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JP7291398B2 - キメラ分子およびその使用 - Google Patents

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ワターソン，ダニエル
ヤング，ポール・ロバート
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ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド
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Description

[0001] 本出願は、Australian Provisional Application No. 2017901152, タイトル“キメラ分子およびその使用”, 2017年3月30日出願に基づく優先権を主張し、その内容を全体として本明細書に援用する。
[0002] 本発明は、一般にウイルス膜融合タンパク質に基づくキメラポリペプチドに関する。より具体的には、本発明はウイルス融合タンパク質のビリオン表面露出部分およびヘテロロガスな構造安定化部分を含むキメラポリペプチド、ならびにそれらのキメラポリペプチドの複合体に関する。本発明はまた、組成物中におけるこれらの複合体の使用、およびエンベロープウイルス融合タンパク質もしくはその融合タンパク質の複合体に対する免疫応答を惹起するための方法、および／またはエンベロープウイルス感染症を治療もしくは予防するための方法に関する。本発明はさらに、目的とするヘテロロガス分子をオリゴマー化するためのヘテロロガスな構造安定化部分の使用に関する。
[0003] エンベロープウイルス、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルスおよび呼吸器合包体ウイルス（呼吸系発疹ウイルス）(respiratory cyncytial virus)（ＲＳＶ）は、宿主細胞に侵入して感染するためにはウイルス膜が宿主細胞膜と融合することを必要とする。ウイルス融合タンパク質は、準安定‘融合前’コンホメーションから高度安定‘融合後’コンホメーションへのエネルギー的に好ましい構造再構成を行なうことによってこのプロセスを容易にする。この構造変化がウイルス膜と宿主細胞膜の融合を駆動し、その結果、ウイルスゲノムが細胞内へ放出される。
[0004] ウイルス融合タンパク質は現在、それらの個々の構造構築および融合プロセスを駆動する分子特徴に基づいて３クラスに分類されている。クラスＩおよびクラスＩＩＩの融合タンパク質は両方ともそれらの融合前および融合後の両方のコンホメーションにおいてトリマーであり、一方、クラスＩＩ融合タンパク質はそれらの融合前コンホメーションにおいてはダイマーであり、それが次いで再構成されてトリマーの融合後形態になる。ただし、これらの現在決定されているクラスと共通するある鍵となる特徴を共有する新たなクラスのウイルス融合タンパク質が将来同定される可能性はある。クラスＩとクラスＩＩＩの融合タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列ならびにＣ末端膜貫通および細胞質ドメインを含めた実質的な構造特徴を共有する。それらは類似の融合メカニズムも共有し、最初の融合前トリマーが部分解離して、融合後トリマーを形成するために必要である重要な構造再構成を可能にする。
[0005] ウイルス融合タンパク質は多くの医学的に重要なエンベロープウイルスに対する防御中和抗体応答の主要ターゲットであるので、それらは卓越したサブユニットワクチン候補である。しかし、自然感染に際して惹起された広域交差反応性である有効な中和抗体は融合後形態ではなく融合前形態と主に反応することを最近の証拠が示しているので、融合タンパク質固有の準安定性は有効なサブユニットワクチン設計に対する大きな障害である。さらに、ウイルスエンベロープ融合タンパク質の融合前形態は融合後形態には存在しないエピトープを含む(たとえば、Magro et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. USA109(8):3089-3094)。よって、ワクチンについては安定化した融合前形態が抗原としてより望ましいと一般に考えられる。しかし、これらのタンパク質を組換え発現させるための従来のアプローチは一般に、早期始動およびより構造的に安定な融合後形態へのコンホメーションシフトを生じる。
Magro et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(8):3089-3094
[0006] したがって、エンベロープウイルスに対してより効果的な免疫応答を刺激するために実質的にそれらの融合前形態を維持する安定化した組換え融合タンパク質を製造する新規方法に対する緊急のニーズがある。
[0007] 本発明は、融合タンパク質ビリオン表面露出ドメイン（本明細書中で“融合エクトドメインポリペプチド(fusion ectodomain polypeptide)”または“エクトドメイン”とも呼ぶ）の下流に、相互に会合して逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する一対の相補的なヘプタッドリピート(heptad repeat)領域を含むヘテロロガス部分を作動可能な状態で結合させることによって、ウイルス融合タンパク質の融合前コンホメーションを模倣できるという判断から得られたものである。この部分は、融合エクトドメインポリペプチドを安定化してそれが融合後コンホメーションに再構成するのを阻止する一種の‘分子クランプ(molecular clamp)’として作用する。本発明の分子クランプアプローチは、それぞれインフルエンザ、ＲＳＶ、ＨＩＶ、麻疹ウイルスおよびエボラウイルスの融合前コンホメーションを模倣したキメラポリペプチドを製造するために用いられ、よってそれ自体が融合前コンホメーションのウイルスエンベロープ融合タンパク質のミメチックを製造するためのプラットフォームとなる。こうして製造したキメラポリペプチドは自己組織化して、キメラポリペプチドのオリゴマーを含む、したがって天然エンベロープウイルス融合タンパク質複合体の融合前コンホメーションを模倣した、人工エンベロープウイルス融合タンパク質複合体を形成することができる。この自己組織化により、特に組換え発現系における人工複合体の容易な製造が可能になる。本発明のキメラポリペプチドを用いて製造した人工複合体は、以下に記載するように、天然エンベロープウイルス融合タンパク質複合体に対する中和抗体の開発を含めて、免疫応答を刺激するための方法および組成物において有用である。
[0008] したがって、本発明は、一側面において、それらの会合に適した条件下で（たとえば水溶液中で）相互に会合して逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する相補的な第１ヘプタッドリピート（ＨＲ１）および第２ヘプタッドリピート（ＨＲ２）領域を含むヘテロロガスな構造安定化部分に、作動可能な状態で下流において結合したエンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチドを含む、キメラポリペプチドを提供する。ＨＲ１およびＨＲ２領域は一般にエクトドメインポリペプチドに対する相補性を欠如し、したがってそれらはエクトドメインポリペプチドの構造要素とではなく優先的に相互に逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する。ある態様において、ＨＲ１およびＨＲ２領域はそれぞれ独立して、（ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ－）ｎまたは（ｄ－ｅ－ｆ－ｇ－ａ－ｂ－ｃ－）ｎとして表記されるｎ回反復７残基パターンのアミノ酸タイプを特徴とし、その際、パターン要素‘ａ’～‘ｇ’はアミノ酸タイプが位置する一般的なヘプタッド位置を表わし、ｎは２に等しいかまたはそれより大きい数値であり、一般的なヘプタッド位置‘ａ’および‘ｄ’の少なくとも５０％（または少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数パーセント）が疎水性アミノ酸タイプにより占有され、一般的なヘプタッド位置‘ｂ’、‘ｃ’、‘ｅ’、‘ｆ’および‘ｇ’の少なくとも５０％（または少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数パーセント）が親水性アミノ酸タイプにより占有され、その結果生じる疎水性アミノ酸タイプと親水性アミノ酸タイプの分布によりヘプタッドリピート領域の同定が可能になる。ある態様において、ＨＲ１およびＨＲ２領域の一方または両方が、内在性クラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質ヘプタッドリピート領域アミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。このタイプの代表例において、ＨＲ１およびＨＲ２領域は、それぞれ１以上のクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質の相補的な内在性ヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）およびヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）領域を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。ある態様において、ＨＲＡ領域アミノ酸配列とＨＲＢ領域アミノ酸配列は同一のクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質に由来する。他の態様において、ＨＲＡ領域アミノ酸配列とＨＲＢ領域アミノ酸配列は異なるクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質に由来する。代表例において、ＨＲ１およびＨＲ２領域は独立して、オルソミキソウイルス、パラミキソウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルスおよびアレナウイルスにより発現される融合タンパク質のＨＲＡおよびＨＲＢ領域から選択される。
[0009] ある態様において、エクトドメインポリペプチドはクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインに対応する。このタイプの代表例において、エクトドメインポリペプチドは内在性ＨＲＡ領域および内在性ＨＲＢ領域のうち一方または両方を含む。クラスＩ融合タンパク質を含む限定ではないエンベロープウイルスには、オルソミキソウイルス、パラミキソウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルスおよびアレナウイルスが含まれる。
[0010] 他の態様において、エクトドメインポリペプチドはクラスＩＩＩエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインに対応する。クラスＩＩＩ融合タンパク質を含む代表的なエンベロープウイルスには、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスが含まれる。
[0011] エクトドメインポリペプチド（たとえば、クラスＩまたはクラスＩＩＩ）は前駆体エクトドメインポリペプチド全体またはその一部を含むか、あるいはそれからなることができる。ある態様において、エクトドメインポリペプチドは、内在性シグナルペプチド、エクトドメインの内在性ヘッド部分、エクトドメインの内在性ステム部分、内在性ムチン様ドメイン、内在性膜近傍外部領域(membrane proximal external region)および内在性融合ペプチドのうちいずれか１以上を欠如する。エクトドメインポリペプチドは、適切には、そのエクトドメインポリペプチドが対応する融合後形態のエンベロープウイルス融合タンパク質には存在しない少なくとも１つの融合前エピトープを含む。
[0012] ある態様において、構造安定化部分のＨＲ１領域とＨＲ２領域はリンカーにより結合し、それは一般に約１～約１００のアミノ酸残基（およびそれらの間のすべての整数のアミノ酸残基）、一般に約１～約１００のアミノ酸残基（およびそれらの間のすべての整数のアミノ酸残基）からなる。リンカーは、キメラポリペプチドの精製を容易にする精製部分、キメラポリペプチドに対する免疫応答を調節する免疫調節部分、キメラポリペプチドを特定の細胞タイプへ指向させるための細胞ターゲティング部分、および構造柔軟性を付与する部分から選択される少なくとも１つの部分を含むことができる。
[0013] キメラポリペプチドは合成または組換え手段により製造することができる。キメラポリペプチドが組換えにより製造される態様において、本発明は、他の側面において、宿主細胞において作動可能である調節要素に作動可能な状態で連結した前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したキメラポリペプチドに対するコーディング配列を含む、核酸構築体を提供する。
[0014] 関連する側面において、本発明は、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に広く記載した核酸構築体を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核宿主細胞または真核宿主細胞であってよい。
[0015] ヘテロロガスな構造安定化部分は、エクトドメインポリペプチドを融合後コンホメーションへの再構成に対抗して安定化する際におけるそれの有用性のほかに、目的とするいずれかのヘテロロガス分子をオリゴマー（特にトリマー）にオリゴマー化するのに有用である。したがって、他の側面において、本発明は、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したように、それらの会合に適した条件下で（たとえば水溶液中で）相互に会合して逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する相補的な第１ヘプタッドリピート（ＨＲ１）および第２ヘプタッドリピート（ＨＲ２）領域を含むヘテロロガスな構造安定化部分に、作動可能な状態で下流において結合したタンパク性分子を含む、キメラポリペプチドを提供する。
[0016] 本発明のキメラポリペプチドは適切な条件下で（たとえば水溶液中で）自己組織化してキメラポリペプチド複合体を形成することができる。したがって、他の側面において、本発明はキメラポリペプチド複合体を製造する方法であって、下記を含む方法を提供する：前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したキメラポリペプチドを、キメラポリペプチド複合体の形成に適した条件下で（たとえば水溶液中で）結合させ、それにより、３つのキメラポリペプチドサブユニットを含み、キメラポリペプチドのそれぞれの構造形成部分の２－ヘリックスバンドルのオリゴマー化により形成された６ヘリックスバンドルを特徴とする、キメラポリペプチド複合体を製造する。
[0017] 関連する側面において、本発明は、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したキメラポリペプチドサブユニットを３つ含み、キメラポリペプチドのそれぞれの構造形成部分の２－ヘリックスバンドルのオリゴマー化により形成された６ヘリックスバンドルを特徴とする、キメラポリペプチド複合体を提供する。キメラポリペプチドがエンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチドを含むある態様において、キメラポリペプチドの自己組織化により形成されたキメラポリペプチド複合体は、融合後形態のエンベロープウイルス融合タンパク質またはその複合体には存在しない、目的とするエンベロープウイルス融合タンパク質（たとえば、野生型エンベロープウイルス融合タンパク質）またはその複合体の少なくとも１つの融合前エピトープを含む。
[0018] 本発明は、他の関連する側面において、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチド複合体、および医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤またはアジュバントを含む、組成物を提供する。ある態様において、組成物は免疫調節組成物である。
[0019] キメラポリペプチドがエンベロープウイルス融合エクトドメインを含むある態様において、本発明のキメラポリペプチド複合体は対象または産生動物においてエンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に対する免疫応答を惹起するために有用である。したがって、本発明の他の側面は、対象においてエンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に対する免疫応答を惹起する方法であって、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したキメラポリペプチド複合体または組成物を対象に投与し、その際、キメラポリペプチド複合体のエクトドメインポリペプチドサブユニットがエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応することを含む方法を提供する。
[0020] 関連する側面において、本発明は、エンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体と結合する薬剤（たとえば、小分子または高分子）を同定する方法であって、下記を含む方法を提供する：前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したエクトドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチド複合体と候補薬剤を接触させ、その際、エクトドメインポリペプチドはエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する；そしてキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチド複合体への候補薬剤の結合を検出する。特定の態様において、本発明はさらに、候補薬剤を融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体と接触させ、そして融合タンパク質またはその複合体への候補薬剤の結合を検出することを含む。特定の態様において、候補薬剤は化合物ライブラリー（たとえば、小分子または高分子のライブラリー）の一部である。これらの態様のうちあるものにおいて、その方法はさらに、候補薬剤をライブラリーから単離することを含む。適切には、候補薬剤はキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチド複合体に、好ましくは融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に、特異的に結合する。
[0021] 他の関連する側面において、本発明は、エンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体と免疫相互作用性である抗原結合分子（たとえば、中和抗体などの抗体）を製造する方法であって、下記を含む方法を提供する：（１）動物を、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したエクトドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチド、またはキメラポリペプチド複合体、または組成物で免疫化し、その際、エクトドメインポリペプチドはエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する；（２）融合タンパク質またはその複合体と免疫相互作用性であるＢ細胞をその動物から同定および／または単離する；そして（３）そのＢ細胞が発現した抗原結合分子を製造する。
[0022] 本発明のさらなる側面として、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載した免疫化方法により製造された抗原結合分子、またはその抗原結合分子と同じエピトープ結合特異性を備えた誘導体型の抗原結合分子をも提供する。誘導体型の抗原結合分子は、抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）およびドメイン抗体（たとえば、サメおよびラクダ科動物の抗体を含む）、ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原結合／認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれかの修飾構造体から選択できる。
[0023] 関連する側面において、本発明は、前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載した抗原結合分子、および医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤またはアジュバントを含む、組成物を提供する。
[0024] 前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載した本発明のエンベロープウイルス融合エクトドメイン含有キメラポリペプチドまたはその複合体、ならびに組成物および抗原結合分子は、エンベロープウイルス感染症を治療または予防するためにも有用である。したがって、さらに他の側面において、本発明は、対象においてエンベロープウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、有効量の前記および本明細書の他のいずれかの箇所に概説的に記載したエンベロープウイルス融合エクトドメイン含有キメラポリペプチドもしくはその複合体、組成物または抗原結合分子を対象に投与することを含む方法を提供する。
[0025] 図１は、コンホメーション特異的モノクローナル抗体とのＥＬＩＳＡ ＲＳＶ Ｆ反応性を示すグラフである。Ａ．融合前特異的モノクローナル抗体Ｄ２５(Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. 97(26): 14172-7)は、キメラクランプ安定化したＲＳＶ Ｆに２３．４±１２．５ｎＭの親和性で結合するが、対応する非安定化ＦエクトドメインであるＦ ｓｏｌには結合しない。Ｂ．融合前特異的モノクローナル抗体Ｄ２５は、キメラクランプ安定化したＲＳＶ Ｆ ＤＳ ｃａｖ変異体および対照のキメラｆｏｌｄｏｎ安定化したＲＳＶ Ｆに同等の親和性（それぞれ、１．２±０．２ｎＭおよび１．３±０．２ｎＭ）で結合するが、対応する非安定化ＦエクトドメインであるＦ ｓｏｌには結合しない。Ｃ．広域交差中和性の融合前特異的モノクローナル抗体ＭＰＥ８(Corti et al., Nature 2013. 501(7467): 439-43)はキメラクランプ安定化したＲＳＶ Ｆ ＤＳ ｃａｖ変異体および対照のキメラｆｏｌｄｏｎ安定化したＲＳＶ Ｆに同等の親和性（それぞれ、７．６±１．５ｎＭおよび１０．８±２．４ｎＭ）で結合するが、対応する非安定化ＦエクトドメインであるＦ ｓｏｌには結合しない。 [0026] 図２は、コンホメーション特異的モノクローナル抗体とのＥＬＩＳＡインフルエンザＨ３反応性を示すグラフである。Ａ．ヘッド(head)特異的抗体Ｃ０５(Ekiert et al., Nature 2012. 489(7417): 526-32)は、Ｈ３ｓｏｌ、Ｈ３クランプおよびＱＩＶに同様に結合する；しかし、融合前ステム(stem)特異的モノクローナル抗体ＣＲ８０４３(Friesen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2014. 111(1): 445-50)はキメラクランプ安定化インフルエンザＨＡに３．３±０．８ｎＭの親和性で結合するが、対応するＨＡエクトドメインまたは市販のＱＩＶには結合しない。 [0027] 図３は、オリゴマー状態のタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー分離を示すグラフである。キメラクランプ安定化したインフルエンザＨＡは、それがＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムからおおよそ１１ｍＬで溶出することにより分かるように、可溶性トリマーとして存在する。比較すると、単離に際して発現した対応するＨＡエクトドメインは、凝集体として存在するタンパク質の部分およびモノマーとしての他の部分に一致するおおよそ８ｍＬおよび１２ｍＬでカラムから溶出する。インフルエンザＨＡの融合後形態は融合ペプチドの曝露により解離してモノマー形または凝集体になる可能性があることが以前に示されている(Weldon et al., PLoS One 2010. 5(9))。市販のＱＩＶは、高分子量凝集体であることを示す８ｍＬで溶出した。 [0028] 図４は、ワクチン接種に際して生じる中和免疫応答を示すグラフである。市販（ＱＩＶ）ワクチンを接種したマウスからの血清は、インフルエンザＡ／Ｈｅｂｅｉ Ｂａｏｄｉｎｇ Ａｎｇｕｏ／５１／２０１０（Ｈ３Ｎ２）に対しておおまかなＩＣ５０値１８０で中和を示した。これと比較して、キメラクランプ安定化したインフルエンザＨＡはＩＣ５０値１：１４，０００（９５％ＣＩ １１，０００～１７，０００）で大幅に増大したレベルのウイルス中和活性を示し、一方、対応するＨＡエクトドメインを接種したマウスからの血清は、最高の試験用量１：２０ですら中和活性を示さなかった。Ｈ３ｓｏｌ、ＱＩＶとのプレインキュベーションはＨ３Ｎ２中和に影響を及ぼさなかったが、Ｈ３クランプとのプレインキュベーションはＨ３Ｎ２中和を移動させた。 [0029] 図５は、誘導免疫応答のサブドメイン特異性を示すグラフである。Ｈ３ｓｏｌ、Ｈ３クランプまたは市販ワクチン（ＱＩＶ）を接種したマウスからの血清は、Ｈ３のヘッドおよびステムサブドメインとの示差反応性を示した。キメラクランプ安定化したインフルエンザＨＡを接種したマウスからの血清はステムドメインに対して最大の反応性を示し（総Ｈ３特異的応答の約２５％）、一方、Ｈ３ｓｏｌおよびＱＩＶで免疫化したマウスからの血清はこのパーセントがはるかに低かった（それぞれ、１％および４％）。 [0030] 図６は、Ｈ５交差反応性を示すグラフである。ＥＬＩＳＡを用いてＨ５との反応性を測定した。バックグラウンド＋３標準偏差より大きい反応性を生じる最大希釈度としてエンドポイント力価を計算した。Ｈ３ｓｏｌ、Ｈ３クランプ、市販ワクチン（ＱＩＶ）、Ｈ１クランプおよびＨ５クランプを接種したマウスからの血清は、Ｈ５との示差反応性を示した。Ｈ３クランプまたはＨ１クランプを接種したマウスからの血清は、ＱＩＶよりはるかに大きいＨ５との交差反応性を示した（それぞれ、２７倍の増大および８１倍の増大）。 [0031] 図７は、Ｈ５交差反応性に関与するサブドメインを示すグラフである。ＥＬＩＳＡを用いてＨ５との反応性を測定した。バックグラウンド＋３標準偏差より大きい反応性を生じる最大希釈度としてエンドポイント力価を計算した。マウス血清についての総Ｈ５反応性を示す（灰色の棒）。ＥＬＩＳＡ前にステム特異的抗体を前吸収するためにＨ３ステムと血清のプレインキュベーションを採用し（白色の棒）、あるいはステム特異的抗体に打ち勝つためにモノクローナル抗体ＦＩ６ｖ３を添加した（黒色の棒）。 [0032] 図８は、可溶性トリマークランプ安定化したＭＥＲＳスパイクタンパク質の精製を示すグラフである。Ａ．発現後にＣＨＯ上清から精製したクランプ安定化ＭＥＲＳスパイクのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。おおよそ２００ｋＤＡにおけるタンパク質バンドは、会合グリカンを含む生成モノマーＭＥＲＳタンパク質に適正なおおよそのサイズであり、ＣＨＯ上清からの対照精製には見られない。Ｂ．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ６ １０／３００ ＧＬカラムにおけるクランプ安定化ＭＥＲＳスパイクタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。１２．５ｍｌにおける主要タンパク質の溶出は、グリカン会合を含む凝集していないトリマーＭＥＲＳタンパク質について適正なサイズであるおおよそ６００ｋＤＡの指標となる。 [0033] 図９は、ＣＨＯ上清からの、クランプ安定化したムチン様ドメインを欠如するエボラＧＰタンパク質の精製を示すグラフである。ＤＴＴなしのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析はおおよそ１００ｋＤＡにタンパク質バンドを示し、それは会合グリカンを含む生成エボラＧＰタンパク質（天然ジスルフィド橋により連結したＧＰ１およびＧＰ２）に適正なサイズにある。ＤＴＴを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析はおおよそ６０ｋＤＡおよび３０ｋＤａに２つのタンパク質バンドを示し、それらは会合グリカンを含むフーリン(furin)開裂したエボラＧＰタンパク質に適正なサイズである。 [0034] 図１０は、高度中和モノクローナル抗体とのＥＬＩＳＡエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）反応性を示すグラフである。モノクローナル抗体Ｋｚ５２、１Ｈ３、２Ｇ４、４Ｇ７および１３Ｃ６(Murin et al., PNAS. 2014 11(48): 17182-7)はすべて高度の親和性でエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）と結合する。 [0035] 図１１は、エボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）の熱安定性を示すグラフである。精製したエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）をＥＬＩＳＡプレートに結合させ、３０％スクロースの存在下で乾燥させた。高度中和モノクローナル抗体Ｋｚ５２、４Ｇ７および１３Ｃ６(Murin et al., PNAS. 2014 11(48): 17182-7)との反応性を、直ちに、または３７℃で１４日間のインキュベーション後に測定した。反応性に有意の変化は見られず、それはクランプ安定化したタンパク質が高温で長期間安定であることを示す。 [0036] 図１２は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫化後のエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）に対する免疫応答を示すグラフである。５匹３グループのマウスを１μｇのエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）、１μｇのエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）＋３ｕｇのサポニンアジュバントＱｕｉｌ Ａ、または陰性対照としてのＰＢＳのいずれかで皮内免疫化した。マウスを０、２８および５６日目に３回免疫化し、２７日目（採血(bleed)１）、５５日目（採血２）および８４日目（採血３）に血液を採集した。Ａ．血清中のエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）に対して特異的な抗体をＥＬＩＳＡにより定量した。Ｂ．バックグラウンド＋３標準偏差を超える読みを生じることができる最終希釈度を計算することにより、エンドポイント力価を計算した。 [0037] 図１３は、生エボラウイルス ザイール株を中和するためにＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化した後の、エボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）に対する免疫応答能を表わすグラフである。１μｇのエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）＋３μｇのサポニンアジュバントＱｕｉｌ Ａで免疫化したマウスからの血清は、生エボラウイルスを中和することができた。プラーク形成単位の５０％低下を生じる幾何平均力価は５２．８（９５％ＣＩ ２４．５～１１４．０）と計算された。 [0038] 図１４は、Ｎ－連結したグリコシル化部位の挿入によるクランプドメインの免疫サイレンシングを示すグラフである。エボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）において、ＨＩＶ ＧＰ１６０ベースのＳＳＭに基づくクランプ配列のＨＲＢ内に４つの別個の変異を作製した。キメラクランプ安定化したインフルエンザＨＡで免疫化したマウスからの血清の反応性を、これと同一のクランプ配列または４つの潜在部位のうちの１つにグリコシル化を組み込んだクランプ配列のいずれかで安定化したエボラＧＰクランプ（ムチン様ドメインを欠如）に対比して試験した。それぞれの個々の部位におけるグリコシル化によって反応性が有意に低下し、これはこの方法をクランプドメインに対する反応性の低下のために使用できるという仮説を支持する。変異クランプ配列を組み込んだエボラＧＰ（ムチン様ドメインを欠如）の適性なフォールディングは、Ｋｚ５２親和性を測定することにより確認された。 [0039] 図１５は、クランプ安定化した８種類のウイルスに由来する精製抗原のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す写真である。橙色の矢印により表示したバンドは非開裂生成物を示し、黄色の矢印は開裂生成物を示す。抗原の予想分子量は以下のとおりである：インフルエンザＨＡクランプ＝約８５ｋＤａ、ＲＳＶ Ｆクランプ＝約６５ｋＤａ、エボラＧＰクランプ＝約７２ｋＤａ、ニパ(Nipah)Ｆクランプ 約６４、ＭＥＲＳ Ｓクランプ 約２００ｋＤＡ、ラッサ(Lassa)ＧＰＣクランプ＝約７５ｋＤＡ、麻疹(Measles)＝約６５ｋＤａおよびＨＳＶ２－Ｇｂクランプ＝約１００ｋＤａ。 [0040] 図１６は、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ｐｄｍで攻撃した後のマウス防御試験の結果を示すグラフである：（Ａ／Ｂ）マウス（ｎ＝５）に株Ｃａｌ／０９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）由来のＨ１ｓｏｌ、Ｈ１ｆｏｌｄｏｎまたはＨ１クランプのいずれかを接種し、次いで適合するインフルエンザ株で攻撃した。（Ｃ／Ｄ）マウスにスイス株／１３（Ｈ３Ｎ２）由来のＨ３ｓｏｌ、Ｈ３ｆｏｌｄｏｎまたはＨ３クランプのいずれかを接種し、次いで派生株(divergent strain)Ｃａｌ／０９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）で攻撃した。 [0041] 図１７は、４３℃で７２時間におけるクランプ安定化抗原の熱安定性を示すグラフである。クランプ安定化したワクチン候補および対照タンパク質を４３℃で７２時間インキュベートし、各抗原についての十分に特性解明された３種類のｍＡｂとの反応性を熱安定性の尺度として用いた。Ａ．融合前特異的ｍＡｂであるＤ２５、ＡＭ２２およびＭＰＥ８を用いて、ＲＳＶ Ｆクランプと、ｆｏｌｄｏｎトリマー化ドメインおよび構造ベースの安定化変異を用いる別法(McLellan et al., Science, 2013. 342(6158): p. 592-8)とを比較した。Ｂ．ＨＡステム特異的ｍＡｂであるＦＩ６Ｖ３およびＣＲ６２６１、ならびにＨＡヘッド特異的ｍＡｂである５Ｊ８を用いて、インフルエンザＨ１クランプとｆｏｌｄｏｎトリマー化ドメインを用いる別法とを比較した。 [0042] 図１８は、クランプ安定化したサブユニットワクチンに対する免疫応答を示すグラフである。ＲＳＶ Ｆクランプ、ＦｓｏｌまたはＦｄｓｃａｖ ｆｏｌｄｏｎ(McLellan et al., Science, 2013. 342(6158):592-598)で免疫化したマウスからの血清を、それがＲＳＶを中和する能力について試験した。 [0043] 図１９は、分子クランプの組込みがトリマー状融合前コンホメーションの安定化を容易にすることを示すグラフおよび写真である。クランプ安定化ニパウイルス融合糖タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにおける溶出体積は、可溶性トリマータンパク質の予想分子量と相関する。ネガティブ染色した電子顕微鏡検査（挿入写真）により、均一な融合前タンパク質コンホメーションの存在が確認される。 [0044] 図２０は、クランプ安定化したサブユニットワクチンに対する免疫応答を示すグラフである。ニパＦクランプで免疫化したマウスからの血清を、それらがニパウイルスを中和する能力について試験した。すべてのパネルにおいて、示した数値は個々のマウスの幾何平均であり、誤差バーは幾何学的標準偏差を示す。 [0045] 図２１は、分子クランプの組込みがクラス３ウイルス融合タンパク質のトリマー構造の安定化を容易にすることを示すグラフおよび写真である。クランプ安定化したＨＳＶ２融合－糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムにおける溶出体積は、可溶性トリマータンパク質の予想分子量と相関する。ネガティブ染色した電子顕微鏡検査（挿入写真）により、公開された構造(Heldwein et al., Science, 2006. 313(5784): 217-20)に類似する均一なトリマーコンホメーションの存在が確認される。このコンホメーションは大部分の中和抗体に結合することが示されている(Cairns et al., JVi, 2014. 88(5): 2677-2689)。
１．定義
[0046] 別に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載のものと類似するかまたは均等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を下記のとおり定義する。
[0047] 冠詞“a”および“an”は、本明細書中で１または１より多い（すなわち、少なくとも１）の目的語を表わすために用いられる。たとえば、“an element（要素）”は１つの要素または１より多い要素を意味する。
[0048] 本明細書中で用いる“および／または”は、１以上の付随する列記した項目のありとあらゆる可能な組合わせ、ならびに選択語（または）において解釈した場合は組合わせの欠如を表わし、かつ包含する。
[0049] さらに、本明細書中で用いる用語“約(about)”および“おおよそ(approximate)”は、計数可能な数値、たとえば量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、位置、長さなどを表わす場合、その特定した量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、位置、長さの±１５％，±１０％，±５％，±１％，±０．５％、またはさらには±０．１％の変動を包含するものとする。用語“約”および“おおよそ”を基準ポリペプチド内における領域の位置または配置との関連で用いる場合、これらの用語は±最大２０のアミノ酸残基、±最大１５のアミノ酸残基、±最大１０のアミノ酸残基、±最大５のアミノ酸残基、±最大４のアミノ酸残基、±最大３のアミノ酸残基、±最大２のアミノ酸残基、またはさらには±１のアミノ酸残基の変動を包含する。
[0050] 本明細書中で用いる用語“アジュバント”は、組成物中で特定の免疫原（たとえば、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体）と組み合わせて用いる場合、抗体および細胞性免疫応答のうちのいずれかまたは両方の特異性を強化または広域化することを含めて、生じる免疫応答を補助する化合物を表わす。
[0051] 用語“剤(agent)”は、化合物または物質、たとえば（ただし、それらに限定されない）小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどを表わすために本明細書中で“化合物”と互換性をもって用いられる。“剤”はいずれかの化学物質、物質または部分であってもよく、それには限定ではなく合成および天然のタンパク性および非タンパク性の物質が含まれる。ある態様において、剤は核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物であり、それには限定ではなくタンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにその修飾体および組合わせなどが含まれる。ある態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、および核酸アナログであり、たとえばＰＮＡ、ｐｃＰＮＡおよびＬＮＡであってもよい。核酸は一本鎖または二本鎖であってよく、目的とするタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡなどを含む群から選択できる。そのような核酸配列にはたとえば下記のものが含まれるが、それらに限定されない：転写リプレッサーとして作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、小型の阻害性核酸配列、たとえば（ただし、それらに限定されない）ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど。タンパク質および／またはペプチド剤、あるいはそのフラグメントは、目的とするいかなるタンパク質であってもよい；たとえば（ただし、それらに限定されない）変異タンパク質；療法用タンパク質；トランケート型タンパク質（そのタンパク質は普通は細胞中に存在しないかあるいはより低いレベルで発現する）。目的とするタンパク質は下記のものを含む群から選択できる：変異タンパク質、遺伝子工学的に操作したタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質、およびそのフラグメント。
[0052] 本明細書中で用いる用語“抗原(antigen)”およびそれの文法上の同等表現（たとえば、“抗原性(antigenic)”）は、特異的な体液性または細胞性免疫の生成物、たとえば抗体分子またはＴ細胞受容体が、特異的に結合できる化合物、組成物、または物質を表わす。抗原は、たとえばハプテン、単純な中間代謝産物、糖類（たとえば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに高分子、たとえば複雑な炭水化物（たとえば、多糖）、リン脂質、およびタンパク質を含めたいかなるタイプの分子であってもよい。抗原の一般的カテゴリーには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫その他の寄生虫性抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶に関連する抗原、トキシン、ならびに他の種々の抗原。
[0053] “抗原結合分子”は、ターゲット抗原に対する結合親和性をもつ分子を意味する。この用語が免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、および抗原結合活性を示す非－免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークにまで及ぶことは理解されるであろう。本発明の実施に有用である代表的な抗原結合分子には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体およびドメイン抗体（たとえば、サメおよびラクダ科動物の抗体を含む）、ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに免疫グロブリン分子の抗原結合／認識部位を含む他のいずれかの修飾構造体が含まれる。抗体には、すべてのクラス、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体はいずれか特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに配属させることができる。５つの主要クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうち幾つかをさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類できる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。抗原結合分子には、ダイマー抗体、および多価形態の抗体も包含される。ある態様において、抗原結合分子は、目的とする生物活性を示す限り、キメラ抗体、すなわち重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるかあるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属し、一方、鎖（単数または複数）の残部は他の種に由来する抗体中の対応する配列と同一または相同であるかあるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するもの、ならびにそのような抗体のフラグメントである(参照：たとえば、US Pat. No. 4,816,567; および Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)。同様にヒト化抗体も考慮され、それらは一般に非ヒト（たとえば、げっ歯類、好ましくはマウス）免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変部に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変ドメインに移入することにより作製される。こうして、フレームワーク領域内においてヒト抗体の典型的な残基が非ヒトカウンターパートで置き換えられる。ヒト化抗体に由来する抗体構成要素の使用は、非ヒト定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を排除する。非ヒト、特にネズミの免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的手法は、たとえばOrlandi et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833)により記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製するための手法は、たとえばJones et al. (1986, Nature 321:522)、Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285)、Sandhu (1992, Crit. Rev. Biotech. 12: 437)、Singer et al. (1993, J. Immun. 150: 2844)、Sudhir (ed., Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc. 1995)、Kelley (“Engineering Therapeutic Antibodies,” in Protein Engineering: Principles and Practice Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)、およびQueen et al., U.S. Pat. No. 5,693,762 (1997)により記載されている。ヒト化抗体には“霊長類化(primatized)”抗体が含まれ、それらにおいては抗体の抗原結合領域がマカク属サルを目的抗原で免疫化することにより産生された抗体に由来する。ヒト化抗体も抗原結合分子として考慮される。
[0054] 本明細書中で用いる用語“逆平行”は、ポリマーの領域またはセグメントが平行な向きであるけれども逆の方向性をもつタンパク性ポリマーを表わす。
[0055] 本明細書中で用いる用語“特異的に結合する”は、タンパク質などの高分子および他の生体物質を含めたヘテロロガスな分子集団の存在下における本発明のキメラポリペプチドまたは複合体の存在の確定となる結合反応を表わす。特定の態様において、用語“特異的に結合する”は、抗原結合分子について述べる場合、用語“特異的に免疫相互作用する”などと互換性をもって、タンパク質および他の生体物質のヘテロロガスな集団の存在下における本発明のキメラポリペプチドまたは複合体の存在の確定となる結合反応を表わすために用いられる。指示したアッセイ条件下で、ある分子は特異的に本発明のキメラポリペプチドまたは複合体に結合し、試料中に存在する他の分子（たとえば、タンパク質または抗原）に有意量で結合することはない。抗原結合分子の態様においては、多様なイムノアッセイフォーマットを用いて本発明のキメラポリペプチドまたは複合体と特異的に免疫反応性である抗原結合分子を選択することができる。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイはタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するためにルーティンに用いられる。特異的免疫反応性を判定するために使用できるイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
[0056] 用語“キメラの(chimeric)”は、分子に関して用いる場合、その分子が２以上の異なる起源または供給源から誘導され、入手もしくは単離され、またはそれらをベースとする部分を含むことを意味する。よって、あるポリペプチドは、それが異なる起源の２以上のアミノ酸配列を含み、（１）自然界では一緒に見られることのないポリペプチド配列を含む（すなわち、アミノ酸配列のうちの少なくとも１つがそれの他のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つに対してヘテロロガスである）か、あるいは（２）自然界では隣接(adjoin)することのないアミノ酸配列を含む場合、キメラである。
[0057] “コード配列”は、遺伝子のポリペプチド生成物または遺伝子の最終ｍＲＮＡ生成物（たとえば、遺伝子のスプライシング後のｍＲＮＡ生成物）のコードに関与するいずれかの核酸配列を意味する。これに対し、用語“非コード配列”は、遺伝子のポリペプチド生成物または遺伝子の最終ｍＲＮＡ生成物のコードに関与しないいずれかの核酸配列を表わす。
[0058] 用語“コイルドコイル”または“コイルドコイル構造”は、本明細書中で２以上のα－ヘリックス（２～７つのα－ヘリックスが最も頻度が高い）がロープの鎖のように互いに巻きついたタンパク質の構造モチーフ（ダイマーおよびトリマーが最も一般的なタイプである）を表わすために互換性をもって用いられる。多くのコイルドコイル型タンパク質が重要な生物学的機能、たとえば遺伝子発現の調節に関与している：たとえば転写因子。常にではないが、コイルドコイルはしばしば疎水性（ｈ）および極性（ｐ）アミノ酸残基の反復パターンｈｐｐｈｐｐｐまたはｈｐｐｐｈｐｐを含み、ヘプタッドリピートと呼ばれる（後記を参照）。この反復パターンをもつ配列がフォールドしてα－ヘリックス状二次構造になると、疎水性残基が左巻きにヘリックスの周りに緩く巻きついた‘ストライプ’として提示されて、両親媒性構造を形成する。２つのそのようなヘリックスが水を満たした環境で自己配列するための最も好ましい方法は、疎水鎖が親水性アミノ酸の間に挟まれた状態で互いに巻きつくことである。こうして疎水性表面が埋没し、それによりα－ヘリックスのオリゴマー化のための熱力学的推進力が生じる。コイルドコイル境界面でのパッキングはきわめて密である。α－ヘリックスは平行または逆平行の可能性があり、通常は左巻きスーパーコイルの形をとる。不都合ではないが、わずかな右巻きコイルドコイルも天然および人工タンパク質で観察されている。用語“コイルドコイル”または“コイルドコイル構造”は、共通の一般的知識に基づいて当業者に明らかであろう。これに関してコイルドコイル構造に関連する概説報文が特に参照される；たとえば、Cohen and Parry (1990. Proteins 7:1-15); Kohn and Hodges (1998. Trends Biotechnol 16:379-389); Schneider et al. (1998. Fold Des 3:R29-R40); Harbury et al. (1998. Science 282:1462-1467); Mason and Arndt (2004. Chem-BioChem 5:170-176); Lupas and Gruber (2005. Adv Protein Chem 70:37-78); Woolfson (2005. Adv Protein Chem 70:79-112); Parry et al. 2008. J Struct Biol 163:258-269); およびMcfarlane et al. (2009. Eur J Pharmacol 625:101-107)。
[0059] 本明細書中で用いる用語“相補的”およびそれの文法上の同等表現は、２以上の構造要素（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子、またはその部分など）の、ハイブリダイズ、オリゴマー化（たとえば、ダイマー化）、相互作用または他の形で互いに複合体を形成できる特徴を表わす。たとえば、“ポリペプチドの相補的領域”は、互いに一緒になって複合体を形成することができ、それは特定の態様において逆平行、２－ヘリックスバンドルを特徴とする。
[0060] 本明細書中で用いる用語“複合体”は、直接および／または間接的に互いに接触した分子（たとえば、ペプチド、ポリペプチドなど）の集合体または凝集体を表わす。特定の態様において、“接触”、またはより具体的には“直接的な接触”は、引力をもつ非共有結合相互作用、たとえばファン－デル－ワールス力、水素結合、イオン性および疎水性の相互作用などが分子の相互作用を支配するのに十分なほど、２以上の分子が近接することを意味する。そのような態様において、分子（たとえば、ペプチドおよびポリペプチド）の複合体は、その複合体が熱力学的に好ましい（たとえば、凝集していない、または複合体形成していない状態のそれの成分分子と比較して）条件下で形成される。本明細書中で用いる用語“複合体”は、別に記載しない限り、２以上の分子（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、またはその組合わせ）の集合体を表わす。特定の態様において、用語“複合体”は３つのポリペプチドの集合体を表わす。
[0061] 本明細書中で用いる用語“化合物ライブラリー”は、異なる構造をもつ複数の分子を含むいずれかの化合物コレクションを表わす。化合物ライブラリーは、コンビナトリアルケミカルライブラリーまたは天然物ライブラリーを含む可能性がある。たとえば水素結合、イオン結合、ファン－デル－ワールス引力、または疎水性相互作用による非共有結合相互作用を含む相互作用によって本発明のキメラポリペプチドまたは複合体と相互作用し、結合することができ、あるいはそれらに対する親和性をもついかなるタイプの分子も、化合物ライブラリー中に存在することができる。たとえば、本発明に包含される化合物ライブラリーは、天然分子、たとえば炭水化物、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＤＮＡフラグメント、ＲＮＡおよびＲＮＡフラグメントなどを含む）、脂質、レチノイド、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；または天然分子のアナログもしくは誘導体、たとえばペプチドミメティックなど；およびたとえばコンビナトリアルケミストリー手法を用いて作製された非天然分子、たとえば“小分子”有機化合物；ならびにその混合物を含むことができる。
[0062] 本明細書全体を通して、内容からそうではないことが要求されない限り、“含む(comprise)、(comprises)および(comprising)”という語は、記載した工程もしくは要素または一群の工程もしくは要素の包含を示し、ただし他のいずれかの工程もしくは要素または一群の工程もしくは要素の除外を示すものではないことは理解されるであろう。よつて、“含む(comprising)”などの用語の使用は、列記した要素が必要または必須であるけれども他の要素は任意選択的であって存在してもしなくてもよいということを示す。“からなる(consisting of)”は、“からなる”という句に続くあらゆるものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。よって、“からなる”という句は、列記した要素が必要または必須であり、他の要素は存在しない可能性があることを示す。“本質的に・・・からなる”は、その句の後に列記したすべての要素、およびそれらの列記した要素について本開示に特定した活性または作用を妨害しないかまたはそれに関与しない他の要素に限定された要素を含むことを意味する。よって、“本質的に・・・からなる”は、列記した要素が必要または必須であるけれども他の要素は任意選択的であって列記した要素の活性または作用にそれらが影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいということを示す。
[0063] 化学的コンジュゲーションまたは組換え手段（たとえば、遺伝子融合）を含めたいずれかの手段によって２以上の要素または成分またはドメインを互いに結合させることに関して、本明細書中で用いる用語“コンジュゲートした(conjugated)”、“連結した(linked)”、“融合した(fused)”または“融合(fusion)”、およびそれの文法上の同等語は、互換性をもって用いられる。化学的コンジュゲーションの方法（たとえば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用）は当技術分野で知られている。より具体的には、本明細書中で用いる“エンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメイン”－“構造安定化部分”の融合またはコンジュゲーションは、適切には準安定、融合前コンホメーション状態にあるエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインを構造安定化部分に遺伝学的または化学的にコンジュゲートさせることを表わす。特定の態様において、構造安定化部分をエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインに間接的に、リンカー、たとえばグリシン－セリン（ｇｌｙ－ｓｅｒ）リンカーを介して融合させる。他の態様において、構造安定化部分をエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインに直接融合させる。
[0064] “保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基を類似の側鎖をもつアミノ酸残基で置き換えるものである。類似の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で規定されており、それらは一般に下記のように下位分類することができる：
Figure 0007291398000001
[0065] 保存的アミノ酸置換には、側鎖に基づくグループ分けも含まれる。たとえば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸のグループはセリンおよびトレオニンであり；アミドを含む側鎖をもつアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖をもつアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖をもつアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄を含む側鎖をもつアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。たとえば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパルテートをグルタメートで、トレオニンをセリンで置換すること、あるいは構造関連アミノ酸による同様なアミノ酸置換は、得られるバリアントポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないであろうと予想するのは妥当である。あるアミノ酸変化が機能性ポリペプチドを生じるかどうかは、それの活性をアッセイすることによって容易に判定できる。保存的置換を代表的な好ましい置換と題する表２に示す。本発明の範囲に含まれるアミノ酸置換は、一般に、下記を維持することに対するそれらの影響において有意差がない置換を選択することにより達成される：（ａ）置換領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位におけるその分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩。置換を導入した後、バリアントを生物活性についてスクリーニングする。
Figure 0007291398000002
[0066] 用語“構築体”は、異なる供給源から単離された１以上の核酸配列を含む組換え遺伝分子を表わす。よって、構築体は起源の異なる２以上の核酸配列を単一核酸分子に組み立てたキメラ分子であり、下記のものを含むいずれかの構築体が含まれる：（１）自然界では一緒に見られることのない核酸配列（調節配列およびコード配列を含む）（すなわち、ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つがそれの他のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つに対してヘテロロガスである）、あるいは（２）自然界では隣接することのない機能性ＲＮＡ分子またはタンパク質の部分をコードする配列、あるいは（３）自然界では隣接することのないプロモーターの部分。代表的な構築体には、いずれかの組換え核酸分子、たとえばプラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製するポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子であって、いずれかの供給源に由来し、ゲノム組込みまたは自律複製が可能であり、１以上の核酸分子が作動可能な状態で連結した核酸分子を含むもの。本発明の構築体は一般に、同様に構築体に含まれる目的とする核酸配列、たとえはターゲット核酸配列またはモジュレーター核酸配列の発現を指令するために必要なエレメントを含むであろう。そのようなエレメントには、制御エレメント、たとえば目的とする核酸配列に作動可能な状態で（その転写を指令するように）連結したプロモーターを含めることができ、しばしばポリアデニル化配列も含まれる。本発明の特定の態様において、構築体はベクター内に収容されてもよい。ベクターは、構築体の構成要素のほかに、たとえば１以上の選択マーカー、１以上の複製起点、たとえば原核細胞および真核細胞起源のもの、少なくとも１つの多重クローニング部位、および／または構築体が宿主細胞のゲノム中へ安定に組み込まれるのを容易にするためのエレメントを含むことができる。２以上の構築体を、単一核酸分子、たとえば単一ベクター内に収容することができ、あるいは２以上の別個の核酸分子、たとえば２以上の別個のベクター内に収容することができる。“発現構築体”は、一般に少なくとも、目的とするヌクレオチド配列に作動可能な状態で連結した制御配列を含む。こうして、たとえば、発現すべきヌクレオチド配列と作動可能な状態で連結したプロモーターが、生物またはその一部（宿主細胞を含む）において発現させるための発現構築体中に備えられる。本発明の実施について、構築体および宿主細胞を調製および使用するための一般的な組成物および方法は当業者に周知である；たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000を参照。
[0067] “に対応する(corresponds toまたはcorresponding to)”は、基準アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性または同一性を示すアミノ酸配列を意味する。一般に、アミノ酸配列は、少なくとも基準アミノ酸配列の一部に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはさらには１００％に及ぶ配列類似性または同一性を示すであろう。
[0068] 本明細書中で用いる用語“ドメイン(domain)”は、分子または構造体の、共通の物理化学的特色をもつ部分、たとえば（それらに限定されない）疎水性、極性、球状およびヘリックス状のドメイン、またはリガンド結合性、膜融合性、シグナル伝達性、細胞透過性などの特性をもつ部分を表わす。しばしば、ドメインはフォールドしたタンパク質構造をもち、それはタンパク質の残部とは独立してそれの三次構造を保持する能力をもつ。一般に、ドメインはタンパク質の別個の特性に関与し、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残部の機能を損なうことなく付加し、排除し、または他のタンパク質へ伝達することができる。ドメインは領域(region)またはその一部と同じ範囲にあってもよい(co-extensive)；ドメインは別個の不連続的な分子領域を含むこともができる。タンパク質ドメインの例には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：細胞または細胞外に局在するドメイン（たとえば、シグナルペプチド(signal peptide)；ＳＰ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、膜融合（たとえば、融合ペプチド(fusion peptide)；ＦＰ）ドメイン、エクトドメイン、膜近傍外部領域(membrane proximal external region)（ＭＰＥＲ）ドメイン、膜貫通(transmembrain)（ＴＭ）ドメイン、および細胞質(cytoplasmic)（Ｃ）ドメイン。
[0069] エンベロープウイルスの融合タンパク質もしくは融合タンパク質の複合体に対する免疫応答の誘導、または疾患もしくは状態の治療もしくは予防に関して、“有効量”は、その必要がある個体に単回量で、またはシリーズの一部として投与する薬剤の量であって、その誘導、治療または予防に有効である量を意味する。有効量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体の分類グループ、組成物の配合、医学的状況の査定、ならびに他の関連要因に応じて異なるであろう。その量は比較的広い範囲に及ぶと予想され、それはルーティン試験により決定できる。
[0070] 用語“内在性”は、宿主生物またはその細胞に存在し、および／または自然に発現する、ポリペプチドまたはその一部を表わす。たとえば、“内在性”エクトドメインポリペプチドまたはその一部は、エンベロープウイルスにおいて自然発現するエンベロープ融合タンパク質のエクトドメインポリペプチドまたはそのエクトドメインの一部を表わす。
[0071] 本明細書中で用いる用語“内在性ＨＲＡ領域”は、クラスＩエクトドメインポリペプチド中に、融合タンパク質前駆体形態の天然融合タンパク質のアミノ酸配列中のＨＲＡ領域と実質的に同じ位置に存在するＨＲＡ領域を表わす。クラスＩ融合タンパク質の限定ではない例の内在性ＨＲＡ領域のおおよそのアミノ酸位置を表３に挙げる。
Figure 0007291398000003
[0072] 本明細書中で用いる用語“内在性ＨＲＢ領域”は、クラスＩエクトドメインポリペプチド中に、融合タンパク質前駆体形態の天然融合タンパク質のアミノ酸配列中のＨＲＢ領域と実質的に同じ位置に存在するＨＲＢ領域を表わす。クラスＩ融合タンパク質の限定ではない例の内在性ＨＲＢ領域のおおよそのアミノ酸位置を表４に挙げる。
Figure 0007291398000004
[0073] 用語“内在性産生”は、生物における核酸の発現および付随する産生、および／または生物における核酸の発現生成物の分泌を表わす。特定の態様において、生物は多細胞性（たとえば、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、たとえばヒト）であり、核酸はその多細胞生物の細胞内または組織内で発現する。
[0074] 本明細書中で用いる“エンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチド”は、成熟したエンベロープウイルス融合タンパク質のビリオン表面露出部分を含むポリペプチドであって、天然エンベロープウイルス融合タンパク質のシグナルペプチドを含むかまたは含まず、ただし膜貫通ドメインおよび細胞質テイルを欠如するものを表わす。
[0075] 用語“エピトープ”と“抗原決定基”は、抗体に特異的に結合できる抗原（一般にタンパク質）決定基（そのようなエピトープはしばしば“Ｂ細胞エピトープ”と呼ばれる）、または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質（たとえば、クラスＩまたはクラスＩＩ）によりＴ細胞受容体に提示できるもの（そのようなエピトープはしばしば“Ｔ細胞エピトープ”と呼ばれる）を表わすために本明細書中で互換性をもって用いられる。Ｂ細胞エピトープがペプチドまたはポリペプチドである場合、それは一般的に３個以上のアミノ酸、一般に少なくとも５個、より通常は少なくとも８～１０個のアミノ酸を含む。それらのアミノ酸はポリペプチドの一次構造において隣接するアミノ酸残基であってもよく（しばしば、連続ペプチド配列と呼ばれる）、あるいはフォールドしたタンパク質において空間的に並置した状態になってもよい（しばしば、不連続ペプチド配列と呼ばれる）。Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる。一般に、ＭＨＣクラスＩ結合性Ｔ細胞エピトープは８～１１アミノ酸の長さである。クラスＩＩ分子は１０～３０残基の長さ（最適長さは１２～１６残基）またはそれより長いペプチドを結合する。推定Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ分子に結合する能力は、実験的に推定および確認できる(Dimitrov et al., 2010. Bioinformatics 26(16):2066-8)。
[0076] 用語“ヘリックスバンドル”は、ヘリックスが互いに実質的に平行または逆平行であるようにフォールドした複数のペプチドヘリックスを表わす。２－ヘリックスバンドルは、互いに実質的に平行または逆平行であるようにフォールドした２つのヘリックスをもつ。同様に、６ヘリックスバンドルは、互いに実質的に平行または逆平行であるようにフォールドした６つのヘリックスをもつ。“実質的に平行または逆平行”は、ヘリックスの側鎖が互いに相互作用できるようにヘリックスがフォールドしていることを意味する。たとえば、ヘリックスの疎水性側鎖は互いに相互作用して疎水性コアを形成することができる。
[0077] 本明細書中で用いる用語“ヘテロロガス”は、この配列とエクトドメインポリペプチドとの融合生成物が前駆体または成熟形態の野生型のエンベロープウイルス融合タンパク質とは異なる配列をもつようにその配列が選択された、いずれかのタンパク性部分を表わす。
[0078] 用語“宿主”は、真核細胞または原核細胞のいずれであっても、それに本発明の構築体を導入できるいずれかの生物またはその細胞、特にＲＮＡサイレンシングが起きる宿主を表わす。具体的な態様において、用語“宿主”は真核生物を表わし、それには酵母および真菌などの単細胞性真核生物、ならびに多細胞性真核生物、たとえば動物が含まれ、それの限定ではない例には無脊椎動物（たとえば、昆虫、刺胞動物(cnidarian)、棘皮動物(echinoderm)、線虫など）；真核細胞性寄生生物（たとえば、マラリア寄生虫、たとえば熱帯マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、蠕虫(helminth)など)；脊椎動物（たとえば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）；ならびに哺乳動物（たとえば、げっ歯類、霊長類、たとえばヒトおよび非ヒト霊長類）が含まれる。よって、用語“宿主細胞”は、適切にはそのような真核生物の細胞およびそのような真核生物に由来する細胞系が包含される。
[0079] 本明細書中における“免疫反応性”への言及には、分子間のいずれかの相互作用、反応、または他の形の関連性、特にそれらの分子のうちの１つが免疫系の構成要素であるか、あるいはそれを模倣しているものについての言及が含まれる。
[0080] 本明細書中で用いる用語“免疫原組成物”または“免疫原配合物”は、脊椎動物、特に哺乳類などの動物に投与した際に免疫応答を誘導する調製物を表わす。
[0081] “リンカー”は、２つの分子を結合させ、しばしば２つの分子を望ましい立体配置に置く作用をする、分子または一群の分子（たとえば、モノマーまたはポリマー）を意味する。
[0082] 本明細書中でタンパク質（たとえば、エンベロープウイルスエクトドメインポリペプチド）に関して用いる用語“準安定(meta-stable)”は、条件の変化に際してより安定なコンホメーション状態に急速に変換する不安定なコンホメーション状態を表わす。たとえば、融合前形態のエンベロープウイルス融合タンパク質は不安定な準安定コンホメーションにあり、たとえば宿主細胞に融合すると、より安定な融合後コンホメーションに変換する。
[0083] 本明細書中で用いる用語“部分(moiety)”は、分子の一部を表わし、それは分子の特徴的な化学的、生物学的、および／または医学的特性に関与する官能基、一組の官能基、および／または 分子内の特定の原子グループである可能性がある。
[0084] 用語“中和性の抗原結合分子”は、ターゲット分子またはリガンドと結合または相互作用して、ターゲット抗原が結合パートナー、たとえば受容体または基質に結合または会合するのを阻止し、それにより、さもなければそれらの分子の相互作用から生じるであろう生物学的応答を妨げる抗原結合分子を表わす。本発明の場合、中和性の抗原結合分子は準安定または融合前形態のエンベロープウイルス融合タンパク質と適切に会合し、好ましくはその融合タンパク質が細胞膜に結合および／または融合するのを妨害または低減する。
[0085] 用語“オリゴマー”は、少なくとも原則としては無限数のモノマーからなるポリマーとは対照的に、１より多いけれども限定された数のモノマー単位からなる分子を表わす。オリゴマーにはダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーなどが含まれるが、これらに限定されない。オリゴマーは、タンパク質のような高分子の非共有結合により形成された高分子複合体である可能性がある。この意味で、ホモ－オリゴマーは同一分子により形成され、これに対しヘテロ－オリゴマーは少なくとも２つの異なる分子で作られるであろう。特定の態様において、本発明のオリゴマーは３つのポリペプチドサブユニットからなるトリマーポリペプチド複合体である。これらの態様において、トリマーポリペプチドは、３つの同一ポリペプチドサブユニットからなる“ホモトリマーポリペプチド複合体”、または３つのポリペプチドサブユニットからなり、それらのうち少なくとも１つのサブユニットポリペプチドが非同一である“ヘテロトリマーポリペプチド複合体”の可能性がある。“ポリペプチドサブユニット”は、２つの他のポリペプチドサブユニットとの組合わせでトリマーポリペプチド複合体を形成する、単一のアミノ酸鎖またはモノマーである。
[0086] 本明細書中で用いる用語“作動可能な状態で結合した(operably connected)”または“作動可能な状態で連結した(operably linked)”は、そのように記載した構成要素がそれらの意図する様式で機能できる関係にある近位(juxtaposition)を表わす。たとえば、目的とするヌクレオチド配列（たとえば、コード配列および／または非コード配列）に“作動可能な状態で連結した”調節配列（たとえば、プロモーター）は、制御配列と適合する条件下でその配列の発現を可能にする、目的とするヌクレオチド配列に対する制御配列の配置および／または配向を表わす。目的とするヌクレオチド配列の発現を制御配列が指令する機能をもつ限り、制御配列は目的とするヌクレオチド配列と連続的である必要はない。よって、たとえば介在する非コード配列（たとえば、翻訳されなかった、まだ転写されていない配列）がプロモーターとコード配列の間に存在することができ、そのプロモーター配列はそれでもなおコード配列に“作動可能な状態で連結した”とみなすことができる。同様に、エンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチドをヘテロロガスな構造安定化部分に“作動可能な状態で結合させる”は、相補的なＨＲ１およびＨＲ２領域がそれらの会合に適した条件下で（たとえば水溶液中で）互いに会合して逆平行２－ヘリックスバンドルを形成できるような構造安定化部分の配置および／または配向を包含する。
[0087] 本明細書中で互換性をもって用いられる用語“患者”、“対象”、“ホスト”または“個体”は、それらに対する治療または予防が望まれるいずれかの対象、特に脊椎動物対象、よりさらに特別には哺乳動物対象を表わす。本発明の範囲に含まれる適切な脊椎動物には下記を含む脊索動物亜門(Chordata)のいずれかのメンバーが含まれるが、それらに限定されない：霊長類（たとえば、ヒト、猿および類人猿；サルの種、たとえばマカク属(Macaca)の猿に属する種を含む（たとえば、蟹食猿(cynomologus monkey)、たとえばカニクイザル(Macaca fascicularis)、および／または赤毛猿(rhesus monkey)(アカゲザル(Macaca mulatta)))、およびヒヒ(baboon)(チャクマヒヒ(Papio ursinus))、ならびにマーモセット（マーモセット属(Callithrix)に属する種）、リスザル（リスザル属(Saimiri)に属する種）およびタマリン（タマリン属(Saguinus)に属する種）、ならびに類人猿の種、たとえばチンパンジー(Pan troglodytes))、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ目(lagomorph)(たとえば、兎(rabbit)、野兎(hare))、ウシ属(bovine)（たとえば牛）、ヒツジ属(ovine)（たとえば羊）、ヤギ科(caprine)（たとえば、山羊）、ブタ科(porcin)（たとえば豚）、ウマ科(equine)（たとえば、馬）、イヌ科(canine)（たとえば、犬）、ネコ科(feline)（たとえば、猫）、鳥類(avian)（たとえば、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、愛玩鳥類、たとえばカナリヤ、セキセイインコなど）、海洋哺乳類（たとえば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、ならびに魚類。好ましい対象は、エンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に対する免疫応答を誘導する必要があるヒトである。ただし、前記用語は症状が存在することを暗示するものではないことは理解されるであろう。
[0088] “医薬的に許容できるキャリヤー”は、動物、好ましくはヒトを含めた哺乳動物への局所または全身投与に際して安全に使用できる固体状もしくは液体状の増量剤、希釈剤または封入用物質を意味する。代表的な医薬的に許容できるキャリヤーには、当業者に知られているように、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（たとえば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬剤、薬物安定化剤、ゲル剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、色素などの材料、およびその組合わせが含まれる（参照：たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 本明細書に援用する）。一般的なキャリヤーが有効成分（単数または複数）と不適合でない限り、医薬組成物中におけるそれの使用が考慮される。
[0089] 本明細書中で用いる用語“ポリヌクレオチド”または“核酸”は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを示す。この用語は、一般に少なくとも１０塩基長さの高分子形態のヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を表わす。この用語には、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡが含まれる。
[0090] “ポリペプチド”、“ペプチド”、“タンパク質”および“タンパク性分子”は、本明細書中でアミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成アナログを表わすために互換性をもって用いられる。よって、これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が合成による非天然アミノ酸、たとえば対応する天然アミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
[0091] 本明細書中で用いる用語、エンベロープウイルスの融合タンパク質の“融合後コンホメーション”は、エンベロープウイルス融合タンパク質の最終コンホメーション（すなわち、融合プロセスの終了時に形成されるもの）でありかつエネルギー的に最も好ましい状態である構造を表わす。融合後コンホメーションにおいては、融合タンパク質の融合ペプチドまたはループが融合タンパク質の膜貫通ドメインと近接する。このヘアピン構造の形成を容易にする具体的な構造要素はエンベロープ融合タンパク質のクラスに従って異なる。たとえば、クラスＩ融合タンパク質の融合後コンホメーションは、個々のクラスＩ融合タンパク質の内在性ＨＲＡ領域と内在性ＨＲＢ領域が相互作用して、３つの内在性ＨＲＢおよび３つの内在性ＨＲＡ領域を含む６ヘリックスバンドルを特徴とするヘアピン構造を形成することを特徴とする。あるいは、クラスＩＩＩ融合タンパク質の融合後コンホメーションは内部融合ループとＣ末端膜貫通領域の相互作用を特徴とし、それがヘアピン構造の形成を容易にする。個々のウイルス融合タンパク質の融合後コンホメーションは電子顕微鏡検査および／またはＸ線結晶学的分析により決定されており、そのような構造はネガティブ染色した電子顕微鏡写真を観察した際、および／または融合前エピトープが無いことによって、容易に同定できる。
[0092] 本明細書中で用いる用語、エンベロープウイルスの融合タンパク質の“融合前コンホメーション”は、準安定(meta-stable)コンホメーション（すなわち、エネルギー的に最も好ましい最終コンホメーションではない半安定(semi-stable)コンホメーション）にあって適切なトリガリングに際してコンホメーション再配列を行なって最終的な融合後コンホメーションになる可能性がある構造のエンベロープウイルス融合タンパク質を表わす。一般に、ウイルス融合タンパク質の融合前コンホメーションは、融合ペプチドまたは融合ループと呼ばれる疎水性配列を含み、それは融合前コンホメーションの内部に位置し、ウイルス膜または宿主細胞膜のいずれとも相互作用できない。トリガリングに際してこの疎水性配列は宿主細胞膜内へ挿入され、融合タンパク質は崩壊して融合後ヘアピン様コンホメーションになる。ウイルス融合タンパク質の融合前コンホメーションはエンベロープ融合タンパク質のクラスに従って異なる。各クラスは非相互作用性の構造要素を特徴とし、それらがその後、エネルギー的に好ましい融合後コンホメーションにおいて会合する。たとえば、クラスＩ融合タンパク質の融合前コンホメーションはトリマーの個々の融合タンパク質の内在性ＨＲＢ領域と相互作用しない内在性ＨＲＡ領域に依存し、そのため６ヘリックスバンドルを特徴とするヘアピン構造の形成は行なわれない。あるいは、クラスＩＩＩ融合タンパク質の融合前コンホメーションは、トリマーの個々の融合タンパク質のＣ末端領域にある融合ループ（単数または複数）とは相互しない中心のα－ヘリックス状コイルドコイルに依存し、したがってヘアピン構造の形成は行なわれない。個々のウイルス融合タンパク質の融合前コンホメーションは電子顕微鏡検査および／またはＸ線結晶学的分析により決定されており、そのような構造はネガティブ染色した電子顕微鏡写真を観察した際、および／または融合後コンホメーションには存在しない融合前エピトープによって容易に同定できる。
[0093] “調節エレメント”、“調節配列”、“制御エレメント”、“制御配列”などは、本明細書中で、コード配列の上流（５’側－非コード配列）、内部、または下流（３’側－非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に直接または間接的に影響を及ぼすヌクレオチド配列を表わすために互換性をもって用いられる。調節配列にはエンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、Ｒｅｐ認識エレメント、遺伝子間領域およびポリアデニル化シグナル配列が含まれる。それらには、天然配列および合成配列、ならびに合成配列と天然配列の組合わせであってもよい配列が含まれる。
[0094] 用語“レプリコン”は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして挙動する、すなわちそれ自身の制御下で複製できる、いずれかの遺伝子エレメント、たとえばプラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどを表わす。
[0095] “自己組織化(self-assembly)”は、高次構造体（たとえば、分子）相互の構成要素の自然引力に依存する、高次構造体の自然組織化のプロセスを表わす。それは一般に、サイズ、形状、組成または化学的特性に基づく分子のランダムな動きおよび結合の形成により起きる。
[0096] 本明細書中で用いる用語“配列同一性”は、配列がヌクレオチド－対－ヌクレオチド基準またはアミノ酸－対－アミノ酸基準で比較ウインドウにわたって同一である程度を表わす。よって、“配列同一性パーセント”は、最適状態にアラインした２つの配列を比較し、同一核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（たとえば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両配列中に現れる位置の数を決定して一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセントを求めることにより計算される。本発明は、本発明の方法およびシステムにおける、全長ＩＬ－２２ポリペプチドおよびそれらの生物活性フラグメントの使用を考慮する。一般に、全長ＩＬ－２２ポリペプチドの生物活性フラグメントは相互作用、たとえば分子内または分子間相互作用に関与することができる。
[0097] “類似性”は、同一であるかあるいは前掲の表１および２に定めた保存的置換を構成するアミノ酸のパーセント数を表わす。類似性は、配列比較プログラム、たとえばＧＡＰ(Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395)を用いて決定できる。この方法で、本明細書に引用したものと類似するかあるいは実質的に異なる長さの配列を、そのアラインメントにギャップを挿入し、そのようなギャップをたとえばＧＡＰに用いる比較アルゴリズムにより判定することによって比較できる。
[0098] ２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を述べるために用いる用語には、“基準配列”、“比較ウインドウ”、“配列同一性”、“配列同一性パーセント”および“実質的な同一性”が含まれる。“基準配列”は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、少なくとも１２、ただし多くの場合１５～１８、しばしば少なくとも２５のモノマー単位の長さである。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含む可能性があるので、２つの（またはそれより多い）ポリヌクレオチド間の配列比較は、一般に２つのポリヌクレオチドの配列を“比較ウインドウ”にわたって比較して、局所領域の配列類似性を同定および比較することにより実施される。“比較ウインドウ”は、少なくとも６、通常は約５０～約１００、より通常は約１００～約１５０の連続位置の概念上のセグメントを表わし、２つの配列を最適状態でアラインさせた後、そのセグメントにおいて同数の連続位置の基準配列に対して配列を比較する。２つの配列の最適アラインメントのために、比較ウインドウは基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドウをアラインさせるための最適な配列アラインメントは、アルゴリズムのコンピューター化実装により（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)、あるいは選択した各種方法のいずれかによって得た検査および最適アラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最高パーセントの相同性を生じるもの）により実施できる。たとえばAltschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389により開示されたＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照できる。配列分析の詳細な考察は、 Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のUnit 19.3にみられる。
[0099] 本明細書中で用いる用語“一本鎖”は、ペプチド結合によって直線状に連結したアミノ酸モノマーを含む分子を表わす。
[0100] 本明細書中で用いる“小分子”は、３キロダルトン（ｋＤａ）未満、一般に１．５キロダルトン未満、より好ましくは約１キロダルトン未満の分子量をもつ組成物を表わす。小分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質、または他の有機分子（炭素含有）もしくは無機分子であってもよい。当業者に自明のとおり、本記載に基づいて、本発明のいずれかのアッセイ法で化学的および／または生物学的混合物（しばしば、真菌、細菌または藻類の抽出物）の広範なライブラリーをスクリーニングして、生物活性を調節する化合物を同定することができる。“小有機分子”は、３キロダルトン未満、１．５キロダルトン未満、またはさらには約１ｋＤａ未満の分子量をもつ有機化合物（または、無機化合物（たとえば金属）と錯体形成した有機化合物）である。
[0101] 本明細書中で用いる用語“処置”、“処置すること”などは、希望する薬理学的および／または生理学的効果を得ることを表わす。その効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に阻止するという点で予防的であってもよく、ならびに／あるいは疾患および／またはその疾患に帰因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書中で用いる“処置”は、哺乳動物、特にヒトの疾患のいずれかの処置を包含し、下記を含む：（ａ）疾患に対する素因をもつ可能性があるけれどもまだそれを伴なうと診断されていない対象においてその疾患が起きるのを阻止する；（ｂ）疾患を阻害する、すなわちそれの発症を制止する；および（ｃ）疾患を軽減する、すなわちその疾患を退行させる。
[0102] 用語“野生型(wild-type)”、“自然(native)”および“天然(naturally occurring)”は、天然源から単離した際の遺伝子または遺伝子生成物の特徴をもつ遺伝子または遺伝子生成物を表わすために本明細書中で互換性をもって用いられる。野生型、自然または天然の遺伝子または遺伝子生成物（たとえば、ポリペプチド）は、ある集団において最も頻繁に見られるものであり、したがって恣意的に“正常”または“野生型”の遺伝子または遺伝子生成物と呼ばれる。
[0103] 本明細書に記載する各態様は、そうではないと特別に述べない限り、必要な変更を加えてそれぞれの態様に適用されるものとする。
２．キメラポリペプチド
[0104] 本発明は、一部は、融合前コンホメーションのエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインポリペプチドを人工的に安定化または‘クランピング(clamping)’するための新規戦略に基づく。この‘分子クランピング’戦略は、構造安定化部分をエクトドメインポリペプチドに融合または連結させてキメラポリペプチドを形成することを採用する。構造安定化部分は一般に、エクトドメインポリペプチドに対する相補性を欠如し、したがってエクトドメインポリペプチドの構造要素とではなくむしろ優先的に相互に会合する相補的ヘプタッドリピートを含む、一本鎖ポリペプチドである。それらの会合に適した条件下で（たとえば水溶液中で）の相補的ヘプタッドリピート相互の会合の結果、エクトドメインポリペプチドの融合後コンホメーションへの再配列を阻害する逆平行、２－ヘリックスバンドルが形成される。構造安定化部分の２－ヘリックスバンドルはトリマー化して高度に安定な６ヘリックスバンドルを形成することができ、よってキメラポリペプチドが自己組織化して人工的なエンベロープウイルス融合タンパク質複合体を形成することが可能になる。こうして組織化した複合体は、天然エンベロープウイルス融合タンパク質複合体の融合前コンホメーションを模倣することができ、キメラポリペプチドのそれぞれの構造安定化部分のコイルドコイル構造により形成された６ヘリックスバンドルを特徴とする３つのキメラポリペプチドを含む。
２．１ 構造安定化部分
[0105] 本発明者らは、フォールドして逆平行立体配置になり、作動可能な状態で結合したエンベロープウイルスエクトドメインポリペプチドを融合前コンホメーションで安定化する、逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する相補的ヘプタッドリピートを含む一本鎖ポリペプチド部分を構築した。その２－ヘリックスバンドルは、適切にはコイルドコイル構造を形成する。コイルドコイルフォールドは、モータータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、細胞外タンパク質およびウイルス融合タンパク質を含めた広範なタンパク質において起きる（参照：たとえば、Burkhard et al., 2001. Trends Cell Biol 11:82-88)。コイルドコイルは機能的にはフォールディング（アセンブリー、オリゴマー化）モチーフとして特徴づけられてきた；すなわち、コイルドコイル構造の形成は多くの場合、異なるタンパク質鎖の非共有結合会合を推進する。コイルドコイルは構造的には平行、逆平行または混合トポロジーに配置したα－ヘリックスの２－、３－、４－または５本鎖のアセンブリーとして特徴づけられてきた(参照：たとえば、Lupas, 1996. Trends Biochem Sci 21:375-382)。通常、ヘリックスは左巻きまたは右巻きに互いに軽く巻きつき(wrapped) (coiled, wound)、スーパーコイリング（超らせん形成）(supercoiling)と呼ばれる。本発明の２－ヘリックスバンドルが一般に、高度に安定な６ヘリックス状コイルドコイルバンドルを形成するためにトリマー化する強い傾向をもつコイルドコイル構造を形成することは理解されるであろう。
２．１．１ ヘプタッドリピート
[0106] α－ヘリックス状コイルドコイルは、各ヘリックスが一連のヘプタッドリピートで構成されるという点でそれらのアミノ酸配列のレベルで特徴づけられてきた。ヘプタッドリピート（ヘプタッドユニット、ヘプタッド）はｈｐｐｈｐｐｐとしてエンコードできる７残基配列モチーフであり、その際、各‘ｈ’は疎水性残基を表わし、各‘ｐ’は極性残基である。場合により、ｐ－残基がｈ－位置にみられ、その逆もある。ヘプタッドリピートはしばしばパターンａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ（ａｂｃｄｅｆｇ）またはｄ－ｅ－ｆ－ｇ－ａ－ｂ－ｃ（ｄｅｆｇａｂｃ）によってもコードされ、その場合はインデックス‘ａ’～‘ｇ’は典型的なアミノ酸タイプがみられる一般的なヘプタッド位置を表わす。一般的に、インデックス‘ａ’および‘ｄ’はコイルドコイルにおけるコア残基（中心の埋没した残基）の位置を示す。コアａ－位置およびｄ－位置にみられる典型的なアミノ酸タイプは疎水性アミノ酸残基タイプである；他のすべての位置（非コア位置）には、主に極性（親水性）残基タイプがみられる。よって、一般的なヘプタッドパターン‘ｈｐｐｈｐｐｐ’はパターン表記‘ａｂｃｄｅｆｇ’と一致する（‘ｈｐｐｐｈｐｐ’パターンは‘パターン位置ｄｅｆｇａｂｃ’と一致し、この表記はコイルドコイルについて用いられるｄ－位置の疎水性残基で開始する）。本発明のヘプタッドリピート領域は、個々のコイルドコイル構造中に少なくとも２、適切には３以上の連続（中断されていない）ヘプタッドリピートを含む。ヘリックス中の各シリーズの連続ヘプタッドリピートは‘ヘプタッドリピート配列(heptad repeat sequence)’（ＨＲＳ）と表記される。ヘプタッドリピート配列の始めと終わりは、好ましくは実験的に決定された３次元（３－Ｄ）構造が得られればそれに基づいて決定される。３－Ｄ構造が得られなければ、ヘプタッドリピート配列の始めと終わりは、好ましくは（ｈｐｐｈｐｐｐ）ｎまたは（ｈｐｐｐｈｐｐ）ｎパターンと実際のアミノ酸配列との最適オーバーレイに基づいて決定され、その際、‘ｈ’および‘ｐ’はそれぞれ疎水性残基および極性残基を表わし、‘ｎ’は２以上の数である。各ヘプタッドリピート配列の始めと終わりは、それぞれａ－またはｄ－位置における最初と最後の疎水性残基であると解釈される。一般的なＨ－残基は、好ましくはバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、グルタミン、トレオニン、セリンおよびアラニンからなる群から、より好ましくはバリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニン、最も好ましくはイソロイシンから選択される。一般的なｐ－残基は、好ましくはグリシン、アラニン、システイン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンからなる群から選択される。この方法がアミノ酸残基をヘプタッドリピート配列に明確に割り当てることができない場合、より特殊な分析方法を適用できる；たとえば、ＣＯＩＬＳ法：Lupas et al. (1991. Science 252:1162-1164; http://www.russell.embl-heidelberg.de/cgi -bin/coils-svr.pl)。
[0107] 具体的な態様において、各ヘプタッドリピート領域（ＨＲ１、ＨＲ２）は独立して、たとえばWO 2010/066740（その内容を全体として本明細書に援用する）に記載されるように（ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ－）ｎまたは（ｄ－ｅ－ｆ－ｇ－ａ－ｂ－ｃ－）ｎとして表わされるｎ回反復７残基パターンのアミノ酸タイプを特徴とし、その際、パターン要素‘ａ’～‘ｇ’はそれらのアミノ酸タイプが存在するヘプタッド位置を表わし、ｎは２以上の数であり、一般的なヘプタッド位置‘ａ’および‘ｄ’の少なくとも５０％（または少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数パーセント）が疎水性アミノ酸タイプにより占有され、一般的なヘプタッド位置‘ｂ’、‘ｃ’、‘ｅ’、‘ｆ’および‘ｇ’の少なくとも５０％（または少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数パーセント）が親水性アミノ酸タイプにより占有され、生じる疎水性アミノ酸タイプと親水性アミノ酸タイプの分布によりヘプタッドリピート領域を同定することができる。特定の態様において、一般的なヘプタッド位置‘ａ’および‘ｄ’の少なくとも５０％、７０％、９０％、または１００％がバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、またはその非天然誘導体からなる群から選択されるアミノ酸により占有される。それゆえ、後者のアミノ酸類はより標準的な（より頻繁にみられる）コイルドコイルコア残基に相当する。他の態様において、一般的ヘプタッド位置‘ａ’および‘ｄ’の少なくとも５０％、７０％、９０％、または１００％がイソロイシンにより占有される。ある態様において、一般的ヘプタッド位置‘ｂ’、‘ｃ’、‘ｅ’、‘ｆ’および‘ｇ’の少なくとも５０％、７０％、９０％、または１００％が、グリシン、アラニン、システイン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、またはその非天然誘導体からなる群から選択されるアミノ酸により占有される。このタイプの具体例において、ＨＲ１およびＨＲ２領域は配列：ＩＥＥＩＱＫＱＩＡＡＩＱＫＱＩＡＡＩＱＫＱＩＹＲＭ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。
[0108] 具体的な態様において、構造安定化部分(structure stabilizing moiety)（本明細書中で“ＳＳＭ”とも呼ばれる）のＨＲ１およびＨＲ２領域は少なくとも１つの内在性ヘプタッドリピートまたはクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質を含む。適切には、ＨＲ１およびＨＲ２領域は多くの場合、それぞれ、１以上のクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質の相補的ＨＲＡおよびＨＲＢ領域により形成される。ＨＲＡ領域アミノ酸配列およびＨＲＢ領域アミノ酸配列は同じクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質に由来してもよい。あるいは、それらは異なるクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質に由来してもよい。代表例において、ＨＲ１およびＨＲ２領域は独立して下記のＨＲＡおよびＨＲＢ領域から選択される：オルトミクソウイルス（たとえば、インフルエンザＡ（Ｉｎｆ Ａ）、インフルエンザＢ（Ｉｎｆ Ｂ）、インフルエンザＣ（Ｉｎｆ Ｃ））、パラミクソウイルス（たとえば、麻疹(Measles)（ＭｅＶ）、牛疫ウイルス(Rinderpest virus)（ＲＰＶ）、イヌジステンパーウイルス(Canine distemper virus)（ＣＤＶ）、ＲＳＶ、ヒトメタニューモウイルス(Human Metapneumovirus)（ＨＭＰＶ）、パラインフルエンザウイルス(Parainfluenza virus)（ＰＩＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス(Mumps virus)（ＭｕＶ）、ヘンドラウイルス(Hendra virus)（ＨｅＶ）、ニパウイルス(Nipha virus)（ＮｉＶ）、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)（ＮＤＶ））、レトロウイルス（たとえば、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、ＨＴＬＶ－２、ＨＴＬＶ－３、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）、フィロウイルス（たとえば、エボラウイルス(Ebola virus)（ＥＢＯＶ）：ザイール(Zaire)（ＺＥＢＯＶ）：レストン(Reston)（ＲＥＢＯＶ）およびスーダン(Sudan)（ＳＥＢＯＶ）株を含む；マールブルグウイルス(Marburg)（ＭＡＲＶ））、アレナウイルス（たとえば、ラッサ(Lassa)ウイルス（ＬＡＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(Lymphocytic choriomeningitis virus)（ＬＣＭＶ）、フニンウイルス(Junin virus))（ＪＵＮＶ））、およびコロナウイルス（たとえば、ヒトコロナウイルス(Human Corona virus)（ＨＣｏＶ）：ＨＣｏＶ ２２９Ｅ、ＨＣｏＶ ＯＣ４３、ＨＣｏＶ ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ ＥＭＣを含む；ヒトトロウイルス(Human Toro virus)（ＨＴｏＶ）、中東呼吸器症候群ウイルス(Middle East Respiratory Syndrome virus)（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス(Severe Acute Respiratory Syndrome virus)（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ））。
[0109] 代表的なＨＲＡ領域アミノ酸配列には表５中のものが含まれるが、それらに限定されない。
Figure 0007291398000005
[0110] 代表的なＨＲＢ領域アミノ酸配列には表６中のものが含まれるが、それらに限定されない。
Figure 0007291398000006
[0111] ＨＲ１領域とＨＲ２領域は一緒になって、オリゴマー、一般に３つのＨＲ１領域および３つのＨＲ２領域から構成されるヘキサマーを形成することができ、それは熱力学的に安定であってクラスＩウイルス融合タンパク質の融合後コンホメーションの典型となる。オリゴマー化する傾向が強いＨＲ１およびＨＲ２領域を、本明細書中で“相補的”ヘプタッドリピート領域と呼ぶ。そのようなヘプタッドリピート領域の限定ではない例を表７に挙げる。
[0112] 具体的な態様において、ヘプタッドリピート領域のうち一方または両方を含む構造安定化部分には、構造安定化部分（特に、フォールドして逆平行、２－ヘリックスバンドルになった場合）に対する免疫応答の誘導または産生を阻害する免疫サイレンシング部分または免疫抑制部分を含む。これらの態様は、エクトドメインポリペプチドまたはその複合体に対してより強いまたは増強された免疫応答を発生できるので、有利である。免疫サイレンシング部分はグリコシル化酵素、特にグリコシルトランスフェラーゼによって特異的に認識されてグリコシル化されるグリコシル化部位であってもよい。グリコシル化はＮ－結合またはＯ－結合であってもよい。Ｎ－結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を表わす。トリペプチド配列Ｎ－Ｘ－ＳおよびＮ－Ｘ－Ｔ（ＸはＰ以外のいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列であり、これらの配列は一般に‘グリコシル化部位’と呼ばれる。Ｏ－結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用できる）への、糖類Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合を表わす。ヘプタッドリピート領域の一方または両方を含めて、構造安定化部分に免疫サイレンシング部分を挿入することができる。
[0113] 他の態様において、拡張した遺伝子コードを用いて非自然または非天然アミノ酸をヘプタッドリピート領域の一方または両方に取り込ませることができる。チロシル－ｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ直交対(orthogonal pair)およびナンセンスコドンを用いて生合成により非天然アミノ酸を希望する位置に取り込ませることができる。外部供給源からキメラポリペプチドを発現できる構築体を発現している細胞へ非天然または非自然アミノ酸を供給し、この戦略によって広範な物理的属性を備えた側鎖を取り込ませることができる；それには、化学架橋基（たとえば、アジドまたはハロアルカン）、トラッキング可能なマーカー（たとえば、蛍光性または放射性）、および時間制御修飾を可能にするための感光性基が含まれるが、これらに限定されない。構造安定化部分への化学的付加により、これらの非自然アミノ酸に種々の部分を共有結合させて有利な特性を付与することができる。
Figure 0007291398000007
[0114] さらなる態様は、前記例のいずれか可能な組合わせ、または構造安定化部分に共有結合した追加の非自然－化学的付加を含むことができる。
[0115] 場合により、１以上の追加のシステイン残基をＨＲ１および／またはＨＲ２領域に挿入してジスルフィド結合を形成し、構造安定化部分の逆平行α－ヘリックス状コイルドコイル構造をさらに安定化することができる。
２．１．２ リンカー
[0116] 本発明の構造安定化部分は、適切にはヘプタッドリピート領域（本明細書中でＨＲ１およびＨＲ２とも呼ばれる）を一定の距離に置くリンカーを含む。リンカーは一般に、明らかにヘプタッドリピート配列に配属される可能性のないいずれかのアミノ酸残基を含む。リンカーは、タンパク質工学操作の領域で異なる機能ユニットを連結するために、たとえば抗体可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）構築体の作製において、しばしば用いられる。それらは一般に溶液中ではコンホメーション的にフレキシブルであり、適切には主に極性アミノ酸残基タイプから構成される。フレキシブルリンカーにおける典型的な（頻繁に用いられる）アミノ酸はセリンおよびグリシンである。より低い程度に好ましくは、フレキシブルリンカーはアラニン、トレオニンおよびプロリンを含むこともできる。よって、構造安定化部分の介在リンカーは、適切にα－ヘリックス状コイルドコイル構造をとる２－ヘリックスバンドルとしてのＨＲ１とＨＲ２の弛緩状態（立体障害が無い）の会合を確実にするために、好ましくはコンホメーションにおいてフレキシブルである。本発明において想定するポリペプチドに使用するのに適したリンカーは当業者に明らかであり、それらが構造安定化部分の特徴的な２－ヘリックスバンドル構造の組織化を許容する（かつ適切には、妨げない）という意味でそのリンカーが構造的にフレキシブルである限り、一般にアミノ酸配列を連結するために当技術分野で用いられるいかなるリンカーであってもよい。
[0117] 当業者は、場合によっては限られた数のルーティン実験を実施した後に、最適リンカーを決定できるであろう。介在リンカーは適切には一般に少なくとも１つのアミノ酸残基からなり、通常は少なくとも２つのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、簡便性の理由で選択される決定的ではない上限は約１００アミノ酸残基である。具体的な態様において、リンカーは約１～約５０アミノ酸残基、または約５０～約１００アミノ酸残基、通常は約１～約４０アミノ酸残基、一般に約１～約３０アミノ酸残基からなる。限定ではない例において、リンカーはクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質の相補的ＨＲＡ領域とＨＲＢ領域を連結しているアミノ酸の数とほぼ同じ数のアミノ酸をもつ。特定の限定ではない例において、リンカー配列の少なくとも５０％のアミノ酸残基がプロリン、グリシン、およびセリンの群から選択される。さらなる限定ではない態様において、リンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも６０％、たとえば少なくとも７０％、たとえば８０％、より特別には９０％が、プロリン、グリシン、およびセリンの群から選択される。他の特定の態様において、リンカー配列は本質的に極性アミノ酸残基からなる；そのような特定の態様において、リンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、たとえば７０％または８０％、より特別には９０％または最大１００％が、グリシン、セリン、トレオニン、アラニン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンからなる群から選択される。特定の態様において、リンカー配列は［ＧＧＳＧ］ｎＧＧ、［ＧＧＧＧＳ］ｎ、［ＧＧＧＧＧ］ｎ、［ＧＧＧＫＧＧＧＧ］ｎ、［ＧＧＧＮＧＧＧＧ］ｎ、［ＧＧＧＣＧＧＧＧ］ｎを含むことができ、それらにおいてｎは１から１０まで、適切には１から５まで、より適切には１から３までの整数である。
[0118] ヘプタッドリピート領域がクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質のそれぞれ相補的ＨＲＡおよびＨＲＢ領域を含み、それからなり、または本質的にそれからなる特定の態様において、リンカーはＨＲＡ領域とＨＲＢ領域を連結する介在－天然アミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。介在配列は全長またはほぼ全長であってもよく、あるいは全長の介在－天然アミノ酸配列の１以上の部分を含み、それからなり、または本質的にそれからなることができる。他の態様において、リンカーは野生型クラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質のＨＲＡ領域とＨＲＢ領域の間にある天然アミノ酸配列を欠如する。前記態様のいずれにおいても、リンカーは１以上の非天然アミノ酸配列を含むことができる。
[0119] 構造安定化部分のヘプタッドリピート領域に間隔を置き、好ましくはそれらの領域の逆平行会合を容易にするための構造フレキシビリティーを導入することに加えて、リンカーは１以上の付随的な機能を含むことができる。たとえば、リンカーはキメラポリペプチドの精製を容易にする精製部分および／またはキメラポリペプチドに対する免疫応答を調節する少なくとも１つの免疫調節部分を含むことができる。
[0120] 精製部分は一般に、親和性結合によりキメラポリペプチドの回収を可能にするある長さのアミノ酸を含む。多数の精製部分または‘タグ’が当技術分野で知られており、その具体例にはビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質タグ(biotin carboxyl carrier protein-tag)（ＢＣＣＰ－タグ）、Ｍｙｃ－タグ（ｃ－ｍｙｃ－タグ）、カルモジュリン－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ（ヘキサヒスチジン－タグ、Ｈｉｓ６、６Ｈ）、マルトース結合タンパク質タグ(Maltose binding protein-tag)（ＭＢＰ－タグ）、Ｎｕｓ－タグ、キチン結合タンパク質タグ(Chitin-binding protein-tag)（ＣＢＰ－タグ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ(Glutathione-S-transferase-tag)（ＧＳＴ－タグ）、緑色蛍光タンパク質タグ(Green fluorescent protein-tag)（ＧＦＰ－タグ）、ポリグルタメート－タグ、アミロイドベータ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｓ－タグ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ストレプトアビジン結合ペプチドタグ(Streptavidin-binding peptide-tag)（ＳＢＰ－タグ）、ビオチン－タグ、ストレプトアビジン－タグおよびＶ５－タグが含まれる。
[0121] キメラポリペプチドまたはその複合体により誘導される免疫応答を調節するために、免疫調節部分をリンカーに導入することができる。そのような部分の限定ではない例には、たとえば前記の免疫サイレンシングまたは抑制部分；病原性生物に由来する抗原性部分、または他の疾患関連抗原性部分、たとえば癌もしくは腫瘍関連抗原を含む、抗原性部分が含まれる。代表的な病原性生物には、ウイルス、細菌、真菌性寄生生物、藻類ならびに原虫およびアメーバが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、抗原性部分は病原性ウイルスの抗原に由来する。疾患に関与する具体的なウイルスにはたとえば下記のものが含まれるが、それらに限定されない：麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、急性灰白髄炎、Ａ型、Ｂ型肝炎（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０２７０７）、およびＣ型肝炎（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０６８９０）、ならびに他の肝炎ウイルス、インフルエンザ、アデノウイルス（たとえば、４および７型）、狂犬病（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ３４６７８）、黄熱病、エプスタイン－バーウイルス、ならびに他のヘルペスウイルス、たとえばパピローマウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｅ０７８８３）、デング熱ウイルス（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、センダイウイルス、呼吸器合包体ウイルス、オルトミクソウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ビスナウイルス、サイトメガロウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ１８５５２）。そのようなウイルスに由来するいずれか適切な抗原が本発明の実施に有用である。たとえば、具体的なＨＩＶ由来のレトロウイルス抗原にはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の遺伝子生成物などの抗原、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、および他のＨＩＶ構成成分が含まれるが、これらに限定されない。肝炎ウイルス抗原の具体例には、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、ＭおよびＬタンパク質などの抗原、Ｂ型肝炎および他の肝炎、たとえばＡ、Ｂ、およびＣ型肝炎ウイルスのｐｒｅ－Ｓ抗原が含まれるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルス抗原の具体例には、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼなどの抗原、ならびに他のインフルエンザウイルス構成成分が含まれるが、これらに限定されない。麻疹ウイルス抗原の具体例には、麻疹ウイルス融合タンパク質などの抗原、ならびに他の麻疹ウイルス構成成分が含まれるが、これらに限定されない。風疹ウイルス抗原の具体例には、タンパク質Ｅ１およびＥ２などの抗原、ならびに他の風疹ウイルス構成成分；ロタウイルス抗原、たとえばＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス構成成分が含まれるが、これらに限定されない。サイトメガロウイルス抗原の具体例には、エンベロープ糖タンパク質Ｂなどの抗原、ならびに他のサイトメガロウイルス抗原構成成分が含まれるが、これらに限定されない。呼吸器合包体ウイルス抗原の限定ではない例には、ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質などの抗原、ならびに他の呼吸器合包体ウイルス抗原構成成分が含まれるが、これらに限定されない。単純ヘルペスウイルス抗原の具体例には、最初期タンパク質、糖タンパク質Ｄなどの抗原、ならびに他の単純ヘルペスウイルス抗原構成成分が含まれるが、これらに限定されない。水痘－帯状疱疹ウイルス抗原の限定ではない例には、９ＰＩ、ｇｐＩＩなどの抗原、ならびに他の水痘－帯状疱疹ウイルス抗原構成成分が含まれるが、これらに限定されない。日本脳炎ウイルス抗原の限定ではない例には、タンパク質Ｅ、Ｍ－Ｅ、Ｍ－Ｅ－ＮＳ １、ＮＳ １、ＮＳ １－ＮＳ２Ａ、８０％ Ｅなどの抗原、ならびに他の日本脳炎ウイルス抗原構成成分が含まれるが、これらに限定されない。狂犬病ウイルス抗原の代表例には、狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質などの抗原、ならびに他の狂犬病ウイルス抗原構成成分が含まれるが、これらに限定されない。パピローマウイルス抗原の具体例には、Ｌ１およびＬ２カプシドタンパク質、ならびに子宮頚癌関連のＥ６／Ｅ７抗原が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス抗原の他の例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M., 1991, Raven Press, New Yorkを参照されたい。具体的な態様において、ウイルス抗原はエクトドメインポリペプチドが対応するエンベロープウイルスの抗原である。他の態様において、ウイルス抗原はエクトドメインポリペプチドが対応するものとは異なるエンベロープウイルスの抗原である。
[0122] ある態様において、１以上の癌－または腫瘍－関連抗原をリンカーに挿入する。そのような抗原には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＵＣ－１、ＭＵＣ－２、ＨＥＲ－２、高分子量メラノーマ－関連抗原ＭＡＡ、ＧＤ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ－７２、卵巣－関連抗原ＯＶ－ＴＬ３およびＭＯＶ １８、ＴＵＡＮ、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ－１２５、ＣＡ－５０、ＣＡ－１９－９、腎腫瘍－関連抗原Ｇ２５０、ＥＧＰ－４０（ＥｐＣＡＭとしても知られる）、Ｓ１００（悪性メラノーマ－関連抗原）、ｐ５３、前立腺腫瘍－関連抗原（たとえば、ＰＳＡおよびＰＳＭＡ）、ｐ２１ｒａｓ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＭＵＣ－Ｉ、ＣＡ １２５、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ３３、Ａ３、Ａ３３抗体に対して特異的な抗原、ＢｒＥ３抗原、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭｌ．２４、ＨＬＡ－ＤＲ（たとえば、ＨＬＡ－ＤＲ１０）、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＨＣＧおよびサブユニット、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ－６、ＣＳＡｐ、ＥＧＰ－Ｉ、ＥＧＰ－２、Ｂａ ７３３、ＫＣ４抗原、ＫＳ－Ｉ抗原、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰｌＧＦ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＮＣＡ ６６ａ－ｄ、ＰＡＭ－４抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、ＳｌＯＯ、ＴＡＧ－７２、ＴｌＯｌ、ＴＡＧ ＴＲＡＩＬ－Ｒｌ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｐ５３、テネイシン(tenascin)、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－Ｉ）、Ｔｎ抗原など。
[0123] リンカーに含まれる抗原性部分（単数または複数）は、全長抗原または部分抗原に相当する可能性がある。部分抗原を用いる場合、その部分抗原は目的とする抗原の１以上のエピトープを含むことができ、それにはＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープ（たとえば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープおよび／またはＴヘルパー（Ｔｈ）エピトープ）が含まれる。多数の抗原のエピトープが文献中に知られており、あるいは当業者に既知のルーティン手法を用いて決定できる。他の態様において、リンカーは免疫化個体内の特定の細胞への送達を提供できる他の細胞ターゲティング部分を含むことができる。目的とする細胞集団にはＢ細胞、マイクロフォールド細胞（Ｍ細胞）(Microfold cell)および抗原提示細胞(antigen-presenting cell)（ＡＰＣ）が含まれるが、これらに限定されない。後者の例において、ターゲティング部分は樹状細胞またはマクロファージなどのＡＰＣに対するキメラポリペプチドまたはその複合体の認識増強を促進する。そのようなターゲティング配列は関連エクトドメインポリペプチドのエピトープのＡＰＣ提示を増強することができ、それは次いでエクトドメインポリペプチドに対する抗体および細胞性免疫応答の一方または両方の特異性の強化または拡大を含めて、生じる免疫応答を増大させることができる。ＡＰＣ－ターゲティング部分の限定ではない例には、ＡＰＣ表面受容体、たとえば（それらに限定されない）マンノース特異的レクチン（マンノース受容体）、ＩｇＧ Ｆｃ受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ３（ＣＤ１４１）、３３Ｄ１、ＳＩＧＬＥＣ－Ｈ、ＤＣＩＲ、ＣＤ１１ｃ、熱ショックタンパク質受容体およびスカベンジャー受容体に結合する、リガンドが含まれる。具体的な態様において、ＡＰＣ－ターゲティング部分は樹状細胞ターゲティング部分であり、それは配列ＦＹＰＳＹＨＳＴＰＱＲＰ(Uriel, et al., J. Immunol. 2004 172: 7425-7431)またはＮＷＹＬＰＷＬＧＴＮＤＷ(Sioud, et al., FASEB J 2013 27(8): 3272-83)を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。
２．２ エンベロープウイルス融合タンパク質およびエクトドメインポリペプチド
[0124] 本発明の分子クランピング戦略は、クラスＩおよびクラスＩＩＩ融合タンパク質を含めて、その野生型カウンターパートがそれらの融合前形態で組織化してトリマーになる広範なエクトドメインポリペプチドを安定化するために有用である。クラスＩ融合タンパク質の限定ではない例には、下記のウイルスの融合タンパク質が含まれる：オルトミクソウイルス（たとえば、Ｉｎｆ Ａ、Ｉｎｆ ＢおよびＩｎｆ ＣのＨＡタンパク質）、パラミクソウイルス（たとえば、ＭｅＶ、ＲＰＶ、ＣＤＶ、ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、ＰＩＶ、ＭｕＶ、ＨｅＶ、ＮｉＶおよびＮＤＶのＦタンパク質）、レトロウイルス（たとえば、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＴＬＶ－３、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２のエンベロープ糖タンパク質）、フィロウイルス（たとえば、ＥＢＯＶ、ＺＥＢＯＶ、ＲＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶの糖タンパク質）、アレナウイルス（たとえば、ＬＡＳＶ、ＬＣＭＶおよびＪＵＮＶの糖タンパク質および安定シグナルペプチド(stable signal peptide)（ＳＳＰ））、およびコロナウイルス（たとえば、ＨＣｏＶ、ＨＴｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質）。代表的なクラスＩＩＩ融合タンパク質には、下記のウイルスの融合タンパク質が含まれる：ラブドウイルス（たとえば、狂犬病ウイルス(Rabies virus)（ＲＡＢＶ）、オーストラリアコウモリリッサウイルス(Australian Bat Lyssa virus)（ＡＢＬＶ）、ウシ流行熱ウイルス(Bovine ephemeral fever virus)（ＢＥＦＶ）、および水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）の糖タンパク質（Ｇ））、およびヘルペスウイルス（たとえば、ヒトヘルペスウイルス１型（ＨＨＶ－１（単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）としても知られる）、ＨＨＶ－２（ＨＳＶ－２としても知られる）、ＨＨＶ－３（水痘－帯状疱疹ウイルス(Varicella zoster virus)（ＶＺＶ）としても知られる）、ＨＨＶ－４（エプスタイン-バーウイルス(Epstein Barr virus)（ＥＢＶ）としても知られる）およびＨＨＶ－５（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）としても知られる）の糖タンパク質（ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ／Ｌ））。
[0125] エクトドメインポリペプチドは全長前駆体エクトドメインポリペプチドまたはその一部を含むか、あるいはそれからなることができる。ある態様において、エクトドメインポリペプチドは内在性シグナルペプチド、エクトドメインの内在性ヘッド部分、エクトドメインの内在性ステム部分、内在性ムチン様ドメイン、内在性の膜近傍外部領域（ＭＰＥＲ）、および内在性融合ペプチドのうちいずれか１以上を欠如する。あるいは、またはさらに、エクトドメインポリペプチドをプロテアーゼ（たとえば、フーリンなどの細胞性プロテアーゼ）によるタンパク質分解開裂に対してより低い感受性にするために、野生型または基準の融合タンパク質の１以上の内在性タンパク質分解開裂部位（たとえば、１以上のフーリン開裂部位）が変異または欠失していてもよい。
[0126] 本発明のエクトドメインポリペプチドは、全長エンベロープウイルス前駆体融合タンパク質中に存在する種々の構造部分および機能部分またはドメインの位置の知識を用いて構築することができる。そのような前駆体タンパク質およびそれらの関連ドメインの限定ではない例を、具体的なエクトドメインポリペプチド態様の構築を参照して以下に述べる。
２．２．１ Ｉｎｆ Ａ ＨＡ
[0127] 代表的なＩｎｆ Ａ ＨＡ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000008
この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0128] ＳＰ＝１－１６
[0129] エクトドメイン＝１７－５２９
[0130] フーリン開裂部位＝３４５－３４６
[0131] ＦＰ＝３４６－３５５
[0132] ＨＲＡ領域＝３５６－３９０
[0133] ＨＲＢ領域＝４２１－４７０
[0134] ＭＰＥＲ＝４７０－５２９
[0135] ＴＭ＝５３０－５５３
[0136] Ｃ＝５３４－５５６
[0137] ヘッド領域＝５１－３２８，４０３－４４４，
[0138] ステム領域＝１７－５８，３２７－４０１，４４２－５０９．
[0139] Ｉｎｆ Ａ ＨＡエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－５２９：
[0140]
Figure 0007291398000009
エクトドメイン マイナス ＳＰ １８－５２９：
[0141]
Figure 0007291398000010
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ１８－４６９：
[0142]
Figure 0007291398000011
エクトドメイン１８－３４１，３４６－５２９ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0143]
Figure 0007291398000012
ステムドメイン１－５８，３２７－４０１，４４２－５０９ プラス リンカー領域：
[0144]
Figure 0007291398000013
ヘッドドメイン１－１８，５１－３２８，４０３－４４４ プラス リンカー領域：
[0145]
Figure 0007291398000014
２．２．２ Ｉｎｆ Ｂ ＨＡ
[0146] 代表的なＩｎｆ Ｂ ＨＡ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000015
[0147] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0148] ＳＰ＝１－１６
[0149] エクトドメイン＝１７－５４７
[0150] フーリン開裂部位＝３６１－３６２
[0151] ＦＰ＝３６２－３８２
[0152] ＨＲＡ領域＝３８３－４１６
[0153] ＨＲＢ領域＝４３６－４８７
[0154] ＭＰＥＲ＝４８８－５４７
[0155] ＴＭ＝５４８－５７３
[0156] Ｃ＝５７４－５８４
[0157] ヘッド領域＝４８－３４４，４１８－４５６
[0158] ステム領域＝１７－４７，３４５－４１７，４５７－５４７
[0159] Ｉｎｆ Ｂ ＨＡエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－５４７：
[0160]
Figure 0007291398000016
エクトドメイン マイナス ＳＰ １７－５４７：
[0161]
Figure 0007291398000017
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ １７－４８７：
[0162]
Figure 0007291398000018
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位１７－３５５，３６２－５４７：
[0163]
Figure 0007291398000019
ステムドメイン１－４７，３４５－４１７，４５７－５４７ プラス リンカー領域：
[0164]
Figure 0007291398000020
ヘッドドメイン１－１７，４８－３４４，４１８－４５６ プラス リンカー領域：
[0165]
Figure 0007291398000021
２．２．３ ＲＳＶ Ｆ
[0166] 限定ではないＲＳＦ Ｆ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000022
[0167] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0168] ＳＰ＝１－２３
[0169] エクトドメイン＝２４－５２４
[0170] フーリン開裂部位＝１０９－１１０，１３６－１３７
[0171] ＦＰ＝１３７－１６３
[0172] ＨＲＡ領域＝１６４－１９６
[0173] ＨＲＢ領域＝４８８－５２４
[0174] ＴＭ＝５２５－５４８
[0175] Ｃ＝５４９－５７４
[0176] Ｄ２５相互作用ドメイン＝６１－９７，１９３－２４０
[0177] ＲＳＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
[0178] エクトドメイン１－５２４：
[0179]
Figure 0007291398000023
ＲＳＶ Ｆエクトドメイン（１－５２０）：
[0180]
Figure 0007291398000024
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２４－５２４：
[0181]
Figure 0007291398000025
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位２４－５２４：
[0182]
Figure 0007291398000026
Ｄ２５相互作用ドメイン ６１－９７，１９３－２４０ プラス リンカー領域：
[0183]
Figure 0007291398000027
２．２．４ ｈＭＰＶ Ｆ
[0184] 具体的なｈＭＰＶ Ｆ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000028
[0185] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0186] ＳＰ＝１－１９
[0187] エクトドメイン＝１－４９０
[0188] フーリン開裂部位＝１０２－１０３
[0189] ＦＰ＝１０３－１２５
[0190] ＨＲＡ領域＝１２６－１６９
[0191] ＨＲＢ領域＝４５６－４９０
[0192] ＴＭ＝４９１－５１４
[0193] Ｃ＝５１５－５３９
[0194] ｈＭＰＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４９０：
[0195]
Figure 0007291398000029
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２０－４９０：
[0196]
Figure 0007291398000030
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位２０－４９０：
[0197]
Figure 0007291398000031
２．２．５ ＰＩＶ Ｆ
[0198] 代表的なＰＩＶ Ｆ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000032
[0199] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0200] ＳＰ＝１－１９
[0201] エクトドメイン＝１－４９３
[0202] フーリン開裂部位＝１０９－１１０
[0203] ＦＰ＝１１０－１３５
[0204] ＨＲＡ領域＝１３６－１６８
[0205] ＨＲＢ領域＝４５８－４９３
[0206] ＴＭ＝４９４－５１６
[0207] Ｃ＝５１７－５３６
[0208] ＰＩＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４９３：
[0209]
Figure 0007291398000033
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２０－４９３：
[0210]
Figure 0007291398000034
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位２０－４９３：
[0211]
Figure 0007291398000035
２．２．６ ＭｅＶ Ｆ
[0212] 代表的なＭｅＶ Ｆ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000036
[0213] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0214] ＳＰ＝１－２４
[0215] エクトドメイン＝１－４９３
[0216] フーリン開裂部位＝１１２－１１３
[0217] ＦＰ＝１１３－１３７
[0218] ＨＲＡ領域＝１３８－１７１
[0219] ＨＲＢ領域＝４５４－４９３
[0220] ＴＭ＝４９４－５１７
[0221] Ｃ＝５１８－５５０
[0222] ＭｅＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４９３：
[0223]
Figure 0007291398000037
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２５－４９３：
[0224]
Figure 0007291398000038
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0225]
Figure 0007291398000039
２．２．７ ＨｅＶ Ｆ
[0226] 限定ではないＨｅＶ Ｆ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000040
[0227] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0228] ＳＰ＝１－２０
[0229] エクトドメイン＝１－４８７
[0230] フーリン開裂部位＝１０９－１１０
[0231] ＦＰ＝１１０－１３５
[0232] ＨＲＡ領域＝１３６－１６９
[0233] ＨＲＢ領域＝４５６－５８７
[0234] ＴＭ＝４８８－５１８
[0235] Ｃ＝５１９－５４６
[0236] ＨｅＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４８７：
[0237]
Figure 0007291398000041
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２１－４８７：
[0238]
Figure 0007291398000042
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位２１－４８７：
[0239]
Figure 0007291398000043
２．２．８ ＮｉＶ Ｆ
[0240] 代表的なＮｉＶ Ｆ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000044
[0241] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0242] ＳＰ＝１－２０
[0243] エクトドメイン＝１－４８７
[0244] フーリン開裂部位＝１０９－１１０
[0245] ＦＰ＝１１０－１３５
[0246] ＨＲＡ領域＝１３６－１６９
[0247] ＨＲＢ領域＝４５６－４８７
[0248] ＴＭ＝４８８－５１８
[0249] Ｃ＝５１９－５４６
[0250] ＮｉＶ Ｆエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４８７：
[0251]
Figure 0007291398000045
エクトドメイン マイナス ＳＰ：
[0252]
Figure 0007291398000046
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0253]
Figure 0007291398000047
２．２．９ ＨＩＶ ＧＰ１６０
[0254] 具体的なＨＩＶ ＧＰ１６０前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000048
[0255] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0256] ＳＰ＝１－２８
[0257] エクトドメイン＝１－６８８
[0258] フーリン開裂部位＝５０８－５０９
[0259] ＦＰ＝５０９－５３８
[0260] ＨＲＡ領域＝５３９－５８７
[0261] ＨＲＢ領域＝６３１－６６７
[0262] ＭＰＥＲ＝６６８－６８８
[0263] ＴＭ＝６８９－７１１
[0264] Ｃ＝７１２－８６１
[0265] ＧＰ４１＝５０９－８６１
[0266] ＧＰ１２０＝１－５０８
[0267] ＨＩＶ ＧＰ１６０エクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－６８８：
[0268]
Figure 0007291398000049
エクトドメイン マイナス ＳＰ：
[0269]
Figure 0007291398000050
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ：
[0270]
Figure 0007291398000051
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0271]
Figure 0007291398000052
ＧＰ４１エクトドメイン ５０９－６８８：
[0272]
Figure 0007291398000053
２．２．１０ ＥＢＯＶ ＧＰ
[0273] 代表的なＥＢＯＶ ＧＰ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000054
[0274] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0275] ＳＰ＝１－２７
[0276] エクトドメイン＝１－６５０
[0277] フーリン開裂部位＝５０１－５０２
[0278] カテプシン開裂部位＝１９１－１９２，２０１－２０２
[0279] ＦＰ＝５１１－５５６
[0280] ＨＲＡ領域＝５５７－５９３
[0281] ＨＲＢ領域＝６００－６３５
[0282] ＭＰＥＲ＝６３６－６５０
[0283] ＴＭ＝６５１－６６９
[0284] Ｃ＝６７０－６７６
[0285] ムチン様ドメイン＝３１２－４６１
[0286] ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－６５０：
[0287]
Figure 0007291398000055
エクトドメイン マイナス ＳＰ：
[0288]
Figure 0007291398000056
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ：
[0289]
Figure 0007291398000057
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0290]
Figure 0007291398000058
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ムチン様ドメイン：
[0291]
Figure 0007291398000059
エクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン：
[0292]
Figure 0007291398000060
２．２．１１ ＭＡＲＶ ＧＰ
[0293] 限定ではないＭＡＲＶ ＧＰ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000061
[0294] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0295] ＳＰ＝１－１９
[0296] エクトドメイン＝１－６５０
[0297] フーリン開裂部位＝４３４－４３５
[0298] ＦＰ＝５２６－５４９
[0299] ＨＲＡ領域＝５８２－５９８
[0300] ＨＲＢ領域＝６１１－６２７
[0301] ＭＰＥＲ＝６２８－６５０
[0302] ＴＭ＝６５１－６６９
[0303] Ｃ＝６７０－６８１
[0304] ムチン様ドメイン＝２４４－４２５
[0305] ＭＡＲＶ ＧＰエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－６５０：
[0306]
Figure 0007291398000062
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２０－６５０：
[0307]
Figure 0007291398000063
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ ２０－６２７：
[0308]
Figure 0007291398000064
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0309]
Figure 0007291398000065
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ムチン様ドメイン：
[0310]
Figure 0007291398000066
２．２．１２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ
[0311] 具体的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000067
[0312] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0313] ＳＰ＝１－１３
[0314] エクトドメイン＝１－１１９９？
[0315] ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ開裂部位＝６６７－６６８
[0316] ＦＰ＝７７０－７８８
[0317] ＨＲＡ領域＝８９２－１０１３
[0318] ＨＲＢ領域＝１１４５－１１８７
[0319] ＭＰＥＲ＝１１８８－１１９９
[0320] ＴＭ＝１２００－１２１６
[0321] Ｃ＝１２１７－１２５５
[0322] ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－１１９９：
[0323]
Figure 0007291398000068
エクトドメイン マイナス ＳＰ：
[0324]
Figure 0007291398000069
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ：
[0325]
Figure 0007291398000070
２．２．１３ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ
[0326] 代表的なＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000071
[0327] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0328] ＳＰ＝１－２１
[0329] エクトドメイン＝１－１３０１
[0330] フーリン開裂部位＝７５１－７５２，８８７－８８８
[0331] ＦＰ＝８８８－８９１，９５１－９８０
[0332] ＨＲＡ領域＝９８４－１１０５
[0333] ＨＲＢ領域＝１２４８－１２９１
[0334] ＭＰＥＲ＝１２９２－１３０１
[0335] ＴＭ＝１３０２－１３１８
[0336] Ｃ＝１３１９－１３５３
[0337] ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－１３０１：
[0338]
Figure 0007291398000072
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２２－１３０１：
[0339]
Figure 0007291398000073
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ ２２－１２９１：
[0340]
Figure 0007291398000074
エクトドメイン マイナス ＳＰ プラス 変異フーリン開裂部位：
[0341]
Figure 0007291398000075
２．２．１４ ＶＳＶ Ｇ
[0342] 代表的なＶＳＶ Ｇ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000076
[0343] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0344] ＳＰ＝１－１７
[0345] エクトドメイン＝１－４６２
[0346] ＭＰＥＲ＝４２１－４６２
[0347] ＴＭ＝４６２－４８３
[0348] Ｃ＝４８４－５１０
[0349] ＶＳＶ Ｇエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４６２：
[0350]
Figure 0007291398000077
エクトドメイン マイナス ＳＰ：
[0351]
Figure 0007291398000078
エクトドメイン マイナス ＳＰ マイナス ＭＰＥＲ：
[0352]
Figure 0007291398000079
２．２．１５ ＲＡＢＶ ＧＰ
[0353] 代表的なＲＡＢＶ ＧＰ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000080
[0354] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0355] ＳＰ＝１－２０
[0356] エクトドメイン＝１－４５８
[0357] ＴＭ＝４５９－４７８
[0358] Ｃ＝４７９－５２４
[0359] ＲＡＢＶ ＧＰエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－４５８：
[0360]
Figure 0007291398000081
エクトドメイン マイナス ＳＰ：
[0361]
Figure 0007291398000082
２．２．１６ ＨＳＶ１ Ｇｂ
[0362] 代表的なＨＳＶ１ Ｇｂ前駆体は、下記のアミノ酸配列をもつ：
Figure 0007291398000083
[0363] この配列は下記のドメイン／部分を含む：
[0364] ＳＰ＝１－２４
[0365] エクトドメイン＝１－７７４
[0366] ＴＭ＝７７５－７９５
[0367] Ｃ＝７９６－９０４
[0368] ＨＳＶ１ Ｇｂエクトドメインポリペプチドの限定ではない例には下記のものが含まれる：
エクトドメイン１－７７４：
[0369]
Figure 0007291398000084
エクトドメイン マイナス ＳＰ ２５－７７５：
[0370]
Figure 0007291398000085
[0371] 本発明のキメラポリペプチドを作製するために用いたエクトドメインポリペプチド配列は、自然界でエンベロープウイルス融合タンパク質内に見出すことができ、および／またはそれは天然の融合タンパク質配列に比較して１以上の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）一アミノ酸変異（挿入、欠失または置換）をもつことができる。たとえば、Ｆタンパク質を変異させてそれらのフーリン開裂配列を除去し、それにより細胞内プロセシングを阻止することが知られている。具体的な態様において、エクトドメインポリペプチドはＳＰ、ＴＭおよびＣドメインのうちいずれか１以上を欠如し、場合により天然の融合タンパク質配列に比較して１以上の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）一アミノ酸変異（挿入、欠失または置換）を含む。
[0372] 本発明は、いずれか希望するエンベロープウイルス融合タンパク質アミノ酸配列、たとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～１２７のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～１２７に対して同一性もしくは類似性をもつ配列を使用できる。一般に、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～１２７に対して少なくとも７５％の同一性または類似性、たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または類似性をもつであろう。
２．３ 代表的なキメラポリペプチド構築体
[0373] 本発明のキメラポリペプチドの限定ではない例を以下に述べる：
２．３．１ Ｉｎｆ Ａ ＨＡエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0374]
Figure 0007291398000086
２．３．２ Ｉｎｆ Ａ ＨＡステムドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0375]
Figure 0007291398000087
２．３．３ Ｉｎｆ Ａ Ｈ５エクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0376]
Figure 0007291398000088
２．３．４ Ｉｎｆ Ｂ ＨＡエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0377]
Figure 0007291398000089
２．３．５ ＲＳＶ Ｆエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0378]
Figure 0007291398000090
２．３．６ ＲＳＶ Ｆ（１－５２０）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0379]
Figure 0007291398000091
２．３．７ ＲＳＶ Ｆ（１－５２０）－ＤＳｃａｖ変異－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0380]
Figure 0007291398000092
２．３．８ ｈＭＰＶ Ｆエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0381]
Figure 0007291398000093
２．３．９ ＰＩＶ Ｆエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0382]
Figure 0007291398000094
２．３．１０ ＭｅＶ Ｆエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0383]
Figure 0007291398000095
２．３．１１ ＨｅＶ Ｆエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0384]
Figure 0007291398000096
２．３．１２ ＮｉＶ Ｆエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0385]
Figure 0007291398000097
２．３．１３ ＨＩＶ ＧＰ１６０エクトドメイン－ＲＳＶ Ｆ－ベースのＳＳＭ
[0386]
Figure 0007291398000098
２．３．１４ ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン（１－３１１，４６２－６５０）－ ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0387]
Figure 0007291398000099
２．３．１５ ＭＡＲＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0388]
Figure 0007291398000100
２．３．１６ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0389]
Figure 0007291398000101
２．３．１７ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0390]
Figure 0007291398000102
２．３．１８ ＶＳＶ Ｇエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0391]
Figure 0007291398000103
２．３．１９ ＲＡＢＶ ＧＰエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0392]
Figure 0007291398000104
２．３．２０ ＨＳＶ１ Ｇｂエクトドメイン－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0393]
Figure 0007291398000105
２．４ 万能オリゴマー化ドメインとしての構造安定化部分の使用
[0394] 構造安定化部分は、本発明のエクトドメインポリペプチドを融合後コンホメーションへの再配列に対して安定化することにおけるそれの有用性に加えて、目的とするいずれかのヘテロロガス分子をオリゴマー化してオリゴマー、特にトリマーにする、万能オリゴマー化ドメイン(universal oligomerization domain)（ＵＯＤ）として有用である。特定の態様において、ＵＯＤをヘテロロガスタンパク性分子の上流または下流に融合させて、キメラポリペプチドを形成する。一般に、ＵＯＤをヘテロロガスタンパク性分子の下流に融合させる。本明細書に記載するエクトドメイン態様と同様に、ＵＯＤの会合に適した条件下での（たとえば水溶液中での）相補的ヘプタッドリピート相互の会合の結果、逆平行、２－ヘリックスバンドルの形成が起き、それがトリマー化して高度に安定な６ヘリックスバンドルを形成し、こうしてキメラポリペプチドがトリマー化してトリマーポリペプチド複合体を形成することが可能になる。
[0395] ヘテロロガスタンパク性分子は天然または非天然ポリペプチドであってよい。ある態様において、ヘテロロガスポリペプチドは療法用ポリペプチドであるか、あるいはそれを含む。リガンドおよび受容体の両方を含めて、多様な疾患を処置するためにきわめて多様な療法用ポリペプチドが有用であることが当技術分野で知られている。療法用ポリペプチドについての既知のターゲットおよび適応症の種々の例を表８に示す。
Figure 0007291398000106
Figure 0007291398000107
[0396] 本発明のＵＯＤを用いて、トリマー化した可溶性受容体、たとえば下記を含むものを作製することができる；ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、Ｉｇスーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体スーパーファミリーメンバー、ケモカイン受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリンファミリーメンバー，成長因子受容体ファミリー、ホルモン受容体、オピオイド受容体、他の神経ペプチド受容体、特に下記を含むイオンチャンネル：ＣＤ１ａ－ｅ、ＣＤ２（ＬＦＡ－２）、ＣＤ２Ｒ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４－７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０ ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗｌ２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１５ｕ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８（インテグリンβ２）、ＣＤ１９－２８、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、ＣＤ３０、ＣＤ３１（ＰＥ－ＣＡＭ－１）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ３４－４１、ＣＤ４２ａ－ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＤＣ４７、ＣＤ４７Ｒ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ－ｆ（ＶＬＡ－１－６）、ＣＤ５０（ＩＣＡＭ－３）、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ５５、ＣＤ５６（Ｎ－ＣＡＭ）、ＣＤ５７、ＣＤ５８（ＬＦＡ－３）、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ－ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ－ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＤＣ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６－ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４－ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００－ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８－ＣＤ１１２、ＣＤｗ１１３、ＣＤ１１４（Ｇ－ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１５（Ｍ－ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ（ＩＬ－１Ｒ、Ｉ型）、ＣＤｗ１２１ｂ（ＩＬ－１Ｒ、ＩＩ型）、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ）、ＣＤｗ１２３（ＩＬ－３Ｒ）、ＣＤ１２４（ＩＬ－４Ｒ）、ＣＤｗ１２５（ＩＬ－５Ｒ）、ＣＤ１２６（ＩＬ－６Ｒ）、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１２８ｂ（ＩＬ－８Ｒβ、ＣＤ１２９（ＩＬ－９Ｒ）、ＣＤ１３０（ＩＬ－６Ｒβ）、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４（Ｏｘ－４０）、ＣＤ１３５－ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲα）、ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦＲβ）、ＣＤ１４１－ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ－ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６２Ｒ、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７８（ＦａｓＬ）、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１（ＣＸＣＲ１）、ＣＤ１８２（ＣＸＣＲ２）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）、ＣＤｗ１８６（ＣＸＣＲ６）、ＣＤ１９１（ＣＣＲ－１）、ＣＤ１９２（ＣＣＲ２）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤｗ１９８（ＣＣＲ８）、ＣＤｗｌ９９（ＣＣＲ９）、ＣＤ２００（Ｏｘ－２）、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４（マクロファージスカベンジャーＲ）、ＣＤ２０７(ランゲリン(Langerin))、ＣＤ２０８（ＤＣ－ＬＡＭＰ）、ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤｗ２１０（ＩＬ－１０Ｒ）、ＣＤ２１２（ＩＬ－１２－Ｒβ１）、ＣＤ２１３ａ１（ＩＬ－１３－Ｒα１）、ＣＤ２１３ａ２（ＩＬ－１３－Ｒα２）、ＣＤｗ２１７（ＩＬ－１７－Ｒ）、ＣＤｗ２１８ａ（ＩＬ－１８Ｒα）、ＣＤｗ２１８ｂ（ＩＬ－１８Ｒβ）、ＣＤ２２０（インスリン－Ｒ）、ＣＤ２２１（ＩＧＦ－１Ｒ）、ＣＤ２２２（ＩＧＦ－ＩＩ Ｒ）、ＣＤ２２３－２３４、ＣＤ２３５ａ（グリコフォリン(glycophorin)Ａ）、ＣＤ２３５ａｂ（グリコフォリンＡ／Ｂ）、ＣＤ２３５ｂ（グリコフォリンＢ）、ＣＤ２３６（グリコフォリンＣ／Ｄ）、ＣＤ２３６Ｒ（グリコフォリンＣ）、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４１－ＣＤ２４９、ＣＤ２５２（Ｏｘ４０Ｌ）、ＣＤ２５４（ＲＡＮＫＬ）、ＣＤ２５６（ＡＰＲＩＬ）、ＣＤ２５７（ＢＡＦＦ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６１（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、ＣＤ２６２（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＣＤ２６３（ＤｃＲ１）、ＣＤ２６４（ＤｃＲ２）、ＣＤ２５６（ＲＡＮＫ）、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ－Ｒ）、ＣＤ２６７（ＴＡＣＩ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７５（Ｂ７－Ｈ２）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ１）、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１（ＴＬＲ１）、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ２８３（ＴＬＲ３）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ２８９（ＴＬＲ９）、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５（レプチンＲ）、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８（Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ β３サブユニット）、ＣＤ２９９（Ｌ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１－ＣＤ３０７、ＣＤ３０９（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４－３２２、ＣＤ３２４、ＣＤｗ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤｗ３２７、ＣＤｗ３２８、ＣＤｗ３２９、ＣＤ３３１－ＣＤ３３７、ＣＤｗ３３８、ＣＤ３３９、Ｂ７－Ｈ４、Ｘｅｄａｒ、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＣＸ３ＣＲ１、ケモカイン様受容体－１（ＣｈｅｍＲ２３）、補体受容体、ＤＡＲＣ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２０Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－２２Ｒ、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－２７Ｒ、ＩＬ－２８Ｒ、ＩＬ－３１Ｒ、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ケモカイン－結合タンパク質２（Ｄ６）、インターフェロン受容体、白血球関連Ｉｇ様受容体ファミリー、ＬＩＬＲＣ１およびＬＩＬＲＣ２を含む免疫グロブリン様受容体ファミリー、ロイコトリエン受容体、ＬＡＭＰ、ネクチン様タンパク質１－４、ＩｇＳＦ８、免疫グロブリン様トランスクリプト(transcript)ファミリー ＬＴ１－６、ＥＤＡＲ、ストローマ由来因子(stromal derived factor)（ＳＤＦ）、胸腺間質性リンパ球新生因子(thymic stromal lymphopoietin)受容体、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、上皮成長因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体ＦＧＦ１－４、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦ－Ｒ）、ｅｐａＣＡＭ、インスリン様成長因子受容体ＩＧＦ１－ＲおよびＩＧＦ２－Ｒ，フィブロネクチン、フィブロネクチン ロイシンリッチ膜貫通タンパク質ＦＬＲＴ１－３、Ｈｅｒ２、３および４、ＣＲＥＬＤ１および２、８Ｄ６Ａ、リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）、Ｃ型レクチン様ファミリーメンバー、たとえばＣＬＥＣ－１、ＣＬＥＣ－２、ＣＬＥＣ４Ｄ、４Ｆおよびデクチン(Dectin)１および２、ライリン(layilin)、成長ホルモン受容体、プロラクチン(prolactin)放出ホルモン受容体（ＰＲＲＰ）、コルチコトロピン放出ホルモン受容体（ＣＲＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＮＲＨＲ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＴＲＨＲ）、ソマトスタチン受容体ＳＳＴＲ１－ＳＳＴＲ５、バソプレシン受容体１Ａ、１Ｂ、２、オキシトシン受容体、黄体形成ホルモン／コリオゴナドトロピン(choriogonadotropin)受容体（ＬＨＣＧＲ）、甲状腺刺激ホルモン受容体、心房性ナトリウム利尿因子受容体ＮＰＲ１－３、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、カルシトニン受容体（ＣＴ）、コレシストキニン(cholecystokinin)受容体ＣＣＫＡＲおよびＣＣＫＢＲ、血管作用性腸管ペプチド受容体ＶＰＡＣ１および２、δ－オピオイド受容体、κ－オピオイド受容体、μ－オピオイド受容体、σ受容体σ１およびσ、カンナビノイド受容体Ｒ１および２、アンギオテンシン受容体ＡＴ１－４、ブラジキニン受容体Ｖ１および２、タキキニン受容体１（ＴＡＣＲ１）、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ），ガラニン受容体Ｒ１－３、ＧＰＣＲ 神経ペプチド受容体神経ペプチドＢ／Ｗ Ｒ１および２、神経ペプチドＦＦ受容体Ｒ１およびＲ２、神経ペプチドＳ受容体Ｒ１、神経ペプチドＹ受容体Ｙ１－５、ニューロテンシン受容体、ＩおよびＩＩ型アクチビン受容体、アクチビン受容体様キナーゼ（Ａｌｋ－１およびＡｌｋ－７）、ベータグリカン、ＢＭＰおよびアクチビン膜結合インヒビター（ＢＡＭＢＩ）、クリプト(cripto)、Ｔｒｋ受容体ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＡＸＬ受容体ファミリー、ＬＴＫ受容体ファミリー、ＴＩＥ－１、ＴＩＥ－２、Ｒｙｋ、ニューロピリン１、Ｅｐｈ受容体ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、メラノコルチン受容体ＭＣ－３およびＭＣ－４、ＡＭＩＣＡ、ＣＸＡＤＲ、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン－結合タンパク質、クラス－Ｉ限定Ｔ細胞関連分子(Class-I resricted T-cell-associated molecule)、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ，アンポテリン誘導遺伝子およびＯＲＦ(ampoterin-induced gene and ORF)（ＡＭＩＧＯ）、ＡＰＪ、アシアロ糖タンパク質受容体１および２（ＡＳＧＰＲ）、脳特異的血管形成インヒビター３（ＢＡＩ－３）、基底細胞接着分子／ルテラン(Lutheran)血液型糖タンパク質（ＢＣＡＭ／Ｌｕ）、カドヘリン、ＣＤＣＰ１、嚢胞性線維症膜貫通型伝導度レギュレーターＭＲＰ－７、軟骨レクチン(chondro lectin)、肺サーフェクチン、クローディン(claudin)、ＡＮＴＨＸＲ２、コラーゲン、補体受容体、コンタクチン(contactin)１－６、キューブリン(cubulin)、エンドグリカン、ＥｐＣＡＭ(epithelial cellular adhesion molecule，上皮細胞接着分子）、内皮プロテインＣ受容体(Endothelial Protein C receptor)（ＥＰＣＲ）、Ｅｐｈ受容体、グルカゴン様ペプチド受容体ＧＬＰ－１Ｒおよび２Ｒ、グルタメート受容体、グルコーストランスポーター、グリシン受容体、グリピカン(glypican）、Ｇ－タンパク質共役型胆汁酸受容体、Ｇ－タンパク質共役型受容体１５、ＫＬＯＴＨＯファミリーメンバー、レプチン受容体、ＬＩＭＰＩＩ、ＬＩＮＧＯ、ＮＯＧＯ、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体(lymphatic bessel endothelial hyaluronan receptor)（ＬＹＶＥ－１）、骨髄阻害性Ｃ型レクチン様受容体(myeloid inhibitory C-type lectin-like receptor)ＣＬＥＣ１２Ａ、ネオゲニン(neogenin)、ネフリン(nephrin)、ＮＥＴＯ－１、ＮＥＴＯ－２、ＮＭＤＡ受容体、オピオイド結合性細胞接着分子、破骨細胞阻害性レクチン関連タンパク質、オンコスタチン(oncostatin)受容体、破骨細胞関連受容体、骨アクチビン、トロンビン受容体、ポドプラニン(podoplanin)、ポリミン(porimin)、カリウムチャンネル、Ｐｒｅｆ－１、幹細胞因子受容体、セマフォリン(semaphorin)、ＳＰＡＲＣ、スカベンジャー受容体Ａ１、スタビリン(stabilin)、シンデカン(syndecan)、Ｔ細胞受容体、ＴＣＡＭ－１、Ｔ細胞サイトカイン受容体ＴＣＣＲ、トロンボスポンジン、ＴＩＭ１－６、ｔｏｌｌ様受容体、骨髄細胞上に発現したトリガリング受容体(triggering receptor expressed on myeloid cell)（ＴＲＥＭ）およびＴ

ＲＥＭ様タンパク質、ＴＲＯＰ－２、またはそのいずれかのミメティックもしくはアナログ。
[0397] さらに、本発明のＵＯＤを用いて前記受容体のいずれかのリガンド、たとえば下記のものをトリマー化することができる：たとえばＴＮＦスーパーファミリーメンバー、サイトカインスーパーファミリーメンバー、成長因子、ケモカインスーパーファミリーメンバー、血管形成促進因子(pro-angiogenic factor)、アポトーシス促進因子(pro-apoptotic factor)、インテグリン、ホルモン、および、特に下記を含む他の可溶性因子：ＲＡＮＫ－Ｌ、リンホトキシン(Lymphotoxin)（ＬＴ）－α、ＬＴ－β、ＬＴ－α１β２、ｚＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＴＬ１Ａ、ＦａｓＬ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢ－Ｌ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、Ｏｘ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６）、ＢＡＦＦ、ＥＤＡ１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１ｇ、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、Ｇ－ＣＭＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β１、２および３、ＴＧＦ－α、カルジオトロフィン－１、白血病阻止因子(leukemia inhibitory factor)（ＬＩＦ）、ベータセルリン(betacellulin)、アンフィレグリン(amphiregulin)、胸腺間質リンホポエチン(thymic stromal lymphopoietin)（ＴＳＬＰ）、ｆｌｔ－３、ＣＸＣＬ１－１６、ＣＣＬ１－３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４－ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＬ１１－２８、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＨＭＧ－Ｂ１、熱ショックタンパク質、ケメリン(chemerin)、デフェンシン(defensin)、マクロファージ遊走阻止因子(macrophage migration inhibitory factor)（ＭＩＦ）、オンコスタチンＭ(oncostatin M)、リミチン(limitin)、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ Ａ－ＤおよびＰＩＧＦ、水晶体上皮由来成長因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子ＦＧＦ１－１４および１６－２３、肝細胞癌由来成長因子、ヘパソシン(hepassocin)、肝細胞成長因子、血小板由来内皮成長因子(platelet-derived endothelial growth factor)（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、インスリン様成長因子ＩＧＦ１およびＩＧＦ２、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ １－６）、ＧＡＳＰＳ(growth and differentiation-factor-associated serum protein，成長および分化因子関連血清タンパク質）、結合組織成長因子、エピジェン(epigen)、エピレグリン(epiregulin)、発生動脈および神経堤上皮成長因子(developmental arteries and neural crest epidermal growth factor)（ＤＡＮＣＥ）、グリア成熟因子－β、インスリン、成長ホルモン、アンギオゲニン、アンギオポエチン１－４、アンギオポエチン様タンパク質１－４、インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１、エリスロポエチン、トロンボポエチン、プロラクチン放出ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、バソプレシン、オキシトシン、デモキシトシン(demoxytocin)、カルベトシン(carbetocin)、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ、カルシトニン、ＣＣＫ ａ、ＣＣＫ Ｂ、血管作用性腸管ペプチド１および２、エンセファリン、ダイノルフィン、β－エンドルフィン、モルヒネ、４－ＰＰＢＰ、［１］ＳＡ ４５０３、ジトリルグアニジン(Ditolylguanidine)、シラメシン(siramesine) アンギオテンシン、カリジン(kallidin)、ブラジキニン、タキキニン、サブスタンスＰ(substance P)、カルシトニン、ガラニン、ニューロテンシン、神経ペプチドＹ１－５、神経ペプチドＳ、神経ペプチドＦＦ、神経ペプチドＢ／Ｗ、脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor)BＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４／５、アクチビンＡ、ＡＢ、ＢおよびＣ、インヒビン、ミュラー管抑制ホルモン(Mullerian inhibiting hormone)（ＭＩＨ）、骨形成タンパク質ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、成長分化因子ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ミオスタチン(Myostatin)／ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、およびニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、アルテミン(artemin)、ペルセフィン(persephin)、ニュールツリン(neurturin)、ＧＤＮＦ、アグリン(agrin)、エフリン(ephrin)リガンドＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ２、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＡ４、ＥＦＮＡ５ ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＢ３、アディポネクチン、α２－マクログロブリン、アグリカン(agrecan)、アグーチ関連タンパク質(agouti-related protein)（ＡｇＲＰ）、α－メラノサイト刺激ホルモン、アルブミン、アメロブラスチン(ameloblastin)、プラスミノーゲン、アンギオスタチン、アポリポタンパク質Ａ１、ＡＩＩ、Ｂ、Ｂ１００、Ｅ、アミロイド、オートファジン(autophagin)、ＴＧＦ－ベータ誘導タンパク質Ｉｇ Ｈ３）、ビグリカン(biglycan)、白血球由来ケモタキシンＬＥＣＴ２、Ｃ－反応性タンパク質、補体成分、コルディン(chordin)、コルディン様タンパク質、コlレクチン(collectin)、クラステリン様プロテイン１、コルチゾール、ファン・ヴィレブランド因子(van willebrandt factor)、サイトスタチン、エンドスタチン、エンドレペリン(endoreppellin)、エフリン(ephrin)リガンド、フェチュイン(fetuin)、フィコリン(ficolin)、グルカゴン、グラニュライシン(granulysin)、グレムリン(gremlin)、ＨＧＦアクチベーターインヒビターＨＡＩ－１および２、カリクレイン(kallilcrein)、ラミニン、レプチン、リポカリン、マンナン結合レクチン(mannan binding lectin)（ＭＢＬ）、メテオリン(meteorin)、ＭＦＧ－Ｅ８、マクロファージガラクトース Ｎ－アセチルガラクトサミン特異的レクチン（ＭＧＬ）、ミッドカイン(midkine)、ミオシリン(myocilin)、ネスチン(nestin)、骨芽細胞特異的因子２、オステオポンチン、オステオクリン(osteocrin)、オステオアドヘリン(osteoadherin)、ペントラキシン(pentraxin)、ペルセフィン(persephin)、胎盤成長因子、リラキシン(relaxin)、レジスチン(resistin)およびレジスチン様分子、幹細胞因子、スタンニオカルシン(stanniocalcin)、ＶＥ－スタチン、サブスタンスＰ、テネイシン、ビトロネクチン、組織因子(tissue factor)、組織因子経路インヒビター、ならびに分泌タンパク質データベースに挙げられたヒト セクレトーム(secretome)中に同定された他のいずれかの＞７０００のタンパク質(Chen Y et al., 2005. Nucleic Acids Res 33 Database Issue:D169-173)、またはそのいずれかのミメティックもしくはアナログ。
[0398] さらに、本発明のＵＯＤを用いて、酵素、たとえばアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、マトリックスメタロプロテアーゼ、トロンボスポンジンＩ型モチーフをもつＡＤＡＭメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１、４、５、１３）、アミノペプチダーゼ、ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素(beta-site APP-cleaving enzyme)（ＢＡＣＥ－１および－２）、キマーゼ(chymase)、カリクレイン、リーリン(reelin)、セルピン(serpin)、またはそのいずれかのミメティックもしくはアナログをトリマー化することができる。
[0399] 同様に、本発明のＵＯＤを用いて、化学療法薬、およびトキシン、たとえば細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する小分子トキシンもしくは酵素活性トキシンまたはそのフラグメントをトリマー化して、療法目的のためのターゲティッド化合物、たとえばカリケアマイシン、シュードルナスエキソトキシン、ジフテリアトキシン、リシン(ricin)、サポリン(saporin)、アポトーシス誘導ペプチド、またはそのいずれかのアナログの力価を高めることができる。
[0400] 他の態様において、同様に、本発明のＵＯＤは、癌ワクチン用の抗原、たとえば特に結腸直腸癌抗原Ａ３３、α－フェトプロテイン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＣＤＣＰ１、癌胎児性抗原細胞接着分子、Ｈｅｒ－２、３および４、メソテリン(mesothelin)、ＣＤＣＰ１、ＮＥＴＯ－１、ＮＥＴＯ－２、シンデカン(syndecan)、ルイスＹ(LewisY)、ＣＡ－１２５、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、チロシナーゼ、上皮腫瘍抗原(epithelial tumor antigen)（ＥＴＡ）を融合するために、また感染性疾患の処置のためのウイルスエンベロープ抗原もしくは真菌抗原を融合するために、使用できる。
２．５ キメラポリペプチド構築体の製造方法
[0401] 本発明のキメラポリペプチドは、化学合成または組換え手段で製造できる。通常は、これらのキメラポリペプチドはキメラポリペプチドをコードする組換え構築体を適切な宿主細胞において発現させることにより製造されるが、適切ないかなる方法も使用できる。適切な宿主細胞にはたとえば下記のものが含まれる：昆虫細胞（たとえば、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、オートグラファ・カリフォルニアカ(Autographa californica)、カイコ(Bombyx mori)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)、およびイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコおよびげっ歯類（たとえば、ハムスター））、鳥類細胞（たとえば、ニワトリ、アヒルおよびガチョウ）、細菌（たとえば、大腸菌(Escherichia coli))、枯草菌(Bacillus subtilis)、および連鎖球菌の種(Streptococcus spp.))、酵母細胞（たとえば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorphs)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・ギリエルモンディ(Pichia guillerimondii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))、テトラヒメナ(Tetrahymena)細胞（たとえば、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile))、またはその組合わせ。多数の適切な昆虫細胞および哺乳動物細胞が当技術分野で周知である。適切な昆虫細胞には、たとえばＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、シュナイダー(Schneider)Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（親イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞系に由来する分離クローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が含まれる。適切な哺乳動物細胞には、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞；一般に、断片化したアデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換したもの）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、２９３－Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、アカゲザル胎仔肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－１６０）、メイディン・ダービー(Madin-Darby)ウシ腎(Madin-Darby bovine kidney)（“ＭＤＢＫ”）細胞、メイディン・ダービーイヌ腎（“ＭＤＣＫ”）細胞（たとえば、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ ３３０１６、ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、たとえばＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞などが含まれる。適切な鳥類細胞には、たとえばニワトリ胚性幹細胞（たとえば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚線維芽細胞、ニワトリ胚生殖細胞、アヒル細胞（たとえば、ＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞系（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）；たとえばVaccine 27:4975-4982 (2009)およびWO2005/042728に記載)、ＥＢ６６細胞などが含まれる。
[0402] 適切な昆虫細胞発現系、たとえばバキュロウイルス系は、当業者に知られており、たとえばSummers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法はキットの形で、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されている。鳥類細胞発現系も当業者に知られており、たとえばU.S. Pat. No. 5,340,740; 5,656,479; 5,830,510; 6,114,168; および 6,500,668; European Patent No. EP 0787180B; European Patent Application No. EP03291813.8; WO 03/043415; および WO 03/076601に記載されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系も当業者に知られており、たとえばYeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londonに記載されている。
[0403] 本発明のキメラポリペプチドをコードする組換え構築体は、適切なベクターにおいて一般的方法を用いて製造することができる。昆虫または哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現のための多数の適切なベクターが当技術分野で周知かつ一般的である。適切なベクターは多数の構成要素を含むことができ、それには１以上の下記のものが含まれるが、それらに限定されない：複製起点；選択マーカー遺伝子；１以上の発現制御エレメント、たとえば転写制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１以上の翻訳シグナル；ならびに選択した宿主細胞における分泌経路をターゲティングするためのシグナル配列またはリーダー配列（たとえば、哺乳動物起源のもの、またはヘテロロガス哺乳動物もしくは非－哺乳動物の種に由来するもの）。たとえば、昆虫細胞における発現に適したバキュロウイルス発現ベクター、たとえばｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組換えバキュロウイルス粒子を作製することができる。バキュロウイルス粒子を増幅させ、昆虫細胞の感染に使用して組換えタンパク質を発現させる。哺乳動物細胞における発現のために、希望する哺乳動物宿主細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）における発現を推進するベクターを使用する。
[0404] キメラポリペプチドはいずれか適切な方法を用いて精製できる。沈殿法、ならびにたとえば疎水性相互作用、イオン交換、アフィニティー、キレーティングおよびサイズ排除を含めた種々のタイプのクロマトグラフィーが当技術分野で周知である。適切な精製スキームは、これらまたは他の適切な方法のうち２以上を用いて実施できる。所望により、キメラポリペプチドは、セクション２．１．２に記載したように、精製を容易にする精製部分または“タグ”を含むことができる。そのようなタグ付きポリペプチドを、たとえば調整培地からキレーティングクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製できる。
[0405] キメラポリペプチドは追加配列を含むことができる。たとえば、発現の目的で、対象とするヘテロロガスポリペプチドの天然リーダー配列（たとえば、エンベロープウイルス融合タンパク質の天然リーダーペプチド）を異なるものに置き換えてもよい。
３．キメラポリペプチドの内在性産生のための核酸構築体
[0406] 本発明は、宿主生物、適切には脊椎動物、好ましくは哺乳動物、たとえばヒト）においてキメラポリペプチドを内在性産生するための核酸構築体をも考慮に入れる。核酸構築体は、自己複製する染色体外ベクター／レプリコン（たとえば、プラスミド）、または宿主ゲノム内へ組み込まれるベクターであってもよい。特定の態様において、核酸構築体はウイルスベクターである。代表的なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、フラビウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターは、生きているもの、弱毒化したもの、複製条件付き(replication conditional)または複製欠損性(replication deficient)であってもよく、一般に非病原性（欠如(defective)）、複製コンピテントウイルスベクターである。
[0407] たとえば、ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである場合、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをワクシニアウイルスベクターゲノムの非必須部位に挿入することができる。そのような非必須部位は、たとえばPerkus et al. (1986. Virology 152:285); Hruby et al. (1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3411); Weir et al. (1983. J. Virol. 46:530)に記載されている。ワクシニアウイルスに使用するのに適切なプロモーターにはＰ７．５（参照：たとえば、Cochran et al. 1985. J. Virol. 54:30)；Ｐ１１（参照：たとえば、Bertholet, et al., 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2096)；およびＣＡＥ－１（参照：たとえば、Patel et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9431)が含まれるが、これらに限定されない。高度に弱毒化したワクシニアの株の方がヒトに使用するものとして許容でき、それにはＬｉｓｔｅｒ、ＮＹＶＡＣ（特異的ゲノム欠失を含む）（参照：たとえば、Guerra et al., 2006. J. Virol. 80:985-998); Tartaglia et al., 1992. AIDS Research and Human Retroviruses 8:1445-1447)、またはＭＶＡ（参照：たとえば、Gheradi et al., 2005. J. Gen. Virol. 86:2925-2936); Mayr et al., 1975. Infection 3:6-14)が含まれる。Hu et al. (2001. J. Virol. 75:10300-10308), 癌療法のためのベクターとしてのヤバ様病(Yaba-Like disease)ウイルスの使用を記載); U.S. Pat. No. 5,698,530および6,998,252も参照されたい。たとえば、U.S. Pat. No. 5,443,964も参照されたい。U.S. Pat. No. 7,247,615および7,368,116も参照されたい。
[0408] ある態様において、目的とするキメラポリペプチドを発現させるためにアデノウイルスベクターを使用できる。ウイルストランスファーベクターのベースとなりうるアデノウイルスは、いかなる起源、いかなるサブグループ、いかなるサブタイプ、サブタイプの混合物、またはいかなる血清型のものであってもよい。たとえば、アデノウイルスはサブグループＡ（たとえば、血清型１２、１８、および３１）、サブグループＢ（たとえば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、および５０）、サブグループＣ（たとえば、血清型１、２、５、および６）、サブグループＤ（たとえば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、および４２～４８）、サブグループＥ（たとえば、血清型４）、サブグループＦ（たとえば、血清型４０および４１）、未分類血清グループ（たとえば、血清型４９および５１）、または他のいずれかのアデノウイルス血清型のものであってもよい。アデノウイルス血清型１～５１はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，バージニア州マナッサス）から入手できる。非－グループＣ アデノウイルス、および非ヒトアデノウイルスすら、複製欠損性アデノウイルスベクターを作製するために使用できる。非－グループＣ アデノウイルスベクター、非－グループＣ アデノウイルスベクターを作製する方法、および非－グループＣ アデノウイルスベクターを使用する方法は、たとえばU.S. Pat. No. 5,801,030、5,837,511および5,849,561、ならびにInternational Patent Application WO 97/12986およびWO 98/53087に開示されている。いかなるアデノウイルスも、キメラアデノウイルスですら、アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムの供給源として使用できる。たとえば、ヒトアデノウイルスを複製欠損性アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムの供給源として使用できる。アデノウイルスベクターのさらなる例を、Molin et al. (1998. J. Virol. 72:8358-8361), Narumi et al. (1998. Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-941), Mercier et al. (2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-6193), U.S.Publication No. 20150093831, 20140248305, 20120283318, 20100008889, 20090175897および20090088398、ならびにU.S. Pat. No. 6,143,290; 6,596,535; 6,855,317; 6,936,257; 7,125,717; 7,378,087; 7,550,296に見出すことができる。
[0409] ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとすることもできる。ＡＡＶ－ベースのベクターの記載については、たとえばU.S. Pat. No. 8,679,837, 8,637,255, 8,409,842, 7,803,622, および7,790,449, ならびにU.S. Publication No. 20150065562, 20140155469, 20140037585, 20130096182, 20120100606, および20070036757を参照されたい。ＡＡＶベクターは自己相補的(self-complementary)（ｓｃ）ＡＡＶベクターであってもよく、それらはたとえばU.S. Patent Publication 2007/01110724および2004/0029106, ならびにU.S. Pat. No. 7,465,583および7,186,699に記載されている。
[0410] 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－ベースのウイルスベクターも本発明のキメラポリペプチドの内在性産生に適している。多くの複製欠損性ＨＳＶベクターが、複製を阻止するために１以上の中初期(intermediate-early)遺伝子を排除する欠失を含む。ヘルペスベクターの利点は、それが長期ＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏期に入る能力、および最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容できるそれの大型ウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶ－ベースのベクターの記載については、たとえばU.S. Pat. No. 5,837,532, 5,846,782, 5,849,572, および5,804,413, ならびにInternational Patent Application WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, およびWO 99/06583を参照されたい。
[0411] レトロウイルスベクターには、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、エコトロピック（環境栄養性）(ecotropic)レトロウイルス、類人猿免疫不全(simian immunodeficiency virus)（ＳＷ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合わせをベースとするものを含めることができる（参照：たとえば、Buchscher et al., 1992. J. Virol. 66:2731-2739; Johann et al., 1992. J. Virol. 66:1635-1640; Sommerfelt et al., 1990. Virology 176:58-59; Wilson et al., 1989. J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., 1991. J. Virol. 65:2220-2224; Miller et al., 1990. Mol. Cell Biol. 10:4239; Kolberg, 1992. NIH Res. 4:43; Cornetta et al.,1991. Hum. Gene Ther. 2:215)。
[0412] 特定の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。当業者に理解されるように、ウイルスベクター、たとえばレンチウイルスベクターは、一般にウイルスベクターゲノムを含むウイルスベクター粒子を表わす。たとえば、レンチウイルスベクター粒子はレンチウイルスベクターゲノムを含むことができる。レンチウイルスベクターに関して、そのベクターゲノムは多数の適切な入手可能なレンチウイルスゲノムをベースとするベクターに由来するものであってよく、それにはヒト遺伝子療法適用のために同定されたものが含まれる（参照：たとえば、Pfeifer et al., 2001. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211)。適切なレンチウイルスベクターゲノムには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、ＨＩＶ－２、ネコ免疫不全（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血症ウイルス、類人猿免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ／ビスナ(maedi/visna)ウイルスをベースとするものが含まれる。レンチウイルスの望ましい特性はそれらが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染できることであるが、ターゲット細胞は分裂中の細胞であるかまたは分裂するように刺激されている必要はない。一般に、ゲノムとエンベロープ糖タンパク質は異なるウイルスをベースとし、したがって得られるウイルスベクター粒子はシュードタイプ化されている(pseudotyped)。ウイルスベクターの安全機能を取り込むのが望ましい。安全機能には、本明細書中にさらに詳細に記載するように自己不活化(self-inactivating)ＬＴＲおよび組込み欠損が含まれる。ある態様において、組込み欠損はベクターゲノムのエレメントにより付与できるが、パッケージング系のエレメントから誘導することもできる（たとえば、ベクターゲノムの一部ではなくトランスで供給してもよい非機能性インテグラーゼタンパク質）。代表的なベクターは、パッケージングシグナル(packaging signal)（ｐｓｉ）、Ｒｅｖ応答エレメント(Rev-responsive element)（ＲＲＥ）、スプライスドナー、スプライスアクセプター、場合によりセントラルポリプリントラクト(central poly-purine tract)（ｃＰＰＴ）、およびＷＰＲＥエレメントを収容している。ある代表的な態様において、ウイルスベクターゲノムはレンチウイルスゲノム、たとえばＨＩＶ－１ゲノムまたはＳＩＶゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構築体は、レンチウイルスの５’および３’ＬＴＲからの配列を含むことができ、特にレンチウイルスの５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列ならびにレンチウイルスからの不活化したまたは自己不活化３’ＬＴＲを含むことができる。ＬＴＲ配列は、いずれのレンチウイルスのいずれの種に由来するＬＴＲ配列であってもよい。たとえば、それらはＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶからのＬＴＲ配列であってもよい。一般に、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。
[0413] ベクターゲノムは、不活化したまたは自己不活化３’ＬＴＲを含むことができる（参照：たとえば、Zufferey et al., 1998. J. Virol. 72: 9873; Miyoshi et al., 1998. J. Virol. 72:8150)。自己不活化ベクターは、一般に３’側の長い末端反復配列(long terminal repeat)（ＬＴＲ）からエンハンサーおよびプロモーター配列を欠失し、それはベクター組込みに際して５’ＬＴＲ中へコピーされる。一例において、３’ＬＴＲのＵ３エレメントはそれのエンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、ＳｐｌおよびＮＦ－カッパＢの部位の欠失を含む。３’ＬＴＲの自己不活化の結果として、侵入および逆転写の後に生成するプロウイルスは不活化した５’ＬＴＲを含むであろう。その理論的根拠は、ベクターゲノムの移動のリスクおよび近辺の細胞プロモーターに対するＬＴＲの影響を低減することによって安全性を改善することである。自己不活化３’ＬＴＲは当技術分野で知られているいずれかの方法により構築できる。
[0414] 場合により、レンチウイルス５’ＬＴＲからのＵ３配列をウイルス構築体においてプロモーター配列、たとえばヘテロロガスプロモーター配列で置き換えることができる。これにより、パッケージング細胞系から回収されるウイルスの力価を増大させることができる。エンハンサー配列も収容することができる。パッケージング細胞系におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を増大させるエンハンサー／プロモーター組合わせをいずれも使用できる。一例において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列を使用する（参照：たとえば、U.S. Pat. No. 5,385,839および5,168,062)。
[0415] ある態様において、レンチウイルスベクターを組込み欠損性であるように構築することにより、挿入変異形成のリスクを最小限に抑える。非組込み型ベクターゲノムを作製するために多様なアプローチを遂行できる。これらのアプローチは、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素構成要素中へ、それが不活性インテグラーゼをもつタンパク質をコードするように変異（単数または複数）を工学的に作製することを伴なう。たとえば、一方または両方の付着部位を変異または欠失させることにより、あるいは３’ＬＴＲ－近位ポリプリン区画(proximal polypurine tract)（ＰＰＴ）を欠失または修飾によって非機能性にすることにより、ベクターゲノム自体を修飾して組込みを阻止することができる。さらに、非遺伝学的アプローチを利用できる；これらには、インテグラーゼの１以上の機能を阻害する薬理作用物質が含まれる。これらのアプローチは相互排他的ではなく、すなわちそれらのうち１より多くを同時に使用できる。たとえば、インテグラーゼと付着部位の両方が非機能性であってもよく、あるいはインテグラーゼとＰＰＴ部位が非機能性であってもよく、あるいは付着部位とＰＰＴ部位が非機能性であってもよく、あるいはそれらのすべてが非機能性であってもよい。
[0416] 代表的なレンチウイルスベクターは、たとえばU.S. Publication No. 20150224209, 20150203870, 20140335607, 20140248306, 20090148936, および20080254008に記載されている。
[0417] ウイルスベクターはアルファウイルス属(Alpha virus)をベースとしてもよい。アルファウイルスには下記のものが含まれる：シンドビス(Sindbis)ウイルス（およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ））、アウラ(Aura)ウイルス、ババンキ(Babanki)ウイルス、バルマ森林(Barmah Forest)ウイルス、ババル(Bebaru)ウイルス、キャバッソウ(Cabassou)ウイルス、チクングニア(Chikungunya)ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズ(Everglades)ウイルス、フォートモルガン(Fort Morgan)ウイルス、ゲタ(Getah)ウイルス、ハイランドＪ(Highlands J)ウイルス、クイズールアガッシュ(Kyzylagach)ウイルス、マヤロ(Mayaro)ウイルス、メトリ(Me Tri)ウイルス、ミッデルブルグ(Middelburg)ウイルス、モッソダスペドラス(Mosso das Pedras)ウイルス、ムカンボ(Mucambo)ウイルス、ヌドゥム(Ndumu)ウイルス、オニョンニョン(O'nyong-nyong)ウイルス、ピクスナ(Pixuna)ウイルス、リオネグロ(Rio Negro)ウイルス、ロスリバー(Ross River)ウイルス、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林(Semliki Forest)ウイルス（ＳＦＶ）、南ゾウアザラシウイルス、トナテ(Tonate)ウイルス、トロカラ(Trocara)ウイルス、ウナ(Una)ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびワタロア(Whataroa)ウイルス。一般に、そのようなウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質において翻訳できる非構造タンパク質（たとえば、レプリコン）および構造タンパク質（たとえば、カプシドおよびエンベロープ）をコードする。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、ＳＦＶ、およびＶＥＥＶはすべて、導入遺伝子送達のためのウイルストランスファーベクターを開発するために用いられている。シュードタイプ化ウイルスは、アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスカプシドを組み合わせることにより形成できる。アルファウイルスベクターの例は、U.S. Publication No. 20150050243, 20090305344, および20060177819中に見出すことができる。
[0418] あるいは、ウイルスベクターは、フラビウイルス(flavivirus)をベースとすることができる。フラビウイルスには下記のものが含まれる：日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス（たとえば、Ｄｅｎｇｕｅ－１、Ｄｅｎｇｕｅ－２、Ｄｅｎｇｕｅ－３、Ｄｅｎｇｕｅ－４）、黄熱病ウイルス、マレーバレー脳炎(Murray Valley encephalitis)ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、クンジン(Kunjin)ウイルス、ロシオ脳炎(Rocio encephalitis)ウイルス、イレウス(Ilheus)ウイルス、ダニ媒介性脳炎(Tick-borne encephalitis)ウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、シベリア脳炎(Siberian encephalitis)ウイルス、ロシア春夏脳炎(Russian Spring-Summer encephalitis)ウイルス、キャサヌール森林病(Kyasanur Forest Disease)ウイルス、オムスク出血熱(Omsk Hemorrhagic fever)ウイルス、跳躍病(Louping ill)ウイルス、ポワッサン(Powassan)ウイルス、根岸(Negishi)ウイルス、アブセタロフ(Absettarov)ウイルス、ハンサロバ(Hansalova)ウイルス、アポイ(Apoi)ウイルス、およびヒプル(Hypr)ウイルス。フラビウイルスベクターの例は、U.S. Publication No. 20150231226, 20150024003, 20140271708, 20140044684, 20130243812, 20120294889, 20120128713, 20110135686, 20110014229, 20110003884, 20100297167, 20100184832, 20060159704, 20060088937, 20030194801および20030044773中に見出すことができる。
４．キメラポリペプチド複合体
[0419] 本発明のキメラポリペプチドは適切な条件下で自己組織化してキメラポリペプチド複合体を形成することができる。したがって、本発明はさらにキメラポリペプチド複合体を製造する方法であって、下記を含む方法を包含する：キメラポリペプチドを、キメラポリペプチド複合体の形成に適した条件下で（たとえば水溶液中で）結合させ、それにより、３つのキメラポリペプチドを含み、キメラポリペプチドのそれぞれの構造形成部分のコイルドコイル構造により形成された６ヘリックスバンドルを特徴とするキメラポリペプチド複合体を製造する。結合するキメラポリペプチドは同一または非同一であってよく、それによりそれぞれホモトリマーおよびヘテロトリマーが形成される。
[0420] 一般に、キメラポリペプチドは緩衝化水溶液（たとえば、ｐＨ約５～約９）中で自己組織化する。必要であれば、再フォールディングおよび自己組織化を促進するために緩和な変性条件を採用して、たとえば尿素、少量の有機溶媒の含有、または熱によって、キメラポリペプチドを緩和に変性させることができる。
[0421] 適切なキメラポリペプチド調製物をいずれもこの方法に使用できる。たとえば、希望するキメラポリペプチドを含有する調整した細胞培養培地をこの方法に使用できる。しかし、精製したキメラポリペプチドをこの方法に使用することが好ましい。
[0422] エクトドメインポリペプチドをオリゴマー化するために構造安定化部分／ユニバーサルオリゴマー化ドメインを用いてキメラポリペプチド複合体を形成する特定の態様において、複合体のエクトドメインポリペプチドサブユニットは融合前コンホメーションにある。いずれか特定の理論により拘束されることは望まないが、ヘテロロガスな構造安定化部分が複合体形成を誘発し、エクトドメインポリペプチドの内部部分またはドメイン（たとえば、クラスＩエクトドメインポリペプチドのＨＲＡおよびＨＲＢ領域、またはクラスＩＩＩエクトドメインの中心のα－ヘリックス状コイルドコイルおよびＣ末端領域における融合ループ（単数または複数））が相互作用するのを阻止するので、本明細書に記載する複合体において融合前形態のエクトドメインポリペプチドトリマーが安定化すると考えられる。そのような内部部分またはドメインの相互作用は融合後形態への再フォールディングをもたらす。
５．スクリーニング方法
[0423] 本発明は、好ましくは特異的にエンベロープウイルスの融合タンパク質および／または融合タンパク質の複合体と結合する薬剤をスクリーニングする方法をも包含する。特定の態様において、エンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチドまたはその複合体への結合について化合物ライブラリーをスクリーニングする。
[0424] 候補薬剤には、小分子、たとえば小型の有機化合物、ならびに高分子、たとえばペプチド、ポリペプチドおよび多糖を含めた、多数の化合物クラスが含まれる。候補薬剤は、タンパク質との構造相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、一般に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくはこれらの官能基のうち少なくとも２つを含む。候補化合物は、前記官能基のうち１以上で置換された炭素環式もしくは複素環式構造体または芳香族もしくは多環式芳香族構造体を含むことができる。候補薬剤は生体分子中にもみられ、それには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはその組合わせ。化合物ライブラリーは細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形の天然化合物を含むことができる。あるいは、またはさらに、化合物ライブラリーは天然化合物または合成により製造された化合物を含むことができる。
[0425] 薬剤がターゲットタンパク質に結合するかどうか、および／またはターゲットタンパク質に対する薬剤の親和性を判定するための方法は当技術分野で知られている。たとえば、ターゲットタンパク質への薬剤の結合は、多様な手法、たとえば（それらに限定されない）バイオレイヤー干渉法(BioLayer Interferometry)（ＢＬＩ）、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）もしくはＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ、または質量分析ベースの方法を用いて検出および／または定量することができる。
[0426] ある態様において、薬剤と本発明のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチドまたは複合体との相互作用の動力学的パラメーターを解明するための当技術分野で知られているいずれかの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを用いて薬剤をアッセイすることができる。下記のものを含めて（それらに限定されない）市販されているいずれかのＳＰＲ機器を本明細書に記載する方法に使用できる：ＢＩＡｃｏｒｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ；スウェーデン、ウプサラ）；１Ａｓｙｓ機器（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ；マサチュセッツ州フランクリン）；ＩＢＩＳシステム（Ｗｉｎｄｓｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ；英国バークシャー州）；ＳＰＲ－ＣＥＬＬＩＡシステム（日本レーザー電子株式会社；日本、北海道）、およびＳＰＲ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｐｒｅｅｔａ（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；テキサス州ダラス）。たとえば、Mullett et al. (2000) Methods 22: 77-91; Dong et al. (2002) Reviews in Mol Biotech 82: 303-323; Fivash et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 97-101; および Rich et al. (2000) Curr Opin Biotechnol 11: 54-61を参照されたい。
[0427] ある態様において、薬剤と本発明のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチドまたは複合体との生体分子相互作用は、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ．）でＢＬＩを用いてアッセイすることができる。ＢＬＩは、バイオセンサーチップ上に固定化したリガンド（たとえば、本発明のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチドまたは複合体）と被分析体（たとえば、被験化合物）との結合を、溶液中で、バイオセンサーチップ上のタンパク質層の厚さの変化をリアルタイムで測定することにより感知する無標識光学分析法である。
[0428] ある態様において、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）アッセイを用いて本発明のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチドまたは複合体への被験薬剤の結合を解明することができる。頭字語ＡＬＰＨＡは、増幅型発光近接ホモジニアスアッセイ(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)を表わす。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎは、ドナービーズとアクセプタービーズ間のエネルギー伝達により生じる信号を測定することにより、ドナービーズとアクセプタービーズに付着した分子間（たとえば、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体と被験化合物）の結合を感知するビーズ－ベースの近接アッセイである（参照：たとえば、Eglen et al. (2008) Curr Chem Genomics 1:2-10)。
[0429] ある態様において、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）アッセイを用いて本発明のキメラポリペプチドまたは複合体への被験薬剤の結合を解明することができる。ＡｌｐｈａＬＩＳＡは、ユーロピウム含有アクセプタービーズを含むように前記のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイから改変され、従来のＥＬＩＳＡアッセイの別法として機能する（参照：たとえば、Eglen et al. (2008) Curr Chem Genomics 1:2-10.)。
[0430] 競合および非競合イムノアッセイを含めた多様なイムノアッセイ法を使用できる。用語“イムノアッセイ”は、限定ではなく下記のものを包含する：フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、たとえば酵素増幅イムノアッセイ法(enzyme multiplied immunoassay technique)（ＥＭＩＴ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕獲ＥＬＩＳＡ(IgM antibody capture ELISA)（ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ）および微粒子エンザイムイムノアッセイ(microparticle enzyme immunoassay)（ＭＥＩＡ）、さらに、キャピラリー電気泳動イムノアッセイ（ＣＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ(immunoradiometric assay)（ＩＲＭＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ(fluorescence polarization immunoassay)（ＦＰＩＡ）および化学発光アッセイ（ＣＬ）。所望により、そのようなイムノアッセイを自動化することができる。イムノアッセイをレーザー誘導蛍光と併用することもできる。リポソームイムノアッセイ、たとえばフローインジェクションリポソームイムノアッセイおよびリポソームイムノセンサーも本発明に使用するのに適している。さらに、たとえばタンパク質／抗体複合体の形成の結果として光散乱が増大し、それがマーカー濃度の関数としてのピーク速度信号に変換されるネフェロメトリー(nephelometry)アッセイが本発明方法に使用するのに適している。
[0431] ある態様において、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体への被験薬剤の結合は、示差走査蛍光光度測定(differential scanning fluorimetry)（ＤＳＦ）および示差静的光散乱(differential static light scattering)（ＤＳＬＳ）を伴なう熱変性法を用いてアッセイすることができる。
[0432] ある態様において、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体への被験薬剤の結合は、質量分析ベースの方法、たとえば（それに限定されない）質量分析にカップリングした親和性セレクション(affinity selection coupled to mass spectrometry)（ＡＳ－ＭＳ）プラットフォームを用いてアッセイすることができる。これは無標識方法であり、そのタンパク質と被験化合物をインキュベートし、結合しなかった分子を洗浄除去し、タンパク質－リガンド複合体を脱複合体化工程後にリガンド同定のためにＭＳにより分析する。
[0433] ある態様において、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体への被験薬剤の結合は、たとえば検出可能な状態に標識されたタンパク質、たとえば放射性標識（たとえば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（たとえば、ＦＩＴＣ）、または酵素標識されたキメラポリペプチドもしくは複合体または被験化合物を用いて、イムノアッセイにより、またはクロマトグラフィー検出により、定量できる。
[0434] ある態様において、本発明はキメラポリペプチドまたは複合体と被験化合物の相互作用の程度を直接または間接的に測定する際の、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を考慮する。
[0435] 前記の態様はすべてハイスループットプラットフォームへの発展に適している。
[0436] 化合物をさらに動物モデルにおいて試験して、最も有効なインビボ効果をもつ化合物、たとえばエンベロープウイルスの融合タンパク質または融合タンパク質の複合体に特異的に結合して、好ましくは療法に有用な効果、たとえばウイルス負荷の低減、感染症またはそれに伴なう症状の軽減を刺激または増強するものを同定することができる。たとえばそれらの化合物に、妥当な薬物設計に用いられる連続修飾、分子モデリング、および他のルーティン操作を施すことにより、これらの分子をさらなる医薬開発のための“リード化合物”として使用できる。
５．抗原結合分子
[0437] 本発明のエクトドメイン含有キメラポリペプチドおよび複合体は、抗原結合分子、好ましくはエンベロープウイルス融合タンパク質と免疫相互作用性であるタンパク質（すなわち、“抗原結合タンパク質”）を製造するのに有用である。特定の態様において、エクトドメイン含有キメラポリペプチドおよび複合体はエンベロープウイルス融合タンパク質の融合後形態には存在しない少なくとも１つの融合前エピトープを含み、したがってエンベロープウイルス融合タンパク質の準安定または融合前形態と免疫相互作用性である抗原結合分子の製造に有用である。
[0438] 当業者は抗原結合タンパク質に基づく十分に発展した知識、たとえば下記に述べられたものを認識しているであろう：Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010) または Murphey et al., Janeway's Immunobiology, 8th ed., Garland Science (2011)；それらのそれぞれを全体として本明細書に援用する。
[0439] ある態様において、本発明のキメラポリペプチドおよび複合体と免疫反応性である抗原結合タンパク質は抗体である。抗体には、定義のセクションに記載したように、無傷抗体およびその抗原結合フラグメントが含まれる。抗体は完全抗体分子（全長の重鎖および／または軽鎖をもつポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、またはヒト形を含む）を含むことができ、あるいはその抗原結合フラグメントを含むことができる。抗体フラグメントには、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、およびＦｄフラグメントが含まれ、それらを単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディー、ミニボディー、イントラボディー、ディアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖ中へ組み込むことができる（参照：たとえば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136)。フィブロネクチンポリペプチドモノボディーを含めた抗体ポリペプチド、たとえばU.S. Pat. No. 6,703,199に開示されたものも含まれる。一本鎖ポリペプチドである他の抗体ポリペプチドが、U.S. Patent Publication 2005/0238646に開示されている。
[0440] 目的とする抗原に対する抗体を製造する多数の方法が当技術分野で知られている。たとえば、本発明のキメラポリペプチドおよび複合体に対するモノクローナル抗体は、しばしばKohler, G. et al. (1975, “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity”, Nature 256:495-497)の有望な方法またはその改変法を基礎とする一般的なハイブリドーマ法を用いて作製できる。一般に、モノクローナル抗体は非ヒト種、たとえばマウスにおいて開発される。一般に、マウスまたはラットを免疫化に用いるが、他の動物も使用できる。抗体は、マウスを免疫原量の免疫原、この場合は本発明のキメラポリペプチドまたは複合体で免疫化することにより製造できる。免疫原を周期的間隔で多数回、たとえば隔週または毎週、投与することができ、あるいは動物の生存性を維持するような方法で投与することができる。
[0441] 抗体応答をモニターするために、少量の生体試料（たとえば、血液）を動物から入手し、免疫原に対する抗体力価を試験することができる。脾臓および／または幾つかの大型リンパ節を摘出し、解離させて単一細胞にすることができる。所望により、抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することによって脾臓細胞をスクリーニングすることができる（非特異的に付着する細胞を除去した後に）。その抗原に対して特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ－細胞はプレートに結合し、残りの懸濁液と共にすすぎ去られることはない。得られたＢ－細胞またはすべての解離した脾臓細胞を、次いで骨髄腫細胞（たとえば、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（カリフォルニア州サンディエゴ）からのもの）と融合させることができる。脾臓またはリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用できる。ハイブリドーマを次いで選択培地（たとえば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、あるいは“ＨＡＴ培地”として知られる）中で培養する。得られるハイブリドーマを次いで限界希釈によりプレーティングし、たとえばＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）または免疫組織化学（ＩＨＣ）スクリーニングを用いて、免疫原に特異的に結合する抗体の産生についてアッセイする。選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを次いでインビトロ（たとえば、組織培養ボトルまたは中空繊維反応器内）、またはインビボ（たとえば、マウスにおいて腹水として）のいずれかで培養する。
[0442] 細胞融合法の他の別法として、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）－不死化Ｂ細胞を用いて、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体と免疫相互作用するモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマを所望により増殖させてサブクローニングし、上清を一般的アッセイ法（たとえば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなど）により抗免疫原活性についてアッセイする。
[0443] よって、本発明はさらに、エンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体と免疫相互作用性である抗原結合分子を製造する方法であって、下記を含む方法を考慮する：（１）動物を、前記および他の箇所に概括的に記載したキメラポリペプチド複合体または組成物で免疫化し、その際、キメラポリペプチド複合体のエクトドメインポリペプチドはエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する；（２）融合タンパク質またはその複合体と免疫相互作用性であるＢ細胞をその動物から同定および／または単離する；そして（３）そのＢ細胞が発現した抗原結合分子を製造する。本発明は、そのような方法により製造された抗原結合分子およびその誘導体をも包含する。本発明の抗原結合分子を産生できるハイブリドーマを含む細胞、および抗原結合分子をそれらの細胞から製造する方法をも包含する。特定の態様において、本発明の方法および細胞により製造された抗原結合分子は、好ましくは中和性の抗原結合分子である。
[0444] キメラ抗体およびヒト化抗体も考慮する。ある態様において、ヒト化モノクローナル抗体はネズミ抗体の可変ドメイン（またはその抗原結合部位の全部もしくは一部）およびヒト抗体に由来する定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体フラグメントはネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する可変ドメインフラグメント（抗原結合部位を欠如）を含むことができる。工学操作したモノクローナル抗体の作製のための方法には、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934, および Winter et al., 1993, TIPS 14:139に記載されたものが含まれる。一態様において、キメラ抗体はＣＤＲグラフト抗体である。抗体をヒト化するための手法は、たとえばU.S. Pat. No. 5,869,619; 5,225,539; 5,821,337; 5,859,205; 6,881,557, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39, Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41, Zhang, W., et al., Molecular Immunology 42(12):1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods 36(1):35-42, 2005; Dall'Acqua W F, et al., Methods 36(1):43-60, 2005; および Clark, M., Immunology Today 21(8):397-402, 2000において考察されている。
[0445] 本発明の抗体は、完全ヒト－モノクローナル抗体であってもよい。完全ヒト－モノクローナル抗体は、当業者に自明である多数の手法により作製できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ヒト末梢血細胞（たとえば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫化、挿入ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化トランスジェニックマウスからの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野で知られている他の方法であって本明細書の開示に基づくもの。
[0446] ヒトモノクローナル抗体を非ヒト動物において生成させる方法が開発された。たとえば、１以上の内在性免疫グロブリン遺伝子を種々の手段で不活化したマウスが作製された。ヒト免疫グロブリン遺伝子をそのマウスに導入して、不活化されたマウス遺伝子と置き換えた。この手法で、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲティッド破壊を含む胚性幹細胞系に由来するマウスの系統に導入する(Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)をも参照されたい)。たとえば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、ミニ遺伝子構築体、または酵母人工染色体上のトランス遺伝子座であってもよく、それらはマウスリンパ様組織においてＢ細胞特異的なＤＮＡ再配列および超変異を行なう。
[0447] その動物において産生された抗体は、その動物に導入されたヒト遺伝子材料によりコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を含む。一態様において、非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスを、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体である免疫原で免疫化する。
[0448] トランスジェニック動物をヒト抗体または部分的ヒト抗体の産生のために作製および使用する手法の例は、下記に記載されている：U.S. Pat. No. 5,814,318, 5,569,825, および5,545,806, Davis et al., Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200 (2003), Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al., 2000, Eur J. Immun. 30:534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics 42:413-21, Mendez et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity 1:247-60, Green et al., 1994, Nat. Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:2551-55. Chen, J., M. et al. Int. Immunol. 5 (1993): 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51, Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotech. 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, Int. Immunol. 6: 579-91, Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 3720-24, および Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912-20.; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immunol. 6:579, 1994; U.S.Pat. No. 5,877,397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995. Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35。さらに、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，現在はＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を伴なうプロトコルが、たとえばU.S. 05/0118643およびWO 05/694879, WO 98/24838, WO 00/76310, およびU.S. Pat. No. 7,064,244に記載されている。
[0449] 本発明はさらに、本発明の抗－キメラポリペプチド／複合体抗体－フラグメントを包含する。そのようなフラグメントは全体が抗体由来の配列からなることができ、あるいは追加配列を含むことができる。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ディアボディー、トリアボディー、テトラボディー、およびドメイン抗体が含まれる。他の例は、Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06に提示されている。
[0450] 一本鎖抗体は、アミノ酸橋（短いペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖の可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを連結させて単一のポリペプチド鎖にすることにより形成できる。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡの間に、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることにより製造された。得られるポリペプチドは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、自然にフォールドバックして抗原結合モノマーを形成することができるか、あるいはそれらはマルチマー（たとえば、ダイマー、トリマー、またはテトラマー）を形成することができる(Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng.18:95-108)。異なるＶＬとＶＨを含むポリペプチドを結合させることにより、異なるエピトープに結合するマルチマー型ｓｃＦｖを形成することができる(Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40)。一本鎖抗体の製造のために開発された手法には、U.S. Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87に記載されたものが含まれる。
[0451] 抗体に由来する抗原結合フラグメントは、たとえば抗体のタンパク質分解性加水分解により、たとえば全抗体を一般的方法に従ってペプシンまたはパパイン消化することにより得ることもできる。たとえば、抗体フラグメントは、抗体をペプシンで酵素開裂してＦ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを得ることにより製造できる。チオール還元剤を用いてこのフラグメントをさらに開裂して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを製造することができる。場合により、開裂反応はジスルフィド結合の開裂から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて実施することができる。別法として、パパインを用いる酵素開裂は、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、たとえばGoldenberg, U.S. Pat. No. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); および Andrews, S. M. and Titus, J. A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J. E., et al., eds), John Wiley & Sons, New York (2003), pages 2.8.1-2.8.10 および 2.10A.1-2.10A.5に記載されている。抗体を開裂するための他の方法、たとえば重鎖を分離して一価軽鎖－重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成し、フラグメントをさらに開裂するもの、あるいは他の酵素的、化学的または遺伝学的手法も、それらのフラグメントが無傷抗体により認識される抗原に結合する限り使用できる。
[0452] 他の形態の抗体フラグメントは、抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲは、目的とするＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することにより得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、たとえば抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として用いて可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより製造できる。(参照：たとえば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”, in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); および Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995))。抗体フラグメントはさらに、本明細書に記載する抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインを含むことができる。よって、たとえばＶ領域ドメインはモノマー状であって、独立して少なくとも１０－７Ｍに等しいかまたはそれ未満の親和性で本発明のエクトドメインポリペプチドまたは複合体に結合することができるＶＬおよびＶＨドメインであってもよい。
[0453] 可変領域ドメインは天然可変ドメインまたはその工学操作バージョンのいずれであってもよい。工学操作バージョンは、組換えＤＮＡ工学手法を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。そのような工学操作バージョンには、たとえば特異的抗体の可変領域からその特異的抗体のアミノ酸配列における、または配列への、挿入、欠失または変化により作製されたものが含まれる。具体例には、第１抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲおよび場合により１以上のフレームワークアミノ酸、ならびに第２抗体に由来する可変領域ドメインの残部を含む、工学操作された可変領域ドメインが含まれる。
[0454] 可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメントに共有結合していてもよい。よって、たとえば可変領域ドメインに存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそのフラグメントに連結していてもよい。同様に、ＶＬドメインはＣＫドメインまたはそのフラグメントに連結していてもよい。こうして、たとえば抗体は、抗原結合ドメインがそれらのＣ末端においてそれぞれＣＨ１およびＣＫドメインに共有結合している会合ＶＨおよびＶＬドメインを含むＦａｂフラグメントであってもよい。ＣＨ１ドメインは、Ｆａｂ’フラグメント中にみられるヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部を付与するために、あるいはさらなるドメイン、たとえばＣＨ２およびＣＨ３ドメインを付与するために、さらなるアミノ酸で延長されてもよい。
７．組成物
[0455] 本発明はさらに、前記および他のいずれかの箇所に概括的に記載したキメラポリペプチドもしくは複合体、またはそのキメラポリペプチドもしくは複合体を発現させることができる核酸構築体を含む、医薬組成物を含めた組成物を提供する。代表的な組成物は、キメラポリペプチドまたは複合体の目的用途に従って選択される緩衝剤を含むことができ、意図する用途に適した他の物質をも含むことができる。意図する用途が免疫応答を誘導することである場合、組成物は“免疫原”または“免疫調節”組成物と呼ばれる。そのような組成物には、予防用組成物（すなわち、感染症などの状態を予防する目的で投与する組成物）および治療用組成物（すなわち、感染症などの状態を治療する目的で投与する組成物）が含まれる。したがって、本発明の免疫調節組成物は予防、改善、対症処置または治療のためにレシピエントに投与できる。
[0456] 当業者は適切な緩衝剤を容易に選択でき、意図する用途に適した多種多様な緩衝剤が当技術分野で知られている。ある例において、組成物は医薬的に許容できる賦形剤を含むことができ、その多様なものが当技術分野で知られており、ここで詳細に考察する必要はない。医薬的に許容できる賦形剤は、たとえば下記のものを含めた多様な刊行物に詳細に記載されている：A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7.sup.th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; および Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3.sup.rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.。
[0457] ある態様において、組成物は１より多い（すなわち、異なる）本発明のキメラポリペプチドまたは複合体（たとえば、その各エクトドメインポリペプチドが異なるエンベロープウイルス融合タンパク質に対応するキメラポリペプチド）、あるいはそれからキメラポリペプチド（単数または複数）または複合体（単数または複数）を発現できる１以上の核酸構築体を含む。
[0458] 本発明の医薬組成物は、注射による投与に適した形態、経口摂取に適した配合物（たとえば、カプセル剤、錠剤、カプレット、エリキシル剤)、局所適用に適した軟膏剤、クリーム剤またはローション剤の形態、点眼剤としての送達に適した形態、吸入、たとえば鼻内吸入もしくは口腔吸入による投与に適したエアゾール剤、または非経口投与、すなわち皮下、筋肉内もしくは静脈無内注射に適した形態であってもよい。
[0459] 補助的な有効成分、たとえばアジュバントまたは生物学的応答改変剤も本発明の医薬組成物に含有させることができる。アジュバント（単数または複数）を本発明の医薬組成物に含有させることができるが、それらは必ずしもアジュバントを含む必要はない。そのような場合、アジュバントの使用から生じる反応源性の問題を避けることができる。
[0460] 一般に、本発明の医薬組成物に関連するアジュバント活性には組成物中の免疫原成分（たとえば、本発明のキメラポリペプチドまたは複合体）により誘導される免疫応答を増強する能力（量的または質的に）が含まれるが、これに限定されない。これによって、免疫応答を生じるために必要な免疫原成分の用量またはレベルを低減することができ、および／または希望する免疫応答を生じるために必要な免疫化の回数もしくは頻度を低減することができる。
[0461] いずれか適切なアジュバントを本発明の医薬組成物に含有させることができる。たとえば、アルミニウムベースのアジュバントを使用できる。適切なアルミニウムベースのアジュバントには水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。使用できるアルミニウムベースのアジュバントの他の適切な例は、たとえばEuropean Patent No. 1216053およびUnited States Patent No. 6,372,223に記載されている。他の適切なアジュバントには、下記のものが含まれる：フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ミシガン州デトロイト）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ローウェイ）；ＡＳ－２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，ペンシルベニア州フィラデルフィア）；アルミニウム塩、たとえば水酸化アルミニウムゲル（みょうばん）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン性もしくはアニオン性に誘導体化した多糖；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａ；European Patent No. 0399843, United States Patent No. 7,029,678およびPCT Publication No. WO 2007/006939に記載のものを含めた水中油型エマルジョン；および／またはさらに他のサイトカイン、たとえばＧＭ－ＣＳＦまたはインターロイキン－２、－７もしくは－１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、コレラトキシン（ＣＴ）もしくはそれの構成成分サブユニット、熱不安定エンテロトキシン(heat labile enterotoxin)（ＬＴ）もしくはそれの構成成分サブユニット、ｔｏｌｌ様受容体リガンドアジュバント、たとえばリポ多糖（ＬＰＳ）およびその誘導体（たとえば、モノホスホリルリピドＡおよび３－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、フラビウイルスＮＳ１およびムラミルジペフチド(muramyl dipeptide)（ＭＤＰ）。
[0462] 本発明の医薬組成物をキット中において提供することができる。キットは本発明方法の実施を補助するための追加構成要素、たとえば投与デバイス（単数または複数）、緩衝液（単数または複数）、および／または希釈剤（単数または複数）を含むことができる。キットは、種々の構成要素を収容するための容器、およびキットの構成要素を本発明方法に使用するための指示を含むことができる。
８．投与量および投与経路
[0463] 組成物は、“有効量”、すなわち対象において意図する目的を達成するために有効な量で投与される。患者に投与される有効化合物（単数または複数）の量は、有益な応答、たとえば感染症に関連する少なくとも１つの症状の軽減を対象において長時間にわたって達成するために十分でなければならない。医薬有効化合物（単数または複数）の投与量または投与頻度は、年齢、性別、体重および全般的な健康状態を含めて、処置される対象に依存する可能性がある。これに関して、有効化合物（単数または複数）の厳密な投与量は専門家の判断に依存するであろう。当業者は、希望する療法転帰を得るために本発明の医薬組成物に含有させるべき本明細書に記載するキメラポリペプチドまたは複合体の有効な無毒性の量をルーティン実験により決定できるであろう。
[0464] 一般に、本発明の医薬組成物は、投与経路およびレシピエントの身体特徴（健康状態を含む）と適合する様式で、かつ希望する効果（単数または複数）（すなわち、療法有効な免疫原効果および／または防御効果）をそれが誘導する方法で投与することができる。たとえば、本発明の医薬組成物の適切な投与量は、下記のものを含めた（それらに限定されない）多様な要因に依存する可能性がある：その化合物を単剤として使用するかまたはアジュバント療法として使用するかにかかわらず対象の身体特徴（たとえば、年齢、体重、性別）、患者のＭＨＣ制限のタイプ、ウイルス感染症の進行（すなわち、病的状態）、および当業者が認識できる他の要因。本発明の医薬組成物の適切な投与量を決定する際に考慮される可能性がある多様な全般的考慮事項は、たとえばGennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; およびGilman et al., (Eds), (1990), “Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics”, Pergamon Pressに記載されている。
[0465] ある態様において、本発明のキメラポリペプチドもしくは複合体、またはキメラポリペプチドもしくは複合体をそれから発現させることができる核酸構築体の“有効量”は、希望する予防効果または治療効果を達成するために、たとえばその個体においてその感染症に関連する症状を軽減するために、および／または感染性物質の数を低減するために十分な量である。これらの態様において、有効量は、キメラポリペプチドまたは複合体で処置しなかった個体における症状または感染性物質の数と比較した場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれ以上、その個体においてその感染症に関連する症状を軽減し、および／または感染性物質の数を低減する。病原性生物による感染症の症状、およびそのような症状を測定するための方法は、当技術分野で知られている。個体における病原性生物の数を測定するための方法は、当技術分野における標準法である。
[0466] ある態様において、本発明のキメラポリペプチドもしくは複合体、またはキメラポリペプチドもしくは複合体をそれから発現させることができる核酸構築体の“有効量”は、選択した投与経路においてエンベロープウイルス融合タンパク質に対する免疫応答を誘導するために有効な量である。
[0467] ある態様において、たとえばキメラポリペプチドがヘテロロガス抗原を含む場合、“有効量”はその抗原に対する免疫応答の誘導を容易にするために有効な量である。たとえば、ヘテロロガス抗原がエクトドメインポリペプチドの由来するものとは異なる病原性生物に由来する抗原である場合、本発明のキメラポリペプチドもしくは複合体、またはキメラポリペプチドもしくは複合体をそれから発現させることができる核酸構築体の“有効量”は、その抗原に対する免疫応答の誘導、好ましくはその病原性生物による感染症または感染症に関連する症状に対するホストの保護を容易にするために有効な量である。これらの態様において、有効量は、キメラポリペプチドまたは複合体で処置しなかった個体における症状または感染性物質の数と比較した場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれ以上、その個体においてその感染症に関連する症状を軽減し、および／または感染性物質の数を低減する。病原性生物による感染症の症状、およびそのような症状を測定するための方法は、当技術分野で知られている。
[0468] あるいは、ヘテロロガス抗原が癌－または腫瘍－関連抗原である場合、本発明のキメラポリペプチドもしくは複合体、またはキメラポリペプチドもしくは複合体をそれから発現させることができる核酸構築体の“有効量”は、ある投与経路において癌または腫瘍細胞の増殖を低減または阻害し、癌もしくは腫瘍細胞の質量または癌もしくは腫瘍細胞の数を低減し、あるいは癌または腫瘍が形成される可能性を低減するのに有効な免疫応答を誘導するために有効な量である。これらの態様において、有効量は、キメラポリペプチドまたは複合体で処置しなかった個体における腫瘍の増殖および／または腫瘍細胞の数と比較した場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれ以上、その個体において腫瘍の増殖および／または腫瘍細胞の数を低減する。腫瘍の増殖および腫瘍細胞の数を測定するための方法は、当技術分野で知られている。
[0469] それぞれの投与におけるキメラポリペプチドまたは複合体の量は、一般的なワクチンに一般に付随する有意の有害な副作用なしに、コードされるエクトドメインポリペプチドに対する免疫応答を誘導し、および／または免疫防御もしくは他の免疫療法応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの具体的エクトドメインポリペプチドを使用するか、そのワクチン配合物がアジュバントを含むか否か、および多様なホスト依存要因に応じて変動するであろう。
[0470] 本発明の医薬組成物は標準経路によりレシピエントに投与することができ、それには非経口（たとえば、静脈内）が含まれるが、それに限定されない。
[0471] 本発明の医薬組成物は単独で、または追加の療法薬（単数または複数）と組み合わせてレシピエントに投与することができる。医薬組成物を療法薬（単数または複数）と共に投与する態様において、投与は同時または逐次（すなわち、医薬組成物の投与に続いて薬剤（単数または複数）を投与するか、あるいはその逆）であってよい。
[0472] 一般に、治療適用において、治療は疾患状態または症状の持続期間であってもよい。さらに、個々の投与の最適な量および間隔は、治療される疾患状態または症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される特定の個体の性質によって決まることは当業者に自明であろう。最適条件は一般的手法を用いて決定できる。
[0473] 多くの場合（たとえば、予防適用）、本発明の医薬組成物を数回または多数回投与することが望ましい可能性がある。たとえば、医薬組成物を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはより多数回、投与することができる。投与は約１週間から約１２週間までの間隔、特定の態様においては約１週間から約４週間までの間隔であってもよい。本発明の医薬組成物がターゲティングする特定の病原体または他の疾患関連成分に反復曝露される場合には、周期的な再投与が望ましい可能性がある。
[0474] 最適投与コースは一般的な処置コース決定試験を用いて確認できることも当業者に自明であろう。
[0475] ２以上のものを“組み合わせて”または“同時に”対象に投与する場合、それらを単一組成物中において同時に、または別個の組成物中において同時に、または別個の組成物中において別個の時点で投与することができる。
[0476] 本発明の特定の態様は、多数の別個の投与における医薬組成物の投与を伴なう。したがって、本明細書に記載する感染症の予防（すなわち、ワクチン接種）および治療のための方法は、多数回の別個の用量を一定期間にわたって対象に投与することを包含する。したがって、本明細書に開示する感染症の予防（すなわち、ワクチン接種）および治療のための方法は、初回抗原刺激量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。初回抗原刺激量に続いてブースター量を投与することができる。ブースターは再ワクチン接種の目的のためである可能性がある。種々の態様において、医薬組成物またはワクチンを少なくとも１回、２回、３回、またはそれより多く投与する。
[0477] 免疫応答を測定するための方法は当業者に知られている。代表的な方法には下記のものが含まれる：固相不均一アッセイ（たとえば、酵素結合イムノソルベントアッセイ）、溶液相アッセイ（たとえば、電気化学発光アッセイ）、増幅型発光近接ホモジニアスアッセイ、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色、機能性Ｔ細胞アッセイ、機能性Ｂ細胞アッセイ、機能性単球－マクロファージアッセイ、樹状細胞および細網内皮細胞アッセイ、ＮＫ細胞応答の測定、免疫細胞によるＩＦＮ－γ産生、組織または体液におけるウイルスＲＮＡ／ＤＮＡの定量（たとえば、血清もしくは他の体液または組織／臓器におけるウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの定量）、酸化的バーストアッセイ、細胞傷害性－特異性細胞溶解アッセイ、ペンタマー結合アッセイ、ならびに食作用およびアポトーシスの評価。
[0478] 具体的態様に示す本発明に対して、広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱することなく多数の変更および／または改変をなしうることは当業者に自明であろう。したがってそれらの態様はあらゆる点で例示であり、限定ではないと考えるべきである。
[0479] 本発明を容易に理解して実施できるように、特に好ましい態様を限定ではない以下の例により記載する。
実施例１
ＲＳＶ Ｆ
[0480] 本発明が融合前コンホメーションに拘束されたウイルス融合タンパク質のエクトドメインを含むキメラポリペプチドを製造できることを示すものとして、呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質について代表的な証拠を提示する。
材料および方法
キメラポリペプチド設計：
[0481] ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン、および McLellan et al., (Science, 2013, 342(6158): 592-8)による４つの部位に変異を含む（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌ）ＲＳＶ－Ｆエクトドメイン変異体（ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ）を、それぞれ、下流のＨＩＶ－１ ＧＰ１６０に由来する一対の相補的ヘプタッドリピート領域を含むヘテロロガス構造安定化部分（ＳＳＭ）に作動可能な状態で結合させた。このＳＳＭを欠如する対照エクトドメイン構築体、およびｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭに作動可能な状態で結合したＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖを含む陽性対照構築体（ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎ）を同様に製造した。関連タンパク質のアミノ酸配列を以下に提示する。
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－５２０）：
[0482]
Figure 0007291398000108
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－５２０）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0483]
Figure 0007291398000109
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－５２０）－ＤＳｃａｖ変異－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0484]
Figure 0007291398000110
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－５１３）－ＤＳｃａｖ変異－Ｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭ(McLellan et al., (Science, 2013. 342(6158):592-8)による対照):
[0485]
Figure 0007291398000111
タンパク質の発現および精製：
[0486] キメラ融合タンパク質ＲＳＶ Ｆ クランプ、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ クランプ、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎ、ならびにＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢ配列を欠如する対照ＲＳＶ Ｆエクトドメインをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を、それぞれｐＩＲＥＳ－２真核細胞発現ベクターのＣＭＶプロモーターの下流に組み込んだ。得られたプラスミドを、化学的に規定したＣＨＯ(chemically defined CHO)（ＣＤ－ＣＨＯ）培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションした；６００μｇのプラスミドおよび２．４ｍｇの線状ポリエチレンンイミンを３００ｍＬのＣＨＯ細胞中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で含有。トランスフェクション試薬と共に４時間インキュベートした後、細胞をペレット化し、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、７．５％のＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（Ｇｉｂｃｏ）、および７．５％のＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する３００ｍＬのＣＤ－ＣＨＯに再懸濁した。細胞を次いで３７℃、５％ ＣＯ２で７日間、約１２０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。７日後に６，０００×ｇで１０分間の遠心により細胞を分離し、上清を濾過した。
[0487] 組換えタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－活性化ＨＰカラム（ＧＥ）に共有結合した特異的モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢにより形成された６－ヘリックスバンドルに結合するｍＡｂ １２８１(Frey, et al., Nat Struct Mol Biol. 2010. 17(12):1486-91)によって、キメラクランプ安定化ＲＳＶ Ｆを精製した。ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖクランプ、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎキメラタンパク質、および対照ＲＳＶ Ｆを、ｍＡｂ １０１Ｆ(McLellan、et al. J Virol. 2010. 84(23):12236-44)を用いて精製した。希望するタンパク質の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
結果
タンパク質コンホメーション：
[0488] タンパク質コンホメーションを、コンホメーション特異的モノクローナル抗体を用いて査定した。エクトドメインの下流におけるＨＩＶ－１ ＧＰ１６０ ＨＲ１およびＨＲ２配列をベースとするＳＳＭの組込みは、融合エクトドメインポリペプチドが融合後コンホメーションに再配列するのを阻止する一種の‘分子クランプ’として作用する。そのようなキメラ融合タンパク質は融合前コンホメーションで安定化され、一方、対応する裸のエクトドメイン（すなわち、単独で発現したもの）は融合後形態を形成するという証拠を図１Ａ～Ｃに示す。
実施例２
ＩＮＦＡ ＨＡ
[0489] 本発明が融合前コンホメーションに拘束されたウイルス融合タンパク質のエクトドメインを含むキメラポリペプチドを製造できることを示す他の例として、インフルエンザＡ（ＩＮＦＡ）ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質について代表的証拠を提示する。さらに、ＩＮＦＡ ＨＡタンパク質について、前記方法により融合前コンホメーションに拘束されたキメラタンパク質がマウスに投与した際に改善された中和免疫応答を誘導できることについて代表的証拠を提示する。
材料および方法
キメラポリペプチド設計：
[0490] ＩＮＦＡ ＨＡのエクトドメインを、下流のＨＩＶ－１ ＧＰ１６０に由来する一対の相補的ヘプタッドリピート領域を含むヘテロロガス構造安定化部分に作動可能な状態で結合させた。得られたキメラタンパク質およびそれの対照のアミノ酸配列を以下に提示する。
ＩＮＦＡ ＨＡのエクトドメイン（１－５２９）：
[0491]
Figure 0007291398000112
ＩＮＦＡ ＨＡのエクトドメイン（１－５２９）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0492]
Figure 0007291398000113
タンパク質の発現および精製：
[0493] キメラ融合タンパク質インフルエンザＨ３クランプ、またはＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢ配列を欠如する対照エクトドメインをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を、ｐＩＲＥＳ－２真核細胞発現ベクターのＣＭＶプロモーターの後に組み込んだ。得られたプラスミドを実施例１に従ってＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を増殖させ、採集した。
[0494] 組換えタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－活性化ＨＰカラム（ＧＥ）に共有結合した特異的モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。キメラクランプ安定化したインフルエンザＨＡを、、ＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢにより形成された６－ヘリックスバンドルに結合するｍＡｂ １２８１(Frey, et al., Nat Struct Mol Biol. 2010. 17(12):1486-91)によって精製した。インフルエンザＨＡのエクトドメインを、ｍＡｂ Ｃ０５(Ekiert, et al., Nature, 2012. 489(7417): 526-32)で精製した。希望するタンパク質の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。２０１５シーズンのための市販の四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）をＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒから購入した（Ｆｌｕｑｕａｄｒｉ（商標））。
結果
タンパク質の精製：
[0495] タンパク質コンホメーションを、コンホメーション特異的モノクローナル抗体およびサイズ排除クロマトグラフィーで査定した。エクトドメイン下流におけるＨＩＶ－１ ＧＰ１６０ ＨＲ１およびＨＲ２配列をベースとするＳＳＭの組込みは、融合エクトドメインポリペプチドが融合後コンホメーションに再配列するのを阻止する一種の‘分子クランプ’として作用する。そのようなキメラ融合タンパク質は融合前コンホメーションで安定化され、一方、裸のエクトドメイン（すなわち、単独で発現したもの）は融合後形態を形成するという証拠を図２および３に示す。
動物の免疫化
[0496] ６－ヘリックスバンドル形成部分の組込みによりそれらの融合前形態で安定化されたウイルス融合タンパク質の免疫原としての有用性を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをキメラクランプ安定化インフルエンザＨＡ、対応する非安定化エクトドメイン、または市販のＱＩＶで免疫化した。グループ当たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、３μｇのサポニンアジュバントＱｕｉｌ－Ａを含む５μｇの精製タンパク質（またはＰＢＳ）で免疫化した。免疫化は皮内送達によるものであり、３週間置いて２回、マウスを免疫化した。２回目の免疫化の３週間後にマウスをと殺し、血清を採集した。各グループからプールした血清の中和効果を、プラーク減少中和試験(plaque reduction neutralization test)（ＰＲＮＴ）でインフルエンザＡ／Ｈｅｂｅｉ Ｂａｏｄｉｎｇ Ａｎｇｕｏ／５１／２０１０（Ｈ３Ｎ２）に対比して査定した。キメラクランプ安定化インフルエンザＨＡを接種したマウスからの血清は１：１４，０００のＩＣ５０値（９５％ＣＩ １１，０００～１７，０００）をもつ強い中和性活性を示し、一方、対応するＨＡエクトドメインを接種したマウスからの血清は試験した最高用量１：２０ですら中和性活性を示さず、市販のＱＩＶを接種したマウスからの血清は約１：１８０のＩＣ５０値をもつ中和を示す。したがって、ＨＩＶ－１ ＨＲ１およびＨＲ２から構成される構造安定化部分の組込みによるインフルエンザＨＡの融合前形態の安定化は強い中和免疫応答にとって重要であり、現在市販されている不活化ワクチンと比較して中和免疫応答をおおよそ８０倍増大させることができる。
[0497] クランプ安定化ＨＡが融合後ＨＡ ｓｏｌまたは市販のＱＩＶ Ｈ３クランプと相互作用しない新たな抗体集団を誘導したことを確認するために、ワクチン接種したマウスの血清をＨ３ｓｏｌまたはＱＩＶと共にプレインキュベートしてこれらの形態と結合できる抗体をいずれも除去した（図４，白色棒）。Ｈ３ｓｏｌまたはＱＩＶとのインキュベーションはいずれもウイルス中和の低減を生じなかったが、Ｈ３クランプとのプレインキュベーションはウイルス中和活性の完全な除去を生じた。誘導された免疫応答がＨＡのヘッドまたはステムサブドメインのいずれに特異的であるかを試験するために、ＥＬＩＳＡ反応性を全Ｈ３クランプおよびＨ３ステムのみのドメインと対比した（前記にセクション２．３．２で概説したとおり）。ＥＬＩＳＡの前にマウス血清をＥＢＯＶ ＧＰクランプと共にプレインキュベートして（前記にセクション２．３．１２で概説したとおり）、クランプドメイン自体に対して特異的な抗体を再吸着させた。血清を次いでＨ３クランプまたはＨ３ステムでコートしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、体液性抗体反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。ステムドメインに対して特異的な免疫のパーセントを推定するために、最大半量吸光度を生じる希釈計数を比較した。ヘッドドメインに対する免疫は、ステムドメイン特異的免疫を合計から差し引くことにより推定された（参照：図５）。Ｈ３クランプ免疫化により、ステムドメインと反応性である体液性免疫おおよそ２５％およびヘッドドメインと反応性であるもの７５％が生じた。これと対照的に、ＱＩＶ免疫化はステムドメインと反応性である体液性免疫わずか４％およびヘッドと反応性であるもの９６％を生じ、Ｈ３ｓｏｌ免疫化はステムドメインと反応性である体液性免疫わずか１％およびヘッドと反応性であるもの９９％を生じた。
[0498] Ｈ５クランプ構築体を用いて鳥インフルエンザＨ５Ｎ１に由来するＨ５との免疫応答の反応性を比較した（前記にセクション２．３．３で概説したとおり）。Ｈ５クランプまたはＨ１クランプを接種したマウスからの血清も分析に含めた。ＥＬＩＳＡ前にマウス血清をＥＢＯＶ ＧＰクランプと共にプレインキュベートして（前記にセクション２．３．１２で概説したとおり）、クランプドメイン自体に対して特異的な抗体を再吸収させた。Ｈ５クランプでコートしたＥＬＩＳＡプレートに次いで血清を添加し、体液性抗体反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。エンドポイント力価を計算し、図６に提示する。Ｈ３クランプおよびＨ１クランプは両方ともＨ５との実質的な交差反応性を示し、それはＱＩＶのものより有意に大きかった（それぞれ、２７倍の増大および８１倍の増大）。
[0499] 本発明者らは、次いでＨ５交差反応性に関与するサブドメインを決定する設定を行なった。ＥＬＩＳＡ反応性をＨ５ ＥＬＩＳＡで測定する前に、マウス血清をＥＢＯＶ ＧＰクランプと共に（前記にセクション２．３．１２で概説したとおり）、および／またはＨ３ステム Ｈ３ステム単独ドメインと共にプレインキュベートして（前記にセクション２．３．２で概説したとおり）クランプドメイン自体および／またはＨ３ステムドメインに対して特異的な抗体を予め吸収し、あるいはヒトモノクローナル抗体ＦＩ６ｖ３(Corti et al., PNAS 2011)を添加してステム特異的抗体を排除(outcompete)した。Ｈ５クランプでコートしたＥＬＩＳＡプレートに次いで血清を添加し、エンドポイント力価をＥＬＩＳＡにより計算した（図７）。ＱＩＶ免疫化したマウスはＨ５と低い反応性を示し、それはステム吸収／Ｆｉ６Ｖ３競合によってわずかに影響されたにすぎない。Ｈ５クランプで免疫化したマウスからの血清は高い反応性を示し、それはステム吸収／Ｆｉ６Ｖ３競合によって影響されず、これは強いヘッド特異的免疫応答の指標となる。しかし、Ｈ１クランプまたはＨ３クランプで免疫化したマウスからの血清はＨ５との強い反応性を示し、これはステム吸収／Ｆｉ６Ｖ３競合によって有意に低下し、これはステム特異的応答がＨ５交差反応性に関与することの指標となる。
実施例３
ＭＥＲＳスパイク
[0500] 本発明が融合前コンホメーションに拘束されたウイルス融合タンパク質のエクトドメインを含むキメラポリペプチドを製造できることを示すさらに他の例として、中東呼吸器症候群(Middle East Respiratory Syndrome)（ＭＥＲＳ）ウイルススパイクタンパク質について代表的証拠を提示する。
材料および方法
キメラポリペプチド設計：
[0501] ＭＥＲＳスパイクタンパク質のエクトドメインを、下流のＨＩＶ－１ ＧＰ１６に由来する一対の相補的ヘプタッドリピート領域を含むヘテロロガス構造安定化部分に、作動可能な状態で結合させた。得られたキメラタンパク質のアミノ酸配列を以下に提示する。
ＭＥＲＳスパイクのエクトドメイン（１－１２９６）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0502]
Figure 0007291398000114
タンパク質の発現および精製：
[0503] キメラ融合タンパク質ＭＥＲＳ Ｓクランプをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をｐＩＲＥＳ－２真核細胞発現ベクターのＣＭＶプロモーターの後に組み込んだ。得られたプラスミドを実施例１に従ってＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を増殖させ、採集した。この組換えタンパク質を、実施例１の記載に従ってｍＡｂ １２８１(Frey, et al., Nat Struct Mol Biol. 2010. 17(12):1486-91)を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
結果
タンパク質コンホメーション：
[0504] タンパク質コンホメーションを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて査定した。図８に提示する結果は、ＭＥＲＳ Ｓクランプキメラ融合タンパク質が融合前コンホメーションで安定化されていることを示す。
実施例４
ＥＢＯＶ ＧＰ
[0505] 本発明が融合前コンホメーションに拘束されたウイルス融合タンパク質のエクトドメインを含むキメラポリペプチドを製造できることを示すさらに他の例として、ＥＢＯＶ 糖タンパク質（ＧＰ）について代表的証拠を提示する。このキメラポリペプチドが高温で長期間にわたって安定性を示すものとして、さらに他の証拠を提示する。さらに、ＥＢＯＶ ＧＰについて前記方法により融合前コンホメーションに拘束されたこのキメラタンパク質がマウスに投与された際に中和免疫応答を誘導できることについて代表的証拠を提示する。
材料および方法
キメラポリペプチド設計：
[0506] ムチン様ドメインを欠如するＥＢＯＶ ＧＰを、下流のＨＩＶ－１ ＧＰ１６に由来する一対の相補的ヘプタッドリピート領域を含むヘテロロガス構造安定化部分に、作動可能な状態で結合させた。得られたキメラタンパク質のアミノ酸配列を以下に提示する。
ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン（１－３１１，４６２－６５０）－ ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ
[0507]
Figure 0007291398000115
タンパク質の発現および精製：
[0508] ＥＢＯＶ ＧＰデルタムチンクランプをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をｐＩＲＥＳ－２真核細胞発現ベクターのＣＭＶプロモーターの下流に組み込んだ。得られたプラスミドを実施例１に従ってＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を増殖させ、採集した。この組換えタンパク質を、実施例１の記載に従ってｍＡｂ Ｋｚ５２(Murin et al., PNAS. 2014 11(48):17182-7)を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
結果
タンパク質コンホメーション：
[0509] タンパク質コンホメーションを、還元条件の存在下および非存在下で、コンホメーション特異的モノクローナル抗体を用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより査定した。図９～１１に提示した結果は、ＥＢＯＶ ＧＰデルタムチンクランプキメラ融合タンパク質が融合前コンホメーションで安定化されていること、およびこのコンホメーションは比較的高い温度ですら長期間にわたって安定であることを示す（参照：図１１）。
動物の免疫化：
[0510] ６－ヘリックスバンドル形成部分の組込みによりそれらの融合前形態で安定化されたウイルス融合タンパク質の免疫原としての有用性をさらに試験するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをキメラクランプ安定化ＥＢＯＶ ＧＰデルタムチン構築体で免疫化した。グループ当たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、３μｇのサポニンアジュバントＱｕｉｌ－Ａを含む、または含まない、１μｇの精製タンパク質（またはＰＢＳ）で免疫化した。免疫化は皮内送達によるものであり、３週間置いて３回、マウスを免疫化した。３回目の免疫化の３週間後にマウスをと殺し、血清を採集した。それぞれの免疫化の後、ＥＢＯＶ ＧＰ特異的応答を査定した（図１２）。各マウスからの血清の中和効果を、生ＺＥＢＯＶに対してＰＣ４条件下で、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（オーストラリア動物健康研究所）（ＡＡＨＬ）においてプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）で査定した（図１３）。キメラクランプ安定化したＥＢＯＶ ＧＰデルタムチン構築体を接種したマウスからの血清は強い中和活性を示し、プラーク形成単位の５０％低減を生じる幾何平均は５２．８（９５％ＣＩ ２４．５～１１４．０）と計算された。
実施例５
クランプの免疫サイレンシング
[0511] この例は、クランプ配列の溶媒曝露領域がＮ－結合グリコシル化を受け入れるように修飾されたキメラポリペプチドを本発明が製造できることを示す。ＥＢＯＶ ＧＰについて代表的な証拠を提示し、これらの修飾が適応免疫系による認識からのクランプドメインの遮閉を助長することを示す。
材料および方法
キメラポリペプチド設計：
[0512] ムチン様ドメインを欠如するＥＢＯＶ ＧＰを下記の４つの異なる下流ヘテロロガスＳＳＭに作動可能な状態で結合させた：それぞれ、ＨＩＶ－１ ＧＰ１６０に由来する一対の相補的ＨＲＡおよびＨＲＢ領域を含み、個々のＨＲＢ領域はＮ－結合グリコシル化の受入れを容易にする異なる変異を保有していた。これらのキメラタンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン（１－３１１，４６２－６５０） － ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ＋Ｇ１：
[0513]
Figure 0007291398000116
ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン（１－３１１，４６２－６５０） － ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ＋Ｇ２：
[0514]
Figure 0007291398000117
ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン（１－３１１，４６２－６５０） － ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ＋Ｇ３：
[0515]
Figure 0007291398000118
ＥＢＯＶ ＧＰエクトドメイン マイナス ムチン様ドメイン（１－３１１，４６２－６５０） － ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ＋Ｇ４：
[0516]
Figure 0007291398000119
タンパク質の発現および精製：
[0517] 前記の構築体をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をそれぞれｐＩＲＥＳ－２真核細胞発現ベクターのＣＭＶプロモーターの後に組み込んだ。得られたプラスミドを実施例１に従ってＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を増殖させ、採集した。組換えタンパク質を、実施例１の記載に従ってｍＡｂ Ｋｚ５２(Murin et al., PNAS. 2014 11(48):17182-7)を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
結果
[0518] 適応免疫系によるクランプの認識を低減する効力（免疫サイレンシング）を試験するために、ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭに基づくクランプ配列のＨＲＢ内に、Ｎ－結合グリコシル化の受入れを容易にする可能性のある４つの別個の変異を導入した。
[0519] 修飾したＧＰ１６０－ベースのＳＳＭを組み込んだキメラＥＢＯＶ ＧＰ（ムチン様ドメインを欠如）を精製し、精製タンパク質の適性なコンホメーションを確認するために、Ｋｚ５２との反応性を査定した。キメラクランプで安定化したインフルエンザＨＡで免疫系したマウスからの血清の反応性を、修飾したクランプ配列を組み込んだキメラＥＢＯＶタンパク質に対比して試験した（図１４）。それぞれ個々の部位におけるグリコシル化によって反応性が有意に低減し、それによりこの方法をクランプドメインに対する反応性を低減するために使用できるという仮説が支持された。
実施例６
８種類のウイルスに由来するクランプ安定化した抗原の精製
[0520] この例は、本発明が広範なエンベロープウイルスに由来するウイルス融合タンパク質のエクトドメインを含むキメラポリペプチドを製造できること、およびこれらのポリペプチドがクランプドメインに対して特異的なモノクローナル抗体によって精製されることを立証する。
材料および方法
キメラポリペプチド設計：
[0521] ＩＮＦＡ ＨＡ、ＲＳＶ Ｆ、ニパＦおよびＨＳＶ２ ｇＢのエクトドメインを作動可能な状態で下流において、ＨＩＶ－１ ＧＰ１６０に由来する一対の相補的ヘプタッドリピート領域を含むヘテロロガス構造安定化部分に結合させる。得られたキメラタンパク質およびそれらのそれぞれの対照のアミノ酸配列を以下に提示する。インフルエンザについては、ＳＳＭを欠如する可溶性エクトドメインを作製し、ｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭを組み込んだ対照も製造した。ＲＳＶ－Ｆについては、エクトドメインの非必須領域（ａａ１０６－１４４）をその設計から除去した。ＳＳＭを欠如する可溶性エクトドメインを作製し、McLellan et al. (Science, 2013. 342(6158): 592-598)により記載された４つの部位（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌ）に変異を含む陽性対照、およびｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭを含む陽性対照も作製した。ニパおよびＨＳＶの非安定化対照は製造しなかった。
インフルエンザＨＡ（Ａ スイス ２０１３，Ｈ３Ｎ２）のエクトドメイン（１－５３３）：
[0522]
Figure 0007291398000120
インフルエンザＨＡ（Ａ スイス ２０１３，Ｈ３Ｎ２）のエクトドメイン（１－５３３）－Ｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭ：
[0523]
Figure 0007291398000121
インフルエンザＨＡ（Ａ スイス ２０１３ Ｈ３Ｎ２）のエクトドメイン（１－５３３） － ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0524]
Figure 0007291398000122
インフルエンザＨＡ（Ａ カリフォルニア ２００９，Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）のエクトドメイン（１－５２６）：
[0525]
Figure 0007291398000123
インフルエンザＨＡ（Ａ カリフォルニア ２００９，Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）のエクトドメイン（１－５２６）－Ｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭ：
[0526]
Figure 0007291398000124
インフルエンザＨＡ（Ａ カリフォルニア ２００９，Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）のエクトドメイン（１－５２６） － ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0527]
Figure 0007291398000125
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－５１６）－Ｈｉｓタグ：
[0528]
Figure 0007291398000126
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－５１３）－ＤＳｃａｖ変異－Ｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭ：
[0529]
Figure 0007291398000127
ＲＳＶ Ｆのエクトドメイン（１－１０５，１４５－５１１）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0530]
Figure 0007291398000128
ニパＦのエクトドメイン（１－４８３）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0531]
Figure 0007291398000129
ＨＳＶ１ ｇＢのエクトドメイン（２８－７４１）－ＩｇＫシグナルペプチド－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0532]
Figure 0007291398000130
麻疹Ｆのエクトドメイン（１－４８８）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0533]
Figure 0007291398000131
ラッサウイルスＧＰＣのエクトドメイン（１－４２３）－ＨＩＶ ＧＰ１６０－ベースのＳＳＭ：
[0534]
Figure 0007291398000132
タンパク質の発現および精製
[0535] 下記のキメラ融合タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を、ｐＩＲＥＳ－２またはｐＮＢＦ真核細胞発現ベクターのＣＭＶプロモーターの後に組み込んだ：インフルエンザＨ１ ｆｏｌｄｏｎ、インフルエンザＨ１クランプ、インフルエンザＨ３ ｆｏｌｄｏｎ、インフルエンザＨ３クランプ、ＲＳＶ Ｆクランプ、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ Ｆｏｌｄｏｎ、ＭＥＲＳ ＳクランプおよびエボラＧＰクランプ デルタムチン、ニパウイルスＦクランプ、麻疹ウイルスＦクランプ、ラッサウイルスＧＰＣクランプ、単純ヘルペス２ウイルスｇＢクランプ（ならびに、ＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢ配列を欠如する対応するエクトドメインＲＳＶ ＦおよびインフルエンザＨ３）。得られたプラスミドを、化学的に規定されたＣＨＯ（ＣＤ－ＣＨＯ）培地（Ｇｉｂｃｏ）またはＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションした。６００μｇのプラスミドおよび２．４ｍｇの線状ポリエチレンンイミンを３００ｍＬのＣＨＯ細胞中で１×１０６細胞／ｍＬの密度において混和するか、あるいは１６μｇのプラスミドを６４０μｌのＯＰＴＩ－ｐｒｏ無血清培地（ＳＦＭ）および５１．２μｌのエクスピフェクタミン(expifectamine)（Ｇｉｂｃｏ）と混和することにより、ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。４時間のインキュベーション後に、線状ポリエチレンンイミンでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞をペレット化し、トランスフェクション試薬を含有する培地を除去し、８ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、７．５％のＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（Ｇｉｂｃｏ）、および７．５％のＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する３００ｍＬのＣＤ－ＣＨＯに細胞を再懸濁した。エクスピフェクタミンでトランスフェクションした細胞については、２４時間のインキュベーションの後、９６μｌのＥｘｐｉＣＨＯエンハンサーおよび３．８４ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ供給材料を添加した。両セットの細胞を次いで３７℃、７．５％ ＣＯ２で７日間、約１２０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。７日後、６，０００×ｇで１０分間の遠心により細胞を分離し、上清を濾過した。
[0536] 組換えタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ）に共有結合した特異的モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。キメラクランプ安定化したインフルエンザＨＡ、ＲＳＶ Ｆ、ＭＥＲＳ Ｓ、エボラＧＰ、ラッサＧＰＣ、ニパＦ、麻疹ＦおよびＨＳＶ２ ｇＢを、ＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢにより形成された６－ヘリックスバンドルに結合するｍＡｂ １２８１(Frey, et al., Nat Struct Mol Biol. 2010. 17(12):1486-91)により精製した。キメラクランプ安定化した、およびｆｏｌｄｏｎ安定化したインフルエンザＨ１、ならびにＨ１について対応するエクトドメインを、ｍＡｂ ５Ｊ８(Hong, et al., J Virol, 2013. 87(22): p. 12471-80)により精製した。キメラクランプ安定化した、およびｆｏｌｄｏｎ安定化したインフルエンザＨ３、ならびにＨ３について対応するエクトドメインを、ｍＡｂ Ｃ０５(Ekiert, et al., Nature, 2012. 489(7417): 526-32)により精製した。キメラクランプ安定化した、およびｄｓ ｃａｖ変異を含むｆｏｌｄｏｎ安定化したＲＳＶ Ｆ、ならびに対応するＲＳＶ Ｆエクトドメインを、ｍＡｂ １０１Ｆ(McLellan, et al. J Virol. 2010. 84(23):12236-44)により精製した。希望するタンパク質の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。
結果
タンパク質の発現および精製のための一般法としての分子クランプ：
[0537] キメラクランプ安定化した８種類のウイルスに由来するウイルス融合タンパク質の発現および精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した（図１５）。ＨＩＶ－１ ＧＰ１６０ ＨＲ１およびＨＲ２配列をベースとするＳＳＭをエクトドメインの下流に組み込むことにより、ＨＩＶ－１ ＨＲＡおよびＨＲＢにより形成された６－ヘリックスバンドルに結合するｍＡｂ １２８１(Frey, et al., Nat Struct Mol Biol. 2010. 17(12):1486-91)を用いて多様なキメラタンパク質を回収することができる。
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ｐｄｍによる攻撃後のマウス防御試験：
[0538] インフルエンザＨＡエクトドメインへの６－ヘリックスバンドル形成部分の組込みが広域交差反応性の免疫応答を誘導できることを示す結果を拡張するために、インフルエンザ攻撃実験をＣ５７ｂマウスにおいて実施した。この試験を、多様なインフルエンザサブタイプからの広域スペクトル交差防御の誘導に関して、６－ヘリックスバンドル形成部分の分子クランプをｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭと直接比較するためにも設定した。Ｃ５７ｂマウスにＰＢＳ、Ｈ１ｓｏｌ、Ｈ３ｓｏｌ、Ｈ１ｆｏｌｄｏｎ、Ｈ３ｆｏｌｄｏｎ、Ｈ１クランプまたはＨ３クランプのいずれかを接種した。ワクチンを用量調和させてそれぞれが５μｇのＨＡおよび３μｇのＱｕｉｌＡを含有し、マウスに２週間置いて３回のワクチンを投与した。次いでマウスを初回投与の６週間後にインフルエンザＣａｌ／０９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）で攻撃した（グループ当たりｎ＝５匹のマウス）。この試験は、同一株に対する防御ときわめて多様なサブタイプに対する防御の両方を査定するために設計された。マウスを鼻内経路により、１×１０２プラーク形成単位（ＰＦＵ）の‘低用量’および５．５×１０３ ＰＦＵの‘高用量’インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１ｐｄｍで攻撃した。１４日間にわたって毎日、体重減少を測定し、マウスがそれらの元の体重の＞２０％を失えばそのマウスを排除した。
[0539] この試験により、Ｈ１クランプはＨ１ｓｏｌおよびＨ１ｆｏｌｄｏｎと同様に一致した株のインフルエンザに対して完全防御をもたらすことが確認された（図１６ＡおよびＢ）。特に興味深いことに、Ｈ３クランプによる免疫化もインフルエンザＨ１Ｎ１ｐｄｍに対して部分的防御を示した。Ｈ３クランプについて、低い量のインフルエンザＨ１Ｎ１ｐｄｍで攻撃した際に３／５のマウスが生存し、高用量のインフルエンザＨ１Ｎ１ｐｄｍで攻撃した際に２／５のマウスが生存した（図１６ＣおよびＤ）。これと比較して、Ｈ３ｓｏｌまたはＨ３ ｆｏｌｄｏｎで免疫化したマウスは低用量または高用量のいずれのインフルエンザＨ１Ｎ１ｐｄｍで攻撃した際にも生存せず、ＰＢＳで模擬免疫化したマウスは低用量のインフルエンザＨ１Ｎ１ｐｄｍで攻撃した際に１／５が生存したにすぎない。Ｈ３クランプ接種後にＨ１Ｎ１ｐｄｍで生存したマウス（５／１０）と模擬接種またはＨ３ｓｏｌもしくはＨ３ ｆｏｌｄｏｎの接種の後に生存したマウス（１／３０）の比較は、Ｈ３クランプにより仲介される広域インフルエンザ防御の統計学的有意性を立証する（ｐ＝０．０００３；カイ二乗検定計算式）。Ｈ３とＨ１のサブタイプはインフルエンザ系統樹内で別個のグループに属するので、この結果は広域レベルの防御の指標となり、同程度またはより分岐度の少ないすべてのインフルエンザ株およびサブタイプの広域スペクトルを当然予想できる。
クランプＳＳＭを組み込んだ際の熱安定性の増大：
[0540] クランプＳＳＭおよびｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭによってもたらされる安定性を直接比較するために、精製した抗原インフルエンザＨ１ ｆｏｌｄｏｎ、インフルエンザＨ１クランプ、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎ、およびＲＳＶ Ｆクランプを４３℃で７２時間インキュベートし、ｍＡｂとの反応性を熱安定性の尺度として用いた。ＲＳＶ Ｆ比較のために、３種類の融合前特異的ｍＡｂを用いた：Ｄ２５(McLellan et al., Science, 2013. 340(6136): p. 1113-7)、ＭＰＥ８(Corti et al., Nature, 2013. 501(7467): p. 439-43)およびＡＭ２２(McLellan et al., Science, 2013. 340(6136): p. 1113-7)。インフルエンザＨＡの比較のために、２種類のステム特異的ｍＡｂ：ＣＲ６２６１(Ekiert et al., Science, 2009. 324(5924): p. 246-51)およびＦｉ６Ｖ３(Corti et al., Science, 2011. 333(6044): p. 850-6)、ならびに１種類のヘッド特異的ｍＡｂ：５Ｊ８(Hong, et al. J Virol. 2013. 87(22): p. 12471-80)を用いた。直接比較により、ＲＳＶ Ｆクランプは高い温度でのインキュベーション後にＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎより有意に高い融合前特異的ｍＡｂとの反応性を保持していることが明らかになった（図１７Ａ）。同様に、直接比較により、インフルエンザＨ１クランプはインフルエンザＨ１ ｆｏｌｄｏｎより有意に高いＨＡステム特異的ｍＡｂとの反応性を保持していることが明らかになった（図１７Ｂ）。ヘッド特異的ｍＡｂとの反応性の保持は、インフルエンザＨ１クランプとインフルエンザＨ１ ｆｏｌｄｏｎとの間で同等であった。これらの結果を合わせると、ｆｏｌｄｏｎ ＳＳＭと比較してクランプＳＳＭの卓越した安定性が立証される。
ＲＳＶ Ｆクランプにより誘導された中和免疫応答：
[0541] ６－ヘリックスバンドル形成部分の組込みにより融合前形態で安定化されたウイルス融合タンパク質の、免疫原としての有用性を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＲＳＶ Ｆクランプ、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎ、対応するＲＳＶエクトドメイン（ＲＳＶ Ｆ ｓｏｌ）で免疫化し、あるいはＰＢＳで模擬免疫化した。グループ当たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、３μｇのサポニンアジュバントＱｕｉｌ－Ａを含む５μｇの精製タンパク質（またはＰＢＳ）で免疫化した。免疫化は皮内送達によるものであり、それぞれ３週間置いて３回、マウスを免疫化した。３回目の免疫化の３週間後にマウスをと殺し、血清を採集した。個々のマウスからの血清の中和効果を、ＲＳＶ株Ａ２に対してプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）で査定した（図１８）。キメラクランプ安定化したＲＳＶ Ｆクランプを接種したマウスからの血清は幾何平均ＩＣ５０値８，１２４（９５％ＣＩ＝１，９６８～３３，５４３）をもつ強い中和活性を示し、一方、ＲＳＶ Ｆ ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎを接種したマウスからの血清は幾何平均ＩＣ５０値２，８５９（９５％ＣＩ＝７９４～１０，２９０）をもつ中和活性を示し、ＲＳＶ Ｆ ｓｏｌを接種したマウスからの血清は幾何平均ＩＣ５０値５６２（９５％ＣＩ＝２４２～１，４１０）をもつ中和活性を示した。したがって、ＨＩＶ－１ ＨＲ１およびＨＲ２から構成される構造安定化部分の組込みによるＲＳＶ Ｆの融合前形態の安定化は強い中和免疫応答にとって重要であり、それは別の安定化アプローチ‘ｄｓ ｃａｖ ｆｏｌｄｏｎ’(McLellan et al., Science, 2013. 342(6158): p. 592-8)により誘導されるものよりおおよそ３倍高い。
ニパウイルスＦの融合前コンホメーションの安定化：
[0542] ウイルス融合タンパク質の融合前コンホメーションを安定化するためのクランプＳＳＭの有用性をさらに確証するために、クランプＳＳＭをニパウイルスＦのエクトドメインに組み込み、ＣＨＯ細胞において発現させた。イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質を、次いでｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ニパウイルスＦクランプの主要部分はおおよそ１１．５ｍＬで溶出し、それはトリマータンパク質の予想サイズ約１８０ｋＤａにほぼ等しい（図１９）。パラミクソウイルスＦについて十分に立証されているように(Connolly et al., PNAS, 2006. 103(47): P. 17903-8)、ニパウイルスＦの融合後コンホメーションへの転移によって疎水性融合ペプチドの露出が生じ、それによりタンパク質凝集が推進されると予想される。したがって、可溶性トリマータンパク質の存在は融合前コンホメーションの存在を支持する証拠である。精製ニパウイルスＦクランプをネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）によっても分析した（図１９，挿入図）。提示したＴＥＭイメージ内に、ニパウイルスＦクランプの粒子は予想した融合前コンホメーションと一致する均一なサイズおよびトポロジーをもつことが明瞭に見える。提示したデータは、クランプＳＳＭがウイルス融合タンパク質の融合前コンホメーションを安定化する能力をさらに支持する。
ニパウイルスＦクランプにより誘導された中和免疫応答：
[0543] ６－ヘリックスバンドル形成部分の組込みによりそれらの融合前形態で安定化されたウイルス融合タンパク質の免疫原としての有用性をさらに試験するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをニパウイルスＦクランプで免疫化し、あるいはＰＢＳで模擬免疫化した。グループ当たり４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、３μｇのサポニンアジュバントＱｕｉｌ－Ａを含む５μｇの精製タンパク質（またはＰＢＳ）で免疫化した。免疫化は皮内送達によるものであり、それぞれ３週間置いて２回、マウスを免疫化した。２回目の免疫化の３週間後にマウスをと殺し、血清を採集した。個々のマウスからの血清の中和効果を、生ニパウイルス（マレーシア株）に対してプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）でＢＳＬ４含有下に査定した（図２０）。キメラクランプ安定化ニパウイルスＦクランプを接種したマウスからの血清はすべて、幾何平均ＩＣ５０値４８（９５％ＣＩ＝６～３８４）をもつ強い中和活性を示し、一方、ＰＢＳを模擬接種したマウスからの血清は試験した最高血清濃度で中和活性を示さなかった。したがって、この結果はクランプＳＳＭを組み込んだキメラウイルス融合タンパク質が接種に際して中和免疫応答を誘導できるというさらなる証拠を提供する。
クラスＩＩＩウイルス融合タンパク質へのクランプＳＳＭの組込み：
[0544] ウイルス融合タンパク質の安定化に対するクランプＳＳＭの有用性をさらに確証するために、クランプＳＳＭをＨＳＶ２ ｇＢのエクトドメインに組み込み、ＣＨＯ細胞において発現させた。イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質を次いでｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ＨＳＶ２ ｇＢクランプの主要部分はおおよそ１５ｍＬで溶出し、それはトリマータンパク質の予想サイズ約３００ｋＤａにほぼ等しい（図２１）。精製ＨＳＶ２ ｇＢクランプをネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）によっても分析した（図２１，挿入図）。提示したＴＥＭイメージ内に、ＨＳＶ２ ｇＢクランプの粒子はＸ線結晶学によって以前に解像された構造(Heldwein et al., Science, 2006. 313(5784): 217-20)と一致する均一なサイズおよびトポロジーをもつことが明瞭に見える。このコンホメーションはＨＳＶ２ ｇＢ融合後コンホメーションであるという仮説が立てられる。明らかに、ＨＳＶ２ ｇＢクランプはＨＳＶ２に対する大部分の中和抗体を結合することもでき、サブユニットワクチン候補(Cairns et al., JVi, 2014. 88(5): P. 2677-89)として有用な可能性がある。提示したデータは、クランプＳＳＭがウイルスクラスＩ融合タンパク質のほかにウイルスクラスＩＩＩ融合タンパク質を安定化および精製できることを支持する。
[0545] ここに提示した結果は、融合前コンホメーションに拘束されたウイルス融合タンパク質のエクトドメインを含むキメラポリペプチドは
・ より広域の交差防御免疫応答を誘導できる;
・ 高い温度で安定である：
・ 卓越した中和免疫応答を誘導できる；および
・ クラスＩまたはクラスＩＩＩエクトドメインを用いて形成できる
ことを立証する。
[0546] 本明細書に引用したあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示内容の全体を本明細書に援用する。
[0547] 本明細書中の参考文献の引用を、そのような参考文献が本出願に対する“先行技術”として利用されることを認めるものと解釈すべきではない。
[0548] 本明細書全体を通して、その目的は、本発明をいずれか１つの態様または特定集合の特徴に限定することなく本発明の好ましい態様を記載することである。したがって、本開示を考慮に入れて、例示した特定の態様において本発明の範囲を逸脱することなく種々の改変および変更をなしうることは、当業者には認識されるであろう。そのような改変および変更はすべて特許請求の範囲に含まれるものとする。

Claims (50)

  1. エンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチド、および会合に適した条件下で相互に会合して逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する相補的な第１ヘプタッドリピート（ＨＲ１）および第２ヘプタッドリピート（ＨＲ２）領域を含むヘテロロガスな構造安定化部分を含む、キメラポリペプチドであって、
    ここで、前記構造安定化部分はエクトドメインポリペプチドの下流に作動可能な状態で結合しており、そしてＨＲ１およびＨＲ２領域の一方または両方は構造安定化部分に対する免疫応答の惹起を阻害する免疫サイレンシング部分を含み、免疫サイレンシング部分がグリコシル化部位である、
    前記キメラポリペプチド。
  2. ＨＲ１およびＨＲ２領域がエクトドメインポリペプチドに対する相補性を欠如し、したがってそれらはエクトドメインポリペプチドの構造要素とではなく優先的に相互に逆平行、２－ヘリックスバンドルを形成する、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
  3. ＨＲ１およびＨＲ２領域はそれぞれ独立して、（ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ－）ｎまたは（ｄ－ｅ－ｆ－ｇ－ａ－ｂ－ｃ－）ｎとして表記されるｎ回反復７残基パターンのアミノ酸タイプを特徴とし、その際、パターン要素‘ａ’～‘ｇ’はアミノ酸タイプが位置するヘプタッド位置を表わし、ｎは２に等しいかまたはそれより大きい数値であり、ヘプタッド位置‘ａ’および‘ｄ’の少なくとも５０％（または少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数パーセント）が疎水性アミノ酸タイプにより占有され、ヘプタッド位置‘ｂ’、‘ｃ’、‘ｅ’、‘ｆ’および‘ｇ’の少なくとも５０％（または少なくとも５１％～少なくとも９９％、およびその間のすべての整数パーセント）が親水性アミノ酸タイプにより占有され、その結果生じる疎水性アミノ酸タイプと親水性アミノ酸タイプの分布によりヘプタッドリピート領域の同定が可能になる、請求項１または請求項２に記載のキメラポリペプチド。
  4. ＨＲ１およびＨＲ２領域の一方または両方が、内在性クラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質ヘプタッドリピート領域アミノ酸配列を含み、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  5. ＨＲ１およびＨＲ２領域が、それぞれ１以上のクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質の相補的な内在性ヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）およびヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）領域を含み、またはそれからなる、請求項４に記載のキメラポリペプチド。
  6. ＨＲＡ領域アミノ酸配列とＨＲＢ領域アミノ酸配列が同一のクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質に由来する、請求項５に記載のキメラポリペプチド。
  7. ＨＲＡ領域アミノ酸配列とＨＲＢ領域アミノ酸配列が異なるクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質に由来する、請求項５に記載のキメラポリペプチド。
  8. ＨＲ１およびＨＲ２領域が独立して、オルソミキソウイルス、パラミキソウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルスおよびアレナウイルスにより発現される融合タンパク質のＨＲＡおよびＨＲＢ領域から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  9. 構造安定化部分が、１以上の非天然アミノ酸を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  10. エクトドメインポリペプチドがクラスＩエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインに対応する、請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  11. エクトドメインポリペプチドが内在性ＨＲＡ領域および内在性ＨＲＢ領域のうち一方または両方を含む、請求項１０に記載のキメラポリペプチド。
  12. クラスＩ融合タンパク質が、オルソミキソウイルス、パラミキソウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルスおよびアレナウイルスから選択されるクラスＩエンベロープ融合タンパク質ウイルスからのものである、請求項１０または請求項１１に記載のキメラポリペプチド。
  13. エクトドメインポリペプチドがクラスＩＩＩエンベロープウイルス融合タンパク質エクトドメインに対応する、請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  14. クラスＩＩＩ融合タンパク質が、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスから選択されるクラスＩＩＩエンベロープ融合タンパク質ウイルスからのものである、請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
  15. エクトドメインポリペプチドが前駆体エクトドメインポリペプチド全体またはその一部を含むか、あるいはそれからなる、請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  16. エクトドメインポリペプチドまたはその一部が、内在性シグナルペプチド、プロテアーゼ開裂部位、エクトドメインの内在性ヘッド部分、エクトドメインの内在性ステム部分、内在性ムチン様ドメイン、内在性膜近傍外部領域および内在性融合ペプチドのうちいずれか１以上を欠如する、請求項１５に記載のキメラポリペプチド。
  17. エクトドメインポリペプチドをフーリンプロテアーゼによるタンパク質分解開裂に対してより低い感受性にするために、野生型の融合タンパク質の１以上の内在性フーリン開裂部位が変化または欠失している、請求項１５または請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
  18. エクトドメインポリペプチドは、そのエクトドメインポリペプチドが対応する融合後形態のエンベロープウイルス融合タンパク質には存在しない少なくとも１つの融合前エピトープを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  19. 構造安定化部分のＨＲ１領域とＨＲ２領域がリンカーにより結合している、請求項１～１８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  20. リンカーが１～１００のアミノ酸残基からなる、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  21. リンカーが１～５０のアミノ酸残基からなる、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  22. リンカーが５０～１００のアミノ酸残基からなる、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  23. リンカーが、キメラポリペプチドの精製を容易にする精製部分、キメラポリペプチドに対する免疫応答を調節する免疫調節部分、細胞特異的部分、および構造柔軟性を付与する部分から選択される少なくとも１つの部分を含む、請求項１９～２２いずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  24. 宿主生物において請求項１～２３のいずれか一項記載のキメラポリペプチドの内因性産生のための核酸構築体。
  25. 請求項２４に記載の核酸構築体であって、宿主生物が哺乳動物である、前記核酸構築体。
  26. 請求項２５に記載の核酸構築体であって、宿主生物がヒトである、前記核酸構築体。
  27. 前記核酸構築体がｍＲＮＡを含む、請求項２４～２６のいずれかに記載の核酸構築体。
  28. 請求項１～２３のいずれか一項記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  29. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含む、請求項２８記載のポリヌクレオチド。
  30. エンベロープウイルス融合タンパクに対する免疫応答を惹起するための医薬組成物であって、前記組成物は請求項２４～２７のいずれか一項記載の核酸構築体、または請求項２８または２９記載のポリヌクレオチドを含む、前記医薬組成物。
  31. 請求項２４～２７のいずれか一項記載の一つ又はそれ以上の核酸構築体、または請求項２８もしくは２９記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
  32. 前記組成物が免疫調節組成物である、請求項３１記載の組成物。
  33. 宿主細胞において作動可能である調節要素に作動可能な状態で連結した、請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドに対するコーディング配列を含む、核酸構築体。
  34. 請求項３３に記載の核酸構築体を含む宿主細胞。
  35. 宿主細胞が原核宿主細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
  36. 宿主細胞が真核宿主細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
  37. キメラポリペプチド複合体を製造する方法であって、請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドを、キメラポリペプチド複合体の形成に適した条件下で結合させ、それにより、３つのキメラポリペプチドサブユニットを含む、キメラポリペプチドのそれぞれの構造形成部分の２－ヘリックスバンドルのオリゴマー化により形成された６ヘリックスバンドルを特徴とするキメラポリペプチド複合体を製造する方法。
  38. 請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドをサブユニットとして３つ含み、キメラポリペプチドのそれぞれの構造形成部分の２－ヘリックスバンドルのオリゴマー化により形成された６ヘリックスバンドルを特徴とする、キメラポリペプチド複合体。
  39. キメラポリペプチドがそれぞれエンベロープウイルス融合エクトドメインポリペプチドを含み、複合体が融合後形態のエンベロープウイルス融合タンパク質またはその複合体には存在しないエンベロープウイルス融合タンパク質またはその複合体の少なくとも１つの融合前エピトープを含む、請求項３８に記載の複合体。
  40. 請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド、または請求項３８もしくは請求項３９に記載のキメラポリペプチド複合体、および医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤またはアジュバントを含む、組成物。
  41. エンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体と結合する薬剤を同定する方法であって、請求項１～２３のいずれか一項記載のエクトドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチド、または請求項３８または３９記載のエクトドメインポリペプチドを含むキメラポリペプチド複合体と候補薬剤を接触させ、その際、エクトドメインポリペプチドはエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する；そしてキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチド複合体への候補薬剤の結合を検出することを含む方法。
  42. さらに、候補薬剤を融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体と接触させ、そして融合タンパク質またはその複合体への候補薬剤の結合を検出することを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 候補薬剤が化合物ライブラリーの一部である、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
  44. さらに、候補薬剤をライブラリーから単離することを含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 候補薬剤がキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチド複合体に特異的に結合する、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 候補薬剤が融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に特異的に結合する、請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 対象においてエンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に対する免疫応答を惹起するための医薬組成物であって、前記組成物は請求項３８または３９記載のエンベロープウイルス融合エクトドメイン含有キメラポリペプチド複合体を含み、キメラポリペプチド複合体のエクトドメインポリペプチドサブユニットがエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する、前記医薬組成物。
  48. 対象においてエンベロープウイルスの融合タンパク質またはその融合タンパク質の複合体に対する免疫応答を惹起するための医薬組成物であって、前記組成物は請求項１～２３のいずれか一項記載のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチド、または請求項３８もしくは３９記載のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチド複合体を発現できるＤＮＡワクチンまたはウイルスベクター／レプリコンを含み、キメラポリペプチド複合体のエクトドメインポリペプチドサブユニットがエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する、前記組成物。
  49. 対象においてエンベロープウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物であって、前記組成物は請求項３８または３９記載のエンベロープウイルス融合エクトドメイン含有キメラポリペプチド複合体を含み、キメラポリペプチド複合体のエクトドメインポリペプチドサブユニットがエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する、前記組成物。
  50. 対象においてエンベロープウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物であって、前記組成物は請求項１～２３のいずれか一項記載のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチド、または請求項３８もしくは３９記載のエクトドメインポリペプチド含有キメラポリペプチド複合体を発現できるＤＮＡワクチンまたはウイルスベクター／レプリコンを含み、キメラポリペプチド複合体のエクトドメインポリペプチドサブユニットがエンベロープウイルスの融合タンパク質に対応する、前記組成物。
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