JP7391339B2

JP7391339B2 - 細胞製造装置及びその製造方法

Info

Publication number: JP7391339B2
Application number: JP2021542013A
Authority: JP
Inventors: 一訓伴; 聡木下; 剛士田邊; 亮二平出
Original assignee: Fanuc Corp; I Peace Inc
Current assignee: Fanuc Corp; I Peace Inc
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2040-05-28
Also published as: JPWO2021038996A1; US20230038829A1; WO2021038996A1; EP4023741A1; CN114341341A; EP4023741A4

Description

本発明は、細胞製造装置及びその製造方法に関し、特に細胞製造装置の製造の合理化と自動化システムへの適合性を同時に実現した細胞製造装置及びその製造方法に関する。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期杯から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植法に利用可能であると考えられている。しかし、ＥＳ細胞の移植は、臓器移植と同様に、拒絶反応を惹起するという問題がある。また、ヒト杯を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から反対意見が多い。

これに対し、京都大学山中伸弥教授は、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功し、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞であり、細胞移植法への利用が期待されている。

ｉＰＳ細胞のような誘導幹細胞は、細胞に遺伝子等の誘導因子を導入することによって樹立され、拡大培養、凍結保存される。しかし、例えば臨床用ｉＰＳ細胞（ＧＬＰ，ＧＭＰグレード）等を作製するには、非常に綺麗に保たれたクリーンルームを必要とし、高額な維持コストが掛かる。産業化のためには、クリーンルームの運用方法をいかに効率化してコスト削減に努めるかが課題になっていた。

またｉＰＳ細胞の作製は手作業によるところが大きいが、臨床用ｉＰＳ細胞を作製できる技術者は少ない。幹細胞の樹立から保存までの一連の作業が複雑であるという問題がある。臨床用の細胞培養では、標準的な工程（ＳＯＰ：Standard Of Process）の確認と、ＳＯＰに従った操作と、ＳＯＰ通りに実施されたか否かの確認、という３つのステップを行う必要があり、これらステップを人が行う事は非常に非生産的である。細胞培養は２４時間毎日管理する必要があり、幹細胞の保存は何十年にも及ぶため、人材だけで管理するのは限界があった。

そこで、高度に清浄なクリーンルームを不要とし、通常管理区域（例えばＷＨＯ－ＧＭＰ規格において微生物及び微粒子の少なくとも一方がグレードＤレベル又はそれ以上）で作業可能な閉鎖系の細胞製造装置が開発されてきた（例えば、特許文献２参照。）。また人材も排除して複雑な細胞製造工程を自動化するため、細胞製造を補助するロボットを備えた細胞製造システムも開発されている。斯かる細胞製造装置に関する先行技術としては、次の文献が公知である。

特許文献３には、導入前細胞送液路と、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置と、を１つの筐体内にパッケージ化した体細胞製造システムが開示されている。

特許文献４には、培養容器及び流路を閉鎖系にした細胞培養容器が開示されており、細胞培養容器が第一容器内に第二容器を偏心して保持することにより、細胞培養の育成状態が明瞭に観察できる。

特許文献５には、培地貯溜手段、細胞接種手段、及び培養容器が閉鎖系で構成された細胞培養装置が開示されている。細胞培養装置は、培養容器内の細胞の画像から細胞の培養状況を判定し、この判定に基づき培養操作を実行することにより、操作者の労力を軽減している。

特許文献６には、細胞培養チャンバの容積を囲む側壁を有する本体と、細胞培養チャンバを覆う蓋と、本体下部に配置された底板と、を備え、本体には、流入排出コネクタと細胞培養チャンバとの間を流体連通させるマイクロ流体導管を一体形成した細胞培養装置が開示されている。

特許文献７には、マイクロチップの内部空間の気泡を外部空間に移動させる気泡除去手段を備えたマイクロチップ反応装置が開示されている。特許文献８には、第１培養液貯留室及び第２培養液貯留室から気体を排出可能な通気孔を備え、通気孔にエアフィルタを設けた細胞培養装置が開示されている。

特許文献９には、２つの流路が合流する液体混合部を備えた細胞培養プレートが開示されている。特許文献１０には、放射状に分布する微小チャネル部品を支持する基板と、基板上に配置されるカバープレートと、を備え、細胞増殖及び細胞検定を行う装置が開示されている。微小チャネル部品は、液体試料を導入する導入チャネルと、流路面積を相対的に大きくした細胞増殖チャンバ及び検定チャンバと、液体試料を除去する排出チャネルと、を備えている。

特許文献１１は、第一のマイクロ流体チャネルを画定する第一の層と、第二のマイクロ流体チャネルを画定する第二の層と、を備える培養装置が開示されている。

特許文献１２には、流路一体プレート及びベースプレートを備えた細胞培養装置が開示されている。流路一体プレートは、培養液の流路を形成した流路プレートと、培養液の供給及び排出を行うペリスタルティックポンプ群を配置したポンプ部と、を備え、ベースプレートがモータ等の駆動源を備えている。

特許第４１８３７４２号公報特開２０１８－０１９６８５号公報国際公開第２０１８／１５４７８８号国際公開第２０１４／０４９７０１号国際公開第２００７／０５２７１６号特表２０１４－５１４９２６号公報特開２０１４－２２６６２３号公報国際公開第２０１７／１５４８８０号特開２００５－８０６０７号公報特表２００２－５１２７８３号公報特表２０１７－５１３４８３号公報特開２０１７－２２１１６６号公報

従来の装置は、培地貯留リザーバ、培地供給排出流路、細胞培養容器といった細胞培養機能のみを一体的に構成した細胞培養装置が多く、誘導因子導入による、細胞の初期化、リプログラミング、運命転換、ダイレクトリプログラミング、分化転換、分化誘導、形質転換といった細胞誘導機能までを一体化したものは少ない。これら種々の機能部位を閉鎖系で構成するためには、別個の部材をチューブ、ポンプ、コネクタ等を介して閉鎖的に接続するといった煩雑な工程を要するため、製造工数、製造コスト等を増大させる虜がある。また、斯かる装置による細胞製造を完全に自動化するとなると、別個の部材で構成された細胞製造装置がロボットにとって取扱い難いものとなる。

そこで、細胞製造装置の製造の合理化と自動化システムへの適合性を同時に実現する技術が求められている。

本開示の一態様は、複数の機能部位を集約した流体回路を備える細胞作製プレートと、流体回路を外部空間に対して閉鎖的に接続する閉鎖式コネクタと、を備え、流体回路は、複数の機能部位として、閉鎖式コネクタを介して流体を流体回路内に注入又は流体回路外に排出する注入排出部と、注入した流体に基づき細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養部と、相互に不混和な複数の流体を混合する流体混合部と、を備え、該流体混合部は、相互に不混和な流体を１本の流路に合流させる流体合流路を含み、前記流体混合部は、前記流体合流路により合流した流体に混合流を発生させる混合流発生路をさらに含み、該混合流発生路は流体の進行方向とは異なる方向に流路幅を変化させる部分と前記異なる方向に流路深さを変化させる部分とを流体の進行方向に対して交互に備えている、細胞製造装置を提供する。
本開示の他の態様は、複数の機能部位を集約した流体回路を備える平板を成型する工程と、流体回路を覆うように蓋を平板に固着して細胞作製プレートを形成する工程と、流体回路を外部空間に対して閉鎖的に接続する閉鎖式コネクタを細胞作製プレートに取付ける工程と、を含み、流体回路は、複数の機能部位として、閉鎖式コネクタを介して流体を流体回路内に注入又は流体回路外に排出する注入排出部と、注入した流体に基づき細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養部と、相互に不混和な複数の流体を混合する流体混合部と、を備え、該流体混合部は、相互に不混和な流体を１本の流路に合流させる流体合流路を含み、前記流体混合部は、前記流体合流路により合流した流体に混合流を発生させる混合流発生路をさらに含み、該混合流発生路は流体の進行方向とは異なる方向に流路幅を変化させる部分と前記異なる方向に流路深さを変化させる部分とを流体の進行方向に対して交互に備えている、細胞製造装置の製造方法を提供する。

本開示の態様によれば、複数の機能部位が１つの細胞作製プレート内に集約されるため、別個の部品をチューブ、ポンプ、コネクタ等を介して閉鎖的に接続するといった製造工程が不要となり、細胞製造装置の製造工数、製造コスト等が削減される。また同時に、注入又は排出した流体によって押出又は引出される流体が流体回路内に閉じ込められるため、細胞作製プレートの外部に流体を逃がしたり又は外部から流体を取込んだりする必要がなく、流体回路の密閉性を保ちながら細胞作製プレートをプレート状に形成することが可能になる。斯かる細胞作製プレートは、ロボットにとって取扱い易く、自動化システムへの適合性を向上させる。

一実施形態における細胞製造装置の構成図である。細胞作製プレートの一例を示す分解斜視図である。平板と蓋の固着方法の一例を示す拡大断面図である。平板と蓋の固着方法の一例を示す拡大断面図である。混合流路の一例を示す平面図である。混合流路の一例を示すＢ－Ｂ’断面図である。破砕流路の一例を示す拡大斜視図である。交差流路の一例を示す拡大斜視図である。ベースプレートの一例を示す正面斜視図である。ベースプレートの一例を示す背面斜視図である。

以下、添付図面を参照して本開示の実施形態を詳細に説明する。各図面において、同一又は類似の構成要素には同一又は類似の符号が付与されている。また、以下に記載する実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の技術的範囲及び用語の意義を限定するものではない。なお、本書における用語「閉鎖」とは、微生物、ウイルス等の汚染源が装置内部に侵入して生物学的汚染を発生しないこと、及び／又は装置内部の流体（細胞、微生物、ウイルス粒子、タンパク質、核酸等の物質を含む。）が漏出して交叉汚染を発生しないこと、及び／又は病原体に感染したドナーの流体を装置内部で取扱ってもバイオハザードを発生しないことを意味する。但し、本書における装置は、例えば二酸化炭素、窒素、酸素等の汚染源でない流体が装置内部に侵入又は装置外部へ漏出するように構成してもよい。

図１は本実施形態における細胞製造装置１の構成を示している。細胞製造装置１は、誘導因子導入による、細胞の初期化、リプログラミング、運命転換、ダイレクトリプログラミング、分化転換、分化誘導、形質転換等を行う細胞誘導機能を備えた細胞誘導装置であるが、単に培養、拡大培養等を行う細胞培養機能のみを備えた細胞培養装置でもよい。細胞製造装置１は、元細胞（例えば血液細胞、線維芽細胞等の体細胞、又はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞）を含む流体を注入し、元細胞から目的細胞（例えば幹細胞、前駆細胞、最終分化細胞）を製造すると共に、目的細胞を含む流体を排出する。目的細胞として、線維芽細胞、神経細胞、網膜上皮細胞、肝細胞、β細胞、腎細胞、間葉系幹細胞、血液細胞、メガカリオサイト、Ｔ細胞、軟骨細胞、心筋細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、腎細胞、又は他の体細胞等の分化細胞を作製してもよい。細胞製造装置１は、高度にクリーンであるべき部分を全て内部に集約した閉鎖系の細胞処理装置であり、通常管理区域でも使用可能である。装置内部の閉鎖空間は、気体、ウイルス、微生物、不純物等を外部と交換しないように構成される。但し、後述の流体交換フィルタ等を装置に付加的に設けることにより、汚染源でない流体を装置内部と外部で交換可能に構成してもよい。

図１に示すように、細胞製造装置１は細胞作製プレート２及び閉鎖式コネクタ３を備えている。細胞作製プレート２は外部空間Ｓから遮断された閉鎖系の流体回路４を備えており、流体回路４は複数の機能部位を高度に集約した流路を備えている。閉鎖式コネクタ３は、流体回路４へ流体を注入し、又は流体回路４から流体を排出するためのコネクタであり、細胞作製プレート２に取付けられる。閉鎖式コネクタ３は、流体回路４と流体容器を外部空間Ｓに対して閉鎖的に接続するコネクタであり、例えば無菌接続コネクタ、ニードルレスコネクタ、ニードルコネクタ、熱溶断チューブ等でよい。ニードルレスコネクタは、スプリットセプタム型でもよいし、メカニカルバルブ型でもよい。流体容器とは、シリンジ、容積可変バッグ等であり、閉鎖式コネクタ３と流体容器との接続時には流体回路４が流体容器と流体連通する一方、閉鎖式コネクタ３と流体容器との非接続時には流体回路４が外部空間Ｓから遮断される。これにより、流体回路４の生物学的汚染、交叉汚染、及びバイオハザードを防止できる。複数種類の流体の注入又は排出を可能にするため、細胞製造装置１は複数の閉鎖式コネクタ３を備えていることが好ましい。

図２は細胞作製プレート２の一例を示している。図２に示すように、細胞作製プレート２は平板２０及び蓋２１を備えている。平板２０は、例えば生物学的に安全な樹脂、金属等で成形することができる。平板２０は、金型を用いた成型加工、例えば射出成形、圧縮成形等によって成型するのが好ましいが、３Ｄプリンタ等を用いて平板２０を成形してもよい。３Ｄプリンタとしては、光造形、熱溶解積層、粉末焼結、インクジェット等の種々の造形方式を採用できる。平板２０の表面及び裏面の少なくとも一方に、流体を流す流路として溝２０ａを設け、複数の溝２０ａを組み合わせることによって流体回路４を形成する。また、流体回路４の一部に、溝２０ａの幅又は深さを相対的に大きくした箇所を設け、流体を一時的に貯溜する貯溜槽２０ｂを形成する。溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂの壁面には、poly-HEMA（poly 2-hydroxyethyl methacrylate）をコーティングして細胞非接着性にしてもよい。逆に、細胞が溝２０ａ又は貯溜槽２０ｂに入り難い場合には、溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂの壁面を低タンパク吸着性にしてもよい。溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂの少なくとも一部は、流体、細胞、細胞塊等の経時変化を画像認識センサ、超音波認識センサ等によって観察するため、白色又は黒色とすることが好ましい。

蓋２１は、例えば生物学的に安全な樹脂、石英ガラス等で形成されてもよい。蓋２１（即ち、細胞作製プレート２の少なくとも一部）は、流体回路４内の流体、細胞、細胞塊等の経時変化を画像認識センサ、超音波認識センサ等によって観察するため、透明であることが好ましい。この観察により、適切なタイミングで次の細胞製造工程に移行することが可能になる。蓋２１は、流体回路４を外部空間から遮断するため、生物学的に安全な固着方法、例えば化学結合、溶着結合、接着結合等によって流体回路４を覆うように平板２０に固着される。化学結合としては、シランカップリング剤、プラズマ照射等を用いてもよい。また溶着結合としては、レーザ溶着、超音波溶着等を用いてよく、接着結合としては、紫外線硬化接着剤等を用いてもよい。平板２０と蓋２１の固着後に、細胞作製プレート２に対して殺菌処理、例えば加熱滅菌、ガンマ線滅菌、紫外線滅菌、電子線滅菌等を施し、流体回路４を高度にクリーンな状態にする。

図３Ａ－図３Ｂは平板と蓋の固着方法の一例を示している。流体回路４を外部空間から遮断するため、溝２０ａと貯溜槽２０ｂの両側に土手部２０ｃを予め形成しておき、平板２０を蓋２１で覆い、少なくとも土手部２０ｃにレーザ光、超音波等を照射又は印加して土手部２０ｃを加熱し、平板２０と蓋２１を溶着することによって溝２０ａと貯溜槽２０ｂを密封してもよい。或いは、溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂを含む平板２０に対して蓋２１をして、少なくとも溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂ以外の部分をレーザ光、超音波等を照射又は印加して加熱し、平板２０と蓋２１を溶着することによって溝２０ａと貯溜槽２０ｂを密封してもよい。この場合、溝２０ａ及び貯溜槽２０ｂ以外の部分が全て固着されるため、固着強度が高まる。

図１を再び参照すると、流体回路４は、複数の機能部位として、注入排出部１０及び細胞誘導培養部１３を少なくとも備えている。流体回路４は、所望により、容積可変部１１、移送部１２、流体溜め部１４、流体混合部１５、細胞分離部１６、及び細胞塊破砕部１７を備えていてもよい。これら種々の機能部位が１つの細胞作製プレート２内に集約されるため、別個の部品をチューブ、ポンプ、コネクタ等を介して閉鎖的に接続するといった製造工程が不要となり、細胞製造装置１の製造工数、製造コスト等が削減される。

注入排出部１０は、閉鎖式コネクタ３を介して流体を流体回路４内に注入又は排出する注入排出チャネルを備えている。複数種類の流体を注入又は排出可能にするため、注入排出部１０は複数の注入排出チャネル１０ａ－１０ｆを備えていることが好ましい。例えば、第１注入排出チャネル１０ａは元細胞を含む流体等を注入又は排出可能であり、第２注入排出チャネル１０ｂは、元細胞分離用試薬、抗凝固剤、リン酸緩衝生理食塩水等の流体を注入又は排出可能である。また第３注入排出チャネル１０ｃは誘導因子導入試薬等の流体を注入又は排出可能であり、第４注入排出チャネル１０ｄは、初期化用又は誘導用培地等の種々の培地、トリプシン代替組替え酵素等の細胞剥離試薬、シングルセル分離試薬、細胞間接着剥離薬等の流体を注入又は排出可能である。誘導用培地は、初期化用培地、リプログラミング用培地、運命転換用培地、ダイレクトプログラミング用培地、分化転換用培地、分化誘導用培地、形質転換用培地等を含む。さらに第５注入排出チャネル１０ｅは誘導及び培養の少なくとも一方を施した細胞を含む流体をサンプルとして流体容器１９に排出又は注入可能であり、第６注入排出チャネル１０ｆは目的細胞を含む流体を流体容器に排出又は注入可能である。サンプル排出用の流体容器１９は、閉鎖式コネクタ３、例えば熱溶断チューブに接続する容積可変バッグ等でよい。また、目的細胞を含む流体を排出する際に、第６注入排出チャネル１０ｆの周囲に液体窒素等の冷媒を供給し、目的細胞を含む流体を凍結させて細胞作製プレートをシーリングしてもよいし、又は第６注入排出チャネル１０ｆから閉鎖式コネクタ３を介して排出した流体容器を液体窒素等の冷媒で凍結してもよい。

容積可変部１１は、注入又は排出した流体によって押出又は引出される流体を貯溜する物理的又は化学的な容積可変材を備えている。流体回路４内に元々入っていた流体を逃がす流体逃がし流路を設け、流体逃がし流路に物理的な容積可変材を接続するか、又は流体逃がし流路に一定の圧力で開閉する圧力弁を設けて貯溜槽に化学的な容積可変材を留置することにより、流体回路４の密閉性を保ちながら流体の移動を可能にする。物理的な容積可変材は、例えば柔軟性バッグ、シリンジ等でよい。化学的な容積可変材は、例えばソーダ石灰、シリカゲル等の流体吸収剤と、流体吸収剤を留置する貯溜槽とは別の貯溜槽に留置した流体放出剤と、を含んでいてよい。容積可変材により、閉鎖された流体回路４の内圧が概ね一定になると共に、注入又は排出した流体によって押出又は引出される流体が細胞作製プレート２内に閉じ込められるため、細胞作製プレート２の外部に流体を逃がしたり又は外部から流体を取込んだりする必要がなく、流体回路４の密閉性を保ちながら細胞作製プレート２をプレート状に形成することが可能になる。このような細胞作製プレート２はロボットにとって取扱い易い。

移送部１２は、流体回路４内で流体を移送するポンプを備えている。ポンプは、流量制御可能な容積式ポンプ、例えば回転ポンプ、往復ポンプ等でよい。回転ポンプとしては、ペリスタルティックポンプが好ましい。ペリスタルティックポンプの場合、流路の端部に設けたコネクタに柔軟性チューブを密閉接続し、チューブをローラで扱くことによって流体を移送する。チューブはローラで遮断されているので、ポンプ停止時は、流体の流れが遮断され、流量制御が可能となる。また往復ポンプとしては、ダイヤフラムポンプが望ましい。但しダイヤフラムポンプの場合、ダイヤフラムが流路を遮断しないため、流路遮断弁を併用することにより、流量制御が可能になる。

適切なタイミングで適切な機能部位に流体を移送するため、移送部１２は複数のポンプＰ１－Ｐ８を備えていることが好ましい。例えば、第１ポンプＰ１－第３ポンプＰ３は流体溜め部Ａ１－Ａ３に貯溜する流体を適切なタイミングで移送し、第４ポンプＰ４及び第８ポンプＰ８は細胞分離部１６に貯溜する流体を適切なタイミングで移送する。第５ポンプＰ５は流体溜め部Ａ４に貯溜する流体を適切なタイミングで移送し、第６ポンプＰ６－第７ポンプＰ７は細胞誘導培養部１３に貯溜する流体を適切なタイミングで移送する。ポンプとして例えばペリスタルティックポンプを使用する場合、ポンプが確実に回転したか、又は適切な角度だけ回転したか等、ポンプが正常に作動しているか否かの情報を取得するために、ポンプの回転主軸に回転量を検知できるロータリーエンコーダを備えてもよい。或いは、例えばポンプの回転主軸端部に視覚的な目印を設けておき、画像認識センサによって目印の回転運動を画像で直接捉えてもよい。ポンプによる移送が確実に行われていることを確認するため、ポンプの前段又は後段に流量計測部（図示せず）をさらに備えていてもよい。流量計測部は、例えば移送部に連通する流路及び貯溜槽の少なくとも一方に隣接して設けた流量センサ、又は移送部に連通する流路及び貯溜槽の少なくとも一方における流体の経時変化を画像に捉える画像認識センサ等でよい。流量センサは、例えばカルマン渦式、羽根車式、ダイヤフラム式等、細胞に悪影響を及ぼさない種々の計測方式を採用でき、直接流体の流量情報を取得する。画像認識センサは、透明な蓋２１を介して外部カメラ等から画像認識することによって流体の動きから流量情報を取得する。画像認識センサは、本書に記載の他の画像認識センサを流用してもよく、これにより部品点数及び製造コストを低減できる。

細胞誘導培養部１３は、移送した流体に基づき細胞の誘導及び培養の少なくとも一方を行う細胞誘導培養槽１３ａと、細胞誘導培養槽１３ａに流体連通していて培地を循環させる培地循環路１３ｂと、を備えている。細胞誘導培養槽１３ａは、加温素子によって所定の培養温度、例えば３７℃に加温される。培地循環路１３ｂは、冷却素子によって所定の培地品質保持温度、例えば４℃－８℃に冷却される。細胞誘導培養槽１３ａは、密閉された状態であり、二酸化炭素、窒素、酸素等の流体を供給されなくてもよいが、細胞誘導培養槽１３ａ及び培地循環路１３ｂの少なくとも一方に、二酸化炭素、窒素、酸素等の流体を装置内部と外部で交換する流体交換フィルタをさらに備えていてもよい。また、細胞誘導培養槽１３ａは、細胞浮遊培養を行う三次元培養槽でよいが、接着培養を行う二次元培養槽でもよい。接着培養のため、細胞誘導培養槽１３ａは、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、ゼラチン、及びラミニン、ラミニンフラグメント等の細胞接着用コーティング剤でコーティングされてもよいし、又は中空糸を充填されていてもよい。さらに、細胞誘導培養槽１３ａは、培養槽３０と、培養槽３０に培地を供給する培地槽３１と、を一体的に備えていてもよい。この場合、細胞誘導培養槽１３ａは、培養槽３０と培地槽３１との間に特定成分のみの行き来を許容する特定成分透過部材３２、例えば半透膜を備えていることが好ましい。特定成分透過部材３２は、例えば種々の培地、細胞接着用コーティング剤、細胞剥離用試薬等の特定成分を透過する。

細胞誘導培養部１３は、使用した培地のｐＨ値を測定するｐＨ測定部１３ｃをさらに備えていてもよい。ｐＨ測定部１３ｃは、使用した培地のｐＨ値を測定するため、培地循環路１３ｂ又は細胞誘導培養槽１３ａに設けることが好ましい。ｐＨ測定部１３ｃは、例えば画像認識センサ、電極計測センサ等でよい。画像認識センサはｐＨ値を透明な蓋を介して外部カメラ等で色相計測する。電極計測センサはガラス電極法によってｐＨ値を計測する。色相計測の場合、培地循環路１３ｂの少なくとも一部（例えば、色相計測箇所の底面等）を白色とすることにより、色相を正確に検出できるようになる。このｐＨ値により、培地の状態を定量的に把握することが可能になる。また、画像上の細胞の像の輪郭を鮮明にするため、細胞誘導培養槽１３ａの前方、周囲方向（例えば、観察面と直交する方向）、及び後方のうちの少なくとも１つから照明を当てる照明部をさらに備えていることが好ましい。照明部は、例えばＬＥＤ照明等を含み、細胞作製プレート２の内部に埋め込むか、又は細胞誘導培養槽１３ａを細胞作製プレート２よりも凸状にして細胞作製プレート２の外部に設けてもよい。照明が細胞に到達するように、培養槽３０は光を通す透明部材で覆われていてもよい。

流体溜め部１４は、流体回路４内に注入又は流体回路４外へ排出すべき流体を貯溜する貯溜槽を備えている。複数種類の流体を貯溜可能にするため、流体溜め部１４は複数の貯溜槽Ａ１－Ａ４を備えていることが好ましい。貯溜槽Ａ１－Ａ４は、流路の幅又は深さを相対的に大きくした箇所として形成され、種々の流体を適切なタイミングで所定量だけ利用するのを可能にする。例えば、第１貯溜槽Ａ１は元細胞を含む流体を貯溜し、第２貯溜槽Ａ２は、元細胞分離用試薬、抗凝固剤、リン酸緩衝生理食塩水等の流体を貯溜し、第３貯溜槽Ａ３は誘導因子導入試薬等の流体を貯溜し、第４貯液槽Ａ４は種々の培地、細胞接着用コーティング剤、細胞剥離用試薬等の流体を貯溜する。目的細胞を含む流体等を貯溜する貯溜槽を備えていてもよい。

流体混合部１５は、相互に不混和な複数の流体を混合する混合流路を備えている。図４Ａ－図４Ｂは混合流路の一例を示している。混合流路４０は、流体合流路４１及び混合流発生路４２を備えていることが好ましい。流体合流路４１は相互に不混和な流体Ｌ１－Ｌ２を１本の流路に合流させる流路であり、混合流発生路４２は合流した流体Ｌ１－Ｌ２に混合流を発生させる流路である。混合流発生路４２は、例えば流路の断面積を不連続に変化させた流路であり、流体の進行方向とは異なる方向に流路幅及び流路深さの少なくとも一方を変化させていることが好ましい。例えば、混合流発生路４２は、流体の進行方向に対して交互に、流路幅変化部４２ａ及び流路深さ変化部４２ｂを備えている。これにより、流路幅方向に流れが変化する混合流と流路深さ方向に流れが変化する混合流が交互に発生し、相互に不混和な流体Ｌ１－Ｌ２が混合され易くなる。また代替実施形態として、混合流発生路４２は、平板の表面から裏面へ向かって貫通する螺旋流路でもよい。平板の裏面から表面へ流体を戻すため、平板を貫通する２つの螺旋流路を設け、平板の裏面にはこれら螺旋流路間を流体連通する連通路を設ける。

再び図１を参照すると、細胞分離部１６は、細胞又は細胞塊を分離する分離槽Ｄ１－Ｄ２を備えている。例えば、分離槽Ｄ１－Ｄ２は、流路の幅又は深さを相対的に大きくして形成された貯溜槽であり、第１分離槽Ｄ１は元細胞を含む流体から元細胞のみを含む流体に分離し、第２分離槽Ｄ２は比較的大きな細胞塊のみを沈降させることで、それ以外の細胞塊と分離する。元細胞の分離方法としては、元細胞分離用試薬、パニング、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリー等を用いることができる。

細胞塊破砕部１７は、分離した細胞塊（１以上の細胞の塊）をさらに破砕する破砕流路を備えている。図５は破砕流路の一例を示している。破砕流路５０は、上流流路５１と比べて相対的に小さい流路面積を有し、蛇行することが好ましい。流路を蛇行させることにより、潜流を発生させ、細胞塊に剪断応力を加えて大きく成長した細胞塊を小さな細胞塊に分解する。潜流とは、例えば、渦巻きを生じさせる流れ、乱流、逆流、流れの速さの異なる部分を生じさせる流れ、剪断力を生じさせる流れ、及び進行方向の異なる流れが衝突する部分を生じさせる流れのいずれかをいう。

以上のような複数の機能部位が１つの細胞作製プレート２内の流体回路４に集約されているため、流体回路４は種々の方向に延びて複雑に交差した交差流路を備えている。図６は交差流路の一例を示している。交差流路は、細胞作製プレート２の表側に、Ｘ方向に延びる第１流路６０と、Ｘ方向とは異なるＹ方向に延びる第２流路６１と、を備えており、第１流路６０は細胞作製プレート２の裏側に向かって延びて第２流路６１を迂回する迂回路６２を備えている。例えば、迂回路６２は、平板２０の表面から裏面へ貫通する２つの貫通穴６２ａ－６２ｂと、平板２０の裏面で貫通穴６２ａ－６２ｂ同士を連通する連通路６２ｃと、を備えていることが好ましい。平板２０の裏面に形成した連通路６２ｃを覆うため、蓋２１は、平板２０の表面を覆う表蓋２１ａと、平板２０の裏面を覆う裏蓋２１ｂと、を備えていることが望ましい。このような交差流路により、高度に集積した流体回路４を備えた小型な細胞作製プレート２を提供できるようになる。

細胞製造装置１は、細胞作製プレート２に着脱可能に連結するベースプレートをさらに備えていることが好ましい。図７Ａ－図７Ｂはベースプレートの一例を示している。ベースプレート５は、細胞作製プレート２の流体制御、温度制御等を行う。細胞作製プレート２はロボット等が作用を及ぼす危険領域側７０の方を向くように配置されるのに対し、ベースプレート５は危険領域側７０とは反対側の安全領域側７１の方を向くように配置される。生物学的汚染防止の観点から、細胞作製プレート２を使い捨て可能とし、ベースプレート５を使い回し可能としてもよい。また、細胞製造装置１は安全領域側７１からメンテナンス可能に構成する。細胞製造装置１がこのような二面的構造を備えることにより、ロボット等が複数の細胞製造装置１に対して１対多で関わり合えるようになる。

細胞製造装置１は、細胞作製プレート２とベースプレート５の連結面に、位置決め部材７２及びプレート封止部材７３をさらに備えていてもよい。位置決め部材７２は、相互に嵌合する凸部及び凹部でよく、細胞作製プレート２とベースプレート５との連結位置を位置決めする。プレート封止部材７３は、連結面外周に取付けたガスケット、パッキン等でよく、細胞作製プレート２とベースプレート５を連結することにより、プレート封止部材７３の内側が外部空間から遮断され、細胞作製プレート２の裏面からのガス透過が抑制される。ベースプレート５は、移送部１２を駆動する駆動部７４を備えている。駆動部７４は、例えばペリスタルティックポンプを駆動するモータを備えている。さらに、細胞作製プレート２とベースプレート５の連結面に、細胞作製プレート２に配置する電気素子、例えば加温素子、冷却素子、流量センサ等に電力供給する電気接点７５を備えていることが好ましい。

以上の実施形態によれば、複数の機能部位が１つの細胞作製プレート２内に集約されるため、別個の部品をチューブ、ポンプ、コネクタ等を介して閉鎖的に接続するといった手間が無くなり、細胞製造装置１の製造が合理化される。また同時に、注入又は排出した流体によって押出又は引出される流体が細胞作製プレート２内に閉じ込められるため、細胞作製プレート２の外部に流体を逃がしたり又は外部から流体を取込んだりする必要がなく、流体回路の密閉性を保ちながら細胞作製プレート２をプレート状に形成することが可能になる。このようなプレート状の細胞作製プレート２は、ロボットにとって取扱い易く、自動化システムへの適合性を向上させる。

本明細書において種々の実施形態について説明したが、本発明は、前述した種々の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲に記載された範囲内において種々の変更を行えることを認識されたい。

１細胞製造装置
２細胞作製プレート
３閉鎖式コネクタ
４流体回路
５ベースプレート
１０注入排出部
１０ａ－１０ｆ第１－第６注入排出チャネル
１１容積可変部
１２移送部
１３細胞誘導培養部
１３ａ細胞誘導培養槽
１３ｂ培地循環路
１３ｃｐＨ測定部
１４流体溜め部
１５流体混合部
１６細胞分離部
１７細胞塊破砕部
１９流体容器
２０平板
２０ａ溝
２０ｂ貯溜槽
２０ｃ土手部
２１蓋
２１ａ表蓋
２１ｂ裏蓋
３０培養槽
３１培地槽
３２特定成分透過部材
４０混合流路
４１流体合流路
４２混合流発生路
４２ａ流路幅変化部
４２ｂ流路深さ変化部
５０破砕流路
５１上流流路
６０第１流路
６１第２流路
６２迂回路
６２ａ－６２ｂ貫通穴
６２ｃ連通路
７０危険領域側
７１安全領域側
７２位置決め部材
７３プレート封止部材
７４駆動部
７５電気接点
Ａ１－Ａ４第１－第４貯溜槽
Ｄ１－Ｄ２第１－第２分離槽
Ｌ１－Ｌ２第１－第２流体
Ｐ１－Ｐ８第１－第８ポンプ
Ｓ外部空間

Claims

複数の機能部位を集約した流体回路を備える細胞作製プレートと、
前記流体回路を外部空間に対して閉鎖的に接続する閉鎖式コネクタと、
を備え、
前記流体回路は、前記複数の機能部位として、
前記閉鎖式コネクタを介して流体を前記流体回路内に注入又は流体回路外に排出する注入排出部と、
注入した前記流体に基づき細胞の誘導及び培養を行う細胞誘導培養部と、
相互に不混和な複数の流体を混合する流体混合部と、を備え、
該流体混合部は、相互に不混和な流体を１本の流路に合流させる流体合流路を含み、
前記流体混合部は、前記流体合流路により合流した流体に混合流を発生させる混合流発生路をさらに含み、
該混合流発生路は流体の進行方向とは異なる方向に流路幅を変化させる部分と前記異なる方向に流路深さを変化させる部分とを流体の進行方向に対して交互に備えている、細胞製造装置。
注入又は排出した前記流体によって押出される流体又は引出される流体を貯留する容積可変部をさらに備え、前記容積可変部は物理的又は化学的な容積可変材を備える、請求項１に記載の細胞製造装置。
前記物理的な容積可変材は、柔軟性バッグ又はシリンジを備える、請求項２に記載の細胞製造装置。
前記流体回路は、注入した前記流体を前記流体回路内で移送する移送部をさらに備える、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記流体回路は、前記移送部の前段又は後段に流量計測部をさらに備える、請求項４に記載の細胞製造装置。
前記流量計測部は、前記移送部に連通する流路及び貯溜漕の少なくとも一方に隣接して設けた流量センサを備える、請求項５に記載の細胞製造装置。
前記流量計測部は、前記移送部に連通する流路及び貯溜漕の少なくとも一方における流体の継時変化を画像に捉える画像認識センサを備える、請求項５に記載の細胞製造装置。
前記注入排出部は、前記誘導及び前記培養の少なくとも一方を施した細胞を含む流体をサンプルとして前記流体回路外に排出又は前記流体回路内に注入可能な注入排出チャネルを備える、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記流体回路は、細胞又は細胞塊を分離する細胞分離部をさらに備える、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記細胞作製プレートの少なくとも一部が透明である、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記流体回路は、前記細胞作製プレートの表側で、第１方向に延びる第１流路と、前記第１方向とは異なる第２方向に延びる第２流路と、を備え、前記第１流路は前記細胞作製プレートの裏側に向かって延びて前記第２流路を迂回する迂回路を備える、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記細胞作製プレートは、平板と、前記平板を覆う蓋と、を備え、前記迂回路は、前記平板の表面から裏面へ貫通する複数の貫通穴と、前記平板の前記裏面で前記貫通穴同士を連通する連通路と、を備える、請求項１１に記載の細胞製造装置。
前記細胞作製プレートに着脱可能に連結するベースプレートと、前記細胞作製プレート及び前記ベースプレートの連結面に取付けられたプレート封止部材と、をさらに備える、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記細胞作製プレートに着脱可能に連結するベースプレートを備え、前記流体回路は注入した前記流体を前記流体回路内で移送するペリスタルティックポンプを備え、前記ベースプレートが前記ペリスタルティックポンプを駆動する駆動部を備える、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞製造装置。
前記ペリスタルティックポンプの回転運動の状態を画像に捉える画像認識センサをさらに備える、請求項１４に記載の細胞製造装置。
複数の機能部位を集約した流体回路を備える平板を成型する工程と、
前記流体回路を覆うように蓋を前記平板に固着して細胞作製プレートを形成する工程と、
前記流体回路を外部空間に対して閉鎖的に接続する閉鎖式コネクタを前記細胞作製プレートに取付ける工程と、
を備え、
前記流体回路は、前記複数の機能部位として、
前記閉鎖式コネクタを介して前記流体回路内に流体を注入又は流体回路外に排出する注入排出部と、
注入又は排出した前記流体に基づき細胞の誘導及び培養を行う細胞誘導培養部と、
相互に不混和な複数の流体を混合する流体混合部と、を備え、該流体混合部は、相互に不混和な流体を１本の流路に合流させる流体合流路を含み、
前記流体混合部は、前記流体合流路により合流した流体に混合流を発生させる混合流発生路をさらに含み、
該混合流発生路は流体の進行方向とは異なる方向に流路幅を変化させる部分と前記異なる方向に流路深さを変化させる部分とを流体の進行方向に対して交互に備えている、細胞製造装置の製造方法。
前記平板を成型する工程は、前記平板の表面及び裏面の少なくとも一方に前記流体回路として溝又は貯溜槽を形成する工程を含む、請求項１６に記載の細胞製造装置の製造方法。