JP7225364B1

JP7225364B1 - 乳酸菌

Info

Publication number: JP7225364B1
Application number: JP2021211162A
Authority: JP
Inventors: 千紘福▲崎▼; 純子藤本; 陽子曽野; 京鈴木
Original assignee: Sunstar Inc
Current assignee: Sunstar Inc
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-02-20
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: JP2023095339A; CN116333915A

Abstract

【課題】新規な乳酸菌の提供。【解決手段】ラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｓ２５株（受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１）である、乳酸菌。【選択図】なし

Description

NPMD

NITE BP-03571

本開示は、新規な乳酸菌等に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

乳酸菌発酵物により、種々の効果が奏されることが検討されてきている。例えば腸バリアが改善される（特許文献１）、あるいは肌が改善される（特許文献２）等の効果が奏されることが知られており、有用な乳酸菌の探索が行われている。

また、Ｔｈ１細胞が産生するＩＦＮ－γ、及びＩＬ－１２はＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞の活性化など細胞性免疫を増強し、特に初期免疫応答で重要であることが知られている。一方、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ－６を中心としたサイトカインはＢ細胞を介した液性免疫を活性化することが知られている。
Ｔｈ１細胞により産生されるサイトカイン（Ｔｈ１型サイトカインとも称される）はＴｈ２細胞によるサイトカインの産生を抑制し、Ｔｈ２細胞により産生されるサイトカイン（Ｔｈ２型サイトカインとも称される）はＴｈ１細胞によるサイトカインの産生を抑制する。免疫応答においては両者のバランスが重要であるとされているが、近年増加しているアレルギー疾患はＴｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカインバランスがＴｈ２型優位に傾いていることが要因とされている。

特開第２０１９－０１１３１５号公報特開第２０１９－０１１３１６号公報

Ｔｈ１細胞によるサイトカイン産生誘導能の高い乳酸菌を提供することを課題とする。

本発明者らは、ラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｓ２５株（受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１）が、高いＩＬ－１２産生誘導能を有することを見出し、さらに改良を重ねた。

本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｓ２５株（受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１）である、乳酸菌。
項２．
項１に記載の乳酸菌を含む、経口組成物。
項３．
項１に記載の乳酸菌を含む、飲食品組成物又は医薬品組成物。
項４．
免疫調節用、又は細胞性免疫増強用である、項２又は３に記載の組成物。

ＩＬ－１２産生誘導能が高い、新規なラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｓ２５株が提供される。

各種植物性乳酸菌のＩＬ－１２産生誘導能（ＯＤ４５０における吸光度）を示す。ラクチプランチバチルスプランタラムＳ２５発酵ブロッコリを添加した場合の培養上清中のＩＬ－６濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。ラクチプランチバチルスプランタラムＳ２５発酵ブロッコリを添加した場合の培養上清中のＩＬ－１０濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。各種発酵ブロッコリを添加した場合の培養上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。各種発酵ブロッコリを添加した場合の培養上清中のＩＬ－１２濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。各種発酵ブロッコリを添加した場合の培養上清中のＴｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカイン比（ＩＦＮ－γ／ＩＬ－６）を示す。各種発酵ブロッコリを添加した場合の培養上清中のＴｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカイン比（ＩＬ－１２／ＩＬ－１０）を示す。各種植物性乳酸菌によるＮＫ活性を示す。

以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本開示に包含される乳酸菌は、ラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｓ２５株（受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１）である。本明細書において、当該乳酸菌を、「本開示の乳酸菌」と表記することがある。

ラクチプランチバチルスプランタラムＳ２５株は、２０２１年１２月１５日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１で受領されている。

本開示の乳酸菌は、京漬物である、すぐきから分離された植物性乳酸菌である。

本開示の乳酸菌は、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｌｕｍ）、及びしば漬から単離されたラクチプランチバチルスペントーサスと比較して、高いＩＬ－１２産生誘導能を有する。なお、ＩＬ－１２は、主としてＴｈ１細胞が産生するサイトカインである。

本開示の乳酸菌を用いてブロッコリを発酵すると、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスプランタラム、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスペントーサス、すぐきから単離された他のラクチプランチバチルスペントーサス、及びビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）を用いた場合と比較して、ＩＦＮ－γの産生を促進することができる。なお、ＩＦＮ－γは、主としてＴｈ１細胞が産生するサイトカインである。

本開示の乳酸菌を用いてブロッコリを発酵すると、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスプランタラム、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスペントーサス、すぐきから単離された他のラクチプランチバチルスペントーサス、及びビフィドバクテリウム・ロンガムを用いた場合と比較して、ＩＬ－１２の産生を促進することができる。

本開示の乳酸菌を用いてブロッコリを発酵すると、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスプランタラム、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスペントーサス、すぐきから単離された他のラクチプランチバチルスペントーサス、及びビフィドバクテリウム・ロンガムを用いた場合と比較して、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－６の濃度比が１．０以上の高値を示す。なお、ＩＬ－６は、主としてＴｈ２細胞が産生するサイトカインである。
また、本開示の乳酸菌を用いてブロッコリを発酵すると、ＩＬ－６の産生を促進することができる。

本開示の乳酸菌を用いてブロッコリを発酵すると、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスプランタラム、しば漬から単離されたラクチプランチバチルスペントーサス、すぐきから単離された他のラクチプランチバチルスペントーサス、及びビフィドバクテリウム・ロンガムを用いた場合と比較して、ＩＬ－１２／ＩＬ－１０の濃度比が１．０以上の高値を示す。なお、ＩＬ－１０は、主としてＴｈ２細胞が産生するサイトカインである。
また、本開示の乳酸菌を用いてブロッコリを発酵すると、ＩＬ－１０の産生を促進することができる。

本開示の乳酸菌は、Ｔｈ１型サイトカイン、Ｔｈ２型サイトカイン、どちらのサイトカイン産生も高めるため、生体全体の免疫を賦活することができる。特に、Ｔｈ１細胞によって産生されるサイトカインである、ＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－１２の産生を誘導することによって、Ｔｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカイン比（例えば、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－６、ＩＬ－１２／ＩＬ－１０等）を高めることができる。

本開示の乳酸菌は、Ｔｈ１細胞によって産生されるサイトカインである、ＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－１２の産生を誘導することによって、ＮＫ活性を増強することができる。

本開示は、上記乳酸菌を含む、経口組成物をも包含する。
また、本開示は、上記乳酸菌を含む、飲食品組成物をも包含する。
また、本開示は、上記乳酸菌を含む、医薬品組成物をも包含する。
本明細書において、これらの組成物をあわせて、「本開示の組成物」と表記することがある。

飲食品組成物である場合には、例えば加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等であってもよい。

本開示の組成物における乳酸菌の含有量は、特に限定はされず、例えば０．１～１００質量％程度が好ましく、１～９９質量％程度、２～９０質量％、又は５～５０質量％程度がより好ましい。

本開示の組成物中、乳酸菌は、生菌体であってもよく、死菌体であってもよい。

本開示の組成物中、乳酸菌は、例えば、破砕、加熱、乾燥(凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥など)、凍結、溶菌、抽出処理等がなされていてもよく、なされていなくてもよい。

本開示の組成物は、上述した乳酸菌を含み、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬理学上又は食品衛生学上許容される基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、抗酸化剤、保存剤、コーティング剤、着色料等が例示される。これらの成分は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

本開示の組成物は、上述した乳酸菌と、必要に応じて他の成分とを組み合わせて常法により調製することができる。

本開示の乳酸菌は、例えば、ＩＬ－１２の産生を誘導すること、ＩＦＮ－γの産生を誘導すること、Ｔｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカイン比（例えば、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－６、ＩＬ－１２／ＩＬ－１０等）を高めること、又はＮＫ活性を増強することができる。このため、本開示の組成物は、例えば、免疫調節用、細胞性免疫増強用、腸管免疫調整用、腸管免疫増強用等として好適に用いることができる。本明細書において、「免疫調節」とは、Ｔｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカインバランスにおいてＴｈ１型サイトカインを優位にすることを意味する。また本開示の組成物は、例えば、外部刺激が身体に及ぼす影響を緩和して日常的に体調を良好に維持するための、日常的に摂取することで全身（例えば、腸管等）の免疫（抵抗）力が高まり良好な全身状態を維持するための組成物としても好適に用いることができる。

本開示の組成物の摂取対象としては、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。
ヒトとしては、例えば、血中Ｔｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカインバランスにおいてＴｈ２型サイトカインが優位なヒト；アレルギー症状を有するヒト（例えば、アトピー性皮膚炎、花粉症を有するヒト等）；腸管免疫が弱くなっているヒト（例えば、加齢と共に免疫力が落ちる高齢者や、高脂肪食の過剰摂取によって腸の炎症を起こしているヒト等）；風邪をひきやすいヒト；気管支喘息のヒト；慢性炎症状態にあるヒト（例えば、潰瘍性大腸炎、喫煙・飲酒頻度の高いヒト、常時疲労感のあるヒト、食生活が乱れているヒト、ストレスの多い環境下のヒト、肥満・糖尿病などの生活習慣病のヒト等）；腸管や全身のＴｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカインバランスの偏りが発症の一因になると考えられている疾患を有するヒト（当該疾患としては、例えば、アレルギー（小児・成人のアトピー性皮膚炎、花粉症）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎）等）；全身の免役賦活を必要とするヒト（例えば、ストレスや栄養不足により全身の免役機能（ＮＫ細胞活性）が低下しているヒト、がん予防、感冒等のウイルス性感染症の予防を目的として全身の免役機能（ＮＫ細胞活性）を高めたいヒト）等が挙げられる。また、これらの症状が見られない場合であっても、免疫機能の維持のために予防的に用いることもできる。

摂取される乳酸菌の量は、特に制限されず、例えば一日当たり（特に成人一日当たり）１～１０００億個が好ましく、１０～１００億個がより好ましい。
本開示の組成物に含有される乳酸菌量についても、当該一日当たりの乳酸菌摂取量を参考として設定することもできる。乳酸菌死菌粉末１ｇあたり、通常１．０×１０^１１～１．０～１０^１３個程度の乳酸菌が含まれることから、例えば当該値を参考として本開示の組成物に乳酸菌死菌粉末を上記一日当たりの乳酸菌摂取量が含まれるように設定して組成物を調製することもできる。また、組成物に含まれる乳酸菌量を上記一日当たりの乳酸菌摂取量の例えば１／２若しくは１／３として、当該組成物の摂取を一日数回（２回若しくは３回）とすることもできる。

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。

また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。

以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。

被験物質としては、表１に示す植物性乳酸菌６株を用いた。

ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の分離
ヒト末梢血をヘパリン加採血し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠沈法（ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によりＰＢＭＣに分離しＲＰＭＩ１６４０ｍｅｄｉｕｍ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ１０％ＦＣＳ，５ｍＭＨｅｐｅｓａｎｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）で培養した。
ｉｎｖｉｔｒｏ刺激条件
ヒト末梢血ＰＢＭＣ（１×１０^６／ｍｌ）を被験物質（乾重量１μｇ、約ｌ×１０^６細胞）でｉｎｖｉｔｒｏ刺激しＩＬ－１２の変動を検討した。なお、陰性対照としてＰＢＭＣのみ、陽性対照として１０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したＰＢＭＣを用いた。
ＩＬ－１２産生量の測定
ＰＢＭＣを被験物質で１８時間ｉｎｖｉｔｒｏ刺激した時の培養上清中のＩＬ－１２産生量をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図１に示す。

図１に示すとおり、評価したＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｎｔｏｓｕｓと、ＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＳ２５株は、いずれも高いＩＬ－１２産生誘導能を有することが確認された。

表１に示す植物性乳酸菌６株及び、Ｂｉｆｉｌｏｎ５０Ｎより純培養したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ株を、それぞれ定法に従って調製したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＭＲＳＢｒｏｔｈに接種し、植物性乳酸菌６株にあっては３０℃で２０時間、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ株にあっては、３６℃で２０時間培養した。
一方冷凍ブロッコリピューレを、解凍後透明パウチへ８０ｇずつ充填して、電子レンジにて適宜予備加熱した後、ヒートシールにて密封し、湯せん中（９７℃以上）で１５分間加熱殺菌した。それらを３０～４０℃まで冷却して開封し、各ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＭＲＳＢｒｏｔｈ培養液をスターターとして４％（３．２ｇ）接種した。パウチ開口部を再びヒートシールにより密封してから、よくパウチを手で揉んで内容物を混合し、植物性乳酸菌６株は３０℃、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ株は３６℃、いずれも２４時間恒温器内で発酵させた。発酵終了して検査用試料採取後、再びヒートシールして、９０℃以上の湯せん中にて１０分間殺菌処理を行い、サイトカイン誘導試験を開始するまで冷蔵保存した。

上述した方法と同様の方法により調製したＰＢＭＣ細胞調製液を１．０ｍｌずつ１２ｗｅｌｌプレートに播種（１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した。１ｍｇ／ｍｌとなるように上述した発酵後の検体を、また、コントロールとして等量のＰＢＳ（－）を添加し２４時間培養した。２４時間後、培養上清を採取し遠心後、上清中のＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γをＢｉｏ－ＰｌｅｘＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎＡｒｒａｙＳｙｓｔｅｍを使用して測定した。結果を図２Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに検体投与２４時間後のＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２の培養上清中の濃度（ｐｇ／ｍｌ）で示す。また、図２Ｅ及びＦに上清中サイトカイン濃度より算出したＴｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカイン比（ＩＦＮ－γ／ＩＬ－６の濃度比、ＩＬ－１２／ＩＬ－１０の濃度比）を示す。

図２Ａ及びＢに示すとおり、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＳ２５株を用いて発酵したブロッコリを添加することによって、ＩＬ－６及びＩＬ－１０の産生が促進されることが確認された。
図２Ｃ及びＤに示すとおり、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＳ２５株を用いて発酵したブロッコリを添加することによって、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２の産生が促進されることが確認された。
図２Ｅ及びＦに示すとおり、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＳ２５株を用いて発酵したブロッコリを添加することによって、Ｔｈ１型サイトカイン／Ｔｈ２型サイトカイン比（ＩＦＮ－γ／ＩＬ－６、ＩＬ－１２／ＩＬ－１０）は１．０以上の高値を示すことが確認された。

市販の凍結保存ヒト末梢血単核球（ＣｅｌｌｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵ．Ｓ．Ａ．）を用いた。凍結ＰＢＭＣを融解する培地はメーカー推奨の培地ＣＴＬ－Ａｎｔｉ－ＡｇｇｒｅｇａｔｅＷａｓｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔを用い、凍結ＰＢＭＣ１バイアルを３７℃で急速に融解し、ＣＴＬ－Ａｎｔｉ－ＡｇｇｒｅｇａｔｅＷａｓｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔで洗浄した後、遠心してＰＢＭＣを得た。
解凍したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で３×１０^６／ｍｌ濃度に調製した後、２４穴プレートに５００μｌずつ撒いた。次にＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＳ２５株（受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１）、又はヨーグルトから分離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを５０μｌずつ加え、３７℃、５％Ｃ０_２下で２０時間培養した。対照としてＰＢＳを加える試験区分も設けた。
培養終了後、セルストレーナーキャップ付チューブで、大きいｄｅｂｒｉｓを除去した後、２０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈渣のＰＢＭＣをＮＫ活性測定に用いた。

エフェクター細胞としてＰＢＭＣを、標的細胞としてはヒトＮＫ細胞感受性株であるＫ５６２細胞を用いた。Ｋ５６２細胞はＰＢＳでｌ×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した後、疎水性シアニン膜系蛍光色素ＤｉＯを最終濃度８μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１０分間染色した。その後ＰＢＳで一回洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた後、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度に調整した。
９６穴Ｕ底マイクロカルチャープレートの各ウェルに膜不透過性核酸結合蛍光色素ＰＩを最終濃度２５μｇ／ｍｌになるように加えた。その上に、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させたＰＢＭＣ（２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度）を１００μｌずつ分注した後、Ｋ５６２細胞を１００μｌずつ分注した（Ｅ：Ｔ比＝４０：１）。マイクロカルチャープレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、３７℃で２時間反応させ、フローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を用いてＮＫ活性を測定した。結果を図３に示す。
なお、ＮＫ活性は以下の式で算出した。
ＮＫ活性（％）＝ＤｉＯ陽性ＰＩ陽性細胞数／（ＤｉＯ陽性ＰＩ陰性細胞数十ＤｉＯ陽性ＰＩ陽性細胞数）×１００－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｓｉｓ．

図３に示すとおり、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＳ２５株は、高いＮＫ活性を示すことが確認された。

Claims

ラクチプランチバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｓ２５株（受領番号：ＮＩＴＥＡＢＰ－０３５７１）である、乳酸菌。
請求項１に記載の乳酸菌を含む、経口組成物。
請求項１に記載の乳酸菌を含む、飲食品組成物又は医薬品組成物。
ブロッコリの乳酸菌醗酵物を含む経口組成物であって、
前記乳酸菌が請求項１に記載の乳酸菌である、経口組成物。
免疫調節用、又は細胞性免疫増強用である、請求項２～４のいずれかに記載の組成物。