JP7358236B2 - 腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍に標的化する方法 - Google Patents

Description

関連出願を相互参照
本出願は、２０１６年９月１９日出願の米国仮出願第６２／３９６、６０４号の優先権を主張するものであり、図表、核酸配列表、アミノ酸配列表、図面を含む全文を参照することにより組み込まれる。

肺癌は、今なお、男女共に世界における癌関連死の主因である（全米総合癌ネットワーク）。肺癌による死亡は、誘導型癌腫（乳、前立腺及び大腸癌）による合算死亡数を超えており、米国における全死亡数の６％にのぼっている（１）。肺癌患者には、局所進行性または播種性疾患に罹患していることも多い。このような湿潤性肺癌は、薬物誘発毒性のため治療が困難で、診断１年以内に１０人のうち６人が死亡している。全肺癌患者の８５％にのぼる肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）の場合は、適用可能な治療の選択肢の中で、治療の成功が限られており、治療抵抗性となっている。この一因は腫瘍自体、異なる生存経路による細胞の不均質混合物によるものがある。この不均質性のために、薬剤感受性癌細胞の中には、最終的に治療抵抗性をもってしまう。放射線療法単独又は手術や化学療法と組み合わせがＮＳＣＬＣのケアに有益である（２）。放射線療法はＮＳＣＬＣの治療については問題があり、治療前に腫瘍の放射線抵抗性があり、放射線療法中に放射線抵抗性を獲得して、ｐ５３（３）、ＥＧＦＲ（４）、及びＴＮＮＣ１（カルシウムシグナリング経路）等の特異的遺伝子と結合してしまう（５）。このため、手術の進歩、化学療法、放射線療法及び腫瘍特異性モノクローナル抗体の開発にも関わらず、進行性又は転移性ＮＳＣＬＣは今なお治療困難である（６）。これまでの化学及び放射線療法に対する抵抗性の発現によって、新規な非緩和療法方針の開発が切望されている。

これらの課題によって、腫瘍溶解性ウイルス療法が再浮上している（７）。自然発生又は遺伝子組換えウイルスを用いて、周囲の非悪性細胞は無傷のままで、腫瘍細胞を選択的に狙って溶解する、又はアポトーシスによりそれらを殺すものである。安全性及び耐性の点で保証のある数少ないウイルスにより臨床試験は行われているものの（８）、難題がいくつもある（９）。１）ウイルスを循環から即時に取り除いてしまう補体、中和Ａｂｓ及びマクロファージを含む宿主免疫系に対するウイルスの脆弱性（１０）、２）他の組織、例えば、脾臓や肝臓による非特異的取り込み、及び血管腔隙から逃れた最適下限ウイルスが、腫瘍標的に達するウイルスを減少させる（９）、及び３）健康な組織でなく、腫瘍に対してウイルスを標的とすること。特に、肺癌については、腫瘍溶解性ウイルス療法の開発は非常に限定的である。また、腫瘍溶解性ウイルスを肺の腫瘍及び腫瘍細胞へ標的化することは、未だ達成されていない。

本発明は、自然発生又は遺伝子組換えウイルスを用いて、それらをヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）のような間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にパッケージすることによる、選択的標的腫瘍溶解性ウイルス療法に関する。周囲の非悪性細胞は無傷のままのウイルスによる腫瘍標的は、特に、腫瘍細胞の溶解又はアポトーシスによるそれら細胞の死滅による。本発明の一実施形態において、ｈＭＳＣは、培養中のＲＳウイルス（ＲＳＶ）に略１００％感染することが分かった。しかしながら、このような感染はまたＩＤＯの発現も増加させ、これは、抗腫瘍免疫を阻害し、免疫抑制作用をもつことで知られている。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰ／Ｒ法を用いてＩＤＯネガティブを付与されたｈＭＳＣは、免疫抑制機能を喪失する。これらのＩＤＯ欠損ｈＭＳＣは、ＲＳＶにより感染可能であることが分かっており、感染した細胞は、腫瘍部位へマイグレートする力を保持していた。他の実施形態において、ＲＳＶは、単層と腫瘍培養の両方において、ＬＬＣ１細胞のような肺癌細胞に感染することが示された。

本発明の一態様は、（ａ）自然発生又は遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスに感染した、（ｂ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）欠損又は（ａ）と（ｂ）の両方であるである間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関する。

本発明の他の態様は、癌治療に有用な、本明細書に記載したＭＳＣと、医薬的に許容される担体又は希釈剤とを含む組成物に関する。任意で、組成物は１種類以上のアジュバントを含んでいてよい。

本発明の他の態様は、本明細書に記載した有効量のＭＳＣを、それを必要とするヒト又はヒト以外の動物対象に投与することを含む、癌の治療方法に関する。

本発明の他の態様は、癌細胞を本明細書に記載した有効量のＭＳＣと、イン・ビトロ又はイン・ビボで接触させる、或いは近接させることを含む、イン・ビトロ又はイン・ビボで癌細胞の溶解又はアポトーシス誘導を行う方法に関する。

本発明の他の態様は、ＭＳＣを提供し、ＭＳＣを腫瘍溶解性ウイルスに感染させることを含む、腫瘍溶解性剤を製造する方法に関する。任意で、感染ＭＳＣを、医薬的に許容される担体又は希釈剤と組成物として混合してもよい。任意で、組成物は１種類以上のアジュバントを含んでいてよい。

特許又は出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含んでいる。カラー図面による本特許又は特許出願公開のコピーは、請求により必要な料金を支払えば、特許庁より提供される。

ＲＳＶ感染及びｈＭＳＣ複製。（図１Ａ）ｈＭＳＣをＲＳＶに感染させ（ＭＯＩ＝１）、ｍＡｂからＧＦＰ－ＲＳＶ、エバンスブルー染料（赤）及びＤＡＰＩ（青）により、４８又は７２時間ｐ．ｉ．で免疫染色し、共焦点顕微鏡（倍率２００Ｘ又は１０００Ｘ）により視覚化した。（図１Ｂ）ＲＳＶヌクレオカプシド（ＲＳＶＮ）トランスクリプトは、モックまで正規化し、６、１２、２４及び７２時間ｐ．ｉ．でＭＳＣで検出された。（図１Ｃ）ＲＳＶウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）は、感染ＭＳＣの培養媒体から単離された。少なくとも２回の実験の代表結果である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。インターフェロン－βのｑＰＣＲ分析（図１Ｄ）及びＲＳＶ感染ＮＨＢＥ及びＭＳＣでのＩＤＯ（１Ｅ）発現をモック感染細胞（ｎ＝６）と７２時間ｐ．ｉ．比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 同上 同上 同上 同上 （２Ａ）ＲＳＶ感染ＭＳＣ ＣＭによるＩＤＯ拮抗筋無効増殖抑制。ＣＦＳＥラベルＰＢＭＣを、１ｍＭ １－ＭＴ及び１０μＭのビタミンＫ_３有り又は無しで（３回）、５日間、分裂促進ＰＨＡで、未感染（モック）又はＲＳＶ感染ｈＭＳＣ培養からＣＭで処理した。細胞増殖を、フローサイトメトリーにより分析した。（２Ｂ－２Ｃ）１－ＭＴ又はビタミンＫ_３中ＲＳＶ感染（２Ｂ）及びキヌレニンレベル（２Ｃ）でヒトＭＳＣを治療。（２Ｄ－２Ｆ）ＩＤＯ欠損マウスにおけるＲＳＶ感染。ワイルドタイプ及びＩＤＯノックアウトマウスを、３ｘ１０^６ｐｆｕ ＲＳＶで鼻腔内感染させ、５日ｐ．ｉ．で安楽死させ、ｑＰＣＲによる肺のＲＳＶ感染（２Ｄ）、ＲＳＶＮ－（２Ｅ）及びＩＦＮ－β－（２Ｆ）トランスクリプトを調べた。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１＆＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 同上 同上 同上 同上 同上 ＩＤＯ－欠損ＭＳＣはＲＳＶ感染され易いままであった。ヒトＭＳＣに、メーカーの説明書に従って、１ｍＬ当たり１０μｇのポリブレンを存在させて、１２時間にわたって、ｍＣｈｅｒｒｙ用のｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３発現プラスミドを含有するレンチウイルス（Ｌｖ）粒子、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）及び２つのヒトＩＤＯ－特異シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡ（ＬｖＡとＬｖＢ）のうちの１つ又はスクランブルコントロール（ＬｖＳ）（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を形質導入した。細胞を、ｒｇＲＳＶに感染させる前４８時間インキュベートした。（３Ａ）レンチウイルス形質導入及びＲＳＶ感染を、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤）及びＧＦＰ（緑）についてそれぞれ蛍光顕微鏡により視覚化した。（３Ｂ）ＩＤＯのノックアウトは、ＲＳＶ感染ＭＳＣの免疫抑制効果を排除する。ＭＳＣからの馴化培地で処理したＰＢＭＣの増殖を、ＣＦＳＥにより検出した。ｎ＝３、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＰＨＡコントロール、‡ｐ＜０．０００１対ＬｖＳ。（３Ｃ）ＲＳＶ感染を、リアルタイムＰＣＲ（Ｉ）＊ｐ＜０．０５対ＬｖＳ－Ｒにより定量化した。 同上 同上 ＬＬＣ１チューモロイドを、トランスウェルインサートにおいて１ＭＴ有り又は無しでｈＭＳＣにより培養した。各グループについて３回行った。マイグレートＭＳＣの（４Ａ）代表画像及び（４Ｂ）平均±ＳＤを示す。 ＬＬＣ１単層（５Ａ－１及び５Ａ－２）及びチューモロイド（５Ｂ）のＲＳＶ感染のし易さ。代表図を示す。（５Ｃ）正位肺腫瘍の確立。左胸壁を覆う皮膚を腋窩線で切開した後、ＬＬＣ１（～１０^６細胞／マウス）細胞を左肺に注入した。接種後２週間、肺を採取、固定、切断及びＨ＆Ｅ染色した。（５Ｄ）ｈＭＳＣの腫瘍向性。ＰＫＨ２６ラベルのｈＭＳＣをＧＦＰ－Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺（左）の腫瘍に静脈投与し、注射後２４時間、ＩＶＩＳイメージングにより検出した。右：ＧＦＰ－Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコントロール腫瘍。（５Ｅ－５Ｆ）ｉ．ｎ．経路によるＲＳＶ含有ｈＭＳＣの感染後５日のマウス肺腫瘍におけるＲＳＶ検出。抗ＲＳ抗体（Ａｂｃａｍ）による免疫染色。（５Ｆ）ｑ－ＰＣＲによるＲＳＶ Ｎ複写＊ｐ＜０．０５。 同上 同上 同上 同上 同上

本発明者らは、免疫生物学に関連するＲＳＶ及びＡ５４９肺癌腫上皮細胞と通常のヒトの気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）を含む様々な宿主細胞との相互作用について過去１０年間にわたって鋭意研究してきて（１１－１４）、ＲＳＶ誘導ＩＦＮ－βがアポトーシスに重要であることを示してきた。ワイルドタイプ（ｗｔ）のＲＳＶは、前立腺癌異種移植腫瘍に局所的に運ばれると腫瘍溶解性を示した（１５）が、全腫瘍には達していない。従って、ウイルスを体系的に投与し、ウイルスを腫瘍に対して標的とすることが求められている。また、本発明者らは、ｗｔ－ＲＳＶに感染させると、肺癌細胞が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示さなかったことを見出した。恐らく、これは、ＲＳＶは、ＩＦＮ－βをあまり生成しない細胞、例えば、ＮＨＢＥ細胞等に主に感染するためである（１６）。

ＲＳＶは、舌尖気道上皮細胞に一般的に感染するが、培養中の細胞の約４０％しか感染しない。発明者らの実験室における細胞操作エラーにより、ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）はＲＳＶに罹患し易いことが分かった。ＭＳＣは腫瘍を標的とすることが知られているため（１７）、本発明者らは、ＲＳＶ感染ｈＭＳＣは、標的腫瘍溶解性ウイルス療法を開発するのに有用であると仮説を立てた。しかしながら、初期の研究では、ＲＳＶ感染ｈＭＳＣは、ＩＤＯ発現及び活性を増加し、抗腫瘍免疫を抑制し得た。従って、本発明者らは、ＲＳＶベースの腫瘍溶解性治療法による標的遺伝子導入を行い、他の腫瘍溶解性ウイルス療法を導入するのに用いられる、ＩＤＯネガティブＭＳＣを生成した。

ＭＳＣは、ヒトＭＳＣ又はヒト以外の動物ＭＳＣであってよい。ある実施形態において、ＭＳＣを受け取る対象はヒトであり、ＭＳＣはヒトＭＳＣである。

ＭＳＣは、その投与対象が、自家、同種異系又は異種であってよい。

腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞の型に対して腫瘍溶解性のものとする。腫瘍溶解性ウイルスとしては、これらに限られるものではないが、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス、水泡性口炎症ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカウイルス及びＲＩＧＶＩＲが例示される。ある実施形態において、ウイルスはＲＳＶである。ある実施形態において、ウイルスはＲＳＶで、癌は肺癌である。

ウイルスは、例えば、減衰（例えば、ウイルス遺伝子又は遺伝子領域を抹消して、正常細胞でなく、腫瘍細胞で使われるウイルス機能を排除して、ウイルスをより安全で腫瘍特異性とする）、腫瘍標的化（例えば、形質導入による標的化又は形質導入によらない標的化）、レポーター遺伝子導入（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、腫瘍溶解活性の改善（例えば、自殺遺伝子の導入、血管新生抑制遺伝子の添加による血管新生の抑制、放射性ヨウ素（ナトリウム－ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）遺伝子の添加によるヨウ素の蓄積））によって、改変又は遺伝子組換えされてもよい。

ＭＳＣは、単離状態で、対象に投与、又はイン・ビトロ又はイン・ビボで、標的癌細胞と接触若しくは近接させ、任意で、医薬的に許容される担体又は希釈剤と、医薬組成物として混合させてもよい。任意で、組成物は、さらに、１種類以上のアジュバント、化学療法薬、免疫療法薬等を含むことができる。

任意で、ＭＳＣは、対象に対して、１種類以上のその他の薬剤と、同時又は連続的に投与することができる。投与可能な抗癌剤としては、それらに限られるものではないが、表１に示すものが挙げられる。

本明細書に開示された１種類以上の化合物の前及び／又は後に投与される追加の薬剤と同時（同一又は異なる処方）又は連続的投与することができる。

このように、ＭＳＣは、個別に投与しても、医薬組成物として、様々なその他の成分を含むことができる。関連する状況で用いることのできる許容される成分又は添加剤としては、酸化防止剤、フリーラジカル捕捉剤、ペプチド、成長因子、抗生物質、細菌発育抑制因子、免疫抑制剤、抗凝固薬、緩衝剤、抗炎症薬、血管新生阻害剤、解熱薬、徐放性結合剤、麻酔薬、ステロイド及び副腎皮質ホルモンが例示される。かかる成分は、更なる治療有用性を与え、ＭＳＣの治療作用に影響を与えたり、ＭＳＣ又はその他薬剤の投与の結果起こり得る副作用を防ぐ作用をし得る。

ある実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１種類の追加の抗癌剤（例えば、化学療法剤）を含む。本発明のある実施形態において、少なくとも１種類の抗癌剤は、ＭＳＣと共に投与される。

ある実施形態において、本組成物及び本方法は、１種類以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミム）、オートファジー阻害剤（例えば、クロロキン）、アルキル化剤（例えば、メルファラン、シクロフォスファミド）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ９８５０９）、ＦＡＫ／ＰＹＫ２阻害剤（例えば、ＰＦ５６２２７１）、又はＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ）又はこれら２種類以上の混合物及びその投与を含む。

このように、免疫療法薬には、個別に投与しても、医薬組成物としても、様々なその他の成分を添加剤として含むことができる。関連する状況で用いることのできる許容される成分又は添加剤としては、酸化防止剤、フリーラジカル捕捉剤、ペプチド、成長因子、抗生物質、細菌発育抑制因子、免疫抑制剤、抗凝固薬、緩衝剤、抗炎症薬、血管新生阻害剤、解熱薬、徐放性結合剤、麻酔薬、ステロイド及び副腎皮質ホルモンが例示される。かかる成分は、更なる治療有用性を与え、ＭＳＣの治療作用に影響を与えたり、ＭＳＣ又はその他薬剤の投与の結果起こり得る副作用を防ぐ作用をし得る。免疫治療薬は、治療薬又はその他薬剤と共役させることもできる。

本明細書で用いる「免疫治療法」という用語は、癌その他有害タンパク質、細胞又は組織に対して、適応免疫又は先天性免疫を導き出す、又は増幅するための、刺激、導入、破壊、相同性、強化、増強又はその他モジュレーションによる疾病の治療を指す。免疫治療法（例えば、免疫治療剤）には、癌ワクチン、免疫調節薬、モノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）、免疫刺激剤、樹状細胞及びウイルス治療が含まれ、既存の癌の治療、又は癌の発現の抑制、又は癌の再発の可能性を減じるための補助療法としての使用のために設計されている。癌ワクチンとしては、ＧＶＡＸ、Ｓｔｉｍｕｖａｘ、ＤＣＶａｘと腫瘍及びＭＵＣ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ、ｐ５３等を含むその他抗体に対する免疫応答を引き出すために設計されたその他ワクチンが例示される。免疫調節剤としては、１ＭＴ、イピリムマブ、トレメリムマブ及び／又は腫瘍又はその他抗原に対する細胞毒性又はその他Ｔ細胞活性を活性化又はその他調節するよう設計された薬剤が例示され、これらに限られるものではないが、Ｔ－Ｒｅｇ細胞調節経路をＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ２８、その他ＴＣＲｓ、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＣＤ８０、ＩＣＯＳ及びそれらのリガンドを介した、阻害、アゴニスト又は拮抗薬による治療が含まれる。免疫刺激剤としては、副腎皮質ホルモン、その他抗炎症剤、炎症誘発剤、ステロイド、非ステロイドが例示され、これらに限られるものではないが、ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２）、インターフェロンのようなサイトカインその他が含まれる。樹状細胞（ＤＣ）治療としては、変性樹状細胞その他抗原提示細胞、自家又は異種のもので、複数の抗体、全癌細胞、単一抗体による、ｍＲＮＡ、ファージディスプレイ又はその他変性により変性されたものが例示され、これらに限られるものではないが、抗原特異性Ｔ細胞免疫を誘発するための生体外生成、抗原負荷樹状細胞（ＤＣ）、体液性免疫を誘発するための生体外遺伝子負荷ＤＣ、腫瘍特異性免疫を誘発するための生体外生成抗原負荷ＤＣ、これらに限られるものではないが、プロベンジその他をはじめとする耐性を誘発するための生体外生成未熟細胞が含まれる。ウイルス治療としては、腫瘍溶解性ウイルス又はウイルス由来遺伝子又は抗腫瘍免疫を導き出すために設計されたその他材料、及びプロファージ系列における薬剤等の、腫瘍発現に関連する感染性ウイルスの阻害剤が例示される。モノクローナル抗体としては、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、放射線免疫療法、イブリツモマブチウキセタン、トシツブマブ／ヨウ素トシツブマブレジメンが例示される。免疫治療法は、単独治療又は１種類以上のその他の治療と組み合わせて用いてもよい（１種類以上のその他免疫治療法又は非免疫療法）。

本明細書で用いる、「細胞毒性薬」とは、イン・ビトロ及び／又はイン・ビボで細胞の機能を抑制又は抑止し、及び／又は細胞を破壊する物質のことを指す。この用語には、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、細菌、真菌、植物又は動物由来及び抗体の小分子毒素又は酵素活性毒素等の毒素、そのフラグメント及び／又は異形が含まれる。

本明細書で用いる「化学療法剤」という用語は、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ、ＢＲＩＳＴＯＬ－ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ、Ｒｈｏｎｅ－ＰｏｕｌｅｎｃＲｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、クロラムブシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、抗エストロゲン等の癌の治療に有用な化学化合物であり、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ、ＧＴｘ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）、及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロレイン、ゴセレリン等の抗アンドロゲン等が含まれる。本発明の組成物及び方法と組み合わせて用いてよい化学療法剤を含む抗癌剤の例を表１に挙げる。ある実施形態において、化学療法剤は、１種類以上のアントラサイクリンである。アントラサイクリンは、抗生物質でもある化学療法剤の一系列である。アントラサイクリンは、ＤＮＡの構造を中断することにより細胞分裂を防ぎ、その機能を（１）ＤＮＡ小溝の塩基対へのインターカレーション、及び（２）ＤＮＡのリボースへのフリーラジカル損傷を生じさせることにより終了する作用をする。アントラサイクリンは、白血病治療に用いられることが多い。アントラサイクリンとしては、ダウノルビシン（ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ）、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ、ＲＵＢＥＸ）、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ、ＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ）、及びイダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ）が挙げられる。

ＭＳＣの投与前、中及び／又は後に、ＭＳＣと同じ組成物中、又は別の組成物中に、１種類以上のアジュバントをＭＳＣに投与してよい。アジュバントは、アジュバントミョウバン塩、その他鉱物アジュバント、細菌、生成物、細菌由来アジュバント、界面活性剤（例えば、サポニン）、水中油（ｏ／ｗ）及び油注水（ｗ／ｏ）エマルジョン、シポソームアジュバント、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＰ、ＩＬ－１２、及びＩＦＮｇａｍｍａ）、及びアルファガラクトシルセラミド類似体等、いずれの種類であってもよい。アジュバントの限定されない例としては、モンタニドエマルジョン、ＱＳ２１、フロイント完全又は不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ルメット－ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、及びミョウバンが挙げられる。

ＭＳＣは、腸内、非経口、静脈内、筋肉内、局所、皮下等、適切な投与経路に適合する組成で投与される。ＭＳＣは、当業者であれば判断できる通り、連続又は明確な間隔で投与することができる。

ある実施形態において、ＭＳＣは、対象に系統的に投与される。ある実施形態において、ＭＳＣは、対象に癌の部位から離れた解剖学的部位で投与される。ある実施形態において、ＭＳＣは、癌の部位に局所的に投与される。ある実施形態において、ＭＳＣは、鼻腔内に投与される。ある実施形態において、ＭＳＣは、血管内（例えば、静脈内）に投与される。

ＭＳＣ内に一時的又は持続的なインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）欠乏症を誘導するのに用いてよい。例えば、遺伝子欠損又は遺伝子サイレンシングを用いて、相同組換え、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、人工酵素ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、及びクラスター化された等間隔にスペーサーが入った短い回文型のリピート配列（ＣＲＩＳＰＲ）機構等の腫瘍溶解性ウイルスによる感染前、中又は後の、ＭＳＣ中のＩＤＯ発現を排除又は減じてよい（例えば、全文を参照することにより組み込まれる（２２）、（２３）、及び（２４）を参照のこと）。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系列を用いる（実施例３参照）。ＩＤＯ機能及び／又は発現における欠乏は完全（１００％）又は部分的（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％）である。

ヒトＩＤＯの核酸及びアミノ酸配列は公知である（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００２１６４、バージョンＮＭ＿００２１６４．５ＧＩ：３２３６６８３０４；ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１４９０２、これらは全文を参照することにより組み込まれる）。

SEQ ID NO:1 ‐ヒトＩＤＯアミノ酸配列
MAHAMENSWTISKEYHIDEEVGFALPNPQENLPDFYNDWMFIAKHLPDLIESGQLRERVEKLNMLSIDHLTDHKSQRLARLVLGCITMAYVWGKGHGDVRKVLPRNIAVPYCQLSKKLELPPILVYADCVLANWKKKDPNKPLTYENMDVLFSFRDGDCSKGFFLVSLLVEIAAASAIKVIPTVFKAMQMQERDTLLKALLEIASCLEKALQVFHQIHDHVNPKAFFSVLRIYLSGWKGNPQLSDGLVYEGFWEDPKEFAGGSAGQSSVFQCFDVLLGIQQTAGGGHAAQFLQDMRRYMPPAHRNFLCSLESNPSVREFVLSKGDAGLREAYDACVKALVSLRSYHLQIVTKYILIPASQQPKENKTSEDPSKLEAKGTGGTDLMNFLKTVRSTTEKSLLKEG
（UniProt寄託番号 P14902）

SEQ ID NO:2 ‐ ヒトＩＤＯ核酸配列
1 aatttctcac tgcccctgtg ataaactgtg gtcactggct gtggcagcaa ctattataag
61 atgctctgaa aactcttcag acactgaggg gcaccagagg agcagactac aagaatggca
121 cacgctatgg aaaactcctg gacaatcagt aaagagtacc atattgatga agaagtgggc
181 tttgctctgc caaatccaca ggaaaatcta cctgattttt ataatgactg gatgttcatt
241 gctaaacatc tgcctgatct catagagtct ggccagcttc gagaaagagt tgagaagtta
301 aacatgctca gcattgatca tctcacagac cacaagtcac agcgccttgc acgtctagtt
361 ctgggatgca tcaccatggc atatgtgtgg ggcaaaggtc atggagatgt ccgtaaggtc
421 ttgccaagaa atattgctgt tccttactgc caactctcca agaaactgga actgcctcct
481 attttggttt atgcagactg tgtcttggca aactggaaga aaaaggatcc taataagccc
541 ctgacttatg agaacatgga cgttttgttc tcatttcgtg atggagactg cagtaaagga
601 ttcttcctgg tctctctatt ggtggaaata gcagctgctt ctgcaatcaa agtaattcct
661 actgtattca aggcaatgca aatgcaagaa cgggacactt tgctaaaggc gctgttggaa
721 atagcttctt gcttggagaa agcccttcaa gtgtttcacc aaatccacga tcatgtgaac
781 ccaaaagcat ttttcagtgt tcttcgcata tatttgtctg gctggaaagg caacccccag
841 ctatcagacg gtctggtgta tgaagggttc tgggaagacc caaaggagtt tgcagggggc
901 agtgcaggcc aaagcagcgt ctttcagtgc tttgacgtcc tgctgggcat ccagcagact
961 gctggtggag gacatgctgc tcagttcctc caggacatga gaagatatat gccaccagct
1021 cacaggaact tcctgtgctc attagagtca aatccctcag tccgtgagtt tgtcctttca
1081 aaaggtgatg ctggcctgcg ggaagcttat gacgcctgtg tgaaagctct ggtctccctg
1141 aggagctacc atctgcaaat cgtgactaag tacatcctga ttcctgcaag ccagcagcca
1201 aaggagaata agacctctga agacccttca aaactggaag ccaaaggaac tggaggcact
1261 gatttaatga atttcctgaa gactgtaaga agtacaactg agaaatccct tttgaaggaa
1321 ggttaatgta acccaacaag agcacatttt atcatagcag agacatctgt atgcattcct
1381 gtcattaccc attgtaacag agccacaaac taatactatg caatgtttta ccaataatgc
1441 aatacaaaag acctcaaaat acctgtgcat ttcttgtagg aaaacaacaa aaggtaatta
1501 tgtgtaatta tactagaagt tttgtaatct gtatcttatc attggaataa aatgacattc
1561 aataaataaa aatgcataag atatattctg tcggctgggc gcggtggctc acgcctgtaa
1621 tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggcg gatcacaagg tcaggagatc gagaccatct
1681 tggctaacac ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaaattagcc gggcgcggtg
1741 gcgggcacct gtagtcccag ctactcggga ggctgaggca ggagaatggc gtgaacctgg
1801 gaggcggagc ttgcagtgag ccaagattgt gccactgcaa tccggcctgg gctaaagagc
1861 gggactccgt ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa gatatattct gtcataataa ataaaaatgc
1921 ataagatata aaaaaaaaaa aaaa

（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００２１６４、バージョンＮＭ＿００２１６４．５ＧＩ：３２３６６８３０４；Ｙｅｕｎｇ Ａｗら、「インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼの健康と疾病における役割」、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．１２９（７）、６０１－６７２（２０１５）、これは全文を参照することにより組み込まれる）。

上述した通り、初期の研究によれば、ＲＳＶ感染ＭＳＣは、ＩＤＯ発現及び活性を増加させることが分かり、これは、抗腫瘍免疫を抑制してしまうという望ましくない影響をもたらし得る。これを回避する方法の一つが、上述したＩＤＯ欠損ＭＳＣを用いることである。他のやり方は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ抑制剤）の抑制剤を利用するものである。任意で、１種類以上のＩＤＯ抑制剤を対象に投与したり、イン・ビトロ又はイン・ビボで標的癌細胞に近接させてよい。ＩＤＯ抑制剤は、腸内、非経口、静脈内、筋肉内、局所、皮下等、適切な投与経路により投与してよい。当業者であれば判断できる通り、連続又は明確な間隔で投与することができる。ＩＤＯ抑制剤は、ＭＳＣの投与前、中及び／又は後に、ＭＳＣと同じ組成物中、又は別の組成物中で、対象に投与してよい。

ＩＤＯ抑制剤は、通常のＩＤＯ機能を有するＭＳＣと共に対象に投与してもよいし、又は、ＩＤＯ内生を抑制するために、ＩＤＯ欠損ＭＳＣと共に投与してもよい。ＩＤＯは、Ｔ細胞応答を抑制し、免疫寛容を促進する免疫調節酵素である。ＩＤＯはトリプトファンを異化し、腫瘍微小環境においてＴｒｐを消耗することにより、少なくとも一部、免疫系から腫瘍細胞を離すのを補助すると考えられている。ＩＤＯは、腫瘍内に寛容原生環境及び関連する腫瘍流入領域リンパ節を形成するのを補助する。ＩＤＯは、エフェクターＴ細胞の増殖と分化を直接抑制し、Ｔｒｅｇの抑制活性を著しく増強する。ＩＤＯ抑制剤としては、例えば、ＩＮＣＢ０２３８４３及びＩＮＣＢ０２４３６０（国際特許出願２００６１２２１５０号）のようなヒドロキシアミジン、１－メチルトリプトファン、右旋性－１－メチルトリプトファン（－１ＭＴ）のようなトリプトファン類似体が挙げられる。その他のＩＤＯ抑制剤は、全文を参照することにより組み込まれる国際特許出願ＷＯ２０１４１５９２４８号、米国特許出願第２０１２０２７７２１７号、米国特許出願第２０１４０３１５９６２号及び米国特許出願第２０１４０３２３７４０号に記載されている。

ＩＤＯ抑制剤は、１つ以上の作用機構を有する（（２１）その内容は全文を参照することにより組み込まれる）。ＩＤＯ抑制剤は、ＩＤＯ１抑制剤、ＩＤＯ２抑制剤、又はその両方であってよい。ＩＤＯ抑制剤は、小分子のような分子、核酸（ＩＤＯ１及び／又はＩＤＯ２に対して特異性のある干渉ＲＮＡ等）、タンパク質又はペプチド、抗体又は抗体フラグメント等の生物の任意の部類であってよい。ＩＤＯ抑制剤の例を挙げると、これらに限られるものではないが、Ｄ－１ＭＴ（トリプトファンミネティック、ＭＴのＤアイソフォーム、ＩＤＯの遺伝子発現抑制因子）、Ｌ－１ＭＴ（トリプトファンミネティック、ＭＴのＬアイソフォーム、及び選択性ＩＤＯ１抑制剤）、ＭＴＨ－Ｔｒｐ（ＩＤＯのトリプトファンミネティック及び遺伝子発現抑制因子）、β－カーボライン（トリプトファンミネティック及びＩＤＯ及びＴＤＯ抑制剤）、ナフトキノン系抑制剤（天然物アニリンＢのファーマコフォア、インドールミネティック及びＩＤＯ抑制剤）、Ｓ－アリル－ブラシニン（ファイトアレキシン及びインドールミネティック）、Ｓ－ベンジル－ブラシニン（ファイトアレキシン及びインドールミネティック）、５－ブロモ－ブラシニン（ファイトアレキシン及びインドールミネティック）、フェニルイミダゾール系抑制剤（コンピュータ設計合成ＩＤＯ抑制剤）、４－フェニルイミダゾール（ＩＤＯ酵素中ヘムリガンド）、エキシグアミンＡ（非トリプトファン類似体及びＮＳＣ４０１３６６ａ（非インドールＩＤＯ抑制剤）。臨床開発のＩＤＯ抑制剤としては、例えば、 ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＩＤＯペプチドワクチン（コペンハーゲン大学）及びＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）がある。

実施形態
実施形態１ （ａ）自然発生又は遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスにより感染した、又は（ｂ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）欠損、又は（ａ）と（ｂ）の両方である、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。

実施形態２ ＭＳＣは、自然発生又は遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスにより感染している、実施形態１に記載のＭＳＣ。

実施形態３ ＭＳＣは、ＩＤＯ欠損である、実施形態１に記載のＭＳＣ。

実施形態４ ＭＳＣは、自然発生又は遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスにより感染しており、ＭＳＣは、ＩＤＯ欠損である、実施形態１に記載のＭＳＣ。

実施形態５ 腫瘍溶解性ウイルスは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）である、実施形態１～４のいずれか一つに記載のＭＳＣ。

実施形態６ ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである、実施形態１～５のいずれか一つに記載のＭＳＣ。

実施形態７ ＭＳＣには、ＩＤＯのＣＲＩＳＰＲ介在性ノックアウトによりＩＤＯ欠損が付与されている、先行する実施形態のいずれかに記載のＭＳＣ

実施形態８ 実施形態１～７のいずれか一つに記載の有効量のＭＳＣを、それを必要とする、ヒトまたはヒト以外の動物対象に投与することを含む、癌の治療方法。

実施形態９ 癌は、肺癌である、実施形態８に記載の方法。

実施形態１０ 肺癌は、肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）である、実施形態９に記載の方法。

実施形態１１ インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ阻害剤）の阻害剤の対象への投与をさらに含む、実施形態８～１０のいずれか一つに記載の方法。

実施形態１２ ＭＳＣを提供し、ＭＳＣを腫瘍溶解性ウイルスで感染させることを含む、腫瘍溶解性剤を製造する方法。

実施形態１３ ＭＳＣは、感染時、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）欠損である、実施形態１２に記載の方法。

実施形態１４ ＭＳＣインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）欠損を、感染の前又は後にさらに付与する、実施形態１２に記載の方法。

実施形態１５ 癌細胞を、イン・ビトロ又はイン・ビボで、実施形態１～７のいずれか一つに記載の有効量のＭＳＣと接触又は近接させることを含む、イン・ビトロ又はイン・ビボで癌細胞の溶解又はアポトーシスを誘導する方法。

実施形態１６ 癌細胞は、肺癌細胞である、実施形態１５に記載の方法。

実施形態１７ 肺癌細胞は、肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）である、実施形態１６に記載の方法。

実施形態１８ イン・ビトロ又はイン・ビボで癌細胞をインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ抑制剤）と接触させることをさらに含む、実施形態１５～１７のいずれか一つに記載の方法。

実施形態１９ 実施形態１～４のいずれか一つに記載のＭＳＣと、医薬的に許容される担体又は希釈剤とを含む組成物。

実施形態２０ アジュバントをさらに含む、実施形態１９に記載の組成物。

更なる定義
「癌」及び「悪性腫瘍」という用語は、典型的に無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳類における生理学的状態のことを指す、又は説明するのに区別なく用いられる。癌は、薬剤抵抗性又は薬剤感受性である。癌は、原発性又は転移性である。癌は、初期、中期又は後期の疾患、そして急性か慢性で表される。ある実施形態において、癌は肺癌である。ある実施形態において、癌は、肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）又は小細胞肺癌である。

癌としては、これらに限られるものではないが、癌腫、悪性リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。かかる癌の具体例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、鱗状細胞癌、小細胞肺癌、肺非小細胞癌、消化器癌、すい臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、腹膜癌、肝臓癌、例えば、肝癌腫、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌腫、腎臓癌及び甲状腺癌が挙げられる。ある実施形態において、癌は、メラノーマ、ＭＤＳ、卵巣癌、乳癌又は多発性骨髄腫である。

これらに限定されるものではないが、その他の癌としては、基底細胞癌腫、胆管癌、骨癌、脳及びＣＮＳ癌、絨毛癌、結合織腫癌、食道癌、目癌、頭及び首癌、胃癌、上皮内腫瘍、喉頭癌、ホジキン及び非ホジキン悪性リンパ腫を含む悪性リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、神経芽腫、口腔癌（例えば、唇、下、口及び咽頭、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、泌尿器系癌並びにその他癌腫及び肉腫が挙げられる。本発明の組成物及び方法により治療可能な癌種の例を表２に挙げる。

本明細書で用いる「腫瘍」という用語は、悪性か良性を問わず、全ての腫瘍性細胞成長及び増殖並びに全ての前癌状態及び癌細胞及び組織を指す。例えば、個々の癌は、固体塊腫瘍により特定される。存在する場合、固体塊腫瘍は、原発腫瘍塊であってもよい。原発腫瘍塊とは、組織の正常な細胞の形質転換の結果としての、その組織における癌細胞の成長のことを指す。たいていの場合、原発腫瘍塊は、目視又は触診により見つけられる嚢胞の存在により、或いは、組織の形状、質感又は重量における不規則性により確認される。しかしながら、原発腫瘍塊の中には触診できず、Ｘ線（例えば、マンモグラフィー）や細針吸引といった医療画像形成技術によってのみ検出可能なものがある。こうした技術を用いることは、早期発見においてより一般的となっている。組織内の癌細胞の分子及び表現型解析によって、通常、癌が組織に対して内因性か、病変が他の部位からの転移かが確認される。「腫瘍」という用語には、固体腫瘍と非固体腫瘍が含まれる。

癌の場合、治療を含む、本発明の方法から生じ得る実際の臨床成果としては、これらに限られるものではないが、癌の１つ以上の兆候の軽減、疾病範囲の減縮、疾病の安定化（すなわち、悪化していない）、疾病の進行の遅延又は減速、疾病状態の改善又は緩和、検出可能か不可能かを問わず寛解（部分又は全体）、腫瘍退縮、腫瘍成長の抑制、腫瘍転移の抑制、癌細胞数の減少、癌細胞の周辺器官への湿潤抑制、疾病進行期間（ＴＴＰ）の改善、応答速度（ＲＲ）の改善、全生存率（ＯＳ）の延長、次治療開始までの期間（ＴＮＴＴ）の延長、最初の進行から次の治療までの期間の延長、又はこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。

「含む」、「からなる」及び「から実質的になる」という用語は、標準的な意味により定義される。各用語に関連する特定の意味を付与するために、本出願においては、これらの用語は互いに代用してもよい。

「有効量」という用語はまた、癌の１つ以上の症状の緩和、癌細胞溶解又は癌細胞アポトーシスの導入等、対象内又は標的癌細胞からの所望の生体応答を引き出す薬剤の量も意味する。

「単離」又は「生物学的に純粋」という用語は、天然状態で見つかる材料に通常付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料のことを指す。このように、本発明によるＭＳＣは、イン・サイチュの環境においてＭＳＣに通常付随する材料を含有しない、すなわち、単離又は精製された形態で投与されるのが好ましい。しかしながら、ＭＳＣは、単離されてない、又は精製されていない形態で、例えば、組織として、対象に投与されてもよい。

本明細書で用いる単数「１つの」及び「その」には、特に断りのない限り、複数も含まれる。このように、例えば、「１つの細胞」、例えば、１つのＭＳＣを参照する場合、２つ以上の細胞が含まれる。「１つの化合物」を参照する場合、２つ以上の化合物が含まれる、等のようになる。

開示されたＭＳＣ、組成物及び方法から恩恵を受ける哺乳類としては、これらに限られるものではないが、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト及び猿等の霊長類、犬、猫、モルモット、ハムスター、ミニ豚、ラビット及びフェレット等の飼育動物（例えば、ペット）、牛、バッファロー、バイソン、馬、ロバ、豚、羊及びヤギ等の家畜、クマ、ライオン、トラ、豹、像、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、ゼブラ、ヌー、プレーリードッグ、コアラ、クマ、カンガルー、オポッサム、ラクーン、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、オットセイ、ネズミイルカ、イルカ及びクジラ等の動物園にいるような珍しい動物が挙げられる。開示された方法から恩恵を受けるその他の種としては、魚類、両生類、鳥類及び爬虫類が挙げられる。本明細書で用いる、「患者」、「対象」及び「個人」という用語は区別なく用いられ、特に、ヒトかヒトでないか特定しない限り、ヒトもヒトでない種も含まれるものとする。

本発明の方法を用いた治療を必要とする対象（例えば、癌に罹患している）は、医療従事者又は獣医に公知の標準的な技術を用いて、適宜、判別することができる。癌に罹患した対象は、症状の有無は問わない。

任意で、本発明のＭＳＣ及び組成物は、癌の発症又はその再発を防ぐ又は遅延させるために、癌でない対象に予防的に投与してもよい。

本発明の実施にあたっては、特に断りのない限り、当業者に知られた分子生物学、微生物学、ＤＮＡ再結合技術、電気生理学及び薬理学の従来の技術を利用できる。かかる技術は、文献に詳細に説明されており、例えば、それぞれ全文を参照することにより組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版（１９８９）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）、Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ．、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）。ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓら編１９８４）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒら編（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ）、並びにＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編（１９９１）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ））を参照のこと。

本明細書で言及又は引用した全ての特許、特許出願、仮出願及び公報は、全ての図表を含むその全文は、本明細書で明らかに教示されたものと矛盾しない限り、参照により組み込まれる。

以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は限定と解釈されないものとする。特に断りのない限り、パーセンテージは全て重量基準であり、全ての溶剤混合物の比率は容積基準である。

実施例１ ＭＳＣは、ＲＳＶ感染に極めて罹患し易い
ＲＳＶは、一般的に、舌尖軌道上皮細胞に感染するが、血液及び骨髄の様々な免疫細胞にも感染する（１７－１９）。発明者らの実験室における細胞操作エラーにより、ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）はＲＳＶに極めて罹患し易いことが分かった（図１）。７２時間ｐ．ｉ．以内に～９０％の細胞が感染し、ＲＳＶは容易かつ攻撃的にＭＳＣ中で複製される（図１Ａ－Ｃ）。ＩＦＮ－β及びＩＤＯの高発現レベルが、モックに比べてＲＳＶ感染ＭＳＣにおいて認められた（図１Ｄ－Ｅ）。また、これらの細胞は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）及びＣＸＣＲ４（図示せず）の発現を示す。

実施例２ ＩＤＯ欠損ＭＳＣは、ＲＳＶ感染に等しく罹患し易い
ＲＳＶ感染ＭＳＣの免疫学的重要性を調べるために、本発明者らは、フレッシュヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＭＳＣから馴化培地（ＣＭ）で処理した。ＰＢＭＳを、５，６－カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、ＩＤＯ抑制剤、１－メチルトリプトファン（１－ＭＴ）及びビタミンＫ_３有り又は無しで、ＲＳＶに感染したＭＳＣから集めたＣＭで処理した。予測通り、ＭＳＣ培養上清中で分泌されたＩＤＯは、リンパ球増殖を抑制した（図２Ａ）が、１－ＭＴ又はビタミンＫ_３で処理したＲＳＶ感染ＭＳＣは、キヌレニンレベルが減少し（図２Ｃ）、フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ色素希釈により測定された、ＰＢＭＣ増殖に対する悪影響が取り除かれた（図２Ａ）。しかしながら、１－ＭＴ又はビタミンＫ_３による処理で、ウイルス力価により求められたＲＳＶ感染は減少しなかった（図２Ｂ）。本発明者らはまた、ｗｔ及びＩＤＯノックアウトマウスのＲＳＶ感染の罹患し易さについても調べた。ｗｔ及びＩＤＯノックアウトマウスにＲＳＶ感染させ、ＲＳＶ複製をした。ｗｔ対ＩＤＯノックアウトマウスの肺で認められた、ＰＦＵｓ又はＲＳＶヌクレオカプシド（ＲＳＶＮ）トランスクリプト（図２Ｅ）又はＩＦＮ－βトランスクリプトの数における統計的な差は認められなかった（図２Ｆ）。

実施例３ ＩＤＯのＣＲＩＳＰＲ介在性ノックアウトは、ＲＳＶ感染ＭＳＣの抗増殖効果を抑制するが、ＲＳＶ感染の罹患のし易さは維持する
オフターゲット効果を有するＩＤＯ抑制剤を使用する変形方法として、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ＲＳＶ感染前のｈＭＳＣからＩＤＯ遺伝子をノックアウトした。異なるＩＤＯ特異性ガイドＲＮＡ（ＬｖＡ及びＬｖＢ）を発現する２つの別のプラスミドと、標的でないスクランブルガイドＲＮＡ（ＬｖＳ）（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を発現するコントロールプラスミドを個別にｈＭＳＣへ形質導入した。プラスミドの発現は、細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ（赤）から蛍光顕微鏡検査法により明らかとなった（図３Ａ）。同様に、ｒｇＲＳＶによる感染を、ＧＦＰ（緑）蛍光により観察した（図３Ａ）。ＩＤＯノックアウトとコントロールｈＭＳＣからの馴化培地を用いて、図２Ａに示す通り、増殖アッセイ中、ＰＢＭＣを処理した。コントロールｈＭＳＣ（ＬｖＳ）からの培地は、図２Ａに示した通り、ＰＢＭＣ増殖中、同様に減少したが、２つのＩＤＯノックアウト構造（ＬｖＡ及びＬｖＢ）のそれぞれからの培地でのＰＢＭＣ処理は、増殖においてＲＳＶ関連の減少を示さず（図３Ｂ）、これは、ｈＭＳＣが、ＩＤＯ発現しなかったことを示している。しかしながら、ＩＤＯ欠損ｈＭＳＣは、ＲＳＶ感染の罹患のし易さを保持していた（図３Ｃ）。

実施例４ ＩＤＯ抑制剤は、ｈＭＳＣマイグレーションに影響しない
１－ＭＴ のｈＭＳＣの遊走能に与える影響を調べるために、本発明者らは、ルイス肺癌由来（ＬＬＣ１）細胞を下部チャンバーに入れて、栄養因子とした、ボイデンチャンバー湿潤アッセイを用いた。ＭＳＣを、８．０μｍのポアのあるＰＥＴ膜（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上のマトリゲル層の上部で播種させ、コントロールＭＳＣ培地又は１ＭＴ含有培地で処理した。細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに固定する前、２４時間、共生培養した。上部マトリゲル層をキュータップにより除去し、マイグレート細胞をギムザ染色により目視化して数えた。図４に示す結果によれば、ＩＤＯ抑制剤によって、ｈＭＳＣのＬＬＣ１細胞へのマイグレーションは抑制されなかったことが分かる。

実施例５ イン・ビトロ及びイン・ビボでのＬＬＣ１細胞におけるＲＳＶ感染
ＬＬＣ１細胞を、赤色蛍光マーカーｍＫａｔｅ２（１４）を発現するｒＡ２－ＫＬ１９Ｆ菌株の１及び５ＭＯＩに感染させ、蛍光顕微鏡検査法を用いて細胞を調べた。感染後４８時間で、細胞の大半がＲＳＶに感染していることが分かった（図５Ａ）。本発明者らは、さらに、ＬＬＣ１チューモロイド（Ｔｕｍｏｒｏｉｄ）を感染させる、ＲＳＶ感染ｈＭＳＣ（図２）の馴化培地の可能性について調べた。ＬＬＣ１チューモロイドを、ｒｇＲＳＶ感染ＭＳＣの馴化培地で９０分間培養し、感染後７２時間の細胞を、共焦点顕微鏡により調べた。結果によれば、ＬＬＣ１チューモロイドは、ｒｇＲＳＶに容易に感染したことが分かり（図５Ｂ）、このプラットフォームの可能性は、遺伝子操作されたＲＳＶエクス・ビボの腫瘍溶解性の可能性をスクリーンすることが分かる。ｈＭＳＣは、腫瘍向性を持つことが知られている。さらに、マウス腫瘍に対するヒトＭＳＣの腫瘍向性は、以前から示されている（２０）。これと一致して、鼻腔内又はｉ．ｖ．投与されるとき（図５Ｄ）、ＲＳＶ負荷ｈＭＳＣは、腫瘍を含む（正所性ＬＬＣ１接種）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺に誘導された（図５Ｃ）。さらに、ＲＳＶ負荷ｈＭＳＣがＬＬＣ１腫瘍を含むマウスに鼻腔内投与されると、ｈＭＳＣは生き残り、ＲＳＶは腫瘍細胞で複製された（図５Ｅ～Ｆ）。

本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示のためのみであり、その様々な修正又は変更が当業者に示唆され、それらは、技術思想並びに本明細書及び添付の特許請求の範囲内であると考えられる。また、本明細書に開示された発明又は実施形態のあらゆる要素または限定は、あらゆるその他の要素や限定（個別又は任意の組み合わせで）或いは本明細書に開示されたその他の発明や実施形態と組み合わせることができ、かかる組み合わせは、限定されることなく、本発明の範囲に含まれる。

参考文献
1. Schild SE, Tan AD, Wampfler JA, et al. A new scoring system for predicting survival in patients with non-small cell lung cancer. Cancer medicine. 2015. doi: 10.1002/cam4.479. PubMed PMID: 26108458.
2. Bradley JD, Paulus R, Graham MV, et al. Phase II trial of postoperative adjuvant paclitaxel/carboplatin and thoracic radiotherapy in resected stage II and IIIA non-smallcell lung cancer: promising long-term results of the Radiation Therapy Oncology Group--RTOG 9705. J Clin Oncol. 2005;23(15):3480-7. PubMed PMID: 15908657.
3. Biard DS, Martin M, Rhun YL, et al. Concomitant p53 gene mutation and increased radiosensitivity in rat lung embryo epithelial cells during neoplastic development. Cancer Res. 1994;54(13):3361-4. PubMed PMID: 8012950.
4. Wang H, Yu JM, Yang GR, et al. Further characterization of the epidermal growth factor receptor ligand 11C-PD153035. Chinese medical journal. 2007;120(11):960-4. PubMed PMID: 17624262.
5. Xu QY, Gao Y, Liu Y, et al. Identification of differential gene expression profiles of radioresistant lung cancer cell line established by fractionated ionizing radiation in vitro. Chinese medical journal. 2008;121(18):1830-7. PubMed PMID: 19080366.
6. Jones GC, Kehrer JD, Kahn J, et al. Primary Treatment Options for High-Risk/Medically Inoperable Early Stage NSCLC Patients. Clin Lung Cancer. 2015;16(6):413-30. doi: 10.1016/j.cllc.2015.04.001. PubMed PMID: 26027433; PubMed Central PMCID: PMCPMC4609584.
7. Russell SJ, Peng KW, Bell JC. Oncolytic virotherapy. Nature biotechnology. 2012;30(7):658-70. doi: 10.1038/nbt.2287. PubMed PMID: 22781695; PubMed Central PMCID: PMC3888062.
8. Donnelly OG, Errington-Mais F, Prestwich R, et al. Recent clinical experience with oncolytic viruses. Current pharmaceutical biotechnology. 2012;13(9):1834-41. PubMed PMID: 21740364.
9. Ferguson MS, Lemoine NR, Wang Y. Systemic delivery of oncolytic viruses: hopes and hurdles. Advances in virology. 2012;2012:805629. doi: 10.1155/2012/805629. PubMed PMID: 22400027; PubMed Central PMCID: PMC3287020.
10. Ikeda K, Ichikawa T, Wakimoto H, et al. Oncolytic virus therapy of multiple tumors in the brain requires suppression of innate and elicited antiviral responses. Nature medicine. 1999;5(8):881-7. doi: 10.1038/11320. PubMed PMID: 10426310.
11. Bird GH, Boyapalle S, Wong T, et al. Mucosal delivery of a double-stapled RSV peptide prevents nasopulmonary infection. The Journal of clinical investigation. 2014;124(5):2113-24. doi: 10.1172/JCI71856. PubMed PMID: 24743147; PubMed Central PMCID: PMC4001541.
12. Wong TM, Boyapalle S, Sampayo V, et al. Respiratory syncytial virus (RSV) infection in elderly mice results in altered antiviral gene expression and enhanced pathology. PloS one. 2014;9(2):e88764. doi: 10.1371/journal.pone.0088764. PubMed PMID: 24558422; PubMed Central PMCID: PMC3928298.
13. Boyapalle S, Wong T, Garay J, et al. Respiratory syncytial virus NS1 protein colocalizes with mitochondrial antiviral signaling protein MAVS following infection. PloS one. 2012;7(2):e29386. doi: 10.1371/journal.pone.0029386. PubMed PMID: 22383950; PubMed Central PMCID: PMC3288005.
14. Zhang W, Yang H, Kong X, et al. Inhibition of respiratory syncytial virus infection with intranasal siRNA nanoparticles targeting the viral NS1 gene. Nature medicine. 2005;11(1):56-62. doi: 10.1038/nm1174. PubMed PMID: 15619625.
15. Echchgadda I, Chang TH, Sabbah A, et al. Oncolytic targeting of androgen-sensitive prostate tumor by the respiratory syncytial virus (RSV): consequences of deficient interferon-dependent antiviral defense. BMC cancer. 2011;11:43. doi: 10.1186/1471-2407-11-43. PubMed PMID: 21276246; PubMed Central PMCID: PMC3038980.
16. Guerrero-Plata A, Baron S, Poast JS, et al. Activity and regulation of alpha interferon in respiratory syncytial virus and human metapneumovirus experimental infections. Journal of virology. 2005;79(16):10190-9. doi: 10.1128/JVI.79.16.10190-10199.2005. PubMed PMID: 16051812; PubMed Central PMCID: PMC1182647.
17. Hobson L, Everard ML. Persistent of respiratory syncytial virus in human dendritic cells and influence of nitric oxide. Clinical and experimental immunology. 2008;151(2):359-66. Epub 2007/12/08. doi: 10.1111/j.1365-2249.2007.03560.x. PubMed PMID: 18062796; PubMed Central PMCID: PMC2276949.
18. Ajamian F, Wu Y, Davoine F, et al. Respiratory syncytial virus replication induces Indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) activation in human dendritic cells. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 2010;6:1-2.
19. Rezaee F, Gibson LF, Piktel D, et al. Respiratory syncytial virus infection in human bone marrow stromal cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2011;45(2):277-86. doi: 10.1165/rcmb.2010-0121OC. PubMed PMID: 20971883; PubMed Central PMCID: PMC3175557.
20. Jing W, Chen Y, Lu L, et al. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells producing IL15 eradicate established pancreatic tumor in syngeneic mice. Mol Cancer Ther. 2014;13(8):2127-37. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-14-0175. PubMed PMID: 24928851.
21. Moon YW, J Hajjar, P Hwu, et al. Targeting the indoleamine 2,3-dioxygenase pathway in cancer. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 2015; 3:41. Doi:10.1186/s40425-015-0094-9.
22. Unniyampurath U, R Pilankatta, and M Krishnan. RNA Interference in the Age of CRISPR: Will CRISPR Interfere with RNAi? International Journal of Molecular Sciences. 2016; 17:291. Doi:10.3390/ijms17030291.
23. Boettcher M and MT McManus. Mol Cell. 2015; 58(4):575-585. Doi:10.1016/j.molcel.2015.04.028.
24. David E. Knockout by TALEN or CRISPR vs. Knockdown by shRNA or siRNA. GeneCopoeia Technical Note. Downloaded from genecopoeia.com on September 19, 2017.

配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－ヒトＩＤＯアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１４９０２）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－ヒトＩＤＯ核酸配列（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００２１６４、バージョンＮＭ＿００２１６４．５）

Claims (11)

1. 自然発生又は遺伝子組換え腫瘍溶解性ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に感染した、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）欠損間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む
   肺癌への腫瘍溶解性ウイルス導入用の組成物。
2. 前記ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＭＳＣには、ＩＤＯのＣＲＩＳＰＲ介在性ノックアウトによりＩＤＯ欠損が付与されている、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のために用いられる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ阻害剤（ＩＤＯ阻害剤）をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
   
6. 医薬的に許容される担体又は希釈剤をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. アジュバントをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記ＭＳＣはインターフェロン－βを高発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記ＩＤＯ阻害剤は、小分子、又は、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、若しくは抗体フラグメントの中から選択される生物分子を含む、請求項５に記載の組成物。
10. 前記ＩＤＯ阻害剤は、ヒドロキシアミジン又はトリプトファン類似体を含む、請求項５に記載の組成物。
11. 前記ＩＤＯ阻害剤は、ＩＤＯペプチドワクチン又はＮＬＧ９１９を含む、請求項５に記載の組成物。