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JP4521687B2 - プロバイオティクス、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２ - Google Patents

プロバイオティクス、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２ Download PDF

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Description

本発明は、プロバイオティクスのプロピオニバクテリウム菌株並びにプロバイオティクスのサプリメント及び食品の調製におけるそれらの使用に関する。本発明は、プロバイオティクス菌株によるビタミンＢ12、プロピオン酸、フォラシン及びバクテリオシンの提供、ビフィズス菌の増殖刺激、脂質代謝及び免疫刺激を介した宿主の免疫系における良好な効果の生成、又はアジュバントとしてのプロバイオティクス菌株の使用、ホモシステイン及びβ−グルクロニダーゼの低減及びこれらの活性の要求に関係する状態の予防、治療及び改善に関する。本発明のプロバイオティクス細菌はヒト又はそのほかの動物に使用することができる。少なくとも一部の適用では、細胞全体を使用してもよいというよりはむしろ、死んだ細菌又は細菌の一部を使用することができる。本発明はまた、感染症、特に結核から患者を保護するのに使用されるワクチンの調製にも関する。
プロバイオティクス
消化管に導入されるプロバイオティクスは、消化管の腸内細菌叢に影響を及ぼすことができ、宿主における有益な役割を担うことができる。用語「プロバイオティクス」は、「生命のために」を意味するギリシア語に由来する。ある微生物により分泌される別の微生物の増殖を刺激する物質を記載するために最初に使用された（Lilly & Stillwell, 1965）。１９９２年、Ｈａｖｅｎａａｒは、動物又はヒトに適用した際、常在の腸内細菌叢の特性を改善することにより宿主に有益に作用する「生きた微生物の単一の、又は混在した培養物」としてプロバイオティクスを定義することを提案した（Havenaar et al., 1992）。Ｈａｖｅｎａａｒの定義が、用語、プロバイオティクスをヒトと動物の双方に適用した最初のものであった。プロバイオティクスの現在の適用及び判明した効果を考慮して、Ｓａｌｍｉｎｅｎら（１９９９年）は、新しい定義：プロバイオティクスは、宿主の健康及び快適な暮らしに有益な効果を有する微生物細胞製剤又は微生物細胞の成分である、を提案した。この定義は、微生物細胞（生細胞又は非生細胞）及びプロバイオティクスとしての細胞の一部を包含するが、抗生物質のような代謝産物は包含しない。この定義はまた、プロバイオティクスの適用が食物における使用に限定されないことを示している。
最近、乳中のプロピオニバクテリウムの菌株が、宿主におけるプロピオン酸、フォラシン、バクテリオシン及びビタミンＢ12の産生、ビフィズス菌の増殖刺激、並びに脂質代謝及び免疫系における良好な効果を含む有益な効果を有することができるという幾つかの証拠が示されている。プロピオニバクテリウム菌株の使用によって、食物の栄養的及び治療的質が向上し、食品の貯蔵期間が延び、病原性及び有害な腸内細菌の増殖が抑制され、製品に対するさらに良好な感覚刺激的特性に寄与する。
乳中のプロピオニバクテリウムは、プロピオニバクテリウム属における４つの種、Ｐ．フレウデンレイチ（ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、Ｐ．アシッドプロピオニシ（ａｃｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、Ｐ．イエンセニー（ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びＰ．ソエニ（ｔｈｏｅｎｉｉ）から成る。４種のプロピオニバクテリウムはすべて、野菜、果実、ナッツ、発芽した種子、豆、乳製品のような新鮮な、調理していない食物、及び特定の発酵品目を含む食物において生きたまま見い出される。
プロピオニバクテリウムは、食品業界では、スターターカルチャーとして広く使用されている。プロピオニバクテリウム種は、伝統的には、「小穴」を作るスイスの又はスイス型のチーズ及びスイスチーズの典型的な甘味の維持に使用されている。プロピオニバクテリウム種はまた、食品添加物及び飼料添加物として野菜の発酵に、乳児用食品に、並びにプロピオン酸及びビタミンＢ12の生合成に使用されている。
プロバイオティクス効果が生きている生物に依存する場合、プロバイオティクス菌株は、その集団が、腸管内容物で１０6〜１０8ｃｆｕ／ｇ前後の特定の最低レベルに達しなければ影響を与えることができない。経口により供給されるそのようなプロバイオティクス細菌は、上部消化管で生き残らなければならず、次いで下部消化管に達し、生き残って宿主に有益な効果を発揮する。
胃の中の低いｐＨ及びペプシンの抗菌作用は、細菌の腸管への侵入に対して有効な防壁となることが知られている。胃のｐＨは、２．５〜３．５の範囲にあるが、食物摂取の後では、低ければｐＨ１．５に達し、高ければｐＨ６にも達する。食物の種類が胃内容排出に影響を及ぼす。通常、食物は２〜４時間、胃に残るが、脂質の胃からの排出は約２０分以内である。酸認容性の乳酸菌を含む胃の通過認容性を選択するために広範な試験管内の試験が使用されている（Charteris et al., 1998; Clark et al., 1993; Chou & Weimer, 1999）。しかしながら、プロピオニバクテリウムの試験管内の酸認容性に関しては限られた研究しかなく、これは、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチの２つの菌株によるものであった（Jan et al,m 2000; Mantere-Alhonen, 1983）。
プロピオン酸菌のもう１つの防壁は、小腸で生き残るこらねばならない。小腸の有害な条件には、胆汁塩及びパンクレアチンの存在が挙げられる。食物が小腸を通過する時間は、一般に１〜４時間の間である。胆汁塩の存在下で生き残る能力を調べ、種々のレベルの胆汁を伴った選抜培地でのその増殖を調べることによって胆汁塩耐性の乳酸菌を選択することができる（Gilliland et al., 1984; Ibarahimand Bezkorovainy, 1993; Clark & Martin, 1994; Chung et al., 1999）。ヒトでの使用で、プロバイオティクスを選択するには、０．１５〜０．３０％の濃度の胆汁塩が好適な濃度として報告されている。プロピオニバクテリウム菌株の小腸通過の認容性に関する報告は見られない。
上部消化管を通過して生き残った後、消化管でコロニーを形成し、持続するために、プロバイオティクス細菌は、消化管上皮に付着する必要がある。腸管粘膜及びその腸内細菌叢の複雑さによって、生体内で細菌の付着を検討するのが大変困難になっている。発酵したプロバイオティクス食品の調製の間においても、宿主の消化管においても生きているプロバイオティクス微生物は栄養的利益を提供することができる。発酵後、原料の質感及び風味を有意に改善することができ；食品における一部成分の有害効果、たとえば、一部のオリゴ糖及びタンパク質が原因になる食品の非認容性やアレルギーを軽減することができ；アミノ酸やビタミンのレベルを上げて食品の栄養価を改善することができ；及び、糖や食品のそのほかの損傷促進成分を除く結果、貯蔵期間を延ばし、食品の安全性を保証する。ミルクに比べて、発酵したヨーグルトにおいて、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、銅及びリンの生物利用性が高められるという証拠が提示されている。検討の結果は、ヨーグルトにおけるリボフラビン及びニコチン酸の増加、チェダーチーズにおけるビタミンＢ6の増加、カッテージチーズにおけるビタミンＢ12の増加及びヨーグルト、カッテージチーズ、チェダーチーズ及びサワークリームを含む種々の製品における葉酸の増加を明らかにしている。プロバイオティクス微生物の酵素的加水分解もタンパク質及び脂肪の生物利用性を高めることが示されている。細菌のプロテアーゼは、特に宿主が内因性のプロテアーゼ欠損を有する場合、宿主の栄養状況に利益を与えることができる遊離のアミノ酸の産生を高めることができる。
生きているプロバイオティクスを含有する食品の消費は、（１）病原性微生物、抗生物質又は化学療法による感染が原因の便秘及び下痢のような腸管障害の緩和；（２）免疫系の刺激及び調節；（３）β−グルクロニダーゼ、アゾレダクターゼ及びニトロレダクターゼのような腸内細菌酵素の低減により消化管における発癌性化合物を不活化する又は抑制することによる抗腫瘍効果；（４）アンモニア、フェノール及び肝硬変に影響を与えることが分かっているタンパク質の代謝産物のような毒性の最終産物の産生低下；（５）血清コレステロール及び血圧の低下；（６）粘膜整合性の維持；（７）乳糖不耐症の症状の緩和；（８）膣炎の予防、を含む健康上の利益を生じることが報告されている。
生きていないプロバイオティクス及び一部プロバイオティクス菌株の細胞壁成分も宿主に有益な効果を有するが、無処理の細胞よりも安全性の懸念は生じにくい。
プロピオニバクテリウムの菌株は、高濃度のビタミンＢ12を独特に含有しており（Hettinga & Reinbold, 1972a）、そのビタミンＢ12産生は最も効率的であるとみなされている（Hettinga & Reinbold, 1972b）。プロピオニバクテリウムの菌株は、発酵乳製品及び発酵飲料のビタミンＢ12補強に使用されることが多い。Ｐ．フレウデンレイチの亜種、シェルマニ（ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）を包含することにより、Ｋｅｆｉｒ、ストレプトコッカスで発酵した発酵乳、Ｔｖｏｒｏｇチーズ、Ｄｏｍｉａｔｉチーズ及びＺａｂａｄｙチーズでビタミンＢ12の増加を招く。Ｐ．フレウデンレイチの亜種、シェルマニ（ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）を包含することによりＫｅｆｉｒ、ストレプトコッカスで発酵した発酵乳を含む発酵乳製品及び発酵飲料で葉酸含量が増加する。
プロピオニバクテリウムによるビタミンＢ12の産生は、細胞の収量に相関する。ビタミンＢ12の産生は、コバルトの存在、別の培地補助剤の包含、溶解した酸素濃度及び発酵ブイヨンのｐＨを含む多数の因子に影響される（Hettinga & Reinbold, 1972b; Quesada-Chanto et al., 1994b; Berry & Bullerman, 1966;Quesada-Chanto et al., 1998 ）。
ビタミンＢ12は人類の成長及び健康に必須である。それは、赤血球及び神経周囲のミエリンの産生に必要とされ、脂肪酸、炭水化物及びタンパク質の代謝において補酵素として作用する。ビタミンＢ12の天然合成は微生物においてのみ生じる。ビタミンＢ12の微生物による合成は、ヒトの結腸で生じるが、それは吸収されない。従って、人類は、ビタミンＢ12の食物摂取に全面的に依存し、適切な血清レベルや体内貯蔵を維持していると思われる。
ビタミンＢ12は栄養学の文献で用いられる用語であるが、ほとんどの生化学及び化学の教科書では、ビタミンＢ12ではなくコバラミンが用いられる。用語、ビタミンＢ12は今や、抗悪性貧血活性を呈するコバラミンの一般名である。
ビタミンＢ12の欠乏は、心疾患、多発性硬化症、卒中、乳癌、アルツハイマー病、一部の精神病症候群及び加齢促進に対するリスク因子の１つであると報告されている（Choi, 1999; Wynn & Wynn, 1998; Gariballa, 2000; Delva, 1997）。ビタミンＢ12欠乏の有病性は、集団の年齢及び一般的な健康状態、正常な血清ビタミンＢ12の閾値、並びに診断に必要なそのほかの基準によって様々である。さらに優勢な、軽い及び前臨床的なビタミンＢ12欠乏が最近認識されている。前臨床的な欠乏は、不足を示す代謝的証拠は存在するが、巨赤芽球性貧血を含む臨床症状を有さない状態である（Carmel, 2000）。
遺伝因子又は獲得因子のいずれによってもビタミンＢ12欠乏が生じてもよい。ほとんどのビタミンＢ12欠乏は、不適切な食物摂取に関係する。肉、魚、卵及び乳製品のような動物製品は人体に適切な量のビタミンＢ12を含有する。菜食主義者の食事は一般にＲＤＬよりも低いレベルのビタミンＢ12を有する。菜食主義者の食事をするヒト及び彼らの乳児は、ビタミンＢ12の低レベル傾向にあり、ビタミンＢ12欠乏を発生する。研究によって、血清中の低レベルビタミンＢ12は、厳格な菜食主義者のみならず、乳菜食主義者及び乳卵菜食主義者にも見い出されている。ビタミンＢ12欠乏は、補完されていない又は補強されていない菜食主義者の食物において本当に障害である。多数の加工した菜食主義者の食事はビタミンＢ12が補強されているが、経済的理由から、これらの食物は、一部の菜食主義者には利用可能ではない。ビタミンＢ12の欠乏は、子供において成長及び精神運動の発達の遅滞を生じる。従って、菜食主義者の食事をする子供には特別の注意を払い、適切なビタミンＢ12の摂取を保証すべきである。
ビタミンＢ12欠乏のもう１つの原因は、食物中のビタミンＢ12の吸収不良である。
ビタミンＢ12の欠乏の効果を調べるのにラットが用いられてきた。ビタミンＢ12の欠乏は、ラットにおいて成長遅滞、エネルギー代謝の低下、尿中メチルマロン酸（ＭＭＡ）の排泄の増加を引き起こす。ビタミンＢ12の欠乏はまた、ラットにおいて精巣組織にも影響を及ぼす。
ビタミンＢ12欠乏症に対する治療は、欠乏の原因によって様々である。ビタミンＢ12に対する最も頻度の高い２つの治療は、非経口的注射及び経口療法である。
ビタミンＢ12欠乏症の初期段階では、多数の患者が医学的忠告を求めていないことが分かっている。ビタミンＢ12食品補助剤及びビタミンＢ12を伴う一般の食物製品によって、患者の一部ではビタミンＢ12欠乏症の発症を防ぎ、欠乏の問題を軽減し、健康管理のコストを軽減すればよい。
ワクチン
あらゆるワクチンは、１つの目的、特定の疾病を引き起こす作用物資又は病原体が症状を起こすに十分なほど増殖する前に、それらを迅速に破壊するために、免疫系を感作すること、を有する（Langridge, 2000）。
単一の感染性作用物質に由来する世界最大の殺し屋は、結核（ＴＢ）である（ＷＨＯ、１９９２年）。結核は、原発性に肺を冒す、細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシスにより引き起こされる疾病である。現在、２０億の人々がこの細菌に感染している（Agger & Andersen, 2001）。これは世界人口の３分の１に匹敵する。これらの大半は、健康管理が最低限度である開発途上国において見られる。年間３００万人がこの疾病で死亡し、治療しなければ死亡率は５０％である（Collins & Kaufmann, 2001）。ＴＢに現在利用可能なワクチンであるＢＣＧは、様々な集団で０〜８０％の範囲にある様々な有効率を有し（Guerin, 1997）、今日までこの疾病の拡散を防ぐ上では大きく非効果的である。５０％の薬効を持つ新しいワクチンの開発によって２０３０年までに結核による９００万人の死亡をふせぐことができると推定された（Murry & Salomon, 1998）。
Ｍ．ツベルクロシスは、宿主の免疫反応をたくみにくぐりぬける多数のメカニズムを進化させた高度に発達した病原菌である（Flynn, 1999）。ＴＢに対するヒトの免疫反応は、Ｔヘルパー１が関与する独特で複雑な細胞性応答である。免疫系の正しい態様を刺激する試みと組み合わせた細菌のチャレンジそのものが、ＢＣＧより有意に優れたワクチンを作製しようとする何年にもおよぶ試みを無駄なものにしてきた。
結核は、活動形態では、持続する咳、胸痛、発熱、体重減少、夜間の発汗のような症状を起こし、進行すれば、喀血を起こす（Miler & Schieffelbein, editorial 2001a）。結核は主として、咳をすること、くしゃみをすること、会話をすること、及び笑うことを介して、喀痰の小さな液滴で空気中に散らされることによって伝播する（Miler & Schieffelbein， 1998）。しかしながら、長期間にわたる反復した暴露が、暴露の強さと共に宿主における疾患の伝播及び成立に必要である（NIAID, 1999; Miler & Schieffelbein, 1998）。
適切な抗生物質による治療によって９０％の治癒率がある（NIAID, 1999; Collins & Kaufmann, 2001）。しかしながら、この治療方法には問題がある。治療を施すにはコンプライアンスを確保するための監督を必要とし、それは相対的に高価であり、多数の副作用を伴い、治癒には６ヵ月を超える治療を要する（Broker, 1999）。最近の研究により、多数の国で、ＴＢの治療に使用される４種の主な薬剤、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール及びストレプトマイシンに対する耐性が発生していることが示された（Mustafa, 2002）。このことは、多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）菌株による感染は、利用可能な薬剤のいかなるものでも有効に治療することができないことを意味しており、ＭＤＲ−ＴＢ患者の死亡率は４０〜６０％である（NIAID, 1999）。
マイクロバクテリウム・ツベルクロシスは、宿主に感染することができるが、活動型疾患の症状を呈することなく休止状態で存在することができる。これは、潜在的結核感染として知られる。潜在的感染を持つ危険性は、通常、宿主が弱った状態にある場合、特に、ＨＩＶ／ＡＩＤＳのような自己免疫疾患に共に感染した場合、また、高齢者に感染した場合、それらがいつでも再び活動期に入るということである（NIAID, 1996; Tsuyuguchi, 1996）。ＨＩＶ／ＴＢとの同時感染の５０％を超える人々が活動期結核を発症している。免疫系が弱っている場合、細菌はマクロファージに侵入し、休止状態で存在し、血流に入って疾患を引き起こす。治療しないままであれば、活動期疾患の患者の５０％は死亡する（NIAID, 1996）。結核の大半は、最低限の健康管理で、栄養不良やＨＩＶが一般的な世界で最貧の国々で起きる（Kaufmann & Hess, 2000）。
結核と闘うためのＢＣＧ以来最も好評なイニシアチブであり、ＴＢの耐性菌株の拡散を裏付けているのは、ＷＨＯの直接的に観察する短期間療法（ＤＯＴＳ）である（Collins & Kaufmann, 2001）。これは、標準化された短期コースの化学療法の完全コースを達成するために患者のコンプライアンスを高めることを目的とする（Gleissberg, 1999）。これは言い換えれば、完全な投薬コースを確実に採用することによって、Ｍ．ツベルクロシスの抗生物質耐性菌株を除くという条件を排除することを目的とする。しかしながら、この戦略は、問題を制御するにはＢＣＧと同じくらい有効でないと思われる。統計によって、そのような療法の成功率は、アフリカのある国々ではたった６２％であることが示されている（Collins & Kaufmann, 2001）。その結果、ＴＢは、化学療法投薬計画のみでは世界から根絶されないという一般的な合意がある（Hess & Kaufmann, 1999）。
ＢＣＧは世界で最も広く使用されているワクチンである(Kaufmann & Hess, 2000）。今日までに、３０億人を超える人々に投与された（Collins, 2000）。２６５，０００人の被験者を含むインドにおける１９６８年に開始された対照のある臨床試験では、プラセボ群の参加者の方がＢＣＧの投与を受けたものよりもわずかに良好なＴＢへの免疫性を有することが示された（Tripathy, 1987）。ＢＣＧは、前の世紀の初頭に創られ、ウシで結核を起こすマイコバクテリウム菌株である、マイコバクテリウム・ボビスの生きた減衰した菌株から成る。この菌株は、９０％を超えるＤＮＡの相同性を持って、Ｍ．ツベルクロシスと密接に関係するので、Ｍ．ツベルクロシスによる感染に対する優れた免疫反応を感作すると期待された（Andersen, 2001）。ＢＣＧワクチンが結核の解決法ではなかったにもかかわらず、それが創られた時は、そのように期待された（Ravn et al., 1997）。最近の研究によって、ＢＣＧワクチンは、実際、ＴＢへの免疫反応で中心的役割を担うことが今や同定されている良好な抗原性を持つ生命に必要なタンパク質を欠いていることが示されている（Ravn et al., 1997）。
ＢＣＧにおける特定の必須の抗原の欠如は、減衰過程の間に起きた遺伝子欠失によると考えられる（Ethay & Andersen, 1997）。ＢＣＧは、胆汁を含有する寒天プレートを段階的に通過させることを介して、Ｍ．ボビスを減衰することによって創られた（Kaufmann & Hess, 2000）。今や失われたこれらの有益なタンパク質は、結核患者で強く認識され、活発に研究された ｅｓａｔ−６を包含する（Collins, 2000)。
最近の現場の試験では、ＢＣＧによる防御レベルは極めて低く、検出不能の場合もあることが示されている（Andersen, 2001）。
Ｂｒａｎｄｔら（２００２年）は、特定の環境のマイコバクテリアへの暴露は、ＢＣＧの増殖を制御する免疫反応を刺激し、従って、完全なワクチン誘発の免疫反応が発生するのを妨げるという長年の仮説を裏付けた（Brandt at el., 2002）。環境中の細菌への暴露は、免疫系を感作し、そのほかのマイコバクテリアの特定のレベルの防御を提供するが、動物モデルでは、防御は、Ｍ．ツベルクロシスの増殖を有意に減らすほど十分ではない（Brandt, et al., 2002）。
この研究は、生きたワクチンとしてのＢＣＧは、Ｍ．アビウムとＢＣＧとの間で共有する抗原に対して事前に存在する免疫反応の影響に特に感受性があり（Brandt, et al., 2002）、それによって、ＢＣＧワクチンの非有用性を一部説明することができると結論付けた。これに加えて、ＢＣＧは、主な診断ツールである、ＰＰＤ皮内テストにおいて偽陽性を生じることによって、疾患の検出及び初期の治療に対して障害でもある（Fatkenheuer et al., 1999）。
ＢＣＧの明らかに明瞭な破綻及び不適切性にもかかわらず、新しい原型となるワクチンの合成は、未だに、ＢＣＧよりは有意に有効である、動物モデルにおける免疫反応を生じなければならない（Andersen, 1994）。ＢＣＧが世界中で投与され続ける主な理由は、ワクチンが安全であるという利点、安価で容易に製造され、注射１回当たり数セントで済むことである（Orme, 1999）。
背景技術に関する上記の考察は、本発明の背景を説明するのに包含される。引用された文書及びそのほかの資料は、本明細書のクレームのいずれか１項の優先日に、公知であり、知られており、又はオーストラリアにおける一般的知識の一部であったということは、譲歩としては解釈されない。
本明細書の説明及びクレーム全体にわたって、用語「含む」及びその変異型「含むこと」及び「含む（３人称単数形）」は、そのほかの添加物、工程又は整数値を排除することを意図しない。
第１の態様において、本発明は、新規の単離されたプロピオニバクテリウム菌株、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２を提供する。プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２は、ブダペスト条約の規定のもとで、オーストラリア政府の分析研究所（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、２０７３、ピンブル、スアキン通り１）にて、受入番号、ＮＭ０２／２９５１７のもと２００２年６月１２日、供託された。
第２の態様において、本発明は、培養培地、保存培地賦形剤、キャリア又は希釈剤と共にプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２からなる製剤を提供する。
第３の態様において、本発明は、プロバイオティクス菌株としてのプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の使用を提供する。該菌株は、ヒト又はそのほかの動物においてプロバイオティクスとして使用することができる。細菌は生きたまま又は死んだものを使用することができ、また細菌の一部を使用することができる。
第４の態様において、当然のことながら本発明は、送達剤と共にプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２からなるビタミンＢ12サプリメントを提供する。サプリメントにおける使用に好適な送達剤は、薬学上許容可能な送達剤を包含する。
サプリメントは、カプセル、錠剤、粉末（単体又はカプセルに入れて）、顆粒又はペーストの形態で提供してもよい。経口スプレーとしてサプリメントを調製することができる。もう１つの実施形態では、たとえば、朝食用シリアル、豆乳製品又は菜食主義者用のバーガーパティのようなビタミンＢ12を強化した食品の形態で提供される。
第５の態様において、本発明は、方法が本発明のサプリメント又は食物を宿主に投与することからなる、宿主におけるビタミンＢ12欠乏の有害効果を防ぐ、治療する又は改善する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。
第６の態様において、本発明は、好適なキャリア、賦形剤又は希釈剤と共にプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２からなる動物飼料のための成長促進剤を提供する。プロピオニバクテリウムにより動物を飼育することは、抗生物質又は化学療法による成長促進に関係する副作用無しで、成長、ビタミン供給及び有害腸内細菌の抑制を改善することができる。
第７の態様において、本発明は、宿主動物に第６の態様の成長促進剤を有効量で投与することからなる、宿主動物において成長及び／又はビタミンの供給及び／又は有害腸内細菌の抑制を改善する方法を提供する。当然のことながら、本発明の本態様は、宿主動物に第６の態様の成長促進剤を有効量で投与することを含む、宿主動物において成長及び／又はビタミンの供給及び／又は有害腸内細菌の抑制を改善する方法において使用するために第６の態様の成長促進剤を製造する方法も包含する。
第８の態様において、本発明は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の使用を含む発酵工程を含むことにより食品を調製することを含む食品の損傷を防ぎ、及び／又は食物製品の貯蔵期間を延ばす方法を提供する。
発酵した食品は、長い消費歴を有し、元来の食品素材よりもさらに良好な品質を有することが多い。
乳酸菌及びプロピオン酸菌を含む乳スターターは、発酵生成物に阻害性の代謝産物を生成する能力によって、損傷性及び病原性の生物の増殖を制約することができる。阻害剤には、広域スペクトルの拮抗剤、有機酸、ジアセチル、及び過酸化水素が挙げられる。スターターの中には、バクテリオシン又は生産者の培養に通常密接に関係する種に対して活性のある殺菌性タンパク質を生じるものもある。プロピオン酸菌は、プロピオン酸、プロピオン酸塩、ジアセチル及びバクテリオシンを産生することができる。プロピオン酸は、酢酸及び乳酸よりも幅広い阻害を示す。プロピオン酸並びにそのナトリウム塩及びカルシウム塩は、抗ミオサイトで有効であり、多数の焼いた製品に添加してカビを抑制する。プロピオン酸塩はまた、グラム陰性菌を抑制するが、グラム陽性菌には有効ではない。ジアセチルは、酵母、乳酸菌、グラム陽性種及びグラム陰性培養物に抑制効果を有する。プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチの亜種、シェルマニＪＳは、ラクトバチルス・ラムノサスＬＣ７０５と共に、発酵乳及びパンに使用して、製品の貯蔵期間を改善することも報告されている。混合培養は、損傷性酵母、カビ及びバチルス種を抑制することが見い出された。
第９の態様において、本発明は、もう１つの食品発酵微生物を伴った混合培養において、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の使用を含む発酵工程を含むことにより食品を調製することを含む食品の損傷を防ぎ、及び／又は食物製品の貯蔵期間を延ばす方法を提供する。
第１０の態様において、本発明は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又はその一部を用いて調製された食品を提供する。
実施形態の１つでは、食品は、プロピオニアシッドフィルス乳のような発酵乳製品である。
第１１の態様において、本発明は、調製においてプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又はのあるその一部からなる食品を調製する方法を提供する。
プロバイオティクス食品には、「発酵した」プロバイオティクス食品及び「発酵しない」プロバイオティクス食品が挙げられる。「発酵した」プロバイオティクス食品は、食品の中で増殖し、発酵生成物を生成する生きたプロバイオティクス微生物を含有する。「発酵しない」プロバイオティクス食品は、食品の感覚刺激に反応する特性を顕著には変更しないで食品に添加されたプロバイオティクス微生物又はその構成成分を含有する。「発酵した」プロバイオティクス食品には、プロバイオティクス乳食品、チーズ、バター、クリーム、ヨーグルト及び飲用ヨーグルト及び一部の冷凍食品が挙げられる。食品は液体でもよい。「発酵した」プロバイオティクス食品に使用される原料には、ミルク、豆乳、穀物、豆類、果実生産物及び野菜生産物が挙げられる。
プロバイオティクス食品は１種又は数種の微生物菌株を含有してもよい。すでに調製された食品に１又はそれより多くの微生物を添加することにより食品を調製してもよい。別の方法では、調製中に１又はそれより多くの微生物を食品に添加してもよい。これによって、食品内部での微生物の増殖を生じ、食品の特性に結果的に影響を与えてもよい。微生物は、調製において原料の発酵に加担してもよい。微生物は、調製において原料の部分的な又は完全な発酵を提供してもよい。本態様で使用される微生物は、発酵的機能のみを提供してもよく、発酵及びプロバイオティクス的機能を提供してもよい。
１又はそれより多くの微生物を用いて食品を調製し、次いでさらに微生物を添加させてもよい。
市販の食品製造のための乳酸菌及びプロバイオティクス培養、並びに発酵のためのスターター培養は、クリスチャン・ハンセンＰｔｙ社（オーストラリア、ベイズウオーター）及びジスト−ブロケーズ・オーストラリアＰｔｙ社（オーストラリア、モアーバンク）のような国際的な会社から購入することができる。ＣＳＩＲＯスターター・カルチャー・コレクション（オーストラリア、ハイエット）及びオーストラリア・スターター・カルチャー・リサーチ・センター（オーストラリア・ウェリビー）のようなそのほかの研究機関は、良好な乳酸菌及び能力なプロバイオティクスコレクションを有するが、これらの生物は小規模でしか利用可能でない。
第１２の態様において、本発明は、本発明の食品又はサプリメントを患者に投与することを含む、患者において消化器疾患及び／又は乳糖不耐症を治療する方法を提供する。実施形態の１つでは、患者は乳児である。患者はまた、非ヒトの動物であればよい。当然のことながら、本発明の本態様は本発明の食品又はサプリメントを患者に投与することを含む、患者において消化器疾患及び／又は乳糖不耐症を治療する方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
消化器疾患及び／又は乳糖不耐症の治療において乳児の食品にプロピオニバクテリウム菌株が使用される。ラクトバチルス・アシドフィルス及びＰ．フレウデンレイチの亜種、シェルマニを用いて調製されたプロピオニアシッドフィルス乳は、乳児の腸のスタフィロコッカス感染の治療において乳酸菌乳より有効であることが示された。種々の発酵乳製品は、乳糖不耐症の乳児の治療に有効であることが分かっている。乳糖の加水分解に必要な酵素、β−ガラクトシダーゼは、乳酸菌に認められるよりも高い濃度でプロピオニバクテリウムに存在することが分かっている。乳糖不耐症患者を治療するための発酵乳製品の製造にはプロピオン酸菌を使用することが推奨されている。
第１３の態様において、本発明は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主の消化管におけるビフィズス菌の増殖を高める方法を提供する。宿主は、ヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様はプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを患者に投与することからなる、宿主の消化管におけるビフィズス菌の増殖を高める方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
プロピオニバクテリウムは試験管内でビフィズス菌の増殖を高めることができることを示している。ビフィズス産生性の増殖刺激因子は、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチ７０２５の培養物の細胞なしのろ液及び細胞のメタノール抽出分画に存在することが見い出された（Kaneko et al., 1994）。この水溶性の刺激因子は、熱及びタンパク分解酵素に対して安定しており、ビタミンＢ12及び有機酸とは異なる。この刺激因子は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、Ｂ．ロングム、Ｂ．ブレイブ、及びＢ．アドレスセンツの菌株の増殖を増強した。プロピオニバクテリウムのビフィドバクテリウムにおける刺激効果はまた、健常なヒト対象にも処理され（Bougle et al., 1999）、結果は、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチのビフィズス産生特性を裏付けた。
第１４の態様において、本発明は、１又はそれより多くのプロバイオティクス細菌を伴ったプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の混合培養を提供する。
プロピオニバクテリウムとそのほかのプロバイオティクス細菌を含有する混合培養は、結果として多数の有益な効果を生じる。プロピオニバクテリウムと乳酸菌の混合培養は、発酵で広く用いられている。野菜の発酵において乳酸菌と共にプロピオニバクテリウムを添加すると、フォラシン、ビタミンＢ12、プロピオン酸及び酢酸の含量が増加し、有害な病原性微生物が抑制され、製品の貯蔵期間が延びる。さらに、Ｂ．ロングムとＰ．フレウデンレイチの混合培養は、Ｍ．ルテウス、シュードモナス種、及びＳ．アウレウスに対するＢ．ロングム単独よりも良好な抗菌活性が得られる。
さらに、本発明のプロバイオティクス細菌及びその製剤は、抗酸化剤及びプロバイオティクスに有益な効果を呈するそのほかの分子等と他の製剤とを組み合わせることができる。
第１５の態様において、本発明は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを宿主に投与することを含む脂質代謝に影響を与える方法を提供する。宿主はヒトであっても動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様がプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを宿主に投与することを含む脂質代謝に影響を与える方法において使用するための本発明の食品及びサプリメントを製造する方法も含む。
プロピオン酸菌は、宿主の脂質代謝に影響を及ぼすことができる。プロピオン酸を含有する餌で飼育したマウスは血清脂質濃度の低下を示した。脂質低下効果は、プロピオン酸菌の存在による下部腸管での吸収又は高級脂質の異化によるものと考えられる。もう１つの研究では、コレステロール源としてウシ肺疫菌様微生物（ＰＰＬＯ）の血清分画を補完した脳・心臓浸出物培地におけるコレステロールの取り込みについてプロピオニバクテリウム・フレウデンレイチの種々の菌株を調べた。結果は、３２℃において１０〜１４日間した後、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチは培地におけるコレステロール含量を５０％低下させることを示した。さらに、プロピオン酸菌により培地から除かれたコレステロールの７０％は、洗浄したプロピオン酸菌細胞からの溶媒抽出により回収された。プロピオン酸菌によるコレステロールの取り込みは、厳格な嫌気性条件を必要とせず、且つ胆汁酸の存在にも影響されなかった。
第１６の態様において、本発明は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを宿主に投与することを含む、免疫系に作用し、関連する疾患症状を緩和する方法を提供する。免疫刺激、免疫調節によって、又はプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを介して、アジュバントとして宿主の免疫系に効果を与える。また、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントは、アレルギーを緩和する。さらに、死んだプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又はその一部を使用して、宿主の免疫系に効果を与えることができる。宿主は、ヒト又はそのほかの動物であることができる。当然のことながら、発明の本態様がプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２又は本発明の食品もしくはサプリメントを宿主に投与することを含む、免疫系に作用する方法において使用するための本発明の食品もしくはサプリメントを製造する方法も包含する。
プロピオン酸菌は宿主の免疫系に作用することができる。プロピオニバクテリウム・アビダムＫＰ−４０のマウスへの注射によって、肝組織におけるリンパ肉種のコロニー形成が低下した（Pulverer at al., 1994）。プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチの亜種、シェルマニＪＳは、Ｂ及びＴリンパ球の増殖活性に影響を及ぼすことが分かっている。Ｐ．アシッドプロピオニシを食べさせたマウスにおいて、腹腔マクロファージの貪食活性及びカーボン・クリアランス活性の上昇が認められた。死んだプロピオニバクテリウムは、ウマにおいて免疫刺激剤として使用されている。
第１７の態様において、本発明は、大豆系又はシリアル系の製品を含む食品の存在下でプロバイオティクス微生物を投与することを含む、宿主の消化管を通過する間、プロバイオティクス微生物を保護する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。実施形態の１つでは、大豆系製品は豆乳である。もう１つの実施形態では、シリアル系製品はシリアル飲料である。
第１８の態様において、本発明は、本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における高ホモシステインの有害な影響を治療し、予防し又は改善する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様が本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における高ホモシステインの有害な影響を治療する、予防する又は改善する方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
第１９の態様において、本発明は、本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主におけるβ−グルクロニダーゼの有害な影響を治療する、予防する又は改善する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様が、本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主におけるβ−グルクロニダーゼの有害な影響を治療する、予防する又は改善する方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
ステロイド及び幾つかの発癌性化合物は、肝臓で代謝され、グルクロン酸と共役した後、胆汁を介して小腸に分泌される。細菌のβ−グルクロニダーゼは、明らかに有害な化合物を放出するグルクロニドを加水分解することができる（Gadelle et al., 1985; Fujisawa & Mori, 1996; Nanno et al., 1986）。ヒトの糞便から単離されたプロピオニバクテリウムの菌株は、試験管内でβ−グルクロニダーゼ陽性であることが判明している（Nanno et al., 1986）。興味深いことに、生体内の研究では、Ｐ．フレウデンレイチ及びＰ．アシッドプロピオニシの菌株を含む乳中プロピオン酸菌をマウスに与えた後、マウスの糞便中のグルクロニダーゼ活性は同等又は低下さえすると報告された（Perez-Chaia et al., 1999）。プロピオニバクテリウムの菌株は、それが試験管内の環境で増殖するか、生体内の環境で増殖するかのよって異なったグルクロニダーゼ活性を有することが示唆されている。
第２０の態様において、本発明は、本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における循環器疾患のリスクを軽減する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様が本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における循環器疾患のリスクを軽減する方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
プロバイオティクスのプロピオニバクテリウムの種は、血清コレステロールに有益な効果を生じる可能性がある。Ｓｏｍｋｕｔｉ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９０年）は、試験管内で、Ｐ．フレウデンレイチが、増殖培地からコレステロールを取り込むことを実証した。プロバイオティクス及び発酵乳のコレステロール低下効果に関する数多くの生体内の研究がある。異なった結果や誤りを有することが多い実験設計のために矛盾が存在する（Taylor & Williams, 1998）。循環器疾患（ＣＶＤ）は、世界の主な死に至る病の１つであり、年間死亡の少なくとも３分の１に相当する（ＷＨＯ、２００１年）。高いコレステロールは、ＣＶＤの主なリスク因子の１つである。最近、高レベルのホモシステインもＣＶＤのリスクを高めることが理解されている（Ozkan et al., 2002; van der Griend et al., 2000）。ビタミンＢ12のレベルとホモシステインとの間には逆の関係がある。Ｐ．イエンセニー７０２は、高レベルのビタミンＢ12を産生することができる。従って、Ｐ．イエンセニー７０２の有益な効果は、ビタミンＢ12のレベルを改善することを越えてホモシステインを低下させることによりＣＶＤのリスクを軽減し、血清脂質における陽性効果を発揮するまで拡大すればよい。
第２１の態様において、本発明は、Ｐ．イエンセニー７０２、本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における免疫不均衡の有害な影響を治療する、予防する又は改善する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様が本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における免疫不均衡の有害な影響を治療し、予防し又は改善する方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
第２２の態様において、本発明は、Ｐ．イエンセニー７０２、本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における免疫反応を調節する方法を提供する。宿主はヒトであっても、そのほかの動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様が本発明の食品又はサプリメントを宿主に投与することを含む、宿主における免疫反応を強化する方法において使用するための本発明の食品又はサプリメントを製造する方法も包含する。
免疫調節は、Ｐ．イエンセニー７０２、本発明の食品又はサプリメントがワクチンにおける特定の抗原又は抗体へのアジュバントとして機能する免疫刺激を含んでもよい。別の方法では、Ｐ．イエンセニー７０２、サプリメント又は食品が受入者の免疫系への全体的な刺激を提供する一般的な免疫刺激剤として作用してもよい。
第２３の態様において、本発明は、粘膜アジュバントと共に、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原からなる結核に対する粘膜ワクチンを提供する。
通常、ワクチンは経口ワクチンである。別の方法では、ワクチンは、もう１つの粘膜表面を介して投与されてもよい。一例は鼻内投与である。選択されるアジュバントは投与経路に適しており、たとえば、経口ワクチンには、経口アジュバントを使用する。
実施形態の１つでは、経口アジュバントは細菌ベクターである。好ましい実施形態では、経口アジュバントは、Ｐ．イエンセニー７０２又はその一部である。
抗原は通常、Ｍ．ツベルクロシスの細胞全体、破壊したＭ．ツベルクロシス細胞又はその一部、及び可溶性Ｍ．ツベルクロシスタンパク質から成る群から選択され、それは、活発に増殖しているＭ．ツベルクロシスの培養から回収された分泌型又は細胞性のタンパク質、又は分泌型又は細胞性の水溶タンパク質の組み合わせである。短期間の培養物ろ液として抗原を提供することができる。抗原は、超音波処理した細胞全体と短期間の培養物ろ液との組み合わせであっても良い。可溶性タンパク質を含む抗原調製物を異なった大きさの範囲に分画することができる。たとえば、分画＜２０ｋＤａ、２０〜３０ｋＤａ、３０〜３５ｋＤａ、３５〜６５ｋＤａ及び＞６５ｋＤａへの最初の分離を用いて、好適な反応を提供する分画（単数）又は分画（複数）を決定することができる。これらのサイズ分画をさらに精製することができる。分泌型又は細胞性のタンパク質の精選された分画の組み合わせを最適化された各分画の比率で利用して、所望の免疫反応を引き起こすことができる。
実施形態の１つでは、抗原は、有効な比率で存在する分泌型又は細胞性の有効量可溶性タンパク質の組み合わせを含む。
この分野の日常的な慣行に従って決定された有効用量にてワクチンを投与する。有効用量は、免疫を生じるのに十分であるが、寛容を誘導するほど多くない。
投与回数及び投与のタイミングは、この分野の日常的な慣行に従って決定される。
粘膜ワクチンの調製に関する標準法に従って、ワクチンを製剤化してもよい。たとえば、ワクチンをエアゾールにおける食品の一部として液剤、錠剤、粉末に製剤化してもよい。
ワクチンは、宿主において、マイコバクテリウム・ツベルクロシスに対する全身性の、又は粘膜性の免疫反応、又はその両方を提供してもよい。
第２４の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種ことを含む、患者においてマイコバクテリウム・ツベルクロシスに対する免疫反応を産生する方法を提供する。
第２５の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスに対して患者にワクチン接種する方法を提供する。
第２６の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの感染に対して患者を防御する方法を提供する。
第２７の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの再活性化に対して患者を防御する方法を提供する。
第２８の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、結核に対して患者を防御する方法を提供する。
第２９の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、患者においてマイコバクテリウム・ツベルクロシスに対する免疫反応を産生する方法において使用するためのワクチンの製造におけるマイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原の使用を提供する。
第３０の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスに対して患者にワクチン接種する方法において使用するためのワクチンの製造におけるマイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原の使用を提供する。
第３１の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの感染に対して患者を防御する方法において使用するためのワクチンの製造におけるマイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原の使用を提供する。
第３２の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの再活性化に対して患者を防御する方法において使用するためのワクチンの製造におけるマイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原の使用を提供する。
第３３の態様において、本発明は、粘膜表面を介して第２３の態様のワクチンを患者に接種することを含む、結核に対して患者を防御する方法において使用するためのワクチンの製造におけるマイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原の使用を提供する。
通常、粘膜表面は、口、鼻及び消化管である。
ワクチンは、患者において、マイコバクテリウム・ツベルクロシスに対する全身性の、又は粘膜性の免疫反応、又はその両方を提供してもよい。免疫反応は、ＴＢ疾病が発症するのを防ぐことが出来る、及び/又はＴＢによる最初の感染が発生するのを防いでもよい。
本発明のワクチンは最初のワクチン接種として用いてもよいし、最初のワクチン接種の後、免疫反応を感作するのに用いてもよい。
本発明の第３４の態様において、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原、粘膜アジュバント及び好適なキャリアを組み合わせることを含み、抗原がマイコバクテリウム・ツベルクロシスに対して免疫反応を提供するように選択される、本発明のワクチンの調製方法が提供される。
第３５の態様において、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む単離されたマイコバクテリウム・ツベルクロシス抗原が提供される。
抗原は通常、可溶性Ｍ．ツベルクロシスタンパク質より成る群から選択され、それは、活発に増殖しているＭ．ツベルクロシスの培養から回収された分泌型又は細胞性のタンパク質、又は分泌型又は細胞性の可溶タンパク質の組み合わせである。短期間の培養物ろ液として抗原を提供することができる。可溶性タンパク質を含む抗原調製物を異なった大きさの範囲に分画することができる。たとえば、分画＜２０ｋＤａ、２０〜３０ｋＤａ、３０〜３５ｋＤａ、３５〜６５ｋＤａ及び＞６５ｋＤａへの最初の分離を用いて、好適な反応を提供する分画（単数）又は分画（複数）を決定することができる。これらのサイズ分画をさらに精製することができる。分泌型又は細胞性のタンパク質の精選された分画の組み合わせを最適化された各分画の比率で利用して、所望の免疫反応を引き出すことが出来る。
実施形態の１つでは、抗原は、有効な比率で存在する分泌型及び細胞性の可溶性タンパク質の有効量の組み合わせを含む。
当然のことながら、本発明は、結核に関してヒト以外の動物に適用できる。ワクチンに抗原を提供するマイコバクテリウムの種は、当該宿主にＴＢを生じるもの又は当該宿主においてＴＢを起こすマイコバクテリウム種に対する有効な防御を提供することができるものである。
従って、本発明は、宿主において結核を引き起こすことが可能であるマイコバクテリウム種に対して動物宿主において免疫反応を産生する方法も提供するが、該方法は、粘膜表面を介して動物宿主に本発明のワクチンを接種することを含み、該ワクチンは、当該宿主にＴＢを生じるマイコバクテリウムの種又は当該宿主においてＴＢを起こすマイコバクテリウム種に対する有効な防御を提供することができるものに由来する抗原を含む。
本発明はさらに、宿主において結核を引き起こすことが可能であるマイコバクテリウム種に対して動物宿主にワクチン接種する方法を提供するが、該方法は、粘膜表面を介して動物宿主に本発明のワクチンを接種することを含み、該ワクチンは、当該宿主にＴＢを生じるマイコバクテリウムの種又は当該宿主においてＴＢを起こすマイコバクテリウム種に対する有効な防御を提供することができるものに由来する抗原を含む。
本発明は、宿主において結核を引き起こすことが可能であるマイコバクテリウム種に対して動物宿主を防御する方法を提供するが、該方法は、粘膜表面を介して動物宿主に本発明のワクチンを接種することを含み、該ワクチンは、当該宿主にＴＢを生じるマイコバクテリウムの種又は当該宿主においてＴＢを起こすマイコバクテリウム種に対する有効な防御を提供することができるものに由来する抗原を含む。
本発明は、結核の再活性化に対して動物宿主を防御する方法も提供するが、該方法は、粘膜表面を介して動物宿主に本発明のワクチンを接種することを含み、該ワクチンは、当該宿主にＴＢを生じるマイコバクテリウムの種又は当該宿主においてＴＢを引き起こすマイコバクテリウム種に対する有効な防御を提供することができるものに由来する抗原を含む。
本発明は、宿主において結核を引き起こすことが可能であるマイコバクテリウム種に対して動物宿主を防御する方法も提供するが、該方法は、粘膜表面を介して動物宿主に本発明のワクチンを接種することを含み、該ワクチンは、当該宿主にＴＢを生じるマイコバクテリウムの種又は当該宿主においてＴＢを起こすマイコバクテリウム種に対する有効な防御を提供することができるものに由来する抗原を含む。
本発明はまた、本発明の方法で使用するためのワクチンの製造における、マイコバクテリウム種の少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原の使用の提供する。
本発明は、マイコバクテリウム種の少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含む抗原、粘膜アジュバント及び好適なキャリアを組み合わせることを含み、抗原がマイコバクテリウム種に対して免疫反応を提供するように選択される、本発明のワクチンの調製方法を提供する。
本発明はさらに、マイコバクテリウム種の少なくとも１つの細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは少なくとも１つのその免疫的活性部分を含むマイコバクテリウム抗原を提供する。
抗原は通常、可溶性のタンパク質より成る群から選択され、それは、活発に増殖している培養から回収された分泌型又は細胞性のタンパク質、又は分泌型又は細胞性の可溶性タンパク質の組み合わせである。短期間の培養物ろ液として抗原を提供することができる。可溶性タンパク質を含む抗原調製物を異なった大きさの範囲に分画することができる。たとえば、分画＜２０ｋＤａ、２０〜３０ｋＤａ、３０〜３５ｋＤａ、３５〜６５ｋＤａ及び＞６５ｋＤａへの最初の分離を用いて、好適な反応を提供する分画（単数）又は分画（複数）を決定することができる。これらのサイズ分画をさらに精製することができる。分泌型又は細胞性のタンパク質の精選された分画の組み合わせを最適化された各分画の比率で利用して、所望の免疫反応を生じることができる。
ＷＨＯ及びＮＩＡＩＤは、ＴＢに対する理想的なワクチンが所有すべき様々な特徴を概説している。これらの特徴には：ワクチン安全であるべきであり；動物モデルで防御を実証すべきであり；疾病のみならず感染も防御すべきであり；単回服用、必要に応じて少数回服用で防御可能であるべきで、好ましくは注射を必要としない；持続し、免疫記憶を付与し；疾病の診断のためのツベルクリン皮膚テストを妨害しない；製造コストが低く；熱安定性且つ貯蔵期間が長いこと；既存のワクチンによる防御を妨害しない；及び既存のワクチンプログラムに統合可能であるべきであることが挙げられる（ＮＩＡＩＤ、２０００年）。しかしながら、これらの必要条件をすべて満たすわけではないワクチンが未だに有用なワクチンであるとみなされていることが受け入れられている。
本発明者（ら）は、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの可溶性タンパク質の粘膜投与が結核感染に対する免疫を提供することができるという根底的な仮説の検証において、Ｃ５７マウスに対し試しに結核に対する経口ワクチンを作製し、ワクチンに対するマウスの免疫反応を調べた。
この研究は、３つの段階から成り、それは、ワクチンの作製及び分析、試験動物におけるワクチン接種の試み、及び得られる免疫反応を示す免疫パラメータの測定値である。この研究は、免疫反応を調べる技術的手順を最適化し、次いで、これらの最適化レベルで免疫反応を調べることを目的とする。これに加えて、２つの異なった経口アジュバント、コレラ毒素及びＰ．イエンセニー７０２の有効性を調べ、どちらが最大に粘膜及び全身性の免疫反応を刺激するかを見た。免疫反応は、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの分析、及び分泌型抗体ＩｇＡとＩｇＧの存在を介して調べた。
現在、ＴＢに対する複雑な免疫反応の一部が理解されている。ＴＢに対する免疫反応は、主として細胞性であり、液性ではない（Ehlers, 1999）。このことは、免疫反応に関与する免疫細胞はＴ細胞であることを意味する。マイコバクテリウムの増殖の制御にはＢ細胞及び抗体は関連性がないか又は極めて小さな役割を果たしていると考えられている（Ehlers, 1999; Lowrie, Silva & Tascon, 1997）。
ＴＢに対する免疫反応は、３つの相互に関係する相に分類される：第１は、特異的免疫の開始及び発達であり；第２には、肺における防御免疫の発現；及び第３には、この防御免疫の維持である（Sauders & Cooper, 2000）。潜在的ＴＢ感染の再活性化を招くのはこの防御免疫の破壊である。
いったん吸入されると、Ｍ．ツベルクロシスの細菌が肺胞マクロファージによって取り込まれ、肺組織に感染巣を成立させる（Silva et al., 2001）。細菌の増殖を介して、これらの病巣は広がり、マクロファージ及びリンパ球を動員して、この疾病を定義する肉芽腫を形成する（Silva et al., 2001）。それらが、生きた細菌が肺全体にわたって転移するのを阻止する一方で、感染した肺胞マクロファージの溶解への耐性により細菌に安全を与え、生体防御のメカニズムをくぐりぬける（Stenger & Modlin, 1999）。
顆粒球は維持免疫で役割を担っている。防御免疫の維持相は、肉芽腫の整合性を維持し、細菌の複製を制御する強力で長期にわたるメモリーＴ細胞の反応を必要とする（Saundeers & Cooper, 2000）。
顆粒球は、細菌増殖の制御に決定的であるだけでなく、繊細な肺胞組織に損傷を与えないようにマイコバクテリウムを制御するのに必要な毒性環境を含有することによってＴＢの維持を助けている。
マクロファージは、抗原のプロセッシング及び提示からエフェクター細胞機能に至るまでＴＢ感染において種々の重要な役割を担っている（Silva et al., 2001）。適当に活性化されたマクロファージは、生きているＭ．ツベルクロシスを破壊する能力を有するが、これは、無菌化する免疫を提供し、持続するには一般に十分ではないので（Sato, Akaki & Tomioka, 1998）、宿主の中で細菌は慢性的に生存することができる（Bermudez & Sangari, 2001）。マイコバクテリウム感染に対してマクロファージは通常、２つの主な方法で活性化される。
先ず、感染初期に、実際のマイコバクテリウムによって直接マクロファージを刺激することができ、又は感染後期にサイトカインによって間接的に刺激することができる（Tsuyuguchi, 1996）。
Ｍ．ツベルクロシスに対する免疫反応におけるＴ細胞の主なエフェクター機能は、サイトカインの分泌、細胞傷害性のエフェクター機能及び細胞接触依存性のヘルパー機能である（Boom, 1999）。これらの多様なエフェクター機能の目的は、マイコバクテリウム増殖を含有することを手伝うこと及び記憶免疫を刺激することである。二重陰性のαβＴ細胞のような非古典的なリンパ球に加えて、主としてＣＤ４+、ＣＤ８+及びgdＴ細胞が、抗原と反応し、感染肺で増殖することが明らかにされている（Feng, Bean & Hooi, 1999）。
ＴＢに対する免疫反応の知識の大半は、動物モデルから集められている（Elhay & Andersen, 1997）。多数の動物モデルが、ＴＢ免疫におけるＣＤ４+Ｔ細胞の本質的な防御の役割を指し示し、それが、ＴＢに対する免疫反応における単一の最も重要なＴ細胞サブセットであることを示している（Kaufmann & Andersen, 1998）。ＴＢを活性化する防御的ＣＤ４+Ｔ細胞の応答は、Ｔｈ１応答であり、感染と闘う典型的なＴｈ１型サイトカインを産生する（Silva et al., 2001; Havir et al., 1991）。これには、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αの分泌が挙げられる（Barnes, 1993）。
ＣＤ４+Ｔ細胞はまた、細胞傷害活性を有することが同定されている。ＣＤ４+細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のマイコバクテリウム殺傷能は、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド及び細胞傷害性の顆粒エクソサイトシス経路の双方を用いた接触依存性であり、細胞内のマイコバクテリウムを殺傷する（Stenger & Modlin, 1999）。しかしながら、ＣＤ４+Ｔ細胞の作用は、ＣＤ８+Ｔ細胞の作用によって鎮静化され、包括的な免疫反応を提供する。
証拠によって、結核に対する長期に有効な免疫反応を誘発するには、ＣＤ４+Ｔ細胞と同等に重要な役割をＣＤ８+Ｔ細胞も担っていることが示唆されている。特に、粘膜免疫を介して感作されたＣＤ８+Ｔ細胞の応答は、全身性の免疫と比べてさらに長い免疫を提供することが判明している（Feng & Briton, 2000）。ＣＤ８+Ｔ細胞はまた、サイトカイン、特にＩＦＮ−γの重要な供給源でもある（Elhay & Andersen, 1997）。
ＣＤ８+Ｔ細胞は、サイトカインの産生及び直接的な細胞傷害活性のメカニズムを介して有効である（Stenger & Modlin, 1999）。ＣＤ８+Ｔ細胞は、急性の感染に対する防御においては小さな効果しか有さないが、マウスのモデルにおいて潜在的な疾病の再活性化に対する主なメディエータであることが判明している（Andersen, 2001）。
ＣＤ４+及びＣＤ８+のＴ細胞は、双方ともにＩＦＮ−γを産生するが、動物試験では、ＴＢに対する防御ではどちらのサブセットも他を補わないことが示された（Caruso et al., 1999; Tascon et al., 1998）。
γδＴ細胞もＩＦＮ−γを産生する。γδＴ細胞は、ＩＦＮ−γのさらに効率的な産生細胞であり、強力な細胞傷害性エフェクター細胞でもある（Boom, 1999）。ＣＤ４+Ｔ細胞とともに、γδＴ細胞は、ＴＮＦ−αも産生するが、合わせて、Ｍ．ツベルクロシス感染した単球により産生されるＴＮＦ−αも高める（Boom, 1999）。
ＣＤ４+Ｔ細胞は、最も優勢且つ決定的なＴ細胞サブセットのままであるが、γδＴ細胞は、主として成熟する肉芽腫の周りで発現される相補的な役割を担う。ＣＤ４+Ｔ細胞とγδＴ細胞の間の主な差異は、Ｍ．ツベルクロシスに感染したマクロファージにより交互に提示される異なった抗原を同定する２つのサブセットの能力にある。特に、γδＴ細胞は、非ペプチド分子に対する識別可能な反応性を有する（Balaji & Boom, 1999）。
ＤＮαβＴ細胞は、ＣＤ１分子の背景でマイコバクテリウムの糖脂質と反応する小さなサブセットである。ＣＤ１分子はＭＨＣ経路と独立して抗原を提示する（Stenger & Modlin, 1999; Sieling et al., 1995）。ＤＮαβＴ細胞により認識されることが判明したマイコバクテリウム細胞壁からの糖脂質には、ミコール酸及びリポアラビノマンノース（ＬＡＭ）が挙げられる（Sieling et al., 1995）。γδＴ細胞と共にＤＮαβＴ細胞は、さらにメカニズムを提供し、それによって免疫系をマイコバクテリウム感染に感作すればよい。
ＴＮＦは、抗マイコバクテリウム免疫に決定的である（Schaible, Collins & Kaufmann）。それは、重要なサイトカインであり、ケモカイン反応の調節で重要な部分を担う。ケモカインは白血球の輸送や活性化の重要なメディエータなので、これは重要であり、従って、肉芽腫形成において肝要である（Sunders & Cooper, 2000）。
樹状細胞は、ＴＢへの防御免疫の鍵となる要素として関与するサイトカインＩＬ−１２を産生する。ＩＬ−１２は、ＣＤ４+Ｔ細胞にＩＦＮ−γを分泌させることに加えて、感作されていないナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞を活性化する（Cooper, Roberts & Rhoades, 1995）。これらのメカニズムを介して、ＩＬ−１２は、ＴＢのような細胞内細菌に対する生来の抵抗性と獲得免疫の間の架橋として作用する（Demangel & Britton, 2000）。
病原体の体内への最初の侵入ポイントは、鼻及び口である。その結果、それらが遭遇する最初の境界線は、気道及び消化管（ＧＩＴ）に並ぶ粘膜性の膜である（Laogridge, 2000）。腸管は人体で最も長い免疫器官なので、膜は、体内で最も長い病原体を阻止する表面をの一つを構成する（Pouwels et al., 1998）。毎日、体内で産生される抗体の６０％がＧＩＴに分泌される（Pouwels et al., 1998）。免疫学的に、経口ワクチンは、粘膜免疫系に有益な刺激を提供する（Richter & Kipp, 1999）。
経口ワクチンは、投与しやすく、安価であり、投与の非侵襲的方法のために患者の高いコンプライアンスが得られる粘膜ワクチンの一例である（Russell-Joses, 2000; Richter & Kipp, 1999）。経口投与は、多数に、特に途上国で投与する場合、好都合及び効率的である（Pouwels et al., 1998）。経口ワクチン接種には、人口の小さな部分の免疫後、共同社会の人員の間に免疫が広がる「集団免疫」が得られる可能性もある（Pouwels et al., 1998）。
経口ワクチン接種の限界性に焦点を当てられることが多いので、経口免疫反応を誘発するこの重要なメカニズムは軽視されることが多い。
非経口で投与されるワクチンは、全身性の免疫を刺激するのに有効であるが、これにはＴＢ免疫に重要である粘膜表面は含まれていない（Russell-Joses, 2000）。経口投与は、局所粘膜及び全身性の免疫反応の双方を刺激する能力を有し、その結果、外来性の病原体のさらに有効な排除する（Pouwels et al., 1998）。特に、粘膜に会合したリンパ系組織（ＭＡＬＴ）は、ＭＡＬＴの細胞が、主として粘膜系の内部で網状化しているので全身性のリンパ系と離した系とみなすことができる（Erickson & Hubbard, 2000）。このことは、ＭＡＬＴで創られる細胞は体中の粘膜表面に特異的に広がるので、抗原を経口投与する価値を持って防御免疫を誘導することを意味する。
研究によって、ウイルス特異的なＣＤ８+Ｔ細胞の応答は、全身性の免疫ではなく粘膜免疫による方がさらに効果的に生じることも明らかにされている（Feng & Britton, 2000）。ＣＤ８+Ｔ細胞はＴＢへの免疫反応に重要であることは確立しているので、ワクチンの経口投与は免疫系のこの態様へのアクセスを提供するはずである。
粘膜の免疫系は一定に活性があり、異なった抗原すべての間で分化しようとしつつ、毎日、免疫不全を起こすことなく、食物を含む、環境の共生生物、生きた病原体、結合分子、毒素及び炎症性作用剤に出くわしている（Kenney et al., 1997）。粘膜の免疫系が、「体中の粘膜表面すべての間で細胞と分子の変換により統合される機能的な系」であることを示唆している（Famularo et al., 1997）証拠がある。このことは、経口ワクチンによってＧＡＬＴで確立する免疫反応は、肺及び気道において粘膜免疫を付与し、そこで、マイコバクテリウムの感染が生じ、さらに効率的な免疫反応が起きることを意味する。
消化管は、消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）として知られる特殊化されたリンパ系組織を特徴とする。ＧＡＬＴにおけるリンパ系の凝集は、Ｍ（膜様）細胞として知られる特殊化された上皮細胞を特徴とする。Ｍ細胞は、小腸壁に並び（Langridge, 2000）、小腸に侵入する抗原の取り込みにおいて役割を担う（Toy & Mayer, 1996）。Ｍ細胞は、消化管内腔から物質を取り込み、それを上皮下領域に輸送する。一般にＭ細胞によって処理される粒子状物質には、たとえば、ワクチンのサブユニットに一般に見い出されるようなもののような細菌、ウイルス、原生動物及び可溶性タンパク質が挙げられる（Famularo et al., 1997）。
Ｍ細胞は、それらがワクチンベクターを粘膜のリンパ系区画に導く能力を有するので、ワクチンに関して極めて重要である（Famularo et al., 1997）。Ｍ細胞は、粒子状の抗原の結合及び輸送を促進するように設計され、エンドサイトシスに特殊化された表面を有し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、マクロファージ、樹状細胞及びリンパ球が豊富である（Famularo et al., 1997）。ここから、抗原がＡＰＣによって処理され、ＭＨＣクラスＩＩと一緒にリンパ球に提示され、言い換えれば、差し迫った免疫反応を誘発する（Famularo et al., 1997）。
粘膜免疫系は、粘膜表面を攻撃する無害な物質に対する局所及び末梢の過剰反応（過敏症）を回避するために下方調節のメカニズムを進化させている（Brandizaeg, 1998）。この進化的発達は経口免疫寛容として知られている。
用語「経口免疫寛容」は、「経口での抗原投与に続く免疫反応の抗原特異的抑制」を言う（Marth & Strober, 1997）。消化管を介したこの下方調節現象は、１つより多い免疫メカニズムが関与する（Brandtzaeg, 1998）。経口免疫寛容により、細胞性及び液性の免疫反応は双方とも抑制されるが、この免疫反応の停止は、サイトカイン産生性のサプレッサＴ細胞の生成に関係することが多い。特にワクチンに関連する細胞性免疫に関して、経口免疫寛容は、Ｔ細胞による増殖及びサイトカイン産生並びに遅延型過敏症（ＤＴＨ）の抑制の形態で、細胞性免疫を抑制できることが判明している（Marth & Strober, 1997）。経口で投与された抗原に対するＤＨＴ反応の抑制が機能的に作用してもよい一方で、ＣＭＩ全体の抑制は、経口抗原への免疫反応を受けるのに有害である。
Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ（１９９６年）は、経口免疫寛容の誘導を達成することができる多数の変数を同定した。これらには、遺伝、年齢、抗原用量、抗原投与のタイミング、抗原の構造、上皮バリアの整合性及び同時に生じる局所免疫の活性化の程度が挙げられる（Brandtzaeg, 1996）。その結果、送達される抗原用量が、経口免疫寛容を防ぐことに関連して経口ワクチンの成功に関連する。
コレラ毒素（ＣＴ）は、抗原と同時に粘膜に投与した場合、最も強力な既知の粘膜アジュバントの１つである（Del Giudice, Podda & Rapuoni, 2002）。ＣＴの使用はその高い毒性のために限られているが、部位特異的突然変異誘発によって、ＣＴの無毒のＢサブユニットが創られたが、それは粘膜アジュバントの特性を保持するが、毒性活性を欠く（Del Giudice, Podda & Rapuoni, 2002）ので、ヒトへの使用は安全になっている。
コレラ毒素サブユニットＢは、Ｍ細胞に外来物質を招き入れるＭ細胞上の分子に結合することによって作用するので、抗原提示及びそれらの抗原に対する免疫反応の刺激を高める（Langridge, 2000）。ＣＴＢを含む研究は、通常のＣＴに存在する毒性をすべて固有に欠く、組換え的に作製されたＣＴＢが依然として抗原特異的な免疫反応の誘導に対する強力なキャリア増強剤として作用することを示している（Sun, Holmgren & Czerkinsky, 1994）。
プロバイオティクスは、消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）を刺激することによってアジュバント効果を有するので（Fang et al., 2000）、粘膜の免疫反応を改善する。Ｆａｎｇら（２０００年）は、プロバイオティクスを「宿主に有益な効果を有する微生物細胞調製物又は微生物細胞の構成成分」として定義している。以前の研究によって、実験動物において、プロバイオティクスうぃ産生する乳酸、ＩｇＡの分泌を促進し、貪食作用を高め、且つ、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答のバランス及び関連するサイトカイン産生を変えることによって免疫反応を引き上げることが明らかにされている（Fang et al., 2000）。
さらなる態様において、本発明は、宿主に本発明のサプリメント又は食品を投与することを含む宿主における感染症への抵抗性を高める方法を提供する。宿主はヒトであっても動物であってもよい。当然のことながら、本発明の本態様が宿主に本発明のサプリメント又は食品を投与することを含む感染症への抵抗性を高める方法において使用するための本発明の食品及びサプリメントを製造する方法も包含する。
プロバイオティクスの特徴
プロバイオティクス効果を発揮するのに生きている必要があるプロバイオティクスは、少なくとも以下の４つの特徴を保持する。
１）工業的規模で生きた製品として調製することが可能である。
２）貯蔵条件下及び現場の条件下で長期間、安定で且つ生存力を保つ。
３）腸管で生き残る（増殖する必要はない）能力を有する。
４）宿主動物の中で有益な効果を生じなければならない。
微生物はすべて、相対的に安全性という点で、３群：非病原性、日和見病原体及び病原性に分けることができる。プロバイオティクス的使用のための微生物菌株の選択の第１段階は、それが、「安全であるとして一般的に認識されている」（ＧＲＡＳ）微生物である微生物の代表でなければばらないことである（Havenaar et al., 1992）。酪農産業では、現在使用されているプロバイオティクスには、乳酸菌（ＬＡＢ）、ビフィズス菌及び酵母が挙げられる。食品における乳酸菌の使用には長い歴史があり、ほとんどの菌株はＧＲＡＳ微生物であるとみなされる。このことは、乳中プロピオン酸菌についても当てはまる。
安全性は、プロバイオティクスにとって重要な必要条件である。日々の食品から、離乳食、乳児食、果実ジュース系製品、シリアル系製品及び医薬に至るまでプロバイオティクス生物を含有する食品の範囲を広げる要求は高まっている。新たな且つさらに特異性の高いプロバイオティクスの菌株が選抜されつつある。しかしながら、これら新規のプロバイオティクス生物は、従来の菌株の安全性を共有していない可能性がある。食品に使用する前にそれらの安全性を慎重に評価すべきである。
プロバイオティクス菌株の安全性を評価するのに３つの方法を使用することができる：菌株の固有の特性に関する検討；体内動態に関する検討；及び菌株と宿主との間の相互作用を検索することに関する検討である。プロバイオティクス菌株の安全性を調べるのに推奨されるモデル及び方法には、（１）プロバイオティクス的使用のために選択される細菌及び菌株の固有の特性、たとえば、付着因子、抗生物質耐性、プラスミド転移、酵素特性の判定；（２）細菌の代謝産物の影響の評価；（３）極端に大量の細菌を摂取した場合の急性及び亜急性の毒性の評価；（４）細胞株及びヒトの腸管粘膜分解物を用いたプロバイオティクスの試験管内での感染特性の推定；（５）動物モデル、たとえば、免疫不全にした動物又は致死的に放射線照射した動物における感染性の評価；（６）用量反応（必要とされる最少用量及び最大用量、結果として生じる健康効果）により測定される摂取したプロバイオティクスの有効性の判定、ヒト腸管の腸内細菌の組成における大量のプロバイオティクスの影響評価；（７）ヒト志願者の試験及び種々の疾病特異的状態の臨床試験における副作用の評価；（８）感染のために新しく導入されたプロバイオティクスを大量に摂取している人々の疫学的監視；（９）遺伝的に改変した菌株及び動物に由来する菌株への付加的な注意、が挙げられる。
新規のプロバイオティクスの評価は、試験管内の方法、動物モデル及びヒト被験者によって行うことができる。試験管内では、試験は、試験生物の腸管細胞を侵襲し、腸管粘膜に損傷を与える可能性の間接的な測定値を提供する。乳酸菌の菌株はほとんど、ヒト消化管の上皮細胞株、Ｇａｃｏ−２に対して侵襲性の特性を示さない。プロピオン酸菌の腸管細胞を侵襲し、腸管粘膜を損傷する能力は報告されていないし、乳中プロピオン酸菌の大量摂取に関する毒性データはない。
毒性を改変する重要な因子は、消化管における微生物の代謝である。意味深い毒性学的及び発癌的な結果は、動物消化管における微生物の酵素活性の変化の結果生じる可能性がある。結腸の腸内細菌が、食事及び内因性に生じる前駆体から突然変異原、発癌物質及び腫瘍プロモータを生成できることは一般に知られている。これらの有害な過程に関与する細菌酵素には、アゾレダクターゼ、ニトロレダクターゼ、硝酸レダクターゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−グリコシダーゼが挙げられる。乳酸菌及びビフィズス菌のプロバイオティクスの一部は、ラットの下部消化管においてβ−グルクロニダーゼ及びβ−グリコシダーゼを低下させることが示されている。
ヒトの糞便から単離されたプロピオニバクテリウムの６菌株は、β−グルクロニダーゼ活性を有することが見い出されたが（Nannno, 1986）、別の研究ではＰ．フレウデンレイチの２菌株及びＰ．アシッドプロピオニシの３菌株は、マウスにおいてβ−グルクロニダーゼを低下させることが示されが、腸内細菌のアゾレダクターゼ、ニトロレダクターゼ、硝酸レダクターゼ、及びβ−グリコシダーゼの活性を誘導する効果は有さなかった（Perez-Chaia et al., 1999）。
プロバイオティクスの開発中に、加工及び貯蔵の間における微生物の生存率を調べることは極めて重要である（Havenaar et al., 1992）。プロバイオティクスの加工方法及び貯蔵方法は、その適用方法及び投与方法によって決定される。
プロバイオティクスの消化管通過認容性の試験では生体内の結果と試験管内の結果との間で高い相関が認められている（Havenaar et al., 1992）。従って、消化管認容性によるプロバイオティクス菌株の選択は、試験管内の実験に基づくことができる（Havenaar et al., 1992）。消化管認容性のプロバイオティクス菌株を選択するのに幾つかの試験管内の方法が開発されている。最も広く使用されている方法には、ＨＣｌで酸性化した水、ブイヨン及び緩衝液の使用が挙げられる（Chou & Weimer, 1999; Chung et al., 1999; Clark et al., 1993; Clark & Martin, 1994; Wang et al., 1999）。
もう１つの試験管内の方法は、ヒトの上部消化管通過の状態を刺激するものであり、Ｃｈａｒｔｅｒｉｓら（Chrrteris et al., 1998）により開発された。擬似胃液（ｐＨ２．０）はペプシン（０．３％ｗ／ｖ）及び塩化ナトリウム（０．５％ｗ／ｖ）を含有したが、擬似小腸液（ｐＨ８．０）はパンクレアチン（０．１％ｗ／ｖ）及び塩化ナトリウム（０．５％ｗ／ｖ）を含有した。
胆汁耐性の細菌の選択は、種々のレベルの胆汁と共に寒天選抜培地で培養することによって行うことができる（Gilliand et aal., 1984; Ibrahim & Bezkoropovainy, 1993; Clark & Martin, 1994; Chung et al., 1999）。オキシガル（オキソイド）が容易に入手でき、ヒトの腸内病原体の選抜培地に広く使用されているので、その使用は、胆汁認容性プロバイオティクス菌株の選択に広く適用されている（Clark & Martin, 1994）。
腸管で生き残る及びコロニーを形成する能力は、種及び菌株の双方に依存する（Wang etal., 1999)。
腸管表面への付着は、コロニー形成及びプロバイオティクスへの免疫刺激の第１段階とみなされる（Havenaar et al., 1992）。生体内で細菌の付着を研究するのは極めて困難なので、消化管に付着する能力を持つ菌株の選択は、試験管内の試験に基づく（Tuomola et al., 1999; Sarem et al., 1996; Lehto & Salminen, 1997; Crociani et al., 1995; Maya-Makinen et al., 1983）。使用されるモデルの１つは、ヒト腸管上皮細胞株、Ｃａｃｏ−２である。Ｃａｃｏ−２細胞株は、元々、ヒト結腸腺癌から単離された（Pinto et al., 1983）。この細胞株は、標準の試験管内の培養下で、自然に分化し、分化した細胞は、成熟腸管細胞の特徴を発現する（Pinto et al., 1983）。
試験管内の方法は、プロバイオティクスの選択基準の一部の評価に好適である。にもかかわらず、試験管内の試験の結果にかかわらず、依然として生体内の実際の状態を予測するのは難しい（Havenaar, et al., 1992）。生体内での付着及びコロニー形成は、様々な動物種、微生物種の特異性及び消費される様々な食品及び餌に左右される（Havenaar, et al., 1992）。試験管内の付着は生体内での付着を保証しないが、それに続くコロニー形成は通常、生体内の有効性を予測できる。
ここで報告される結果は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２が生体内で付着し、コロニーを形成する証拠を提供する。裏づけは、ラットの試験管内試験により提供される。Ｂａｌｂ／ｃを用いた動物モデルは、試験管内で酸及び胆汁に耐性であることが示されたビフィズス菌菌株の消化管を通った生き残りを測定するに使用されている（Wang et al., 1999）。この試験では、ビフィズス菌をマウスに口から消化管を介して食べさせ、糞便中のこの菌株の生きた細胞数を測定した。糞便中におけるビフィズス菌株の回収率はたったの４．３％であることが判明した（Wang et al., 1999）。
幾つかのプロピオニバクテリウムの菌株の消化管における生き残り及びコロニー形成が、試験管内の試験、動物試験及びヒトでの試験を介して調べられている（Perez-Chaia et al., 1995; Mantere-Alhonen, 1983; Bougle et al., 1999）。Ｐ．フレウデンレイチの菌株は、試験管内でｐＨ４．８の胃消化の間生き残ることができると報告され（Mantere-Alhonen, 1983）、一方、Ｐ．アシッドプロピオニシＣＲＬ１１９８は、ＢＡＬＢ／ｃオスのアルビノマウスの消化管の中で生き残る能力が示された（Perez-Chaia et al., 1995）。ヒトの試験では、消化されたプロピオン酸菌の一部は、消化管通過で生き残れることも判明した（Bougle et al., 1999）。本発明の試験では、精選されたプロピオニバクテリウム菌株の消化管耐性が試験管内条件及び生体内条件双方のもとで調べられている。
プロピオニバクテリウム菌株、Ｐ．フレウデンレイチの亜種、シェルマニＪＳは、試験管内でヒト消化管上皮Ｃａｃｏ−２に付着できることが示されている（Lehto & Salminen, 1997）。結果はまた、Ｐ．フレウデンレイチの亜種、シェルマニＪＳの付着は、あらかじめ付着したラクトバチルス・ラーモサスＬＣ７０５により有意に低下することを示した。このことは、細菌が付着部位について競合してもよいことを示してもよい（Lehto & Salminen, 1997）。本発明の試験では、Ｃａｃｏ−２のサブクローンであるｃ２ｂｂｅｌを用いて、精選されたプロピオニバクテリウム菌株の付着能力を調べた。
生体内の試験では、Ｐ．アシッドプロピオニシＣＲＬ１１９８は、ＢＡＬＢ／ｃオスのアルビノマウスの消化管の中で定着する能力を示した（Perez-Chaia et al., 1995）。食事の停止から１週間後、マウスの消化管内容物及び消化管壁には与えられたＰ．アシッドプロピオニシＣＲＬ１１９８が多数安定した状態を保つ。それに対して、ヒトの試験では、プロピオン酸菌は消化管に付着することはできるが、コロニー形成できないことが判明した（Bougle et al., 1999）。糞便中のプロピオン酸の数は、補完停止の数日以内に補完前に観察されたレベルに戻った。
プロピオニバクテリウム菌株は乳酸塩を利用するので、乳酸ナトリウム、カゼインペプトン、酵母抽出物及び寒天を含有する酵母抽出物乳酸培地（ＹＥＬＡ）を用いて食物及び環境中の試料から単離することができる（Harrigan, 1998a; Fessler et al., 1998; Briz & Riedel, 1994; Cummins & Johnson, 1986）。
単離された菌株のプロピオニバクテリウム属への主な同定は、形態学的な顕微鏡検査、染色特性、培養特性及び簡単な生化学試験に基づく。プロピオニバクテリウムは、グラム陽性染色、抗酸性染色陰性、内生胞子の非形成、カタラーゼ陽性、乳酸発酵陽性、及び不規則形状のロッドによって近縁の細菌種から分離される（Harrigan, 1998b）。
種レベルにプロピオニバクテリウムを同定する従来の方法には、糖質発酵試験、硝酸塩還元試験、β−溶血試験、細胞及びコロニーの形態分析が挙げられる。プロピオニバクテリウム種の様々な選択された生化学特徴を表１に示す（Cummins & Johnson, 1986; Holt et al., 1997）。

表１．プロピオニバクテリウムの種を識別する特徴
Figure 0004521687
記号：＋：菌株の９０％以上が陽性；（＋）：菌株の８０〜８９％が陽性；
ｄ＋：菌株の４０〜９０％が陽性；ｄ：菌株の２１〜７９％が陽性；
ｄ−：菌株の１０〜４０％が陽性；（−）：菌株の１１〜２０％が陽性；
−：菌株の９０％以上が陰性

従来の方法はほとんど表現型の特徴に基づいているが、種の区別は、特異的な表現型の特徴における変異のために必ずしも再現可能とは限らない（Cummins & Johnson, 1986; Britz & Riedel, 1994）。従って、属及び種をさらに正確に、さらに感度良く、且つさらに迅速に同定するには、タンパク質特性研究及び遺伝的解析のような代替の分類技術を用いる（Jones & Krieg, 1986; Jones, 1986）。
タンパク質特性法は、密接に関連する生物は類似の又は同一の種類の細胞性タンパク質を有するはずであるという原理に基づく（Jones & Krieg, 1986）。典型菌株とタンパク質特性に７０％を超える同一性がある場合、ある菌株は、特定の種に属するとみなされる（Fessler, 1999）。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって、全細胞、細胞膜分画及び可溶性タンパク質分画を分離し、染色したゲルを用いて無関係の生物から関係するものを区別する（Jones & Krieg, 1986）。可溶性タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、プロピオニバクテリウムの様々な種を区別している。細胞を含まない可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性によって乳中プロピオニバクテリウムの４つの種を区別できることが報告されている（Fessler, 1999;Bear, 1987; Riedel & Britz, 1992）。これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質特性の同定法と遺伝法との間に相関があることを示している（Fessler, 1999）。
乳中プロピオニバクテリウム種の同定に適用される、パルスフィールド電気泳動法によるＤＮＡフィンガープリント及び種々のＰＣＲ法を含む幾つかの遺伝解析法がある（Gaulter et al., 1996; Melle et al., 1999; Fessler, 1999; Riedel et al., 1992）。プロピオニバクテリウムの同定に用いたＰＣＲ法及びプライマーの詳細をそれぞれ表２及び表３に要約する（Melle et al., 1999; Rossi et al., 1998;Fessler, 1999; Riedel et al., 1998; Riedel et al., 1994; Rossi et al., 1999）。
表２．プロピオニバクテリウムの同定に用いたＰＣＲ法
Figure 0004521687
 表３．プロピオニバクテリウムの同定に用いたプライマー
Figure 0004521687
様々なＰＣＲ法が様々な能力を有する。２セットのプライマー、ｇｄＩ−ｂａｋＩＩＷ及びｇｄ１−ｂａｋ４を用いたマルチプレックスＰＣＲ（ＭＰＣＲ）は、プロピオニバクテリウムを類縁属から区別することはできるが、プロピオニバクテリウムの種を区別することはできない（Meile et al., 1999）。プライマーＯＰＬ−０５を用いるＲＡＰＤ−ＰＣＲ法は、乳中プロピオニバクテリウムの４種を区別することができるが、プライマーＯＰＬ−０１、ＯＰＬ−０２、ＳＫ２、ＤＦ−４を用いたＲＡＰＤ−ＰＣＲ法は、異なった菌株を単一の種の範囲内で異なった群に分けるさらに良好な結果を生じる（Fessler et al., 1999; Rossi et al., 1998）。２３ｓのｒＤＮＡを標的とするＲＦＬＰ及びＰＣＲ（プライマーＡ及びＢ）及び制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩの使用によって、類縁種から乳中プロピオニバクテリウムを区別することができる（Fessler et al., 1998）。４つの乳中プロピオニバクテリウムの種は、１６ｓのｒＤＮＡを標的としたＰＣＲ及び制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の組み合わせを用いても分離することができる。これらの方法は、エンドヌクレアーゼ、ＡｌｕＩ、ＨａｅＩ、ＨｐａＩＩとの組み合わせで１６ｓＰ１−１６ｓＰ４．１６ｓＰ３−１６ｓＰ４のプライマー対を使用する（Riedel et al., 1998; Riedel et al., 1994）。最近、１６ｓのｒＤＮＡをコードする遺伝子を標的とする属特異的且つ種特異的な迅速ＰＣＲが開発され、環境中の試料において乳中プロピオニバクテリウムを検出した（Rossi et al., 1999）。この方法では、乳中プロピオニバクテリウム、Ｐ．アクネ、Ｐ．フレウデンレイチ、Ｐ．イエンセニー、Ｐ．アシッドプロピオニシ、及びＰ．ソエニについてそれぞれ特異的に、プライマーＰＢ１−ＰＢ２、ＰＦ−ＰＢ２、ＰＪ−ＰＢ２、ＰＡ−ＰＢ２及びＰＴ３−ＰＢ２が設計された。
ヒトの口及び腸管は、多数の細菌属のための生息環境を提供している。プロピオン酸菌は、正常な口内細菌叢として見い出され（Sutter, 1984）、ヒトの結腸でも見い出されている（Allison et al., 1989; Macfaelane et al., 1986）。プロピオン酸菌は糞便中に１０4.3〜１０12ｃｆｕ／ｇ存在することが認められる（Finegold et al., 1983; Macfarlane, 1986）。
略語
Figure 0004521687
ビタミンＢ12の分析
分光光度計、微生物アッセイ、タンパク質結合アッセイ、放射線アッセイ及び高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を含む幾つかの分析方法が、別々の試料におけるビタミンＢ12のレベルを測定するのに利用可能である。ビタミンＢ12活性には国際単位は定義されておらず、アッセイ結果は、純粋なシアノコバラミンのミリグラム、マイクログラム又はナノグラムで表現される（Ball, 1998）。
ビタミンＢ12の総含量を決定するには一般に抽出手順を必要とする（Ball, 1998）。ビタミンＢ12は動物の生組織及びほとんどの生合成的微生物において細胞内で生じるか、又は食物でタンパク質に結合している。抽出手順は、タンパク質に結合したコバラミンを遊離させ、それぞれ、シアン化物又はメタビスルフィドとの反応によって、単一且つ安定な形態、シアノコバラミン又はスルフィトコバラミンに変換する（Ball, 1998）。
食物又は微生物試料細胞からビタミンＢ12を抽出するのに幾つかの抽出方法が用いられている。ＡＯＡＣ［１９９０年までは、公式分析化学者協会で今や国際ＡＯＡＣ］の公式な方法では、１．３％のリン酸水素ナトリウム、１．２％のクエン酸水及び１．０ｇのメタビ亜硫酸ナトリウムを含有する抽出溶液における試料を１２１〜１２３℃にて１０分間オートクレーブにかける（ＡＯＡＣ、１９９５年）。０．１％のＫＣＮ、又は０．０１％のＫＣＮを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液にて１２１℃で１０分間オートクレーブにかけることによってＰ．アシッドプロピオニシ細胞のビタミンＢ12を抽出している（Chanto et al., 1994b; Quesada-Chanto et al., 1994a; Quesada-Chanto et al., 1998）。食物試料からビタミンＢ12を抽出するために記載されているもう１つの手順には、１ｍＭのシアン化カリウムを含有する０．１Ｍの酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）と共に食物試料を超音波処理にてホモジネートし、次いで１２１℃にて１０分間、混合物をオートクレーブにかけることが挙げられる（Muhammad et al., 1993c）。０．０１％のシアン化カリウム（ＫＣＮ）を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）にてプロピオニバクテリウム・フレウデンレイチ細胞からビタミンＢ12を抽出するのに１００℃にて２０分間の煮沸も用いられる（Ye et al., 1996）。水の煮沸は結合したビタミンすべてを完全には抽出しない可能性があるので（Casey et al., 1982）、水を煮沸することによる加熱よりもオートクレーブの方がさらに良好な抽出を生じるので、本発明の研究では、０．０１％のＫＣＮを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）にて１２１℃で１０分間オートクレーブにかける方法を用いて、プロピオニバクテリウム細胞からビタミンＢ12を抽出した。
放射定量法
臨床環境においてビタミンＢ12含量を測定するのに放射定量法が最初に用いられた（Lau et al., 1965）。今や、放射定量法の技術は、食物におけるビタミンＢ12のレベルを測定するように開発されている（Casey et al., 1982; Richardson et al., 1978）。
放射定量法は、放射性ビタミンＢ12とタンパク質に結合するために試料中のビタミンＢ12の競合結合能に基づく。競合結合放射定量法では、較正標準としてシアノコバラミンが推奨されている（Muhammad et al., 1993b; Muhammad et al., 1993a）。様々なビタミンＢ12形態（メチルコバラミンを除く）をジシアノコバラミンに変換する調製手順が、正確な結果をもたらすように提案されている（Muhammad et al., 1993a）。これは、ヒドロキソコバラミン、アデノシルコバラミン及びスルフィトコバラミンによるブタの固有因子に対する結合親和性がシアノコバラミンのそれと統計的に異なることが判明しているためである。しかし、ジシアノコバラミン又はメチルコバラミンの結合親和性は、シアノコバラミンのそれとは有意に違わない（Muhammad et al., 1993a）。
ビタミンＢ12の測定には、ファルマシアＢ12テスト５０ラジオアッセイ（Poston & Hemmings, 1979）及びバイオラッドＢ12／葉酸（本発明の研究で使用される）を含む幾つかの市販の放射定量キットが利用可能である（Richardson et al., 1978）。バイオラッドの市販の放射定量キットは、［57Ｃｏ］シアノコバラミンをトレーサとして、ブタの固有因子を結合タンパク質として、及びシアノコバラミンを較正標準として利用する。この市販キットの検査範囲は、５０ｐｇ／ｍｌ〜２０００ｐｇ／ｍｌである。
実施例１
生乳、チーズ及びヒト小腸生検試料からの乳中プロピオン酸菌の単離及び同定
本研究の目的は、生乳、チーズ製品及びヒト小腸生検試料からの乳中プロピオン酸菌を単離し、さらに単離した菌株の種を同定することであった。この目的のために、従来の同定法、ＡＰＩ５０ＣＨ糖質発酵特性、ＰＣＲ同定法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる全細胞の可溶性タンパク質の解析を含む様々な同定方法を使用した。
材料及び方法
参照菌株
本発明の研究を通して使用した参照菌株を表４に列記する
表４．使用した参照菌株の詳細
Figure 0004521687
菌株の再生
菌株を液体培地で再生したが、プロピオニバクテリウムには、乳酸ナトリウムブイヨン（ＳＬＢ）を、ラクトバチルスにはデマン・ロゴサアンドシャープ培地（ＭＲＳ、オキソイド）を用いて３０℃にて嫌気的に再生し、プロピオニバクテリウムでは乳酸ナトリウム寒天（ＳＬＡ）、ラクトバチルスではＭＲＳ（オキソイド）寒天の寒天プレートに播き、純度を確立した。純粋なコロニーにグラム染色を施し、カタラーゼを調べた。染色はすべて、正しい細胞形態について顕微鏡で調べた。
菌株の保存
プロピオニバクテリウム菌株をＳＬＡプレートから回収し、２０％グリセロール（シグマ）を含むＳＬＢである乳酸ナトリウムグリセロールブイヨンに再懸濁させた。細菌懸濁液１ｍＬを２ｍＬのコーニング凍結用バイアル（コーニンググラスワークス）に分注し、ドライアイスで凍結し、−７０℃で保存した。
Ｌ．アシッドフィルスＭＩＬＡ１をＭＲＳプレートから回収し、２０％グリセロールを含有するＭＲＳブイヨンに再懸濁させた。細菌懸濁液１ｍＬを２ｍＬのコーニング凍結用バイアル（コーニンググラスワークス）に分注し、ドライアイスで凍結し、−７０℃で保存した。
乳中ピオニバクテリウム菌株の単離
倫理的認可
ヒト生検試料を研究するための倫理的認可は、オーストラリアのニューキャッスル大学の倫理委員会及びオーストラリア、ニューサウスウェールズ、シドニーのシドニーアドベンチスト病院の倫理委員会双方から得た。倫理証明番号は、Ｈ６７００４９９である。
ヒト生検試料、牛乳及びチーズ試料の収集
ヒトの消化管生検試料は、オーストラリア、ニューサウスウェールズ、シドニーのシドニーアドベンチスト病院で収集し、１ｍＬのマキシマム・リカバリー・ディルエント（ＭＲＤ、オキソイド）を含有する２ｍＬのコーニング凍結用バイアルに保存し、常温にて研究室に運んだ。
生乳試料は、オーストラリア、ニューサウスウェールズ、クーランボングの酪農牧場から得た。
パルメザンチーズ（ボンラック）、スイスチーズ（デイリーグッド）、ベストクオリティゴーダ（ニュージーランド）、グラナ・パパノ・チーズ（ベンゴジ）及びヤールスバーグチーズ（ノルウェイ）を含むチーズ試料は、オーストラリア、ニューサウスウェールズ、ゴスフォードのウールワーススーパーマーケットから購入した。
乳中プロピオニバクテリウム菌株の単離の手順
１０ｇの各チーズを４０ｍＬのＭＲＤと混合することにより、１：５に希釈したチーズ試料をストマッカー袋で調製し、次いで、ストマッカー（カルワース）にて１分間消化した。
ボルテックスミキサーを用い、最大に設定して、ヒト生検試料を含有するコーニング凍結用バイアルをボルテックス混合した。
白金耳１杯の各チーズ懸濁液、ヒト生検懸濁液及び生乳試料を酵母抽出物乳酸寒天（ＹＥＬＡ）プレートに播き、３０℃にて嫌気的に１０日間インキュベートした。１０日間のインキュベートの後、ＹＥＬＡプレート上の様々な単一コロニーを取り、ＳＬＡプレートに播き、３０℃にて嫌気的に７日間インキュベートした。次いで、純粋な単一コロニーをＳＬＡスロープに播き、同定のために３ヵ月まで４℃で保存した。
従来の同定方法
種の同定スキーム
単離した菌株を同定するために、迅速な従来の同定スキームを立案した。
１．グラム陽性、カタラーゼ陽性、胞子形成なし、不規則形状の短いロッド
・・・・２つのプロピオニバクテリウム属
２．ゼラチン加水分解陽性 ・・・・皮膚プロピオニバクテリウム
ゼラチン加水分解陰性 ・・・・３つの乳中プロピオニバクテリウム
３．マルトース及びスクロースの発酵陽性 ・・・４
マルトース及びスクロースの発酵陰性 ・・・・Ｐ．フレウデンレイチ
４．β溶血陽性 ・・・Ｐ．ソエニ
β溶血陰性 ・・・５
５．硝酸の還元陽性 ・・・Ｐ．アシッドプロピオニシ
硝酸の還元陰性 ・・・Ｐ．イエンセニー
このスキームは、「グラム陽性細菌の同定のためのスキーム」（Harrigan, 1998b）及びバーギーの体系的細菌学における乳中プロピオニバクテリウムの区別特徴（Cummins & Johnson, 1986）に含有される情報から作製した。同定は、形態的特徴及び生化学的特徴（カタラーゼ試験、ゼラチンの加水分解、マルトース及びスクロースの発酵、β−溶血及び硝酸の還元）を含む表現型の特徴に基づく。
グラム染色
各菌株の単一コロニーをＳＬＡプレートから選択した。清潔な油気のないスライドに細菌の塗抹を調製した。塗抹を風乾した後、熱で固定し、クリスタルバイオレット染色（マイクロダイアグノスティクス）に３０秒間漬け、水ですすぎ、染色を乾燥させ；次いで、塗抹をグラムイオジン染色（マイクロダイアグノスティクス）に３０秒間漬け、水ですすぎ、染色を乾燥させ；９５％エタノール（マイクロダイアグノスティクス）で５〜１５秒間脱色し、サフラミン染色（マイクロダイアグノスティクス）で３０秒間対比染色した。スライドを水ですすぎ、スライドの裏の水滴をろ紙で慎重に除いた。スライドの染色を乾燥させ、光学顕微鏡にて１０００倍で調べた。
カタラーゼ試験
３％過酸化水素（ケム・サプライ）を毎日新しく調製し、使用まで４℃で保管した。各単離された細菌の単一コロニーをＳＬＡプレートから取り、木製の爪楊枝を用いて、清潔な油気のないスライド上で３％の過酸化水素により乳化した。気体泡の産生は、試験培養におけるカタラーゼの存在を示した。
ゼラチンの加水分解
１０ｘ１３０ｍｍのネジ蓋の付いた試験管にて１２％のゼラチン（オキソイド）を含有する栄養ブイヨン（ＮＢ）（オキソイド）を調製した。まっすぐな細いワイヤにて、ＳＬＡプレート上の各単離された菌株の単一コロニーを培地に播種し、３０℃にて３０日間権気的にインキュベートした。培養物を含有する試験管をインキュベータから出し、４時間、又は陰性対照の試験管を設定するまで４℃の冷蔵庫に置いた。培地の液化は、陽性のゼラチン加水分解反応を示した。
β−溶血反応
ＳＬＡプレート上の各単離された菌株の単一コロニーをヒツジ血液の寒天プレート（ＨＡＰＳ）に播き、３０℃にて７日間嫌気的にインキュベートした。次いで、溶血の徴候についてプレートをチェックした。ヒツジ血液寒天プレートは保存中又はインキュベート中に自然に溶血しうるので、播種していないヒツジ血液寒天プレートを陰性対照として用いて偽陽性の結果を防いだ。
糖質の発酵
糖質の発酵培地は、１％の各マルトース又はスクロースを含有する乳酸ナトリウムベースから成る。ネジ蓋の付いた２０ｍＬのビン（オキソイド）にて各糖質培地１０ｍＬを調製し、ヒツジ血液寒天上にて３０℃で５日間嫌気的に増殖した各単離された菌株の単一コロニーを播種した。各菌株は２組で調べた。播種したビンを３０℃にて７日間嫌気的にインキュベートした。ブイヨンの濁り又は沈殿が陽性の増殖を示した。ブイヨンの黄色の着色又は５．７より低いブイヨンのｐＨが陽性の発酵を示した。
乳中プロピオニバクテリウムの属及び種に特異的なＰＣＲ
ゲノムＤＮＡの調製
単離された６つの菌株及び参照用のプロピオニバクテリウム菌株のゲノムＤＮＡの精製は、Ｒｏｓｓｉ（１９９８年）により記載された方法に基づき、以下に簡単に概説する。
ＳＬＢブイヨン中にて４８〜７２時間、嫌気的に菌株を増殖させた。各菌株１ｍＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（サーステッド）に移し、２５００ｘｇにて５分間遠心した（ベックマン）。上清を捨てた。次いで細胞ペレットを９００μＬのＴＢ緩衝液に再懸濁した。リゾチーム（１００μＬ）（シグマ、１００ｍｇ／ｍＬ）を細胞懸濁液に加え、チューブを３０回反転することにより混合した。次いで３７℃の温水浴にて混合物を２時間インキュベートした。インキュベートの後、試験細胞を遠心（２５００ｘｇ、５分間）して回収した。上清を除き、各ペレットをＴＥ緩衝液（３７０μＬ）及び２０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（１０μＬ、ＳＤＳ）に再懸濁し、次いでチューブを１０回反転することにより混合した。ＤＮＡ分解酵素を含まないＲＮＡ分解酵素（２０μＬ）（シグマ、２ｍｇ／ｍＬ）を懸濁液に加え、チューブを２０回反転することにより混合し、３７℃の温水浴にて３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫ（８μＬ）（シグマ、１ｍｇ／ｍＬ）を加え、チューブを２０回反転することにより混合し、３７℃の温水浴にて１時間インキュベートした。過塩化ナトリウム（３Ｍ、２１５μＬ）（シグマ）を加え、チューブを３０回反転することにより混合した。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（シグマ）、次いで、間に遠心（３５００ｘｇ、５分）を挟んで、クロロホルム（アジャックス）：イソアミルアルコール（アジャックス）（２４：１）にて水性相を抽出し、各抽出後、新しいエッペンドルフチューブに移した。チューブを穏やかに５０回混合することにより、等量のイソプロパノール（ユニラボ）とともにＤＮＡを沈殿させた。遠心（３５００ｘｇ、１分）によりＤＮＡをペレットにした。次いで、ＤＮＡペレットを７０％の冷却エタノール（体積／体積）（ローヌプーラン）にて洗浄し、３０分風乾し、４℃にて一晩、１００μＬのＰＣＲ等級の水に再懸濁させた。ＤＮＡ溶液をボルテックスミキサー（ラテックス）により１０秒間穏やかに混合し、２０℃で保存した。
ＤＮＡ濃度の測定
Ｔｏｗｎｅｒ（１９９９年）により記載されるようにＤＮＡ濃度を測定した。
簡単に言えば、５μＬのＤＮＡ溶液を９９５μＬの希釈水を含有するエッペンドルフチューブに加え、ボルテックスミキサー（ラテックス）により混合した。ＤＮＡ溶液の吸収を２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで測定した。ＯＤ260／ＯＤ280の比がＤＮＡ試料の純度を示した。１．７を越える比を持つ試料を受け入れた。ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）の濃度は、１０4＊ＯＤ260に等しい。
乳中プロピオニバクテリウムの属特異的な及び種に特異的なプライマー
Ｒｏｓｓｉ（１９９９年）による記載に従って、表５のように、オーストラリア、ＷＡ、パースのジーンワークスによりプライマーが構成された。プライマー対は、ＰＢ１−ＰＢ２、ＰＦ−ＰＢ２、ＰＪ−ＰＢ２、ＰＡ−ＰＢ２及びＰＴ３−ＰＢ２である。
表５．プライマーの配列
Figure 0004521687
ＰＣＲの増幅手順
１ｘ反応緩衝液（バイオテック）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（バイオテック）、１００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ（バイオテック）、０．５μＭの各プライマー、１ＵＩのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び１μＬの希釈した標的ＤＮＡ溶液（２０ｎｇ前後のＤＮＡ）を含有する２０μＬの反応容積でＰＣＲを行った。サーマルサイクラー（コルベットリサーチ）にてＰＣＲを行った。９４℃にて４分間の最初の変性の後、使用したＰＣＲ条件は、９４℃にて３０秒間の変性、各異なった上流プライマーについて様々な温度での（ＰＡとＰＪでは６８℃、ＰＦは６９℃、及びＰＴ３とＰＢ１では７０℃）１５秒間のアニーリング及び７２℃にて１分間の伸長の４０サイクルからなる。最終サイクルの後、７２℃で５分間温度を維持し、伸長を完成させた。
乳中プロピオニバクテリウムの属特異的なＰＣＲ産物の解析
５μＬの混合物を１μＬの６ｘ試料緩衝液（バイオテック）と混合し、０．５ｘＴＡＥ緩衝液（シグマ）中に０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する１．５％のアガロースゲルを用い、１００ボルトにて２０分間のアガロースゲル電気泳動の後、観察することによって、増幅産物についてＰＣＲ混合物を解析した。電気泳動の後、Ｇｅｌ−Ｄｏｃコンピュータソフトウエア（バイオラッド）を用いて、アガロースゲルを調べ、写真撮影した。
乳中プロピオニバクテリウムを同定するためのプライマーＯＰＬ−０５を用いたＲＡＰＤ−ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡの調製及びＤＮＡ濃度の測定は、前に記載通りに行った。
プライマーＯＰＬ−０５
プライマーＯＰＬ−０５（５’−ＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣ−３’）は、オーストラリア、ＷＡ、パースのジーンワークスが構成した。
ＲＡＰＤ−ＰＣＲの増幅手順
１ｘ反応緩衝液（バイオテック）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2（バイオテック）、１００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ（バイオテック）、１μＭのプライマーＯＰＬ−０５、２．５ＵＩのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び５μＬの希釈した標的ＤＮＡ溶液（２５ｎｇ前後のＤＮＡ）を含有する２５μＬの反応容積でＰＣＲを行った。サーマルサイクラー（コルベットリサーチ）にてＲＡＰＤ−ＰＣＲを行った。９４℃にて４分間の最初の変性の後、使用したＰＣＲ条件は、９４℃にて１分間の変性、３５℃にて１分間のアニーリング及び７２℃にて２分間の伸長の４５サイクルからなる。最終サイクルの後、７２℃で５分間温度を維持し、伸長を完成させた。
ＲＡＰＤ−ＰＣＲ産物の解析
５μＬの混合物を１μＬの６ｘ試料緩衝液（バイオテック）と混合し、０．５ｘＴＡＥ緩衝液（シグマ）中に０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウム（バイオラッド）を含有する１．５％のアガロースゲルを用い、８０ボルトにて４０分間のアガロースゲル電気泳動の後、観察することによって、増幅産物についてＰＣＲ混合物を解析した。電気泳動の後、Ｇｅｌ−Ｄｏｃ（バイオラッド）を用いて、アガロースゲルを調べ、写真撮影した。
全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
全細胞の可溶性タンパク質の調製
全細胞の可溶性タンパク質の抽出は、Ｆｅｓｓｌｅｒ（１９９９年）により記載された方法に基づく。簡単に言えば、１０ｍＬのＳＬＢにて各菌株を３０℃で４８時間、嫌気的に増殖させた。細胞を遠心分離（３５００ｘｇ、１０分間）し、ペレットを１ｍＬの０．９％ＮａＣｌで２回洗浄した。次いで、ペレットを２００μＬのＴＥＳ緩衝液に再懸濁した。およそ０．５ｇのガラスビーズ（０．２５ｍｍ〜０．５ｍｍ、オーストラリアンサイエンティフィック）を懸濁液に加え、最大速度にて１分間隔で５回、懸濁液をボルテックスした。ボルテックスとボルテックスの間で少なくとも１分間懸濁液を氷上で冷やした。懸濁液を遠心し（６００ｘｇ、１０分間）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析のために、全細胞の可溶性タンパク質を含有する上清を回収した。
タンパク質濃度の測定
各試料のタンパク質濃度は、バイオラッドのプロテインアッセイ、マイクロタイター・プレート・プロトコールを用いて決定した。０．０７３、０．１３７、０．２４７及び０．３３６ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（バイオラッド）濃度を用いて、標準曲線を構成した。各標準液と試料（１０μＬ）を９６穴のマイクロタイタープレートに３連一組で入れた。タンパク質試料は必要に応じて希釈したので、読み取りは標準曲線の境界の範囲内に納まった。バイオラッドの染色試薬（１００μＬ）を各ウエルに加え、穏やかに混合した。５分間〜１時間反応させた。バイオラッドのマイクロプレートリーダー（モデル５５０）を用いて各ウエルの吸収を読み取り、試験試料のタンパク質濃度を自動的に計算させた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の条件は、Ｂａｅｒ（１９８７年）により記載されたものを改変したものである。簡単に言えば、バイオラッドのプロテアンＩＩｘｉセル冷却垂直スラブ式装置を用いて、厚さ０．７５ｍｍの垂直の１２％アクリルアミドゲルを調製した。スタッキングゲルのために上４ｃｍを残して、ガラス板の縁に沿って１２％アクリルアミド分離ゲルミックスをゆっくりピペットで入れることによって各ゲルを調製した。無菌の水を上に重層し、アクリルアミドゲルは室温で固まるのに４０〜４５分要した。水の層を慎重に捨て、上０．５ｃｍを残して、４〜４．５ｍＬの４％アクリルアミドのスタッキングゲルを分離ゲルの上に加えた。次いで、１５穴のコームをスタッキングゲルに挿入した。ゲルを静置し、３０〜３５分間で室温にて固化させた。最終タンパク質濃度１０〜１５μｇ／μＬになるように試料緩衝液で試料を希釈し、３分間９４℃に加熱した。試料（３０μＬ）を各ウエルに加えた。二重ゲルを１ｘ泳動緩衝液中に完全に浸し、定電流３０ｍＡ室温にて５時間泳動した。
クマシーブルー染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
ガラス板から慎重にゲルを外し、１ｘクマシーブルー染色（バイオラッド）に浸し、回転インキュベータ（１０ｒｐｍ）上で一定に振盪しながら室温にて３０分インキュベートした。
次いで、一定に振盪し、ゲルの背景が透明になるまで脱色液を交換しながら、室温にて脱色液に９０分間浸すことにより、ゲルを脱色した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解析
ＧｅｌＤｏｃコンピュータソフトウエア（バイオラッド）を用いてゲルを写真撮影し、バンドの特性を解析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの保存
セロファンで乾燥することによりゲルを保存した。簡単に言えば、ゲルを脱イオン水で３回洗浄し、一定で振盪しながら、ゲルドライ溶液（バイオラッド）に３０分間浸し、次いで、バイオラッドのゲルエアドライシステムによってセロファンで乾燥した。
ＳＬを用いたＡＰＩ ＣＨ５０の糖質の特性
ＡＰＩ ＣＨ５０試験紙を用いて糖質特性についてプロピオニバクテリウム菌株を評価した。製造元の指示書に従って、単離物の調製及び分析を行った。ＳＬブイヨンは増殖培地として採用した。
簡単に言えば、ヒツジ血液寒天上で３０℃にて５日間、嫌気的に各菌株を増殖させた。製造元の指示書に従って、ＳＬブイヨンを用いて、各菌株の播種材料を調製した。ＡＰＩ ＣＨ５０のキットをインキュベートし、鉱油を各チューブに加えて嫌気的条件を提供した。キットを３０℃にて嫌気的に４日間インキュベートした。インキュベートの２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間後に、検査結果を読み取った。陽性の検査は、ＳＬに含有されるブロモクレゾールの紫色の指標が黄色に変化することによって明らかにされる酸性化に相当した。エスクリン検査については、紫色から黒色への変化が陽性反応を示した。
結果
以下に要約される方法によって単離された菌株は、乳中のプロピオニバクテリウム種に同定された。
Figure 0004521687
乳中プロピオニバクテリウム菌株の存在
６種類の乳中プロピオニバクテリウム菌株が単離され、そのうち、４種類は牛乳からであり、２種類はスイスチーズの試料からであった（表６）。これら６種は、グラム陽性、カタラーゼ陽性、胞子形成なし、不規則な短いロッドであった。これら６種の単離物はゼラチンを加水分解しなかったので、乳中のプロピオン酸菌の種に包含される。
乳中のプロピオン酸菌の菌株は、パルメザンチーズ、ベストクオリティゴーダ、グラナ・パパノ・チーズ及びヤールスバーグチーズの試料からは単離されなかった（結果は示さず）。乳中のプロピオン酸菌の菌株は８７のヒト消化管生検試料からは単離されなかった（結果は示さず）。
表６．単離された菌株の名札及び起源
Figure 0004521687
プロピオニバクテリウム属に特異的なＰＣＲ法を用いた属の同定
図１は、プロピオニバクテリウム属に特異的なプライマーＰＢ１−ＰＢ２を用いた単離された６種及び参照菌株６つについて得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の特性を示す。単離された菌株の同定は、乳中プロピオン酸菌の種の参照菌株と単離された菌株のＰＣＲ産物の電気泳動特性を視覚的に比較することによって行った。調べた菌株すべてについてたった１つのＰＣＲ産物が生成された。プライマー対ＰＢ１−ＰＢ２は、乳中プロピオン酸及びＰ．アクネに特異的であることが証明されている（Rossi, 1999）。Ｐ．アクネは皮膚のプロピオン酸菌に属する（Cummins & Johnson, 1986）。従って、６種の単離物は、プロピオニバクテリウム属の菌株として同定されうるが、ＰＢ１−ＰＢ２のプライマー対の属特異的なＰＣＲを用いているので必ずしも乳中プロピオン酸菌の菌株として同定されえない。
従来の方法を用いた単離された菌株の種の同定
単離したプロピオニバクテリウム菌株の形態的特徴及び調べた生化学的特徴を表７に列記する。比較を目的として、参照菌株の一部の形態的特徴及び調べた生化学的特徴も表７に列記する。Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６を除いて、参照菌株はすべて公表されたデータ（Cummins and Johnson, 1986）に基づく予想された結果を示した。単離された菌株は、従来の迅速同定スキームによって種に同定された。Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６は、Ｐ．フレウデンレイチ種のマルトース及びスクロース発酵（Cummins and Johnson, 1986）について期待された結果を示さなかった。
乳中プロピオン酸菌はほとんどがカタラーゼ陽性である（Cummins and Johnson, 1986）。菌株Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２は、カタラーゼ検査で陰性を示したが、Ｐ．アシッドプロピオニシ菌株のたった４０〜９０％がカタラーゼ陽性であると報告（Cummins and Johnson, 1986）されているので、これは偽陽性ではない。
Ｐ．フレウデンレイチ菌株の間で硝酸塩の還元にばらつきがある。このことは、９種の同定されたＰ．フレウデンレイチ菌株の間での菌株差を示している。このばらつきは、Ｐ．フレウデンレイチ菌株による硝酸塩還元における公開されたデータ、すなわち、菌株の１１〜８９％が硝酸塩を還元する（Cummins and Johnson, 1986）ということによって支持される。
表７．調べた菌株の異なった特徴の要約
Figure 0004521687
 記号、＋：陽性反応又はｐＨが５．７より低い；−：陰性反応又はｐＨが５．７より高い
プロピオニバクテリウムの種特異的ＰＣＲを用いた単離した菌株の種の同定
単離した菌株の種特異的ＰＣＲ産物の電気泳動特性を参照菌株のそれと比較することによって単離した菌株の同定を行った。プライマー対、ＰＦ−ＰＢ２、ＰＪ−ＰＢ２及びＰＴ３−ＰＢ２（図２、図３、図４）を用いたＰＣＲ反応からＰＣＲ産物を検出した；しかしながら、プライマー対ＰＡ−ＰＢ２を用いたＰＣＲ反応からはＰＣＲ産物は検出されなかった（結果は示さず）。
図２は、プライマー対ＰＦ−ＰＢ２により生じたＰＣＲ産物の電気泳動特性を示す。菌株２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１、１００１、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２０００、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２００１、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６について、同一サイズのたった１つのＰＣＲ産物しか生じなかった。しかしながら、菌株７０２及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６はＰＣＲ産物を生じなかった。プライマー対ＰＦ−ＰＢ２は、Ｐ．フレウデンレイチに特異的であることが判明している（Rossi at al., 1999）。従って、菌株２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１及び１００１はＰ．フレウデンレイチの菌株として同定され、菌株７０２及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６ではない。この結果は、従来の同定法を用いた結果と相関がある（表７）。さらに、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６の同定状況は疑わしい。それはＰ．フレウデンレイチに属さないのかも知れない。
図３は、プライマー対ＰＪ−ＰＢ２により得られた、菌株７０２及び参照菌株のアガロースゲル電気泳動の特性を示す。菌株７０２、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７１及びＮＣＦＢ５７２により、同一サイズの１本のＰＣＲ産物が生じた。菌株Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、ＣＳＣＣ２２０７又はＰ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２ではＰＣＲ産物は生じなかった。プライマー対ＰＪ−ＰＢ２は、Ｐ．イエンセニーに特異的であることが判明している（Rossi at al., 1999）。従って、７０２はＰ．イエンセニーの菌株として同定された。
図４は、プライマー対ＰＴ３−ＰＢ２により得られた、菌株７０２及びＰ．ソエニＡＣＭ３６５のアガロースゲル電気泳動の特性を示す。Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５は同一サイズの１本のＰＣＲ産物を生じた。菌株７０２ではＰＣＲ産物は生じなかった。プライマー対ＰＴ３−ＰＢ２はＰ．ソエニに特異的であることが判明している（Rossi at al., 1999）。従って、７０２はＰ．ソエニの菌株ではなかった。
ＲＡＰＤ−ＰＣＲを用いた単離された菌株の種の同定
図５は、ＯＰＬ−０５を用いたＲＡＰＤ−ＰＣＲにより得られたアガロースゲル電気泳動の特性を示す。６種の単離された菌株の同定は、それらの電気泳動特性を参照菌株と目視比較よって行う。菌株、２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１、１００１及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６は同一サイズのたった１本のＰＣＲ産物を生じたが、菌株、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及び２４１は、いくつかの共通バンドを持つ複数のＰＣＲ産物のパターンを有した。菌株７０２、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２及び菌株Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７は、ＯＰＬ−０５を用いた同一増幅プログラムのもとで調べると、いかなる産物も生じなかった。従って、菌株、２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１、及び１００１はＰ．フレウデンレイチの菌株として同定されうるが、菌株７０２は、このＲＡＰＤ−ＰＣＲ法を用いては、同定することができなかった。
単離した菌株の全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性
６種の単離した菌株及び参照菌株の全細胞の可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。各単離された菌株の電気泳動特性を参照菌株と比較した。バンドの濃さは、同一細菌についてもタンパク質試料の様々なバッチで変化する可能性があるので（Baer, 1987）、様々な菌株のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドパターンは、バンドの濃さではなく典型的なバンドの存在によって比較した。図６及び図７は、１つの単離物、菌株７０２及び乳中プロピオン酸菌４種の参照菌株のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドパターンを示す。菌株７０２、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２及びＰ．ソエニＡＣＭ３６５の複製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドパターンは同一であった。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ同定法の高い再現性を示している。菌株７０２のバンドパターンは、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２とほぼ同一であったが、Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及びＬ．アシッドフィルスＭＩＬＡ１とは異なっていた。従って、菌株７０２は、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２に極めて近縁である。
図８は、６種の単離された菌株及びＰ．フレウデンレイチの５種の参照菌株のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドパターンを示す。単離された菌株７０２は、Ｐ．フレウデンレイチの５種の菌株とは異なったパターンを有したが、単離された菌株、２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１、及び１００１は、Ｐ．フレウデンレイチの５種の参照菌株に部分的に類似するバンドパターンを有した。
ダイス（さいころ）係数（クオリティワンソフトウエアパッケージ、バイオラッド）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質バンドのパターンの相同性を解析することによって表８において、Ｐ．フレウデンレイチの５種の参照菌株に対する単離された菌株の関連性をさらに明らかにする。相同性の百分率は、共有する遺伝的マーカー又はバンドの数を用いて算出される遺伝的関連性を示す。百分率が高ければ高いぼど菌株の類縁関係は密接になる。菌株、２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１、及び１００１のＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７と一致する比率は、他の４種のＰ．フレウデンレイチ参照菌株のいずれよりも高かった。菌株７０２は、Ｐ．フレウデンレイチの５種の参照菌株との低い一致率を有した。菌株、２０１ａ１、２０１ｂ、８０１、９０１、及び１００１はＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７と極めて類縁であるとみなされたが、菌株７０２は、Ｐ．フレウデンレイチの５種の参照菌株のいずれとも密接に関連しなかった。
表８．相関マトリクス：プロピオニバクテリウム菌株の全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる相同性
Figure 0004521687
 ダイス係数、クオリティワンソフトウエア（バイオラッド）を用いて得た相同性

表９．調べた菌株のＡＰＩ５０ＣＨ
Figure 0004521687
乳中プロピオン酸菌菌株のＡＰＩ５０ＣＨの特性
Ｐ．イエンセニー７０２のＰ．イエンセニーの参照菌株、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７１及びＮＣＦＢ５７２との差異を見るためにＡＰＩ５０ＣＨの試験紙を用いた。反応対照として、ＡＰＩ５０ＣＨの試験紙を用いて、他の３種の乳中プロピオン酸菌、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及び Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５も調べた。表９は、ＡＰＩ５０ＣＨの試験紙を用いたこれら６菌株の４９の糖質発酵パターンを提示する。
調べた菌株すべてのＡＰＩ５０ＣＨ特性（表９）を各種の公開された利用可能な糖質特性（Cummins & Johnson, 1986）と比較した。Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２及び Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５のＡＰＩ５０ＣＨ特性は、公開されたデータと相関していたが、Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７１は１つの異なった反応を有した。すなわち、Ｐ．イエンセニーの９０〜１００％が陽性を示すと報告されている（Cummins & Johnson, 1986）、サリシンを発酵できなかった。単離された菌株７０２は、Ｐ．イエンセニーの９０〜１００％が陽性を示すと報告されている（Cummins & Johnson, 1986）、Ｄ−ラフィノースを発酵できないことを除いて、Ｐ．イエンセニーで報告されているもの（Cummins & Johnson, 1986）に類似の糖質特性を有した。
考察及び結論
ＹＥＬＡを用いて６種の乳中プロピオン酸菌の菌株を単離し、従来の方法、プロピオニバクテリウム属特異的ＰＣＲ、プロピオニバクテリウム種特異的ＰＣＲ、及び全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって種を同定した。精選した参照菌株に対する単離した菌株の関連性も全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって説明した。さらに、ＡＰＩ５０ＣＨ糖質発酵特性を用いて、５種の参照菌株と１種の単離菌株（７０２）について異なった糖質特性を比較した。
６種の乳中プロピオン酸菌は、スイスチーズ及び生乳で見い出されたが、パルメザンチーズ、ベストクオリティゴーダチーズ、グラナ・パパノ・チーズ及びヤールスバーグチーズでは見い出されなかった。しかしながら、ほかの研究では、プロピオニバクテリウムは、生乳試料と同様に、グラナ、パルメザン及びパスタ・フィラタのチーズ試料から単離されたと報告されている（Rossi et al., 1998; Fessler et al., 1999）。これらの結果は、主として乳製品、ヒトの皮膚及び貯蔵生牧草であるというプロピオニバクテリウムの既知の生息環境を裏付けている（Jones & Collins, 1986; Grant & Salminen, 1998）。
本発明の研究では、８７の生検試料からは乳中プロピオニバクテリウムは単離されなかった。生検試料は、シドニー・アドベンチスト病院で集められた。この病院は、シドニー・セブンスデー・アドベンチスト教会によって設立され、菜食主義を奨励することで良く知られている。その結果、これらの生検試料は、乳中プロピオン酸菌を含有する乳製品にさらされにくい菜食主義者集団から主として集められた可能性がある。生検試料の結果は、特定の菜食主義者における差別的なビタミンＢ12のレベルが、食事摂取というより特定の食物微生物への暴露の結末であることを示している。
６種の単離された菌株は、形態的特徴及び生化学的特徴に基づいた従来の同定法によってプロピオン酸菌の種であると同定された。本発明の研究では、スクロースとマルトースの発酵、硝酸塩の還元、β−溶血及び色素沈着の色を含むたった４つの特徴を適用して乳中プロピオン酸菌の種を区別した。４つの乳中プロピオン酸菌の種を区別する特徴の１つとして推奨されている、細胞壁におけるジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の異性体は、本発明の研究では試験しなかった。
従来の方法で同定された単離された菌株の種の状況は、プロピオニバクテリウムの属特異的な及び種特異的なＰＣＲの特性によって確認された。プロピオニバクテリウムの参照菌株及び単離された６種の菌株はすべてＰＣＲ産物を発現し、それは、Ｒｏｓｓｉら（１９９９年）の知見を裏付けている。プライマーセットＰＪ−ＰＢ２及びＰＴ３−ＰＢ２を用いて調べられたプロピオニバクテリウムは、Ｒｏｓｓｉら（１９９９年）により記載されたようにＰＣＲ産物（図３、図４）を生成した。Ｐ．フレウデンレイチの５つの参照菌株のうち４つは、プライマー対ＰＦ−ＰＢ２を用いてＲｏｓｓｉら（１９９９年）により記載されたものと同一のＰＣＲ産物を生成したが（図２）、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６はＰＣＲ産物を生成しなかった（図２）。Ｐ．アシッドプロピオニシに特異的である（Rossi et al., 1999）ＰＡ−ＰＢ２を用いた場合、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１（データは占めさず）の双方について、ＰＣＲ産物は検出されなかった。Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１はＲｏｓｓｉら（１９９９年）による研究では使用されなかった。この矛盾は、ゲノムＤＮＡの調製の差異又は実験室条件の差異による可能性がある。
種特異的ＰＣＲと同様に、プライマーＯＰＬ−０５を用いたＲＡＰＤ−ＰＣＲは、この技術が、Ｐ．フレウデンレイチの菌株の間の明瞭な類似性及びＰ．フレウデンレイチとＰ．アシッドプロピオニシの菌株の間の差異を示すことを実証している。これはＲｏｓｓｉ（１９９８年）の結果と相関した。Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、菌株７０２及びＰ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２により生成されるＰＣＲ産物はなかった。このことは、プロピオニバクテリウムすべての種に適用できないというＲＡＰＤ−ＰＣＲの限界を示してもよい。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質解析は、プロピオニバクテリウム菌株の種及び菌株を区別するための迅速な技術である（Baer, 1987; Fessler et al., 1999）。菌株７０２の複製試料（図６、図７）、Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５の複製試料（図６）及びＰ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２の複製試料（図７）のほとんど一致しているＳＤＳ−ＰＡＧＥの特性は、細菌の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析が高い再現性を持つことを示している。細菌の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析再現性は、種の同定について、９２〜９８％（Costas et al., 1990; Costas, 1990）及び９３〜９７％（Tsakalidou et al., 1994）であると報告されている。
種の同定には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性の７０％相同性カットオフが推奨されている（Fessler et al., 1999）。これによって使用したＰ．フレウデンレイチの５つの参照菌株は４つの種に分離され、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１とＣＳＣＣ２２０７のみが７０％相同性を上回る（８２．８％）（表８）。２０１ａ１と８０１がＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７と同じ種であるとみなすならば、それらは、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１とも同じ種であるはずである。従って、さらに多くの参照菌株をスクリーニングし、バンドすべてのパターンの相同性を比較するのではなく、種の区別に共通するバンドを同定するには、さらなる研究が必要であってもよい。
乳中プロピオン酸菌の異なった種に対する明瞭に異なったＡＰＩ特性を用いて、種を分離することができる（表９）。Ｐ．イエンセニーの３つの菌株におけるＡＰＩ５０ＣＨの特性の変異は、菌株の差異を示す有用なツールであり、プロバイオティクスとして特定の菌株を選択するのに必須である。
実施例２
試験管内における乳中プロピオン酸菌の擬似上部消化管通過認容性及びＣ２ＢＢｅｌ細胞への付着
本研究は、ビタミンＢ12の合成が可能である幾つかの乳中プロピオン酸菌の菌株の試験管内における上部消化管通過認容性及びヒト上皮細胞への付着を評価することを目的とする。この目的で、以下、（１）擬似胃液通過条件（ｐＨ２、ｐＨ３及びｐＨ４の胃液）における乳中プロピオン酸菌菌株の生存率；（２）乳中プロピオン酸菌菌株ｐＨ２の胃液通過認容性における菜食主義者の食品の影響；（３）擬似小腸通過条件における乳中プロピオン酸菌の生存率；（４）０．３％胆汁塩を含有するＳＬＢ中での乳中プロピオン酸菌菌株の増殖；及び（５）Ｃａｃｏ−２細胞株のクローンである細胞株Ｃ２ＢＢｅｌへの乳中プロピオン酸菌菌株の付着、を調べた。
材料及び方法
細菌菌株
試験管内での消化管通過の認容性及び細胞株Ｃ２ＢＢｅｌへの付着について１３の乳中プロピオン酸菌の菌株をスクリーニングした。これらの菌株は、発酵培地（ＦＭ）におけるビタミンＢ12の合成に基づいて選択した。これらの菌株の起源及びビタミンＢ12の産生レベルを表１０に提示する。
オーストラリアのジスト・ブロケイズが、ラクトバチルス・アシッドフィルスＭＪＬＡ１及びビフィドバクテリウム・ラクティスＢＤＢＢ２を提供し、それぞれ、Ｃａｃｏ−２への付着陽性対照及び陰性対照として記載した。Ｃ２ＢＢｅｌ付着アッセイでそれらをそれぞれ陽性及び陰性の対照として用いた。
細菌菌株の再生及び保存
プロピオニバクテリウム及びＬ．アシッドフィルスＭＪＬＡ１の再生及び保存は、実施例１に記載の通りに行った。Ｂ．ラクティスＢＤＢＢ２は、強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ、オキソイド）で再生し、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ、オキソイド）上に播き、純度を確立した。グラム染色を行い、カタラーゼ試験を行い、正しい細胞形態について顕微鏡で調べた。
発酵培地における乳中プロピオン酸菌によるビタミンＢ12生成の測定
ＦＭにおける乳中プロピオン酸菌菌株によるビタミンＢ12生成の測定には、１９９８年のＱｕｅｓａｄａ−Ｃｈａｎｔｏらの方法を適用した。
簡単に言えば、乳中プロピオン酸菌をＳＬＢ中にて嫌気的に４８時間増殖させた。各菌株の４８時間培養物（２０μＬ）をＦＭブイヨンに播種し、３７℃にて４日間インキュベートした。次いで、１０ｍＬの無菌遠心管にＦＭ（１０ｍＬ）中の細菌細胞を遠心（３５００ｘｇ、１５分）により回収した。次いで、細菌のペレットを０．９％ＮａＣｌ（１０ｍＬ）にて２回洗浄した。次いで、細菌ペレットを０．１Ｍ、ｐＨ５．５のリン酸緩衝液（８ｍＬ）に再懸濁し、１％のＫＣＮ（０．１ｍＬ）（ケムサプライ）を加えた。１２１℃にて１０分間、細菌懸濁液をオートクレーブにかけた。室温まで冷却した後、５００ｘｇにて２０分間、懸濁液を遠心した。上清を回収し、ビタミンＢ12を調べるまで４℃で保存した。ビタミンＢ12のレベルは、オーストラリア、ニューサウスウェールズ、シドニーのシドニー・アドベンチスト病院にて、クアンタフェーズＢ12／葉酸アッセイキット（バイオラッド）により決定した。
ヒトの消化管上皮細胞株Ｃ２ＢＢｅｌ
細胞培養Ｃ２ＢＢｅｌは、オーストラリア、メルボルンのルドウィック研究所のマチアス・アーンスト博士から供与された。Ｃ２ＢＢｅｌは、ヒト消化管上皮細胞株である細胞培養Ｃａｃｏ−２のクローンである。
Ｃ２ＢＢｅｌ細胞の継代培養
Ｃ２ＢＢｅｌは、補完されたＲＰＭＩ１６４０を１０ｍＬ含有する２５ｃｍ3の組織培養フラスコにて３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2で７日間又は集密になるまで培養した。２日目毎に細胞に新しい補完したＲＰＭＩ１６４０を与えた。
Ｃ２ＢＢｅｌ細胞の保存
２５ｃｍ3の組織培養フラスコにて集密になるまでＣ２ＢＢｅｌ細胞を増殖させた。増殖培地を捨て、０．２５％トリプシン、０．２％ＥＤＴＡの溶液（１ｍＬ）（シグマ）を培養フラスコに加え、細胞をすすいだ。次いで、さらに１．５ｍＬの０．２５％トリプシン、０．２％ＥＤＴＡの溶液を加え、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2で１０分間又は細胞が離れるまでフラスコを静置した。パスツールピペットを用いて、５％ＤＭＳＯ（シグマ）を含むＲＰＭＩ１６４０ブイヨン（トレース・バイオサイエンシズ）１０ｍＬに分離した細胞を再懸濁した。１ｍＬの細胞懸濁液を２ｍＬのコーニング凍結用バイアルに分注し、−７０℃にて保存した。
擬似上部消化管通過の認容性試験
試験管内での胃通過の認容性及び小腸通過の認容性に関する試験は、Ｃｈａｒｔｅｒｉｓ（１９９８年）により記載された方法に基づいた。
細菌懸濁液の調製
３０℃にてＳＬＢブイヨンで４８時間、１３の乳中プロピオン酸菌菌株すべてを嫌気的に増殖させた。１ｍＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、遠心（２５００ｘｇ、５分）により細菌細胞を回収し、洗浄と洗浄の間で遠心（２５００ｘｇ、５分）して細胞をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。次いで、細菌細胞を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液１ｍＬに再懸濁した。細菌懸濁液を希釈して適当な１０8ｃｆｕ／ｍＬの濃度を得、使用まで３７℃に保存した。
擬似胃通過認容性試験
３００μＬの０．５％ＮａＣｌ又は液状の食物、２００μＬの細菌懸濁液及び１ｍＬの擬似胃液を含有する１．５ｍＬの反応容積にて擬似胃通過認容性試験をおこなった。試験混合物を最大に設定したボルテックスで１０秒間撹拌し、次いで、３７℃にて空気を強制したインキュベータで１８０分間インキュベートした。インキュベート時間の１分、６０分、９０分、１８０分で各試験混合物から等量（０．１ｍＬ）取り、混釈平板法にて生きた細胞数を測定した。
擬似小腸通過認容性試験
３００μＬの０．５％ＮａＣｌ又は液状の食物、２００μＬの細菌懸濁液及び１ｍＬの０．３％の胆汁塩を含むまたは含まない擬似小腸液を含有する１．５ｍＬの反応容積にて擬似小腸通過認容性試験を行った。試験混合物を最大に設定したボルテックスで１０秒間撹拌し、次いで、３７℃にて空気を強制したインキュベータで２４０分間インキュベートした。インキュベート時間の１分及び２４０分で各試験混合物から等量（０．１ｍＬ）取り、混釈平板法にて生きた細胞数を測定した。
混釈平板法を用いた生細胞数の測定
混釈平板法を用いて生きた細胞数を計数した。簡単に言えば、ＭＲＤブイヨンにより試験混合物の０．１ｍＬの連続希釈を作製した。選択した希釈の部分試料（１ｍＬ）を２枚のペトリ皿それぞれに移した。次いで、５０℃の温水浴で保存したＳＬＡ寒天（１５ｍＬ）をそれぞれのプレートに注いだ。前後に５回動かし、次いで５回時計回りで回し、次いで、最初の設定に対して右角で前後に５回動かし、次いで反時計回りに５回回すことによって培地と播種物を混合した。室温にて培地が固まるまでペトリ皿を静置した。培地が固まったら直ちに、ペトリ皿を反転し、３０℃にて嫌気的にインキュベートした。６日間のインキュベートの後、コロニーカウンタ（スチュアートサイエンティフィック）を用いてコロニーを数えた。
胆汁塩の存在下で乳中プロピオン酸菌菌株の増殖
胆汁認容性のラクトバチルス菌株及びビフィドバクテリウム菌株を選択するのに開発された公開された方法（Gilleland et al., 1984; Chou & Weimer, 1999; Ibrahim & Bezkirovainy, 1993）から方法を外挿した。標準化された胆汁抽出物であり、胆汁にだけ認容性の生物を増殖させる細菌培地において選択的阻害剤として広く使用されているので、本研究には、胆汁塩（オキソイド）を選択した。
３７℃にて０．３％の胆汁塩（オキソイド）を含有するＳＬＢブイヨンで増殖する能力についてプロピオニバクテリウムの菌株をスクリーニングした。プロピオニバクテリウム菌株の４８時間培養物の部分試料（１００μＬ）を３連一組で、０．３％の胆汁塩の存在下又は非存在下、１０ｍＬのＳＬＢに播種し、３７℃で５日間インキュベートした。５日間のインキュベート期間の間１０間隔にて６５０ｎｍで光学密度を測定することにより増殖程度を確定した。マイクロソフトのエクセルソフトウエアを用いて各菌株の増殖曲線（Ａ650対時間）を作成した。
ヒト消化管上皮細胞株Ｃ２ＢＢｅｌに対する付着
細菌懸濁液の調製
プロピオニバクテリウムではＳＬＢ、Ｌ．アシッドフィルスＭＪＬＡ１ではＭＲＳ、及びＢ．ラクティスＢＤＢＢ２ではＲＣＭにて３０℃で４８時間、菌株を嫌気的に増殖させた。部分試料（１ｍＬ）を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、遠心（２５００ｘｇ、５分）により細菌細胞を回収し、洗浄の間に遠心（２５００ｘｇ、５分）を挟んで１ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にて３回洗浄した。次いでＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に細菌細胞を再懸濁して適当な１０9ｃｆｕ／ｍＬの濃度を得て、付着試験まで最大１時間３７℃で保存した。
単層Ｃ２ＢＢｅｌの調製
Ｃ２ＢＢｅｌの保存培養物を３７℃の温水浴で溶解し、２５ｃｍ3の組織培養用フラスコにて、補完されたＲＰＭＩ１６４０培地（７．５ｍＬ）と混合した。５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気で３７℃にて集密になるまでＣ２ＢＢｅｌ細胞をインキュベートした。インキュベート中培地が黄色っぽい赤に変わったら、新鮮な補完されたＲＰＭＩ１６４０培地を細胞に与えた。細胞が集密になったら、補完されたＲＰＭＩ１６４０培地を取り除き、０．２５％トリプシン、０．２％ＥＤＴＡの溶液（１．５ｍＬ）をフラスコに加え、５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気で３７℃にて１０分間又は細胞が離れるまでインキュベートした。パスツールピペットを用いて、離れた細胞を３０ｍＬの補完されたＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。無菌のカバーグラス（１３ｍｍ、サーステッド）を含有する組織培養用プレート（２４穴、ベクトン・ディッキンソン）の各ウエルに細胞懸濁液の部分試料（１ｍＬ）を播いた。次いで、カバーグラス上で集密な増殖になるまで、５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気で３７℃にてプレートをインキュベートした（７〜８日前後）。インキュベート中培地が黄色っぽい赤に変わったら、新鮮な補完されたＲＰＭＩ１６４０培地を細胞に与えた。
試験管内での付着アッセイ
Ｃ２ＢＢｅｌ細胞への細菌の試験管内での付着アッセイは、Ｃａｃｏ−２細胞への付着に関する試験管内アッセイ（Tuomolz & Salminen, 1998; Samen et al., 1996）に基づいた。
マイクロタイタープレートの２４穴におけるカバーグラス上の単層Ｃ２ＢＢｅｌを１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（トレース・バイオサイエンシズ）で洗浄し、９５０μＬの新鮮なＲＰＭＩ１６４０を補完した。３７℃にて５％ＣＯ2／９５％空気でプレートをインキュベートした。マイクロタイタープレートの各ウエルに２連一組で、各細菌懸濁液の部分試料（５０μＬ）を加えた。培養物を５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気で３７℃にて２時間インキュベートした。次いでパスツールピペットを用いて、あらかじめ温めた（３７℃）ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬで４回単層を洗浄し、室温にて一晩５００μＬの固定緩衝液で固定し、走査電子顕微鏡観察に供した。
走査電子顕微鏡
１ｍＬの０．１Ｍカコジル酸緩衝液により、マイクロタイタープレートのウエルにおける組織の単層を３回洗浄した。次いで段階系列のエタノール（３０％、５０％、７０％、９０％及び１００％）で各１０分間、単層を脱水した。オーストラリア、ニューサウスウェールズのニューキャッスル大学の電子顕微鏡室に運ぶ間、単層を１ｍＬの１００％エタノールに保存した。次いで臨界点ドライヤーで単層を乾燥し、電子顕微鏡室のデシケータに保存した。
乾燥した単層は、ニューキャッスル大学の電子顕微鏡室のデビッド・フェラン氏が走査電子顕微鏡により観察した。
結果
ビタミンＢ12の産生
ビタミンＢ12の産生を表１０に示す。プロピオニバクテリウムの菌株はすべて、０．６１ｎｇ／ｍＬ〜２０．２９ｎｇ／ｍＬの範囲のビタミンＢ12を産生した。
表１０．発酵培地における乳中プロピオン酸菌のビタミンＢ12の産生
Figure 0004521687
表示結果は平均値（Ｓ．Ｄ．）である。ｎ＝２
乳中プロピオン酸菌菌株の生存率における擬似胃液（ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４）の影響
１３の乳中プロピオン酸菌菌株の生存率における擬似胃液（ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４）の影響を表１１に提示する。ｐＨ２、ｐＨ３及びｐＨ４の胃液に対する擬似通過混合物の最終ｐＨの平均は、２．３３、３．８０及び５．９７であった。
各菌株は、ｐＨ２の擬似胃液よりもｐＨ３又はｐＨ４の擬似胃液での方が高い生存率を示した（表１１）。
擬似胃液がｐＨ２であった場合、１８０分間の擬似胃液通過の間、菌株はすべて生存率の進行的な低下を示した。たった１分間の胃液（ｐＨ２）とのインキュベートの後、菌株Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、Ｐ．アシッドプロピオニシ３４１及びＰ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２は、生存率が２〜３ログの低下した（Ｐ＜０．０５）（表１１）。６０分間のインキュベートでは、たった１ログの低下しか示さなかったＰ．フレウデンレイチ８０１及びＰ．フレウデンレイチ９０１を除いて、ほとんどの菌株の生存率は、実質的に低下した。擬似胃液（ｐＨ２）とのインキュベート９０分〜１８０分後では、異なったレベルで菌株はすべて生存率の有意な低下を示し（表１１）、特に、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６は、１８０分の擬似胃液通過後、生存度を完全に喪失した（表１１）。このことは、菌株はすべてｐＨ２での擬似胃液に高感度であることを示している。
擬似胃液がｐＨ３であった場合、調べた菌株１３のうち１０は、１８０分までの擬似胃液通過の間同様の生存率を保持した（表１１）。３つの菌株、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、Ｐ．アシッドプロピオニシ３４１及びＰ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２ ＣＳＣＣ２２０６は、１８０分の擬似胃液通過の間、たった１ログサイクルの低下を示した（表１１）。このことは、調べた菌株の大半は、ｐＨ３での擬似胃液に認容性であり、胃を通過して生き残ってもよいことを示している。
擬似胃液がｐＨ４であった場合、調べた菌株はすべて１８０分の擬似胃液通過の間、同一レベルの生存率を保持した（表１１）。このことは、胃液がｐＨ４であれば、調べた１３のプロピオン酸菌菌株の細胞は胃を通過して生き残ってもよいことを示している。
表１１．乳中プロピオン酸菌菌株の生存率における擬似胃液（ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４）の影響
Figure 0004521687
 表示結果は平均値（Ｓ．Ｄ．）である。ｎ＝２
０分の時と様々なインキュベート時間での値を比較する。単一因子統計、ＡＮＯＶＡを使用
＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１
a，b，c，混合物のｐＨはそれぞれ、２．３４、３．８０、５．９７であった。
擬似胃液通過認容の間の乳中プロピオン酸菌菌株の生存率に対する食物添加の影響（ｐＨ２の胃液）
調べた乳中プロピオン酸菌菌株はすべてｐＨ２の擬似胃液（表１１）に対し高感度だったので、ｐＨ２の胃液による１８０分の擬似胃液通過の認容の間における乳中プロピオン酸菌菌株の生存率に対する影響について、２種類の菜食主義者の食物である、ソーグッド豆乳（サニタリウム）及びアップ＆ゴーシリアル朝食（サニタリウム）を調べた。擬似通過混合物の最終ｐＨの平均は、対照、ソーグッド豆乳及びアップ＆ゴーシリアル朝食についてそれぞれ、２．３３、５．２３及び５．３４であった。
一般に、擬似胃液がｐＨ２であった場合（表１２）、ソーグッド豆乳及びアップ＆ゴーシリアル朝食の添加は、各菌株の生存率を有意に改善した（Ｐ＜０．０５）。
食物添加がなければ、試験した１３の乳中プロピオン酸菌菌株すべては、ｐＨ２の胃液による１８０分の擬似胃液通過の認容の間における生存率の３．５〜８ログの低下を示した（表１２）。
ソーグッド豆乳の存在下で、試験した１３のプロピオン酸菌菌株のうち１２は、１８０分の擬似胃液通過の間、生存率の喪失を伴わずに、ｐＨ２の擬似胃液通過に対して完全な認容性を示した（表１２）。菌株Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００だけが０．３ログの生存率の低下を示した（表１２）。興味深いことに、菌株Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６は１分の擬似胃液通過で生存率にやや低下を示したが、１８０分の胃液通過の終了時、０分時と同じレベルの生存率に回復した。
アップ＆ゴーシリアル朝食の存在下では、試験した１３のプロピオン酸菌菌株のうち１１が、ｐＨ２の胃液による１８０分の擬似胃液通過を通して、同じ生存率を維持した（表１２）。菌株、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００及び菌株、Ｐ．イエンセニー７０２はたった０．３ログの生存率の低下を示した。しかしながら、ｐＨ２の胃液による１８０分の擬似胃液通過の後、アップ＆ゴーの添加なしでは、それぞれ２．６ログ及び＜１ログのＰ．イエンセニー７０２及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００に比べて、それらは、約８ログの値を持つ生存率を依然として有する。これらの結果は、胃液がｐＨ２であったとしても、調べた菌株がソーグッド豆乳又はアップ＆ゴーシリアル飲料と共に摂取されれば、試験した乳中プロピオン酸菌は、ヒトの胃を通って生き残る可能性を示している。
表１２．胃液通過中（ｐＨ２）プロピオニバクテリウムの生存率における食物添加の影響
Figure 0004521687
 表示結果は平均値（Ｓ．Ｄ．）である。ｎ＝２
０分の時と様々なインキュベート時間での値を比較する。単一因子統計、ＡＮＯＶＡを使用
＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１
a，b，c，混合物のｐＨはそれぞれ、２．３４、５．２３、５．３５である。
乳中プロピオン酸菌株の擬似小腸通過認容性
１３の乳中プロピオン酸菌株の生存率に対する擬似小腸通過の影響を表１３に提示する。
胆汁塩の非存在下で、調べた菌株はすべて、２４０分間の擬似小腸通過の間同じ生存率を保持した（表１３）。それに対して、０．３％の胆汁塩の存在下では、調べた１３の乳中プロピオン酸菌株のうち１１は、２４０分間の擬似小腸通過の間同じ生存率を維持したが、他の２菌株、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１はそれぞれ、生きた菌の数の０．２ログ及び０．９７ログの軽い低下を示した（表１３）。
表１３．乳中プロピオン酸菌株の生存率に対する擬似小腸通過の影響
Figure 0004521687
 表示結果は平均値（Ｓ．Ｄ．）である。ｎ＝２
０分の時と様々なインキュベート時間での値を比較する。単一因子統計、ＡＮＯＶＡを使用
＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１
０．３％の胆汁塩を含むＳＬＢにおける乳中プロピオン酸菌菌株の増殖
本実験における１３の乳中プロピオン酸菌菌株の増殖は、増殖ブイヨンの光学密度（Ａ650）の上昇によって証明された。ブイヨンの光学密度が高ければ高いほど、ブイヨンにおける細菌細胞も多い。Ａ650の値が０．５であった場合、乳中プロピオン酸菌菌株の生きた細胞の総数は１０8ｃｆｕ／ｍＬ前後であることが判明した（表１４）。プロバイオティクス細菌は、集団が腸管内容物の１０6〜１０8ｃｆｕ／ｇ前後の特定の最少レベルに達しないと環境に影響を及ぼすことができない。従って、Ａ650＝０．５は、本実験における乳中プロピオン酸菌菌株の有効な増殖の閾値であるとみなされる。
表１４．０．５のＡ650における乳中プロピオン酸菌菌株の生きた細胞の総数
Figure 0004521687
 図９及び表１５は、０．３％の胆汁塩と共に３７℃にてＳＬＢ中で嫌気的にインキュベートされた、６種の単離菌株、５種のＰ．フレウデンレイチの菌株及び２菌株のＰ．アシッドプロピオニシを含む１３の乳中プロピオン酸菌菌株の増殖特性を示す。
調べた１３の乳中プロピオン酸菌菌株のうち９が、５日間のインキュベート期間の間に最大増殖（Ａ650）に達した（図９、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ）。Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、Ｐ．フレウデンレイチ８０１、Ｐ．フレウデンレイチ１００１及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１（図９、Ｂ、Ｈ、Ｊ、Ｌ）を含むそのほかの４菌株は、５日間のインキュベート期間の間に最大増殖（Ａ650）に達しなかった。これは、５日後活発な増殖を示したにすぎなかったＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６で特に顕著だった（図９Ｂ）。
調べた菌株１３のうち９は、閾値の０．５より高いＡ650を有した。特に、Ｐ．イエンセニー７０２、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１は、５日間のインキュベートで１．０を超えるＡ650を得た（表１５）。それに対して、そのほかの４菌株、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、ＣＳＣＣ２２００、ＣＳＣＣ２２０１及びＣＳＣＣ２２１６は増殖閾値（Ａ650＝０．５）を超えなかった（表１５）。
調べた菌株で２４時間以内にＡ650＝０．５に達したものはなかった（表１５）。しかしながら、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、Ｐ．アシッドプロピオニシ３４１、Ｐ．フレウデンレイチ２０１ａ１及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７を含む４菌株は、４８時間のインキュベート後、０．５より高いＡ650を有した（表１５）。
表１５．プロピオニバクテリウム菌株の胆汁認容性の比較
Figure 0004521687
 平均値（Ｓ．Ｄ．）として示される結果、ｎ＝３
細胞株Ｃ２ＢＢｅｌに対する付着
細胞株Ｃ２ＢＢｅｌに対する付着について、６種の単離された菌株、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、ＣＳＣＣ２２０１、ＣＳＣＣ２２０６、ＣＳＣＣ２２０７及びＣＳＣＣ２２１６、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１を含む１３のプロピオニバクテリウム菌株を調べた。陽性対照、ラクトバチルス・アシッドフィルスＭＪＬＡ１及び陰性対照、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢＤＢＢ２は、付着能について予想どおり反応した（図１０Ａ、Ｂ）。たった１菌株、プロピオニバクテリウム、Ｐ．イエンセニー７０２だけがＣ２ＢＢｅｌに付着性であることが判明した（図１０、Ｃ、Ｄ）。調べたそのほかの１２菌株は、Ｃ２ＢＢｅｌに対し付着性はないことが判明した（写真は示さず）。
考察
経口で導入されるプロバイオティクス微生物は、少なくとも、上部消化管、すなわち、胃及び小腸で生き残ることが求められる。試験管内での酸耐性、胆汁耐性、胃液耐性及び小腸液耐性は、生体内での微生物の消化管認容性の特徴に関連している（Havanaar et al., 1992; Conway et al., 1987; Charteris et al., 1998; Chou & Weimer, 1999）。しかしながら、微生物の上部消化管通過の認容性を調べるための標準的なスクリーニング法はない。
本研究では、（１）乳中プロピオン酸菌菌株の生存率に対する擬似胃液（ｐＨ２、ｐＨ３及びｐＨ４）の異なったｐＨの影響；（２）乳中プロピオン酸菌菌株の１８０分間の胃通過（ｐＨ２の胃液と共に）の認容性に対する２種類の菜食主義者の食品、ソーグッド豆乳及びアップ＆ゴーシリアル朝食の影響；（３）０．３％の胆汁塩の存在下又は非存在下における擬似小腸液での乳中プロピオン酸菌菌株の生存率；（４）０．３％の胆汁塩を含有するＳＬＢ中の３７℃での乳中プロピオン酸菌菌株の嫌気的増殖を含む、上部消化管通過の認容性について、１３の乳中プロピオン酸菌菌株を試験管内でスクリーニングした。
酸認容性とは、低ｐＨ条件で生き残る微生物の能力を言う。耐酸性スクリーンイングに対して協定規則はない。ｐＨ１〜ｐＨ５の範囲で、ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム及び乳中プロピオニバクテリウムの菌株の酸認容性を試験管内でスクリーニングするのに使用した（Mantere-Alhonen, 1983; Charteris etal., 1998; Clark et al., 1993; Conway et al., 1987; Chou & Weimer, 1999; Chung et al., 1999）。微生物の生き残りに対する低ｐＨの抑制効果は、本研究のみならず、他の幾つかの研究で認められている（Hood & Zottola, 1988; Clark et al., 1993; Chung et al., 1999; Jan et al., 2000）。本研究では、試験した１３の乳中プロピオン酸菌菌株すべてで、３時間にわたるインキュベートで擬似胃液におけるｐＨ２において生存率の大きな低下が示された（表１１）。これは、３時間のインキュベート時間の後、生細胞が全く検出されなかったＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６で特に顕著だった。ｐＨ３では、１０菌株の乳中プロピオン酸菌は、３時間のインキュベート後、一定の生存率を維持したが、それに対して、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６３及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１の細胞数は有意に低下した。ｐＨ４では、調べた菌株すべての細胞数は、３時間のインキュベート後一定を維持していた。Ｈｏｏｄ及びＺｏｔｔｏｌａ（１９８８年）は、最初の細胞数１０7〜１０8ｃｆｕ／ｍＬから４５分後、ＭＲＳブイヨン、塩化カリウム緩衝液及びフタル酸カリウム緩衝液中のｐＨ２でＬ．アシッドフィルスＢＧ２Ｆ０４の細胞数が０まで急激に低下することを報告した。ｐＨ３では、Ｌ．アシッドフィルスＢＧ２Ｆ０４の細胞数は、ＭＲＳブイヨン及び塩化カリウム緩衝液中で２時間にわたって一定を維持したが、フタル酸カリウム緩衝液中では３０分後細胞数はゼロまで急激に低下した。ｐＨ４では、Ｌ．アシッドフィルスＢＧ２Ｆ０４の細胞数は、ＭＲＳブイヨン、塩化カリウム緩衝液及びフタル酸カリウム緩衝液の中で２時間、同一を維持した。Ｃｌａｒｋら（１９９３年）は、３７％ＨＣｌ溶液を用いて、ｐＨレベル１、２及び３に対する４菌株のビフィドバクテリウムの反応を調べた。ｐＨ１では、ビフィドバクテリウム菌株の数は、急激に低下し、特に、Ｂ．ビフィズムは１時間後ゼロに低下した。ｐＨ２では、Ｂ．インファンティス、Ｂ．アドレスセンティス、及びＢ．ロングムの数の減少はなかったが、それに対して、Ｂ．ビフィズムの数は、１時間後当初の数の１０％に減少し、２時間後、生細胞は検出されなかった。ｐＨ３では、ビフィドバクテリウムの４菌株の細胞はすべて、３時間のインキュベートの間生き延びた。Ｊａｎら（２０００年）は、ｐＨレベル２、２．５、３及び４で酸性化されたチーズにおいてプロピオン酸菌の生き残りを調べた。１時間のインキュベート後、ｐＨ３又は４では、生存率に有意な損失は認められなかった。それに対して、最終ｐＨ２．５又はｐＨ２に酸性化されたチーズでは、生きた細菌の数の急激な減少が検出された。
この現在の研究の結果（表１１）は、他の研究者のもの（Hood & Zottola, 1988; Clark et al., 1993; Chung et al., 1999; Jan et al., 2000）と同様に、胃の通過の間、微生物の生き残りに影響する鍵となる因子はｐＨであることを実証している。結果はまた、一部の菌株は、他の菌株よりも強い酸耐性を有することを示している。
胃の通過を介した微生物の生き残りは、ｐＨに依存するだけでなく、食品及び食品成分の存在に影響される（Conway et al., 1987; Charteris et al., 1998; Wang et al., 1999）。Ｃｏｎｗａｙら（１９８７年）は、１０％の脱脂粉乳の添加により、胃液におけるラクトバチルス菌株の生き残りが有意に高められることを報告した。Ｃｈａｔｅｒｉｓらは、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウムの生存率が乳タンパク質（カゼイン酸ナトリウム及び乳清タンパク質）の添加によって改善されることを見い出した。本研究では、ソーグッド豆乳及びアップ＆ゴーシリアル朝食を添加することにより、ｐＨ２の擬似胃通過の間、試験した１３の乳中プロピオン酸菌菌株の生存率は大きく改善された。ソーグッド豆乳及びアップ＆ゴーシリアル朝食の天下により胃通過混合物のｐＨの上昇があった（表１２）。従って、生存率の改善は部分的には、食品添加による擬似胃液のｐＨの上昇による可能性もある。しかしながら、別の物理的保護メカニズムがある可能性もある。胃通過を介した微生物の生存率の向上は、食品又は、たとえば、緩衝化された溶剤若しくはカプセル化システムのようなもう１つの好適な送達システムを介して、それらが多数小腸に送達される限り、低い酸認容性の菌株はかならずしもプロバイオティクス適用から除外されなくてもよいことを示している。
小腸通過の認容性（胆汁認容性を含めて）は、プロバイオティクス菌株が小腸でコロニー形成するのに必須である。胆汁がなければ、調べた１３の菌株はすべて４時間の擬似小腸通過の間、生存率の低下を示さなかった（表１３）。胆汁が存在しても、それぞれ０．２ログ及び０．９７ログ生存率が低下したＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７及びＰ．アシッドプロピオニシ３４１を除いて、調べた菌株はほとんどすべて、４時間のインキュベートの後、同じ生存率を示した（表１）。このことは、試験した１３の乳中プロピオン酸菌菌株が小腸通過の間、生き残ることができることを示している。
微生物学的用語では、胆汁認容性は、胆汁の存在下で生き延びるのみならず、複製することも意味する。調べた１３の乳中プロピオン酸菌菌株すべてが、０．３％の胆汁塩の存在下で増殖することができた（図９）。しかしながら、５日間のインキュベートの間、様々な菌株が様々な最大増殖（Ａ650）を生じた。２０％胆汁の存在下でＰ．アシッドプロピオニシは、乳中プロピオン酸菌菌株の間では最もよく増殖できることが分かっているので（Commins & Johnson, 1986）、Ｐ．アシッドプロピオニシの２つの菌株が、Ｐ．イエンセニー及びＰ．フレウデンレイチよりも高いＡ650を生じた（表１５）ことは驚くことではない。注目すべきことに、Ｐ．イエンセニー７０２も０．３％の胆汁を含むＳＬＢ中で高い増殖（Ａ650）を生じた。Ａ650＝０．５の閾値レベルによって、可能性のあるプロバイオティクス候補として、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１、Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６及びＰ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６を除外してもよい。
プロバイオティクス菌株が有効であるためには、消化管に付着力が必須である。付着性の菌株の選択は、試験管内における消化管細胞への付着に基づくことができる。細胞株Ｃ２ＢＢｅｌは、細菌の付着を研究するのに初めて用いられた。参照菌株、Ｌ．アシッドフィルスＭＪＬＡ１及びＢ．ラクティスＢＤＢＢ２の付着の結果は、Ｃ２ＢＢｅｌが細菌の付着をスクリーニングするのに好適であることを示している。本研究では、１３の乳中プロピオン酸菌菌株のうちたった１菌株、Ｐ．イエンセニー７０２だけがＣ２ＢＢｅｌに付着性であることが見い出された。
結論
可能性のあるプロバイオティクスとしての使用のために、本研究は、標準の試験管内の方法によって１３の乳中プロピオン酸菌菌株をスクリーニングした。消化器認容性及び付着を比較した結果、たった１菌株、Ｐ．イエンセニー７０２だけがさらなる生体内の研究に対する好適な候補であることが見い出された。
本研究によって、相対的に高い胃の認容性を持つ３種の乳中プロピオン酸菌菌株を明らかにした。さらに、食品の存在が、胃通過中の乳中プロピオン酸菌菌株の生存率を明らかに向上させるので、酸認容性は必ずしも、可能性のあるプロバイオティクスの必須の選択基準ではないことが示唆されることがわかった。
実施例３
ウイスター系オスラットにおける経口投与された生きたプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の生存率、安全性及びプロバイオティクス効果
新規のプロバイオティクス菌株は、食品に組み込まれる前に安全性だけでなく有効性についても評価される必要がある。本研究の目的は、オスのウイスター系ラットのモデルを用いてＰ．イエンセニー７０２の安全性及び可能性のあるプロバイオティクス効果を評価することであった。この目的のために、以下、（１）急性の経口毒性；（２）肝臓、腸間膜リンパ節及び脾臓組織への細菌細胞の転座；（３）糞便中の好気性及び嫌気性の細菌；（４）糞便中のβ−グルクロニダーゼのレベル；（５）ラットの精巣の組織学的変化；（６）Ｐ．イエンセニー７０２の小腸への付着；（７）Ｐ．イエンセニー７０２の小腸内容物中の数；（８）血清中のビタミンＢ12及びホモシステインのレベル；及び（９）総コレステロール及び中性脂肪、を調べた。
材料及び方法
倫理的認可
動物の使用を含む本研究の倫理的認可は、オーストラリア、ニューサウスウェールズのニューキャッスル大学の倫理委員会から得た。倫理証明番号は、７１８０９０２である。
ラットの餌用の細菌懸濁液の調製
生乳（実施例１）から単離されたＰ．イエンセニー７０２を本研究では使用した。Ｐ．イエンセニー７０２の再生及び保存は以前、実施例１で記載通りに行った。
餌用の細菌懸濁液は、以下のように調製した。それぞれ２０ｍＬのＳＬＢブイヨンを含有する２０のマッカートニーボトルにて３０℃で３日間、菌株、Ｐ．イエンセニー７０２を嫌気的に増殖させた。次いで、培養物を２本の無菌の２５０ｍＬの遠心管に移した。細菌細胞を遠心（３５００ｘｇ、５分）により回収した。上清を捨て、各洗浄の間に遠心（３５００ｘｇ、５分）を挟みながら、細胞ペレットを０．８５％ＮａＣｌ（シグマ）６０ｍＬで２回洗浄した。細菌細胞を３０ｍＬの０．８５％ＮａＣｌに再懸濁し、細菌懸濁液の部分試料（３．５ｍＬ）を５ｍＬの無菌試験管に分注し、７日まで４℃で保存した。混釈平板法によって細菌懸濁液の生細胞数を調べた。この方法を用いて、細菌懸濁液の生細胞数は、１０10ｃｆｕ／ｍＬ前後（生データは示さず）であることが分かった。
動物及び給餌法
動物モデルは、Ｋａｗａｔａら（１９９７年）により記載されたものから改変し、ウイスター系離乳ラットを用いた。Ｋａｗａｔａの餌を用いた以前の実験（データは示さず）は、実験完了前に安楽死を必要とする重篤な栄養不良を招いた。Ｋａｗａｔａら（１９９７年）により記載された方法とは異なって、本研究のラットは、正常で健康な母親から生まれ、離乳まで正常なラットの餌を与え、本研究の処理期間の間、全ラットに市販のペレット化した餌、ビタミンＢ12欠乏改変餌（ＩＣＮ）を食べるよう馴化した。
動物維持施設に到着した際、離乳ラットを無作為に３群、すなわち、欠乏群（ＶＤ）、細菌群（Ｂ）及び対照群（ＶＣ）に分け、各群は７匹のラットを含んだ。各群３ケージ、１ケージに２〜３匹を収容した。第１週では、５０％正常餌及び５０％ビタミンＢ12欠乏改変餌をラットに与えた。第１週の後、ラットすべてにビタミンＢ12欠乏改変餌を与え、試験期間中、この餌で維持した。過剰に無菌の水を飲料として与え、第２週から、飲水中で、０．８５ＮａＣｌ中の１μｇ／ｍＬのシアノコバラミン（シグマ）（対照グループ）、０．８５％ＮａＣｌ（欠乏群）又は０．８５ＮａＣｌ中の１０10ｃｆｕ／ｍＬのＰ．イエンセニー７０２（細菌群）を１％の補完物として各群に与えた。毎日、吸水ビンの水を変え、各群の補完物を添加した。
ラットのモニタリング
実験を通して、餌及び水の摂取、動物の活動性、行動、及び一般的な健康状態を毎日モニターした。水及び餌は自由摂取としたので、個々の摂取の測定はできなかったが、ケージ毎の餌及び水の総摂取を測定し、ラット当たりの平均を決定した。個々のラットの体重は週１回測定した。
ラット糞便中の生きた細菌数
月に１回、床にペーパータオルを敷いた個別ケージにラットを一晩入れ、細菌数及びグルクロニダーゼのレベルを調べるために、各ラットの２４時間の糞便を回収した。糞便中の生きた細菌の計数方法は、Ｗａｎｇら（Wang etal., 1999）の方法に基づいた。
ラット糞便の連続希釈の調製
各ラットの糞便を２０ｍＬの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に回収し、検査前２４時間まで４℃で保存した。ヘラを用いて撹拌することにより糞便懸濁液を調製し、次いで、ボルテックスミキサーにより最大に設定した１０秒間撹拌した。糞便懸濁液が混ぜるには濃すぎる場合、５〜１０ｍＬの余分の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を加え、混ぜ易くした。次いで１ｍＬの注射器を用い、１ｍＬの糞便懸濁液を９ｍＬの半強度のウイルキンス−チャルグレンアナエローブブイヨン（ＷＣＡＢ）（オキソイド）に移すことによって、１／１０の希釈液を調製した。９ｍＬの半強度のＷＣＡＢを用いて、さらなる連続希釈を行った。
ラット糞便における細菌の生細胞の計数
プレート塗布法により、ラット糞便中の細菌生細胞の数を測定した。簡単に言えば、上述のように調製した選択した希釈液１００μＬを栄養寒天（ＮＡ）（オキソイド）、ウイルキンス−チャルグレンアナエローブ寒天（ＷＣＡＡ）（オキソイド）及びＳＬＡのプレート上に移した。播種物（１００μＬ）を曲がったスプレッダによって各プレート上で穏やかに且つ均一に広げた。１５分間又は各プレート上の播種物が完全に吸収されるまで室温にて実験台でプレートを静置した。プレートを反転し、次いでＮＡプレートは３７℃にて４８時間、ＷＣＡＡプレートは３７℃にて嫌気的に５日間、及びＳＬＡプレートは３０℃にて嫌気的に５日間インキュベートした。ＮＡ及びＷＣＡＡにおけるコロニーをそれぞれ、好気性の生細胞の総数及び嫌気性の生細胞の総数について計数した。ＳＬＡプレートを調べ、乳中プロピオン酸菌の典型的なコロニーを乳中プロピオン酸菌について計数した。
βーグルクロニダーゼの検査
Ｎａｎｎｏ（１９８６年）により記載された方法に従って、β−グルクロニダーゼの活性を測定した。糞便の連続希釈液を上述のように調製した。選択した糞便希釈液（０．１ｍＬ）又は細菌懸濁液（０．１ｍＬ）を、０．９ｍＬの反応混合物を含有する５ｍＬの試験管に加えた。試験管を３７℃にて２時間インキュベートした。次いで、グリシン−ＮａＯＨ−ＮａＣｌ緩衝液（０．２３Ｍ、ｐＨ１０．４、２．５ｍＬ）を各試験管に加えて、反応を停止した。次いで、反応溶液を３５００ｘｇにて３０分間遠心し、分光光度計（ファルマシアバイオテック）を用いて、４００ｎｍにて上清の吸収を測定した。
ｐ−ニトロフェノール（シグマ）で標準液を作製した。０．１、０．２、０．５、１及び１０ｍＭのｐ−ニトロフェノールを用いて標準曲線を構成した。１００万単位（１ＭＵ）を１時間で１ｍｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを放出するのに必要な活性として定義した。
ラット血液における血清ビタミンＢ12及びホモシステインのレベル
処理の開始時（０ヵ月）、ｌヵ月目の終わり、２ヵ月目の終わりに各ラットの血液試料を伏在静脈から採取した。３ヵ月目の終了時、麻酔下で心臓穿刺により血液を採取し、回復させないまま二酸化炭素ガスで安楽死させた。血液試料は最高２時間まで氷上に保存し、遠心（４５０ｘｇ、１０分、４℃）により血清を細胞成分から分離した。血清試料をエッペンドルフチューブに移し、検査まで−７０℃で保存した。細胞成分も−７０℃で保存した。
血清ビタミンＢ12のレベルは、オーストラリア、ニューサウスウェールズ、シドニーのシドニーアドベンチスト病院の病理ユニットにてクアンタフェーズＢ12／葉酸アッセイ（バイオラッド）によって測定した。
０ヵ月目、１ヵ月目及び２ヵ月目の試料の血清ホモシステインはアボットＩＭｘにより、３ヵ月目の試料の血清ホモシステインは、ＤＰＣイムライト２０００により、シドニーアドベンチスト病院の病理ユニットにて測定した。
細菌菌株、Ｐ．イエンセニー７０２の給餌の転座試験
Ｐ．イエンセニー７０２の給餌の転座試験は、Ｚｈｏｕら（２０００年）の方法に基づいて設計された。方法の詳細は以下である。
実験の終了時、ラットを安楽死させて解剖した。組織試料を切り出す前に、無菌の細菌学用綿棒（ＩＤＥＸＸ獣医病理サービス）で臓器の表面をぬぐった。次いで、綿棒をブレインハートインフージョン寒天（ＢＨＡ）（オキソイド）プレート及びＳＬＡプレートの上を這わせ、臓器表面の微生物的無菌性を調べた。ＢＨＡプレートを３７℃にて３日間嫌気的にインキュベートし、プレート上の微生物増殖をチェックした。次いで、ＳＬＡプレートを３０℃にて６日間インキュベートして微生物の増殖及び乳中プロピオン酸菌の典型的なコロニーの存在をチェックした。
ぬぐい取りに続いて、内蔵臓器のサイズ及び外観を顕微鏡で調べた。次いで、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、脾臓及び肝臓組織の試料を無菌的に切り出した。組織試料をすでに重量を測定し、２ｍＬのブレインハートインフージョンブイヨン（ＢＨＩ）を含有する５ｍＬの容器に回収し、再び重量を測定した。次いで、最後に測定した生体重（ｇ）で割った実際の脾臓重量として脾臓重量指数（ＳＷＩ）を決定した。次いで、腸間膜リンパ節、脾臓及び肝臓の一部を無菌的に小さく刻んだ。組織懸濁液及び心臓穿刺で得た血液試料を別々にＳＬＡ及びＢＨＡのプレートに載せた（各プレートで０．１ｍＬ）。ＢＨＡプレートを３７℃で３日間嫌気的にインキュベートして微生物の増殖をチェックした。次いで、ＳＬＡプレートを３０℃にて６日間嫌気的にインキュベートして微生物の増殖及び乳中プロピオン酸菌の典型的なコロニーの存在をチェックした。
小腸部分における乳中プロピオン酸菌の計数
体の解剖の間で、回腸部分を内容物と共に（１０ｃｍ）無菌的に切り出し、すでに重量測定した５ｍＬのＢＨＩブイヨンを含有する３０ｍＬの容器に回収し、処理するまで氷上で保存した。
回収して２４時間以内に、回腸部分を長手方向に切り開き、内容物から分離した。次いで、回腸部分の組織をもう１つの３０ｍＬの容器に入れ、５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。小片（約１ｃｍ）を走査電子顕微鏡用の解剖トレイのワックスにピンで固定した。次いで回腸部分の組織の残りを秤量し、２ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で細かく刻んだ。小腸組織の懸濁液を１分間激しくボルテックスした。９ｍＬのＭＲＤ（オキソイド）を用いて、回腸部分の内容物及び組織懸濁液の連続希釈液を作製した。選択した希釈液をＳＬＡプレートに載せた（各プレートで０．１ｍＬ）。次いで、ＳＬＡプレートを３０℃にて６日間インキュベートして乳中プロピオン酸菌の典型的なコロニーの存在をチェックした。
小腸組織の試料の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
ＳＥＭのための試料調製は、ＢｒｏｏｋとＦｕｌｌｅｒ（１９７５年）及びＳｗｉｆｔとＭａｒａｓｈ（１９６８年）の方法に基づいた。簡単に言えば、あらかじめ解剖トレイのワックスにピンで止められた回腸部分の組織片を１０％ホルマール生理食塩水（ＩＤＥＸＸ−獣医病理サービス）中で室温にて２時間浸漬することによって固定した。固定後、組織をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。次いで、エタノールの段階系列（３０％、５０％、７０％、９０％、及び１００％）を用い、各１０分間で組織を脱水した。次いで、走査電子顕微鏡を用いて、デビッド・フェラン氏がさらに組織を処理して調べるためオーストラリア、ニューサウスウェールズのニューキャッスル大学の電子顕微鏡ユニットに輸送する間、組織を２４穴マイクロプレートに移し、１ｍＬの１００％エタノール中に保存した。
精巣の形態の検討
死亡後、直ちにラットの精巣を取り出し、重量を測定し、一本の長手切開を入れて、１０％ホルマール生理食塩水（ＩＤＥＸＸ−獣医病理サービス）中に保存した。最後に測定した生体重１００ｇに対する精巣重量（ｇ）として相対的精巣重量を求めた。オーストラリア、ブリスベンのＩＤＥＸＸ−獣医病理サービスによって精巣の組織病理が調べられた。
統計学的解析
両側スチューデントのｔ検査又は一方向ＡＮＯＶＡ（マイクロソフト、エクセルソフトウエア）のいずれかを用いて異なったラット群から得られたデータを統計的に解析した。本文及び表の中の統計的データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。図におけるデータは平均値として表し、エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表した。指示がない限り、＜０．０５のＰ値を有意とした。
結果
一般的な健康状態
実験を通して、ラットは、健康で、探究心旺盛で且つ活動的であると思われた。病気や死亡はなかった。実験の最後の月、欠乏群で活動性が低下したと思われ、ラットは取り扱いに苛立っていた。動物の毛並みで観察可能な差異は群間に見られなかった。
餌の摂取及び生体重の増加
３つの試験群の間で体重増加に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）（表１６、図１１）。細菌群の餌摂取は、対照群及び欠乏群よりも有意に高かった。このことは、Ｐ．イエンセニー７０２を伴った給餌は、細菌群のラットの食欲を刺激したことを示している。
表１６．８１日間の処理の間のウイスター系オスラットの様々な群の体重、体重増加（ｇ）及び餌摂取（ｇ）の比較
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
細菌群の水の摂取及び細菌用量
細菌群の各ケージの水の摂取を毎日測定し、ラット当たりの平均の水摂取を計算した。図１２は、Ｐ．イエンセニー７０２の懸濁液を与えた細菌群における各ケージの毎日の平均水摂取を表す。
水中で与えられるＰ．イエンセニー７０２の濃度を前述に記載の通りに混釈平板法で測定し、１日当たりラットの飲水で提供されるＰ．イエンセニー７０２の平均ログ値は、８．７９±０．３６（ｎ＝１２）と算出された（生データは示さず）。このデータから１日当たりの平均細菌摂取量を算出した（表１７）。ラットの成長につれて水摂取量が比例して上昇するという公差はなかった。
表１７．細菌群（ｎ＝７）のウイスター系オスラットによる毎日の平均水摂取及びＰ．イエンセニー７０２の摂取
Figure 0004521687
 Ｐ．イエンセニー７０２細胞の転座
３つの実験群のラットの内臓表面から取った綿棒からは細菌の増殖はなく、このことは、内臓表面が細菌で汚染されていないことを示している。
３つの実験群のいずれも菌血症は検出されなかった。血液、脾臓、腸間膜リンパ節及び肝臓試料のいかなる培養にもＰ．イエンセニー７０２の増殖はなかった。このことはＰ．イエンセニー７０２の血液及び組織への転座はないことを示し、それは、Ｐ．イエンセニー７０２の摂取が、宿主の組織細胞にいかなる侵襲も生じないことを示唆している。
内臓臓器の検査
顕微鏡検査は、各群間で、内臓臓器のサイズ及び外観に差異がないことを示した。肝腫脹及び脾腫脹も生じなかった。
ラットの脾臓重量及び脾臓重量指数を表１８に示す。対照群、欠乏群及び細菌群で脾臓の重量に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。細菌群における脾臓重量指数は、欠乏群より有意に小さかったが（Ｐ＜０．０５）、細菌群又は欠乏群の脾臓重量指数は、対照群と有意差がない（Ｐ＞０．０５）。細菌群と欠乏群の脾臓重量指数の差異は、有意ではないが体重の差異による可能性がある。
表１８．３ヵ月間ビタミンＢ12欠乏餌で飼育したウイスター系オスラットの様々な群の脾臓重量（ｇ）、脾臓重量指数（ｍｇ／ｇ）
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
糞便中の生きた細菌の数
糞便中の好気性菌の総数
８１日間の処理期間の間のウイスター系オスラットの３つの実験群における糞便中の好気性菌の総数のレベルを表１９に示す。
各実験群の中で、３６日目、６４日目及び８１日目の糞便中の好気性菌の総数を０日のものと比較した。細菌群の３６日目及び６４日目の糞便中の好気性菌の総数は０日のものより有意に多かった（Ｐ＜０．０５）、が、８１日目までに、細菌群の糞便中の好気性菌の総数は０日と同じレベルに減少した（Ｐ＞０．０５）（表１９）。同じパターンが対照群及び欠乏群でも認められた（表１９）。この結果は、Ｐ．イエンセニー７０２が糞便中の好気性菌集団に影響を及ぼさないことを示している。
各検査時期で、異なった実験群の糞便中好気性菌の数を比較した（表１９）。３６日目では、欠乏群及び細菌群の糞便中好気性菌の総数は対照群よりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。しかしながら、６４日目及び８１日目では、対照群、欠乏群及び細菌群の糞便中好気性菌の数は有意に違わなかった（Ｐ＞０．０５）。
表１９．処理中のウイスター雄ラットの糞便中好気性菌の総数（log cfu/g)
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
各群内で３６日目、６４日目及び８１日目の値を０日と比べた、＊ｐ＜０．０５（両側スチューデントのｔ検査）
各検査時期で、異なった実験群の値を互いに比較した；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
糞便中の嫌気性菌の総数
８１日間の給餌期間の間のウイスター系オスラットにおける糞便中の嫌気性菌の総数のレベルを表２０に示す。
各実験群の中で、３６日目、６４日目及び８１日目の糞便中の嫌気性菌の総数を０日のものと比較した。対照群及び欠乏群の３６日目６４日目及び８１日目の糞便中の嫌気性菌の総数は０日のものより有意に異なってはいなかった（Ｐ＞０．０５）（表２０）。それに対して、細菌群では３６日目と６４日目の糞便中嫌気性菌の総数は、０日と有意に異なってはいなかったが（Ｐ＞０．０５）（表２０）、細菌群での８１日目の糞便中嫌気性菌の総数は、０日目よりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。細菌群における糞便中嫌気性菌の総数の減少は、Ｐ．イエンセニー７０２を含む給餌は、糞便中の嫌気性腸内細菌叢に影響を有することを示唆している。
各検査時期で、異なった実験群の糞便中嫌気性菌の数を比較した（表２０）。８１日の給餌期間の間、対照群、欠乏群及び細菌群の間で、糞便中嫌気性菌の数に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。
表２０．処理中のウイスター系オスラットにおける糞便中嫌気性菌の総数（log cfu/g）
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
各群内で３６日目、６４日目及び８１日目の値を０日と比べた、＊ｐ＜０．０５（両側スチューデントのｔ検査）
各検査時期で、異なった実験群の値を互いに比較した；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
細菌群における糞便中の乳中プロピオン酸菌の数
飲水中でＰ．イエンセニー７０２を提供する前は、細菌群のラットでは乳中プロピオン酸菌は検出されなかった（図１３）。第２の検査時（Ｐ，イエンセニー７０２で飼育して３６日後）、細菌群における糞便中の乳中プロピオン酸菌のレベルは、８ログの値に上昇し、実験終了まで８〜９ログの値を維持した（図１３）。８１日の処理期間の間、対照群及び欠乏群の糞便では乳中プロピオン酸菌は検出されなかった。
糞便中のβ−グルクロニダーゼ活性
Ｐ．イエンセニー７０２懸濁液（１０10ｃｆｕ／ｍＬ）のβ−グルクロニダーゼ活性は、検査限界（ＩＵ）を下回った。
８１日の処理期間の間、ウイスター系オスラットの様々な実験群の糞便中のβ−グルクロニダーゼ活性の平均を表２１に示す。各検査時で各群内にてラットの間でβ−グルクロニダーゼ活性にばらつきがあった。各群内で、３６日目、６４日目及び８１日目の糞便中β−グルクロニダーゼ活性を０日と比較した（表２１）。３６日目と６４日目の対照群の平均の糞便中β−グルクロニダーゼ活性は、０日と同じレベルのままだったが、８１日目では有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。欠乏群の平均の糞便中β−グルクロニダーゼ活性は、８１日の給餌期間の間、同じレベルのままだった（ｐ＞０．０５）。それに対して、細菌群の平均の糞便中β−グルクロニダーゼ活性は、３６日目で０日より有意に高くなり、次いで６４日目では低下し、処理期間の８１日目の終わりまで、０日の同じレベルのままだった（ｐ＞０．０５）。
各検査時で、異なった群の平均の糞便中β−グルクロニダーゼ活性を比較した（表２１）。０日、３６日目及び６４日目では、対照群、欠乏群及び細菌群の間で、平均の糞便中β−グルクロニダーゼ活性に有意差はなかった。それに対して、８１日目では、細菌群及び欠乏群における平均の糞便中β−グルクロニダーゼ活性は、対照群より有意に低かった（ｐ＜０．０５）（表２１）。
表２１．処理中のウイスター系オスラットにおける糞便中β−グルクロニダーゼ活性（MU/g)
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
各群内で３６日目、６４日目及び８１日目の値を０日と比べた、＊ｐ＜０．０５（両側スチューデントのｔ検査）
各検査時期で、異なった実験群の値を互いに比較した；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
小腸における乳中プロピオン酸菌
細菌群のラットの回腸部分の内容物及び組織から乳中プロピオン酸菌を単離した。これらの試料から得られる乳中プロピオン酸菌の生きた数は極めて少ない（１０1〜１０2ｃｆｕ／ｇ）が、たった１０ｃｍの小腸が試料になっているので、これは小腸における総数を反映していない。欠乏群及び対照群のラットの回腸部分の内容物及び組織からは乳中プロピオン酸菌は単離されなかった。
Ｐ．イエンセニー７０２に特異的に利用可能なモノクローナル抗体がないので、走査電子顕微鏡写真の観察は解釈するのが困難であった。小腸組織の試料において細菌に似た構造は、欠乏群及び対照群には認められなかった。細菌群の場合、予想される形状及びサイズの短いロッド形状の構造が存在した（図１４）。これらのロッド形状の構造は他の２つの群では認められなかった。
血清のビタミンＢ12及びホモシステインのレベル
３ヵ月の給餌期間の間のウイスター系オスラットの３つの実験群における血清ビタミンＢ12の平均値を表２２に提示する。
対照群の血清ビタミンＢ12のレベルは、給餌１ヵ月後有意に上昇し（ｐ＜０．０５）、実験の残りの間、相対的に一定のレベルのままだった（表２２）。対照群において１ヵ月目と３ヵ月目との間で血清ビタミンＢ12のレベルに有意差はなかった（ｐ＜０．０５）（表２２）。結果は、対照群のラットは、１ヵ月の間に飲水からビタミンＢ12を吸収し、血清ビタミンＢ12を構築し、次いで１ヵ月の処理後、このビタミンの吸収上限に達したことを示唆する。
欠乏群の血清ビタミンＢ12レベルは、１ヵ月後、４４４．４ｐｍｏｌ／Ｌから１３１．３ｐｍｏｌ／Ｌに有意に減少し（ｐ＜０．０５）、３ヵ月の給餌期間の終了まで有意に低いレベルのままだった（ｐ＜０．０５）（表２２）。このことは、ビタミンＢ12欠乏餌がラットにおいて血清ビタミンＢ12の欠乏を生じることを示している。
細菌群の血清ビタミンＢ12レベルは、最初の１ヵ月の給餌期間の後有意に低下した（ｐ＜０．０５）（表２２）。２ヵ月間の給餌の後、細菌群の血清ビタミンＢ12レベルは、１ヵ月目に比べて有意に上昇し（ｐ＜０．０５）、０月と同じレベルだった（ｐ＞０．０５）。細菌群の３ヵ月目の血清ビタミンＢ12のレベルは、０月よりも有意に低下したが（表２２）、１ヵ月目よりは有意に高く、２ヵ月目とは有意差はなかった（ｐ＜０．０５）。
表２２．給餌期間中のウイスター系オスラットにおける血清ビタミンＢ12レベル（pmol/L)の比較
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
各群内での１ヵ月目、２ヵ月目及び３ヵ月目の値を０月と比べた、＊ｐ＜０．０５（両側スチューデントのｔ検査）
各検査時期で、異なった実験群の値を互いに比較した；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
各検査時で異なった群の血清ビタミンＢ12レベルを比較した（表２２）。給餌期間の開始時、対照群、欠乏群及び細菌群の間で血清ビタミンＢ12のレベルに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。１ヵ月後、欠乏群と細菌群における血清ビタミンＢ12のレベルは対照群より有意に低かった（ｐ＜０．０５）。これは、改変ビタミンＢ12欠乏餌のビタミンＢ12欠失効果に起因する。対照群で血清ビタミンＢ12のレベルが上昇したという事実は、飲水中の医薬形態のビタミンＢ12がビタミンＢ12の適当な食物源を提供したことを示している。実験の終了まで２ヵ月後、細菌群の血清ビタミンＢ12のレベルは欠乏群よりも有意に高かった。このことは、Ｐ．イエンセニー７０２細胞が細菌群のラットにビタミンＢ12を提供したことを裏付けている。細菌群が、試験の終了時対照群より有意に低い血清ビタミンＢ12を有したという事実は懸念には及ばず、後に続く考察で対処する。
血清ホモシステインのレベル
３ヵ月の給餌期間の間のウイスター系オスラットの３つの実験群における血清ホモシステインのレベルの平均値を表２３に提示する。対照群の血清ホモシステインのレベルの平均値は、３ヵ月の給餌期間の間、同じレベルのままだった（ｐ＜０．０５）（表２２）。欠乏群の血清ホモシステインのレベルは、１ヵ月後有意に上昇し（ｐ＜０．０５）、３ヵ月の給餌期間の終了時まで０月よりも有意に高いままだった（ｐ＜０．０５）。細菌群の血清ホモシステインのレベルは、当初、１ヵ月後、有意に上昇したが（ｐ＜０．０５）、次いで、２ヵ月目及び３ヵ月目で有意に低下した（ｐ＜０．０５）。３ヵ月目における細菌群の血清ホモシステインのレベルは、０月の最初の値と有意に違わなかった（ｐ＞０．０５）。
各検査時での異なった群における血清ホモシステインのレベルを比較した（表２３）。給餌期間の開始時、対照群、欠乏群及び細菌群の間で血清ホモシステインのレベルに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。１ヵ月目、欠乏群と細菌群の血清ホモシステインのレベルは対照群より有意に高かった。２ヵ月目と３ヵ月目、欠乏群の血清ホモシステインのレベルは依然として対照群より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。それに対して、細菌群の血清ホモシステインのレベルは、２ヵ月目で低下し、欠乏群及び対照群と有意差はなかったが；３ヵ月目、細菌群の血清ホモシステインのレベルはさらに低下し、欠乏群より有意に低くなり、対照群とは同じレベルだった（ｐ＞０．０５）。細菌群における血清ホモシステインのレベルの緩やかな低下は、Ｐ．イエンセニー７０２を含む給餌が血清ホモシステインを低下させていることを示している。血清ホモシステインのレベルは、動物におけるビタミンＢ12の貯蔵を反映するので、対照群が達するホモシステインのレベルは、ラットで見られた低いホモシステインの結果値であるというのは起こり得る。
表２３．３ヵ月の給餌期間中のウイスター系オスラットにおける血清ホモシステインレベル（pmol/L）の比較
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
各群内での１ヵ月目、２ヵ月目及び３ヵ月目の値を０月と比較した、＊ｐ＜０．０５（両側スチューデントのｔ検査）
各検査時期で、異なった実験群の値を互いに比較した；同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
精巣の重量及び形態
対照群、欠乏群及び細菌群の間で精巣の湿重量に有意差はなかった（表２４）。しかしながら、対照群の相対的な精巣重量（ｇ／１００ｇ体重）は、欠乏群及び細菌群より有意に低かった（表２４）。この結果について考えられる理由の１つは、対照群の１匹が小さな精巣を有するのに気づいたことであり（データは示さず））、健常なウイスター系ラットでは生じることがある（ニューキャッスル大学、動物倫理役員、マリー・バイト博士の私信）ということである。このことがおそらく結果を歪めた。
オーストラリア、ブリスベンのＩＤＥＸＸ獣医病理サービスからの報告によれば（データは示さず）、検査した３群のすべての精巣の形態も正常であった。

表２４．ビタミンＢ12欠乏餌で飼育したウイスター系オスラットにおける精巣重量（ｇ）及び相対的精巣重量（ｇ／１００ｇ体重）
Figure 0004521687
 値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、両側スチューデントのｔ検査）
コレステロール及び中性脂肪
対照群、欠乏群及び細菌群について血清脂質濃度の平均値を表２５に提示する。実験群の血清コレステロール濃度の平均値を３ヵ月目で比較した。細菌群は対照群より低いコレステロールレベルを有したが、有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、細菌群は、欠乏群よりは有意に低い総コレステロール濃度を有することが判った（ｐ＜０．０５）。３つの実験群の間でリポタンパク質に関する有意差は認められなかった。
実験群の血清中性脂肪の濃度を実験終了時に比較した（表２５）。細菌群は、対照群及び欠乏群の両方よりも有意に低い中性脂肪を有した（ｐ＜０．０５）。欠乏群におけるラットは、対照群よりも有意に低い中性脂肪を有したが、細菌群のラットよりは有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
表２５．３ヵ月の給餌処理終了時におけるウイスター系オスラットの３つの実験群の血清脂質パラメータ（mmol/L）
Figure 0004521687
 ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質。フィールドワルズら（１９７２年）の公式によりＬＤＬを算出した。
値は平均値±ＳＤである（ｎ＝７）
同一の上付き文字を持つ所定の欄の中の値は有意に異ならない（Ｐ＞０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ）
考察
新しいプロバイオティクス菌株の選択については安全性が最も重要な基準であり、安全性評価について一般的な指針又は特殊な政策がないのは残念なことである。本研究では、急性の経口毒性の測定、血液や臓器組織への細菌の転座及び有害な酵素の産生を含む、推奨される安全性試験を行った。
急性経口毒性は、安全性を評価するための基礎的な試験として提唱されている（Donohue et al., 1998; Stine & Brown, 1996）。急性経口毒性は、以前、乳酸菌の安全性評価において適用された（Shou et al.,2000）。これらの評価では、食欲、活動性及び生体重の増加が、動物の健康状態に関する一般的且つ高感度のよい指標とみなされた。
平均において、細菌群のラットは、１日当たり非常に多数の生きた細菌（１０10ｃｆｕ／日）を消費した（表１７）。この群のラットは全て、その活動性、餌の摂取量、毎日の体重増加、成長曲線及び一般的な外観から示されるように健全であり、Ｐ．イエンセニー７０２の有害効果は認められなかった。１５０〜５００ｇの範囲にあるラットの体重に対して本研究で使用されたＰ．イエンセニー７０２の平均用量（１０10ｃｆｕ／日）は、７０ｋｇのヒトにとってのＰ．イエンセニー７０２の平均用量（１０12ｃｆｕ／日）に相当する。食品において一般に提案されているプロバイオティクスのレベルは、１０6ｃｆｕ／ｍＬ（ｃｆｕ／ｇ）である。従って、本研究は、一般的なプロバイオティクス食品のレベルでのＰ．イエンセニー７０２の消費は、ヒトに有害効果を生じそうにないことを示唆している。
急性経口毒性に加えて、細菌の転座は、プロバイオティクスの安全性評価でもう１つの高度に推奨される指標である（Marteau et al., 1997; Zhou et al., 2000）。細菌の転座とは、感染性の測定である。本研究では、Ｐ．イエンセニー７０２の消化管から、脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節及び血液を含む組織への転座は認められなかった。
上記の証拠から、Ｐ．イエンセニー７０２がラットにおいて病原性ではないことは明らかである。この結果は、乳中プロピオン酸菌の菌株がいかなる有害な結果もなく、長年にわたって人々に消費されていることから、予測されたものだった。本研究の限界は、それが健全なラットについて行われたものなので、免疫抑制された集団による乳中プロピオン酸菌の大量消費の効果に対するデータを提供していないことである。さらに種間の病理は異なるので、単一の動物モデルは常に限界を有する。
プロバイオティクスに関するもう１つの安全性における懸念は、潜在的に有害な酵素の産生であり、その１つがβ−グルクロニダーゼである。細菌性のβ−グルクロニダーゼは、食事中のグルクロニドを加水分解しステロイド類及び特定の発癌性化合物を放出することができる。前記の方法を用いて、試験管内での菌株、Ｐ．イエンセニー７０２のβ−グルクロニダーゼ活性は、試験限界（１Ｕ）を下回った。本研究では、同じ群内のラット間の大きなバラツキのために、ウイスター系オスラットの３つの実験群における糞便中のβ−グルクロニダーゼ活性を読み取るのは困難であった。しかしながら、８１日目での細菌群の糞便中のβ−グルクロニダーゼ活性（表２１）は、対照群より有意に低下していた。８１日目の欠乏群における糞便中のβ−グルクロニダーゼのレベルも対照群より有意に低下していたことに気づくのは重要である。このことは、餌におけるビタミンＢ12の欠乏が消化管における微生物の種類を変えることを示している可能性がある。
糞便中のβ−グルクロニダーゼの低下はまた、乳中プロピオン酸菌菌株、Ｐ．アシッドプロピオニシＣＲＬ１１９８においても見い出されている（Perez-Chaia et al., 1999）。嫌気性菌及び大腸菌が糞便中のβ−グルクロニダーゼ活性に主として寄与することが示唆されており；糞便中のβ−グルクロニダーゼの低い活性は、Ｐ．アシッドプロピオニシＣＲＬ１１９８の包含後、糞便中の集団及びその代謝活性の変化から生じる（Perez-Chaia et al., 1999）。
様々な細菌数は、検査時での対照群、欠乏群及び細菌群の間で、好気性菌及び嫌気性菌の総数に有意差がないことを実証した（表１９、表２０）。しかし、８１日目での細菌群の糞便中の嫌気性菌の総数は、０日よりも有意に低下した（表２０）。このことは、細菌群における低い糞便中β−グルクロニダーゼは、腸内嫌気性菌又はβ−グルクロニダーゼ活性の低下によってもよいし、それは、腸内細菌叢におけるＰ．イエンセニー７０２の包含から生じてもよいことを示唆している。さらに、それに続く嫌気性菌の有意な減少なしで、しかし、相対的に高い糞便中β−グルクロニダーゼ活性を伴って、乳中プロピオン酸菌の総数は、給餌後３６日で１０8ｃｆｕ／ｇ糞便に達したので、消化管の嫌気性菌に対するＰ．イエンセニー７０２の影響は、それが小腸に付着し、コロニー化した後ずいぶん後に生じることを推測することができた。Ｐ．イエンセニー７０２のコロニー化はほかの嫌気性菌と競合的であってもよいし、Ｐ．イエンセニー７０２がその増殖相で抑制性化合物を分泌してもよい。このことは、給餌期間の最初の１ヵ月間、Ｐ．イエンセニー７０２の消化管の単なる通過が細菌群のラットに明らかな影響を発揮しなかったことを説明している。消化管におけるβ−グルクロニダーゼの存在が結腸癌のリスクを高めるので、Ｐ．イエンセニー７０２が抗癌剤として作用してもよいことが可能である。これを裏付けるためにはさらに詳細な研究が必要である。
有効なプロバイオティクスは、たとえば、胃の酸及び酵素、腸管における胆汁塩及び酵素並びに消化管における拮抗的細菌の相互作用を含む、それらを冒す可能性がある多数の有害因子にもかかわらず、消化管でその生存率を維持することが可能でなければならない。
実施例２では、試験管内で、菌株Ｐ．イエンセニー７０２が胃及び腸管における酸及び酵素の条件に耐性であることを明らかにしている。本研究では、生体内でもＰ．イエンセニー７０２がラットの消化管の条件に耐性であることが判った。ラットがＰ．イエンセニー７０２を与える前、細菌群の糞便中では乳中プロピオン酸菌は検出されず、それは、欠乏群及び対照群から単離されなかった。細菌群の糞便における乳中プロピオン酸菌の不変の存在は、Ｐ．イエンセニー７０２が生体内で消化管の条件に認容性であることを示す試験管内の結果を裏付けている。
乳中プロピオン酸菌は、相対的に少数にもかかわらず、ウイスター系オスラットの小腸からも単離された。これは多分、細菌の数の実際の表れではなく、試料化した小腸の小さな部分を反映している可能性がある。
小腸組織を薄片に切り、走査電子顕微鏡を用いて組織試料を調べることにより、生体内でのＰ．イエンセニー７０２の小腸への付着を調べた。モノクローナル抗体なしでは、走査電子顕微鏡で観察された、細菌群の小腸に付着する細菌形状の構造が実際、Ｐ．イエンセニー７０２であることを確定するのは可能ではなかった（図１４）。しかしながら、これらの構造は試験管内での実験で見られたものに似ており（図１０Ｃ、Ｄ）、欠乏群及び対照群では見られなかった。これらがＰ．イエンセニー７０２であり、ラットの上皮への生体内の付着を実証するのはありそうなことである。
安全であり、且つ消化管で生き延びる細菌菌株が、プロバイオティクス菌株としてみなされるには、さらに宿主にプラスの効果をもたらさなければならない。本研究では、選択されたプロバイオティクス特性はビタミンＢ12の産生であった。
ビタミンＢ12欠乏ラットは、成長遅延を示し、それは食物摂取の低下により生じることが判っている（Kawata et al., 1995）。本研究では、我々もまた、欠乏群の毎日の食物摂取量は細菌群より有意に低いことが見い出された（表１６）。しかしながら、対照群も細菌群に比べて、有意に低い食物摂取量を有した（表１６）。対照群と欠乏群の間では食物摂取量に有意差はなかったが、それは、Ｋａｗａｔａらの研究（Kawata et al., 1995）によって示されるビタミンＢ12の状態に食物摂取が反映しない可能性を示唆している。細菌群が高い食物摂取量を有する理由は本実験では説明できず、この食欲刺激の実際のメカニズムは何なのかを確定するには、さらなる、さらに詳しい研究が必要である。
欠乏群の毎日の体重増加は、細菌群より少なかったが、有意ではなかった（ｐ＞０．０５）（表６）。これには考えられる２つの理由がある。対照群と（ｐ＞０．０５）と細菌群（ｐ＜０．０５）の食物摂取量は欠乏群より高いが（表１６）、この２群は高い生理的活動性も示した。さらに、本研究で使用したラットは、急激に成長する週令なので、特に、欠乏が瞬間的なものではなく、１ヵ月にわたって生じるとみなされる場合、この急激な成長が体重増加を曇らすのはありそうなことである。実験が延長されれば、体重増加に差異が認められることが期待される。
本研究では、ビタミンＢ12の欠乏の指標の１つとして血清ビタミンＢ12を測定した。全群での時間ゼロでのビタミンＢ12レベルの測定値は、統計的に同一であり、おそらく、健全なラットにおける正常なビタミンＢ12レベルの平均を反映する。ビタミンＢ12欠乏餌を給餌して１ヵ月後、欠乏群及び細菌群の双方は、対照群よりも低い血清ビタミンＢ12のレベルを有した（表２２）。２ヵ月目では、細菌群のビタミンＢ12レベルは欠乏群よりも有意に高く（ｐ＜０．０５）、実験の終了まで統計的に高いままだった（ｐ＜０．０５）。このことは、Ｐ．イエンセニー７０２細胞の給餌が細菌群の餌にビタミンＢ12を補完していることを示唆している。１ヵ月での細菌群でのビタミンＢ12の最初の低下に対する理由は、プロバイオティクスは宿主に有益な効果を発揮する前に腸でコロニー化する時間を必要とするという事実によって説明される。いったんＰ．イエンセニー７０２が消化管に定着すると、次いで食事のビタミンＢ12源の活発な寄与体になり、細菌群の血清ビタミンＢ12のレベルは上昇し始める（表２２）。このことは、嫌気性菌の総数及びβ−グルクロニダーゼ活性に関して前に考察したが、ビタミンＢ12レベルの結果は、この論点に相関する。研究が継続された場合、細菌群のビタミンＢ12レベルがどれくらい高くなるのかを推測することは不可能である。明らかに、最終的には、Ｐ．イエンセニー７０２の最大集団が小腸内に確立され、それが、結合部位の数、利用可能な栄養及びそのほかの生態的基準を反映する。一定のビタミンＢ12レベルに達するのは、コロニー化がこのレベルにあるときである。しかしながら、２ヵ月後、細菌群におけるビタミンＢ12のレベルは最初と同じレベルに戻るのは明らかである（表２２）。
３ヵ月目で、細菌群で血清ビタミンＢ12レベルの低下が認められた。３ヵ月目での血清ビタミンＢ12のレベルは２ヵ月目とは有意に違わないが、０月の最初のレベルとは有意に異なる。これは、ビタミンＢ12の供給源としてのＰ．イエンセニー７０２から減らすのではない。細菌群は依然として欠乏群（１０５．３ｐｍｏｌ／Ｌ）の２倍の血清ビタミンＢ12レベル（２１６．０ｏｍｏｌ／Ｌ）を有した。３ヵ月目の細菌群の血清ビタミンＢ12レベルは、ウイスター系オスラットの血清ビタミンＢ12の正常範囲内にあり、３ヵ月目の細菌群の正常なホモシステインレベルにより反映されると思われる（表２３）。各実験群内での血清ビタミンＢ12レベルのバラツキは、さらに正確に研究するのはさらに大きな集団が必要とされることを示唆している。
対照群と細菌群のビタミンＢ12レベルの間での大きな差異は予想されなかった。過剰量のビタミンＢ12が対照群の飲水に与えられ、おそらくこのビタミンの吸収上限レベルにまで達した。このことは、ビタミンＢ12レベルが１ヵ月後で急速に上昇し、実験の残りについては相対的に一定のままだったという事実によって反映される（表２２）。
ビタミンＢ12の欠乏は、ヒトにおいて高ホモシステイン血症を生じることが判っている（Bjorkergen & Svardsudd, 2001）。血清／血漿のホモシステインレベルは、血清／血漿のビタミンＢ12レベルと反対の関係を示す（Mann et al., 1999）。本研究では、欠乏群と細菌群におけるラットの血清ビタミンＢ12と血清ホモシステインのレベルの間でこの反対の関係が明らかに認められた（図１５）。欠乏群では、低下した血清ビタミンＢ12レベルが上昇した血清ホモシステインレベルに相関していた（図１５）。このことは、ビタミンＢ12の欠乏は結果としてホモシステインの上昇を招き、血清ホモシステインの測定は、ビタミンＢ12欠乏症に対する相補的な診断ツールであることを裏付けている（Bjorkergen & Svardsudd, 2001）。
高レベルのホモシステインは今や、循環器疾患のリスク因子として認識されている（Shaw et al., 1999; Wilcken & Wolcken, 1998）。０月では、ラット３群においてホモシステインレベルに統計的な差異はなかったが（表２３）、その後、ホモシステインレベルにおける変化（表２３）は逆にビタミンＢ12に反映した（図１５）。Ｐ．イエンセニー７０２の摂取は、細菌群において血清ホモシステインレベルを低下させ（図１５）、２ヵ月及び３ヵ月の終了時、細菌群及び対照群のホモシステインレベルに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）（表２３）。この結果は、本研究の完了時での細菌群のビタミンＢ12レベルは、ラットの正常範囲内であることを示唆している。従って、プロバイオティクス細菌としてのＰ．イエンセニー７０２の適用は、循環器疾患のリスクの軽減に拡大することができる。
Ｋａｗａｔａら（１９９７年）の研究では、ビタミンＢ12欠乏の測定の１つは精巣の異常であった。本研究では、餌による精巣の異常は示されなかった。Ｋａｗａｔａら（１９９７年）が血清レベルではなく精巣組織を測定したので、２つの研究の間でビタミンＢ12のレベルを比較するのは不可能であり、これらは比較可能ではない。さらに、本研究で使用したラットは、Ｋａｗａｔａら（１９９７年）のモデルとは異なって、本研究のラットは健全な母親から生まれ、離乳まで欠乏症ではなかったという点でＫａｗａｔａら（１９９７年）の改変であった。使用した餌も異なっていた。以前の実験では、Ｋａｗａｔａら（１９９７年）の餌を調べ、ラットは栄養不良になり、矮小な成長に苦しみ、試験終了前に安楽死させた（データは示さず）。その餌はビタミンＢ12より多くのものを欠いているので、本研究では、市販のペレット製品、改変ビタミンＢ12欠乏餌を用いた。
循環器疾患とコレステロールの間の関係は揺るぎないものである。多数の研究により、コレステロールを下げるためのプロバイオティクスの使用の可能性が同定されており、好ましい治療方法である食事を管理することによって、コレステロールを低下させるプロバイオティクスの潜在的な市場が重要である。本研究で使用したウイスター系ラットのモデルは主としてビタミンＢ12欠乏症のモデルとして選択されてので、コレステロールの研究には最適ではない。これにもかかわらず、群間においてコレステロールのシフトが観察され、欠乏群に比べて細菌群について有意に低いコレステロールが確認された（表２５）。
以前の研究によって、すでに高い血清コレステロールレベルを持つ被験者においてプロバイオティクスは単にコレステロールだけを変化させることが示唆されている（de Rossa & Katan, 2000）。本実験では、ラットは高コレステロール餌では飼育されなかった。さらに、プロバイオティクスによるコレステロール低下のメカニズムの１つが胆汁の脱共役なので、本研究ではラットは胆嚢を欠くために、このメカニズムのいかなる測定可能な効果も確定できなかった。これらの理由で、我々は、この細菌をさらに好適なモデルに入れた場合、さらに有意な反応を期待する。
３ヵ月の給餌期間の後、細菌群は、ビタミンＢ12補完群及び欠乏群の双方よりも有意に低い中性脂肪を有した（表２５）。高い中性脂肪は、コレステロール代謝におけるその影響のために循環器疾患のリスク因子として同定されている。Ｐ．イエンセニー７０２の中性脂肪を下げる能力は、脂肪酸代謝に関係があると思われ、同様に、そのほかの腸内細菌及びプロバイオティクスで実証されている（Kankaapaa et al., 2002）。
結論
新しいプロバイオティクスとして、Ｐ．イエンセニー７０２は顕著な可能性を有すると思われる。それは、ビタミンＢ12及びホモシステインに陽性の効果を明らかに発揮し、この領域におけるその適用は、純粋に食事を補完することを越えて、胃の萎縮症、Ｒ因子障害、及びビタミンＢ12欠乏症のそのほかの生理的原因を持つ患者の有効な治療へと拡大される。小腸で生じるビタミンＢ12の大量摂取（Herbert, 1988）とは無関係な固有因子の潜在性のために、Ｐ．イエンセニー７０２は、悪性貧血の治療に安価な代替法を提供してもよい。さらに、Ｐ．イエンセニー７０２がコレステロール及び中性脂肪に積極的な効果を有する可能性のある事実は、菜食主義者の食品業界で広く使用されてきたので、食品防御にとってさらに好都合である。最後に、天然の細菌菌株、Ｐ．イエンセニー７０２は、特に厳格な食事プログラムを維持するものにとって重要である消費者の容認可能性を有すると思われる。
実施例４
免疫刺激剤、免疫調節剤及びアジュバントとしてのプロバイオティクス、Ｐ．イエンセニー７０２の使用
免疫機能におけるプロバイオティクスの役割に関する数多くの報告があるが、これらは主として、ラクトバチルス種及びビフィドバクテリウム種に関するのもである。免疫反応の種類には、貪食作用の増強（Fooks et al., 1999）、免疫グロブリン（Ｉｇ）−Ａ産生の刺激（Fooks et al., 1999）、細胞性免疫反応の刺激（Kaur et al., 2002）、経口ワクチンに対する免疫反応の増強（Salminen et al., 1998b）、免疫調節（Kitazawa et al., 1992）、及び有糸分裂促進的Ｂリンパ球刺激（Takeda et al., 1997）が挙げられる。不活化したプロピオニバクテリウム・アクネは、非特異的免疫刺激剤として作用することが知られている（Julia et al., 1998）。免疫機能を高めるのに使用される乳中プロピオニバクテリウムの報告はない。
この実施例の目的は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２が、（１）液性免疫反応を高めるように作用し；（２）細胞媒介性の応答を高め、且つ調節するように作用し；及び（３）ワクチンに対する応答を高めるよう作用する（アジュバントとして作用する）ことを実証することである。本実施例では、生きたＰ．イエンセニー７０２を使用するが、不活化したＰ．イエンセニー７０２、殺したＰ．イエンセニー７０２又はＰ．イエンセニー７０２の精選した一部が同等の応答を生成することが推定できる。
さらに、本実施例は、結核に対する経口ワクチンを産生する能力の証拠を提供する。現在ヒトへの使用が認可された経口アジュバントが本実施例で示されるような免疫反応を刺激することができないという事実によって、以前はこの研究はこれを行うことができなかった。
材料及び方法
液性免疫反応の刺激及び調節
上記実施例３において、Ｐ．イエンセニー７０２をウイスター系オスラットに３ヵ月間食べさせた。この研究の終わりに血液を採取した。本実施例では、標準の酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、採血の一部を用いてＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＥを測定する。予測される結果は、細菌を食べた群では、他の２群よりも高いＩｇＡ及びＩｇＧ並びに低いＩｇＥを有するということである。
ワクチンに対する免疫反応の刺激、調節及び増強（液性及び細胞性）
ワクチン
本実施例では、生きていない細菌ワクチンを経口で与える。（ａ）ワクチンが生きている又は源弱していても、（ｂ）ワクチンが生物全体又は生物の一部であっても、（ｃ）ワクチンがウイルス、細菌又は真菌であっても、及び（ｄ）ワクチンを経口で、非経口で、又は皮下で与えても、結果は同等であることを推定することができる。本実施例のワクチンは、２種類；（ｉ）増殖中の細菌から抽出された可溶性タンパク質と組み合わせた細菌全体から抽出された可溶性タンパク質及び（ｉｉ）増殖中の細菌から抽出された可溶性タンパク質として与えられる。
さらに本実施例は、結核に対して成功した経口ワクチンの最初の証拠を示す抗原としてＭ．ツベルクロシスを使用する。示された原理の適用は、動物の結核及びそのほかの経口ワクチンに外挿することができる。
最後に、本実施例で生じる免疫反応から、Ｐ．イエンセニー７０２が免疫調節剤として作用可能であることを推定することができ、すなわち、それは、（ａ）生きている形態又は減衰した状態あるいは（ｂ）生物全体又は生物の一部のいずれかにおいてアレルギー型の免疫系を調整する免疫反応を改変する有効性を有する。
一般装置
生きたＭ．ツベルクロシス生体を含むあらゆる作業は、クラスＩＩ生物安全性キャビネット（ゲルマンサイエンシズ）の中で行った。以下の実験に使用した試薬は、それぞれの業者から調合済みを得るか、又は上で列記したように調合した。特に指示がない限り、ピペッティングはすべて、ギルソンの自動ピペッター及びボネットエクイップメントのピペットチップを用いて行った。
生きたＭ．ツベルクロシスの増殖
ローウェンスタイン・ジャンセンスロープ
本研究ではたった１種のマイコバクテリウムの菌株、マイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖ菌株（ＡＴＣＣ２７２９４）を使用し、ローウェンスタイン・ジャンセン（ＬＪ）スロープ（マイクロ・ダイアグノスティクス）でそれを増殖させ、維持した。貯蔵培養の目的で、本研究の間中、ＬＪスロープを維持した。播種されたＬＪスロープを３７℃にて空気中で３週間培養し、次いで新しいスロープで継代培養し、細菌の継続した増殖及び生き残りを確保した。
改変ソートン培地
本実験では、Ｍ．ツベルクロシスの急激な増殖を支えるために改変ソートン培地（ＭＳＭ）を用いた。先ず、ループを介してＬＪスロープからＭ．ツベルクロシスを０．４５μｍのセルロースエステル膜（アドバンティーＭＦＳ）に移すことによって、培養を改変ソートン培地で設定した。ピンセットを用いて、円盤状の膜を液状の改変ソートン培地の表面に浮かせた。次いで培養容器を３７℃空気中にて（サーモライン）２週間培養した。この時間が終わった後、茶さじを用いて、細菌を膜から分離し、新しい改変ソートン培地に移した。
細菌の増殖程度に応じて４〜７日毎に継代培養を行った。
ＭＳＭでの増殖から２倍のタンパク質を回収した。第１に培地の表面からＭ．ツベルクロシス全体を回収し、第２に、短期間培養物ろ液（ＳＴＣＦ）として知られる分泌されたタンパク質の無菌ろ過を行った。これら２種の供給源をさらに処理してワクチンに使用するタンパク質を生成した。
抗原の作製
マイコバクテリウム・ツベルクロシス細胞全体の回収
４日間の増殖の後、ＭＳＭから細胞を回収した。培地表面から細胞をすくい取り、１０ｍＬの無菌遠心管（サーステッド）に回収した。合計３回、細胞を４０００ｒｐｍで１５分間遠心して細胞を洗浄した。各遠心の間で、３ｍＬの使い捨てピペットを用い、上清を捨て、無菌蒸留水を１０ｍＬまで加えた。水をピペットで捨て、実験の次の段階まで細胞を−８０℃に保存した。
短期間培養物ろ液（ＳＴＣＦ）（アンダーソンら（１９９１年）により記載された方法に基づく）
短期間培養物ろ液（ＳＴＣＦ）は、４日間の指数的なＭ．ツベルクロシスの増殖から分泌されたタンパク質を含有する改変ソートン培地から成る。６０ｍＬの注射器及びミニスタート（０．２２μｍ）の無菌フィルターヘッドを用いて、全細胞を除いた改変ソートン培地を密封容器に無菌ろ過し、使用に必要とされるまで−８０℃で凍結した。
ＳＴＣＦタンパク質の濃縮
ＳＴＣＦの２工程限外ろ過
この工程は、ＭＳＭ増殖培地から続けてろ過することによりＳＴＣＦを取り出すことを目的とした。具体的には、ＳＴＣＦ及び培地をろ過するために、１０ｋＤａの分子量カットオフの再生セルロース限外ろ過膜（ミリポア）の使用が関与する。限外ろ過ユニットの廃棄ラインからの液体を無菌の７０ｍＬのポット（サーステッド）に回収した。約２ｍＬを残して、試料をろ過した後、限外ろ過を止め、この濃縮された溶液を取り出し、無菌の５ｍＬの試験管（サーステッド）に入れた。これが１０ｋＤａより大きなタンパク質すべてを含有し、限外ろ過の次の工程を行うまで冷蔵庫に入れた。次の工程には、１０ｋＤａのフィルター（ミリポア）を３ｋＤａの分子量カットオフフィルターに交換し、１０ｋＤａ未満のタンパク質を含有する廃棄ラインからの最初のろ液を再びろ過した。この試料が２ｍＬにいったん減ると冷蔵庫の残りの試料を加えた。このろ過工程の間に廃棄ラインからの液体を捨てた。最終試料の総容積がいったん、２ｍＬ未満に減ったら、外して、凍結用試験管に入れ、−８０℃で保存した。かなりの容積のＳＴＣＦがいったん回収されれば、それを洗浄して残留のＭＳＭを除いた。これには、試料を解凍し、３０ｋＤａのフィルターで限外ろ過を行い、２０ｍＬの無菌蒸留水をそれに通すことを含む。この洗浄工程を３回繰り返した。
Ｍ．ツベルクロシス細胞全体の超音波処理
改変ソートン培地上から離した細胞を、超音波処理に先立って、無菌ＰＢＳで４０００ｒｐｍにて１５分間で洗浄し、上清を除いた。本研究で行われた超音波処理はすべて、マイクロチップ先細１／８”ホーンのブランソン・デジタル・ソニファー２５０を利用した。
各回の超音波処理について、６ｍＬのガラスビーズ及び７．５ｍＬのＰＢＳと共に、６ｍＬのペレット化した細胞を１０ｍＬの丸底試験管（クラウンサイエンティフィック）に入れた。レトルトスタンドに取り付けられた留め具によって、この試験管をその中にある超音波処理器のチップとともに正しい位置に固定した。２つの留め具で４５°の角度に固定して超音波処理器をレトルトスタンドに載せ、クラスＩＩ生物安全性キャビネットに収容した。超音波処理機のチップのそばで、試験管内に含められるのは試料の温度をモニターする温度プローブだった。温度限界を２０℃に設定し、この温度に達したら、温度が下がるまで、超音波処理機はいったん止まった。試料の温度をさらに制御するために、氷と５０ｍＬの１００％エタノールで満たしたビーカーを、試料を含有する試験管の底を包むようにもう１つの留め具で固定し、第１のレトルトスタンドに取り付けた。これは、超音波処理過程により創られる熱による肝要なタンパク質の損傷をさらに最小限にとどめることを目的とする。上述の２０℃の温度限界で３５％の振幅にて２０分間超音波処理を行った。
超音波処理に続いて、移しピペットを介して、後にガラスビーズを残して、試料を試験管から超遠心管に移した。１４０００ｒｐｍ、４℃にて試料を３０分間遠心し（ベックマン、Ｊ２−ＭＣ遠心機）、いかなる不溶性タンパク質も除いた。次いで、０．２２μｍのザルトリウス・ミニスタートフィルターを用い、試料を無菌容器の中に無菌ろ過し、必要とされるまで−８０℃で保存した。タンパク質アッセイを行うことにより、試料のタンパク質濃度を決定した。
ワクチンのタンパク質濃度を決定するためのタンパク質アッセイ
試料が含有してもよい、タンパク質の量をミリリットル当たりミリグラムで測定するのに、バイオラッドのタンパク質アッセイキットを用いた。このアッセイの線形の範囲は０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍＬ／ｍＬの間であり、その結果、試料を原液で調べ、１：５、１：１０及び１：２０の希釈を調製した。次いで１０ｍＬのブランク（蒸留水）、標準又は試料をヌンクの９６穴マイクロタイタープレートの指定されたウエルにピペットで入れた。１００μＬの希釈した染色試薬を各ウエルに加え、室温にてインキュベートするために最低５分間、最大１時間、プレートを放置した。
バイオラッドのマイクロプレートリーダー（モデル５５０）を用い、５９５ｎｍの波長にてプレートを読み取った。バイオラッドのマイクロプレートマネージャーコンピュータプログラム（バージョン５．０．１）を介して、生データが自動的に処理され、標準曲線を作り、試料のタンパク質濃度を算出する。
プロバイオティクスアジュバントＰ．イエンセニー７０２の作製
本実験にアジュバンドとして用いたプロバイオティクスの菌株は、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２である。本実施例では、それは「Ｐ．イエンセニー７０２」又は「プロバイオティクス」と呼ぶ。
飲水用のＰ．イエンセニー７０２の調製
１００μＬを２０ｍＬの乳酸ナトリウムブイヨン（ＳＬＢ）に入れることにより凍結した培養物からプロピオニバクテリウムを生き返らせ、３０℃で３日間嫌気的に増殖させた。３日後、２０ｍＬのＳＬＢをそれぞれ含有する新しい２０のビンに１００μＬを移した。これらも３０℃で３日間嫌気的に増殖させた。２つの無菌の２５０ｍＬの遠心ビン（ナルゲン）に移した１つを除いて、培養ビンはをすべてまとめることによって細菌細胞を回収した。ワクチン用アジュバントを調製するのに使用するために、余分なビン１本を取っておいた。これらを１０，０００ｒｐｍ、４℃にて７分間遠心し、上清を捨てた。６０ｍＬの無菌０．８５％のＮａＣｌ（シグマ）でさらに２回細胞を洗浄した。最後の洗浄の後、細胞を３０ｍＬの無菌０．８５％のＮａＣｌ（シグマ）に再懸濁し、その部分試料０．５ｍＬを５ｍＬの無菌の容器（サーステッド）に小分けし、飲水での使用を必要とされるまで４℃で保存した。これにより、飲水に加えた場合、１０8ｃｆｕの濃度の細菌が作製された。各週で新しいロットの細菌を飲水中での使用のために製造してその生存率を確保した。
ワクチンにおけるアジュバントとしてのＰ．イエンセニー７０２の調製
ＳＬＢで増殖させたＰ．イエンセニー７０２の２０ｍＬビンの残りから１０ｍＬを取って、５０００ｒｐｍで１０分間別々に遠心した。上清を除き、０．８５％のＮａＣｌ（シグマ）で５０００ｒｐｍにて１０分間、２回洗浄した。最後の洗浄の後、上清を捨て、細胞のペレットを、無菌容器中の２００μＬの０．８５％ＮａＣｌ（シグマ）に再懸濁した。これをワクチン接種の前日に調製し、使用まで４℃に保存した。細菌の濃度はおよそ１０9ｃｆｕであった。
免疫
倫理的認可
ニューキャッスル大学動物倫理委員会から倫理的認可を得た。その結果、本研究は、倫理認可番号７１２０９０２のもとで行われた。
実験動物の取り扱い
本実験に用いた動物は、８〜１２週令のＣ５７系のメスマウスであった。それらが投与されるワクチンに従って、マウスを各群８匹で５群に分けた。各群の中で、さらに２群に分けてケージ当たり４匹収容し、合計１０ケージに収容して合計４０匹を本実験に用いた。マウスは毎日チェックし、新鮮な水と餌を提供した。ワクチンの中でＰ．イエンセニー７０２を与えた３群のマウスには飲水中にもプロバイオティクスを与えた。前もって調製した１０8の細菌０．５ｍＬを５０ｍＬの飲水に加えた。新しい細菌を毎日加えた。動物維持施設に到着後、１週間休ませてマウスを新しい環境に馴染ませた。
経口ワクチンの投与
２１ゲージの洗浄用針を用いてワクチンを経口的に投与した。マウスの胃に針を挿入する前に、５Ｌ／分の速度でハロタンＢＰ（１ｍＬ／ｍＬ、レーザー・アニマル・ヘルス）及び４Ｌ／分の酸素を用い、麻酔チャンバーにて吸入（ＣＩＧＴＭ４１、麻酔装置、ノバメディカル・バポライザー）によって各マウスに麻酔をかけた。合計１００μＬのワクチン（表２６）を各動物に投与した。ワクチンはＰＢＳで作製した。各ワクチン接種の間に７日間置いて、動物に３回ワクチン接種した。
表２６．本研究で調べた５種のワクチンとその内容
Figure 0004521687
 ＳＴＣＦ＝短期間培養物ろ液；ＷＴＢ＝超音波処理した全ツベルクロシス；Ｐ＝Ｐ．イエンセニー７０２；ＣＴ＝コレラ毒素（シグマ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）
血液試料
２回採血した。最初のワクチン接種と同じ日及び動物実験の最後の日、各マウスの伏在静脈から血液を採取した。次いで、血液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、５０００ｒｐｍにて８分間遠心した。次いで、血清を新しいエッペンドルフチューブに移し、免疫グロブリン試験に必要とされるまで−８０℃で保存した。
糞便の回収
２つの別々の検査のために２回糞便を回収しなければならなかった。０日目（ワクチン接種の最初の日）及び２５日目（実験の最終日）の同じ時間に双方の糞便試料を回収した。２つの検査は、抗体ＩｇＡのための検査及び他の試料は、生きているＰ．イエンセニー７０２を調べるために用いた。
ＩｇＡ分析のための糞便ペレットの調製
各マウスから糞便ペレットを回収し、０．５ｍＬのプロテアーゼ阻害剤を含有するエッペンドルフチューブに入れた。次いで室温にて試料を１５分間ボルテックスした。いったんペレットが溶解したら、試料を４℃にて最大速度で１５分間遠心（エッペンドルフ遠心機５４１５Ｃ）した。次いで、１００μＬのグリセロール（シグマ）を含有する新しいエッペンドルフチューブに各試料の上清４００μＬを移し、１０μＬのＰＭＳＦ溶液を加えた。チューブを再び手短にボルテックスし、ＩｇＡ検査に必要とされるまで−８０℃で保存した。
糞便プレートの計数
生きているプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２についても糞便を調べた。これは、細菌が消化管で生き延びたかどうかを見るために行った。この検査のために各動物から回収された糞便試料を２ｍＬの糞便緩衝液に入れた。１０-4、１０-5及び１０-6の希釈、希釈されたウイルキンス・チャルゲン・嫌気性ブイヨン（ＷＣＡＢ）（オキソイド）。試料をボルテックスし、１ｍＬを希釈したＷＣＡＢに入れ、各希釈の間でボルテックスしながら、連続希釈を作製した。乳酸ナトリウム寒天（ＳＬＡ）を含有するプレート上に各希釈物１００μＬを載せた。ガラスのロッドでプレート上に広げ、乾かし、次いで反転して３０℃にて６日間嫌気的にインキュベートした。
組織試料の取り出し
ハロタンで麻酔し、過剰の二酸化炭素を含有するタンクに沈めることによってマウスを安楽死させた。次いで腹部領域を７０％エタノールで殺菌した。無菌の切開ハサミで腹部を切開し、脾臓、パイエル板及び腸間膜リンパ節を４０ｍＬの冷却無菌ＰＢＳに入れ、氷上に置いた。各ワクチン群の臓器をプールし、適当な数の細胞を確保した。
リンパ球の増殖及び培養の調製
使用前に一晩紫外線にさらすことによってクレムコ・ラミナ・フローフードで無菌環境を設定した。フードに入れるものはいかなるものも７０％アルコールを噴霧して無菌環境を保持した。
組織試料から細胞懸濁液を調製するためのふるい法
無菌の２０ｍＬの注射器の内筒の平坦な末端を用いて、組織を無菌のふるいにかけることによって単一細胞の懸濁液を創った。無菌ＰＢＳでふるいを介して細胞を洗浄し、組織残渣、脂肪及び結合組織はふるいの表面に残った。細胞懸濁液を５０ｍＬの遠心管（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン）に回収した。
リンパ球の単離
［脾細胞］
ＰＢＳ中の細胞懸濁液を数分間氷上に置いた。大きな残渣を取り除き、４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間、懸濁液を遠心した（ヘラカス・メガフージ１．０Ｒ）。上清を取り除き、次いで、脾細胞を５ｍＬの赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、５分間氷上に置いた。次いで、５ｍＬのＲＰＭＩ完全培地を加え、４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間、遠心した。１０ｍＬのＲＰＭＩ完全培地で脾細胞を３回洗浄し、最後に１０ｍＬのＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、必要とされるまで氷上で保存した。
［パイエル板及び腸間膜リンパ節］
ＰＢＳ中の細胞懸濁液を４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間、懸濁液を遠心した（ヘラカス・メガフージ１．０Ｒ）。上清を捨て、１０ｍＬのＲＰＭＩ完全培地でペレットを３回洗浄し、最後に１０ｍＬのＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、必要とされるまで氷上で保存した。
脾細胞、腸間膜リンパ節及びパイエル板の細胞の計数
トリパンブルー色素排除を用いて細胞の計数を行った。脾細胞は、トリパンブルー（シグマ）で１：５に希釈し、腸間膜リンパ節及びパイエル板は１：２に希釈した。計数チャンバー（ＷＥＢＥＲ）及びオリンパスの倒立顕微鏡を用いて細胞計数を得た。次いでｍＬ当たりの細胞数を算出した。
リンパ球の増殖
ヌンクロンサーフェスの組織培養プレートでリンパ球の増殖を設定した。合計１８枚のプレートを設定した。各回収日について幾つかの異なった増殖の組み合わせを収容するのに６枚のプレートを必要とした。最適な抗原濃度、最良の刺激抗原、ＷＴＢ、ＳＴＣＦ又はＷＴＢ／ＳＴＣＦの組み合わせ、及び最良のワクチンを調べるようにプレートを設定した。複数のプレートをセットし、３、４、及び５日目にプレートを回収してどれが最高のＴ細胞増殖をしているかを測定することによって、Ｔ細胞増殖の最適な日数を確定した。
１００μＬの各抗原をプレートに加えた。様々な濃度で抗原をＲＰＭＩ完全培地に組み入れた。調べた最終抗原濃度はそれぞれ、ＳＴＣＦ、ＷＴＢまたはＷＴＢ／ＳＴＣＦの組み合わせについて２．５、５及び１０μｇ／ｍＬであった。４ウエルをブランクの対照とし、１００μＬのＲＰＭＩ完全培地で満たした。
２ｘ１０6個／ｍＬの濃度で、１００μＬの細胞懸濁液をプレートに加えた。組織試料はできれば４連一組で実験を行ったが、場合によっては、特にパイエル板の場合、得られた細胞数が少なく、２連一組又は１つのみしかできなかった場合もあった。５％二酸化炭素（ＣＯ2）３７℃にて３〜５日間、プレートをインキュベートした。
コンカナバリンＡ対照プレート
１００μＬのレクチン、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（ベーリンガーマンハイム）を含有するプレートをセットした。ＣｏｎＡは２．５μｇ／ｍＬとした。プレートのウエルに、ＲＰＭＩ完全培地中、２ｘ１０6個／ｍＬの濃度で１００μＬの組織細胞を加えた。次いで５％ＣＯ2，３７℃にてプレートをインキュベートした。
サイトカイン分析のためのリンパ球培養
サイトカイン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の存在を調べるのに使用するために脾臓リンパ球の培養をセットした。脾細胞組織を用いて、マルチウエル組織培養プレート（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン）にて２連一組で培養をセットした。ＲＰＭＩ完全培地中２ｘ１０6のリンパ球０．５ｍＬを各ウエルに加えた。それぞれ以下の濃度、２．５μｇ、５μｇ、及び１０μｇで刺激抗原、ＷＴＢ、ＳＴＣＦ及びＷＴＢ／ＳＴＣＦの異なった濃度をＲＰＭＩで作製し、各抗原０．５ｍＬをプレートに加えた。５％二酸化炭素、３７℃にて培養物を７２時間、インキュベートした。次いで、各ウエルからの上清を回収し、検査で必要とされるまで、−８０℃で保存した。
Ｔ細胞増殖の回収
増殖の３日目、最初に設定した６枚のプレートをインキュベータから取り出し、無菌のバイオ安全性キャビネットに入れ、完全ＲＰＭＩで希釈した［メチル−3Ｈ］チミジンのトレーサ（アマシャム）１０μＬを各ウエルに加えた（０．５μＣｉ／ウエル）。回収し、読み取る前にさらに６時間プレートをインキュベートした。次に続く２日間、４日目及び５日目もこの工程を繰り返した。
６時間のインキュベートの後、パッカードフィルターメート１９６でグラスファイバーフィルター（パッカード）上にリンパ球を回収し、６０℃のインキュベータで乾かした。いったん乾いたら、各フィルターをプラスチックフィルム又はホットプレート上に置き、マルチレックス・シンチレータ用ワックス（ワラック）のシートを上に置き、フィルターを介して溶かした。いったフィルターが冷え、ワックスが固まったら、フィルターを切り取り、試料袋（ワラック）に入れ、ワラック１２９５−０１２熱シーラーで密封した。切り取り、密封した試料袋をカセットに入れ、液体シンチレーション発光カウンタ（ＴＲＩＬＵＸ１４５０、マイクロベータ）で読み取った。
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γのためのＥＬＩＳＡ検査
サイトカインを調べるのにファーミンジェンのＯｐｔＥＩＡキットを用いた。製造元の指示書に従って、ＥＬＩＳＡ及び必要な緩衝液及び試薬を調製した。
１００μＬの希釈した捕捉抗体（ファーミンジェン）でヌンクの免疫吸収マルチウエルプレートをコーティングし、密封して４℃で一晩インキュベートした。次いで、洗浄緩衝液でウエルを５回洗浄した。次いでアッセイ希釈液（ファーミンジェン）でプレートをブロックし、室温で1時間インキュベートした。それに続いて、洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄した。次いで１００μＬの標準液又は試料を各ウエルに加え、室温で２時間インキュベートした。再びプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで１００μＬのワーキングディテクタ（ファーミンジェン）を各ウエルに加え、室温にてさらに１時間、プレートをインキュベートした。
次いで、３０秒間のすすぎでプレートを１０回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ基質溶液（ファーミンジェン）を各ウエルに加え、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。この時間が経過した後、５０μＬの停止液を各ウエルに加えた。直ちに、バイオラッドのマイクロプレートリーダー（モデル５５０）により４５０ｎｍ及び５７０ｎｍの吸収で得られたプレートを読み取った。５７０ｎｍの読み取りは、４５０ｎｍの読み取りから差し引いて最終の吸収を得ることができるバックグランドの読み取りを提供した。マイクロプレートリーダーは、各プレートの標準液のデータに従って自動的に結果を調整し、最終的なサイトカインの濃度をピコグラム／ｍＬ（ｐｇ／ｍＬ）で提供した。
ＩｇＧ及びＩｇＡのための血清及び糞便の試料のＥＬＩＳＡ測定
重炭酸イオン緩衝液で希釈した２５μｇ／ｍＬの抗原、ＳＴＣＦ又はＳＴＣＦ／ＷＴＢの組み合わせ１００μＬでヌンク免疫吸収マルチウエルプレートの適当なウエルをコーティングした。プレートを４℃にて一晩インキュベートした。次いで、洗浄緩衝液でプレートを２回洗浄した。次いで、５％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）でプレートをブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。試料を希釈した。１：１０〜１：１００００で血清を１０倍希釈した。糞便ではｌ：１０〜ｌ：８０で倍々希釈した。対照の血清を１：１００に希釈して対照として各プレートに加えた。２ウエルをブランクウエルとし、バックグランド染色の存在に対する対照とした。適当なウエルを試料で満たして、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄した。
次いで、標識したビオチン化抗マウスＩｇＧ（１．０ｍｇ／ｍＬ）を血清試料について調べ、又は糞便試料のためのビオチン化抗マウスＩｇＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ）（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ）を各プレートに加えた。次いで、それらを３７℃のインキュベータに２時間戻した。この時間が経過した後、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄し、次いで１００μＬのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を各プレートに加えた。プレートを３７℃にてさらに１時間インキュベートした。
次いで、１００μＬの発色試薬、ＴＭＢ基質溶液（ファーミンジェン）を各ウエルに加え、色の変化について５分後反応をチェックした。５〜７分後、５０μＬの停止液を各ウエルに加えた。次いで、バイオラッドのマイクロプレートリーダー（モデル５５０）により４５０ｎｍにてプレートを読み取った。
統計的解析
結果の統計的解析は、マイクロソフトのエクセル２０００を用いて行った。同等の変異を仮定する両側スチューデントｔ検査を用いた。０．０５未満のＰ値をデータ間の統計的有意を示すものとみなした。平均値、標準偏差及びすべてのグラフもマイクロソフトのエクセル２０００で作成した。
結果
ワクチンの調製
本研究のためのワクチンの製造には、ＳＴＣＦ及び超音波処理したＷＴＢを製造し、それらを十分量に濃縮することが関与した。
ワクチンの投与
動物モデル：マウスのモニタリング
一般的な外観及び行動を調べることによりマウスを毎日モニターした。あらゆる処置の前にマウスの体重を測定した。処置に続いて、１〜２時間、マウスを定期的にモニターした。
表２７．２５日間の試験期間にわたるマウスの平均体重
Figure 0004521687
 値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝８）。列の範囲内で同一アルファベットは、指定日での体重の間で統計的な有意差を示す（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）。
試験群における体重は、試験期間と通して相対的に一定のままであった（表２７）。各測定日におけるマウスの群間で体重に有意差はなかった。ワクチン群５のマウスの体重において４週間にわたって統計的な有意差が同定された。しかしながら、これは、ワクチンの試行に何の意味も持たないし、他の領域の結果にも影響を与えなかった。
ワクチン試行の最後の週で、数匹の試験動物が病気になり、又は死亡し、又は安楽死させられた。病気の動物の解剖は、推定上のマイコプラズマ感染により生じた肺炎が死因であることが明らかになった。感染源は同定されなかった。死亡はワクチン群にも広がり、ワクチン群２で１匹が死亡し、ワクチン群４及び５では２匹が死亡した。４０匹のマウスのうち全体で５匹の喪失は、各群におけるマウスの数の統計的正当性に影響を及ぼすことはなかった。興味深いことに、Ｐ．イエンセニー７０２を服用しているワクチン群の中でたった１匹が死亡したということは、動物の全体的な健康及び免疫系の機能に対するプロバイオティクスの防御効果の可能性を示唆している。
試験期間の間のマウスにおける消化管微生物の変化
嫌気性菌及びプロバイオティクスの計数をマウスの糞便で行った。
マウス糞便からのＰ．イエンセニー７０２の回収
試験動物からの糞便試料においてプレート計数を行って、Ｐ．イエンセニー７０２がマウスの消化管で生き延び、コロニー化していること、及びプロバイオティクスを服用しなかったマウスが消化管の中でＰ．イエンセニー７０２が混入していないこと又は自然にそれを含有していないことを確認した。
表２８．試験期間中におけるマウス糞便中の生きているＰ．イエンセニー７０２の数
Figure 0004521687
 値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝６〜８）。
糞便試料は、０日目（Ｐ．イエンセニー７０２の投与前）、７日目及び２５日目に回収した（表２８）。細菌の投与前、どのマウスの糞便にもＰ．イエンセニー７０２は見い出されなかった。ワクチン群１及び２では、７日目までにマウスの糞便試料中にプロバイオティクスが存在し、２５日目までにＰ．イエンセニー７０２を服用した全ワクチン群が多数のプロバイオティクスを有した。細菌を服用しなかったどのマウスからもＰ．イエンセニー７０２は単離されなかった。
マウス糞便の嫌気性菌のプレート計数
プロバイオティクスの存在が消化管において嫌気性菌の減少を招くかどうかを検出するために、全体の嫌気性菌のプレート計数を行った（表２９）。消化管におけるＰ．イエンセニー７０２のコロニー化の測定としてこれを用いた。
表２９．２５日間の試験中のマウスの糞便における嫌気性菌のプレート計数
Figure 0004521687
 値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝６〜８）。列を超えて同じアルファベットは、０日目、７日目及び２５日目の３回の試料採取時にわたる嫌気性菌のプレート計数間での有意差を示す。行におけるの同じ数字は、指定日におけるワクチン群間での有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
３回の試料採取時にわたってワクチン群１、２、３及び４の中では糞便中の嫌気性菌の数に有意差はなかった（表２９）。ワクチン群５は、０日目と７日目と２５日目との間でプレート計数に有意な低下を有した（表２９）。０日目及び２５日目では、ワクチン群の間での糞便中の嫌気性菌の数の間で統計的な差異はなかった。７日目では、ワクチン群１、２及び５の間で統計的な差異（ｐ＜０．０５）があった。
Ｔ細胞の増殖
コンカナバリンＡ
マイトジェン、ＣｏｎＡに対するＴ細胞の反応性及び増殖能力の一般的な指標として、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）対照プレートを用いた。表３０は、各ワクチン群の３種類のリンパ球についての増殖を１分当たりのカウント（ＣＰＭ）で表す。ワクチン群１及び３では、すべての組織で高い増殖が見られたが、それらは一般的な増殖の指標にすぎず、１つのワクチンのもう１つに対する有効性を具体的に示すものではないので、これらの結果における統計的有意性は調べなかった。
表３０．コンカナバリンＡに対するＴ細胞の増殖
Figure 0004521687
 値は、１分間当たりのカウントにおける平均値±ＳＤ(CPM)である（ｎ＝６〜８）。
投与したワクチンに対するＴ細胞の増殖
各ワクチンについて、変数：抗原の濃度、刺激抗原の種類、インキュベートの時間、及びリンパ球の回収に用いた組織の種類を用いて、Ｔ細胞の増殖を測定した。
表３１は、３日目での平均のＴ細胞増殖の結果を示す。４日目及び５日目のデータは示さない。全体として高いＴ細胞増殖に基づいて、しかしまた、多量の統計的に高い増殖を有したので、Ｔ細胞増殖の最適日数として３日目を選択した。Ｔ細胞の応答が４日目に比べて、３日目で有意に高い場合、これを表３１に示す。
表３１．３日目のＴ細胞増殖の結果
Figure 0004521687
Figure 0004521687
Figure 0004521687
値は、１分間当たりのカウント（ＣＰＭ）における平均値±ＳＤである（ｎ＝６〜８）。アルファベットは、各ワクチン群及び各刺激抗原の中での異なった抗原濃度での増殖レベルの間での有意差（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）を示す。
＊は、４日目と５日目との間の増殖における有意差（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）を示す。
＃は、３日目が４日目又は５日目に対して有意に差異はないが、最低の変異を示したのでこれに基づいて選択した場合を示す。
−は、増殖を行うには細胞が不十分であったことを示す。
２．５μｇの抗原を用いた３日目でのＴ細胞増殖の要約
各組織源のリンパ球に対して３種の異なった抗原の組み合わせを調べた。各場合において、刺激抗原は、それが元々のワクチンの成分である場合にのみ調べた。３日目で、刺激抗原の最適濃度は、それが全体的に最高の増殖の読み取りを生じることに基づいて、２．５μｇ／ｍＬであった（表３１）。残りの分析にこの濃度を選択した。
刺激抗原として２．５μｇのＳＴＣＦによる３日目のＴ細胞増殖
表３２は、本研究で調べた全ワクチンに関する２．５μｇのＳＴＣＦに対する３日目で得られた平均の増殖を示す。
表３２．各組織に関する２．５μｇのＳＴＣＦによる平均の増殖
Figure 0004521687
 値は、１分間当たりのカウント（ＣＰＭ）における平均値±ＳＤである（ｎ＝６〜８）。欄の中での同一アルファベットは、所定のリンパ球源に関する印をつけたワクチン群の間で有意性がないことを示す（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）。欄の中で同じ文字の指示を共有しない値に加えて、印のついていない残りは、有意差がある（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検査）。
各組織群の範囲内でワクチン群の間でのみ有意性を検査した。異なった組織を用いたリンパ球の増殖は、免疫反応の種類を反映し、最良のワクチンを決定するのに使用されることはない。このことはさらに考察において取り上げる。脾臓に関する増殖の結果は、ワクチン１、２及び５は、ワクチン３、対照よりも有意に高いカウントを有することを示している。脾臓に関しては、ワクチン１が最高のカウントを有した。しかしながら、パイエル板では、２．５μｇのＳＴＣＦタンパク質に対してワクチン５が最高の増殖を有し、対照よりも唯一有意に高い読み取りだった。腸間膜リンパ節では、増殖のカウントについてワクチン群間では統計的な有意性はなかった。
刺激抗原としての２．５μｇのＷＴＢによる３日目におけるＴ細胞の増殖
表３３は、２．５μｇのＷＴＢ抗原で刺激した場合の各Ｔ細胞源についての平均の増殖の値を示す。
表３３．各組織についての２．５μｇのＷＴＢによる平均の増殖
Figure 0004521687
 値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝６〜８）。欄の中での同一アルファベットは、各組織リンパ球源に関する印をつけたワクチン群の間で有意性がないことを示す（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）。欄の中で同じ文字の指示を共有しない値に加えて、印のついていない残りは、有意差がある（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検査）。
一方の成分が他方よりも高い増殖に関与しているかどうかを区別するという試みで、抗原ＳＴＣＦとＷＴＢの別々の試験を行った。表３３から、ワクチン５は再び、脾臓及びパイエル板の双方について、対照及びワクチン２よりも有意に高い増殖を示した。腸間膜リンパ節は対照により最高のシンチレーションカウントを有した。
刺激抗原としての２．５μｇのＳＴＣＦ−ＷＴＢによる３日目のＴ細胞の増殖
表３４は、２．５μｇのＳＴＣＦ−ＷＴＢ混合抗原により刺激した場合の各Ｔ細胞源についての平均の増殖を示す。
表３４．２．５μｇのＳＴＣＦ−ＷＴＢによる各組織についての平均の増殖
Figure 0004521687
 値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝６〜８）。欄の中での同一アルファベットは、各組織リンパ球源に関する印をつけたワクチン群の間で有意性がないことを示す（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）。同じ文字の指示を共有しない値に加えて、印のついていない残りは、有意差がある（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検査）。
刺激抗原としてＳＴＣＦ−ＷＴＢを用い、及び脾臓細胞に由来するリンパ球を用いて、ワクチン５は、対照に対して有意差があり、４５，１３５ｃｐｍという非常に高い増殖を示した。ワクチン２も相対的に高い読み取りを示したが、対照に対して有意差はなかった。パイエル板のリンパ球は再び、対照に比べてワクチン５について有意に高い増殖（５５，５１６ｃｐｍ）を示した。腸間膜リンパ節についてのシンチレーションカウントはすべて低く、本当の読み取りではなく、バックグランドであると思われた。
リンパ球の培養上清を用いたサイトカインの分析
サイトカインを用いて、免疫反応の種類を決定する。３種のサイトカイン；ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γを測定した。サイトカインの産生のためには脾臓由来のリンパ球のみを培養した。最適な増殖が２．５μｇ／ｍＬの刺激抗原濃度で決定されたので、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬでのサイトカインの結果は示さない。
インターロイキン２のレベル
ＩＬ−２は、Ｔ細胞応答の一般的な指標である。ＩＬ−２にとっては最適ではない３日目に細胞上清を回収したが、結果は明らかに、ワクチンはすべてＩＬ−２応答を刺激したことを示している（図１７）。
Ｔ細胞応答の種類の測定としてのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４
ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４（図１８）の比較により、Ｔ細胞応答の種類、すなわち、Ｔｈ１応答又はＴｈ２応答が生じているかどうかの指標を得られる。
ＶＩ（ＳＴＣＦ）を除いてすべての場合で、ＩＦＮ−γの応答がＩＬ−４よりも有意に高く、Ｔｈ１の応答であることを示した。ワクチン１（ＳＴＣＦ）は４．５８ｐｇ／ｍＬの平均ＩＬ−４レベルを生じた。ＩＦＮ−γの読み取りの２連一組における大きな差異（１６０．５ｐｇ／ｍＬと７４３．０ｐｇ／ｍＬ）は大きさ誤差を生じ、意味のある測定値を否定した。しかしながら、大きな値を除外してもＩＦＮ−γの値は、明らかにＩＬ−４よりもはるかに高い。
マウスにおける免疫グロブリンの測定
ＥＬＩＳＡを行って免疫グロブリンを測定した。ＩｇＧ及びＩｇＡを測定し、比較した。表３５は、４５０ｎｍの波長でのＥＬＩＳＡの読み取りの平均吸収を示す。ＩｇＧについては、血清を１：１００の希釈で調べ、ＩｇＡについては、糞便上清を１：１０に希釈した。それぞれが含有する抗原に対する抗体について各ワクチン群を調べた。そのどちらも含有せず、対照としての役割に必要なので、Ｐ．イエンセニー７０２対照群を双方の抗原、ＳＴＣＦ及びＳＴＣＦ−ＷＴＢの混合に対して調べた。
表３５．ワクチン群についての各免疫グロブリンの平均吸収値
Figure 0004521687
 値は、４５０ｎｍ（バイオラッド、マイクロプレートリーダー、モデル５５０）で測定した吸収（ｎｍ）における平均値プラス標準偏差（ｎ＝６〜８）である。
＊は、０日目と２５日目の間の各ワクチン群の中での免疫グロブリンのレベルの間での有意差（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検査）を示す。
総ＩｇＧのレベルは、０日目から２５日目で各ワクチンについて上昇したが、有意な上昇は、ワクチン１、２、３（ＳＴＣＦ／ＷＴＢ）及び５のみに見られた。
ワクチン１、２及び３についてＩｇＡのレベルに有意差はなかった。ワクチン４及び５は、ＩｇＡにおいて有意な低下を示した。糞便の調製がＩｇＡの保存に不利な影響を有したかも知れず、考察でさらに対処する。
考察
Ｍ．ツベルクロシスに対する４種の経口ワクチンの有効性を調べた。各ワクチンの最も免疫刺激する成分を見い出すことに加えて、プロバイオティクス、Ｐ．イエンセニー７０２を含有するアジュバントの有効性を、所定の抗原への免疫反応を刺激するその能力について、汎用される粘膜アジュバントコレラ毒素に対して調べた。結果から、ワクチンが試験管内で免疫反応を効果的に誘導するのは明らかである。
ＴＢ免疫に対する強いＴｈ１のＴ細胞応答の重要性が認識されている（Kaufmann & Andersen, 1998）。Ｍ．ツベルクロシスの細胞内の性質によって、この細菌に対する免疫反応においてＴ細胞の役割が不可欠なものとなっている。その結果、可能性のあるワクチンの成功にとって、試験管内のＴ細胞の増殖は、良好な指標を提供する。ＴＢワクチンにとって最適なアジュバントは細胞性免疫反応の発生に有利に働くはずであり、優先的に強いＩＦＮ−γの応答を刺激するはずである（Agger & Andersen, 2001）。
アジュバントとしてのＰ．イエンセニー７０２の実証された有効性は、特に、今日ヒトのワクチン接種に認可されたアジュバントがないという事実を鑑みれば、Ｍ．ツベルクロシスに対する防御免疫の確立に対して不可欠である１型免疫反応の発生を促進する（Medina & Guzman, 2000）。
可溶性ペプチド及びタンパク質に対して適当な免疫反応を生じることは周知のように難しいので、適当なアジュバントによる免疫は必須である（Maharias et al., 1995）。その結果、２つの検査されたアジュバントを含有する様々なワクチンに対するあらゆる検査を通して得られた結果は、アジュバントの有効性に関する有益な情報及び視点を提供する。
最適な抗原濃度及びＴ細胞増殖の日を決定するために本研究ではデータを集めた（表３１）。Ｔ細胞の増殖に対して最適な抗原濃度を決定することは重要である。このことは、抗原が高すぎる濃度で存在すればリンパ球に毒性効果を発揮する可能性があり、低すぎる濃度は、応答を刺激するのに全く不十分である可能性があるという事実による。本研究では３種の抗原濃度、２．５μｇ、５μｇ及び１０μｇ／ｍＬを調べられた。統計的な解析から、２．５μｇ／ｍＬの刺激抗原濃度による３日目がほとんどの場合で最高のＴ細胞増殖が得られることは判明した（表３１）。
免疫反応の異なった側面を表す能力について、Ｔ細胞の増殖を行うために選択された３種の組織試料が選択された。脾臓のＴ細胞の増殖は、全身性の免疫反応の指標であり、一方、パイエル板は、粘膜免疫反応の証拠について調べた（Bouvet, Decroix & Pamonsinlapatham, 2002）。粘膜関連リンパ系組織（ＭＡＬＴ）の一部でもある腸間膜リンパ節も調べた（Roitt & Delves, 1997）。しかしながら、パイエル板は最初に抗原に接触し、刺激抗原感作リンパ球において役割を担っているので、粘膜の免疫反応の主な指標としてそれらを選択した。パイエル板からのこれらの刺激されたリンパ球はリンパ液に入り、腸間膜リンパ節を介して排出される（Roitt & Delves, 1997）。その結果、パイエル板で不十分な量しか得られなかった例では、粘膜の免疫反応の第２の指標として腸間膜リンパ節を使用した。パイエル板が十分なＴ細胞増殖を示したので、腸間膜リンパ節はさらに考察しないこととする。
一般に、パイエル板及び腸間膜リンパ節に比べて、脾細胞のさらに高い増殖によって示されるように、全身性の免疫反応は、粘膜よりも大きい。ワクチンを経口的に投与する好ましい目的は、粘膜の免疫反応を誘発することである。１箇所の粘膜表面での免疫は、他の粘膜表面での免疫の増強を招くことが、長い間仮説とされていた（Famularo, 1997）。Ｄｏｈｅｒｔｙら（２００２年）は、ブースターワクチンを経口で投与することによってあらかじめ感作した動物の肺で高いレベルの防御を生じ、粘膜表面にわたって免疫を付与する能力を示すことを見い出した。共生生物によるコロニー化を調節する能力、並びに上皮を介した病原体の侵入に対する防御の増強、有害レベルまでのその濃度の低下のために、粘膜表面での免疫反応の誘導は、主な関心である（Bouvet, Decroix & Pamonsinlapatham, 2002）。生体でＭ．ツベルクロシスの定着を妨げる能力は、極めて有益な功績であろう。
免疫グロブリン試験の結果は、血清における総ＩｇＧレベルの上昇を介して示されるように、強い全身性の免疫反応が得られることをさらに強調している（表３５）。低いＩｇＡレベルが認められた（表３５）。ＩｇＡの分泌は、粘膜表面での特異的な免疫防御に介在する抗体の優勢な形態であり、限定した呼吸器感染で役割を有することが判っている（Gleeson et al., 1999）。アジュバント、Ｐ．イエンセニー７０２を含有するワクチン１及び２に対してＩｇＡ応答が低いのは、所望の粘膜免疫反応を得るため細菌に対するさらに長い暴露時間の必要性による可能性がある。Ｂｏｕｖｅｔら（２００２年）は、免疫反応の程度が、ワクチン微生物のコロニー化の程度に関係することを見い出した。その後、このことは、Ｐ．イエンセニー７０２のコロニー化に対して十分な時間を与えることがワクチンのベクターとしてのその活性をさらに改善することを示唆している。
Ｐ．イエンセニー７０２に関する糞便プレート計数から、マウスの糞便から生きているＰ．イエンセニー７０２を得るには少なくとも７日間必要としたが、同時に、嫌気性菌の総数において相当する減少はなかったことがわかる（表２９）。Ｈｕａｎｇ（２００２年）による以前の研究では、ウイスター系オスラットにおいて、Ｐ．イエンセニー７０２がコロニー化するのに１ヵ月かかり、それは、嫌気性菌の減少が明らかであるＰ．イエンセニー７０２の競合的コロニー化が生じるまでではなかった。本研究におけるさらなる測定、たとえば、ビタミンＢ12の産生及び血清コレステロールレベルの低下もまた、宿主に有益な効果を発揮することができる前、細菌が定着するのに１ヵ月かかることが明らかになった（Huang, 2002）。粘膜応答を生じることにおいてＰ．イエンセニー７０２が有効なアジュバントとして機能するには、暴露時間が決定的に重要な意味を持つ可能性がある。このコロニー化期間は種特異的であるとも思われる。
パイエル板の結果は、コレラ毒素をアジュバントとして用いた場合（表３２〜３４）ワクチンが粘膜の免疫反応を刺激できることを示している。従って、ワクチン自体が、粘膜の及び全身性の免疫反応を刺激するのに経口ワクチンとして有効であることは疑いない。このことは、有効な粘膜の及び全身性の免疫反応を促進する経口のワクチン接種が今日まで多くの場合有効ではなかったので重要な所見である（Russell-Jones, 2000; Doherty et al., 2002）。
増殖反応の結果が、刺激する抗原の種類によって異なるということは価値有る指摘である。ワクチン２及び５は等量のＳＴＣＦとＷＴＢを含有した。ＳＴＣＦ単独で刺激した場合（表３２）、脾臓に関する増殖反応の結果は、ＳＴＣＦ−ＷＴＢの混合で刺激した場合よりもはるかに低かった（表３４）。ＷＴＢで刺激した場合（表３３）、ワクチン２は混合よりも低い結果を有したが、ワクチン５はさらに高い結果を有した。ワクチン５の場合、ＳＴＣＦ単独に比べて、刺激抗原がＳＴＣＦ−ＷＴＢ又はＷＴＢのいずれかである場合増殖反応に有意な増加があった。ワクチン２について同じ有意差が見られなかったと言う事実は、コレラ毒素をアジュバントとして用いた場合、ＷＴＢのマイトジェン効果がより顕著であることを示している。ワクチン２と５との間の有意差は刺激抗原がＷＴＢであるときのみに見られ、それもこのマイトジェン効果に起因する可能性がある。防御免疫では、マイトジェン応答ではなく、特異的な免疫反応が望ましい。従って、免疫反応を誘導するには、ＳＴＣＦ及びＷＴＢを含有するワクチンが有効であるが、防御免疫では、Ｐ．イエンセニー７０２がさらに良好なアジュバントであってもよい。
Ｔ細胞の増殖反応は、Ｐ．イエンセニー７０２のみを含有した対照、ワクチン３でも認められた。これは、Ｍ．ツベルクロシスと共有する免疫原性のタンパク質による可能性もあるし、以下でさらに考察する。このことにかかわりなく、脾細胞では、刺激抗原としてＳＴＣＦを用いて、ワクチン１、２及び５で、対照よりも有意に高い増殖結果が見い出された（表３２）。脾臓リンパ球をＷＴＢ（表３３）又はＷＴＢ／ＳＴＣＦの混合（表３４）で刺激した場合、ワクチン５が対照よりも有意に高かった。抗原のいかなる組み合わせで刺激してもワクチン１とワクチン５との間に有意差はなかった（表３２〜３４）。従って、ワクチン１及びワクチン５の双方は、有意な全身性のＴ細胞応答を示している。ＷＴＢの提案されたマイトジェン効果を考慮すると、ワクチン１がさらに良好なワクチンであると結論付けられる。
しかしながら、ワクチン１とワクチン２との間で増殖反応に有意差がなかったということは、アジュバントが同じである場合、このデータではどのタンパク質成分がさらに良好なワクチンを生じているのかを同定できないことを示している。非経口ワクチンに関する以前のデータは、免疫反応を誘導するには、全細胞のタンパク質よりも分泌されたＭ．ツベルクロシスのタンパク質がより重要であることを実証した（Weldingh & Andersen, 1999）。この研究は、Ｍ．ツベルクロシスの可溶性タンパク質が実際、この応答で役割を担っていることを示唆している。ワクチンにおけるこれらのタンパク質の比率が有効性において決定的な因子である可能性があるという仮説が立てられる。
さらに、ワクチン１はワクチン４よりも有意に高い増殖反応を生じた。これら２つのワクチンは同じタンパク質を含有するので、このことは、ワクチンの成功にはアジュバントが決定的な指標であることを示している。ワクチン４は、対照、ワクチン３よりも高いＴ細胞応答を誘導できなかった（表３２）。このことは、Ｐ．イエンセニー７０２が有効な経口アジュバントであることを実証している。粘膜経路を介して投与されたワクチンが細胞性の有効な免疫反応を刺激できることはほとんどない（Doherty et al., 2002）ので、本研究で得られた全身性の免疫を示す、脾細胞の有意な増殖反応は、独特で且つ重要である。
パイエル板の場合、３種の抗原の組み合わせ、ＳＴＣＦ、ＷＴＢ及びＳＴＣＦ−ＷＴＢで刺激された場合、ワクチン５のみがＰ．イエンセニー７０２対照に対して有意差を示した。パイエル板は粘膜免疫の測定なので、このことは、提案されたワクチンが有意な粘膜免疫を誘導することを示している。ワクチン５がこの反応を生じ、同じタンパク質成分を含有するワクチン２が生じない理由は、コレラ毒素がＰ．イエンセニー７０２よりもアジュバントとして迅速に作用するからであるというのはありそうなことである。しかしながら、コレラ毒素はその毒性ゆえにヒトでは使用することができず、コレラ毒素の非毒性サブユニットが利用可能ではあるが、それらも未だにヒトでの使用は許可されていない（Pizza et al., 2001）。Ｐ．イエンセニー７０２は安全な食品系の細菌である。Ｙａｎｇによる研究は、ヒトでの使用に好適であるという利点と共に、コレラ毒素に類似の又はそれより良好な活性を示すように、Ｐ．イエンセニー７０２のコロニー化期間を増やすことがアジュバント効果を高めると思われることを示唆している。
サイトカインは免疫反応の鍵となる指標なので、サイトカインの試験は本研究に極めて重要である（Kaufmann & Andersen, 1998）。正しくない免疫反応（Ｔｈ２）は、ＴＢの制御に有効ではなく、実際に病気を悪化させる効果を引き出すことが判っているので（Linblad et al., 1997）、ワクチンで誘導される免疫反応の種類はＴＢ免疫にとって決定的である。Ｔｈ１の応答は、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生を特徴とし（Kaufmann & Andersen, 1998）、ＴＢの効率的な防御には、高いレベルのＩＦＮ−γと共に強力なＴｈ１応答の誘導が必要とされる（Agger & Andersen, 2001）。Ｔｈ１サイトカインの産生はＩＬ−４により阻害され、Ｔｈ２応答の生成は、ＩＬ−４の産生が有利に働き、ＩＦＮ−γで阻害される（Marth & Strober, 1997）。ＩＬ−２は、Ｔｈ１応答が誘導する活性化Ｔ及びＢ細胞の増殖の前駆体である（Roitt & Delves, 2001）。
３日目にサイトカインを測定したが、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４（図１８）については、最適な存在に適していたが、ＩＬ−２（図１７）については、ＩＬ−２は感染後２４時間という早期にＴＢに反応して高い量で見いだされる早期応答性サイトカインなので、この時期は低下相を表す（Kaufmann & Andersen, 1998）。本研究で見い出された、延長して存在するＩＬ−２は、ワクチンには望ましい、さらに延長した免疫反応が起きていることを示している。いかなるＩＬ−２反応も十分である。明らかに最大の応答は、ＷＴＢ（図１７）で刺激されたワクチン５で見られ、再び、リンパ球とＷＴＢとの相互作用が示唆される。
ＩＦＮ−γとＩＬ−４の結果の比較を用いて、Ｔ細胞応答のＴｈ１性又はＴｈ２性を確定した（Marth & Strober, 1997）。現在の知識では、結核のワクチンのための最適なアジュバントは、１型方向の応答に偏るはずであることが示されている（Elhay & Andersen, 1997）。ワクチン群すべてにわたるすべての結果は、ＩＦＮ−γがＩＬ−４レベルよりも有意に高いことを示した（図１８）。以前の研究は、経口ワクチンは通常Ｔｈ２応答を誘導し、このことは、経口ワクチンがワクチン投与の方法として見逃されることが多い理由であることを示している（Doherty et al., 2002）。本研究は、経口ＴＢワクチンに対する強いＴｈ１Ｔ細胞応答を初めて示したので独特である。
細胞性の免疫反応は防御的であるとみなされるが、抗体の応答が果たす役割は現在のところ再評価中である（Attanasio, Pehler & McClure, 2000）。総ＩｇＧの存在は、全身性の免疫反応が誘発されたことを示している（Roitt & Delves, 2001）。ワクチン１、２及び５によって明らかに抗体陽転が生じている（表１１）。抗体陽転は、ＳＴＣＦ−ＷＴＢに対して調べた場合、プロバイオティクス対照群についても観察された。ＴＢに見い出される可溶性のタンパク質が保存され、他の細菌でも見い出される機会があり、これらの保存されたタンパク質が免疫原性でる可能性はある。これらのタンパク質がＰ．イエンセニー７０２に存在することは可能である。
強いＩｇＡ応答は、ＴＢのような細胞内の感染性病原体に応答する防御の最前線を提供する（Falero-Diaz, 2000）ことが予想された。強い粘膜免疫反応を誘発した後、ワクチン５は強いＩｇＡ応答を生じることが期待されたが、これは起きず、実際、ワクチン４及び５は、試験の終了時有意に低いＩｇＡレベルを有した（表１１）。低レベルのＩｇＡは、ＩｇＡを維持するための糞便試料の調製に伴う問題、又はキャンパス間の試料の輸送で、温度の変動が免疫グロブリンのレベルに悪影響を及ぼす可能性があるという問題に起因することが可能である。これらの検体は、ＩｇＡには十分であるはずの１：１０の希釈で調べられた。
ワクチン１及び２によって、ＩｇＡレベルが上昇しないという事実が予想され（表３５）が期待され、Ｐ．イエンセニー７０２への暴露時間が決定的であることは今や受入られている。本研究の最終的な観察には、ワクチンの試行中、５匹の実験動物の死亡に関して注目することができる興味深いパターンが関与する。解剖によって、マウスの死亡は推定的なマイコプラズマ感染により引き起こされたことが明らかとなった。死亡した５匹のマウスのうち４匹がプロバイオティクスではなく、コレラ毒素をアジュバントとして服用しているワクチン群のものだったことに注目するのは興味深い。Ｐ．イエンセニー７０２を服用したマウスが病気にならなかったという事実は、呼吸器感染に対するこのプロバイオティクスの防御効果のさらなる指標であってもよい。文献は、プロバイオティクスが既知の免疫刺激剤であることを示している。それらは、競合排除によって及びバクテリオシンの産生を介して潜在的病原体から宿主を守る（Matsuzaki & Chin, 2000）。そういうわけで、本研究の結果は、この観察と合わせて、プロバイオティクス、Ｐ．イエンセニー７０２が免疫刺激及びアジュバント効果を有することを示している。
今年、サブユニットTBワクチンの経口投与を伴う似通った性質の研究がＤｏｈｅｒｔｙら（２００２年）によって行われ、経口免疫は効果的に免疫反応を感作せず、経口免疫された実験動物のＩＦＮ−γレベルは無処置の動物と差異がなかったと結論付けた（Doherty et al., 2002）。経口ワクチン接種はＭ．ツベルクロシスに対して、全身的にも、又は粘膜表面でも、有意な免疫を誘発することができないことも明らかであり、達成できたのはせいぜいあらかじめ存在する免疫反応をブーストすることであった。ここに記載する結果は、これらの知見に反して、Ｍ．ツベルクロシスの可溶性の分泌型及び細胞内のタンパク質は強い全身性の及び粘膜の免疫反応を刺激し、それらは、それぞれ、脾臓リンパ球及びパイエル板におけるＴ細胞の高い増殖反応で示されると結論付けている。これに加えて、免疫反応は、高いＩＦＮ−γ及び低いＩＬ−４レベルで示される所望のＴｈ１型のものだった。
結論
本研究から、Ｍ．ツベルクロシスの可溶性タンパク質の経口投与が免疫反応を誘導できることは明らかである。このことは、Ｔ細胞の増殖反応、サイトカインの分析及び免疫グロブリンのレベルから得られる結果によって示される。この一連の免疫試験技術から、ワクチン１、２及び５は、脾細胞の有意なＴ細胞増殖を誘導することが見い出された。ワクチン５だけがパイエル板において有意な増殖を生じた。これらの結果は、ワクチンが結核感染に対して防御する可能性を有することを示している。
Ｔ細胞増殖の結果は、ワクチン製造におけるアジュバントの重要な役割を強調した。Ｐ．イエンセニー７０２なしでは、可溶性のＭ．ツベルクロシスのタンパク質を用いた経口ワクチン製造の同様の成功は疑わしいと結論付けられる。この結論は、ワクチン１とワクチン４の間で脾細胞の増殖を比較した場合、明らかである。双方のワクチンは同じタンパク質を含有するが、アジュバントとしてＰ．イエンセニー７０２を有するワクチン１だけが対照（ワクチン３）よりも高いＴ細胞の増殖反応を有した。
粘膜の免疫反応を誘発する２つのアジュバントの能力に差異が認められた。ワクチン２はワクチン５と同じ抗原を含有するが、アジュバントとしてＰ．イエンセニー７０２を有した。双方は、脾臓では高い増殖反応を生じたが、ワクチン２はパイエル板から単離されたリンパ球で有意な増殖反応を生じることができなかった。この粘膜の免疫反応を誘導することができなかったことは、Ｐ．イエンセニー７０２が粘膜の免疫系に対してアジュバントとしての効果を発揮できる前にコロニー化することの必要性に起因することができる。低いＩｇＡレベル及び試行の最初の２週間以内の最少コロニー化によって、短いワクチン試行期間内に適当にコロニー化できないＰ．イエンセニー７０２をさらに検証した。マウスの消化管におけるＰ．イエンセニー７０２の存在は、試験の７日目までに見られたが、嫌気性菌の総数の減少はなかった。このことは、さらに長いコロニー化時間が実際必要であり、消化管内に定着するのに将来、さらに長い時間を置けば、Ｐ．イエンセニー７０２は全く有効な粘膜のアジュバントになると思われる。
本研究で調べたワクチンすべてによって所望のＴｈ１型免疫反応に成功した。今日まで、他のワクチンはＴＢに対するＴｈ１応答を上手く誘導できなかったので、これは独特且つ有益な達成である。これに加えて、Ｔｈ１免疫反応を誘導する能力によってＰ．イエンセニー７０２の経口アジュバントとしての能力が再び強調された。コレラ毒素はＴｈ１応答を誘導することができるが、それは、非毒性のサブユニットと共にヒトでの使用が許可されていない。しかしながら、Ｐ．イエンセニー７０２は、食品系の生物／食品で使用される生物としてその安全性が立証されている。
免疫調節剤としてのＰ．イエンセニー７０２の実証
上述のように、ワクチン実験では、Ｐ．イエンセニー７０２は、経口アジュバントとして作用する。そのように行いつつ、それは、抗アレルギーである免疫反応を生じる。免疫系では２種類のＴ細胞が存在する：Ｔｈ１とＴｈ２である。一方の存在が他方の生成を防止する。アレルギーでは、Ｔｈ２免疫系が優勢であるが、上で実証したように、Ｐ．イエンセニー７０２はＴｈ１応答を生じ、そのように行いつつ、Ｔｈ２を減らすので、アレルギーの免疫的原因を調整する。
実施例５
プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２をアジュバント及びキャリアとして用いた経口ワクチンにおける適用のための可能性のあるタンパク質の選択
以下は、経口ワクチンで使用するためのタンパク質を同定するために使用されるべき技術の実施例である。技術は文献でうまく規定されている。ほとんどの感染剤は、上手く性状分析された免疫原性のタンパク質（抗原）であるが、場合によっては、送達方式、たとえば、経口対非経口によって、並びに使用されるアジュバントの種類に応じて、免疫原性の応答は変化する可能性もある。経口免疫の概念として、特に、結核のような適用は新規であり、どのように免疫原性のタンパク質を単離し、有効性に対してスクリーニングできるかの実施例を以下に説明する。単にアプローチを記載することを意味するのではなく、既知の抗原及び以前は有することができなかった心気の抗原の双方を用いた経口ワクチンを製造するのに使用することが出来る既知の技術が、既存のアジュバント技術を
この場合、実施例は結核に関するが、いかなる感染剤への適用も推定可能である。
方法
免疫原性タンパク質の単離及び同定
超音波処理したＭ．ツベルクロシス全体又は短期間の培養物ろ液から分画したタンパク質の分離物を使用してワクチンに抗原を提供することができる。
超音波処理したＭ．ツベルクロシス全細胞のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分離
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの装置
本実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に、バイオラッド・プロテアンＩＩＸＩゲル電気泳動ユニットを用いる。製造元の指示書に従って、４％のスタッキングゲルを重層した、１２％の分離ゲルから成る１６ｃｍｘ０．７５ｍｍのゲルを調製する。１５ウエルのコームでスタッキングゲルにウエルを作る。製造元の指示書に従って、ゲル及び泳動緩衝液を電気泳動槽に載せる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量標準
分子量標準の選択は、ゲルが溶出用のものなのか、染色目的で使用されるのかに依存する。ゲルが溶出用であれば、事前に染色された低範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準液（バイオラッド）を用いて分子量を示す。この標準液は、予備処理を必要とせず、２５μＬを指定されたウエルに直接加える。ゲルが染色されるべき又はタンパク質バンドの視覚化用であれば、未染色の低範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量標準液（バイオラッド）を使用する。試料緩衝液でこの標準液を１：１０に希釈し、９５℃で４分間加熱して冷却する。調製されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの指定されたウエルに処理した標準液１０μＬを加える。
事前に染色された標準液及び未染色の標準液は双方とも、およそ２０〜１１０ｋＤａのサイズ範囲にある６種の異なったタンパク質をそれぞれ含有する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離のための超音波処理したＭ．ツベルクロシスの調製
試料を試料緩衝液で１：３に希釈し、９５℃にて４分間加熱し、冷却する。電気泳動に先立って調製されたゲルの指定されたウエルに処理した試料６０μＬ加える。
超音波処理したＭ．ツベルクロシスの分離のための泳動条件
定電流２５ｍＡにておよそ８〜１２時間、又は染料の先端がゲルの底から約１ｃｍになるまで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。ゲルを泳動した後、溶出して分離したタンパク質分画を回収してもよいし、タンパク質バンドの視覚化のためにそれを染色することができる。
分離したタンパク質分画の電気的溶出（アンダーセン＆ヘロン（１９９３年）の方法に基づく）
電気泳動に続いて、ラテックローケータ上で合計２０分間、２ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．８を３回代えて、ゲルを浸す。これにより、電気的溶出の前にゲルを膨潤させ、過剰のＳＤＳを取り除くことができる。次いで、ゲルを緩衝液から取り出し、平面上に置き、形を整え、この工程で分子量マーカーの位置を記録する。次いで、ゲルをバイオラッド・ホールゲル・エルータに載せ、製造元の指示書に従って、組み立てる。４０Ｖにて２０分間ゲルで電気的溶出を行い、次いで、電流を１５秒間逆流させ、セロファン膜に結合した可能性のあるタンパク質を取り外す。
バイオラッド・ホールゲル・エルータからの分画の回収
溶出に続いて、回収箱をホールゲル・エルータ（バイオラッド）に固定し、３０分画を別々の試験管に回収する。個々の分画を５つの指定されたサイズ群（表１２）にまとめて、−８０℃で保存する。
表３６．超音波処理したＭ．ツベルクロシスの分画（ｋＤａ）
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 標準的なＴ細胞増殖試験における刺激抗原として得られた分画を使用する。この方法に従って陽性の結果を得た分画をさらに分画し、得られた亜分画を標準的なＴ細胞増殖試験における刺激抗原として使用し、抗原をさらに精製してもよい。
ＨＰＬＣを用いて分画を得て、さらに大きな収量を生じてもよい。
免疫反応の測定
実施例４に記載の方法によって免疫反応を測定することができる。いったん、最良の免疫反応が確定したら、感作試験を行うだろう。
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参考文献
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プライマー対ＰＢ１−ＰＢ２による属特異的増幅を示す。レーン１：ＰＣＲのＤＮＡマーカー（ＦＮ−１、バイオテック）、レーン２、１２、１３：７０２、レーン３：８０１、レーン４：９０１、レーン５：１００１、レーン６：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、レーン７：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１、レーン８：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン９：Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、レーン１０：２０１ａ、レーン１１：Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２、レーン１４：２０１ｂ、レーン１５：Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５、レーン１６：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン１７：Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２。 プライマー対ＰＢ１−ＰＢ２による種特異的増幅を示す。レーン１：ＰＣＲのＤＮＡマーカー（ＦＮ−１、バイオテック）、レーン２：２０１ａ、レーン３：２０１ｂ、レーン４：７０２、レーン５：８０１、レーン６：９０１、レーン７、８：１００１、レーン９：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、レーン１０：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１、レーン１１：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、レーン１２：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン１３：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６。 プライマー対ＰＢ１−ＰＢ２による種特異的増幅を示す。レーン１：ＰＣＲのＤＮＡマーカー（ＦＮ−１、バイオテック）、レーン２：陰性対照、レーン３〜５：７０２、レーン６：Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、レーン７、８：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、レーン９：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン１０：Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７１、レーン１１：Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２。 プライマー対ＰＴ３−ＰＢ２による種特異的増幅を示す。レーン１：ＰＣＲのＤＮＡマーカー（ＦＮ−１、バイオテック）、レーン２、３：Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５、レーン４、５：７０２。 プライマーＯＰＬ−０．５を用いたＲＡＰＤ−ＰＣＲによりプロピオニバクテリウムの試験種で得られた電気泳動特性を示す。レーン１：ＰＣＲのＤＮＡマーカー（バイオラット、アンプリサイズ（登録商標）、分子量定規５０〜２０００ｂｐのラダー）、レーン２：１００１、レーン３：９０１、レーン４：８０１、レーン５：２０１ｂ、レーン６：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、レーン７：２０１ａ、レーン８：Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、レーン９：Ｐ．アシッドプロピオニシ３４１。 単離された菌株７０２及び参照菌株の全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１、１０：ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質マーカー（バイオラッド、予測タンパク質標準、広域、未染色）、レーン２：ラクトバチルス・アシッドフィルス（ＭＪＬＡ１）、レーン３：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン４：Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、レーン５及び６：Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５、レーン７及び８：菌株７０２。 単離された菌株７０２及び参照菌株の全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質マーカー（バイオラッド、予測タンパク質標準、広域、未染色）、レーン２：ラクトバチルス・アシッドフィルス（ＭＪＬＡ１）、レーン３：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン４：Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、レーン５：Ｐ．ソエニＡＣＭ３６５、レーン６及び７：Ｐ．イエンセニーＮＣＦＢ５７２、レーン８〜９：７０２。 ６種の単離された菌株及び５種のプロピオニバクテリウム菌株の全細胞の可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質マーカー（バイオラッド、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子標準、低域）、レーン２：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００、レーン３：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１、レーン４：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、レーン５：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、レーン６：Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６、レーン７：菌株２０１ａ１、レーン８：菌株２０１ｂ、レーン９：菌株７０２、レーン１０：菌株８０１、レーン１１：菌株９０１、レーン１２：菌株１００１。 ３７℃にて嫌気的に、０．３％の胆汁塩を伴ったＳＬＢにおける乳中プロピオン酸菌の増殖曲線を示す。（Ａ）Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０１、（Ｂ）Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０６、（Ｃ）Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２０７、（Ｄ）Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２１６、（Ｅ）Ｐ．フレウデンレイチ２０１ａ１、（Ｆ）Ｐ．フレウデンレイチ２０１ｂ、（Ｇ）Ｐ．イエンセニー７０２、（Ｈ）Ｐ．フレウデンレイチ８０１、（Ｉ）Ｐ．フレウデンレイチ９０１、（Ｊ）Ｐ．フレウデンレイチ１００１、（Ｋ）Ｐ．アシッドプロピオニシＡＴＣＣ２５５６２、（Ｌ）Ｐ．アシッドプロピオニシ３４１、（Ｍ）Ｐ．フレウデンレイチＣＳＣＣ２２００。 ヒト上皮細胞株Ｃ２ＢＢｅｌに対して付着性の菌株の走査電子顕微鏡写真を示す。（Ａ）Ｌ．アシッドフィルスＭＪＬＡ１、（Ｂ）Ｂ．ラクティスＢＤＢＢ２、（Ｃ）（Ｄ）Ｐ．イエンセニー７０２。 自由に餌を食べさせたラット群（ｎ＝７）の成長曲線を示す。 Ｐ．イエンセニー７０２群のラットが摂取した水を示す。 Ｐ．イエンセニー７０２を食べさせたラットの糞便における乳中プロピオニバクテリウムの計数を示す。ｎ＝７ ８１日間Ｐ．イエンセニー７０２を食べさせたウイスター系オスラット小腸の内表面の走査電子顕微鏡写真を示す。 ３ヵ月間の餌処理の間の血清ビタミンＢ12のレベルとホモシステインのレベルの逆の関係を示す。Ａ：欠乏群、Ｂ：細菌群、各群は７匹のラットを含む。 ３ヵ月の餌処理完了時の３群のウイスター系ラットにおける平均総コレステロールと中性脂肪の比較を示す。各群は７匹のラットを含む。 マウスの血清試料におけるインターロイキン２のレベルを示す。 ワクチン群の間でのＩＦＮγとＩＬ−４のレベルの比較を示す。値は平均値であり、誤差棒は、標準偏差を表す。

Claims (19)

  1. 単離したプロピオニバクテリウム菌株、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２。
  2. 培養培地、保存培地、賦形剤、キャリア又は希釈剤と共にプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２を含む製剤。
  3. プロバイオティクス菌株としてのプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の使用。
  4. 送達剤とともにプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２を含むビタミンＢ12サプリメント。
  5. カプセル、錠剤、又は粉末（単体又はカプセルに入れた）、顆粒又はペースト又はスプレーの形態である請求項４記載のサプリメント。
  6. 朝食シリアル、豆乳製品又は菜食主義者のバーガーパティのようなビタミンＢ12を強化した食品の形態で提供される請求項４記載のサプリメント。
  7. 好適なキャリア、賦形剤又は希釈剤と共にプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２を含む動物の餌用の成長促進剤。
  8. 成長促進及び／又はビタミン供給を改善し、及び／又は有害腸内細菌を抑制する薬剤の製造におけるプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の利用。
  9. プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の使用を含む発酵工程を包含することによる食品を調整することを含む食品の損傷を防ぎ、及び／又は食品の貯蔵期間を延長する方法。
  10. プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２は別の食品発酵微生物と共に混合培養体内に存在することを特徴とする請求項９記載の方法。
  11. プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２を用いて調製される食品。
  12. 食品が、プロピオニ・アシッドフィルス乳のような発酵乳製品である請求項１１記載の食品。
  13. 調製においてプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２を使用することを含む食品の調製方法。
  14. ビタミンＢ12不足、高ホモシスティン、ベータ・グルクロニダーゼ又は免疫インバランスによる悪影響の予防、治療または改善、胃腸病及び／又はラクトース不耐症の治療、腸内でのビフィドバクテリアの成長促進、脂質代謝の向上、免疫システムに作用することによる抗原増強効果の提供、免疫刺激全身性又はアレルギーの緩和、心臓病のリスク低減、免疫反応の改質、あるいは感染症への抵抗性増強用の食品またはサプリメントの製造におけるプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の利用。
  15. １又はそれより多くのプロバイオティクス細菌を含む、プロピオニナクテリウム・イエンセニー７０２培養物。
  16. プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の粘膜アジュバントを含むツベルクロシスのための粘膜ワクチンであって、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１種の細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは免疫学的に活性のあるその少なくとも一部を含むマイコバクテリウム・ツベルクロシス抗原を更に含む、粘膜ワクチン。
  17. 抗原が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス細胞全体、崩壊させたマイコバクテリウム・ツベルクロシスの細胞又はその一部、及び活発に複製しているマイコバクテリウム・ツベルクロシスの培養から回収された分泌型又は細胞性のいずれかのマイコバクテリウム・ツベルクロシスの可溶性タンパク質、あるいは分泌型又は細胞性の可溶性タンパク質の組み合わせより成る群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載のワクチン。
  18. マイコバクテリウム・ツベルクロシスに対するワクチンを調製する方法であって、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の粘膜アジュバントと、好適なキャリアと、マイコバクテリウム・ツベルクロシスの少なくとも１種の細胞性又は分泌型のタンパク質あるいは免疫学的に活性のあるその少なくとも一部を含む抗原と、を組み合わせることからなり、抗原がマイコバクテリウム・ツベルクロシスに対して免疫反応をもたせるように選択されることを特徴とする方法。
  19. アジュバントとしてのプロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２の使用。
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