えば、非特許文献１には、トランスジェニックマウスモデル及び死後の患者の脳を用いた解析の結果、前頭側頭型認知症患者の病理学的側面を明らかにすることができたと報告されている。
Denk F. and Wade-Martins R., Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies., Neurobiol Aging, 30 (1), 1-13, 2009.
しかしながら、非特許文献１に記載されたトランスジェニックマウスモデルは、種の違い及びタウトランスジーンの過剰発現に起因して、ヒトのタウ関連疾患の病理学的側面を十分に反映することができない。また、死後の患者の脳は、タウ関連疾患の発病及び進行のモデルにはなり得ない。そこで、本発明は、タウ関連疾患モデルを製造する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］ＭＡＰＴ遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を３次元培養し、神経オルガノイドを形成する工程と、前記神経オルガノイドを単一細胞に解離させて２次元で接着培養し、神経細胞を得る工程と、を含み、前記神経細胞がタウ関連疾患モデルである、タウ関連疾患モデルの製造方法。
［２］前記変異が、エクソン９～１３又はイントロン１０に存在する１つ又は複数の変異である、［１］に記載の製造方法。
［３］エクソン９～１３に存在する前記変異が、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｓ２８５Ｒ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｓ３０５Ｎ、Ｓ３０３Ｓ、Ｓ３０５Ｓ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｇ３８９Ｒ及びＲ４０６Ｗからなる群より選択される変異型タウタンパク質をコードする変異であり、イントロン１０に存在する前記変異が、イントロン１０の５’側から第１番目～第２０番目のヌクレオチドのいずれか１つ又は複数の塩基における変異である、［２］に記載の製造方法。
［４］野生型の神経細胞と比較して、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能が有意に異なり、ＭＡＰＴ遺伝子に変異を有する神経細胞からなるタウ関連疾患モデル。
［５］［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法により製造された、［４］に記載のタウ関連疾患モデル。
［６］被験物質の存在下で［４］又は［５］に記載のタウ関連疾患モデルを培養する工程と、前記タウ関連疾患モデルの、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能を測定する工程と、測定されたタウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に異なることが、前記被験物質がタウ関連疾患の予防剤又は治療剤であることを示す、タウ関連疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
本発明によれば、タウ関連疾患モデルを製造する技術を提供することができる。
（ａ）及び（ｂ）は、実験例２で使用したターゲッティングベクターの構造を示す模式図である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例２で作製したｉＰＳ細胞のタウ遺伝子の塩基配列の解析結果を示す波形である。 実験例３におけるｉＰＳ細胞から神経細胞への分化のスケジュールを示す模式図である。 実験例３で作製したタウ関連疾患モデルの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｅ）は、実験例３で作製したタウ関連疾患モデルにおける各マーカー陽性細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。（ａ）はＭＡＰ２の結果であり、（ｂ）はβＩＩＩチューブリンの結果であり、（ｃ）はＴＢＲ１の結果であり、（ｄ）はＮＥＵＮの結果であり、（ｅ）はＦＯＸＧ１の結果である。 （ａ）は、実験例４において、タウタンパク質のリン酸化を検討した結果を示す写真である。（ｂ）及び（ｃ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。（ｄ）は、実験例４において、タウタンパク質のリン酸化を検討した結果を示す写真である。 （ａ）は実験例５において、Ｔａｕ１２抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果に基づいて、断片化したタウタンパク質の量を数値化したグラフである。 （ａ）は、実験例６における免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例６における免疫染色の結果に基づいて、樹状突起に局在したタウタンパク質の割合、及び、軸索に局在したタウタンパク質の割合を数値化したグラフである。 実験例６における免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例７における免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例７における免疫染色の結果に基づいて神経突起のパンクタの数を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例８における代表的な蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例８における蛍光顕微鏡写真に基づいて、軸索上に存在するミトコンドリアの数を測定した結果を示すグラフである。 実験例８において、順方向に移動するミトコンドリア、逆方向に移動するミトコンドリア及び静止しているミトコンドリアの割合を測定した結果を示すグラフである。
［タウ関連疾患モデルの製造方法］
１実施形態において、本発明は、ＭＡＰＴ遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を３次元培養し、神経オルガノイドを形成する工程と、前記神経オルガノイドを単一細胞に解離させて２次元で接着培養し、神経細胞を得る工程と、を含み、前記神経細胞がタウ関連疾患モデルである、タウ関連疾患モデルの製造方法を提供する。本明細書において、タウ関連疾患としては、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病等が挙げられる。
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により製造されたタウ関連疾患モデルは、タウ関連疾患の発病及び進行の機構の解明や、タウ関連疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニングに利用することができる。
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。多能性幹細胞はヒトの細胞であることが好ましい。
ＭＡＰＴ遺伝子に変異を有する多能性幹細胞は、タウ関連疾患の患者由来の多能性幹細胞であってもよいし、人為的にＭＡＰＴ遺伝子に変異を導入した健常人由来の多能性幹細胞であってもよい。あるいは、タウ関連疾患の患者由来の多能性幹細胞に、人為的にＭＡＰＴ遺伝子を更に導入した多能性幹細胞であってもよい。
ヒトＭＡＰＴのゲノムＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ＿００００１７．１１である。本実施形態の製造方法において、ＭＡＰＴ遺伝子の変異は、タウ関連疾患に関連する変異であれば特に限定されず、例えば、エクソン９～１３又はイントロン１０に存在する１つ又は複数の変異であることが好ましい。
エクソン９～１３に存在する変異のより具体的な例としては、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｓ２８５Ｒ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｓ３０５Ｎ、Ｓ３０３Ｓ、Ｓ３０５Ｓ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｇ３８９Ｒ、Ｒ４０６Ｗ等の変異型タウタンパク質をコードする変異が挙げられる。これらの変異のうち、Ｌ２８４Ｌ、Ｓ３０３Ｓ、Ｓ３０５Ｓは、アミノ酸置換を伴わず、コドンが変化することによるスプライシングの異常が生じる変異である。
また、イントロン１０に存在する変異としては、イントロン１０の５’側から第１番目～第２０番目のヌクレオチドのいずれか１つ又は複数の塩基における変異が挙げられる。イントロン１０に存在するより具体的な変異としては、Ｅｘ１０＋３、Ｅｘ１０＋１２、Ｅｘ１０＋１３、Ｅｘ１０＋１４、Ｅｘ１０＋１６、Ｅｘ１０＋１９、Ｅｘ１０＋２９等が挙げられる。
多能性幹細胞の３次元培養は、細胞接着性の低いＵ底又はＶ底プレートで、多能性幹細胞の凝集塊（胚葉体）を形成して培養することにより行ってもよいし、多能性幹細胞を細胞外マトリクスに包埋して培養することにより行ってもよい。
細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）としては、例えばマトリゲル（登録商標、コーニング社）、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（新田ゼラチン）、細胞外マトリクスタンパク質（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（シグマ社）等の市販のものを用いることができる。
あるいは、ＥＣＭを調製して用いてもよい。ＥＣＭの調製方法としては、例えば、培養容器内でＥＣＭ産生細胞を培養した後、細胞を取り出し、培養容器の表面にコートされたＥＣＭを使用する方法が挙げられる。ＥＣＭ産生細胞としては、例えば、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞；主にＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲン、フィブロネクチンを産生する線維芽細胞；主にコラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＶ型)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシン－Ｃを産生する結腸筋線維芽細胞等が挙げられる。
オルガノイドとは、細胞が集積して形成された構造体であり、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有している。近年、多能性幹細胞から様々なオルガノイドを作製する研究が盛んに行われており、例えば、神経オルガノイド（脳オルガノイド）、腸オルガノイド、肝臓オルガノイド、腎臓オルガノイド等が作製されている。
本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞から神経オルガノイドを形成する方法は、特に限定されず、例えば、多能性幹細胞をＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で３次元培養することが挙げられる。
ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＲｅｐＳｏｘ（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）等を使用することができる。
Ｗｎｔ阻害剤としては、例えば、ＩＷＰ－２（ＣＡＳ番号：６８６７７０－６１－６）、ＩＷＰ－３（ＣＡＳ番号：６８７５６１－６０－０）、ＩＷＰ－４（ＣＡＳ番号：６８６７７２－１７－８）、ＸＡＶ－９３９（ＣＡＳ番号：２８４０２８－８９－３）等を使用することができる。
多能性幹細胞の３次元培養は、例えば２０日以上、例えば２５日以上、例えば３０日以上行うことが好ましい。３次元培養の期間の上限は特にない。３次元培養の結果、神経オルガノイドを得ることができる。
続いて、神経オルガノイドを単一細胞に解離させる。神経オルガノイドの解離方法は特に限定されず、物理的方法、酵素処理法等が挙げられるが、細胞を傷つけない観点から酵素処理法が好ましい。酵素処理法に用いられる酵素としては、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、パパイン、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼＩ等を用いることができる。
神経オルガノイドの解離は、単一細胞になるまで行うことが好ましいが、完全に単一細胞に解離させなくてもよい。具体的には、神経オルガノイドが、例えば２～１０個、例えば２～８個、例えば２～５個程度の細胞の塊にまで解離すればよい。
続いて、神経オルガノイドを解離させて得られた細胞を２次元で接着培養する。２次元培養とは、通常の、プレート、ディッシュ等を用いた培養である。実施例において後述するように、２次元培養を行うことにより、純度の高い神経細胞の集団を得ることができる。
２次元培養は、例えば２０日以上、例えば２５日以上、例えば３０日以上行うことが好ましい。２次元培養の期間の上限は特にない。２次元培養は通常の神経細胞の培養に用いられる培地中で行えばよい。このような培地としては、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ培地（ステムセルテクノロジーズ社）等が挙げられる。
実施例において後述するように、２次元培養後の神経細胞は、タウ関連疾患の病理学的側面を十分に反映しており、タウ関連疾患モデルとして利用することができる。
［タウ関連疾患モデル］
１実施形態において、本発明は、野生型の神経細胞と比較して、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能が有意に異なり、ＭＡＰＴ遺伝子に変異を有する神経細胞からなるタウ関連疾患モデルを提供する。本実施形態のタウ関連疾患モデルは、例えば、上述した製造方法により製造することができる。
本実施形態のタウ関連疾患モデルは、ＭＡＰＴ遺伝子に変異を有している。ＭＡＰＴ遺伝子の変異については上述したものと同様である。
実施例において後述するように、本実施形態のタウ関連疾患モデルは、野生型の神経細胞と比較して、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度、軸索輸送機能が有意に異なっており、タウ関連疾患の病理学的側面を反映している。
タウタンパク質のリン酸化の程度は、ＭＡＰＴ遺伝子の変異の種類により、野生型の神経細胞と比較して上昇している場合もあるし、減少している場合もある。例えば、タウ関連疾患モデルがＲ４０６Ｗ変異型タウタンパク質を有している場合、タウタンパク質のリン酸化の程度は有意に減少する。
タウタンパク質のリン酸化は、抗リン酸化タウ抗体を用いたウエスタンブロッティング等により測定することができる。また、タウタンパク質の断片化は、抗タウ抗体を用いたウエスタンブロッティング等により測定することができる。
また、軸索の変質は、例えば、神経細胞の免疫染色画像に基づいて測定することができる。例えば、実施例において後述するように、タウ関連疾患モデルがＲ４０６Ｗ変異型タウタンパク質を有している場合、神経細胞の軸索に多数の小さなパンクタ（ｐｕｎｃｔａ）が観察される。
神経細胞の軸索内ではタンパク質の合成がほとんど行われないことが知られている。このため、軸索内及びシナプス領域で必要なほとんどのタンパク質は細胞体で合成された後、軸索の中を輸送される必要がある。この軸索内での物質輸送を軸索輸送という。軸索輸送では、モータータンパク質（キネシン、ダイニン）によって様々な膜小器官やタンパク質複合体が微小管に沿って両方向性に運ばれており、神経細胞の生存、形態形成及び機能発現にとって基本的でかつ重要な役割を果たしている。軸索では、微小管の方向がそろっており、＋（プラス）端が軸索末端に、－（マイナス）端が細胞体に向いている。順向性輸送は微小管の＋端方向への輸送である。一方、逆向性輸送は微小管の－端方向への輸送である。
軸索輸送機能は、例えば、顕微鏡観察により、単位長さあたりの軸索に含まれるミトコンドリアの数を測定することにより評価することができる。あるいは、ライブ画像解析により、順方向に移動するミトコンドリアの割合、逆方向に移動するミトコンドリアの割合、静止しているミトコンドリアの割合等を測定することにより評価することができる。
［タウ関連疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で上述したタウ関連疾患モデルを培養する工程と、前記タウ関連疾患モデルの、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能を測定する工程と、測定されたタウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に異なることが、前記被験物質がタウ関連疾患の予防剤又は治療剤であることを示す、タウ関連疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
本実施形態のスクリーニング方法において、タウタンパク質のリン酸化、タウタンパク質の断片化、軸索の変質、軸索輸送機能については上述したものと同様である。被験物質の存在下で測定された、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度、軸索輸送機能が、被験物質の非存在下と比較して有意に変化した場合、当該被験物質は、タウ関連疾患の予防剤又は治療剤になり得ると判断することができる。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ＭＡＰＴ Ｒ４０６Ｗ ｉＰＳ細胞の作製）
同じ血統の２人の日本人の前頭側頭型認知症患者（以下、「患者＃１」及び「患者＃２」という場合がある。）からＭＡＰＴ Ｒ４０６Ｗ ｉＰＳ細胞を樹立した。ｉＰＳ細胞はエピソーマルベクターを用いて作製した。これらの患者の初期の症状は記憶障害であった。ＤＮＡシーケンシングの結果、これらの患者のＭＡＰＴ遺伝子における変異はヘテロ接合であることが確認された。ＭＡＰＴ遺伝子には、Ｒ４０６Ｗ以外の変異は存在しなかった。
また、患者＃１及び＃２とは別の血統の患者（以下、「患者＃３」という場合がある。）からも上記と同様にしてＭＡＰＴ Ｒ４０６Ｗ ｉＰＳ細胞を樹立した。患者＃３のＭＡＰＴ遺伝子における変異もヘテロ接合であることが確認された。
［実験例２］
（ゲノム編集によるｉＰＳ細胞株の同質遺伝子系統の作製）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集により、実験例１で作製した各ｉＰＳ細胞から、野生型株であるｉＰＳ細胞、及び、ホモ接合の変異型株であるｉＰＳ細胞の同質遺伝子系統をそれぞれ作製した。ターゲッティングベクターとして、３’アームがＭＡＰＴ遺伝子の変異部位を含み、３’アームと５’アームの間に薬剤選択可能なセレクションカセットを含むベクターを設計して使用した。セレクションカセットは、両末端にＰｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲを配置することにより除去可能に設計した。図１（ａ）及び（ｂ）は、ターゲッティングベクターの構造を示す模式図である。図１（ａ）は、ＭＡＰＴ遺伝子座を野生型に組換えるためのターゲッティングベクターの模式図であり、図１（ｂ）は、ＭＡＰＴ遺伝子座を変異型に組換えるためのターゲッティングベクターの模式図である。
ゲノム編集を行った後、薬剤選択を行い、生存したｉＰＳ細胞のコロニーをピックアップしてＭＡＰＴ遺伝子の変異部位の塩基配列を解析した。図２（ａ）～（ｃ）は、塩基配列の解析結果を示す波形である。図２（ａ）はヘテロ接合の変異型株である、患者由来のｉＰＳ細胞株の結果を示し、図２（ｂ）は、ゲノム編集により作製した、同質遺伝子系統の野生型のｉＰＳ細胞の結果を示し、図２（ｃ）は、ゲノム編集により作製した、同質遺伝子系統のホモ接合の変異型株であるｉＰＳ細胞の結果を示す。
その結果、ＭＡＰＴ遺伝子の変異部位のゲノム編集により、野生型のｉＰＳ細胞と、同質遺伝子系統のホモ接合の変異型株であるｉＰＳ細胞が得られたことが確認された。その後、ゲノム編集後の各ｉＰＳ細胞にＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをトランスフェクションし、セレクションカセットを除去した。続いて、ＤＮＡシーケンシングにより、ゲノムＤＮＡへのインテグレーションや他の意図しない変異が導入されていないことを確認した。
［実験例３］
（タウ関連疾患モデルの作製）
実験例２で作製した各ｉＰＳ細胞株を神経細胞に分化させた。図３は神経細胞への分化のスケジュールを示す模式図及び細胞の写真である。
まず、３０日間の３次元培養により、神経オルガノイドを作製した。具体的には、まず、０日目にｉＰＳ細胞を単一細胞に解離し、３×１０５個／ウェルで低吸着性のＶ型９６ウェルプレート（住友ベークライト）に播種し、胚葉体を形成させた。培地としては、３０μＭ Ｙ－２７６３２、５μＭ ＳＢ－４３１５４２、２．５μＭ ＩＷＰ－２を添加したＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（味の素）を使用した。続いて、胚葉体を６日間培養し、神経組織の前脳に誘導した。
続いて、培養６日目に、培地を神経誘導培地に交換した。神経誘導培地の組成は、１（ｖ／ｖ）％Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１（ｖ／ｖ）％Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１（ｖ／ｖ）％非必須アミノ酸－ＭＥＭ、２．５μＭ ＩＷＰ－２、５μｇ／ｍＬへパラン硫酸ナトリウム（シグマ－アルドリッチ社）、１（ｖ／ｖ）％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）であった。
続いて、培養９日目に、培養体を低吸着性の６ウェルプレート（コーニング社）に移し、分化培地中で培養した。分化培地の組成は、１（ｖ／ｖ）％Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、２（ｖ／ｖ）％ビタミンＡ不含Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１００μＭ ２－メルカプトエタノール、２．５μｇ／ｍＬインスリン（富士フイルム和光純薬）、１（ｖ／ｖ）％Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、０．５（ｖ／ｖ）％非必須アミノ酸－ＭＥＭ、１（ｖ／ｖ）％マトリゲル（登録商標、コーニング社）を含む、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）の１：１混合培地であった。胚葉体を含むプレートは、シェーカー上で維持し、栄養分及び酸素の吸収を促進した。
続いて、培養１５日目に、培地を、ビタミンＡ含有Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含む分化培地に交換した。その後、５～７日ごとに培地を交換した。
続いて、培養３０日目に、神経細胞分散液（ケー・エー・シー社）を用いて神経オルガノイドを単一細胞に解離させた。続いて、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個の細胞を、６０μｇ／ｍＬポリ－Ｌ－オルニチン及び１０μｇ／ｍＬラミニンをコートした、９６ウェルプレート、４８ウェルプレート、１２ウェルプレートにそれぞれ播種し、更に３０日間培養した。培地には、１（ｖ／ｖ）％ビタミンＡ含有Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、０．２５（ｖ／ｖ）％Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１（ｖ／ｖ）％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含む、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。その結果、細胞の２次元培養物が得られた。
続いて、免疫蛍光染色により得られた細胞を評価した。具体的には、神経細胞マーカーであるＭＡＰ２、神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリン、前脳マーカー（皮質神経細胞マーカー）であるＴＢＲ１、前脳マーカー（皮質神経細胞マーカー）であるＦＯＸＧ１、成熟した神経細胞マーカーであるＮＥＵＮ、及び、タウタンパク質を染色した。
図４は、細胞の免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図４中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示す。
その結果、得られた細胞は、ＭＡＰ２陽性、ＴＢＲ１陽性、タウ陽性であり、純粋な神経細胞集団であることが明らかとなった。後述するように、上記の方法により分化させた細胞をタウ関連疾患モデルとして使用できることが明らかとなった。
図５（ａ）～（ｅ）は、各マーカー陽性細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。図５（ａ）はＭＡＰ２の結果であり、図５（ｂ）はβＩＩＩチューブリンの結果であり、図５（ｃ）はＴＢＲ１の結果であり、図５（ｄ）はＮＥＵＮの結果であり、図５（ｅ）はＦＯＸＧ１の結果である。その結果、各ｉＰＳ細胞から分化した神経細胞は、８５％超がＭＡＰ２陽性且つβＩＩＩチューブリン陽性であり、神経細胞であることが明らかとなった。また、これらの細胞はＴＢＲ１陽性、ＦＯＸＧ１陽性、ＮＥＵＮ陽性であることが明らかとなった。したがって、これらの細胞は皮質神経細胞であることが明らかとなった。
［実験例４］
（Ｒ４０６Ｗ変異型タウタンパク質は様々なキナーゼによるリン酸化の程度が低下していた）
続いて、皮質神経細胞におけるタウタンパク質のリン酸化を検討した。アルツハイマー病や前頭側頭型認知症等の神経変性疾患では、タウタンパク質は複数の位置で高度にリン酸化されていることが知られている。一方、興味深いことに、Ｒ４０６Ｗ変異型タウタンパク質は変異部位の近傍の特定の位置においてリン酸化の程度が低下することが報告されている。
本実験例では、実験例３と同様にして作製したタウ関連疾患モデルのＳ４０４（第４０４番目のセリン残基）及びＳ４０９（第４０９番目のセリン残基）のリン酸化をウエスタンブロッティングにより解析した。
図６（ａ）は、Ｓ４０４のリン酸化を検討した結果を示す写真である。また、図６（ｂ）及び（ｃ）は、図６（ａ）の結果を数値化したグラフである。図６（ｂ）中、「＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。また、図６（ｃ）は、Ｓ４０９のリン酸化を検討した結果を示す写真である。また、図６（ｄ）は、Ｓ４０９のリン酸化を検討した結果を示す写真である。
図６（ａ）～（ｄ）中、「ｐＳ４０４」は、Ｓ４０４がリン酸化したタウタンパク質に対する抗体で染色した結果であることを示し、「ｐＳ４０９」は、Ｓ４０９がリン酸化したタウタンパク質に対する抗体で染色した結果であることを示し、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「Ｔｏｔａｌ ｔａｕ」は全タウタンパク質を染色した結果であることを示し、「ＧＡＰＤＨ」は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を検出した結果を示す。
その結果、Ｒ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体及びホモ接合体の双方において、野生型と比較して、Ｓ４０４及びＳ４０９のリン酸化の程度が有意に低下したことが明らかとなった。
［実験例５］
（Ｒ４０６Ｗ変異型タウはＣ末端側が切断された）
実験例３と同様にして作製したタウ関連疾患モデルにおけるＲ４０６Ｗ変異型タウタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した結果、Ｒ４０６Ｗ変異型タウタンパク質は、３５ｋＤから４５ｋＤに断片化されることが明らかとなった。これは特に、タウタンパク質のＮ末端を認識するＴａｕ１２抗体を用いてウエスタンブロッティングした場合に顕著であった。したがって、タウタンパク質のＣ末端側が切断され断片化されたと考えられた。
図７（ａ）はＴａｕ１２抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。また、図７（ｂ）は、図７（ａ）の結果に基づいて、３５ｋＤから４５ｋＤに断片化したタウタンパク質の量を数値化したグラフである。図７（ａ）及び（ｂ）中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「ＧＡＰＤＨ」は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を検出した結果を示す。また、図７（ｂ）中、「＊＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
その結果、Ｒ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体及びホモ接合体の双方において、野生型と比較して、断片化したタウタンパク質が有意に増加したことが明らかとなった。
［実験例６］
（変異型神経細胞の表現型の検討）
実験例３と同様にして作製したタウ関連疾患モデルを用いて、Ｒ４０６Ｗ変異型タウタンパク質により誘導される細胞表現型を検討した。
まず、タウ関連疾患モデルの神経細胞を免疫染色し、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００（ＧＥヘルスケア社）で解析してＭＡＰ２及びタウタンパク質の共局在を検討した。
図８（ａ）は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍを示す。図８（ａ）中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「ＤＡＰＩ」は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールで核を染色した結果であることを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は、画像を重ね合わせた結果であることを示す。
その結果、Ｒ４０６Ｗ変異体では、ＭＡＰ２及びタウタンパク質の共局在の割合が上昇することが明らかとなった。
また、図８（ｂ）は、免疫染色の結果に基づいて、樹状突起に局在したタウタンパク質の割合、及び、軸索に局在したタウタンパク質の割合を数値化したグラフである。ＭＡＰ２陽性領域に局在するタウタンパク質を、樹状突起に局在したタウタンパク質として測定した。また、βＩＩＩチューブリン陽性且つＭＡＰ２陰性領域に局在したタウタンパク質を、軸索に局在したタウタンパク質として測定した。
図８（ｂ）中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃３」は患者＃３由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「ｈｅｔ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「ｈｏｍ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「Ｄｅｎｄｒｉｔｅ」は樹状突起に局在したタウタンパク質の割合を示し、「Ａｘｏｎ」は軸索に局在したタウタンパク質の割合を示す。また、「＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
その結果、変異型タウタンパク質はＭＡＰ２陽性の樹状突起に局在した割合が上昇することが明らかとなった。この結果から、Ｒ４０６Ｗ変異型タウタンパク質は、本来タウタンパク質が局在する軸索ではなく、樹状突起に誤局在する傾向があることが明らかとなった。
また、神経細胞の形態を免疫染色により検討した。図９は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍを示す。図９中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「ＤＡＰＩ」は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールで核を染色した結果であることを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は、画像を重ね合わせた結果であることを示す。
図９に示すように、βＩＩＩチューブリンを染色した結果、Ｒ４０６Ｗ変異体の神経細胞では、微小管に変質が観察された。そして、変異体の神経細胞の軸索は、多数の小さなパンクタ（ｐｕｎｃｔａ）から構成されていることが明らかとなった。
［実験例７］
（微小管の不安定化の検討）
実験例３と同様にして作製したタウ関連疾患モデルを、微小管安定化剤であるエポチロンＤ（ＥｐｏＤ）で処理し、免疫染色によりβＩＩＩチューブリンを染色した。具体的には、タウ関連疾患モデルを、終濃度２０ｎＭのエポチロンＤ（アブカム社）の存在下及び非存在下で２４時間インキュベートした後、免疫染色を行った。
図１０（ａ）は免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍを示す。図１０（ａ）中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示す。また、「＋ＥｐｏＤ」はエポチロンＤ処理を行った結果であることを示す。
また、図１０（ｂ）は、βＩＩＩチューブリンの免疫染色の結果に基づいて神経突起のパンクタの数を測定した結果を示すグラフである。図１０（ｂ）中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「ｈｅｔ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「ｈｏｍ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「＋ＥｐｏＤ」はエポチロンＤ処理を行った結果であることを示す。また、「＊＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。また、グラフの縦軸は１μｍあたりの神経突起のパンクタの数を示す。
その結果、エポチロンＤ処理により、微小管の変質が修復されたことが明らかとなった。
以上の結果から、Ｒ４０６Ｗ変異型タウタンパク質が、微小管の動力学又は安定性を変化させることにより、軸索の変質を誘導することが明らかとなった。
［実験例８］
（変異型神経細胞におけるミトコンドリア輸送の検討）
変異型神経細胞におけるミトコンドリア輸送を検討した。まず、実験例３と同様にして作製したタウ関連疾患モデルに、Ｍｉｔｏ－ｅＹＦＰの発現ベクター及びｔｄＴｏｍａｔｏの発現ベクターを導入した。続いて、蛍光顕微鏡観察により、軸索上のミトコンドリアの数を測定した。Ｍｉｔｏ－ｅＹＦＰは、ミトコンドリアに特異的に局在する蛍光タンパク質である。
図１１（ａ）は、代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１０μｍを示す。また、図１１（ｂ）は、蛍光顕微鏡写真に基づいて、軸索上に存在するミトコンドリアの数を測定した結果を示すグラフである。
図１１（ａ）及び（ｂ）中、「２０１Ｂ７」は健常人由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ＃２」は患者＃２由来のｉＰＳ細胞を分化させた結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「Ｈｅｔｅｒｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「Ｈｏｍｏ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「＋ＥｐｏＤ」はエポチロンＤ処理を行った結果であることを示す。また、「＊＊＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、ｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。グラフの縦軸は神経突起１μｍあたりのミトコンドリアの数を示す。
また、図１２は、共焦点レーザー顕微鏡（型番「ＦＶ３０００」、オリンパス社）を用いたライブ画像解析により、順方向に移動するミトコンドリア、逆方向に移動するミトコンドリア及び静止しているミトコンドリアの割合を測定した結果を示すグラフである。図１２中、「ＷＴ」は野生型であることを示し、「ｈｅｔ」はＲ４０６Ｗ変異体のヘテロ接合体であることを示し、「ｈｏｍ」はＲ４０６Ｗ変異体のホモ接合体であることを示し、「Ａｎｔｅｒｏｇｒａｄｅ」は順方向に移動するミトコンドリアを示し、「Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ」は逆方向に移動するミトコンドリアを示し、「Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ」は静止しているミトコンドリアを示す。また、「＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。グラフの縦軸はミトコンドリアの割合（％）を示す。
その結果、変異型神経細胞では、野生型の神経細胞と比較して、静止したミトコンドリアの割合が低く、逆方向移動するミトコンドリアの割合が高いことが明らかとなった。以上の結果は、変異型タウタンパク質により誘導された微小管の不安定化が、軸索輸送機構の機能不全の原因であることを示す。
本発明によれば、タウ関連疾患モデルを製造する技術を提供することができる。

Claims (3)

  1. Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を３次元培養し、神経オルガノイドを形成する工程と、
    前記神経オルガノイドを単一細胞に解離させて２次元で接着培養し、神経細胞を得る工程と、
    を含み、前記神経細胞がタウ関連疾患モデルであり、
    前記変異が、エクソン９～１３又はイントロン１０に存在する１つ又は複数の変異であり、
    エクソン９～１３に存在する前記変異が、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｓ２８５Ｒ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｓ３０５Ｎ、Ｓ３０３Ｓ、Ｓ３０５Ｓ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｇ３８９Ｒ及びＲ４０６Ｗからなる群より選択される変異型タウタンパク質をコードする変異であり、
    イントロン１０に存在する前記変異が、Ｅｘ１０＋３、Ｅｘ１０＋１２、Ｅｘ１０＋１３、Ｅｘ１０＋１４、Ｅｘ１０＋１６、Ｅｘ１０＋１９及びＥｘ１０＋２９からなる群より選択される塩基における変異である、タウ関連疾患モデルの製造方法。
  2. 請求項１に記載の製造方法により製造された、タウ関連疾患モデル。
  3. 被験物質の存在下で請求項２に記載のタウ関連疾患モデルを培養する工程と、
    前記タウ関連疾患モデルの、タウタンパク質のリン酸化の程度、タウタンパク質の断片化の程度、軸索の変質の程度又は軸索輸送機能を測定する工程と、を備え、
    前記被験物質の非存在下と比較して測定されたタウタンパク質のリン酸化が有意に減少又は増加し、タウタンパク質の断片化が増加し、軸索が変質し、又は軸索輸送機能の不全が生じていることが、前記被験物質がタウ関連疾患の予防剤又は治療剤であることを示す、タウ関連疾患の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
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