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JP7330235B2 - 血中循環腫瘍細胞に関する方法およびアッセイ - Google Patents

血中循環腫瘍細胞に関する方法およびアッセイ Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）（35 U.S.C. §119（e））の下で、2013年12月20日に提出された米国仮出願第61／918,816号、および2014年2月10日に提出された第61／937,883号の優先権を主張し、それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
政府の援助
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号2R01CA129933の下で、米国政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
技術分野
本明細書に記載される技術は、癌の診断および治療に関する。
背景
血中循環腫瘍細胞（CTC）は、原発性腫瘍から剥離して血流中に入り、遠隔臓器への癌の伝播（転移）を媒介する。このため、血流中に血中循環腫瘍細胞（CTC）が存在すると、最終的には遠隔臓器への癌の伝播につながる。しかし、CTCは稀であり、血液1ミリリットル中の正常血液細胞100億個当たり、腫瘍細胞は1～10個と推定される。そのため、それらの単離および分子的分析は大きな技術的課題となっている（Pantel et al., Nat Rev Cancer 2008 8:329-340（非特許文献1）；Yu et al., J Cell Biol 2011 192:373-382（非特許文献2））。
Pantel et al., Nat Rev Cancer 2008 8:329-340 Yu et al., J Cell Biol 2011 192:373-382
概要
本明細書に述べるように、本発明者らは、その発現がCTCに特徴的であるいくつかの遺伝子を同定した。特に、これらの遺伝子の発現は、原発性腫瘍細胞からCTCを分化させる。したがって、本明細書において提供されるのは、診断的および予後予測的な方法およびアッセイを含む、CTCの検出に関する方法およびアッセイである。さらに、本明細書において提供されるのは、例えば、転移を阻害することを目的とする、CTCのこれらのマーカーを標的とする癌の治療である。
1つの局面において、本明細書に記載されるのは、試料中の血中循環腫瘍細胞（CTC）を検出する方法であって、試料中のPC-CTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；および、マーカー遺伝子発現産物の検出レベルが参照基準レベルを上回る場合にPC-CTCが存在すると判定する段階、を含む方法である。いくつかの態様において、CTCは膵癌CTCである。いくつかの態様において、本方法は、試料からCTCを単離する第1の段階をさらに含む。いくつかの態様において、発現産物は核酸である。いくつかの態様において、発現産物のレベルは、RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーションからなる群より選択される方法を用いて決定される。いくつかの態様において、発現産物はポリペプチドである。いくつかの態様において、発現産物のレベルは、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される：ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射性免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は表7または表8から選択される。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1およびWNT4。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
1つの局面において、本明細書に記載されるのは、対象における癌を治療する方法であって、CTCマーカー遺伝子標的療法の治療的有効量を対象に投与する段階を含む方法である。いくつかの態様において、癌は膵癌である。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は、CTCマーカー遺伝子の阻害薬を含む。いくつかの態様において、阻害薬は抗体反応物である。いくつかの態様において、阻害薬は阻害性核酸反応物である。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は、CTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物および化学療法薬を含む。いくつかの態様において、対象は、血液中および／または癌の間質中に存在するCTCのレベルが高い、かつ／またはCTCマーカー遺伝子のレベルが高いと判定された対象である。
1つの局面において、本明細書に記載されるのは、対象がCTCマーカー遺伝子標的療法による治療に反応する可能性が高いか否かを判定する方法であって、血液中および／または癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；ならびに発現産物のレベルが参照基準レベルに比して高い場合に対象が治療に反応する可能性が高いと判定する段階、を含む方法である。いくつかの態様において、本方法は、試料からCTCを単離する第1の段階をさらに含む。いくつかの態様において、癌は膵癌である。いくつかの態様において、発現産物は核酸である。いくつかの態様において、発現産物のレベルは、RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーションからなる群より選択される方法を用いて決定される。いくつかの態様において、発現産物はポリペプチドである。いくつかの態様において、発現産物のレベルは、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される：ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射性免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。いくつかの態様において、PC-CTCマーカー遺伝子は表7または表8から選択される。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPTl；TWSGlおよびWNT4。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
1つの局面において、本明細書に記載されるのは、対象の治療をモニターするための方法であって、癌治療法をそれを必要とする対象に投与する段階；血液中および／または癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；ならびにCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルが参照基準レベルに比して低い場合に対象が反応していると判定し、CTCマーカー遺伝子発現産物が参照基準レベルに比して低くない場合に対象が治療に反応していないと判定する段階、を含む方法である。いくつかの態様において、癌は膵癌である。いくつかの態様において、参照基準レベルは、投与の段階の前の患者における遺伝子発現産物のレベルである。いくつかの態様において、本方法は、試料からCTCを単離する第1の段階をさらに含む。いくつかの態様において、発現産物は核酸である。いくつかの態様において、発現産物のレベルは、RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーションからなる群より選択される方法を用いて決定される。いくつかの態様において、発現産物はポリペプチドである。いくつかの態様において、発現産物のレベルは、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される：ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射性免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。いくつかの態様において、PC-CTCマーカー遺伝子は表7または表8から選択される。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPTl；TWSGlおよびWNT4。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子は、以下からなる群より選択される：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
図1A～1Cは、CTCの単離および特性決定を明示している。図1Aは、CTC-iChip陰性IFDシステムの概略図を描写している。 図1Bは、正常マウスモデルと癌マウスモデルとの間でのマウスWBC枯渇の均一性に関するグラフを描写している。WBC枯渇はlog10で示されている。 図1Cは、正常マウスおよびKPCマウスでの免疫蛍光染色（CK+／CD45-／DAPI+）によるCTC計数のグラフを描写している。 図2は、単一細胞試料の主成分分析の概略図を描写している。 図3A～3Bは、上皮細胞、間葉細胞および幹細胞の遺伝子が、CTC-c細胞と腫瘍との間で変動して発現されることを明示している。描写されているのは、CTC-c細胞と腫瘍との比較で、A）ダウンレギュレートされる遺伝子（図3A）およびアップレギュレートされる遺伝子（図3B）のボックスプロットである。バー＝中央値、ボックスプロット＝四分位数、尺度はlog10（rpm）。 図3Aの説明を参照。 図4A～4Cは、CTC-iChip特性決定を明示している。図4Aは、WBC当たりの抗CD45ビーズの数（x軸）の関数としての、偏向したWBCのパーセント（y軸）のグラフを描写している。 図4Bは、正常マウス血液中にスパイク投与したマウスPDAC細胞株NB508の回収のグラフを描写している（4回の独立した実験を示している）。 図4Cは、NB508細胞株を用いた同系同所性PDAC腫瘍からの捕捉CTC／血液mLのグラフを描写している。 図5Aは、KPCマウスの遺伝子型および特徴の表を描写している。 図5Bは、単細胞シークエンシングの品質計量値のグラフを、細胞株（NB508、MEF）、CTC、WBC、および条件を合わせた原発性腫瘍からのバルクRNA希釈物に関する、アラインメントを行ったリードのパーセンテージおよびユニークアラインメントの総数とともに描写している。 図5Cは、各クラスターに関する（右）、ならびに単細胞原発性腫瘍（TuGMP3）、癌細胞株（NB508）、および全CTC（クラスター1、3、4、5、9）の間でのクラスター内相関係数の平均値を用いた、単細胞不均一性のグラフを描写している。丸印＝平均値、範囲＝95％ CI。 図6は、CTC-cにおいてエンリッチされているECMタンパク質遺伝子のボックスプロットグラフを、バルク原発性腫瘍および単細胞原発性腫瘍と比較して描写している。バー＝中央値、ボックスプロット-四分位数、尺度はlog 10（rpm）。 図6-1の説明を参照。 図7は、3人の患者由来のヒト膵臓CTCのヒートマップ発現プロファイルを描写している。CTCを定義するために用いた上皮遺伝子、およびエンリッチされている細胞外タンパク質をを示している。発現はlog 10尺度で示されている。 図8は、ヒト膵癌細胞株におけるSPARC発現の定量的RT-PCRのグラフを描写している。 図9は、浸潤アッセイを描写している。SPARCに対するshRNA（ShF1およびShF3）による、PDAC2およびPDAC 3細胞株のMatrigelを経由しての浸潤の減少が観察された。shNT＝非標的shRNA 図10は、非標的shRNA（NT）およびSPARC shRNA（SHF1）におけるインビボルシフェラーゼ画像化による、検出可能な転移を有するマウスの数のグラフを描写している。 図11は、CTCの不均一性を判定する過程の概略図を描写している。 図12A～12Cは、CTCでエンリッチされている遺伝子が、原発性腫瘍の上皮性構成要素および間質性構成要素に見いだされることを明示している。描写されているのは、（図12A）Aldh1a2幹細胞ならびにCTCで高度にエンリッチされている遺伝子である（図12B）Klf4遺伝子および（図12C）Igfbp5遺伝子の発現ボックスプロットである。バー＝中央値、ボックスプロット＝四分位数、尺度はlog10（rpm）。 図13は、種々の上皮癌にわたるヒトおよびマウスCTCが、ECMタンパク質遺伝子を高レベルで発現することを明示している。描写されているのは、ヒトpdac、乳癌（br）および前立腺癌（pr）ctcにおける高発現ecm遺伝子の発現ボックスプロットである。バー、中央値；ボックスプロット、四分位数；尺度はlog10（rpm）。holm調整p値＜0.05（*）、0.01（**）、0.001（***）。 図14A～14Eは、ヒトPDACにおけるSPARC発現が、浸潤および転移を強化することを明示している。図14Aは、MTTによって判定したPDAC3細胞株の増殖のグラフを描写している。 図14Bは、43の視野当たりで算定した、PDAC3 shNTにおける腫瘍スフェアをshSPARCと比較したグラフを描写している（エラーバーはSDを表す）。 図14Cは、203の視野当たりの核の数によって定量した、shSPARC細胞株およびshNT細胞株の浸潤のグラフを描写している。p値＜0.01（**）、0.001（***）、0.0001（****）。エラーバーはSDを表す。 図14Dは、PDAC3細胞株の尾静脈接種から3週後のインビボルシフェラーゼ画像化による、検出可能な肺転移のパーセンテージのグラフを描写している。Fisherの直接確率検定によるp値を示している。 図14Eは、PDAC3細胞株由来の同所性膵臓腫瘍を有するマウスにおける、正規化した転移負荷量のグラフを描写している。エラーバーはSDを表す（*p＜0.05）。 図15は、転移カスケードにおける膵臓CTCの役割に関する概要モデルを描写している。示されているのは膵臓CTCの異質なサブセットであり、上皮性遺伝子（ケラチン）および間質性遺伝子（Sparc）の共発現を高度に有する最も顕著な古典的CTC群に注目している。 図16Aは、qRT-PCRによるPDAC2 shRNA細胞株のグラフを描写している。平均値がRQの最大値および最小値（エラーバー）とともに示されている。 図16Bは、同様にPDAC2細胞株におけるMTTアッセイによる増殖速度のグラフを、shNT安定株とshSPARC安定株との間で描写している。 図16Cは、2週時点での腫瘍スフェア浸潤アッセイ（エラーバー＝STD）形成のグラフを、同様にshNT細胞株とshSPARC細胞株との間で描写している。定量は4倍拡大視野当たりに行った（エラーバー＝SD）。 48時間時点で浸潤アッセイによって判定した（図16D）、shSPARC_1 & 3によって減少した遊走挙動。
詳細な説明
本明細書に述べるように、本発明者らは、血中循環腫瘍細胞（CTC）が、ある特定の遺伝子、すなわちCTCマーカー遺伝子の発現によって特徴づけられることを発見した。これらのCTCマーカー遺伝子の発見により、CTCレベル、例えば、対象由来の試料におけるCTCレベルの検出および／または測定のための方法およびアッセイが可能になる。これらの方法およびアッセイは、CTCレベルの測定における速さおよび精度の向上をもたらすことができる。その上、これらのマーカー遺伝子の発現によってCTCが他の細胞、例えば、他の血中循環細胞および／または正常腫瘍細胞と識別されることから、CTCのレベルおよび／または転移能を低下させるためにこれらのマーカー遺伝子発現産物と結合させること、および／またはそれらの産物を阻害することによって、治療法をCTCに対して標的化することができる。
本明細書で用いる場合、「血中循環腫瘍細胞」または「CTC」とは、腫瘍から剥離して血液中に存在する、すなわち循環している腫瘍細胞のことである。CTCを血液の他の構成要素から同定する、および／または単離するために用いうる細胞マーカー（例えば、マーカー遺伝子）は、本明細書において以下に記載されている。いくつかの態様において、CTCは膵癌CTCであってよい。
1つの局面において、本明細書に記載されるのは、試料中の血中循環腫瘍細胞（CTC）を検出する方法であって、試料中のCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；および、マーカー遺伝子発現産物の検出レベルが参照基準レベルを上回る場合にCTCが存在すると判定する段階、を含む方法である。
本明細書に述べるように、本発明者らは、いくつかの遺伝子が、例えば血中非循環性腫瘍細胞と比較して、CTCにおいて変動して調節されていることを発見した。したがって、本明細書において提供されるのは、CTCレベルの測定に関する方法およびアッセイが提供される。高CTCレベルは、予後不良、例えば、転移のリスクが高いことを指し示しうる。したがって、本明細書において提供されるのは、癌を有する対象の予後予測、リスク評価および治療に関する方法およびアッセイが提供される。ある態様において、アッセイおよび方法は、対象の生物試料における遺伝子産物（例えば、タンパク質および／またはmRNAなどの遺伝子転写物）の発現レベルの決定および／または測定を対象とする。ある態様において、アッセイおよび方法は、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、すなわち、本明細書に述べるような表7、表8および／もしくは表14から選択される、少なくとも2種の遺伝子、少なくとも3種の遺伝子、少なくとも4種の遺伝子、少なくとも5種の遺伝子、少なくとも6種の遺伝子、少なくとも7種の遺伝子、少なくとも8種の遺伝子、少なくとも9種の遺伝子、少なくとも10種の遺伝子...少なくとも15種の遺伝子...少なくとも25種の遺伝子...少なくとも30種の遺伝子、またはそれを上回る遺伝子、または任意の数の遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1およびWNT4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイ、方法およびシステムは、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、例えば、以下のうち少なくとも2種の遺伝子、または少なくとも3種の遺伝子、または少なくとも4種の遺伝子、または例えばすべての遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1およびWNT4。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイ、方法およびシステムは、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、例えば、以下のうち少なくとも2種の遺伝子、または少なくとも3種の遺伝子、または少なくとも4種の遺伝子、または例えばすべての遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARCからなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイ、方法およびシステムは、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、例えば、以下のうち少なくとも2種の遺伝子、または少なくとも3種の遺伝子、または少なくとも4種の遺伝子、または例えばすべての遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；およびDCNからなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイ、方法およびシステムは、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、例えば、以下のうち少なくとも2種の遺伝子、または少なくとも3種の遺伝子、または例えばすべての遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；およびDCN。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC；およびARSAからなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイ、方法およびシステムは、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、例えば、以下のうち少なくとも2種の遺伝子、または少なくとも3種の遺伝子、または少なくとも4種の遺伝子、または例えばすべての遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC；およびARSA。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON；およびSV2Aからなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイ、方法およびシステムは、対象の生物試料における少なくとも2種の遺伝子、例えば、以下のうち少なくとも2種の遺伝子、または少なくとも3種の遺伝子、または少なくとも4種の遺伝子、または少なくとも5種の遺伝子、または少なくとも6種の遺伝子、または少なくとも7種の遺伝子、または少なくとも8種の遺伝子、または例えばすべての遺伝子の遺伝子産物の発現レベルの決定を対象とする：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON；およびSV2A。いくつかの態様においては、ポリペプチド発現産物のレベルが、IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON；およびSV2Aからなる群より選択されるマーカー遺伝子に関して決定されるが、これは例えば、本明細書に述べるように、細胞表面タンパク質のRNAレベルがポリペプチドレベルよりも低いためである。
（表７）例示的なマウスマーカー遺伝子
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（表８）例示的なヒトマーカー遺伝子
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表7および表8に列記された遺伝子名は一般名である。表7または表8に列記された遺伝子のそれぞれに関するNCBI Gene ID番号は、NCBIの"Gene" Database（World Wide Webのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用可能）を、一般名をクエリーとして用いて検索し、返された最初のヒト（Homo sapiens）遺伝子（表8中の遺伝子の場合）またはマウス（Mus musculus）遺伝子（表7中の遺伝子の場合）を選択することによって得ることができる。他の遺伝子を、UCSCゲノムブラウザ（World Wide Webのhttp://genome.ucsc.eduで利用可能）をGene Sorter機能を用いて得ることもできる。マウス遺伝子のヒト相同体は、例えば、NCBIデータベース中の相同体を同定すること、またはBLASTなどのデータベースのクエリーを行うことによって、容易に同定することができる。ある態様において、マーカー遺伝子は、表7、表8または表14に列記された遺伝子から選択される。
CTCにおいて、表7、表8または表14に列記されたマーカー遺伝子がアップレギュレートされてもよく、例えば、表7、表8または表14に列記されたマーカー遺伝子に関して、細胞または試料における測定されたマーカー遺伝子の発現がそのマーカー遺伝子の発現の参照基準レベルと比較して高度であるならば、その細胞はCTCと同定される、かつ／またはその試料はCTCを含むと同定される。統計学的に有意な変化が認められることが好ましい。しかし、たとえ一群の中の少数の遺伝子が正常と異なっていなくても、その一群の全体的変化が有意な変化、好ましくは統計学的に有意な変化を示すならば、その試料はCTCを含むと同定することができる。表記されたマーカーの考えられる2種またはそれを上回る組み合わせが、本明細書において想定される。
そのマーカー遺伝子の参照基準レベルよりも高く、参照基準量よりも少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約80％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約500％、または少なくとも約1000％高い、またはそれを上回る、表7、表8または表14中のマーカー遺伝子の遺伝子発現産物のレベルは、CTCの存在の指標となる。
いくつかの態様において、参照基準は、CTCではない細胞または細胞の集団におけるマーカー遺伝子産物の発現のレベル、例えば、血中非循環性腫瘍細胞および／または癌細胞でない血中循環細胞における平均レベルであってよい。いくつかの態様において、参照基準が、対照試料、対照個体のプール試料におけるマーカー遺伝子産物の発現のレベル、またはそれらに基づく数値もしくはある範囲の値であってもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法およびアッセイは、（a）遺伝子発現産物を検出可能な遺伝子標的に変換すること；（b）検出可能な遺伝子標的の量を測定すること；ならびに（c）検出可能な遺伝子標的の量を参照基準の量と比較して、検出可能な遺伝子標的の量が参照基準レベルの量と統計学的に有意に異なる場合に、CTCの存在および／またはレベルが決定されること、を含む。いくつかの態様において、検出可能な遺伝子標的の量が参照基準レベルの量と統計学的に有意に異なってはいない場合に、試料はCTCを含まないと同定される。
本明細書で用いる場合、「変換すること」または「変換」という用語は、対象物または物質、例えば、生物試料、核酸またはタンパク質を、別の物質に変化させることを指す。変換は物理的、生物的または化学的であってよい。例示的な物理的変換には、生物試料の前処理、例えば、分画遠心法による全血の血清への前処理が非限定的に含まれる。生物的／化学的変換は、少なくとも1つの酵素および／または化学的反応物を反応に必要としうる。例えば、DNA試料を1つもしくは複数の制限酵素によって消化して断片化すること、または断片化されたDNA試料にリガーゼによって外因性分子を結びつけることができる。いくつかの態様において、DNA試料は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による酵素的複製を受けることができる。
本明細書に記載のマーカー遺伝子に関連のある遺伝子発現産物を測定するための方法は当業者に周知である。遺伝子発現産物、例えばタンパク質のレベルを測定するためのそのような方法には、抗体またはタンパク質結合剤などの検出反応物を用いる、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウエスタンブロット法、FACS、放射線免疫アッセイ；（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；免疫電気泳動；免疫沈降法および免疫蛍光が含まれる。または、標識抗ペプチド抗体および他の種類の検出剤を対象に導入することによって、ペプチドを対象において検出することもできる。例えば、抗体を、対象における存在および場所が標準的な画像化手法によって検出される放射性マーカーによって標識することができる。
例えば、本明細書に記載のマーカー遺伝子のポリペプチド発現産物に対する抗体は市販されており、タンパク質発現レベル、例えば、抗IGFBP5（カタログ番号4255；Abcam；Cambridge, MA）を測定するために本発明の目的で用いることができる。または、本明細書に記載のマーカー遺伝子のアミノ酸配列は公知であって、NCBIウェブサイトに公開されているため、当業者は、関心対象のこれらのタンパク質に対する自分たち独自の抗体を本発明の目的のために産生させることができる。本明細書に記載のマーカー遺伝子のアミノ酸配列には、ヒト、マウスおよびラットなどの種々の種についてのNCBIアクセッション番号が割り当てられている。
いくつかの態様においては、免疫組織化学（「IHC」）および免疫細胞化学（「ICC」）の手法を用いることができる。IHCは組織切片に対する免疫化学の適用であり、一方、ICCは、細胞または組織インプリントに対する、それらが特定の細胞学的調製、例えば液体ベースの調製などを受けた後の免疫化学の適用である。免疫化学は、特異的抗体の使用に基づく一群の手法であり、ここで抗体は細胞の内部または表面にある分子を特異的に標的化するために用いられる。抗体は典型的には、標的化された分子に遭遇すると即座に生化学的反応を受け、それによって色調変化を呈するマーカーを含有する。場合によっては、マーカー色素またはマーカーシグナルを含む二次抗体を一次特異抗体に適用することを伴うシグナル増幅を、特定のプロトコールに組み込んでもよい。
いくつかの態様において、アッセイはウエスタンブロット分析であってよい。または、タンパク質を二次元ゲル電気泳動システムによって分離することもできる。二次元ゲル電気泳動は当技術分野において周知であり、典型的には、第1の次元に沿った等電点フォーカシングと、それに続く第2の次元に沿ったSDS-PAGE電気泳動を必要とする。これらの方法はまた、かなりの量の細胞材料も必要とする。2D SDS-PAGEゲルの分析は、ゲル上のタンパク質スポットの強度を決定することによって行うことができ、または免疫検出を用いて行うこともできる。他の態様において、タンパク質試料は質量分析法によって分析される。
免疫学的試験は本明細書に記載の方法およびアッセイとともに用いることができ、これには例えば、ウエスタンブロット法、放射性免疫アッセイ（RIA）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、例えばラテックス凝集、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、例えば、FIA（蛍光結合免疫アッセイ）、化学発光免疫アッセイ（CLIA）、電子化学発光免疫アッセイ（ECLIA、計数免疫アッセイ（CIA）、ラテラルフロー試験または免疫アッセイ（LFIA）、磁気免疫アッセイ（MIA）およびプロテインA免疫アッセイなどの手法を用いる競合アッセイおよび非競合的アッセイシステムが含まれる。そのようなアッセイを行うための方法は、適切な抗体反応物が利用可能であれば、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、免疫アッセイは定量的または半定量的な免疫アッセイであってよい。
免疫アッセイは、生物試料、典型的には血清などの流体試料における物質の濃度を、1つまたは複数の抗体のその抗原との相互作用を用いて測定する生化学的試験である。本アッセイは、抗体のその抗原との高度に特異的な結合を利用する。本明細書に記載の方法およびアッセイの場合には、標的ポリペプチドの、本明細書に記載の各々のタンパク質もしくはタンパク質断片、または単離されたペプチド、または融合タンパク質との特異的結合が免疫アッセイにおいて起こって、標的タンパク質／ペプチド複合体が形成される。続いて複合体が、当技術分野において公知の種々の方法によって検出される。免疫アッセイは多くの場合、検出用抗体の使用も必要とする。
酵素結合免疫吸着アッセイは、ELISA、酵素免疫アッセイまたはEIAとも呼ばれ、試料における抗体または抗原の存在を検出するために免疫学において主に用いられる生化学的手法である。ELISAは医学および植物病理学において診断用ツールとして用いられているほか、さまざまな産業において品質管理チェックとしても用いられている。
1つの態様において、特定の所望の抗原（すなわち、本明細書に述べるようなマーカー遺伝子ポリペプチド）に対する特異性を有する少なくとも1つの抗体を必要とするELISAを行うこともできる。既知量の試料および／または抗原を、固体支持体（通常はポリスチレン製マイクロタイタープレート）上に固定化する。固定化は、非特異的（例えば、表面への吸着による）でも、または特異的（例えば、表面上に固定化させた別の抗体を、抗原または一次抗体を捕捉するために用いる場合）でもよい。抗原を固定化した後に、検出用抗体を添加して、抗原との複合体を形成させる。検出用抗体を酵素と共有結合性に連結させることもでき、またはそれ自体を、バイオコンジュゲーション（bio-conjugation）によって酵素と連結させた二次抗体によって検出することもできる。各段階の間に、典型的にはプレートを、特異的に結合していないあらゆるタンパク質または抗体を除去するために、穏和な洗浄液によって洗浄する。最後の洗浄段階の後に、試料中の抗原の数量を指し示す可視シグナルを生じさせるために、酵素基質を添加することによってプレートを現像する。以前のELISAでは発色性基質を利用していたが、最近のアッセイでは感度がはるかに高い蛍光発生基質を使用している。
もう1つの態様においては、競合的ELISAを用いる。標的ポリペプチドまたはその断片を対象とする精製抗体を、マルチウェルプレートの固相上にコーティングする、すなわち、固体表面に対してコンジュゲートさせる。固体支持体上にコンジュゲートされていない精製抗体の第2のバッチも必要となる。これらの非コンジュゲート精製抗体は、検出目的で標識され、例えば、検出可能なシグナルを生じさせるために西洋ワサビペルオキシダーゼによって標識される。対象由来の試料（例えば、腫瘍、血液、血清または尿）を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体とともに、既知量の所望の抗原（例えば、標的ポリペプチドを含む既知の容積または濃度の試料）と混合し、続いて混合物を、競合的な組み合わせを形成させるために、コーティングされたウェルに添加する。試料中のポリペプチドレベルが高ければ、インキュベーション後に、標識抗体反応物-抗原という複合体が形成されると考えられる。この複合体は溶液中で遊離状態にあり、洗い流すことができる。ウェルの洗浄により、複合体は除去されると考えられる。続いてウェルを、ウェル中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体の位置決定のために、TMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）発色基質とともにインキュベートする。試料中の標的ポリペプチドレベルが高ければ、色調変化は全くないか、またはわずかであると考えられる。試料中に存在する標的ポリペプチドがわずかであるかまたは全くないならば、異なる複合体、すなわち固体支持体と結合した抗体反応物-標的ポリペプチドという複合体が形成される。この複合体はプレート上に固定化されており、洗浄段階では洗い流されない。その後のTMBとのインキュベーションにより、はるかに大きな色調変化が生じると考えられる。そのような競合的ELSA試験は、特異的で、感度が高く、再現性があり、かつ操作が容易である。
他の異なる形態のELISAもあり、それらも当業者に周知である。ELISAのための、当技術分野において公知の標準的な手法は、"Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980；およびOellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904に記載されている。これらの参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
1つの態様において、試料におけるポリペプチドのレベルは、免疫クロマトグラフィーアッセイまたはストリップ試験としても知られるラテラルフロー免疫アッセイ試験（LFIA）によって検出される。LFIAは、流体試料における抗原、例えばポリペプチドの存在（または欠如）を検出することを意図した単純なデバイスである。現在、多くのLFIA試験が、家庭での検査、医療現場での検査、または検査室での使用のいずれかを目的として、医療診断のために用いられている。LFIA試験は、試験試料が毛管作用を通して固体基質に沿って流れる免疫アッセイの一形態である。試料を試験ストリップに適用した後に、それを、試料と混ざり、基質を移行させて、別の抗体または抗原によって前処理された線または帯域に遭遇させる、微粒子と結合した有色反応物（試験標的抗原に対して特異的な抗体を一般に含む）に遭遇させる。試料中に存在する標的ポリペプチドのレベルによっては、有色反応物を捕捉して試験線または帯域の箇所で結合させることができる。LFIAは本質的には、試験ストリップ方式またはディップスティック方式に適応するように単一の軸に沿って操作させるのに適合化された免疫アッセイである。ストリップ試験は極めて用途が広く、尿、血液、水、および／または均質化された腫瘍試料などといった流体試料から広大な範囲の抗原を検出するために当業者による容易な改変が可能である。ストリップ試験はディップスティック試験としても知られ、その名前は、試験ストリップを、試験しようとする流体試料に「浸す」という文字通りの行為からとられている。LFIAストリップ試験は用いるのが容易で、わずかな訓練しか必要とせず、現地の現場で用いるために臨床現場検査（POCT）診断法の構成要素として容易に組み入れることができる。LFIA試験は、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイとして操作することができる。サンドイッチLFIAはサンドイッチELISAと類似している。試料をまず、標的抗原に対して産生された抗体によって標識された有色粒子に遭遇させる。試験線は同じ標的に対する抗体も含有するが、それは抗原上の異なるエピトープと結合してもよい。試験線は陽性試料では有色バンドを示すと考えられる。いくつかの態様において、ラテラルフロー免疫アッセイは、二重抗体サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、定量的アッセイ、またはそれらの変形物であってよい。競合的LFIAは競合的ELISAに類似している。試料をまず、標的抗原または類似体によって標識された有色粒子に遭遇させる。試験線は標的／その類似体に対する抗体を含有する。試料中の非標識抗原は抗体上の結合部位を遮断して、有色粒子の取り込みを妨げる。試験線は陰性試料では有色バンドとして示されると考えられる。ラテラルフロー技術にはいくつかの変形物がある。多重試験を作り出すために複数の捕捉帯域を適用することも可能である。
「ディップスティック」またはLFIA試験ストリップおよび他の固体支持体の使用は、当技術分野において、いくつかの抗原バイオマーカーに関して免疫アッセイの文脈で記載されている。米国特許第4,943,522号；第6,485,982号；第6,187,598号；第5,770,460号；第5,622,871号；第6,565,808号、米国特許出願第10／278,676号；米国特許出願第09／579,673号および米国特許出願第10／717,082号は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられ、そのようなラテラルフロー試験デバイスの非限定的な例である。免疫化学アッセイを介して可溶性抗原を検出するための「ディップスティック」技術の使用を記載している特許の例には、米国特許第4,444,880号；第4,305,924号；および第4,135,884号が非限定的に含まれ、それらはそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの3つの特許の装置および方法は、「ディップスティック」上に固定された構成要素と結合する可溶性抗原を含有する溶液に曝露され、その後にスティック上の構成要素-抗原複合体の検出が行われる、「ディップスティック」上の固体表面上に固定された第1の構成要素を広範囲に記載している。この「ディップスティック」技術の教示を、本明細書に述べるような抗体反応物を用いるポリペプチドの検出用に改変することは、当業者の技能の範囲内にある。
試料におけるポリペプチドのレベルを検出するために他の手法を用いることができる。そのような手法の1つは、ウエスタンブロット法（Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)）の変法の1つであるドットブロット法である。ウエスタンブロット法では、ポリペプチドまたはその断片を界面活性剤によって解離させ、SDS-PAGEゲル上で加熱および分離させた後に、ニトロセルロース膜またはPVDF膜などの固体支持体に移行させる。膜を、標的ポリペプチドまたはその断片に対して特異的な抗体反応物とともにインキュベートする。続いて膜を、非結合タンパク質および非特異的結合を有するタンパク質を除去するために洗浄する。検出可能に標識された酵素が結合した二次抗体または検出用抗体を、続いて、検査する試料中のポリペプチドの量を検出および評価するために用いることができる。検出可能な標識からのシグナルの強度は存在する酵素の量に対応し、それ故にポリペプチドの量に対応する。レベルは、例えば濃度測定によって定量することができる。
フローサイトメトリーは、流体の流れの中に懸濁化された細胞（または他の小粒子）の分析および選別のための周知の手法の1つである。この手法により、光学的、電子的または磁気的な検出装置を通って流れる単細胞の物理的および／または化学的特性の同時分析が可能になる。FACSに適用される場合、フローサイトメーターは、単一の縦列の形にある流体の流れの中の細胞を、蛍光標識した検出用マーカー（例えば、抗体反応物）を励起させて細胞の蛍光特性を測定する光源を通過させて移送するフローセルからなる。続いて、流体の流れを加圧下でノズルおよび荷電リング（charging ring）を通して吐出させ、流体を壊して小滴にする。フローセル装置および流体の流れは、個々の細胞間または結合した細胞群間の距離が比較的大きくなり、その結果、あらゆる小滴が単細胞または結合した細胞群よりも多くのものを含む確率が小さくなるように較正される。荷電リングは、小滴を、その中に含有されている細胞の蛍光特性に基づいて荷電させる。荷電した小滴を続いて、小滴の進路をその電荷（細胞の蛍光強度と関係がある）に基づいて変えてさまざまな容器内に入れる、静電荷電偏向システムによって偏向させる。FACSシステム（例えば、FACSARIA（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）およびFLOWJO（商標）バージョン7.6.4（TreeStar））は、総細胞数、ならびに1つまたは複数の蛍光特性を呈する細胞の数、例えば、CTCマーカー遺伝子に対して特異的な1つまたは複数の抗体反応物が結合した細胞の総数を検出して記録することができる。
ある態様において、本明細書に述べるような遺伝子発現産物を、代わりに、本明細書に記載のマーカー遺伝子と関連のある遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）発現のレベルを決定することによって決定することもできる。そのような分子は、腫瘍生検試料などの生物試料から単離すること、導き出すこと、または増幅することができる。mRNA発現の検出は当業者には公知であり、これには例えば、PCR手順、RT-PCR、定量的PCRまたはRT-PCR、ノーザンブロット分析、遺伝子発現変動、RNA保護アッセイ、マイクロアレイ分析、ハイブリダイゼーション法、次世代シークエンシングなどが非限定的に含まれる。次世代シークエンシング技術の非限定的な例には、Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454；Massively Parallel Signature Sequencing固相、可逆的ダイターミネーターシークエンシング；およびDNAナノボールシークエンシングが含まれる。
一般に、PCR手順は、（i）核酸試料またはライブラリー内の特定の遺伝子または配列に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ii）耐熱性DNAポリメラーゼを用いる複数回のアニーリング、伸長および変性を伴うその後の増幅、ならびに（iii）正しいサイズのバンドに関するPCR産物のスクリーニング、で構成される遺伝子増幅の方法を記述する。用いられるプライマーは、重合の開始をもたらすのに十分な長さおよび適切な配列を持つオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅しようとするゲノム遺伝子座の鎖に対して相補的となるように特別に設計される。1つの代替的な態様において、本明細書に記載の遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCR法によって、および定量的RT-PCR（QRT-PCR）法またはリアルタイムPCR法によって決定することができる。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は当技術分野において周知である。本明細書に記載のマーカー遺伝子の核酸配列には、ヒト、マウスおよびラットといった種々の種についてNCBIアクセッション番号が割り当てられている。したがって、当業者は、各々の遺伝子のmRNAレベルを決定するために、公知の配列に基づいて適切なプライマーを設計することができる。
核酸分子およびリボ核酸（RNA）分子は、当技術分野において周知であるいくつかの手順のいずれかを用いて特定の生物試料から単離することができ、選択される特定の単離手順は、特定の生物試料にとって適切である。例えば、凍結融解およびアルカリ溶解手順は、固体材料から核酸分子を得るために有用でありうる；熱およびアルカリ溶解手順は、尿から核酸分子を得るために有用でありうる；かつ、プロテイナーゼK抽出は、血液から核酸を得るために用いることができる（Roiff, A et al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)）。
一般に、PCR手順は、（i）核酸試料またはライブラリー内の特定の遺伝子に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ii）DNAポリメラーゼを用いる複数回のアニーリング、伸長および変性を伴うその後の増幅、ならびに（iii）正しいサイズのバンドに関するPCR産物のスクリーニング、で構成される遺伝子増幅の方法を記述する。用いられるプライマーは、重合の開始をもたらすのに十分な長さおよび適切な配列を持つオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅しようとする核酸分子の各鎖に対して相補的となるように特別に設計される。
1つの代替的な態様において、本明細書に記載の遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCR法によって、および定量的RT-PCR（QRT-PCR）法またはリアルタイムPCR法によって決定することができる。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は当技術分野において周知である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の反応物（例えば、抗体反応物および／または核酸プローブ）の1つまたは複数は、検出可能な標識を含むこと、および／または検出可能なシグナル（例えば、化合物を検出可能な産物に変換する反応を触媒することによる）を生じる能力を含むことができる。検出可能な標識は、例えば、光吸収性色素、蛍光色素、または放射性標識を含みうる。検出可能な標識、それらを検出する方法、およびそれらを反応物（例えば、抗体および核酸プローブ）に組み入れる方法は、当技術分野において周知である。
いくつかの態様において、検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁的、放射化学的または化学的な手段によって検出しうる標識、例えば蛍光、化学蛍光または化学発光など、または他の任意の適切な手段が含まれうる。本明細書に記載の方法に用いられる検出可能な標識は、一次標識（標識が、直接的に検出可能であるかまたは直接的に検出可能なモイエティーを生成するモイエティーを含む場合）であってもよく、または二次標識（検出可能な標識が、例えば二次抗体および三次抗体を用いる免疫学的標識において一般的であるように、検出可能なシグナルを生じるように別のモイエティーと結合する場合）であってもよい。検出可能な標識は、共有結合的または非共有結合的な手段によって反応物と連結させることができる。または、リガンド-受容体結合対配置を介して反応物との結合を実現する分子、または他のそのような特異的認識分子を直接的に標識することなどによって、検出可能な標識を連結させることもできる。検出可能な標識には、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素が非限定的に含まれうる。
他の態様において、検出反応物は、蛍光化合物を有する標識である。蛍光標識された抗体が適正な波長の光に曝露されると、その存在を蛍光によって検出することができる。いくつかの態様において、検出可能な標識は、蛍光色素分子または蛍光団であってよく、これには、フルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレサミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、ペリデニンクロロフィル、シアニン、タンデムコンジュゲート、例えばフィコエリトリン-Cy5（商標）など、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびオレゴングリーン（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、テキサスレッドおよびテトラローダミンイソチオシアネート（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes（商標）、6-カルボキシフルオレセイン（6-carboxyfhiorescein）（略号FAMおよびFによって一般的に知られる）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（6-carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorofiuorescein）（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfiuorescein）（JOEまたはJ）、N,N,N',N'-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）、およびローダミン110；シアニン色素、例えば、Cy3、Cy5およびCy7色素；クマリン、例えばウンベリフェロン；ベンジミド色素、例えば、Hoechst 33258；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、シアニン色素、例えばCy3、Cy5など；BODIPY色素ならびにキノリン色素が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、検出可能な標識は、3H、125I、35S、14C、32Pおよび33Pを非限定的に含む放射性標識であってよい。いくつかの態様において、検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを非限定的に含む酵素であってよい。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、色シグナル、または蛍光シグナルを生じうる。抗体反応物を検出可能に標識するために用いることを想定している酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、検出可能な標識は、ルシゲニン、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルを非限定的に含む化学発光標識である。いくつかの態様において、検出可能な標識は、コロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびラテックス）ビーズを非限定的に含むスペクトル比色標識であってよい。
いくつかの態様において、検出反応物が、検出可能なタグ、例えばc-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HISまたはビオチンなどによって標識されていてもよい。他の検出系、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン系を用いることもできる。この系では、関心対象のバイオマーカーに対して免疫反応性がある（すなわち、特異的な）抗体をビオチン化する。バイオマーカーと結合したビオチン化抗体の数量を、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発色（chromagenic）基質を用いて決定する。そのようなストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キットは、例えば、DAKO；Carpinteria, CAから市販されている。また、反応物を、152Euまたはランタン系列の他のものなどの蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの金属キレート基を用いて反応物に結びつけることができる。
本明細書に記載の諸局面のいずれかのいくつかの態様において、複数の遺伝子の発現産物のレベルは同時に決定することもでき（例えば、多重アッセイ）、または並行して決定することもできる。いくつかの態様においては、200種を上回らない他の遺伝子の発現産物のレベルを決定する。いくつかの態様においては、100種を上回らない他の遺伝子の発現産物のレベルを決定する。いくつかの態様においては、20種を上回らない他の遺伝子の発現産物のレベルを決定する。いくつかの態様においては、10種を上回らない他の遺伝子の発現産物のレベルを決定する。
「試料」または「試験試料」という用語は、本明細書で用いる場合、生物体から採取または単離された試料、例えば、対象由来の腫瘍試料のことを表す。例示的な生物試料には、生物流体試料；血清；血漿；尿；唾液；腫瘍試料；腫瘍生検試料および／または組織試料などが非限定的に含まれる。この用語はまた、上述した試料の混合物も含む。「試験試料」という用語はまた、処理されていない、または前処理された（または前加工処理された）生物試料も含む。いくつかの態様において、試験試料は対象由来の細胞を含みうる。いくつかの態様において、試験試料は腫瘍細胞試験試料であってよく、例えば、試料は癌性細胞、腫瘍由来の細胞、および／または腫瘍生検試料をを含みうる。いくつかの態様において、試験試料は血液試料であってよい。
試験試料は、細胞の試料を対象から取り出すことによって得ることができるが、以前に単離された細胞（例えば、事前の時点に単離され、かつ同じであるかまたは別の人によって単離された）を用いて実現することもできる。加えて、試験試料は新たに収集された試料であってもよく、または以前に収集された試料であってもよい。
いくつかの態様において、試験試料は処理されていない試験試料である。本明細書で用いる場合、「処理されていない試験試料」という語句は、溶液中での希釈および／または懸濁化を除いて、事前の試料前処理を受けていない試験試料のことを指す。試験試料を処理するための例示的な方法には、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結および融解、ならびにそれらの組み合わせが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、試験試料は凍結された試験試料、例えば、凍結組織であってよい。凍結試料は、本明細書に記載の方法、アッセイおよびシステムを使用する前に融解させることができる。融解後に、凍結試料を遠心分離して、その後に本明細書に記載の方法、アッセイおよびシステムに供することができる。いくつかの態様において、試験試料は、清澄化された試験試料、例えば、遠心分離、および清澄化された試験試料を含む上清の収集によるものである。いくつかの態様において、試験試料は、前加工処理された試験試料、例えば、遠心分離、濾過、融解、精製およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される処理に起因する上清または濾液であってよい。いくつかの態様において、試験試料は、化学的および／または生物学的反応物によって処理されていてよい。化学的および／または生物学的反応物は、加工処理中の、試料中の生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）を含む、試料の安定性を保護および／または維持するために使用することができる。1つの例示的な反応物はプロテアーゼ阻害薬であり、これは一般に、加工処理中のタンパク質の安定性を保護および／または維持するために用いられる。当業者は、本明細書に述べるような発現産物のレベルの決定のために必要とされる生物試料の前加工処理のために適切な方法および過程を十分に把握している。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法、アッセイおよびシステムは、対象から試験試料を得る段階をさらに含みうる。いくつかの態様において、対象はヒト対象であってよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法およびアッセイは、本明細書に記載のマーカー遺伝子のうち1つまたは複数の発現産物のレベルを測定するために、CTCまたはCTCの可能性があるものを試料から単離する段階をさらに含みうる。非限定的な例として、CTCは、例えば、流体力学的サイズに基づく分離、および／または血液試料中に存在する他の細胞型の免疫枯渇（immunodepletetion）によって、血液試料から単離することができる。本明細書において実施例に記載されているCTC-iChipは、CTCを単離するためのこれらの2つのアプローチを組み合わせている。
CTCのレベルが高いか、または少なくとも検出可能である対象は、CTCを特異的に標的とする治療法による治療によって恩恵を受ける可能性が非常に高い。したがって、本明細書において提供されるのは、対象がCTCマーカー遺伝子標的療法による治療に反応する可能性が高いか否かを判定する方法であって、血液中および／または癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；ならびに発現産物のレベルが参照基準レベルに比して高い場合に、対象が治療に反応する可能性が高いと判定する段階、を含む方法である。CTCマーカー遺伝子標的療法について、本明細書において以下に考察する。
治療法の投与後のCTCレベルの低下は、対象の病状の改善、例えば、癌のサイズ、増殖、および／または転移能が低下したことの指標となりうる。したがって、本明細書において提供されるのは、対象の治療をモニターするための方法であって、癌治療法をそれを必要とする対象に投与する段階；血液中および／または癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；ならびにCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルが参照基準レベルに比して低い場合に対象が反応していると判定し、CTCマーカー遺伝子発現産物が参照基準レベルに比して低くない場合に対象が治療に反応していないと判定する段階、を含む方法である。いくつかの態様において、治療法は化学療法、外科療法、および／または放射線療法である。いくつかの態様において、治療法はCTCマーカー遺伝子標的療法である。いくつかの態様において、参照基準レベルは、投与の段階の前の患者における遺伝子発現産物のレベルである。
本明細書に記載のCTCマーカー遺伝子を直接的に標的化すること、ならびに／またはCTCのレベルおよび／もしくは病原性活性（例えば、転移活性）を低下させるために化学療法薬を物理的に標的化するために用いることができる。したがって、本明細書に記載されるのは、対象における癌を治療する方法であって、CTCマーカー遺伝子標的療法の治療的有効量を対象に投与する段階を含む方法である。いくつかの態様において、対象は、CTCのレベルが高値である、ならびに／または血液中および／もしくは癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子のレベルが高値であると判定された対象である。
いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法はCTCマーカー遺伝子の阻害薬を含むことができ、例えば、CTCマーカー遺伝子標的療法は、CTCマーカー遺伝子のレベルおよび／または活性を阻害することができる。本明細書で用いる場合、「阻害薬」という用語は、標的化された発現産物（例えば、標的をコードするmRNA、または標的ポリペプチド）の発現および／または活性を、例えば、少なくとも10％またはそれを上回って、例えば、10％もしくはそれを上回って、50％もしくはそれを上回って、70％もしくはそれを上回って、80％もしくはそれを上回って、90％もしくはそれを上回って、95％もしくはそれを上回って、または98％もしくはそれを上回って低下させることのできる作用物質のことを指す。CTCマーカー遺伝子の阻害薬の有効性、例えば、それがCTCマーカー遺伝子のレベルおよび／または活性を低下させる能力は、例えば、CTCマーカー遺伝子の発現産物のレベルおよび／または活性を測定することによって決定することができる。ある所与のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定するための方法は当業者に公知であり、例えば、RNAのレベルを決定するためにプライマーを用いるRTPCRを用いること、およびポリペプチドのレベルを決定するために抗体を用いるウエスタンブロット法を用いることができる。例えばCTCマーカー遺伝子の活性は、例えば、当技術分野において公知であって本明細書中の他所に記載されている方法を用いて、CTCのレベルおよび／または生存を測定することによって測定することができる。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子の阻害薬は、阻害性核酸；アプタマー；抗体反応物；抗体；または小分子であってよい。
いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子の阻害薬は抗体反応物であってよい。本明細書で用いる場合、「抗体」とは、抗体を天然に産生するいずれかの種に由来するか、または組換えDNA技術によって作り出されるかに関係なく；血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌のいずれから単離されるかにも関係なく、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE分子、またはそれらの抗原特異的抗体断片（Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド連結Fv、scFv、単一ドメイン抗体、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合型scfv、ダイアボディを非限定的に含む）のことを指す。
本明細書に述べるように、「抗原」は、抗体物質上の結合部位による結合を受ける分子のことである。典型的には、抗原は抗体リガンドによる結合を受け、インビボで抗体を産生させることができる。抗原はポリペプチド、タンパク質、核酸もしくは他の分子、またはそれらの部分であってよい。「抗原決定基」という用語は、抗原結合性分子、より詳細には前記分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープのことを指す。
本明細書で用いる場合、「抗体反応物」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつある所与の抗原と特異的に結合するポリペプチドのことを指す。抗体反応物は、抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。いくつかの態様において、抗体反応物は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。例えば、抗体は、重（H）鎖可変領域（本明細書ではVHと略記）および軽（L）鎖可変領域（本明細書ではVLと略記）を含みうる。もう1つの例では、抗体は2つの重（H）鎖可変領域および2つの軽（L）鎖可変領域を含みうる。「抗体反応物」という用語は、抗体の抗原結合性断片（例えば、単鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、およびドメイン抗体（dAb）断片（例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照；これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる））ならびに完全な抗体を範囲に含む。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（ならびにそれらのサブタイプおよびそれらの組み合わせ）の構造的特徴を有しうる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラットおよび霊長動物（ヒトおよび非ヒト霊長動物）抗体ならびに霊長類化抗体を含む、任意の供給源に由来してよい。抗体にはまた、ミニボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含まれる。
VH領域およびVL領域は、「相補性決定領域」（「CDR」）と名づけられた超可変性領域と、その間に散在する、「フレームワーク領域」（「FR」）と名づけられたより保存性の高い領域にさらに細分することができる。フレームワーク領域およびCDRの範囲は以前に明確にされている（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照；それらはそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）。各VHおよびVLは典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
「抗原結合性断片」または「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、関心対象の標的と特異的に結合する能力を保っている完全長抗体の1つまたは複数の断片を指して用いられる。完全長抗体の「抗原結合性断片」という用語の範囲に含まれる結合性断片の例には、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；（iii）VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインまたはVLドメインからなるdAb断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546；これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）；および（vi）特異的な抗原結合機能を保っている、単離された相補性決定領域（CDR）。本明細書で用いる場合、「特異的結合」という用語は、第1の実体が、第2の標的実体と、それが標的でない第3の実体と結合するよりも高い特異性および親和性で結合する、2つの分子、化合物、細胞および／または粒子の間の化学的相互作用のことを指す。いくつかの態様において、特異的結合は、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性が、第3の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、またはそれを上回ることを指すことができる。
さらに、かつ本明細書に述べるように、組換えヒト化抗体を、ヒトにおける治療法のために、機能的活性を維持しながら潜在的な免疫原性を低下させるために、さらに最適化することができる。この点に関して、機能的活性とは、本明細書に述べるような組換え抗体またはその抗体反応物に付随する1つまたは複数の既知の機能的活性を示すことができるポリペプチドを意味する。そのような機能的活性には、例えば、ある所与のCTCマーカー遺伝子と結合する能力が含まれる。
いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子の阻害薬は、阻害性核酸反応物であってよい。いくつかの態様において、阻害性核酸は阻害性RNA（iRNA）である。二本鎖RNA分子（dsRNA）は、RNA干渉（RNAi）として知られる高度に保存された調節機構で遺伝子発現を阻止することが示されている。本明細書に記載の阻害性核酸は、長さが30ヌクレオチドまたはそれ未満、すなわち15～30ヌクレオチドの長さ、一般に19～24ヌクレオチドの長さを有するRNA鎖（アンチセンス鎖）の領域を有し、その領域は標的化されたmRNA転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である。これらのiRNAの使用により、mRNA転写物の標的化分解が可能になり、その結果として標的の発現および／または活性の低下がもたらされる。
本明細書で用いる場合、「iRNA」という用語は、この用語が本明細書において定義されるようにRNAを含み、かつRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）経路を介してRNA転写物の標的化切断を媒介する作用物質のことを指す。1つの態様において、本明細書に述べるようなiRNAは、標的mRNAの発現および／または活性の阻害を生じさせる。ある態様においては、細胞を阻害薬（例えば、iRNA）と接触させることにより、その結果として、細胞における標的mRNAレベルは、iRNAが存在しない細胞内で見いだされる標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、最大で100％までの減少をもたらす。
いくつかの態様において、iRNAはdsRNAであってよい。dsRNAは、dsRNAが用いられる条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的である2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現の間に形成されるmRNAの配列に由来しうる。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的である領域を含み、その結果、2本の鎖は、好適な条件下で組み合わされるとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。一般に、二重鎖構造は15塩基対以上30塩基対以下であり、より一般的には18塩基対以上25塩基対以下であり、さらにより一般的には19塩基対以上24塩基対以下であり、最も一般的には19塩基対以上21塩基対以下である。同様に、標的配列に対する相補性領域は15ヌクレオチド長以上30ヌクレオチド長以下であり、より一般的には18ヌクレオチド長以上25ヌクレオチド長以下であり、さらにより一般的には19ヌクレオチド長以上24ヌクレオチド長以下であり、最も一般的には19ヌクレオチド長以上21ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、dsRNAは15ヌクレオチド長以上20ヌクレオチド長以下であり、他の態様において、dsRNAは25ヌクレオチド長以上30ヌクレオチド長以下である。当業者は認識しているであろうが、切断のための標的となるRNAの標的領域は、ほとんどの場合、より大きいRNA分子の一部、しばしばmRNA分子である。該当する場合、mRNA標的の「一部」は、RNAi指向性切断（すなわち、RISC経路を経由する切断）のための基質であるのに十分な長さであるmRNA標的の連続した配列である。9塩基対ほどの短さである二重鎖を有するdsRNAは、ある状況下では、RNAi指向性RNA切断を媒介する。ほとんどの場合、標的は少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは15～30ヌクレオチド長である。
さらにもう1つの態様において、iRNAのRNA、例えば、dsRNAは、安定性または他の有益な特性を強化するために化学修飾される。本発明において特徴となる核酸は、"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているもののような、当技術分野において十分確立された方法によって合成および／または修飾することができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。修飾には、例えば、（a）末端修飾、例えば、5'端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆結合など）、3'端修飾（コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆結合など）など、（b）塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくはパートナーの広範なレパートリーと塩基対合する塩基による置き換え、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲートされた塩基など、（c）糖修飾（例えば、2'位または4'位で）、または糖の置き換え、ならびに（d）ホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む骨格修飾が含まれる。本明細書に記載の態様において有用なRNA化合物の具体例には、修飾された骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないRNAが非限定的に含まれる。修飾された骨格を有するRNAには、とりわけ、骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書においては、かつ当技術分野において時に言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたRNAもオリゴヌクレオシドであると見なすことができる。特定の態様において、修飾されたRNAは、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有する。
修飾されたRNA骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、2'-5'結合したこれらの類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'へ、または2'-5'から5'-2'へ結合する、逆向きの極性を有するものを含むことができる。また、さまざまな塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。上記のリン含有結合の調製を教示している代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639号；第6,608,035号；第6,683,1677号；第6,835,826号；第6,858,715号；第6,867,289号；第6,867,294号；第6,878,805号；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933号；第7,321,029号；第7,834,171号；第7,919,612号；第7,960,360号；第7,989,603号；第8,309,707号；第6,524,681号；および米国特許RE39464号が非限定的に含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
内部にリン原子を含まない修飾されたRNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混在性のヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混在性のN、O、SおよびCH2構成要素部分を有する他のもの、を有するものが含まれる。上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号、および第5,677,439号が非限定的に含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
iRNAにおける使用が好適であるかまたは想定される他のRNA模倣体では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が、新規の基によって置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の1つであるRNA模倣体は、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物では、RNAの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられる。核酸塩基は保たれ、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示している代表的な米国特許には、米国特許第5,539,082号；第5,714,331号；および第5,719,262号が非限定的に含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。PNA化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に見いだすことができる。
本発明において特徴となるいくつかの態様は、ホスホロチオエート骨格を有するRNA、ならびにヘテロ原子骨格、特に上述の米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--［メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られる］、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--、および--N(CH3)--CH2--CH2--［式中、ネイティブ性のホスホジエステル骨格は--O--P--O--CH2--として表される］、ならびに上述の米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、本明細書において特徴となるRNAは、上述の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。
また、修飾されたRNAは、1つまたは複数の置換糖モイエティーも含有しうる。本明細書において特徴となるiRNA、例えばdsRNAは、2'位に以下のうち1つ：OH；F；O-、S-もしくはN-アルキル；O-、S-もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル、を含むことができ、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換型または非置換型のC1～C10アルキルまたはC2～C10アルケニルおよびアルキニルであってよい。例示的な適した修飾には、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2が含まれ、式中、nおよびmは、1～約10である。他の態様において、dsRNAは、2'位に以下のうち1つを含む：C1～C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、もしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、介入物、iRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはiRNAの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基。いくつかの態様において、修飾には、2'-メトキシエトキシ（2'-O--CH2CH2OCH3、これは2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られる）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわちアルコキシ-アルコキシ基が含まれる。もう1つの例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に述べるような、2'-DMAOEとしても知られる2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、および同じく本明細書において以下の実施例に記載される、2'-ジメチルアミノオキシエトキシエトキシ（当技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても知られる）、すなわち2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2である。
他の修飾には、2'-メトキシ（2'-OCH3）、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2）および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾を、iRNAのRNA上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上または2'-5'結合dsRNA内の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位に行うこともできる。また、iRNAが、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチルモイエティーなどの糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許には、米国特許第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811号；第5,576,427号；第5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,639,873号；第5,646,265号；第5,658,873号；第5,670,633号、および第5,700,920号；第8,084,600号；第8,124,745号；第8,377,644号が非限定的に含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
iRNAはまた、核酸塩基（当技術分野ではしばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換も含みうる。本明細書で用いる場合、「非修飾」もしくは「天然」の核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成性および天然性の核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどが含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に開示されたもの；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されたもの、およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されたものが含まれる。これらの核酸塩基のうちある種のものは、本発明において特徴となるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6～1.2℃高めることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、例示的な塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に有用である。
上述した修飾された核酸塩基のある種のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示している代表的な米国特許には、上述した米国特許第3,687,808号、ならびに米国特許第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；および第7,495,088号が非限定的に含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられ、米国特許第5,750,692号も参照により本明細書に組み込まれる。
また、iRNAのRNAを、1つまたは複数のロックド核酸（LNA）を含むように修飾することもできる。ロックド核酸は、修飾リボースモイエティーを有するヌクレオチドであり、このリボース部分は、2'および4'炭素を接続する追加の架橋を含む。この構造は、リボースを3'-endo構造配座に効果的に「ロックする」。siRNAに対するロックド核酸の付加は、血清中のsiRNAの安定性を高め、オフターゲット効果を低下させることが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook, OR. et al., (2007) Mol Cane Ther 6(3):833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示している代表的な米国特許には、米国特許第6,268,490号；第6,670,461号；第6,794,499号；第6,998,484号；第7,053,207号；第7,084,125号；および第7,399,845号が非限定的に含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
本発明において特徴となるiRNAのRNAのもう1つの修飾は、iRNAの活性、細胞分布、薬物動態学的特徴、またはiRNAの細胞内取り込みを強化する1つまたは複数のリガンド、モイエティーまたはコンジュゲートと、RNAとを化学的に連結させることを伴う。そのようなモイエティーには、コレステロールモイエティー（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ベリル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett, 1995, 36:3651-3654）、パルミチルモイエティー（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロールモイエティー（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）などの脂質部分が非限定的に含まれる。
いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は、CTCマーカー遺伝子発現産物と結合する作用物質を含むことができ、作用物質は化学療法剤である。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は、CTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物および化学療法薬を含む。CTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物は、例えば、CTCマーカー遺伝子ポリペプチドと結合する抗体反応物であってよい。結合抗体反応物は阻害薬であってもよく、またはそれ自体では阻害効果を示さなくてもよい。CTCマーカー遺伝子と、それ故にCTCと結合することにより、それは化学療法薬を循環血液中および／または腫瘍の間質中のCTC細胞内に濃縮および局在させ、有効性を高めるとともに副作用を低下させる。
いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は、表14から選択されるマーカー遺伝子と結合するCTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物を含む。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は、以下からなる群より選択されるマーカー遺伝子と結合するCTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物を含む：IL6ST、SULF2、およびSV2A。
本明細書で用いる場合、「化学療法薬」という用語は、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有する、あらゆる化学的または生物学的な作用物質のことを指す。そのような疾患には、腫瘍、新生物および癌、ならびに過形成性増殖を特徴とする疾患が含まれる。これらの作用物質は、癌細胞が持続的増殖のために依存している細胞活性を阻害するように機能することができる。すべての態様のいくつかの局面において、化学療法薬は細胞周期阻害薬または細胞分裂阻害薬である。本発明の方法において有用な化学療法薬のカテゴリーには、アルキル化／アルカノイド剤、代謝拮抗剤、ホルモンまたはホルモン類似体、および多種多様な抗悪性腫瘍薬が含まれる。これらの作用物質のほとんどは、癌細胞に対して直接的にまたは間接的に毒性がある。1つの態様において、化学療法薬は放射性分子である。当業者は、有用な化学療法を容易に特定することができる（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition；Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed. 2000 Churchill Livingstone, Inc；Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995；Fischer D S, Knobf M F, Durivage H J (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993を参照）。いくつかの態様において、化学療法薬は細胞傷害性化学療法薬である。本明細書で用いる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害するかもしくは妨げる、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質のことを指す。この用語は、放射性同位体（例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、およびLuの放射性同位体）、化学療法薬および毒素、例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性のある毒素を、その断片および／または変異体を含めて含むものとする。
化学療法薬の非限定的な例には、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103；アルキル化剤、例えばチオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロフォスファミドなど；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）など；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ1IおよびカリケアマイシンωI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）；ダイネミシンAを含むダイネミシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネートなど；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連した色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、アドリアマイシン（ADRIAMYCIN）（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンCなど、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補給剤、例えばフロリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（elfornitine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサマイトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンAおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール（TAXOL）（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、パクリタキセルのクレモフォール無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）であるアブラキサン（ABRAXANE）（登録商標）、およびタキソテール（TAXOTERE）（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ジェムザール（GEMZAR）（登録商標）ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（NAVELBINE）（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Camptosar, CPT-11）（イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンとの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害薬RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイド、例えばレチノイン酸など；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン治療レジメン（FOLFOX）を含む、オキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb（登録商標））；細胞増殖を低下させるPKC-α、Raf、H-Ras、EGFR（例えば、エルロチニブ（タルセバ（Tarceva）（登録商標）））およびVEGF-Aの阻害薬、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれる。
いくつかの態様においては、結合抗体反応物と化学療法薬を直接的にコンジュゲートさせること、および／または互いに結合させることができ、例えば、それが抗体-薬物コンジュゲートであってもよい。いくつかの態様において、結合は、例えば水素、静電またはファンデルワールス相互作用による非共有結合性であってもよいが、しかし、結合が共有結合性であってもよい。「コンジュゲートされた」とは、少なくとも2つの分子の共有結合を意味する。いくつかの態様において、組成物は抗体-薬物コンジュゲートであってよい。
いくつかの態様において、結合抗体反応物を、複数の化学療法用分子と結合させること、および／またはコンジュゲートさせることができる。いくつかの態様において、ある所与の化学療法用分子と結合抗体反応物分子との比は約1：1～約1,000：1であってよく、例えば、単一の抗体結合反応物分子を、約1～約1,000個の個々の化学療法用分子と連結させること、コンジュゲートさせること、などができる。
いくつかの態様において、結合抗体反応物および化学療法薬がスカフォールド材料の中に存在してもよい。治療用組成物に用いるのに適したスカフォールド材料は当技術分野において公知であり、これには、ナノ粒子；マトリックス；ヒドロゲル；ならびに生体材料性、生体適合性、および／または生分解性のスカフォールド材料が非限定的に含まれる。本明細書で用いる場合、「ナノ粒子」という用語は、約10-9すなわち10億分の1メートルのオーダーである粒子のことを指す。「ナノ粒子」という用語は、ナノスフェア；ナノロッド；ナノシェル；およびナノプリズムを含み、これらのナノ粒子はナノネットワークの一部であってもよい。
「ナノ粒子」という用語はまた、ナノ粒子のサイズを有するリポソームおよび脂質粒子も範囲に含む。本明細書で用いる場合、「マトリックス」という用語は、本明細書に記載の組成物（compostion）の構成成分（例えば、結合反応物、キナーゼ阻害薬、および／またはEGFR阻害薬）を含む3次元構造のことを指す。マトリックス構造の非限定的な例には、発泡体；ヒドロゲル；エレクトロスピニング法による繊維（electrospun fiber）；ゲル；繊維マット；スポンジ；3次元スカフォールド；不織マット；織物；編み物；ファイバーバンドル；ならびに繊維および他の材料形式（例えば、Rockwood et al. Nature Protocols 2011 6: 1612-1631、および米国特許出願公開第2011／0167602号；第2011／0009960号；第2012／0296352号；および米国特許第8,172,901号を参照されたい；これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。マトリックスの構造は、組成物の意図する用途に応じて当業者によって選択可能であり、例えば、エレクトロスピニング法によるマトリックスは、発泡体よりも大きな表面積を有しうる。
いくつかの態様において、スカフォールドはヒドロゲルである。本明細書で用いる場合、「ヒドロゲル」という用語は、水に不溶性であるが、大量の水を吸収および保持して、安定した、多くの場合は柔軟で曲げやすい構造を形成する、三次元ポリマー構造のことを指す。いくつかの態様においては、水がポリマーネットワークのポリマー鎖の間に浸透して、その後にヒドロゲルの膨潤および形成を引き起こすことができる。一般に、ヒドロゲルは高吸収性である。ヒドロゲルは、生物医学用途にとって多くの望ましい特性を有する。例えば、それらは無毒性で組織との適合性があるように作ることができ、かつそれらは水、イオンおよび小分子の透過性が高い。ヒドロゲルは超吸収性（それらは99％を上回る水分を含有しうる）であり、天然性（例えば、絹）または合成性のポリマー、例えばPEGで構成されうる。
本明細書で用いる場合、「生体材料」という用語は、生体適合性および生分解性である材料のことを指す。本明細書で用いる場合、「生体適合性」という用語は、細胞に対する毒性のない物質のことを指す。いくつかの態様において、物質は、インビトロでの細胞に対するその添加が、およそ20％未満またはそれに等しい細胞死をもたらす場合に「生体適合性」であると見なされる。いくつかの態様において、物質は、インビボでの細胞に対するその添加が、インビボで炎症および／または他の有害作用を誘導しない場合に「生体適合性」であると見なされる。本明細書で用いる場合、「生分解性」という用語は、生理的条件下で分解される物質のことを指す。いくつかの態様において、生分解性物質は、細胞機構によって分解される物質である。いくつかの態様において、生分解性物質は、化学的過程によって分解される物質である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、癌を有するかまたは癌を有すると診断された対象を、CTCマーカー遺伝子標的療法によって治療することに関する。いくつかの態様において、癌は膵癌であってよい。癌を有する対象は、癌を診断する現行の方法を用いて、医師によって同定されうる。これらの病状を特徴づけるとともに診断にも役立つ、癌、例えば膵癌の症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、上腹部の疼痛、胸やけ、悪心、嘔吐、下痢、悪液質、黄疸、肺塞栓症、トルソー症候群、および真性糖尿病が非限定的に含まれる。膵癌の診断に役立つ検査には、例えば、肝機能検査、CA19-9検査、CTおよび超音波内視鏡検査が非限定的に含まれる。膵癌の家族歴、または膵癌の危険因子（例えば、喫煙または飲酒）への曝露も、対象が癌を有する可能性が高いか否かを判定するのに、または癌の診断を下すのに役立つ。
本明細書に記載の組成物および方法は、癌、例えば膵癌を有する対象、または有すると診断された対象に投与することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、癌の症状を緩和する目的で、本明細書に記載の組成物、例えば、CTCマーカー遺伝子標的療法の有効量を対象に投与する段階を含む。本明細書で用いる場合、「癌の症状を緩和する」とは、癌に伴う任意の病状または症状を緩和することである。同等の無治療対照と比較して、そのような軽減は、いずれかの標準的な手法による測定で、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％またはそれを上回る。本明細書に記載の組成物を対象に投与するための種々の手段が当業者に公知である。そのような方法には、経口的、非経口的、静脈内、筋肉内、皮下、経皮的、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、局部への注射、または腫瘍内投与が非限定的に含まれる。投与は局所性でも全身性でもよい。
本明細書で用いる「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を緩和するために必要とされるCTCマーカー遺伝子標的療法の量のことを指し、所望の効果を与えるのに十分な薬理学的組成物の量に関する。「治療的有効量」という用語は、それ故に、典型的な対象に投与された場合に特定の抗癌効果をもたらすのに十分な、CTCマーカー遺伝子標的療法の量のことを指す。本明細書において用いられる有効量はまた、さまざまな状況で、疾患の症状の発生を遅延させる、疾患の症状の経過を変化させる（例えば、限定されることはないが、疾患の症状の進行を遅らせる）、または疾患の症状を好転させるのに十分な量を含むと考えられる。したがって、正確な「有効量」を特定することは一般に実用的ではない。しかし、任意の所与の場合に、当業者は慣行的な実験のみを用いて、適切な「有効量」を判定することができる。
有効量、毒性、および治療効果は、例えば、LD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を判定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて異なりうる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これはLD50／ED50という比として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイによってまず推定することができる。また、細胞培養において、または適切な動物モデルにおいて判定されたIC50（すなわち、症状の半値阻害を達成するCTCマーカー遺伝子標的療法の濃度）を含む循環血漿中濃度が達成されるように、ある用量を動物モデルに処方することもできる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適したバイオアッセイ、例えば、いくつかある中から例を挙げると、CTCレベルに関するアッセイによってモニターすることができる。投与量は、医師によって決定されて、観察される治療効果に適合するように、必要に応じて調整することができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の技術は、本明細書に述べるようなCTCマーカー遺伝子標的療法と、任意で薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。薬学的に許容される担体および希釈剤には、食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒が含まれる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として役立てることができる材料のいくつかの非限定的な例には、（1）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなど；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなど；（8）賦形剤、例えばカカオ脂および坐薬ワックスなど；（9）油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油など；（10）グリコール、例えばプロピレングリコールなど；（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）など；（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（15）アルギン酸；（16）発熱物質を含まない水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（22）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸など；（23）血清成分、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDLなど；（22）C2～C12アルコール、例えばエタノールなど；ならびに（23）薬学的製剤中に使用される他の無毒性適合物質が含まれる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料および抗酸化剤も、製剤中に存在しうる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書において互換的に用いられる。いくつかの態様において、担体は、活性作用物質、例えば本明細書に述べるようなCTCマーカー遺伝子標的療法の分解を阻害する。
いくつかの態様において、本明細書に述べるようなCTCマーカー遺伝子標的療法を含む薬学的組成物は、非経口剤形であってよい。非経口剤形の投与では、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御が回避されることから、非経口剤形は無菌であるか、または患者への投与の前に滅菌可能であることが好ましい。非経口剤形の例には、即座に注射できる溶液、注射用の薬学的に許容される媒体に即座に溶解または懸濁させることができる乾燥製品、即座に注射できる懸濁液、および乳濁液が非限定的に含まれる。加えて、患者の投与のために、DUROS（登録商標）型剤形および用量ダンピング（dose-dumping）を非限定的に含む、制御放出性の非経口剤形を調製することもできる。
ここに開示されたようなCTCマーカー遺伝子標的療法の非経口剤形を提供するために用いうる適した媒体は、当業者には周知である。例としては、滅菌水；注射用水USP；生理食塩液；グルコース溶液；限定されることはないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンゲル注射液などの水性媒体；限定されることはないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの水混和性媒体；ならびに限定されることはないが、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジルなどの非水性媒体が非限定的に含まれる。また、本明細書に開示されたようなCTCマーカー遺伝子標的療法の薬学的に許容される塩の溶解性を改変または変更する化合物を、従来の制御放出性の非経口剤形を含む、本開示の非経口剤形に組み入れることもできる。
また、CTCマーカー遺伝子標的療法を含む薬学的組成物を、経口投与に適するように、例えば、限定されることはないが、錠剤（分割錠もしくはコーティング錠を非限定的に含む）、丸剤、カプレット、カプセル、チュアブル錠、粉末パケット、カシェ剤、トローチ、オブラート剤、エアロゾルスプレイなどの分離した剤形として、または、限定されることはないが、シロップ、エリキシル剤、水性液体、非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油型乳剤、または油中水型乳剤などの液体として製剤化することもできる。そのような組成物は、あらかじめ決められた量の、開示される化合物の薬学的に許容される塩を含有し、当業者に周知の薬学の方法によって調製することができる。概論については、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照されたい。
従来の剤形は一般に、製剤からの急速または即時的な薬物放出をもたらす。薬物の薬理および薬物動態によっては、従来の剤形の使用は、患者の血液中および他の組織中での薬物濃度の大幅な変動につながる恐れがある。これらの変動は、投薬頻度、作用の発現、有効性の持続期間、治療域血中レベルの維持、毒性、副作用などのような、いくつかのパラメータに影響を及ぼしうる。制御放出製剤を用いて、薬物の作用の発現、作用の持続期間、治療ウィンドウ内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御しうることが有利である。特に、制御放出性または延長放出性の剤形または製剤を用いることで、薬物の最大の有効性を達成する一方で、薬物の過少投与（すなわち、最低治療レベルを下回る）および薬物の毒性レベルを超過することの両方から起こりうる、可能性のある有害作用および安全性の問題を最小限にすることを確実にできる。いくつかの態様において、CTCマーカー遺伝子標的療法は徐放製剤で投与されうる。
制御放出性の医薬製品は、その非制御放出性対応物によって達成されるものと比べて薬物療法を改善するという共通の目標を有する。理想的には、医学的治療における最適にデザインされた制御放出調製物の使用は、最少量の薬物を使用し、最小限の時間で病状を治癒させること、またはコントロールすることを特徴とする。制御放出製剤の利点には、1）薬物の活性延長；2）投薬頻度の低下；3）患者コンプライアンスの増大；4）薬物全体の使用量の減少；5）局所または全身副作用の軽減；6）薬物蓄積の最小化；7）血中レベルの変動低減；8）治療の有効性の改善；9）薬物活性の増強または消失の低下；および10）疾患または病状のコントロールの速度の改善が含まれる。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
ほとんどの制御放出製剤は、所望の治療効果を迅速に生じさせる量の薬物（有効成分）を最初に放出し、この治療的または予防的な効果のレベルを長期間にわたって維持するように残りの量の薬物を徐々にかつ持続的に放出するように設計される。体内でこの薬物の一定のレベルを維持するために、薬物は、代謝されて身体から排泄される薬物の量と置き換わる速度で剤形から放出されなければならない。有効成分の制御放出は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理的条件または化合物を非限定的に含む、さまざまな条件によって誘発することができる。
種々の公知の制御放出性または持続放出性の剤形、製剤およびデバイスを、本開示の塩および組成物とともに用いるために適合させることができる。例としては、米国特許第3,845,770号；第3,916,899号；第3,536,809号；第3,598,123号；第4,008,719号；第5674,533号；第5,059,595号；第5,591,767号；第5,120,548号；第5,073,543号；第5,639,476号；第5,354,556号；第5,733,566号；および第6,365,185B1号に記載されたものが非限定的に含まれる；これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。これらの剤形は、所望の放出プロフィールをさまざまな比率で提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム（例えば、OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA）など）、またはそれらの組み合わせを用いて、1つまたは複数の有効成分の緩徐放出または制御放出を提供するように用いることができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、併用療法の一部として、第2の作用物質および／または治療を対象に投与する段階をさらに含みうる。第2の作用物質および／または治療の非限定的な例には、本明細書において上述したように、放射線療法、手術および化学療法薬が含まれうる。
ある態様においては、本明細書に述べるようなCTCマーカー遺伝子標的療法を含む組成物の有効用量を、患者に1回投与することができる。ある態様においては、CTCマーカー遺伝子標的療法を含む組成物の有効用量を、患者に繰り返して投与することができる。全身投与の場合には、対象に、CTCマーカー遺伝子標的療法を含む組成物の治療量、例えば、0.1mg／kg、0.5mg／kg、1.0mg／kg、2.0mg／kg、2.5mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、15mg／kg、20mg／kg、25mg／kg、30mg／kg、40mg／kg、50mg／kg、またはより多くを投与することができる。
いくつかの態様においては、初期の治療レジメン後に、治療をより少ない頻度で投与することができる。例えば、3カ月間にわたって隔週で治療した後に、治療を月1回ずつ、6カ月間または1年間またはより長く繰り返すことができる。本明細書に記載の方法による治療は、病状のマーカーまたは症状のレベル、例えばCTCレベルを、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％、またはより多く低下させることができる。
本明細書に述べるような組成物の投与量は、医師によって決定されて、観察される治療効果に適合するように、必要に応じて調整することができる。治療の期間および頻度に関して、治療が治療的有益性をもたらす時期を判定するために、ならびに投与量を増加させるかまたは減少させるか、投与頻度を増加させるかまたは減少させるか、治療を中断するか否か、治療を再開するか否か、または治療レジメンに他の変更を加えるか否かを決定するために対象をモニターすることは、熟練した臨床医にとって一般的なことである。投薬スケジュールは、いくつかの臨床的因子、例えばCTCマーカー遺伝子標的療法に対する対象の感受性などに応じて、週1回から毎日までの間でさまざまでありうる。活性化の所望の用量または量を、一度に投与することもでき、または分割用量（subdose）、例えば2つ～4つの分割用量に分けて、ある期間にわたって、例えば1日を通じて適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することもできる。いくつかの態様において、投与は長期的に、例えば1つもしくは複数の用量および／または治療を数週間または数カ月にわたって毎日行うことができる。投薬および／または治療スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月または6カ月、またはそれより長い期間にわたって、毎日、1日2回、1日3回または1日4回、またはより多く投与することである。CTCマーカー遺伝子標的療法を含む組成物は、ある期間、例えば5分間、10分間、15分間、20分間または25分間にわたって投与することができる。
本明細書に記載の方法による、CTCマーカー遺伝子標的療法の投与のための投与量の範囲は、例えば、CTCマーカー遺伝子標的療法の形態、その効力、および本明細書に記載の病状の症状、マーカーまたは指標に関して望まれる低下の程度、例えば、CTCレベルに関して望まれる低下率に依存する。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くあるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態および性別に応じて異なると考えられ、当業者によって決定されうる。投与量はまた、何らかの合併症が生じた場合に、個々の医師によっても調整可能である。
CTCマーカー遺伝子標的療法の、例えば本明細書に記載の病状の治療における有効性、または本明細書に述べるような反応（例えば、CTCレベルの低下）を誘導する有効性は、熟練した臨床医によって決定されうる。しかし、治療は、本明細書に記載の方法による治療後に、本明細書に記載の病状の徴候または症状のうち1つまたは複数が有益な様式で変化するか、他の臨床的に許容される症状が改善する、もしくはさらには寛解するか、または所望の反応が、例えば少なくとも10％誘導される場合に、「有効な治療」と見なされ、この用語は本明細書においてそのように用いられる。有効性は、例えば、本明細書に記載の方法によって治療される病状のマーカー、指標、症状および／もしくは発生率、または適切な任意の他の測定可能なパラメーター、例えば、腫瘍のサイズおよび／または増殖を測定することによって評価することができる。また、有効性を、入院による評価で個体が悪化しなかったこと、または医学的介入の必要性がない（すなわち、疾患の進行が停止する）ことによって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載される。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例には、ヒトまたは動物が含まれる）における疾患の任意の治療を含み、これには（1）疾患を阻害すること、例えば、症状（例えば、疼痛もしくは炎症）の悪化を防止すること；または（2）疾患の重症度を緩和すること、例えば、症状の退縮を引き起こすことが含まれる。疾患の治療のための有効量は、それを必要とする対象に投与された時に、その疾患に対して有効な治療が、本明細書においてこの用語が定義された通りにもたらされるのに十分な量を意味する。作用物質の有効性は、病状の身体的指標または所望の反応（例えば、CTCレベル）を評価することによって判定することができる。そのようなパラメーターのいずれか1つまたはパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、投与および／または治療の有効性をモニターすることは、十分に当業者の技能の範囲内にある。有効性は、本明細書に記載の病状の動物モデルにおいて、例えば癌の治療に関して評価することができる。実験動物モデルを用いる場合、治療の有効性は、マーカーの統計的に有意な変化、例えばCTCレベルの変化が観測される場合に証明される。
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語および語句の意味を以下に提示する。別様に指定しない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語および語句は、以下に提示する意味を含む。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の態様を記載する上で助けとなるように与えられるものであり、特許請求された発明を限定することを意図するものではない。特に定義しない限り、本明細書において用いられるすべて技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書に提示されたその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に与えられる定義が優先されるものとする。
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語をここにまとめる。
「減少する」、「低下した」、「低下」、または「阻害する」という用語はすべて、本明細書において、統計的に有意な量の減少を意味して用いられる。いくつかの態様において、「低下させる」、「低下」または「減少する」または「阻害する」は、典型的には、参照基準レベル（例えば、所与の治療がない場合）と比較して、少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはより多くの減少を含むことができる。本明細書で用いる場合、「低下」または「阻害」は、参照基準レベルと比較した場合の完全な阻害または低下を包含しない。「完全な阻害」は、参照基準レベルと比較した場合の100％阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体にとって正常な範囲内として許容されるレベルまで低下することであってよい。
「増加した」、「増加する」、「強化する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書において、統計的に有意な量の増加を意味して用いられる。いくつかの態様において、「増加した」、「増加する」、「強化する」または「活性化する」という用語は、参照基準レベルと比較して、少なくとも10％の増加、例えば、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、もしくは最大で100％までの増加、もしくは参照基準レベルと比較して10～100％の間の任意の増加、または参照基準レベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍～10倍の間の任意の増加、もしくはより多い増加を意味することができる。マーカーまたは症状に関して、「増加する」は、そのようなレベルの統計的に有意な増加である。
本明細書で用いる場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長動物、齧歯動物、家畜または狩猟動物といった脊椎動物である。霊長動物は、チンパンジー、カニクイザル、クモザルおよびマカクザル、例えばアカゲザルを含む。齧歯動物は、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科動物、例えばイエネコ、イヌ科動物、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えばマス、ナマズおよびサケを含む。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物、例えば霊長動物、例えばヒトである。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであってよいが、これらの例には限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、癌の動物モデルを表す対象として好都合に用いることができる。対象は雄であっても雌であってもよい。
対象は、治療を必要とする病状（例えば、癌）またはそのような病状に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されているか、またはそれらに罹患しているかもしくはそれらを有すると同定されていて、かつ任意で、癌または癌に関連する1つもしくは複数の合併症に対する治療をすでに受けている対象であってよい。または、対象が、癌または癌に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断された対象であってもよい。例えば、対象は、癌または癌に関連する1つもしくは複数の合併症の1つもしくは複数の危険因子を示す対象であってもよく、または危険因子を示さない対象であってもよい。
特定の病状に対する治療を「必要とする対象」は、その病状を有する、その病状を有すると診断された、またはその病状を発症するリスクのある対象であってよい。
本明細書で用いる場合、「癌」または「腫瘍」という用語は、身体の臓器および系の正常な機能を妨害する、制御下にない細胞増殖のことを指す。癌または腫瘍を有する対象とは、その身体に客観的に測定可能な癌細胞が存在する対象である。この定義には、良性のがんおよび悪性癌、ならびに休眠状態の腫瘍または微小転移が含まれる。その当初の場所から遊走して重要な臓器に播種する癌は、罹患した臓器の機能の悪化を通じて、最終的に対象を死に至らせうる。
「作用物質」という用語は、一般に、通常は存在しないか、または細胞、組織もしくは対象に投与されるレベルでは存在しない任意の実体のことを指す。作用物質は、以下を非限定的に含む群から選択されうる：ポリヌクレオチド；ポリペプチド；小分子；および抗体またはその抗原結合性断片。ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAであってよく、一本鎖または二本鎖であってよく、かつ、例えば、ポリペプチドをコードする核酸および核酸類似体を含む群から選択されうる。ポリペプチドは、天然のポリペプチド、関心対象の機能を保っている突然変異ポリペプチドまたはその断片であってよいが、それらには限定されない。作用物質のさらなる例には、核酸アプタマー、ペプチド-核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、小型の有機分子または無機分子；サッカリド；オリゴ糖；多糖；生体高分子、ペプチド模倣体；核酸類似体および誘導体；細菌、植物、真菌または哺乳動物の細胞または組織などの生体物質から作製された抽出物、および天然性または合成性の組成物が非限定的に含まれる。作用物質を培地に適用して、そこで細胞と接触させてその作用を誘導することができる。または、作用物質が、作用物質をコードする核酸配列の細胞内への導入およびその転写の結果として細胞内にあって、細胞内での核酸および／またはタンパク質環境刺激の生成をもたらすこともできる。いくつかの態様において、作用物質は、合成性および天然性の非タンパク質性実体を非限定的に含む、任意の化学物質、実体またはモイエティーである。ある態様において、作用物質は、例えば、マクロライド、レプトマイシンおよび関連する天然産物またはそれらの類似体を含む、非置換もしくは置換アルキル、芳香族またはヘテロシクリルモイエティーから選択される化学モイエティーを有する小分子である。作用物質は、所望の活性および／もしくは特性を有することが知られていてもよく、または多様な化合物のライブラリーから選択することもできる。本明細書で用いる場合、「小分子」という用語は、「天然産物様」である化合物を指すことができるが、しかしながら、「小分子」という用語は、「天然産物様」化合物には限定されない。より正確に言えば、小分子は、典型的には、いくつかの炭素-炭素結合を含有し、かつ分子量が約50ダルトンを上回るが約5000ダルトン（5kD）未満であることを特徴とする。好ましくは、小分子は、3kD未満、さらにより好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。場合によっては、小分子が700ダルトンまたはそれ未満の分子量を有することが好ましい。
アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸などのさまざまな分子標的、ならびにさらには細胞および組織などとも特異的に結合する、短い合成一本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの小型核酸分子は、タンパク質または他の細胞標的と特異的に結合しうる二次構造および三次構造を形成することができ、本質的には抗体の化学的同等物である。アプタマーは高度に特異的であり、サイズが相対的に小さく、かつ非免疫原性である。アプタマーは一般に、SELEX（指数的エンリッチメントによるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment））として知られるバイオパニング法によって選択される（Ellington et al. Nature. 1990;346(6287):818-822；Tuerk et al., Science. 1990;249(4968):505-510；Ni et al., Curr Med Chem. 2011;18(27):4206-14；これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。任意の所与の標的に対してアプタマーを作製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、アプタマー-siRNAキメラおよびアプタマー標的化ナノ粒子治療薬を用いた前臨床試験は、癌およびHIVのマウスモデルにおいて非常に好成績を収めている（Ni et al., Curr Med Chem. 2011;18(27):4206-14）。
本明細書で用いる場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指して互換的に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化された、糖化された、グリコシル化された、など）およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸の重合体のことを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合、相対的に大きいポリペプチドについて用いられ、一方、「ペプチド」という用語は、多くの場合、小さいポリペプチドについて用いられるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用法には重複がある。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、遺伝子産物およびその断片に言及する場合に互換的に用いられる。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述のものの他の同等物、変異体、断片および類似体が含まれる。
本明細書で用いる場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの類似体の単位を組み込んだ任意の分子、好ましくは重合性分子のことを指す。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAのうちの1本の核酸鎖であってよい。または、一本鎖核酸は、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であってもよい。1つの局面において、核酸はDNAであってよい。もう1つの局面において、核酸はRNAであってよい。適した核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適した核酸分子は、mRNAを含むRNAである。
本明細書で用いる場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「改善」という用語は、その目的が、疾患または障害、例えば癌に関連する病状の進行または重症度を好転させる、緩和する、改善する、阻害する、緩徐にする、または停止させることにある治療的処置のことを指す。「治療すること」という用語は、癌に関連する病状、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を軽減または緩和することを含む。治療は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低下する場合に「有効」である。または、治療は、疾患の進行が低下または停止する場合に「有効」である。すなわち、「治療」は、治療を行わなかった場合に予想されるものと比較して、症状またはマーカーの改善だけでなく、症状の進行または悪化を休止させること、または少なくとも遅らせることも含む。有益な、または所望の臨床的結果には、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、1つまたは複数の症状の緩和、疾患範囲の縮小、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の緩和もしくは一時的緩和、寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）、および／または死亡率の減少が非限定的に含まれる。疾患の「治療」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの解放（姑息療法を含む）をもたらすことも含む。
本明細書で用いる場合、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば製薬業界において一般的に用いられる担体と組み合わされた活性作用物質のことを指す。「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適する化合物、物質、組成物および／または剤形を指して用いられる。
本明細書で用いる場合、「投与すること」という用語は、作用物質の所望の部位での少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路によって、本明細書に開示されたような化合物を対象の内部に配置することを指す。本明細書に開示された化合物を含む薬学的組成物は、対象に有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性のことを指し、一般に2標準偏差（2SD）またはそれを上回る差異を意味する。
実施例以外において、または特に指示のない限り、本明細書で用いられる成分の数量または反応条件を表すすべての数値は、すべての事例において、「約」という用語によって一部変更されているものと解釈されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージと併せて用いられる場合、±1％を意味しうる。
本明細書で用いる場合、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」は、組成物、方法、およびそれらの方法または組成物に必須であるその各々の成分に言及して用いられるが、必須であるか否かにかかわらず明記されていない要素を含めることも受け入れられる。
「からなる」という用語は、態様の説明に列挙されていないいかなる要素も含まない、本明細書に述べるような組成物、方法およびその各々の成分のことを指す。
本明細書で用いる場合、「から本質的になる」という用語は、所与の態様にとって必要な要素のことを指す。この用語は、その態様の基本的で新規な、または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
単数形の用語である「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に他のことを示していない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、「または（or）」という単語は、文脈が明確に他のことを示していない限り、「および」を含むものとする。本明細書に記載の方法および材料と類似または同等な方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、適した方法および材料については以下に述べる。「例えば（e.g.）」という略語は、例えば（ラテン語のexempli gratia）に由来するものであり、本明細書において非限定的な例を指すために用いられる。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義である。
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0)；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321)；Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., edsに見いだすことができる。
特に指示のない限り、本発明は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995)；またはMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)；Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss；5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)に記載されているような標準的な手順を用いて実施しており、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
他の用語は、本明細書において、本発明のさまざまな局面の説明において定義されている。
本出願の全体を通して引用される、参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願、および同時係属特許出願を含む、すべての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書に記載された技術と併せて用いられる可能性のある、そのような刊行物中に記載された方法を記載および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の提出日以前にさかのぼったそれらの開示のためのみに提供される。この点に関して、本発明者らが、先行発明の権限に基づいて、または任意の他の理由によって、そのような開示に先行する権利を持たないことを認めたものと見なされるべきではない。これらの文書の日付に関するすべての記述、またはそれらの内容に関する描写は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認も行うものではない。
本開示の態様の説明は、包括的であることも、本開示を開示された厳密な形態に限定することも意図していない。本開示の具体的な態様およびその例は、例示の目的で本明細書に記載されているが、関連する技術分野の当業者には理解されるであろうが、さまざまな同等な変更が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の段階または機能が、ある所与の順序で提示されているが、代替的な態様が異なる順序で機能を遂行することも考えられ、または複数の機能が実質的に同時に遂行されることも考えられる。本明細書において提供された本開示の教示を、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載されたさまざまな態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面を、必要であれば、上記の参考文献および出願の組成物、機能および概念を使用するように変更することで、本開示の別のさらなる態様を提供することができる。さらに、例えば、コドン縮重性のために、様々な変化を、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、基礎となるＤＮＡ配列において行うことができる。さらに、生物学的な機能的同等性を考慮することにより、いくつかの変化を、種類または量の点で生物学的または化学的な作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造に施すことができる。これらのおよび他の変更は、詳細な説明に照らして本開示に対して施すことができる。そのような変更物はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
前述の態様のいずれかの具体的な要素を、他の態様における要素と組み合わせること、またはそれと置き換えることができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点をこれらの態様に照らして説明しているが、他の態様がそのような利点を示すこともあり、本開示の範囲内に入るようにすべての態様がそのような利点を示すことは必ずしも必要でない。
本明細書に記載された技術を、以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例は決して、さらに限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書に記載された技術のいくつかの態様は、以下の番号付きの項目のいずれかに従って定義することができる。
1. 試料中の血中循環腫瘍細胞（CTC）を検出する方法であって、
試料中のPC-CTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；および
該マーカー遺伝子発現産物の検出レベルが参照基準レベルを上回る場合にPC-CTCが存在すると判定する段階
を含む、方法。
2. CTCが膵癌CTCである、項目1の方法。
3. 試料からCTCを単離する第1の段階をさらに含む、項目1～2のいずれかの方法。
4. 発現産物が核酸である、項目1～3のいずれかの方法。
5. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、項目4の方法：
RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーション。
6. 発現産物がポリペプチドである、項目1～3のいずれかの方法。
7. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、項目6の方法：
ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射線免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。
8. CTCマーカー遺伝子が表7；表8；または表14から選択される、項目1～7のいずれかの方法。
9. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目1～8のいずれかの方法：
ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1およびWNT4。
10. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目1～8のいずれかの方法：
ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。
11. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目1～9のいずれかの方法：
ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
12. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目1～9のいずれかの方法：
ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；およびDCN。
13. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目1～9のいずれかの方法：
TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC；およびARSA。
14. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目1～9のいずれかの方法：
IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON；およびSV2A。
15. 対象における癌を治療する方法であって、CTCマーカー遺伝子標的療法の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、方法。
16. 癌が膵癌である、項目15の方法。
17. CTCマーカー遺伝子標的療法がCTCマーカー遺伝子の阻害薬を含む、項目15～16のいずれかの方法。
18. 阻害薬が抗体反応物である、項目17の方法。
19. 阻害薬が阻害性核酸反応物である、項目17の方法。
20. CTCマーカー遺伝子標的療法がCTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物および化学療法薬を含む、項目15～19のいずれかの方法。
21. 前記対象が、血液中および／または癌の間質中に存在するCTCのレベルが高い、かつ／またはCTCマーカー遺伝子のレベルが高いと判定された対象である、項目15～20のいずれかの方法。
22. CTCマーカー遺伝子標的療法が、以下からなる群より選択されるマーカー遺伝子と結合するCTCマーカー遺伝子結合性抗体反応物を含む、項目15～21のいずれかの方法：
IL6ST、SULF2およびSV2A。
23. 対象がCTCマーカー遺伝子標的療法による治療に反応する可能性が高いか否かを判定する方法であって、
血液中および／または癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；ならびに
該発現産物のレベルが参照基準レベルに比して高い場合に、対象が治療に反応する可能性が高いと判定する段階
を含む、方法。
24. 試料からCTCを単離する第1の段階をさらに含む、項目23の方法。
25. 癌が膵癌である、項目23～24のいずれかの方法。
26. 発現産物が核酸である、項目23～25のいずれかの方法。
27. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、項目26の方法：
RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーション。
28. 発現産物がポリペプチドである、項目23～26のいずれかの方法。
29. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、項目28の方法：
ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射線免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。
30. PC-CTCマーカー遺伝子が表7；表8；または表14から選択される、項目23～29のいずれかの方法。
31. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目23～30のいずれかの方法：
ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1およびWNT4。
32. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目23～31のいずれかの方法：
ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。
33. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目23～31のいずれかの方法：
ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
34. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目23～31のいずれかの方法：
ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；およびDCN。
35. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目23～31のいずれかの方法：
TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC；およびARSA。
36. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目23～31のいずれかの方法：
IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON；およびSV2A。
37. 対象の治療をモニターするための方法であって、
癌治療法をそれを必要とする対象に投与する段階；
血液中および／または癌の間質中に存在するCTCマーカー遺伝子発現産物のレベルを測定する段階；ならびに
CTCマーカー遺伝子発現産物のレベルが参照基準レベルに比して低い場合に対象が反応していると判定し、CTCマーカー遺伝子発現産物が参照基準レベルに比して低くない場合に対象が治療に反応していないと判定する段階
を含む、方法。
38. 癌が膵癌である、項目37の方法。
39. 参照基準レベルが、投与する段階の前の患者における遺伝子発現産物のレベルである、項目37～38のいずれかの方法。
40. 試料からCTCを単離する第1の段階をさらに含む、項目37～39のいずれかの方法。
41. 発現産物が核酸である、項目37～40のいずれかの方法。
42. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、項目41の方法：
RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーション。
43. 発現産物がポリペプチドである、項目37～40のいずれかの方法。
44. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、項目43の方法：
ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射線免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。
45. PC-CTCマーカー遺伝子が表7；表8；または表14から選択される、項目37～44のいずれかの方法。
46. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目37～45のいずれかの方法：
ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1およびWNT4。
47. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目37～46のいずれかの方法：
ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1；およびTIMP2。
48. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目37～46のいずれかの方法：
ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；およびSPARC。
49. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目37～46のいずれかの方法：
ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；およびDCN。
50. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目37～46のいずれかの方法：
TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC；およびARSA。
51. CTCマーカー遺伝子が以下からなる群より選択される、項目37～46のいずれかの方法：
IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON；およびSV2A。
実施例1：マウス血中循環膵臓腫瘍細胞の単細胞RNAシークエンシングにより、それらのECMタンパク質の発現が明らかになる
血中循環腫瘍細胞（CTC）は、原発性腫瘍から剥離して血流中に入り、遠隔臓器への癌の血行性伝播を媒介する。膵癌マウスモデルを用いて、腫瘍エピトープに非依存的にCTCを単離するためにマイクロ流体デバイスを適用し、これらを単細胞RNAシークエンシングに供した。CTCは、原発性腫瘍および癌細胞株とは異なる複数のサブセットへとクラスター化した。増殖シグネチャーは概ね少なかったが、CTCは、MAPK、ならびにWNT、TGF-β、ニュートロフィン、Toll様受容体およびB細胞受容体シグナル伝達経路に関してエンリッチされていた。CTCは、幹細胞関連遺伝子Aldh1a2の発現に関して高度にエンリッチされていた。それらによるIgfbp5およびKlf4の事実上普遍的な発現は、上皮／間質境界に局在した原発性腫瘍細胞のサブセットと相関しており、これはCTCに上皮マーカーおよび間葉マーカーの両方が存在することに一致する。DenおよびSparcを含む間質由来細胞外マトリックスタンパク質のCTC発現が非常に高度であることにより、転移への微小環境の寄与が指し示され、かつ予想外の治療標的が同定される。
序論
膵管腺癌（PDAC）は、米国における癌による死因の第4位であり、5年時の全生存率は6％である（Society, 2013）。この癌の高い高い死亡率は、広範な転移を招く腫瘍細胞の急速な播種から来ている。局所組織およびリンパ管への浸潤は早期PDACでも明白であり、血流中の血中循環腫瘍細胞（CTC）の存在は、遠隔臓器への癌の伝播を最終的に招く。CTCは稀であり、血液1ミリリットル中の正常血液細胞10億個当たり、腫瘍細胞は1～10個と推定される。そのため、それらの単離および分子的分析は大きな技術的課題となっている（Pantel et al., 2008；Yu et al., 2011）。血行性転移におけるそれらの役割を考慮すると、CTC集団は転移前駆細胞に関してエンリッチされている可能性が高く、それらの分析により、有望な治療標的が同定され、ならびに膵癌の早期検出の機会がもたらされる可能性がある。
遺伝子操作されたマウス膵癌モデルにより、この疾患の進行に関する重要な洞察がもたらされた。具体的には、遺伝子操作されたLSL-KrasG12D、Trp53flox／flox or+、Pdxl-Cre（KPC）マウスモデルは、前癌性膵臓上皮内新生物（PanIN）病変から浸潤癌への組織学的進行を再現した（Bardeesy et al., 2006）。最近の諸研究により、このモデルでは上皮-間葉転換（EMT）が早期に起こり、そのために腫瘍浸潤性が強化される可能性が示唆されている（Rhim et al., 2012）。マウス膵臓CTCの初期の分子特性決定で、CTCでエンリッチされている集団のRNAシークエンシングが行われ、それにより、血中循環上皮細胞のアノイキス耐性に寄与する可能性がある、非標準的WNTシグナル伝達の活性化が反復性イベントとして同定されている（Yu et al., 2012）。その研究では、CTCでエンリッチされている発現シグネチャーを導き出すために、精製されたCTC集団の分析を、条件を合わせた白血球RNAリードのデジタル減算と組み合わせた単分子RNAシークエンシングを用いて実現している。しかし、そのような部分的に精製された細胞集団のトランスクリプトーム分析は、最も高度な発現変動遺伝子をカバーする深さの点で限界があり、バルクCTC集団のその種の研究では、これらのほとんど解明されていない細胞集団間の不均一性の度合いを解き明かすことができない。
CTCのディープRNAシークエンシングプロファイルを単細胞レベルで達成するために、正常血液細胞の高効率陰性枯渇を可能にして非付着性CTCを溶液中に残し、それらを単細胞として選択して分析することができる新規な慣性集束強化デバイス、CTC-iChip（Ozkumur et al., 2013）を用いた。上皮マーカーEpCAMを標的化するといった腫瘍エピトープ特異的捕捉を避けることにより、CTC-iChipは、上皮性および間葉性特徴の両方を有する癌細胞を単離する点で無バイアス性である。さらに、タグ標識がなく生存能のあるCTCから精製されるRNAの品質の高さは、詳細なトランスクリプトーム分析に特に適する。その上、膵癌のマウスモデルの使用により、原発性腫瘍とCTCの同時分析が可能になり、一方、異なる動物間で共有されるドライバー突然変異により、CTC特異的不均一性の同定が容易になる。本明細書に記載されるのは、CTC集団内の異なる細胞サブセット、CTCにおいてエンリッチされているシグナル伝達経路、ならびに特有のCTCマーカーおよび治療標的を同定することに向けた、CTCの単細胞レベルでの包括的トランスクリプトーム分析である。
結果
マウス膵臓CTCの単離．CTCの単離のために全血標本に直接適用される一体型マイクロ流体細胞分離プラットフォームであるCTC-iChip（Ozkumur et al., 2013）を、本明細書に記載された実験に用いた。これは、血球、血小板および血漿からのすべての有核細胞（白血球（WBC）およびCTC）の流体力学的サイズに基づく分離を最初に行い、続いて単一の流線内の有核細胞の慣性集束と組み合わせることで、高効率のインライン式磁気選別を達成する。腫瘍エピトープはばらつきが大きいが、WBC細胞表面マーカーは十分に確立されている；磁気結合抗WBC抗体をこの非常にハイスループットのマイクロ流体細胞分離デバイスに適用することにより、それ故、大多数のWBCが除外されて、タグ標識のない少数のCTCが明らかになる（図1A）。CTC-iChipをマウス造血細胞の枯渇用に適合化して、KPC膵癌マウスモデルに適用した。このPDACモデルでは、かなりの数のCTCが生じる（Rhim et al., 2012；Yu et al., 2012）。WBC当たり100個の抗CD45ビーズを用いた全血標識により、正常マウス、同所性腫瘍担持マウス、および遺伝子操作されたKPCマウスにおいて、103を上回る枯渇が達成された（図1Bおよび4A～4C）。
マウス全血にスパイク投与したGFPタグ標識NB508マウス膵癌細胞を用い、CTC-iChipを通して処理したところ、CTC回収は平均95％（+/-3％標準偏差）と測定された（図4A～4C）。NB508細胞は、同じKras／Trp53を動因とするKPCマウスモデルにおいて生じた膵臓腫瘍から以前に作製された（Bardeesy et al., 2006）。これに比較して、マウスCTCの抗EpCAM捕捉に基づく代替的なマイクロ流体プラットフォームを用いた場合、同じ細胞の回収は35％しか達成されなかった（Yu et al., 2012）。GFPタグ標識NB508細胞の膵臓接種に由来する同所性腫瘍にCTC-iChipを適用したところ、試験した3種のマウスすべてで、1000個を上回るCTC／mLが得られた（図4A～4C）。さらに、遺伝子操作されたKPCモデルを用いてCTC-iChipを試験し、その後に上皮マーカーであるパン-サイトケラチン（CK）および白血球マーカーCD45に関する単離された細胞の二重免疫蛍光染色を行ったところ、中央値118個のCTC／mL（平均429個のCTC／mL；範囲0～1694）が明らかになった（図1C）。7匹の健常対象マウスからはCK陽性細胞は全く単離されなかった。マイクロ流体デバイス内で偏向することができなかった大多数のCD45陽性細胞は、その表面上に免疫磁気ビーズをいくつか保持していた。このように、CTC-iChip製品においてCTCをWBCと容易に識別することができ、EpCAMなどの上皮特異的細胞表面エピトープに対する染色を必要とせずに単細胞操作が可能になった。
単一CTCのRNAシークエンシング．5匹の腫瘍担持KPCマウスから合計168個の単一CTCが得られ、それらを改変された初期のcDNA増幅およびライブラリープロトコールに供し（Tang et al., 2010）、RNAの品質（Gapdh、Actb）、膵臓マーカーの存在（Krt8、Krt18、Krt19、Pdx1）、およびWBCマーカーの欠如（Cd45／Ptprc）に関してスクリーニングした（図5A～5C）。これらのうち、75個（45％）は次世代シークエンシングのためにさらに増幅およびライブラリー構築を進めるのに十分な品質であった。注目に値することとして、候補CTCの大半（55％）は形態的には無傷であるように見えたが、RNAは分解されていた。これらの細胞は血流中で生存能を失った腫瘍細胞である可能性が高い。マウスモデルからの血液試料の迅速な処理、マイクロ流体デバイスにおける剪断条件が最小限であること、および同じ処理を受けた対照細胞でRNAの品質が保たれたことを考慮すれば、細胞がそのような損傷をインビトロ精製の間に受けた可能性は低い。膵臓CTCとの比較のために、単細胞RNAシークエンシングを、対照マウス由来の12個のWBC、12個のマウス胚線維芽細胞（MEF）およびマウスNB508膵癌細胞株由来の16個の単細胞に対しても行った。NB508およびMEF培養物由来の単細胞の90％超はシークエンシングの品質に関する基準を満たしており、損なわれたRNAテンプレートを同じ条件下で有するCTCの頻度が高いことが強く示された。CTCプロファイルを、CTC単離の時点で採取した条件を合わせた親腫瘍のものと比較するために、各原発性腫瘍からのバルクRNAを1または10細胞当量（10または100pg RNA）に希釈して、同じ増幅およびRNAシークエンシングのプロトコールに供した（n＝34；条件を合わせた4つの腫瘍からの最低8つの反復試験物）。
単細胞RNAシークエンシングの成績は分析したすべての試料について同等であり、リード数は平均440万～850万で、そのうち平均46～61％がゲノムに対してユニークにアラインメントされた（図5A～5C）。ゲノムにアラインメントされたリードにアノテーションを行い、UCSC Known Geneトランスクリプトーム参照基準を用いて算定した上で、100万当たりリード数（RPM）として正規化した。続いて、正規化されたリードを、教師なし階層クラスタリングによって分析した（非提示データ）。MEF、NB508膵癌細胞株および正常WBCからの単細胞トランスクリプトームは高度にクラスター化し、このRNAシークエンシング戦略の分析上の信頼性が裏づけられた。候補CTCの5つの異なるクラスターが同定され、これらはすべて、条件を合わせた原発性腫瘍配列とも癌由来細胞株とも異なっていた。主成分分析により、これらの異なる群のクラスタリングおよび相互関係が実証されている（図2）。
KPCマウスモデルにおけるPDACの遺伝的動因が均一であることから、個々のマウスに由来するCTCおよび異なるマウス間のCTCにおいて、細胞不均一性の尺度を定量することが可能になる。各CTCクラスター内での単細胞不均一性をクラスター内相関係数を計算することによって評価したが、ここで相関係数が低いことは不均一性が高いことを反映する（図5A～5C）。予想された通り、CTCクラスターは、NB508癌細胞株に由来する単細胞（平均0.86、95％ CI 0.80～0.91、p値 1.2×10-15）よりも、不均一性がかなり高かった（平均0.42、95％ CI 0.36～0.47）。原発性PDACの中での細胞の不均一性を評価するために、条件的Tomato／EGFP（mT／mG）発現マーカー（Muzumdar et al., 2007）をKPCマウスと交配させて、系列タグ標識マウス腫瘍（KPC-mT／mG）を作製したが、これは個々のEGFP陽性原発性腫瘍細胞を混入性の間質細胞から単離することができると考えられる。原発性腫瘍（TuGMP3）を脱凝集させて単細胞浮遊液にして、20個のEGFP陽性細胞をRNAシークエンシングに供した。個々の原発性腫瘍細胞は、以前分析したバルク腫瘍材料の内部に十分にクラスタリングし（非提示データ）、不均一性スコア（平均0.38、95％ CI 0.28～0.47）はCTCのもの（p値 0.49）と同程度であった。
要約すると、本明細書に記載されるのは、親腫瘍、遺伝子型の条件を合わせた樹立癌細胞株、MEFおよびWBCとともに、陽性選択バイアスを伴わずに単離されたマウス膵臓CTCの単細胞RNAシークエンシングである。CTCは、原発性腫瘍（バルク腫瘍および単離された単細胞の両方）とも腫瘍由来細胞株とも別個にクラスター化し、CTCと原発性腫瘍細胞との間で細胞間不均一性は同等の度合いであった。
膵臓CTCのサブセットを規定する．候補CTCの同定および分類のために、既知の上皮マーカー、造血マーカーおよび内皮マーカーに関する遺伝子セットを、クラスター化したすべての試料に適用した。予想された通り、上皮マーカー（Krt7、Krt8、Krt18、Krt19、Epcam、Egfr、Cdh1）は原発性膵臓腫瘍および癌細胞株NB508において高発現され、非上皮MEFおよび正常WBCにはほぼ存在しなかった（非提示データ）。対照的に、造血マーカー（Ptprc／Cd45、Csf3r／Cd114、Cd14、Fcgr3／Cd16、Itga2b／Cd41、Itgb3／Cd61）は正常WBCに存在し、NB508およびMEFには存在しなかった。バルク原発性腫瘍試料では造血マーカーのある程度の発現が検出可能であり、これは白血球浸潤の度合いがさまざまであることに一致する。特徴的マーカー（Cdh5／Cd144、Vwf、Thbd／Cd141、Pecam1／Cd31、Mcam／Cd146、Sele／E-セレクチン、Cd34）の発現、ならびに上皮マーカーおよび造血マーカーの欠如に基づくと、内皮細胞の特定のクラスターは同定されなかった。
腫瘍担持マウスからCD45枯渇によって単離された単細胞の、上皮マーカー、造血マーカーおよび内皮マーカーを用いた照合により、大きく5つの候補CTCグループ分類が明らかになった（クラスター1、3、4、5および9；非提示データ）。クラスター3、4および5はすべて、より大きなグループ分類の一部であり、上皮マーカーの強い発現を示し、「古典的」CTCに一致する（CTC-cと表す）。これらの細胞の1つのサブセットは、MEF（非提示データ）および間質細胞（Krause et al., 1994）を含む間葉細胞にも見いだされる内皮前駆細胞マーカーであるCd34を発現したが、他の特徴的内皮系列マーカーは存在しなかった。クラスター1および9はより複雑であり、前者は血小板マーカーCD41（Itga2b）およびCD61（Itgb3）のエンリッチメントが注目され（それ故にCTC-pltと表す）、後者は顕著な細胞増殖シグネチャーを有する（CTC-pro）。
各候補CTCクラスターの特徴をさらに規定するために、細胞間での絶対的転写物レベルの変動およびトランスクリプトーム描写の違いに適合させた、ランクプロダクト（rank product）（RP）法を含むノンパラメトリック遺伝子発現変動分析を用いた（Breitling et al., 2004）。非常に厳密なパラメーター（FDR≦0.01）を設定したところ、原発性腫瘍とWBCとの対照比較により、上皮腫瘍マーカーであるケラチン7、8、18および19と白血球特異的CD45の比較で予想された発現変動を含めて、腫瘍において相対的に過剰発現される927種の遺伝子、およびWBCにおいて高度である293種の遺伝子が同定された（非提示データ）。「古典的」CTC-cクラスターとWBCを比較したところ、WBCにおけるCD45と比較してCTCにおけるサイトケラチン18および19のエンリッチメントも示され、このことはRP法によって単細胞集団間で妥当な発現変動遺伝子が同定されることを実証している。
最も存在量の多いCTCクラスターであるCTC-cは、細胞75個のうち41個（55％）を構成し、上皮腫瘍細胞に関して確立された基準を満たす（これに対してCTC-plt：32％；CTC-pro：13％）。注目されることとして、複数の肉眼的転移を有した唯一のマウス（MP7）は、このクラスの中でCTCの数が多かった。条件を合わせた原発性腫瘍と比較すると、CTC-c細胞では878種の転写物で発現が増加しており、発現が減少したのは774種の遺伝子であった（表2）。CTC-cでエンリッチされている遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）分析（表3）により、環境シグナルとの細胞相互作用（GO：0045785‐細胞接着の正の調節；GO：0048584‐刺激に対する応答の正の調節）、細胞の形状および構造（GO：0030036‐アクチン細胞骨格組織化；GO：0060429‐上皮発生）、ならびに転写状態（GO：0045449‐転写の調節；GO：0051276‐染色体組織化）に関連するシグネチャーのエンリッチメントが指し示された。CTC-c細胞において外部刺激によって活性化されるシグナル伝達経路の寄与を評価するために、エンリッチされている遺伝子に対して、KEGGデータベースを用いてアノテーションを行った（表1）。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）経路分析によっても、細胞接着斑（オッズ比［OR］2.7、q値 6.7 3 10.4）およびアクチン細胞骨格の調節（OR 2.4、q値 0.005）に関するエンリッチメントが同様に示された。注目に値することとして、アノテーションを行ったKEGGシグナル伝達経路のうち、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路は最も高度にエンリッチされていた。最も高度に示されたのはMAPK経路（OR 2.2、q値 0.006）であった；MAPKシグナル伝達は、KrasG12Dを動因とする原発性腫瘍において既に活性化されている。しかし、MSigDB Kras依存性シグネチャーはCTCと比較して原発性腫瘍においてエンリッチされていたものの、後者はBraf、MrasおよびRras2の発現が増加しており、これはCTCにおいてMAPKを活性化するための代替的な経路を示している。この知見は、マイクロアレイに基づく方法を用いて、膵臓CTCにおいてMAPK経路が最も高度にエンリッチされていることを同定した別の研究と一致する（Sergeant et al., 2012）。
CTCでエンリッチされている遺伝子には、TGF-β（kushima and Miyazono, 2010；Siegel and Massague, 2003）、WNT（Anastas and Moon, 2013；Clevers and Nusse, 2012；Katoh and Katoh, 2007）、およびVEGF（Carmeliet and Jain, 2011；Folkman, 1995）を含む、転移に関与する十分に確立されたシグナル伝達経路の代表も見られた。膵癌CTCのこのコホートでは、Wnt4およびTgfb2が原発性腫瘍と対比してCTCにおいて最も高度にエンリッチされており、これはこれらの主要な経路に関与するオートクリンシグナル伝達を示す。転移へのこれらの十分に明確な寄与因子に加えて、CTC発現分析により、ニュートロフィン経路、toll様受容体経路およびB細胞受容体経路を含む、予想外のシグナル伝達経路の活性化も明らかになった。ニュートロフィン経路の活性化は膵癌において、特に神経周囲浸潤の増加と関連して報告されている（Miknyoczki et al., 1996；Miknyoczki et al., 1999；Ohta et al., 1997；Wang et al., 2009；Zhang et al., 2005）。Toll様受容体経路およびB細胞受容体経路は、CTCリードにおける提示はよりわずかであったが、それらは免疫調節シグナル伝達の構成要素の異常活性化を示唆する。最終的には、これらの活性化されたシグナル伝達経路の機能的意義を検証するために、CTC由来培養物の樹立が必要であると考えられる。
CTC-cクラスター内の単細胞は腫瘍細胞の特徴的基準を満たしたものの、非古典的CTCクラスター、CTC-pltおよびCTC-proの実体を規定するにはさらなる分析が必要となった。CTC-cと比較して、CTC-pltクラスター内の単細胞は、創傷治癒および止血のシグネチャーに関して高度のエンリッチメントを有し、さらにMSigDB血小板および巨核球発現プロファイルについても同様であった（表4）。このことは、これらの細胞が血中循環巨核球／巨大血小板のいずれかであるか、またはCTCが付着性血小板に覆われていることを指し示す。腫瘍細胞特異的な系列タグ標識により、CTC-plt細胞が腫瘍起源であるという実体が裏づけられる。2匹のKPC-mT／mGマウス由来の18個のEGFP系列タグ標識単一CTCを、単細胞RNAシークエンシングに供した：2匹のマウス由来の合計9個のCTC（マウスGMP1由来のCTC 7個中7個、およびマウスGMP2由来の11個中2個）は、教師なし階層クラスタリングを用いて、CTC-plt内に含められた（非提示データ）。このように、CTC-pltクラスターは強い血小板マーカーを示すCTCを含んでおり、これは付着性血小板によってコードされる転写物に由来する可能性が最も高い。興味深いことに、CTC-plt細胞は、アノテーションを行ったすべての血小板転写物のデジタル除去後にも、それらのCTC-cとの明確な分離を維持していた（非提示データ）。このため、インビトロモデル化実験によって最近示唆されているように（Labelle et al., 2011）、大量の血小板の付着のために本来のCTC発現プロファイルが変化している可能性がある。
CTC-proクラスターはNB508膵癌細胞株およびMEFの両方と最も類似しており、これはCTC-cと比較すると細胞増殖マーカーMki67がエンリッチされていた。この複合的なグループ分類には複数の系列が寄与している可能性が高い：腫瘍に限定された系列タグ標識EGFP発現を有するKPCマウス由来のCTCはCTC-proとともにクラスター化し（非提示データ）、Mki67の大量発現およびMSigDBにおけるアノテーションを行った細胞周期シグネチャーの点で注目される（Whitfield et al., 2002）（非提示データ）。CTC-proクラスター内の1つの単細胞は膵癌細胞株NB508に由来しているが、もう1つのもの（MP3-2）は、古典的CTCに特徴的なケラチン高発現／E-カドヘリン高発現を有していた（非提示データ）。しかしながら、もう1つのサブクラスターは、抗原プロセシング遺伝子および抗原提示遺伝子の発現によって同定された免疫細胞および樹状細胞を含んでいた（GO：0019886‐抗原プロセシングおよびMHCクラスIIを介した外因性ペプチド抗原の提示；表5）。以上を総合すると、CTC-proクラスターは増殖性の高い細胞のグループ分類に相当し、そのサブセットは腫瘍由来であるように思われる。
総合すると、個々の膵臓CTCのバイアスのない単離およびRNAシークエンシング評価により、これらの過半数はRNAのさまざまな段階での分解のために生存能がないことが指し示された。生存能のある残りのCTCにおいて、3つの主要なクラスが教師なしクラスタリングによって識別可能である：古典的サブセット（CTC-c）が55％を占め、第2は血小板付着グループ（CTC-plt；32％）、第3は増殖シグネチャーを特徴とする異種混交的クラスター（CTC-pro；13％）である。それらの最も明確に規定された腫瘍由来特徴を考慮して、本発明者らはCTC-cクラスターを、転移関連経路の詳細な分析のために選択した。
膵臓CTCは上皮マーカー、間葉マーカーおよび幹細胞マーカーを共発現する．膵癌における初期転移とのEMTの関連性は、KPCマウスモデルにおける系列追跡研究によって裏づけられている（Rhim et al., 2012）。ヒト乳癌CTCにおいて、個々のCTC内の上皮マーカーおよび間葉マーカーの分布が本発明者らによって最近報告され、それは腫瘍組織学、および多様な治療法に対する反応または耐性の両方を反映している（Yu et al., 2013）。マウス膵臓CTCにおいてEMTを直接的に検討するために、樹立された上皮（E）マーカーおよび間葉（M）マーカー（Kalluri and Weinberg, 2009）を、CTC-cクラスター内の各細胞を評価するために用いた（非提示データ）。原発性腫瘍と比較して、CTC-c細胞は上皮マーカーであるE-カドヘリン（Cdh1）およびMuc1の明白な損失を明らかに示し、一方、間葉転写物は混在性であり、いくつかは発現増加（Cdh11、Vim）を示し、他のものはレベルが低下した（S100a4、Itga5、Sdc1）（図3Aおよび3B）。注目に値することとして、CTCにおいてアップレギュレートされていた間葉遺伝子でさえも、単細胞間で高度に異種混交的な発現を示した（非提示データ）。対照的に、E-カドヘリン（Cdh1）を含む上皮マーカーの損失は、すべての古典的CTCを通じてほぼ一様であった。
CTCはまた、転移前駆細胞についてもエンリッチされていて、転移性腫瘍の蓄積を開始させることができると考えられている。そのような前駆細胞と想定されている癌幹細胞との関係ははっきりしておらず、これらの細胞を同定する上での確立された幹細胞マーカーの関連性についても同様である。提唱されている膵癌幹細胞遺伝子（Rasheed and Matsui, 2012；Rasheed et al., 2010）を、単細胞RNAシークエンシングのリードで評価した（図3B）。検討したすべての候補マーカー（Aldh1a1、Aldh1a2、Prom1／Cd133、Cd44、Met、EpCAM）のうち、Aldh1a1およびAldh1a2のみがCTCにおいてエンリッチされていた。古典的CTCはほとんどAldh1a2アイソフォームを発現し、一方、CTC-plt細胞ではAldh1a1がエンリッチされていたが、いくつかの単一CTCではこれらのアイソフォームが共発現されてもいた。MEF、NB508膵癌細胞および正常WBCもAldh1a1を発現したが、Aldh1a2は発現しなかった（非提示データ）。単一CTCにおいて、Aldh1アイソフォームの発現と間葉遺伝子Cdh11またはVimのエンリッチメントとの間に相関は見られず、このことはこれらの2種のバイオマーカーに本来は結びつきがないことを示唆する。
Aldh1a2がCTCによって発現される有望な幹細胞様マーカーとして同定されたことを受けて、条件を合わせた原発性腫瘍におけるその発現を、RNAインサイチューハイブリダイゼーション（RNA-ISH）を用いて検討した。腫瘍内での発現パターンは異種混交的であった：Aldh1a2発現細胞は主として、腫瘍の「間質」区画または非上皮（すなわち、ケラチン低値）区画に局在していた（非提示データ）。膵癌において特に大量である、これらの非上皮細胞の起源は、混在性である可能性が高い。ヒト膵癌における組織学的評価、およびKRAS突然変異分析が陰性であったこと（Biankin et al., 2012；Ogino et al., 2005）により、これらの細胞のほとんどは、腫瘍起源ではなく、反応性線維芽細胞または間質であることが指し示された。しかし、KPCマウスにおける系列追跡により、間質細胞と推定されるこれらのごく一部は実際には腫瘍由来であり、おそらくEMTを受けて線維芽細胞のように見えるようになったと考えられることが最近示されている（Rhim et al., 2012）。興味深いことに、最も多くの転移を有し、Aldh1a2陽性CTCの数も最も多かったマウスであるMP7も、Aldh1a2が最も高いレベルである原発性腫瘍を有していた。そのケースでは、Aldh1a2陽性細胞は間質区画内に散在性に存在しており、さらに上皮性（ケラチン高値）構成要素の小さな部分集団も含んでいた（非提示データ）。このように、ケラチン高値である古典的CTCは幹細胞関連遺伝子Aldh1a2を発現し、原発性腫瘍におけるその発現は、間質（ケラチン低値）区画に、しかも上皮細胞の小さな部分集団のみに限定される。
古典的CTCは、間質でエンリッチされている遺伝子の発現を共通に有する．CTCの明らかな多様性に加えて、原発性腫瘍内にあるそれらの起源の細胞、それらが血流に侵入してその中で生存する機序、および最終的にはCTC特異的治療標的の可能性があるものの同定について、洞察がさらに得られる可能性のある共通の転写物を探索した。すべての古典的CTCのうち90％以上で、非常に高いレベル（100 RPMを上回る）で発現される、最も高度にエンリッチされているCTC転写物（RPスコア＜300）を同定するために、厳格な基準を選択した。3種の遺伝子がこれらの基準を満たした：種々の異なる癌で腫瘍間質中に発現される細胞外マトリックスプロテオグリカンであるデコリン（Decorin）（Dcn）（Adany et al., 1990；Bostrom et al., 2013；Henke et al., 2012；Hunzelmann et al., 1995；Iozzo and Cohen, 1994；Mu et al., 2013；Nash et al., 2002）；増殖誘発特性および抗増殖特性の両方を有すると報告されている、ヒトPDACで発現される細胞外増殖因子結合タンパク質であるインスリン様増殖因子結合タンパク質5（Igfbp5）（Johnson et al., 2006；Johnson and Haun, 2009）；および重要な幹細胞（iPS）リプロラミング因子の1つであり（Takahashi and Yamanaka, 2006）、膵癌発生と関連づけられるKruppel様因子4（Klf4）（Brembeck and Rustgi, 2000；Prasad et al., 2005；Wei et al., 2010）。RNA-ISHによれば、Dcnは腫瘍の間質要素中で散在性に発現されていた（図6）。注目すべきことに、Igfbp5およびKlf4は両方とも限局性に発現されており、その大部分は腫瘍の上皮区画に隣接する間質性に見える細胞内にあった（非提示データ）。EGFP系列限定原発性腫瘍のRNA-ISHにより、上皮／間質境界面にあるIgfbp5陽性細胞は腫瘍起源であることが確認された（非提示データ）。この移行領域に加えて、このEGFPタグ標識腫瘍におけるKlf4の分析により、上皮管のサブセットにおける発現も認められた（非提示データ）。注目されることとして、それらは原発性腫瘍細胞の小さなサブセットのみで発現されるものの、Igfbp5およびKlf4は両方とも、すべての古典的CTCのうち85％で高度に共発現される。CTCにおいて明らかな混在性上皮／間葉マーカーと合わせて考えると、これらの観察所見は、多くのCTCが、Igfbp5およびKlf4の発現によって規定される上皮／間質境界面にある病巣に由来するという可能性を提起するものである。
最も高度に発現されるこの3種の転写物に加えて、CTCは、間質細胞マトリックスに関連づけられる遺伝子の高レベル発現の点でも注目された。CTCでエンリッチされている全遺伝子の遺伝子オントロジー分析（表3）により、60種の細胞外タンパク質（GO：0044421、OR 1.7、q値 6.4×10-3）が同定され、そのうち32種はタンパク質性細胞外マトリックス（ECM）中に見いだされた（GO：0005578、OR 2.4、q値 4.8×10-3）。最近の諸研究により、膵癌病態および転移に対する反応性間質の重要性が強く示されている（Feig et al., 2012；Neesse et al., 2013；Neesse et al., 2011；Olive et al., 2009；Provenzano et al., 2012）。しかし、循環血液中の腫瘍細胞内でのこれらの間質関連ECM遺伝子の発現は予想外であった。マウス膵臓腫瘍モデルにおいて、間質でエンリッチされている主要な遺伝子を同定するために、本発明者らは、腫瘍細胞と反応性間質細胞が混在するものに相当するバルク腫瘍試料と原発性腫瘍由来の精製EGFPタグ標識単細胞（TuGMP3）との間でRP発現変動分析を行った。原発性腫瘍単細胞との比較で、合計51種のタンパク質性ECM遺伝子が、バルク腫瘍においてエンリッチされていた（GO：0005578、OR 4.8、q値 3.4×10-18）。これらのうち、6種の遺伝子（Ccdc80、Col1a2、Col3a1、Dcn、Sparc、Timp2）は、以前同定されたCTCでエンリッチされている遺伝子セットと共通していた（非提示データ）。上述したように、デコリン（Dcn）は、CTCにおいて最も高度にエンリッチされており（中央値10,686rpm）、CTCの98％で高レベル発現（＞100rpm）を有するものとして同定された。2番目に存在量の多い遺伝子はSparc（中央値3,913rpm）であり、CTCの88％で高発現された。これらの2種の遺伝子は、古典的CTCの88％で高レベルに共発現された。Dcn（図6）およびSparc（非提示データ）の両方に関する原発性腫瘍のRNA-ISHにより、これらの遺伝子は反応性間質全体で発現されるが、原発性腫瘍の上皮ケラチンリッチ領域には存在しないことが確かめられた。
間質由来ECM遺伝子の発現はすべての古典的CTCに共通する特徴であるものの、それらが同一のKras／p53遺伝的動因を有するにもかかわらず、これらの遺伝子間でのマウス特異的な分布バイアスは明白であった。このマウス特異的クラスタリングは、教師なし分析で明白であった（p値＜2.2×10-16）。例えば、サブクラスター3はマウスMP6由来の単一CTCにおいて大きな比率を占め、一方、サブクラスター4はマウスMP7で、サブクラスター5はマウスMP2でエンリッチされていた。RP分析によってマウスMP2およびMP7のCTC間で発現変動が見られた68種の転写物のうち、遺伝子オントロジーにより、11種の細胞外タンパク質について有意なエンリッチメントが指し示され（GO：0044421、OR 3.8、q値 0.06）、そのうち7種はタンパク質性ECM中に見いだされた（GO：0005578、OR 6.3、q値 0.05）（非提示データ）。総合すると、これらのデータは、マウス膵癌モデルに由来するほとんどのCTCが、原発性腫瘍の上皮区画ではなく間質中に正常認められるECM遺伝子のセットを高レベルで発現することを指し示している。このことは多くのCTCの起源が上皮／間質境界面にあることを反映すると考えられ、これはIgfbp5およびKlf4といった特有の限定的なマーカーの発現と一致する。遺伝的に条件を合わせた個々のマウス腫瘍から、ECM遺伝子発現の共通かつ特有の両方のパターンを有するCTCが生じたことは、CTCの基本的特徴に重ね合わされた腫瘍特異的浸潤経路を示唆する。CTCによって発現された細胞外タンパク質が高レベルであることは、これらの転移前駆細胞を標的化するための予想外の機会をもたらす。
ヒト膵臓CTCはECMタンパク質SPARCを発現する．ECMタンパク質発現のヒト疾患との関連性を明らかにするために、転移性PDAC患者の血液からCTCを単離して単細胞RNAシークエンシングに供した。3人の患者由来の7個の膵臓CTCの分析により、その大半がそれらが上皮起源であることを示すケラチンを発現すること、およびマウスCTCにおいてエンリッチされていた60種の細胞外タンパク質遺伝子のうち合計13種が、少なくとも1つのヒト膵臓CTCにおいて高レベル（＞100rpm）で発現されることが明らかになった（図7）。ヒトSPARCは、すべてのヒト膵臓CTCにおいて高レベルで認められた唯一の遺伝子であった。ヒト前立腺CTCおよび乳癌CTCの分析からも、SPARCを含む細胞外タンパク質の有意な発現が示され、このことはこれらの標的が転移上皮癌細胞に一般的に共通することを強く示している（非提示データ）。マウスおよびヒトの両方のPDACにおけるSparc／SPARCのRNA-ISHにより、発現が主として腫瘍の間質区画に限局されることが見いだされた（非提示データ）。SPARC発現はヒト原発性PDAC腫瘍の198件中196件（99％）に認められ、陽性腫瘍の36％は、シグナル全体のうちわずかではあったが、上皮腫瘍細胞においてある程度検出可能なSPARCを有した。細胞外タンパク質としてのSPARCの存在により、SPARCを標的とする抗体主導療法が可能になる。総合すると、これらのデータは、マウス膵臓CTCにおける知見をヒト疾患でも見いだすことができ、新規バイオマーカーおよび治療標的の両方が与えられることを指し示している。
考察
本明細書に記載されたのは、単細胞RNAシークエンシングを用いた、CTCの組成および多様性の詳細な分析である。合計すると、高品質トランスクリプトームが93個のマウス膵臓単一CTCで達成され、それらを、条件を合わせた原発性腫瘍由来の20個の単細胞、ならびにバルク腫瘍調製物、ならびに同じマウス膵臓腫瘍モデルから樹立された16個の細胞と比較した。ヒトPDACによく一致するマウスモデルの使用により、CTCと同時に単離された原発性腫瘍標本と比較することが可能であった。KPCマウスモデルにおける共通のKras／Trp53遺伝的動因を考慮することで、個々のマウスにおける、および異なる動物間のCTC不均一性を検討することも可能であった。さらに、CTC-iChip技術の使用により、タグ標識のないCTCをそれらの細胞表面エピトープにかかわらず選択することが可能になり、それ故に腫瘍マーカー特異的な細胞精製物に付随するバイアスを回避することができた。総合すると、これらの観察所見には以下が含まれる：1．CTCが、主要な「古典的CTC」グループ、および血小板由来マーカーまたは増殖シグネチャーを特徴とする他のグループを含む複数のサブセットにクラスター化すること；2．個々のマウス腫瘍はこれらのクラスターのそれぞれに合致するCTCを生じうるが、それらに共通の遺伝的動因があるにもかかわらず、個々のマウスに由来するCTCに特有のパターンがあること；3．事実上すべての古典的CTCが有する共通のマーカーには、上皮マーカーおよび間葉マーカーの両方、Aldh1a2幹細胞マーカー、ならびに原発性腫瘍の上皮／間質境界に局在する病巣を特定する2種の高発現転写物（Igfbp5およびKlf4）が含まれること；ならびに4．ほぼすべての古典的CTCが共通して有する最も高度にエンリッチされているCTC特異的転写物は、腫瘍間質区画に付随する細胞外マトリックスタンパク質をコードすること。
部分的に精製されたバルクCTC集団の以前のRNAシークエンシングと比較して、本明細書において報告された単細胞分析は、かなり上回る深さを持つ腫瘍細胞特異的リードをもたらす。そのため、マウス膵癌モデル由来の古典的CTCの詳細な分析は前例のないものである。膵癌CTCが、上皮-間葉転換の重要な特徴である上皮マーカー、E-カドヘリン（Cdh1）の発現を一様に喪失していることが、本明細書において実証された。しかし、これらの細胞は、サイトケラチンなどの他の上皮マーカーの発現は喪失しておらず、ビメンチンなどの古典的EMT間葉マーカーの一貫した増加も見られない。そのため、ほとんどの古典的CTCは混合型状態に停止しているように思われる。それらによるサイトケラチン（原発性腫瘍の上皮構成要素に存在する）の発現にもかかわらず、CTCにおけるほとんどの他の高発現マーカーは、原発性腫瘍の非上皮性または「間質」性構成要素と共通している。古典的CTCにおいて発現されるこれらの間質遺伝子の中には、膵癌幹細胞マーカーと推定されるAldh1a2がある（Rasheed and Matsui, 2012；Rasheed et al., 2010）。Aldh1a2が、転移前駆細胞における細胞可塑性の機能的に有意なマーカーであるか否かはまだ明らかでない。
古典的CTCに共通する上皮性および間葉性状態に関する興味深い観察所見は、原発性腫瘍内の上皮／間質境界面にある細胞の小さな部分集団でのみ発現される2種の遺伝子であるIgfbp5およびKlf4の、事実上一様な（＞85％）高レベルでの共発現である。このことは、腫瘍内のこの決定的な場所で、生存能のあるCTCのかなり多くの割合が生じるという興味深い可能性を提起する。実際に、EMTを活発に受ける腫瘍細胞はおそらく上皮-間質機能がエンリッチされており、腫瘍由来細胞型および非悪性の反応性細胞型の両方を有する腫瘍間質の混在系列に寄与すると考えられる。胚発生および膵臓悪性腫瘍におけるIGFシグナル伝達およびKlf4転写調節の両方について考えられる役割からみて、腫瘍およびCTCの両方におけるそれらの特有の発現パターンは特に注目に値する。
最後に、この単一CTC RNAシークエンシング研究からの最も予想外の観察所見は、古典的CTCの大多数でECMタンパク質の存在量が極めて高レベルであったことである。注目に値することとして、条件を合わせた原発性乳房腫瘍および転移性乳房腫瘍の以前の評価から、最もよく認められる遺伝子発現の差異として、転移におけるECM分子のエンリッチメントが同定されており、それは発現変動遺伝子のおよそ18％を占めた（Weigelt et al., 2005）。このことは転移部位の局所環境における差異を反映すると解釈されたが、今回のデータは、ECMタンパク質がCTCそれ自体によって高発現されることを指し示している。古典的な「種子か土壌か（seed versus soil）」論争（Fidler, 2003）になぞらえて言えば、CTCは実のところ、それら自身の土壌をある程度保有している種子であるのかもしれない。
CTCの詳細な分子分析の最終的な目標は、それらが生じる過程、およびそれらの治療上の脆弱性を解明することである。この点に関して、今回の単一CTC RNA配列解析によって導き出された重要な観察所見は、ECMに認められるタンパク質が圧倒的多数であるという細胞外タンパク質の予想外の発現であった。CTCにおいて最も存在量が多く、かつ共通していたECMタンパク質の2つはDcnおよびSparcであり、これらはいずれも確立されている腫瘍間質遺伝子である。注目に値することとして、Sparcを発現する間質はアルブミン結合化学療法含有ナノ粒子（nab-パクリタキセル）と結合するように思われ、ヒトPDACにおける細胞傷害性および有効性の増大が可能になっている（Neuzillet et al., 2013；Von Hoff et al., 201 1；Yardley, 2013）。実際に、化学療法薬の送達を改良し、腫瘍細胞をそれらを支える微小環境から引き離す手段として、膵癌間質を標的とすることにはかなりの努力が向けられている（Neesse et al., 2011；Olive et al., 2009；Provenzano et al., 2012；Rasheed et al., 2012）。これらの遺伝子産物がCTCによっても発現されるという知見は、抗体主導療法を、原発性腫瘍間質に対してだけでなく、腫瘍細胞をそれらが血液中を移行している時に標的とするためにも用いうることを指し示している。
本明細書に述べるように、今回のCTC分析は、CTCを腫瘍を規定する既知のマーカーに合わせることから、CTCをほとんどの原発性腫瘍細胞と区別し、かつCTCが血流中で生存して遠隔転移を生じさせる能力の基盤をなす可能性のある、特有の特性を調べることへと拡張している。ヒト癌転移の細胞過程についてのそのような洞察は、遠隔臓器への原発性腫瘍の伝播を最終的に予防するという目標にとって決定的に重要である。
実験手順
マウスおよび細胞株．これらの実験に用いた膵癌を有するマウスは、以前に記載された通り（Bardeesy et al., 2006）、Pdx1、LSL-KrasG12D、およびTrp53lox/+またはTrp53lox/loxによって作動されるCreを発現する。EGFP膵臓系列タグ標識KPCマウスは、mT／mGマウス（Jackson Laboratory‐Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J）を、KPCマウス作製のための交配ペアと交配させることによって作製した。正常FVBマウスはJackson Laboratoryから購入した。マウスの飼育および手順はすべて、MGH SRACにより承認されたプロトコールの下で行った。
CTCエンリッチメント技術の適合化．バイアスのないエンリッチメントシステムへの要求を考慮した上で、以前に提示された陰性枯渇技術を本出願のために選択した（Ozkumur et al., 2013）。ラット抗マウスCD45抗体（BAM114、R&D Systems, USA）をMyOneビーズと結合させた点を除き、処理プロトコールはすべて、以前に特定されたものと同一とした。
単細胞顕微操作、増幅およびシークエンシング．全血抗CD45陰性枯渇の後に、エンリッチされた細胞を含有する産物を35mmペトリ皿に収集し、Nikon Eclipse Ti（商標）倒立蛍光顕微鏡を用いて観察した。関心対象の細胞は、細胞形態が無傷であり、抗CD45磁気ビーズによる標識がないことに基づいて同定した。これらの標的細胞を、Eppendorf TransferMan（登録商標）NK 2マイクロマニピュレーターに装着した10μm移行チップで個別に顕微操作して、RNA保護用溶解緩衝液を含有するPCRチューブに注入し、液体窒素中で直ちに急速凍結させた。単細胞を改変プロトコール（Tang et al., 2010）を用いて増幅させて、ABI5500XL（商標）システムでシークエンシングを行った。
RNAインサイチューハイブリダイゼーション（RNA-ISH）．RNA-ISHは、Affymetrix QuantiGene ViewRNA ISH Tissue-2 Plex Assay（商標）に従って行った。
参考文献
Figure 0007330235000049
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Figure 0007330235000052
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（表１）KEGGに定義されたシグナル伝達経路における、CTCでエンリッチされている遺伝子のアノテーション．*は複数の経路遺伝子セットに見いだされた遺伝子を指し示している。
Figure 0007330235000054
（表２）ランクプロダクトによる、有意に発現された遺伝子（FDR＜0.01）
Figure 0007330235000055
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（表３）BP_FATおよびCC_FATデータセットを用いた、CTC-cでエンリッチされている遺伝子における最も有意な遺伝子オントロジー用語
Figure 0007330235000077
Figure 0007330235000078
（表４）CTC-cとの比較でCTC-pltにおいてエンリッチされていた最も有意な遺伝子セット
Figure 0007330235000079
（表５）CTC-cとの比較でCTC-proにおいてエンリッチされていた最も有意な遺伝子セット
q値＜0.01
Figure 0007330235000080
実施例2：補足的方法
マウスおよび細胞株．これらの実験に用いた膵癌を有するマウスは、以前に記載された通り（Bardeesy et al., 2006）、Pdx1、LSL-KrasG12D、およびTrp53lox/+またはTrp53lox/loxによって作動されるCreを発現する（その他の場合はKPCと称する）。EGFP膵臓系列タグ標識KPCマウスは、mT／mGマウス（Jackson Laboratory‐Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J）を、KPCマウス作製のための交配ペアと交配させることによって作製した。正常FVBマウスはJackson Laboratoryから購入した。マウスの飼育および手順はすべて、MGH SRACにより承認されたプロトコールの下で行った。
心臓穿刺のためには、動物をイソフルラン（isofluorane）で鎮静させた上で、胸腔を露出させて正常皮膚上皮細胞混入をなくすために、胸壁をエタノールで消毒し、胸郭の上方に皮膚切開を加えた。23ゲージ針を用いて、およそ1mLの血液を、100μLのPBS-10mM EDTA pH 7.4（Gibco）をあらかじめ加えた1mLシリンジ中に採取した。500mM EDTAの濃縮ボーラスまたは10mM EDTAの1：1希釈物のいずれかの添加によって、血中EDTA濃度を5mMに高めた。続いて動物を、動物プロトコールガイドラインに従って安楽死させた。
この内因性モデルにおいて発生させた原発性腫瘍から以前に作製したマウス膵臓細胞株NB508（Pdx1-Cre／KrasG12D／Trp53lox/+）に、レンチウイルスによってGFPトランスフェクションを行った（NB508-GFP）。この細胞株を、スパイク細胞実験および同所性腫瘍形成のために用いた。
NB508-GFP細胞株は、RPMI-1640培地＋10％ FBS＋1％ Pen／Strep（Gibco／Invitrogen）を用いて、標準的な培養条件下で維持した。
同所性実験のためには、NB508-GFP細胞を、健常同系（FVBバックグラウンド）マウスの膵臓に同所性に注入した。手短に述べると、マウスにイソフルラン（isofluorane）で麻酔を施して、左腹壁をNair（登録商標）脱毛製品で処理し、70％エタノールで消毒した。小切開を左側腹壁上方に加え、膵臓を移動させた。PBS中にあるおよそ100万個のNB508-GFP細胞、総容積0.1mLを膵臓に注入した。腹壁および腹壁を滅菌手術用ステープラーによって閉じた。腫瘍を2週間増殖させ、その時点でCTC-iChip処理のために心臓穿刺によって血液を採取した。
CTCエンリッチメント技術の適合化．バイアスのないエンリッチメントシステムへの要求を考慮した上で、陰性枯渇技術を本出願のために選択した。ラット抗マウスCD45抗体（BAM114、R&D Systems, USA）をMyOneビーズと結合させた点を除き、処理プロトコールはすべて、以前に特定されたものと同一とした。
ほぼ1000個のGFP発現NB508細胞を1mLの健常マウス血液にスパイク投与した上で回収効率を判定するために処理を行うことによって、システムを検証するために、スパイク細胞実験を実施した。回収効率を検証するため、ならびに腫瘍担持マウスからの予想枯渇効率を最初に判定するために、同所性モデルを用いた。これらの実験では、エンリッチされた試料を、産物中に観察されるGFP+細胞の数について評価した。
内因性モデルから単離されたCTCの免疫染色．単離したCTCを遠心によりスライドグラス上に沈下させ、一次-二次アプローチを用いて免疫染色を行った。一次抗体は、ウサギ抗広域サイトケラチン（1：50、Abeam ab9377）およびヤギ抗マウスCD45（1：500、R&D Systems AF114）とした。二次免疫蛍光性タグ標識抗体をシグナル増幅のために用いた。これらはロバ抗ウサギAlexa Fluor 594（1：500、Invitrogen A-21207）およびロバ抗ヤギAlexa Fluor 488（1：500、Invitrogen A-11055）であった。続いて核をDAPIで対比染色して、スライドをPBSですすぎ洗いし、カバーグラスをかけて4℃で保存した。BioView（商標）Ltd. 自動画像化システム（Billerica, MA）ならびに自動正立蛍光顕微鏡（Eclipse 90i（商標）、Nikon, Melville, NY）を用いて、それらを倍率10倍で画像化した。CTCの可能性があるもののスコア化のためには、CD45染色を伴わないCKに関する陽性染色が必要であり、続いてそれらを手作業で詳しく調べた。閾値およびベースラインシグナルは、非腫瘍担持マウスからの標本を用いて確立した。
単細胞顕微操作．全血抗CD45陰性枯渇の後に、エンリッチされた細胞を含有する産物を35mmペトリ皿に収集し、Nikon Eclipse Ti（商標）倒立蛍光顕微鏡を用いて観察した。関心対象の細胞は、細胞形態が無傷であり、抗CD45磁気ビーズによる標識がないことに基づいて同定した。これらの標的細胞を、Eppendorf TransferMan（登録商標）NK 2マイクロマニピュレーターに装着した10μm移行チップで個別に顕微操作して、RNA保護用溶解緩衝液（（10×PCR緩衝液II、25mM MgCl2、10％ NP40、0.1M DTT、SUPERase-In、Rnase Inhibitor、0.5uM UP1 Primer、10mM dNTPおよびヌクレアーゼ非含有水）を含有するPCRチューブに注入し、液体窒素中で直ちに急速凍結させた。
単細胞増幅およびシークエンシング．単細胞の増幅およびシークエンシングは、以下に示す若干の変更を加えた上で、以前に記載された通り（Tang et al., 2010）に行った。抽出された単一血中循環腫瘍細胞からのRNA試料を氷上で融解させて、70℃で90秒間インキュベートした。cDNAを作製するために、試料を逆転写マスターミックス（0.05uL RNase阻害薬、0.07uL T4遺伝子32タンパク質および0.33uL Superscript（商標）III逆転写酵素、1×容積当たり）で処理し、サーモサイクラーにて50℃で30分間、および70℃で15分間インキュベートした。遊離プライマーを除去するために、1.0uLのEXOSAPミックスを各試料に添加し、それを37℃で30分間インキュベートした上で、80℃で25分間かけて失活させた。次に、 3'-ポリ-A尾部を各試料中のcDNAに添加し、マスターミックス（0.6uL 10×PCR緩衝液II、0.36uL 25mM MgCl2、0.18uL 100mM dATP、0.3uL Terminal Transferase、0.3uL RNase H、および4.26uL H2O、1×容積当たり）中で37℃で15分間インキュベートした上で、70℃で10分間かけて失活させた。第2鎖cDNAは、各試料を4つに分けて、マスターミックス（2.2uL 10×High Fidelity PCR緩衝液、1.76uL 2.5mMの各dNTP、0.066uL 100uMのUP2プライマー、0.88uL 50mM MgSO4、0.44uL Platinum Taq DNAポリメラーゼ、および13.654uL H2O、1×容積当たり）中で95℃で3分間、50℃で2分間および72℃で10分間インキュベートすることによって合成した。
PCR増幅（95℃で3分間の後、95℃で30秒間、67℃で1分間および72℃で6分6秒間を20サイクル）は、マスターミックス（4.1uL 10×High Fidelity PCR緩衝液、1.64uL 50mM MgSO4、4.1uL 2.5mMの各dNTP、 0.82uL 100uMのAUP1プライマー、0.82uL 100uMのAUP2プライマー、0.82uL Platinum Taq DNAポリメラーゼ、および6.7uL H2O、1×容積当たり）を用いて行った。各試料の4つの反応物をプールして、QIAGEN PCR Purification Kit（カタログ番号28106）を用いて精製し、50uL EB緩衝液中に溶出させた。qPCRを用いて、試料を遺伝子Gapdh、ActB、Ptprc（CD45）、Krt8、Krt18、Krt19およびPdx1に関して選択した。各試料を再び4つに分け、2回目のPCR増幅（98℃で3分間、67℃で1分間および72℃で6分6秒間を9サイクル）を、マスターミックス（9uL 10×High Fidelity PCR緩衝液、3.6uL 50mM MgSO4、13.5uL 2.5mMの各dNTP、0.9uL 100uMのAUP1プライマー、0.9uL 100uMのAUP2プライマー、1.8uL Platinum Taq DNAポリメラーゼおよび59.1uL H2O、1×容積当たり）を用いて行った。試料をプールし、Agencourt AMPure XPビーズを用いて精製して、40uLの1×low TE緩衝液中に溶出させた。
シークエンシングライブラリーの構築．Covaris S2（商標）Systemを用いてDNAを剪断するために、1×low TE緩衝液および1.2uLの剪断緩衝液を各試料に添加した。剪断プログラムの条件は以下を含む：6サイクル、浴温5℃、浴温限界15℃、10％デューティーサイクル、強度5、100サイクル／バースト、および60秒間。続いて、試料を、マスターミックス（40uL 5X反応緩衝液、8uL 10mM dNTP、8uL End Polish Enzyme1、10uL End Polish Enzyme2および14uL H2O、1×容積当たり）を用いて、室温で30分間かけてエンドポリッシュした。500bpよりも長いDNA断片は、0.5倍容積のAgencourt AMPure XP（商標）ビーズを用いて除去した。上清を別のチューブに移した。200～500bpのDNA産物をサイズ選択するために、0.3倍容積のビーズを添加し、試料を70％ EtOHで2回洗浄した。産物を36uLのlow TE緩衝液中に溶出させた。マスターミックス（10uL 5×反応緩衝液、1uL 10mM dATPおよび5uL A-Tailing Enzyme I、1×容積当たり）で処理することによってサイズ選択した各DNAにdA尾部を添加し、68℃で30分間インキュベートして、室温まで冷却させた。各DNA試料をシークエンシングのために標識して識別するために、バーコードアダプター（5500 SOLiD 4464405）を、5500 SOLiD Fragment Library Enzyme Module（商標）（4464413）を用いて、DNAに連結させた。バーコード化の後に、Agencourt AMPure XP（商標）ビーズを用いて試料を2回精製し、22uL low TE緩衝液中に溶出させた。1回のPCR増幅（95℃で5分間の後に、95℃で15秒間、62℃で15秒間および70℃で1分間を12サイクル、さらに70℃で5分間）の後に、ライブラリーをAMPure XPビーズを用いて精製した。最後に、連結されたDNAの量を定量するために、qPCRを行うためにSOLiD Library TaqMan Quantitation Kit（商標）を用いた。続いて、完成したバーコード付きライブラリーを、テンプレートビーズ調製物を用いるエマルションPCRに供し、ABI5500XL（商標）でシークエンシングを行った。
RNAインサイチューハイブリダイゼーション（RNA-ISH）．パラフィン包埋した組織ブロックを新たに切り出して、-80℃で凍結させた。冷凍器から取り出した後に、スライドのベーキングを60℃で1時間行い、室温（RT）で1時間かけて10％ホルムアルデヒド中に固定した。パラフィンをHisto-Clear（商標）を用いて除去して、RNA-ISH（商標）を、Affymetrix QuantiGene ViewRNA ISH Tissue-2 Plex Assay（商標）に従って行った。組織切片の透過処理は、緩衝液中にて95℃で10分間前処理し、プロテアーゼで10分間消化させることによって行い、その後に5％ホルムアルデヒド中にて室温で固定した。標的プローブセットを適用し、40℃で2時間インキュベートすることによって組織とハイブリダイズさせた。1型プローブは1：50希釈で用い、これにはAldh1a2（VB1-14197）、Dcn（VB1-14962）、Klf4（VB1-14988）、Igfbp5（VB1-14987）およびSparc（VB1-14196）が含まれた。6型プローブには1：50のEGFP（VF6-13336）、ならびにそれぞれ1：100のプールしたKrt8（VB6-11060）およびKrt18（VB6-11059）が含まれた。シグナルを、 PreAmplifierおよびAmplifer QTミックスの標的プローブセットとの逐次的ハイブリダイゼーションを通じて増幅させた。標的mRNA分子は、Type 6型標識プローブをFast Blue基質とともに適用し、1型標識プローブをFast Red基質とともに適用することによって検出した。組織をGill's Hemotoxylinによって室温で10秒間かけて対比染色した。DAPI（Invitrogen、D3571；3.0μg／ml）染色は1分間行った。標的mRNAを描出するために、Nikon 90iを用いる蛍光顕微鏡検査を用いた。1型プローブはCy3チャンネルで検出し、6型プローブはCy5チャンネルで検出した。合成像はNIS-Elements（商標）ソフトウェアを用いて作成した。
100万当たりリード数（rpm）の決定．色空間のリードのアラインメントは、tophat（商標）バージョン2.0.4（Trapnell et al., 2009）およびbowtie1（商標）バージョン0.12.7を、no-novel-juncs論証セットとともに、マウスゲノムバージョンmm9およびgenome.ucsc.eduによるmm9 knownGene表によって規定されたトランスクリプトームとともに用いて行った。ゲノムに対してアラインメントされないか、ゲノム中の複数の場所に対してアラインメントされたリードは廃棄した。可能な場合には、genome.ucsc.eduによるmm9表knownToLocusLinkを用いて、アラインメントされた各リードを、そのリードがアラインメントされたエクソンを有する遺伝子に対してマッピングした。各遺伝子に関するリードのカウントは、その遺伝子に対してそのようにマッピングされたリードの数とした。このカウントを、任意の遺伝子に対してマッピングされたリードの総数で除算して、100万を乗算することで、100万当たりリード（rpm）カウントを得た。rpkmでなくrpmを用いた理由は、3'バイアスがアラインメントに認められたためである。
教師なし階層クラスタリングおよび主成分分析．ゼロをなくすために、最小値1およびrpmマトリックスの最小陽性値を、rpmマトリックスに加えた。その結果を続いてlog10変換して、log10（rpm）マトリックスと呼ばれるものを得た。標準偏差が上位2000となるlog10（rpm）マトリックスの列（遺伝子に対応する）を残して、残りの列は廃棄した。続いてその結果に対して中央値分散分析を行った。その結果を、1からPearson相関係数を差し引いたものに等しい距離基準を用いる平均連結法を用いる凝集階層クラスタリングによってクラスター化させた。log10（rpm）マトリックスの主成分を計算し、最初の3つの主成分に関する試料の座標をプロットした。
細胞不均一性の尺度．試料のクラスターの収集のために、統計量Mを、対に対応するrpmマトリックスの2つの行の間の相関係数のatanhのクラスターにおけるすべての試料対に関する平均値のクラスターに関する平均値と定義した。「クラスター内相関係数の平均値」は、tanh（M）と定義した。統計量の標準偏差sを推定するために、ジャックナイフ推定量を試料に対して用いた。95％ CIは、tanh
Figure 0007330235000081
と定義され、式中、
Figure 0007330235000082
は標準正規分布の累積分布関数である。クラスターに関するM統計量の分布の平均値がクラスターの収集のためのM統計量の分布の平均値と等しいという帰無仮説に関してp値を計算するために、本発明者らは
Figure 0007330235000083
とした。注目されることとして、ジャックナイフの代わりとして同じデータに対してブートストラップを行ったところ、同様の結果が得られた（非提示データ）。
ランクプロダクトを用いる教師あり遺伝子発現変動．2セットの試料間での発現変動遺伝子を見つけるために、上記に定義したlog10（rpm）マトリックスを用いる分析を開始した。いずれのセットの試料にもない試料に対応する行は除去した。続いて、値の90パーセンタイルがlog10（10）未満である列を除外した。Bioconductor（Gentleman et al., 2004）RankProd（商標）パッケージ（バージョン2.28.0）のRP関数を用いて、発現増加変動および発現減少変動の両方に関するFDR推定量を得た。遺伝子はそれらのFDR推定量が0.01未満であれば発現変動性であると見なしたが、それらに発現増加変動および発現減少変動の両方が、少しでもある場合には、それらを除外した。
遺伝子セットのエンリッチメント．エンリッチメントを、4種の遺伝子セット収集物において考察した：（1）DAVID（商標）6.7に見られるような（Huang da et al., 2009）、KEGG（商標）のすべて、（2）DAVID 6.7に見られるような、GO_BPを用いる遺伝子オントロジー（GO）、および（3）DAVID 6.7に見られるようなGO_CC。発現変動性であることが見いだされた遺伝子のセットを、収集物中の各遺伝子セットに関する超幾何学検定を用いて、遺伝子セット収集物におけるエンリッチメントに関して検討した。各収集物に関してその結果得られたp値を、ベンジャミニ-ホフバーグ（Benjamini-Hochberg）の方法（Benjamini and Hochberg, 1995）を用いてFDR推定量に変換した。
アノテーションを行ったすべての血小板転写物のデジタル除去．log10（rpm）マトリックスにおける発現の、MSigDB v3.1におけるGNATENKO_PLATELET_SIGNATUREおよびTENEDINI_MEGAKARYOCYTE MARKERSと名づけられた遺伝子セット中の遺伝子のいずれかの発現との相関係数の絶対値が0.6を上回っていた446種の遺伝子は、log10（rpm）マトリックス（上記に定義）から除去した。続いて、クラスタリングを上記の通りに行った。
補足的な方法の参考文献
Bardeesy, N., Aguirre, A.J., Chu, G.C., Cheng, K.H., Lopez, L.V., Hezel, A.F., Feng, B., Brennan, C, Weissleder, R., Mahmood, U., et al. (2006). Both p 16(Ink4a) and the pl9(Arf)-p53 pathway constrain progression of pancreatic adenocarcinoma in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 5947-5952.
Benjamini, Y., and Hochberg, Y. (1995). Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological) 57, 289-300.
Gentleman, R.C., Carey, V.J., Bates, D.M., Bolstad, B., Dettling, M., Dudoit, S., Ellis, B., Gautier, L., Ge, Y., Gentry, J., et al. (2004). Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome biology 5, R80.
Huang da, W., Sherman, B.T., and Lempicki, R.A. (2009). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4, 44-57.
Tang, F., Barbacioru, C, Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V.I., Lao, K., and Surani, M.A. (2010). RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc 5, 516-535.
Trapnell, C, Pachter, L., and Salzberg, S.L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 25, 1105-1111.
実施例3
マウス膵臓CTCの比較分析により、60種の細胞外タンパク質のエンリッチメントが指し示された（表6）。ヒト血中循環膵臓腫瘍細胞におけるこれらの特定のバイオマーカーおよび治療標的の評価に着手し、ヒト膵臓CTCにおける最も存在量の多い標的を示している（図7）。これらは可能性のあるバイオマーカーを表しているだけでなく、腫瘍細胞の外表面にあるタンパク質というそれらの性質を考慮すれば、それらは治療標的でもある。表6の細胞外タンパク質は、例えば、癌を治療するために、抗体ベースの治療薬（例えば、HER2に対するトラスツズマブ、EGFRに対するセツキシマブ、およびVEGFに対するベバシズマブ）によって標的化することができる。
（表６）膵臓CTCでエンリッチされている細胞外タンパク質のリスト
Figure 0007330235000084
Figure 0007330235000085
Figure 0007330235000086
CTCでエンリッチされているこれらの遺伝子を、ヒトの膵癌、乳癌、前立腺癌単一細胞CTCデータに拡張したところ、表9に示した5種の候補遺伝子が同定された。
（表９）RNA-seqによって高発現であったヒト単一CTCのパーセント
Figure 0007330235000087
膵癌に注目して、評価する最初の遺伝子としてSPARCを選択した。マウスおよびヒトの原発性腫瘍におけるSPARC RNA-ISH（非提示データ）により、腫瘍に対して必須の微小環境シグナルを与える、腫瘍の間質細胞における有意な発現が明示された。治療効果を目的としてPDACの間質を標的とすることに注目してきた、この分野における多くの努力により［1-4］、SPARCはCTC治療標的であるとともに間質指向性標的ともされている。ヒト膵臓腫瘍198件中合計196件（99％）はSPARCに関して陽性であり、明らかな上皮腫瘍細胞発現については36％陽性であった。
ヒト膵癌細胞株の評価により、5種の細胞株のうち3種がSPARC発現が高値であるとして同定され、それらは、転移挙動と相関する代用インビトロアッセイである遊走挙動の増加と相関していた（図8）。
ヒト膵癌におけるSPARC機能の評価を、SPARC発現が最も高度であった2種の細胞株（PDAC2およびPDAC3）に対して、低分子ヘアピン型RNA干渉（shRNA）を用いて行った。増殖、遊走、浸潤、スクラッチ法および軟寒天法を含む、複数のインビトロアッセイを行った。SPARC発現を抑制することによる最も著明な効果は遊走挙動に対してであり（図9および非提示データ）、このことはSPARCが多くのCTCに存在するだけでなく、細胞株モデルにおいて阻害された場合にも機能的影響があることを指し示している。
これらのデータを考慮した上で、SPARCノックダウンが転移に影響するか否かを明らかにするために、PDAC-3を用いてインビボ尾静脈接種を行った。尾静脈注射から2週後の初期データでは、SPARCがshRNAによって阻害された場合に転移能の低下が指し示されており、対照マウスでは83％が転移を有したが、これに対してSPARCに対するshRNAを有する細胞株では40％であった（図10）。
表面タンパク質標的
表9に特定されている標的のほとんどは分泌性因子であり、細胞表面タンパク質としてアノテーションが行われた遺伝子の分析については表14にまとめた。
（表１４）表面タンパク質遺伝子が高発現であるヒト単一CTCのパーセント
Figure 0007330235000088
これらの遺伝子は、それらがCTCの原形質膜中に組み込まれることを考慮すれば、標的であることが本明細書において想定される。一般に、細胞表面マーカーのRNA発現は、細胞上での実際のタンパク質レベルよりも少ない傾向がある。
本明細書において治療的有用性に関して想定しているのは、IL6ST、SULF2およびSV2Aに対する抗体である。
1．IL6ST‐IL6、LIF、CNTFおよびオンコスタチンMに対するシグナル伝達物質。
a．下流でのSTAT3活性化のために重要
b．IL6受容体およびIL6に対する抗体は、癌を含むヒト疾患に対して開発されている
2．SULF2-スルファターゼは6-O-硫酸基を除去することによってヘパリン硫酸を修飾する
a．癌の進行および転移において発現がエンリッチされる
b．スルファターゼ活性に対する薬物が開発され、肝癌モデルにおいて活性が試験されている
3．SV2Aシナプス小胞糖タンパク質は神経内分泌細胞において高値である。
a．神経内分泌細胞のマーカーであり、ヒト膵癌の上皮間質境界に認められる
b．癌における神経内分泌分化の共通の特徴であり、より悪性度の高い疾患の前兆となる
参考文献
Figure 0007330235000089
Figure 0007330235000090
Figure 0007330235000091
実施例5
血中循環腫瘍細胞（CTC）は、原発性腫瘍から剥離して血流中に入り、遠隔臓器への癌の血行性伝播を媒介する。それらの組成を明確にするために、CTCのゲノムワイド発現プロファイルを、膵癌のマウスモデルにおける条件を合わせた原発性腫瘍と比較し、エピトープ非依存的なマイクロ流体捕捉を用いて個々のCTCを単離し、その後に単細胞RNAシークエンシングを行った。CTCは原発性腫瘍由来のものと腫瘍由来細胞株に由来するもので別々にクラスター化し、増殖シグネチャーが少ないこと、Aldh1a2のエンリッチメント、上皮マーカーおよび間葉マーカーの混合型発現、ならびに上皮-間質境界面でエンリッチされる遺伝子転写物であるIgfbp5の発現を示した。マウスならびにヒトの膵臓CTCは、SPARCを含む間質由来細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の極めて高度の発現を示し、癌細胞におけるそのノックダウンにより、細胞遊走および浸潤性が抑制された。間質ECM遺伝子のCTCによる異常発現は、癌の遠隔臓器への伝播のための微小環境シグナルへのそれらの寄与を提示するものである。
古典的CTCはほとんどAldh1a2アイソフォームを発現し、一方、種々の細胞型ではAldha1が発現された（非提示データ）。単一CTCにおいて、Aldh1アイソフォームの発現と間葉遺伝子（Cdh11、Vim）のエンリッチメント、または上皮遺伝子（Cdh1、Muc1）の損失との間に相関は見られず、このことは幹細胞マーカーおよびEMTマーカーがCTCと本来結びつきがないことを指し示している。RNAインサイチューハイブリダイゼーション（RNA-ISH）を用いた、Aldh1a2に関する原発性膵臓腫瘍の分析により、この幹細胞マーカーを発現する稀な上皮腫瘍細胞が同定されたが、発現の大半は癌に付随する間質細胞内に存在しており（図12A）、これはヒトPDACにおけるALDHタンパク質に関する免疫組織化学と一致する（Rasheed et al., 2010）。
CTCの明らかな多様性に加えて、原発性腫瘍内にあるそれらの起源の細胞、それらが血流に侵入してその中で生存する機序、および最終的にはCTC特異的治療標的の可能性があるものの同定について、洞察がさらに得られる可能性のある共通の転写物を検索した。すべての古典的CTCのうちR90％で、非常に高いレベル（100 RPMを上回る）で発現される、最も高度にエンリッチされているCTC-c転写物（RPスコア＜300）を同定するために、厳格な基準を選択した。3種の遺伝子がこれらの基準を満たした：重要な幹細胞（iPS）リプロラミング因子の1つであるKruppel様因子4（Klf4）（Takahashi and Yamanaka, 2006）、細胞外増殖因子結合タンパク質の1つであるインスリン様増殖因子結合タンパク質5（Igfbp5）、およびデコリン（Dcn）。これらの3種の高度にエンリッチされているCTC遺伝子の共存の可能性を同定するために、原発性腫瘍標本においてRNA-ISHを利用した。Aldh1a2とは対照的に、Klf4は原発性腫瘍の上皮性構成要素において発現される（図12B）。Igfbp5は、それが腫瘍上皮-間質境界面で限局性に発現されるという点で特に関心が持たれる（図12C）。この位置領域はEMTを受ける癌細胞がエンリッチされており、単一CTCのRNA-seqによって明らかとなった混在性上皮／間質転写プログラムに寄与することを、本明細書において想定している。
CTCは、高発現されるDcnに加えて、複数のECM遺伝子転写物も一貫して高レベルで有していた。CTCでエンリッチされている全遺伝子のGO分析（表3）により、32種のタンパク質性ECM遺伝子（GO：0005578、OR 2.4、q値 4.8 3 10.3）が同定された。これらの遺伝子は、上皮癌細胞ではなく、反応性間質細胞において通常発現されており、最近の諸研究では膵癌病態および転移を支える上での間質の重要性が強く示されているが（Feig et al., 2012；Neesse et al., 2011, 2013；Olive et al., 2009；Provenzano et al., 2012）、循環血液中の腫瘍細胞におけるこれらの間質関連ECM遺伝子の発現は予想外であった。RP発現変動分析を用いて、CTCを、精製EGFPタグ標識原発性腫瘍単細胞（TuGMP3）およびバルク腫瘍試料（反応性間質細胞が混在する腫瘍細胞）と比較した。6種のタンパク質性ECM遺伝子がCTCおよび間質構成要素において高発現されていたが、原発性腫瘍内の上皮細胞によっては発現されなかった：Dcn、Sparc、Ccdc80、Col1a2、Col3a1およびTimp2（非提示データ）。DcnおよびSparcの両方のRNA-ISH分析により、マウス原発性腫瘍の間質性要素における散在性発現が確かめられ、上皮-間質境界でこれらの転写物がケラチン-発現細胞と共存している稀な領域も認められた（非提示データ）。
SPARCは、ECMタンパク質遺伝子の1つである。198種の原発性ヒトPDACのRNA-ISH分析により、症例の99％でSPARC転写物の大量の間質細胞発現が実証され、腫瘍の最大3分の1ではこのECM遺伝子産物を発現する稀な上皮細胞が認められた（非提示データ）。これらの観察所見に一致して、単一のEGFPタグ標識原発性腫瘍細胞のRNA-seq （非提示データ）では、SparcおよびKrt19の高レベル（＞100rpm）での共発現を有することが同定された細胞は20個中1個（5％）のみであった。
以上をまとめると、ECM遺伝子の大量の発現は、すべてのケラチンリッチ古典的CTCの共通の特徴である。これは原発性腫瘍とは著しく対照的であり、これらの遺伝子産物は支持性の間質細胞によっては分泌されるが、上皮癌細胞によっては分泌されない。しかし、原発性腫瘍の上皮-間質境界面にある稀な細胞はケラチンおよびECM遺伝子の両方を発現するように思われ、これはCTCそれ自体において観察されるパターンと一致する。
血流中のヒト癌細胞血中循環によるタンパク質性ECM遺伝子の発現を確かめるために、単一CTCを膵癌（n＝7）、乳癌（n＝29）および前立腺癌（n＝77）の患者から単離し、これらを単細胞RNA-seqに供した。6種のECMタンパク質遺伝子がヒトCTCにおいて高発現されていた（全CTC試料の15％超で＞100rpm）（図13；表13）。注目に値することとして、この3種の遺伝子（SPARC、MGP、SPON2）はECM糖タンパク質であり、コアマトリソーム（core matrisome）の一部として明確になっている（Naba et al., 2012）。コアマトリソームタンパク質SPARCは、膵臓CTCにおいて特にエンリッチされており、膵臓CTCの100％で高レベル（＞100rpm）で発現され、これに対して乳癌CTCでは31％、前立腺CTCでは9％であった。ヒト上皮CTC間でのECMタンパク質遺伝子発現の顕著な違いは、微小環境組織特異性を示唆するとともに、ECMタンパク質シグナル伝達の冗長性の可能性も示唆する。総合すると、ヒトCTCにおけるECM遺伝子ファミリーメンバーの一貫した発現は、それらのアップレギュレーションが、原発性腫瘍からのCTCの生成、または血流中を循環している時の微小環境シグナルが失われた癌細胞の生存のいずれかに寄与することを指し示している。
膵癌細胞におけるSPARC発現の機能的影響を明確にする目的で、患者由来で継代数の少ない一群のPDAC細胞株を発現に関してスクリーニングした。SPARC発現が比較的高度である2種のヒトPDAC細胞株（PDAC2 and PDAC3）が同定され、それにより、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）媒介性ノックダウンの結果を検証することが可能になった（図8、9、図16A～16D）。PDAC2およびPDAC3細胞株の両方において、2種の無関係なshRNA構築物を用いた内因性SPARC発現の抑制は、2D培養物における増殖にも、足場非依存的な腫瘍スフェア形成にも影響を及ぼさなかった（図14A～14B、図16A～16D）。しかし、この両方のshRNAによるSPARCノックダウンにより、創傷スクラッチアッセイにおける膵癌細胞遊走、およびインビトロBoydenアッセイによって測定したそれらの浸潤特性は有意に低下した（非提示データ）。
両方のshRNA構築物を用いてSPARCが抑制されたPDAC3細胞の尾静脈注射は、非標的ヘアピン（shNT）対照を発現する細胞よりも、生じる肺転移を有意に減少させた（図14D）。同所性膵臓異種移植片から生じる転移も、ルシフェラーゼ画像化および原発性腫瘍サイズに関する正規化による測定で、SPARCが抑制されたPDAC3細胞に関しては有意に減少した（図14E）。したがって、膵癌細胞によるSPARC発現は、それらの浸潤特性および遊走特性を選択的に強化して、転移の病毒性を増強させるように思われる。このことからみて、事実上すべての膵臓CTCで明らかに認められる高レベルのSPARC発現は、それが膵癌の転移伝播に有意に寄与するという可能性を提起するものである。
考察
本明細書に記載されたのは、単細胞RNA-seqを用いた、膵癌におけるCTCの組成および多様性の詳細な分析である。高品質トランスクリプトームが93個のマウス膵臓単一CTCで達成され、それらを、条件を合わせた原発性腫瘍由来のバルク調製物および単細胞調製物、ならびに同じマウス膵臓腫瘍モデルから樹立された不死化細胞株と比較した。KPCマウスモデルの使用により、同時に単離された原発性腫瘍標本とCTCを比較することが可能になり、かつ、同じKras／Trp53遺伝的原因を共通に有する複数のマウス間でCTC不均一性を検討することも可能になった。単離されたCTCが多数であること、およびこれらの細胞から単離されたRNAが高品質であることは、正常な血液成分を効果的に枯渇させ、タグ標識のないCTCを濃縮し、かつ単細胞操作を可能にするという、CTC-iChip技術の有用性を反映している。さらに、その細胞表面エピトープにかかわらずCTCが精製されることにより、EpCAMなどの一般的な上皮マーカーの発現に基づくそれらの精製につきまとうバイアスも回避される。
総合すると、本明細書において得られた観察所見には以下が含まれる。（1）CTC発現プロファイルが、主要な「古典的CTC」グループ、および血小板由来マーカーまたは増殖シグネチャーによって定義される他のグループを含む、3つのクラスにクラスター化する。（2）事実上すべての古典的CTCが有する共通のマーカーには、上皮マーカーおよび間葉マーカーの両方、幹細胞関連遺伝子Aldh1a2、ならびに高発現される3種の転写物、Klf4、Igfbp5およびDcnの発現が含まれる。原発性腫瘍における上皮-間質境界でのIgfbp5発現細胞の特異的な局在は、CTC生成に有意に寄与する領域を提示している。（3）ほぼすべての古典的CTCが共通して有する最も高度にエンリッチされているCTC特異的転写物は、細胞外マトリックスタンパク質、例えばSparcなどをコードする。（4）腫瘍間質区画に通常大量に存在する、このECM遺伝子産物のCTCにおける異常発現が、マウスおよびヒトの両方の膵臓CTCで観察され、かつそのノックダウンにより、再構成された系における癌細胞の遊走および浸潤が減弱する（図15）。白血球由来リードのデジタル減算を必要とした、部分的に精製されたバルクCTC集団のRNA-seqと比較して（Yu et al., 2012, 2013）、本明細書において報告された単細胞分析は、かなり上回る深さを持つ腫瘍細胞特異的リードをもたらし、それはCTC不均一性の測定を可能にする。
体細胞性に獲得された遺伝的およびエピジェネティックな変化は、突然変異を惹起することに加えて、種々の腫瘍に由来するCTCを識別させうることが本明細書において想定される。複数のマウス腫瘍は、CTCの3つの異なるクラスターのそれぞれに寄与していた。それらの非典型的な発現パターンにもかかわらず、血小板関連CTCサブセットおよび増殖性CTCサブセットが腫瘍由来であると同定されることは、それらに系列タグ標識腫瘍細胞を含めることによって立証された。古典的CTCクラスターによって示されるより特徴的な発現パターンにより、原発性腫瘍細胞との詳細な比較が可能になっており、それによってCTCの起源および特性についての洞察がさらに得られる。
マウス膵臓古典的CTCは、上皮-間葉転換の重要な特徴である上皮マーカー、E-カドヘリン（Cdh1）の発現を一様に喪失している。しかし、これらの細胞は、サイトケラチンなどの他の上皮マーカーの発現は喪失しておらず、ビメンチンなどの古典的間葉マーカーの一貫した増加も見られない。そのため、ほとんどの古典的CTCは混合型状態に停止しているように思われる。原発性腫瘍の上皮構成要素に存在する、それらによるサイトケラチンの発現にもかかわらず、CTCにおけるほとんどの他の高発現マーカーは、原発性腫瘍の間質性構成要素と共通している。これらの間質遺伝子の中には、Aldh1a2がある（Rasheed and Matsui, 2012；Rasheed et al., 2010）。古典的CTCに共通する上皮性および間葉性状態に関する興味深い観察所見は、原発性腫瘍内の上皮／間質境界面にある細胞の小さな部分集団で特有に発現されるIgfbp5の、それらによる事実上普遍的な（93％）発現である。このことは、原発性腫瘍内のこの決定的な場所で、生存能のあるCTCのかなり多くの割合が生じるという可能性を提起する。
この単一CTC RNAseq研究からの最も予想外の観察所見は、古典的CTCの大多数でECM転写物の存在量が非常に多かったことである。これらのECM遺伝子産物を発現する単細胞における、膵癌においてエンリッチされているサイトケラチン（Krt7およびKrt19）の共発現により、これらが血中循環腫瘍由来線維芽細胞であるという可能性は否定される。
一部の膵癌細胞におけるSPARCの異常発現と一致して、患者由来腫瘍細胞株のサブセットも、それを上皮サイトケラチンと共発現する。SPARCノックダウン後のこれらの膵臓細胞株によって示された細胞遊走および転移能の低下は、それがCTC媒介性転移に寄与することを指し示している。Sparc発現は転移に寄与するものの、ECMタンパク質発現に本来備わった冗長性のために、いくつかの態様においてはこの効果が減じる可能性があることが本明細書において想定される。
化学療法薬の送達を改良し、さらに腫瘍細胞をそれらを支える微小環境から引き離す手段として、膵癌間質を標的とすることにはかなりの努力が向けられている（Neesse et al., 2011；Olive et al., 2009；Provenzano et al., 2012；Rasheed et al., 2012）。本明細書に記載された知見、例えば、これらの遺伝子産物がCTC自体によっても発現されるという知見は、著しいレベルの細胞可塑性を示唆する。CTCの浸潤特性がそのようなECMタンパク質の発現によって部分的に媒介されるという限りにおいて、このことは血液中の癌細胞を標的化する可能性をも提起する。
（表１３）ヒトCTC ECM遺伝子の発現
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（表１０）CTC-cとの比較でCTC-proにおいてエンリッチされている最も有意な遺伝子セット
q値＜0.01
Figure 0007330235000099
（表１１）CTC-cとの比較でCTC-pltにおいてエンリッチされている最も有意な遺伝子セット
q値＜0.01
Figure 0007330235000100
（表１２）ランクプロダクトによる、有意に発現された遺伝子（FDR＜0.01）
Figure 0007330235000101
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Figure 0007330235000127
表13および表12に列記された遺伝子名は一般名である。表13または表12に列記された遺伝子のそれぞれに関するNCBI Gene ID番号は、NCBIの"Gene" Database（World Wide Webのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用可能）を、一般名をクエリーとして用いて検索し、返された最初のヒト（Homo sapiens）遺伝子を選択することによって得ることができる。他の遺伝子を、UCSCゲノムブラウザ（World Wide Webのhttp://genome.ucsc.eduで利用可能）をGene Sorter機能を用いて得ることもできる。ある態様において、マーカー遺伝子は、表13および／または表12に列記された遺伝子から選択される。
いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、表13で少なくとも1つの型のCTCにおいてアップレギュレートされることが示されているマーカー遺伝子、例えば、マーカー遺伝子1～142から選択される。いくつかの態様において、マーカー遺伝子は、表12で少なくとも1つの型のCTCにおいてアップレギュレートされることが示されているマーカー遺伝子、例えば、「CTC-c 対 原発性腫瘍でエンリッチされている遺伝子」または「CTC-c 対 WBC」と表示された列の中のマーカー遺伝子から選択される。
CTCにおいて、表13または表12に列記されたマーカー遺伝子がアップレギュレートされてもよく、例えば、表13または表12に列記されたマーカー遺伝子に関して、細胞または試料における測定されたマーカー遺伝子の発現がそのマーカー遺伝子の発現の参照基準レベルと比較して高度であるならば、その細胞はCTCと同定される、かつ／またはその試料はCTCを含むと同定される。統計学的に有意な変化が認められることが好ましい。しかし、たとえ一群の中の少数の遺伝子が正常と異なっていなくても、その一群の全体的変化が有意な変化、好ましくは統計学的に有意な変化を示すならば、その試料はCTCを含むと同定することができる。表記されたマーカーの考えられる2種またはそれを上回るすべての組み合わせを、本明細書において想定している。

Claims (6)

  1. 試料中の膵癌血中循環腫瘍細胞（PC-CTC）を検出する方法であって、
    試料からCTCを単離する段階；
    単離されたCTC中の、膵癌腫瘍細胞と比較してPC-CTCにおいて優先的に発現される表面タンパク質遺伝子の遺伝子発現産物のレベルを測定する段階であって、該表面タンパク質遺伝子が、IL6ST；SULF2；ARSA；TIMP2；CD55；ITGA6；SDC4；およびCDONからなる群より選択される、段階；および
    該遺伝子発現産物の検出レベルが参照基準レベルを上回る場合にPC-CTCが存在すると判定する段階;
    を含む、方法。
  2. 以下からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現産物のレベルを測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
    ABI3BP; ADAMTS5; ADAMTSL1; ALDH1A1; ALDH1A2; ANG; C1RL; C3; C4A; C4B; CCDC80; CD109; CHI3L1; CLEC3B; CMTM3; CMTM7; COL14A1; COL1A2; COL3A1; COL4A6; CSF1; DAG1; DCN; DMKN; FBLN1; FGF1; FMOD; GPC3; GPC4; HMGB1; IFNAR2; IGFBP5; IL16; KLF4; LAMA4; LTBP4; MFAP1A; NID2; OGN; PDAP1; PF4; PLAT; PODN; PRELP; RSPO1; SERPING1; SLURP1; SOD3; SPARC; SPOCK2; SPON2; SULF1; TGFB2; TGM2; THBD; THBS1; THSD4; TIMP2; TNXB; TPT1; TWSG1; VEGF; およびWNT4。
  3. 発現産物が核酸である、請求項1または2記載の方法。
  4. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、請求項3記載の方法：
    RT-PCR；定量的RT-PCR；ノーザンブロット法；マイクロアレイに基づく発現分析；次世代シークエンシング；およびRNAインサイチューハイブリダイゼーション。
  5. 発現産物がポリペプチドである、請求項1または2記載の方法。
  6. 発現産物のレベルが、以下からなる群より選択される方法を用いて決定される、請求項5記載の方法：
    ウエスタンブロット法；免疫沈降法；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射線免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織染色；放射性免疫測定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法；FACS；および免疫電気泳動アッセイ。
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