JP7111878B1

JP7111878B1 - ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法

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Inventors: 毅松岡; 竜也平田; 勝山越
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Abstract

【課題】１つの酵素によりヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸及びニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供する。【解決手段】少なくとも下記の１）及び２）の工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。１）ヌクレオシドモノリン酸及びピロリン酸に実質的に１つの酵素を作用させてホスホリボシル二リン酸を生成する第一の工程２）前記第一の工程の生成物であるホスホリボシル二リン酸、及びニコチンアミドに実質的に前記１つの酵素のみを作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを生成する第二の工程【選択図】図１

Description

本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法に関する。

近年、ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下「ＮＭＮ」と記載することがある）は抗老化物質として注目されており、健康サプリメントなどとしての需要が拡大している。

ＮＭＮの製造方法としては、（１）有機合成による製造方法、（２）酵母を用いた発酵法による製造方法、（３）酵素を用いた酵素法による製造方法などが知られている。これらのうち、有機合成による製造方法は、数段階の合成工程が必要なため、時間とコストがかかるという問題がある。また、発酵法による製造方法は、ＮＭＮの生産性が非常に悪く大規模な培養設備などが必要である。

ＮＭＮの酵素法による製造方法がいくつか報告されている。その中で、特許文献１～９には、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（nicotinamide phosphoribosyltransferase）（EC 2.4.2.12）（以下「ＮＡＭＰＴ」と記載することがある）によりニコチンアミド（以下「ＮＡＭ」と記載することがある）とホスホリボシル二リン酸（ホスホリボシルピロリン酸とも言う）（以下「ＰＲＰＰ」と記載することがある）からＮＭＮに転換させる方法が開示されている。

それらの中で特許文献７～９には、安価なヌクレオシドモノリン酸としてイノシン酸（ＩＭＰ）、５'－グアニル酸（ＧＭＰ）を原料としてヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyltransferase）(EC 2.4.2.8)（以下「ＨＧＰＲＴ」又は「ＨＰＴ」と記載することがある）によりＰＲＰＰを生成させ、そのＰＲＰＰとＮＡＭを原料としてＮＡＭＰＴによりＮＭＮを生成させる方法、つまりＨＧＰＲＴとＮＡＭＰＴという２つの酵素を用いてヌクレオシドモノリン酸からＮＭＮを生成させる方法が開示されている。

国際公開第２０１７／１８５５４９号国際公開第２０１８／０２３２０６号国際公開第２０１８／０２３２０７号国際公開第２０１８／０２３２０８号国際公開第２０１８／０２３２０９号国際公開第２０１９／０６５８７６号国際公開第２０１８／０２３２１０号米国特許出願公開第２０１７／０１２１７４６号明細書米国特許出願公開第２０２１／０２４６４７６号明細書

しかしながら、１つの酵素によりヌクレオシドモノリン酸からＮＭＮを生成させる方法については知られていない。

本発明の目的は、１つの酵素によりヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸及びニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することである。

本発明者らは、１つの酵素によりヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸及びニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを生成する反応を見出し、本発明を完成した。

本発明は、上記目的を達成するために、下記のニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供する。

［１］少なくとも下記の１）及び２）の工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
１）ヌクレオシドモノリン酸及びピロリン酸に実質的に１つの酵素を作用させてホスホリボシル二リン酸を生成する第一の工程
２）前記第一の工程の生成物であるホスホリボシル二リン酸、及びニコチンアミドに実質的に前記１つの酵素のみを作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを生成する第二の工程
［２］前記第一の工程及び第二の工程が、同時に進行させる工程である前記［１］に記載の製造方法。
［３］前記酵素が、Pentosyltransferases(EC 2.4.2)に属する酵素である前記［１］又は前記［２］に記載の製造方法。
［４］前記Pentosyltransferases(EC 2.4.2)に属する酵素が、hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素である前記［３］に記載の製造方法。
［５］前記hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素が、ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ、ＨＰＴ－Ｌのいずれか、又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドである前記［４］に記載の製造方法。
［６］前記ヌクレオシドモノリン酸が、イノシン酸、グアニル酸、又はイノシン酸とグアニル酸の混合物である前記［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
［７］前記ヌクレオシドモノリン酸の一部又は全部が、イノシン酸であり、
前記第一の工程は、当該工程で生成されるヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させる工程を含む前記［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］前記第一の工程及び前記第二の工程は、Ｍｇイオン及び／又はＭｎイオンの存在下で前記酵素を作用させる工程である前記［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］ホスホリボシル二リン酸及びニコチンアミドにhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する１つ又は複数の酵素を作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
［１０］前記hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素の少なくとも１つが、ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ、ＨＰＴ－Ｌのいずれか、又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドである前記［９］に記載の製造方法。
［１１］Ｍｇイオン及び／又はＭｎイオンの存在下で前記酵素を作用させる前記［９］又は前記［１０］に記載の製造方法。

本発明によれば、１つの酵素によりヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸及びニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することができる。

本発明の実施形態に係るニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法の各工程を示す概略図である。実施例１におけるサンプルのＨＰＬＣ溶出挙動を示す図である。実施例１４における試料及びＮＭＮのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

図１は、本実施形態に係るニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法の各工程を示す概略図である。

本実施形態に係るニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法は、少なくとも下記の１）及び２）の工程を含む。
１）ヌクレオシドモノリン酸及びピロリン酸に実質的に１つの酵素を作用させてホスホリボシル二リン酸を生成する第一の工程
２）前記第一の工程の生成物であるホスホリボシル二リン酸、及びニコチンアミドに実質的に前記１つの酵素のみを作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを生成する第二の工程

上記第一の工程は、上記第二の工程に先立って行ってもよいが、上記第一の工程と第二の工程を同時に進行させることが好ましい。ここで、「同時に進行させる」とは、「同一反応器内で第一の工程を進行させつつ、第二の工程も並行して進行させる」ことを意味する。

ヌクレオシドモノリン酸とはヌクレオチドの１種であり、リボース類似体（例えばリボース、デオキシリボースなど）の１位の炭素原子が塩基（例えばプリン塩基、ピリミジン塩基）の窒素原子と結合し、５位の炭素原子がリン酸基と結合しているものであり、例えばＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ＸＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＯＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰなどである。

酵素を用いてヌクレオシドモノリン酸であるＩＭＰ又はＧＭＰとピロリン酸からＰＲＰＰを生成させ（本明細書では第一の工程という）、その生成物であるＰＲＰＰとＮＡＭに酵素を作用させる（本明細書では第二の工程という）ことでＮＭＮを生成させることは、前述の通り、これまでに報告されている(特許文献７～９)。

この第一の工程に用いられる酵素としては、ＨＧＰＲＴが示されており、第二の工程に用いられる酵素としては、ＮＡＭＰＴが示されていた（特許文献７～９）。そして、この第一の工程と第二の工程を同時に行うことも示されている（特許文献７の実施例１～５、特許文献９の実施例３２，３３、５４～５６）。

しかし、第一の工程と第二の工程を同時に行うことはできても、１つの酵素で反応触媒させることはこれまで知られておらず、少なくとも別の２つの酵素を用いる必要があった。酵素を用いる物質の製造方法において、酵素の種類や量を減らすことはコスト的に優れているだけでなく、反応系の制御を簡素にすることができ、さらに反応後の生成物の精製も簡素にすることができるので、生成物の品質向上にも大きく寄与するものである。

本発明者らは、これまで全く別の酵素による反応であると思われていたヌクレオシドモノリン酸とピロリン酸からＰＲＰＰを生じさせる第一の工程と第一の工程の生成物であるＰＲＰＰとＮＡＭからＮＭＮを生じさせる第二の工程の反応を１つの酵素が触媒することを予想外に発見し、２つの酵素を用いることなく、図１に示されるような、１つの酵素により反応が進行する第一の工程と第二の工程とを含むＮＭＮの製造方法を完成した。

ここでいう１つの酵素は、ヌクレオシドモノリン酸とピロリン酸からＰＲＰＰを生じさせる第一の工程と、第一の工程の生成物であるＰＲＰＰとＮＡＭからＮＭＮを生じさせる第二の工程の反応を触媒することができる酵素であれば天然型酵素や反応性や安定性や特異性を変化させるなどのために変異や欠失や付加や融合などをさせた改変型酵素などであってもよく、特に限定はしないが、例えばPentosyltransferases(EC 2.4.2)に属する酵素が挙げられる。中でも、例えばhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素が好ましいものとして挙げられる。なお、本明細書においては、現在の分類では異なる酵素番号が付与されているものであっても旧分類にて上記の酵素番号が付与されていた酵素も含む。

１つの酵素を作用させてとは、作用させて生成させる反応に関与する酵素が１つであることを言うのであって、作用させて生成させる反応に関与しない他の酵素の存在を除外するものではない。例えば、ヌクレオシドモノリン酸及びピロリン酸に１つの酵素を作用させてホスホリボシル二リン酸を生成するとは、ヌクレオシドモノリン酸及びピロリン酸からホスホリボシル二リン酸を生成する反応に関与する酵素が１つであり、この反応に関与しない他の酵素が共存することをも含む。

実質的に1つの酵素とは、1つの酵素が９０％以上であり他に混在する酵素が１０％以下であることをいい、好ましくは1つの酵素が９５％以上であり他に混在する酵素が５％以下であること、より好ましくは１つの酵素が９９％以上であり他に混在する酵素が１％以下であることをいう。また、ここでいう酵素の％表示は、酵素のタンパク重量、酵素の活性単位であるユニットによるいずれの％表示であってよい。なお、他に混在する酵素とは、第一の工程及び／又は第二の工程の反応を触媒することができる１つ又は複数の酵素のことをいう。

hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酵素「ＨＰＴ－Ｗ（本件発明者らが命名）」、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる酵素「ＨＰＴ－Ｃ（本件発明者らが命名）」、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる酵素「ＨＰＴ－Ｌ（本件発明者らが命名）」が好適なものとして挙げられる。さらにこれらのアミノ酸配列と７０％以上、もしくは８０％以上、もしくは９０％以上、もしくは９５％以上、もしくは９８％以上一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドも挙げられる。

特許文献７～９にはＮＡＭ、ＩＭＰ又はＧＭＰ、ピロリン酸を原料としてＨＧＰＲＴとＮＡＭＰＴの２つの酵素を用いてＮＭＮを製造する方法が開示されているが、ＨＧＰＲＴの活性とＮＡＭＰＴの活性を共に持つ酵素の存在を示唆したり、そのような酵素の発見や開発を課題として認識しているものではない。つまり、これまでに開示されている先行技術を組み合わせても、１つの酵素により反応が進行する第一の工程と第二の工程とを含むＮＭＮの製造方法に関する示唆はこれまで何ら無かった。

特に、hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)のペプチドの長さは約２００アミノ酸であり、一方、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）のペプチドの長さは約４５０アミノ酸であり、構造的に大きく異なっているため、hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)がnicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）と同様にニコチンアミドに対して活性を持つということはこれまで想定もされていなかった。

本実施形態に係る、少なくとも上記第一の工程と上記第二の工程を含むニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法は、ニコチンアミドモノヌクレオチドを効率的に生産するために、工程の条件を工夫して最適化することができる。

効率的に生産とは、投入する原料や酵素の量、時間、作業量や作業安全性及び環境への負荷に比較して、取得する生成物の量、純度などを増大させるように生産することである。特に、第一の工程と第二の工程とも平衡反応であるため、生成物の量が増大するように平衡を望ましい方向に移すように工程の条件を工夫、最適化し、ニコチンアミドモノヌクレオチドを効率的に生産することが重要である。

以下に詳細に説明するが、工程の条件の最適化として、酵素の種類、酵素剤型、酵素濃度、基質原料の種類、基質原料の濃度と比率、反応温度、反応時間、溶存酸素濃度、ｐＨ、緩衝液の種類や濃度、イオン強度の調整、酵素安定化剤の添加、生成物安定化剤の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加、反応補因子や反応促進成分の添加、副産物の除去などがある。

酵素の種類の最適化とは、第一の工程と第二の工程の反応を触媒できる酵素の群の中からニコチンアミドモノヌクレオチドを効率的に生産するために、基質原料の種類に応じて適切な種類の酵素を選ぶことである。例えばPentosyltransferases (EC 2.4.2)に属する酵素を選択することで最適化できる。また、Pentosyltransferases (EC 2.4.2)に属する酵素の中から、purine-nucleoside phosphorylase（EC 2.4.2.1）、pyrimidine-nucleoside phosphorylase（EC 2.4.2.2）、uridine phosphorylase（EC 2.4.2.3）、thymidine phosphorylase（EC 2.4.2.4）、nucleoside ribosyltransferase（EC 2.4.2.5）、nucleoside deoxyribosyltransferase（EC 2.4.2.6）、adenine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.7）、hypoxanthine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.8）、uracil phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.9）、orotate phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.10）、nicotinate phosphoribosyltransferase（EC 6.3.4.21、旧酵素番号：EC 2.4.2. 11）、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）、methionine adenosyltransferase（EC 2.5.1.6、旧酵素番号：EC 2.4.2.13）、amidophosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.14）、guanosine phosphorylase（EC 2.4.2.15）、urate-ribonucleoside phosphorylase（EC 2.4.2.16）、ATP phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.17）、anthranilate phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.18）、nicotinate-nucleotide diphosphorylase (carboxylating)（EC 2.4.2.19）、dioxotetrahydropyrimidine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.20）、nicotinate-nucleotide-dimethylbenzimidazole phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.21）、xanthine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.22）、deoxyuridine phosphorylase （EC 2.4.2.2, EC 2.4.2.3, EC 2.4.2.4.、旧酵素番号：EC 2.4.2.23）、1,4-beta-D-xylan synthase（EC 2.4.2.24）、flavone apiosyltransferase（EC 2.4.2.25）、protein xylosyltransferase（EC 2.4.2.26）、dTDP-dihydrostreptose-streptidine-6-phosphate dihydrostreptosyltransferase（EC 2.4.2.27）、S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase（EC 2.4.2.28）、tRNA-guanosine34 transglycosylase（EC 2.4.2.29）、NAD⁺ ADP-ribosyltransferase（EC 2.4.2.30）、NAD⁺-protein-arginine ADP-ribosyltransferase（EC 2.4.2.31）、dolichyl-phosphate D-xylosyltransferase（EC 2.4.2.32）、dolichyl-xylosyl-phosphate-protein xylosyltransferase（EC 2.4.2.33）、indolylacetylinositol arabinosyltransferase（EC 2.4.2.34）、flavonol-3-O-glycoside xylosyltransferase（EC 2.4.2.35）、NAD⁺-diphthamide ADP-ribosyltransferase（EC 2.4.2.36）、NAD⁺-dinitrogen-reductase ADP-D-ribosyltransferase（EC 2.4.2.37）、glycoprotein 2-beta-D-xylosyltransferase（EC 2.4.2.38）、xyloglucan 6-xylosyltransferase（EC 2.4.2.39）、zeatin O-beta-D-xylosyltransferase（EC 2.4.2.40）、xylogalacturonan beta-1,3-xylosyltransferase（EC 2.4.2.41）、UDP-D-xylose:beta-D-glucoside alpha-1,3-D-xylosyltransferase（EC 2.4.2.42）、lipid IVA 4-amino-4-deoxy-L-arabinosyltransferase（EC 2.4.2.43）、S-methyl-5'-thioinosine phosphorylase（EC 2.4.2.44）、decaprenyl-phosphate phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.45）、galactan 5-O-arabinofuranosyltransferase（EC 2.4.2.46）、arabinofuranan 3-O-arabinosyltransferase（EC 2.4.2.47）、tRNA-guanine15 transglycosylase（EC 2.4.2.48）、neamine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.49）、cyanidin 3-O-galactoside 2''-O-xylosyltransferase（EC 2.4.2.50）、anthocyanidin 3-O-glucoside 2'''-O-xylosyltransferase（EC 2.4.2.51）、triphosphoribosyl-dephospho-CoA synthase（EC 2.4.2.52）、undecaprenyl-phosphate 4-deoxy-4-formamido-L-arabinose transferase（EC 2.4.2.53）、beta-ribofuranosylphenol 5'-phosphate synthase（EC 2.4.2.54）、nicotinate D-ribonucleotide:phenol phospho-D-ribosyltransferase（EC 2.4.2.55）、kaempferol 3-O-xylosyltransferase（EC 2.4.2.56）、AMP phosphorylase（EC 2.4.2.57）、hydroxyproline O-arabinosyltransferase（EC 2.4.2.58）、sulfide-dependent adenosine diphosphate thiazole synthase（EC 2.4.2.59）、cysteine-dependent adenosine diphosphate thiazole synthase（EC 2.4.2.60）、alpha-dystroglycan beta1,4-xylosyltransferase（EC 2.4.2.61）、xylosyl alpha-1,3-xylosyltransferase（EC 2.4.2.62）、EGF-domain serine xylosyltransferase（EC 2.4.2.63）、NAD⁺-protein-arginine ADP-ribosyltransferase（EC 2.4.2.B12）、NAD⁺-protein-arginine ADP-ribosyltransferase（EC 2.4.2.B13）、(KDO)2-lipid IV(A) 4-amino-4-deoxy-L-arabinosyltransferase（EC 2.4.2.B4）のいずれかに属する酵素を選択することで最適化できる。また、Archaeoglobus veneficus、Artemia sp.、Bos taurus、Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis、Carboxydothermus hydrogenoformans、Cricetulus griseus、Cryptosporidium parvum、Escherichia coli、Gallus gallus、Giardia intestinalis、Giardia intestinalis Portland、Halobacterium salinarum、Haloferax volcanii、Homo sapiens、Hungateiclostridium thermocellum、Hungateiclostridium thermocellum DSM 1237、Legionella pneumophila、Leishmania donovani、Leishmania tarentolae、Lontra longicaudis、Methanococcus voltae、Mirounga angustirostris、Mus musculus、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium tuberculosis H37Rv、Plasmodium chabaudi、Plasmodium falciparum、Plasmodium lophurae、Pyrococcus horikoshii、Rattus norvegicus、Saccharolobus solfataricus、Saccharolobus solfataricus P2、Saccharomyces cerevisiae、Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium、Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium LT2、Schistosoma mansoni、Schizosaccharomyces pombe、Streptomyces cyanogenus、Sus scrofa、Thermus thermophilus、Thermus thermophilus HB8 / ATCC 27634 / DSM 579、Toxoplasma gondii、Tritrichomonas suis、Trypanosoma cruziのいずれかの菌由来のhypoxanthine phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8)を選択することで最適化できる。また、上記の酵素をそのまま、又はアミノ酸配列において欠失、挿入、付加、融合などの改変した酵素として遺伝子組み換え生物等で生産させた酵素のいずれかを選択することで最適化できる。前述のＨＰＴ－Ｗ、ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｌのいずれかを選択する場合には、後述の実施例に記載のように生産したものが好ましいが、遺伝子組み換えをしたその他の菌から生産したものを選択してもよい。

基質原料のヌクレオシドモノリン酸がＩＭＰ、ＧＭＰ又はこれらの混合物の時は、hypoxanthine phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8)、nicotinate phosphoribosyltransferase （EC 6.3.4.21）、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）のいずれかに属する酵素を選択することが好ましい。
基質原料のヌクレオシドモノリン酸がＡＭＰ又はその含有物の時は、adenine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.7）、nicotinate phosphoribosyltransferase（EC 6.3.4.21）、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）のいずれかに属する酵素を選択することが好ましい。
基質原料のヌクレオシドモノリン酸がＵＭＰ又はその含有物の時は、uracil phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.9）、nicotinate phosphoribosyltransferase （EC 6.3.4.21）、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）のいずれかに属する酵素を選択することが好ましい。
基質原料のヌクレオシドモノリン酸がＯＭＰ又はその含有物の時は、orotate phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.10）、nicotinate phosphoribosyltransferase （EC 6.3.4.21）、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）のいずれかに属する酵素を選択することが好ましい。
基質原料のヌクレオシドモノリン酸がＸＭＰ又はその含有物の時は、xanthine phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.22）、nicotinate phosphoribosyltransferase （EC 6.3.4.21）、nicotinamide phosphoribosyltransferase（EC 2.4.2.12）のいずれかに属する酵素を選択することが好ましい。

酵素剤型の最適化とは、酵素を含有する生きている微生物、酵素を含む不活化した微生物、酵素を含む微生物の粗抽出物又は粗抽出液、精製処理をした粉末酵素又は液体酵素、リンカーなど重合剤を用いて重合させた酵素、ポリスチレンやアクリルアミドやアガロースなどの担体上に固定化された酵素などからそれぞれの条件において最適なものを選択することである。さらに酵素を固定した担体をカラムに詰め、工程の反応液を通液、循環通液させることも可能である。

酵素濃度の最適化とは、ヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸に作用し、かつその生成物であるＰＲＰＰ、ＮＡＭに作用する酵素の濃度を他の様々な条件をも勘案しながら最適な濃度を選択することである。酵素のタンパク濃度では例えば０．００１ｍｇ～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１ｍｇ～１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１～１００ｇ／Ｌの範囲、酵素の活性濃度では例えば０．０１Ｕ～１０００ｋＵ／Ｌ、好ましくは１Ｕ～１００ｋＵ／Ｌ、より好ましくは１０Ｕ～１０ｋＵ／Ｌの範囲などから適切な濃度を選択することで最適化できる。

基質原料の種類の最適化とは、ヌクレオシドモノリン酸を基質原料として酵素反応によりＰＲＰＰが生成するものであればよく、例えばＩＭＰ、ＧＭＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＯＭＰ、ＸＭＰ又はこれらのうちの２以上の混合物でもよく、他の様々な条件をも勘案しながら最適なヌクレオシドモノリン酸を選択することである。また、ヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸、ＮＡＭは各工程の反応液中で酵素と反応する際にその形態であればよく、原料として投入する際はそれらの塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩や水和物などでもよく、他の様々な条件をも勘案しながら最適な形態の原料を選択することで最適化できる。

基質原料の濃度と比率の最適化とは、第一の工程開始時の反応液中のヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸の濃度とその比率を他の様々な条件をも勘案しながら最適な濃度と比率を選択することであり、第二の工程開始時の反応液中のヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸、ＮＡＭの濃度とその比率を他の様々な条件をも勘案しながら最適化することである。第一の工程開始時の反応液中の濃度とその比率としては、例えばヌクレオシドモノリン酸の濃度は０．０１～５００ｍＭ、好ましくは０．１～２０ｍＭ、ピロリン酸の濃度は０．００１～１００ｍＭ、好ましくは０．０２～１０ｍＭの範囲から、ヌクレオシドモノリン酸とピロリン酸の濃度の比率は例えば１：０．００１～１００の範囲から、適切な値を選択する。第二の工程開始時の反応液中の濃度とその比率は、例えばヌクレオシドモノリン酸の濃度は０～５００ｍＭ、好ましくは０．１～２０ｍＭ、ピロリン酸の濃度は０～１００ｍＭ、ＮＡＭの濃度は０．０１～５００ｍＭ、好ましくは０．１～２０ｍＭの範囲から、ヌクレオシドモノリン酸とピロリン酸とＮＡＭの濃度の比率は例えば０～１０：０～１００：１の範囲から、適切な値を選択する。例えば第一の工程と第二の工程を同時に開始し、ヌクレオシドモノリン酸としてＩＭＰを用いる場合はＩＭＰとピロリン酸とＮＡＭの濃度の比率として０．１～１０：０．００１～１００：１の範囲から、適切な値を選択する。また、工程の途中において濃縮や希釈もしくは原料の追加投入をして基質原料の濃度や比率を変化させて最適化することもある。

反応温度の最適化とは、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、それぞれの工程の温度を別に、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合はその工程の温度を、他の様々な条件をも勘案しながら最適化することである。例えば０～７０℃、好ましくは２５～６５℃の範囲で、一定の温度もしくは途中で変化させることを検討し、最適な温度、最適な温度変化プログラムを選択することで最適化できる。

反応時間の最適化とは、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、それぞれの工程の時間を別に、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合はその工程の時間を、他の様々な条件をも勘案しながら最適化することである。例えば１～２４０ｈｒ、好ましくは１～７２ｈｒの範囲で選択することで最適化できる。

溶存酸素濃度の最適化とは、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、それぞれの工程における反応液中の酸素濃度を別に、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合はその工程の反応液中の酸素濃度を、他の様々な条件をも勘案しながら最適化することである。例えば０～１４．１５ｍｇ／Ｌの範囲で、工程中に一定の濃度もしくは途中で変化させることを検討し、最適な濃度、最適な濃度変化プログラムを選択することで最適化できる。

ｐＨの最適化とは、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、それぞれの工程における反応液中のｐＨを別に、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合はその工程の反応液中のｐＨを、他の様々な条件をも勘案しながら最適化することである。例えばｐＨ４～１１の範囲で、工程中に一定のｐＨもしくは途中で変化させることを検討し、最適なｐＨ、最適なｐＨ変化プログラムを選択することで最適化できる。

緩衝液の種類や濃度の最適化とは、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、それぞれの工程における緩衝液の種類や濃度を別に、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合はその工程における緩衝液の種類や濃度を、他の様々な条件をも勘案しながら選択し、最適化することである。緩衝液の種類としては例えばクエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液、トリス緩衝液、ビストリス緩衝液、アンモニウム緩衝液、トリエチルアミン緩衝液、グリシン緩衝液、マッキルベイン緩衝液やそれらを組み合わせた緩衝液などから、緩衝液の１～５００ｍＭ濃度の範囲で最適な種類と濃度を選択することで最適化できる。

イオン強度の調整の最適化とは、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、それぞれの工程におけるイオン強度の調整を別に、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合はその工程におけるイオン強度の調整を、他の様々な条件をも勘案しながら行うことである。イオン強度の調整方法としては例えば反応液中の緩衝液の濃度や、反応液にＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄などの塩を加えることで調整でき、緩衝液は１～５００ｍＭ、ＮａＣｌは０～２Ｍ、ＫＣｌは０～２Ｍ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄は０～１Ｍの範囲で濃度を選択し、最適なイオン強度を設定することで最適化できる。

酵素安定化剤の添加の最適化とは、工程中の酵素の活性を維持するため酵素安定化剤を第一の工程又は第二の工程の反応液に、他の様々な条件をも勘案しながら種類、濃度を選択し添加することである。酵素安定化剤としては例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を０．１～０．５Ｍ、グリセロール、エチレングリコール、シュークロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、エタノールを０．１～５０％、界面活性剤、スキムミルク、大豆プロテイン、ホエイ、カゼイン、アルブミンを０．００１～１％の範囲で濃度を選択し、反応液に添加することで最適化できる。

生成物安定化剤の添加の最適化とは、第一の工程での生成物と第二の工程での生成物が熱、酸素、混在物質、混在酵素などにより想定外の分解で収量が減ることを防ぐために第一の工程又は第二の工程の反応液に生成物安定化剤を、他の様々な条件をも勘案しながら種類、濃度を選択し添加することである。生成物安定化剤としては例えばＥＤＴＡなどのキレート剤、カタラーゼ、メルカプトエタノール、ＤＴＴやチオグリセロールなどの還元剤、亜硫酸ナトリウムなどから適宜選択して反応液に添加することで最適化できる。

界面活性剤の添加の最適化とは、第一の工程又は第二の工程の酵素反応を促進、生成物量が増大するように反応の平衡を移動するために第一の工程又は第二の工程の反応液に界面活性剤を他の様々な条件をも勘案しながら種類、濃度を選択し添加することである。界面活性剤として例えばアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、サポニン、リン脂質、ペプチド、バイオサーファクタント（糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系、高分子系）などから適宜選択して反応液に添加することで最適化できる。

有機溶媒の添加の最適化とは、第一の工程又は第二の工程の酵素反応を促進、生成物量が増大するように反応の平衡を移動するために第一の工程又は第二の工程の反応液に有機溶媒を他の様々な条件をも勘案しながら種類、濃度を選択し添加することである。有機溶媒として例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサンなどから適宜選択して反応液に添加することで最適化できる。

反応補因子や反応促進成分の添加の最適化とは、第一の工程又は第二の工程の酵素による反応に必要な補因子や、反応を活性化し反応時間を短縮及び／又は添加酵素量を減少させるために第一の工程又は第二の工程の反応液に反応補因子又は反応促進成分を他の様々な条件をも勘案しながら種類、濃度を選択し添加することである。反応補因子又は反応促進成分としては例えばＭｇＣｌ₂やＭｇＳＯ₄などのＭｇ化合物、ＭｎＣｌ₂などのＭｎ化合物、ＦｅＣｌ₃、ＦｅＣｌ₂などのＦｅ化合物、ＺｎＣｌ₂などのＺｎ化合物、Ｃｏ化合物、Ｍｏ化合物、Ｃｕ化合物、Ａｇ化合物、Ａｌ化合物、Ｃａ化合物、Ｎｉ化合物などを０．００１～１００ｍＭ、好ましくは０．１～１００ｍＭ、より好ましくは２～５０ｍＭなどの範囲で適宜選択又は組み合わせて反応液に添加することで最適化できる。

副産物の除去の最適化とは、第一の工程では反応液から塩基を、第二の工程では反応液からピロリン酸を除去する条件を他の様々な条件をも勘案しながら選択することである。第一の工程でヌクレオシドモノリン酸がＩＭＰの場合はヒポキサンチンの除去、ＧＭＰの場合はグアニンの除去、ＡＭＰの場合はアデニンの除去である。
ヒポキサンチンの除去は、キサンチンオキシダーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼによりキサンチン及び尿酸へ変換することで除去できる。キサンチンオキシダーゼを用いる場合は、発生する過酸化水素をカタラーゼやパーオキシダーゼにより除去することで、より効率的にヒポキサンチンの除去ができる。キサンチンデヒドロゲナーゼを用いる場合は、生成するＮＡＤＨをＮＡＤＨオキシダーゼなどでＮＡＤに変換することで、より効率的にヒポキサンチンの除去ができる。キサンチンオキシダーゼは例えば東洋紡社製のＸＴＯ－２１２（コード名）を０．０１～１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１～１０Ｕ／ｍＬの酵素濃度で添加することでき、上記の変換反応を０～７０℃、好ましくは２５～６５℃の反応温度で行えばよい。
グアニンの除去は、グアニンデアミナーゼによりグアニンをキサンチンへ変換した後、キサンチンを除去することで達成できる。
アデニンの除去は、アデニンデアミナーゼにより、アデニンをヒポキサンチンに変換した後、ヒポキサンチンを除去することで達成できる。
また、ヒポキサンチン、グアニン、アデニンはともに水への溶解度が低いため、高温で反応させておいて冷却して析出させて遠心分離やろ過で除去したのち高温に戻すことを繰り返すことで除去してもよい。例えば、高温は３７～６５℃で、冷却は０～１０℃の範囲で行えばよい。さらにまた、ヒポキサンチン、グアニン、アデニンはともに水への溶解度が低いため、水を蒸発させるなど濃縮して析出させて遠心分離やろ過で除去したのち、再度水を添加して元に戻すことを繰り返すことで除去してもよい。ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒に抽出、分液することで除去してもよい。また、ヒポキサンチン、グアニン、アデニンをレジンなどに吸着して除去してもよい。
第一の工程でヌクレオシドモノリン酸がＩＭＰとＧＭＰの混合物の場合は、上述の方法を適宜組み合わせて用いてもよい。
第二の工程で生成するピロリン酸は、第一の工程を第二の工程に先立って行う場合には、単純に除去すればよいが、第一の工程と第二の工程を同時に行う場合は、第一の工程が十分に進行したのちに除去を行う必要がある。第一の工程が十分に進行したとは、例えば投入原料であるヌクレオシドモノリン酸の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上から塩基が生成したことをいう。
ピロリン酸の除去は、反応液に無機ジホスファターゼ（inorganic diphosphatase）(EC 3.6.1.1)などを加えてリン酸に加水分解する方法や、カチオン（cation）を添加し沈澱化する方法（例えばＭｇイオン、Ｍｎイオン、Ｃａイオンを過剰に加えて析出させる方法）などがある。Ｍｇイオン、Ｍｎイオン、Ｃａイオンを過剰に加えるとは、反応液に５０ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ以上、より好ましくは２００ｍＭ以上、さらに好ましくは５００ｍＭ以上、最も好ましくは１０００ｍＭ以上の過剰な濃度のＭｇ化合物やＭｎ化合物やＣａ化合物を添加することである。また、ピロリン酸をレジンなどに吸着して除去してもよい。

本実施形態によれば、１つの酵素によりヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸及びニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することができる。したがって、本実施形態によれば、少数の比較的安価な原料から、簡素な工程によりニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することができる。

また、別の本実施形態によれば、ホスホリボシル二リン酸及びニコチンアミドにhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素を作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することができる。当該製造方法を前述の第一及び第二の工程を含む上記本実施形態に係る製造方法に利用する場合には、作用させるhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素は１つ（前述の実質的に１つの場合を含む）であるが、その他の場合、例えば第二の工程のみからなる製造方法を実施するような場合には複数であってもよく、例えば、ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ、ＨＰＴ－Ｌ及びこれらのアミノ酸配列と９０％以上一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドから選ばれる２つ以上の酵素を作用させてもよい。なお、実質的に１つの酵素とは前述したとおりであるが、ここでの１つ又は複数の酵素はhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素であり、他の混在する酵素はニコチンアミドモノヌクレオチドを製造する上記反応（第二の工程に相当）を触媒することができる１つ又は複数の酵素のことである。hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素を1つ又は複数作用させる場合においても、他の混在する酵素が上記反応を触媒する酵素全体の１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下混在されていてもよい。さらに、１つ又は複数のhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素以外にニコチンアミドモノヌクレオチドを製造する上記反応（第二の工程に相当）を触媒しない他の酵素が共存されていてもよい。

本発明の実施例を以下に詳細に述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。

〔実施例１：塩基、ヌクレオシドモノリン酸、ニコチンアミド、ニコチンアミドモノヌクレオチドのＨＰＬＣによる検出〕
［サンプル溶液の調製］
下記のサンプルを記載の濃度となるように精製水に溶解し、サンプル溶液を調製した。
０．０５ｍｇ／ｍＬＩＭＰ
０．０５ｍｇ／ｍＬＧＭＰ
０．０５ｍｇ／ｍＬＮＭＮ
０．０２ｍｇ／ｍＬヒポキサンチン
０．０２ｍｇ／ｍＬグアニン
０．０２ｍｇ／ｍＬＮＡＭ
［検出条件］
ＨＰＬＣシステム：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ－２０Ａ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８
ＴＡ１２Ｓ０５－１５４６ＷＴ１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ（ＹＭＣ社、日本国）
流速、モード、カラム温度：１ｍＬ／ｍｉｎ、アイソクラテック、３７℃
移動相：１０ｍＭリン酸２水素１カリウム
サンプルインジェクション：５μＬ
［結果］
結果を図２及び表１に示す。図２は溶出挙動（横軸：溶出時間（分）、縦軸：検出強度（ｍＶ））を示す。各サンプルのリテンションタイムは表１に記載の通りであり、ヒポキサンチン、グアニン以外はピークが分離していることがわかる。

〔実施例２：ＨＧＰＲＴの製造〕
（１）大腸菌由来ＨＧＰＲＴが挿入されたプラスミドの形質転換体の作製
（１．１）大腸菌由来ＨＧＰＲＴの配列の確認
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、センスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）並びにＫＯＤＰＬＵＳＮＥＯ（品番：ＫＯＤ－４０１、東洋紡株式会社）を用いてＰＣＲを行い、ＨＧＰＲＴ遺伝子を増幅してＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯＰＣＲｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔを用いてｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｔｏｐｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）に挿入後、得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシーケンシングにより確認した。確認されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ３１１０株由来のＨＧＰＲＴの塩基配列及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。

（１．２）大腸菌由来ＨＧＰＲＴが挿入されたプラスミドの形質転換体の作製
大腸菌由来のＨＧＰＲＴ遺伝子が挿入されたｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｔｏｐｏを鋳型として、センスプライマー（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（配列番号６）並びにＫＯＤＰＬＵＳＮＥＯ（品番：ＫＯＤ－４０１、東洋紡株式会社）を用いてＰＣＲを行い、５’末端の開始コドンの前にＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ配列、およびＨＧＰＲＴの開始コドンの直後にＨｉｓタグをコードするＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ配列を、３’末端側の終始コドンの直後にＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ配列をそれぞれ有するＨＧＰＲＴ遺伝子を増幅してＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をＩｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて発現ベクターであるｐＥＴ－２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入して、ＨＧＰＲＴ／ｐＥＴ２１ａ（＋）発現用プラスミドを得た。この発現用プラスミドでは、ＨＧＰＲＴ遺伝子の５’末端にＨｉｓタグをコードする塩基配列が付加されている。この発現用プラスミドをＯｎｅｓｈｏｔＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入して、大腸菌由来のＨＧＰＲＴをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体ＨＧＰＲＴ／ｐＥＴ－２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。

（２）大腸菌由来ＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｗ）の調製
（２．１）形質転換体におけるＨＧＰＲＴの誘導発現及び粗酵素液の調製
上記（１．２）で得た形質転換体を１コロニー取り、これを５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地（５ｍＬ）に植菌して、試験管にて約３０℃で約２２時間培養した。培養物（１．６ｍＬ）を、５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有液体培地（１％グリセロール含有６％ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ^TM ＩｎｓｔａｎｔＴＢＭｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ社）、０．１％アデカノールＬＧ－１０９（ＡＤＥＫＡ社製））（１．６Ｌ）に添加して、ジャーファーメンターにて３０℃、通気１．６Ｌ／ｍｉｎ、６５０ｒｐｍの条件で約２４時間培養した。培養物を遠心分離して集菌し、得られた菌体を溶液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３ＭＮａＣｌ）で懸濁し、菌体を超音波で破砕して可溶化した後、遠心分離して粗酵素液を得た。

（２．２）ＨＰＴ－Ｗの精製
ＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）をカラムに充填してＮｉ²⁺を固定化した後、溶液Ａで平衡化した。得られたカラムに上記の粗酵素液を添加して、ＨＰＴ－Ｗを吸着させた。カラムを溶液Ａで洗浄した後、溶液Ａ及び０．４Ｍイミダゾールを含有する溶液Ａを用いた１０ＣＶ（カラムボリューム）のリニアグラジエントにより、ＨＰＴ－Ｗを溶出した。得られたＨＰＴ－Ｗの活性画分を、ペンシル型モジュール（ＵＦ）（旭化成ケミカルズ株式会社）で１／１０量となるまで濃縮し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア社）で脱塩して、ＨＰＴ－Ｗの酵素液を得た。

（３）ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｌの調製
（３．１）Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ）の調製
Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のＨＧＰＲＴ（配列番号７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）である人工合成遺伝子を鋳型として、センスプライマー（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法を用いてｐＥＴ－２１ａ（＋）ベクターに挿入した点以外はＨＰＴ－Ｗと同様に形質転換体の作製、ＨＧＰＲＴの誘導発現、及び精製を行い、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するＨｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ）の溶液を得た。

（３．２）Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｖｅｎｅｆｉｃｕｓ由来のＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｌ）の調製
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｖｅｎｅｆｉｃｕｓ由来のＨＧＰＲＴ（配列番号１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）である人工合成遺伝子を鋳型として、センスプライマー（配列番号１３）及びアンチセンスプライマー（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法を用いてｐＥＴ－２１ａ（＋）ベクターに挿入した点以外はＨＰＴ－Ｗと同様に形質転換体の作製、ＨＧＰＲＴの誘導発現、及び精製を行い、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｖｅｎｅｆｉｃｕｓ由来のＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｌ）の溶液を得た。

（４）ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ及びＨＰＴ－Ｌの活性測定
ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ及びＨＰＴ－Ｌのイノシン酸に対する酵素活性を、ＨＧＰＲＴの作用により生成したヒポキサンチンをキサンチン脱水素酵素により尿酸に変換することで生じるＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光度の変化に基づいて測定した。３７℃で１分間に１μモルのヒポキサンチンを発生させる酵素量を１Ｕとした。測定は７０８０型日立自動分析装置（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いて行った。活性測定試薬組成、酵素希釈液組成、自動分析装置の測定パラメータはそれぞれ以下の通りである。
[活性測定試薬組成]
２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５（Ｍｅｒｃｋ社）
５ｍＭイノシン酸（Ｍｅｒｃｋ社）
５ｍＭ二リン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）
５ｍＭＮＡＤ（オリエンタル酵母株式会社）
５ｍＭＭｇＣｌ_２（富士フイルム和光純薬株式会社）
５Ｕ／ｍＬＸＤＨＩＩ（キサンチン脱水素酵素：Ｔ－１３４、旭化成ファーマ株式会社）
[酵素希釈液組成]
２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５（Ｍｅｒｃｋ社）
[自動分析装置の測定パラメータ]
分析方法Ｒａｔｅ－Ａ
測定波長（副／主）４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
反応時間５分
測光ポイント１０－１３
試料量５μＬ
活性測定試薬量１５０μＬ

〔実施例３：ＨＧＰＲＴによるヌクレオシドモノリン酸とピロリン酸から塩基の生成（第一の工程）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍＭピロリン酸
５ｍＭヌクレオシドモノリン酸（ＩＭＰ又はＧＭＰ）
２０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ又はＨＰＴ－Ｌ）
［測定］
３７℃で１ｈｒ反応後、精製水にて２０倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表２にＩＭＰ、ヒポキサンチン、ＧＭＰ、グアニンのピーク面積を示す。３種類のＨＧＰＲＴのいずれも、ＩＭＰからヒポキサンチンへ、ＧＭＰからグアニンへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例４：ＨＧＰＲＴ又はＮＡＭＰＴによるＮＡＭとＰＲＰＰからＮＭＮの生成（第二の工程）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭ表３に示す各緩衝液
２ｍＭＮＡＭ
２ｍＭＰＲＰＰ
２０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ又はＨＰＴ－Ｌ）
又は０．２μｇ／ｍＬＮＡＭＰＴ（ＭＥＲＣＫ社製のＳＰＲ０５１４）
［測定］
３７℃で２ｈｒ反応後、精製水にて８倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表３にＮＭＮ及びＮＡＭのピーク面積を示す。ＨＰＴ－ＣはｐＨ５、６の緩衝液において、ＨＰＴ－ＷはｐＨ５、６、７、８、９の緩衝液において、ＨＰＴ－ＬはｐＨ５の緩衝液において、ＮＡＭＰＴはｐＨ６、７、８、９の緩衝液において、ＮＡＭからＮＭＮへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例５：ＨＧＰＲＴによる塩基とＰＲＰＰからヌクレオシドモノリン酸の生成（第一の工程の逆反応）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ塩基（ヒポキサンチン又はグアニン）
１ｍＭＰＲＰＰ
５ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ又はＨＰＴ－Ｌ）
［測定］
３７℃で１ｈｒ反応後、精製水にて４倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表４にＩＭＰ、ヒポキサンチン、ＧＭＰ、グアニンのピーク面積を示す。３種類のＨＧＰＲＴのいずれも、ヒポキサンチンからＩＭＰへ、グアニンからＧＭＰへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例６：ＨＧＰＲＴ又はＮＡＭＰＴによるＮＭＮとピロリン酸からＮＡＭの生成（第二の工程の逆反応）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍＭピロリン酸
５ｍＭＮＭＮ
２０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ又はＨＰＴ－Ｌ）
又は０．２μｇ／ｍＬＮＡＭＰＴ（ＭＥＲＣＫ社製のＳＰＲ０５１４）
［測定］
３７℃で１ｈｒ反応後、精製水にて２０倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表５にＮＭＮ及びＮＡＭのピーク面積を示す。３種類のＨＧＰＲＴ及びＮＡＭＰＴのいずれも、ＮＭＮからＮＡＭへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例７：ＨＧＰＲＴによるＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭ表６に示す各緩衝液
２０ｍＭＩＭＰ
２ｍＭピロリン酸
２０ｍＭＮＡＭ
２０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ又はＨＰＴ－Ｗ）
［測定］
３７℃で２ｈｒ反応後、精製水にて４０倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表６にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＩＭＰ、ヒポキサンチンのピーク面積を示す。ＨＰＴ－Ｃ及びＨＰＴ－Ｗ（ｐＨ６におけるＨＰＴ－Ｗは除く）はいずれも、ＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例８：ＨＧＰＲＴによるＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成反応にＸＯＤを添加（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭ表７に示す各緩衝液
５ｍＭＩＭＰ
５ｍＭピロリン酸
５ｍＭＮＡＭ
２０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＰＴ－Ｃ（ＸＯＤ無添加）
又は２．５Ｕ／ｍＬＨＰＴ－Ｃ（５０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）を添加）
［測定］
３７℃で５ｈｒ反応後、精製水にて２０倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表７にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＩＭＰ、ヒポキサンチンのピーク面積を示す。ＸＯＤを添加することにより、ＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮへの反応が促進することがわかる。

〔実施例９：ＨＧＰＲＴによるＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成反応にＸＯＤを添加（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）
１ｍＭＩＭＰ
０．２ｍＭピロリン酸
１ｍＭＮＡＭ
５０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ又はＨＰＴ－Ｌ）
１０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）
［測定］
３７℃又は６５℃で１ｈｒ反応後、精製水にて４倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表８にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＩＭＰ、ヒポキサンチンのピーク面積を示す。ＨＧＰＲＴは３７℃及び６５℃においてＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例１０：ＨＧＰＲＴによるＩＭＰとＧＭＰの混合物、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成反応にＸＯＤを添加（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）
０．５ｍＭＩＭＰ
０．５ｍＭＧＭＰ
０．２ｍＭピロリン酸
１ｍＭＮＡＭ
５０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＧＰＲＴ（ＨＰＴ－Ｃ、ＨＰＴ－Ｗ又はＨＰＴ－Ｌ）
１０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）
［測定］
３７℃又は６５℃で１ｈｒ反応後、精製水にて４倍希釈して分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表９にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＩＭＰ、ＧＭＰのピーク面積を示す。ＨＧＰＲＴは３７℃及び６５℃においてＩＭＰとＧＭＰの混合物、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮへの反応を触媒していることがわかる。

〔実施例１１：ＨＧＰＲＴによるＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成反応にＸＯＤを添加、かつＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭの比率を変化（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）
ＩＭＰ表１０に示す各濃度
ピロリン酸表１０に示す各濃度
ＮＡＭ表１０に示す各濃度
５０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＰＴ－Ｃ
１０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）
［測定］
３７℃で３ｈｒ反応後、１ｍＭＮＡＭの反応液は精製水で４倍希釈して、０．５ｍＭＮＡＭの反応液は２倍希釈して、０．２ｍＭＮＡＭの反応液は希釈せず分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表１０にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＩＭＰのピーク面積を示す。ＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭの様々な比率においてＮＭＮが生成していることがわかる。

〔実施例１２：ＨＧＰＲＴによるＧＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成反応にＸＯＤを添加、かつＧＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭの比率を変化（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）
１ｍＭＧＭＰ
ピロリン酸表１１に示す各濃度
１ｍＭＮＡＭ
５０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＰＴ－Ｃ
１０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）
［測定］
３７℃で６ｈｒ反応後、反応液を精製水で４倍希釈して、分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表１１にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＧＭＰのピーク面積を示す。ＧＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭの様々な比率においてＮＭＮが生成していることがわかる。

〔実施例１３：ＨＧＰＲＴによるＩＭＰ、ピロリン酸、ＮＡＭからＮＭＮの生成反応にＸＯＤを添加、かつＭｇイオンをＭｎイオンに変更（第一の工程及び第二の工程の同時進行）〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）
１ｍＭＩＭＰ
０．２ｍＭピロリン酸
１ｍＭＮＡＭ
５０ｍＭＭｇＳＯ₄又は５０ｍＭＭｎＣｌ₂
２．５Ｕ／ｍＬＨＰＴ－Ｃ
１０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）
［測定］
３７℃で３ｈｒ反応後、反応液を精製水で４倍希釈して、分画分子量１００００の膜でろ過をし、ろ液をＨＰＬＣ分析した。
［検出条件］
実施例１と同様に行った。
［結果］
表１２にＮＭＮ、ＮＡＭ、ＩＭＰのピーク面積を示す。ＭｇイオンをＭｎイオンに替えてもＮＭＮが生成していることがわかる。

〔実施例１４：ＨＧＰＲＴによるヌクレオシドモノリン酸、ピロリン酸、ニコチンアミドから生成したニコチンアミドモノヌクレオチドの分子量、構造の確認〕
［反応液の調製］
下記の試薬成分を記載の濃度となるように精製水に溶解し、これらを混合して反応液を調製した。
１００ｍＭａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）
１ｍＭＩＭＰ
０．２ｍＭピロリン酸
１ｍＭＮＡＭ
５０ｍＭＭｇＳＯ₄
２．５Ｕ／ｍＬＨＰＴ－Ｃ
１０Ｕ／ｍＬＸＯＤ（東洋紡社製のＸＴＯ－２１２）
［測定］
３７℃で３ｈｒ反応後、反応液を精製水で４倍希釈して、分画分子量１００００の膜でろ過をし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析をした。
［分析条件］
ＬＣシステム：ACQUITY UPLC I-Class 日本ウォーターズ株式会社製
ＭＳ：micrOTOF-Q III ブルカー・ダルトニクス株式会社製
測定条件
Source Type：ESI、Scan Range：50～1,000 m/z、Ion Polarity：Positive、
Capillary：4,500V、End Plate：500V、Nebulizer：1.2bar、
Dry Heater：200℃、Dry Gas：6.0 L/min
ソフトウエア：DataAnalysis Ver.4.3 ブルカー・ダルトニクス株式会社製
NIST MS Search Ver.2.2 アメリカ国立標準技術研究所製
カラム：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm I.D. × 50 mm, 1.7 μm
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相：10 mmol/L ギ酸アンモニウム溶液（pH 4.6）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
サンプルインジェクション：５又は２０μＬ
［結果］
この反応で生成したＮＭＮと同じリテンションタイムで溶出している物質（試料）は分子量測定値［Ｍ＋Ｈ］⁺が３３５．０６３７であり、図３に示すＭＳ／ＭＳスペクトルでＮＭＮと一致することが確認できる。

配列番号１：実施例２の（１．１）で使用したセンスプライマー
配列番号２：実施例２の（１．１）で使用したアンチセンスプライマー
配列番号３：ＨＰＴ－Ｗをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：ＨＰＴ－Ｗのアミノ酸配列
配列番号５：実施例２の（１．２）で使用したセンスプライマー
配列番号６：実施例２の（１．２）で使用したアンチセンスプライマー
配列番号７：ＨＰＴ－Ｃのアミノ酸配列
配列番号８：ＨＰＴ－Ｃをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号９：実施例２の（３．１）で使用したセンスプライマー
配列番号１０：実施例２の（３．１）で使用したアンチセンスプライマー
配列番号１１：ＨＰＴ－Ｌのアミノ酸配列
配列番号１２：ＨＰＴ－Ｌをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１３：実施例２の（３．２）で使用したセンスプライマー
配列番号１４：実施例２の（３．２）で使用したアンチセンスプライマー

Claims

少なくとも下記の１）及び２）の工程を含み、下記のヌクレオシドモノリン酸がＡＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ＸＭＰ又はこれらのうちの２以上の混合物であり、下記の１つの酵素がhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素であり、下記の「実質的に」が酵素のタンパク重量又は酵素の活性単位であるユニットによる％表示で前記１つの酵素が９０％以上であり他に混在する酵素が１０％以下である、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
１）ヌクレオシドモノリン酸及びピロリン酸に実質的に１つの酵素を作用させてホスホリボシル二リン酸を生成する第一の工程
２）前記第一の工程の生成物であるホスホリボシル二リン酸、及びニコチンアミドに実質的に前記１つの酵素のみを作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを生成する第二の工程
前記第一の工程及び第二の工程が、同時に進行させる工程である請求項１に記載の製造方法。
前記hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素が、ＨＰＴ－Ｃ（配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる酵素）、ＨＰＴ－Ｗ（配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酵素）、ＨＰＴ－Ｌ（配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる酵素）のいずれか、又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項１に記載の製造方法。
前記ヌクレオシドモノリン酸が、ＩＭＰ、ＧＭＰ、又はＩＭＰとＧＭＰの混合物である請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
前記ヌクレオシドモノリン酸の一部又は全部が、ＩＭＰであり、
前記第一の工程は、当該工程で生成されるヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させる工程を含む請求項1～４のいずれか１項に記載の製造方法。
前記第一の工程及び前記第二の工程は、Ｍｇイオン及び／又はＭｎイオンの存在下で前記酵素を作用させる工程である請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
ホスホリボシル二リン酸及びニコチンアミドにhypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する１つ又は複数の酵素を作用させてニコチンアミドモノヌクレオチドを製造するニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
前記hypoxanthine phosphoribosyltransferase(EC 2.4.2.8)に属する酵素の少なくとも１つが、ＨＰＴ－Ｃ（配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる酵素）、ＨＰＴ－Ｗ（配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる酵素）、ＨＰＴ－Ｌ（配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる酵素）のいずれか、又はこれらのアミノ酸配列と９０％以上一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項７に記載の製造方法。
Ｍｇイオン及び／又はＭｎイオンの存在下で前記酵素を作用させる請求項７又は請求項８に記載の製造方法。