JP6948059B2

JP6948059B2 - ｍｉＲ−１４０−３ｐによる骨芽細胞からのオステオカルシン産生促進

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Publication number: JP6948059B2
Application number: JP2017188037A
Authority: JP
Inventors: 博信勝山; 滋子伏見; 勉濃野
Original assignee: Kawasaki Gakuen Educational Foundation
Current assignee: Kawasaki Gakuen Educational Foundation
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: JP2019059709A

Description

本発明は、ｍｉＲ−１４０−３ｐを有効成分として含むオステオカルシン産生促進剤及び骨形成促進剤、ｍｉＲ−１４０−３ｐを利用したオステオカルシン産生促進剤をスクリーニングする方法、並びに、健康状態を把握するため、骨形成の判定をするため、及び骨粗鬆症の治療効果を判定するためのバイオマーカーに関する。

骨は破壊と形成を繰り返しつつ支持組織としての形態の維持や体内のカルシウム代謝に貢献している。この骨吸収と骨形成を骨リモデリングと呼んでおり、骨組織中の骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞が関与している。この骨リモデリングには骨芽細胞と破骨細胞の直接的作用だけでなく、女性ホルモンなどの液性因子も複雑に関与している。骨吸収が優位になると骨量の減少が起こり、骨粗鬆症の状態となり、脆弱性骨折の原因となって、寝たきりや認知症の発症に関与する。高齢社会の現在では脆弱性骨折を予防することが寝たきりや認知症などの加齢に伴う疾患を予防する上で重要と考えられる。

これまで骨粗鬆症の治療には破骨細胞機能の阻害を目的にしたビスフォスフォネート製剤や骨芽細胞に作用する副甲状腺ホルモン製剤、女性ホルモン製剤などが用いられてきた。

現在、骨粗鬆症治療に主に用いられているビスフォスフォネート製剤は破骨細胞機能を抑制することで骨量を維持する。また、副甲状腺ホルモン製剤は骨芽細胞に作用して骨形成を促進し、選択的エストロゲン受容体モジュレーターは骨質の改善作用も有する。このように骨粗鬆症治療薬はそれぞれ特徴的な作用を有しているが、ビスフォスフォネート製剤は長期投与により大腿骨の非定型骨折を引き起こすことがある。また、副甲状腺ホルモン製剤は骨芽細胞に直接作用するが、骨折の危険性の高い骨粗鬆症患者に２４ヶ月までの期間限定で投与することと定められている。以上のようにこれまでの骨粗鬆症治療薬は副作用を含め、投薬に際して種々の制限が存在する。

このような副作用や投薬に際して種々の制限が課されない、従来とは異なる作用機序に基づく骨粗鬆症治療薬の提供が課題とされている。

近年生体内の機能調節をしている因子としてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が注目されている。ｍｉＲＮＡは約２２塩基からなる１本鎖ノンコーディングＲＮＡであり、分泌顆粒のエクソソーム中に含まれて遠隔細胞において標的遺伝子の３’ＵＴＲ部に結合し、標的遺伝子の転写後にその遺伝子発現を調節すると考えられている。ｍｉＲＮＡは、分化、発生、腫瘍形成、および感染に対する細胞防御において、重要な役割を果たしていることが知られている。また、ｍｉＲＮＡの中には骨芽細胞から産生、分泌されるものがある。
骨芽細胞分化の過程で、ＢＭＰ経路に作用するのはｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１３８であり、Ｗｎｔ経路に作用するのはｍｉＲ−２９とｍｉＲ−３３５である（非特許文献１）。ｍｉＲ−２９は両経路に作用するが、作用機序は独立していると考えられる。
ゲノム中に存在するｍｉＲＮＡは５００種類以上報告されているが、その多くのｍｉＲＮＡに関する機能は依然不明である。

ｍｉＲ−１４０−３ｐ遺伝子に関して、その機能については具体的に報告がされていない。ｍｉＲ−１４０−３ｐを含む医薬組成物について開示する文献がある（特許文献１）。しかしながら、特許文献１は、ｍｉＲ−１４０−３ｐとオステオカルシンの関係について言及するものでなく、ｍｉＲ−１４０−３ｐを用いた実施例を開示するものでもなく、ｍｉＲ−１４０−３ｐの機能は依然として不明である。オステオカルシンを含む医薬組成物についても知られているが（特許文献２）、ｍｉＲＮＡやＴＧＦβとオステオカルシンの関連性については開示も示唆もなく、当該医薬組成物の対象疾患は糖尿病等である。

特表２０１３−５０４５４２号公報特許５４２１１０９号公報

Rahman MS et al., Bone Res. 2015Apr14;3:15005

本発明の目的は、従来とは異なる作用機序に基づく新たな骨粗鬆症治療薬を提供するために、骨粗鬆症を治療可能な新たな作用機序を解明し、その新規作用機序に基づく、オステオカルシン産生促進剤及び骨形成促進剤を提供すること、オステオカルシン産生促進剤、骨粗鬆症の治療及び／又は予防剤をスクリーニングするための新規な方法を提供すること、並びに、健康状態を把握するため、骨形成の判定をするため、及び骨粗鬆症の治療効果を判定するための新規バイオマーカーを提供することである。

本発明者らは、ｍｉＲ−１４０−３ｐがＴＧＦβ３とＷｎｔ経路を直接結びつける働きをしていること、および、骨形成マーカーであるオステオカルシンの発現を促進させるという骨粗鬆症を治療可能な新たな作用機序を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下からなる：
１．ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む、オステオカルシン産生促進剤。２．ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つがＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制するものである、前項１に記載の剤。
３．ＴＧＦβ３の遺伝子発現の抑制がＴＧＦβ３の３’ＵＴＲへの結合によるものである、前項２に記載の剤。
４．ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つは、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制されるものである、前項１に記載の剤。
５．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、骨形成促進剤。
６．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤をインビトロにおいて細胞に供給することにより、オステオカルシン産生を促進する方法。
７．オステオカルシン産生促進がＴＧＦβ３の発現の抑制によるものである、前項６に記載の方法。
８．ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各ｍｉＲ−１４０−３ｐ及び／又はＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質及び／又はＴＧＦβ３の発現量を抑制する物質を選択する工程、
を含む、方法。
９．細胞が骨芽細胞である、前項８に記載のスクリーニング方法。
１０．ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、骨粗鬆症の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各ｍｉＲ−１４０−３ｐ及び／又はＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質及び／又はＴＧＦβ３の発現量を抑制する物質を選択する工程、
を含む、方法。
１１．ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる、健康状態を把握するためのバイオマーカー。
１２．ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる、骨形成を判定するためのバイオマーカー。
１３．ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる、骨粗鬆症の治療効果を判定するためのバイオマーカー。
１４．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、骨粗鬆症予防治療剤。
１５．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、代謝機能改善剤。
１６．代謝機能改善が膵臓β細胞におけるインスリン産生の促進である、前項１５に記載の剤。
１７．代謝機能改善が脂肪細胞におけるインスリン感受性の促進である、前項１５に記載の剤。
１８．少なくとも前項１〜５及び１４〜１７のいずれか一項に記載の剤を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体、アジュバント、塩、希釈剤及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。

本発明によれば、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制を作用機序とする、オステオカルシン産生促進剤及び骨形成促進剤を得ることができる。

マウス由来骨芽細胞におけるＷｎｔ３ａ過剰発現実験の概要を示すものである。（実施例１）Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのリン酸化βカテニン及びβカテニンの発現を調べたものである。（実施例１）Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）陽性細胞の割合及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現変化を示すものである。（実施例１）Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、ＲＵＮＸ２及びオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を確認したものである。（実施例１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析（Ｗｎｔ３ａｖｓｅＧＦＰ）の結果を示すものである。Ｗｎｔ３ａの過剰発現により２倍以上発現が増加したｍｉＲＮＡを１４種、減少したｍｉＲＮＡを２１種同定し、そのうちｍｉＲ−１４０−３ｐに注目したことを示すものである。（実施例１）Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのｍｉＲ−１４０−３ｐの発現を確認したものである。（実施例１）Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのＴＧＦβ３の発現変化を示すものである。（実施例１）ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃのマウス由来骨芽細胞への導入によるＴＧＦβ３の発現変化を示すものである。（実施例２）ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲを用いてルシフェラーゼを行った結果を示すものである。（実施例２）ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃのマウス由来骨芽細胞へのトランスフェクションの概要を示すものである。（実施例３）ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃのマウス由来骨芽細胞への導入によりオステオカルシン（ＯＣＮ）発現が促進されたことを示す。（実施例３）ｒＴＧＦβ３でマウス由来骨芽細胞を処理した概要を示すものである。（実施例３）ＴＧＦβ３投与によりマウス由来骨芽細胞におけるオステオカルシン（ＯＣＮ）発現が抑制されたことを示す。Ａ．マウス由来骨芽細胞におけるＷｎｔ３ａの過剰発現の結果、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性が促進され、（２）ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現が抑制され、（３）ＴＧＦβ３の遺伝子及びタンパクの発現が上昇したことを示す。Ｂ．マウス由来骨芽細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現により、オステオカルシンの発現が促進されること、ＴＧＦβ３の発現の抑制により、オステオカルシンの発現が促進することを示す。オステオカルシンが全身に及ぼす影響について説明するものである。

Ｗｎｔは分子量が約４万のパルミチン酸による脂質修飾を受けた分泌性糖タンパクである。Ｗｎｔの受容体としては７回膜貫通型受容体であるFrizzled、１回膜貫通型受容体であるLRP5/6の２種類が報告されている。従来、Ｗｎｔシグナルは、骨形成に対し促進的に作用すると考えられている(Rawadi, G.& Roman-Roman, S., Expert Opin TherTargets.2005Oct;9(5):1063-77)。

骨形成性骨芽細胞は多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）に由来する。Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは間葉系幹細胞が骨芽細胞系譜への分化に必要とされ、脂肪細胞や軟骨細胞への細胞運命を抑制する。一旦細胞運命が決定すると、骨芽細胞の前駆細胞の増殖と分化に古典的Ｗｎｔシグナルが必須となる。全ての場合ではないが、Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは、骨芽細胞のアポトーシスの下方制御にも関与する。また、最終分化細胞であり最も豊富にある骨細胞を包含する骨芽細胞系譜において、Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは、破骨細胞性骨吸収を阻害する。実際に、Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは、骨芽細胞および骨細胞でのＲＡＮＫＬのおとり受容体である抗破骨細胞因子ＯＰＧの発現に必要である（Roland Baron & Michaela Kneissel, NatMed. 2013 Feb;19(2):179-92）。

形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）は、特定の組合せの標的遺伝子の発現を調節することによって、細胞増殖、細胞死、細胞分化、炎症、免疫反応を含む幅広い生物活性に関連すると考えられている。ＴＧＦβには３つのサブタイプ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３が存在する。これら３つのサブタイプはいずれも、タイプＩとタイプＩＩのＴＧＦβ受容体に結合する。これらの受容体は、セリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、Ｓｍａｄファミリーの転写因子を介して標的遺伝子へのシグナル伝達系を活性化する。一般的には、ＴＧＦβファミリーに属する増殖因子の機能は細胞の状態と細胞のタイプによりさまざまであると考えられている。

オステオカルシン（ＯＣＮ）はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とともに骨形成マーカーとして使用されている。これらのマーカーは、骨芽細胞由来のタンパク質であり、骨芽細胞が増殖したときに濃度が上昇する。特に、オステオカルシンは骨芽細胞から特異的に産生されるタンパク質であり、生体において血清オステオカルシン値の上昇が骨形成の指標とされている。また、これらのマーカーは、通常、骨粗鬆症の骨代謝疾患における骨代謝マーカーとしても用いられている。

本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。

本明細書において、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、三極特許庁共通のガイドラインである「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。

本明細書において「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの修飾ポリヌクレオチドのいずれも包含するものとして用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また上記修飾ポリヌクレオチドには、核酸の天然の糖部分、塩基部分又はホスホジエステル結合を非天然構造に変換したポリヌクレオチドが含まれ、例えばＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）、ＰＮＡ（ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）、ホスホロチオエート結合を有するポリヌクレオチド、２'−Ｏ−アルキルリボース基を有する人工的ポリヌクレオチドなどが含まれる。また、本明細書では、核酸はポリヌクレオチドと互換的に使用される。

本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。

本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片、及びヒトゲノムのいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬＴＨＩＲＤＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、ColdSpring Harbor LaboratoryPress）に記載の条件が挙げられる。）で、配列番号１又は２に示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。また、「遺伝子」は細胞に含まれていてもよく、細胞外に放出されて単独で存在していてもよく、またエキソソームと呼ばれる脂質二重膜に包まれた小胞に内包された状態にあってもよい。

本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３’末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。

本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基のＲＮＡを意図して用いられる。また該「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、ストリンジェントな条件下で、特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。

本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、又は配列番号１〜２で示される塩基配列若しくはその相補的塩基配列において１又は２個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入、好ましくは置換、を含む変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。

本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４０−３ｐ」という用語は、配列番号１に示されるＲＮＡ配列「UACCACAGGGUAGAACCACGG」からなるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲｂａｓｅＩＤ：hsa-miR-140-3p、ｍｉＲｂａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MIMAT0004597）やその他生物種ホモログなどが包含される。本明細書において、「ｍｉＲ−１４０−３ｐ」は、配列番号１に示されるＲＮＡ配列からなるＲＮＡ又はその他生物種ホモログ（例えば、マウスホモログであるｍｉＲｂａｓｅＩＤ：mmu-miR-140-3p、ｍｉＲｂａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MIMAT0000152が挙げられる）であればよく、配列番号１に示されるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡから発現されるＲＮＡや、次に説明する配列番号２に示されるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡから発現された後、プロセシングを受けたものであってもよい。

本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４０」または「ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体」という用語は、配列番号２に示されるＲＮＡ配列「UGUGUCUCUCUCUGUGUCCUGCCAGUGGUUUUACCCUAUGGUAGGUUACGUCAUGCUGUUCUACCACAGGGUAGAACCACGGACAGGAUACCGGGGCACC」からなるＲＮＡ（ｍｉＲｂａｓｅＩＤ：hsa-miR-140、ｍｉＲｂａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MI0000456）やその他生物種ホモログ（例えば、マウスホモログであるｍｉＲｂａｓｅＩＤ：mmu-mir-140、ｍｉＲｂａｓｅＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MI0000165が挙げられる）が包含される。本明細書において、「ｍｉＲ−１４０」は「ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体」をいい、ｍｉＲ−１４０−３ｐのＲＮＡ配列を包含するものである。

ＲＮＡ分子が単一ポリヌクレオチドである場合、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域との間にリンカー領域がある。いくつかの態様において、単一ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域との間の結合の結果としてヘアピンループ構造を形成することが可能である。リンカーは、ヘアピンループを構成する。いくつかの態様において、リンカー領域は、長さが少なくとももしくは多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40残基、またはそこに導き出せる任意の範囲であることが意図される。特定の態様において、リンカーは、長さが3〜30残基（両端の数値を含む）である。

ｍｉＲＮＡ領域および相補領域を有することに加えて、領域の5'または3'末端のいずれかにさらにフランキング配列があり得る。いくつかの態様においては、これらの領域の片側または両側に隣接する、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチドもしくはそれより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲が存在する。

本発明の一態様において、オステオカルシン産生促進剤又は骨形成促進剤は、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体、およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む剤であってもよい。ｍｉＲ−１４０−３ｐは、配列番号１に示されるＲＮＡ配列からなるＲＮＡ又はその他生物種ホモログである。ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体はｍｉＲ−１４０−３ｐのＲＮＡ配列を含むものであり、配列番号２に示されるＲＮＡ配列からなるＲＮＡ又はその他生物種ホモログである。前記ＤＮＡ構築物はｍｉＲ−１４０を発現するＤＮＡ配列を含むものであればよい。前記ＤＮＡ構築物の例としては、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現するベクターが挙げられる。

本発明の一態様において、オステオカルシン産生促進剤はＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制することに基づく。ここで、「遺伝子発現を抑制する」とは、遺伝子発現をｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで抑制することを意味する。たとえば、遺伝子発現の対象となる遺伝子が発現した後にｍＲＮＡが分解されることでｍＲＮＡレベルが抑制されるものであってもよい。本発明の一態様において、ＴＧＦβ３の発現の抑制は、ｍｉＲ−１４０−３ｐがＴＧＦβ３の３’ＵＴＲに結合することによって生じるものであってもよい。

本発明の一態様において、ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲは、ＴＧＦβ３ｍＲＮＡのコーディング領域の３’側に位置するタンパク質に翻訳されない非翻訳領域であれば特に限定されない。ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲは、「ＧＣＵＵＵＧＡＧＡＡＵＣＡＣＵＧＵＧＧＵＡ」からなるＲＮＡ配列及び「ＡＣＡＵＧＧＡＡＵＵＵＣＵＧＵＧＧＵＧ」からなるＲＮＡ配列を含むものが好ましい。

本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐは、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制される。

本発明の一態様において、オステオカルシン産生を促進する方法は、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体、およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む剤を、細胞に供給することにより行われる。好ましくは、当該供給は細胞に導入することにより行われる。細胞に供給することはインビトロで行われてもよい。好ましくは、該細胞は骨芽細胞である。また、オステオカルシン産生の促進はＴＧＦβ３の発現が抑制されることにより生じるものであってもよい。

本発明の一態様において、オステオカルシンの産生を促進する対象となる細胞としては、オステオカルシンを産生する細胞ならどのような細胞でもよく、例えば、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆細胞を挙げることができる。骨芽細胞の前駆細胞としては、骨髄間質細胞やそれ由来の細胞株を例示することができる。

骨芽細胞分化の程度は、例えば細胞中のアルカリホスファターゼ活性を測定することにより、評価することができる。骨芽細胞分化の程度の評価方法については、例えば、J. Biol. Chem. 2006, 281(26), 18015-24等を参照することができる。

本発明の一態様において、オステオカルシンの産生を促進する対象となる細胞として組換え細胞を挙げることができる。当該組換え細胞は、例えば、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現するベクターを培養骨芽細胞等（以下に説明する、マウス骨芽細胞前駆細胞、ラット大腿骨・頸骨骨髄由来間葉系幹細胞、ヒトの骨髄単核球）に導入することにより調製できる。

マウス骨芽細胞前駆細胞は、胎生１８．５日のマウス胎仔あるいは、新生仔の頭蓋冠を切り取り、はさみで細かい断片にした後、コラーゲンゲル(cell matrix type I-A)を加え、ゲルが固まった後、αＭＥＭを加え１０〜１４日間培養する。その後、０．２％コラゲナーゼで処理、遠心して細胞を集め、αＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含）で細胞を再懸濁し、培養プレートに細胞を播種し培養することによって調製することができる。

ラット大腿骨・頸骨骨髄由来間葉系幹細胞は、大腿骨・頸骨を取り出した後、培養液で骨髄をフラッシュアウト、ピペッティング後遠心、上澄みを破棄し、αＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含）で細胞を再懸濁し、ラミニンでコートした培養プレートに細胞を播種し培養し、播種後９日目にｂＦＧＦを最終濃度３ｎｇ／ｍｌ加えて培養することにより調製することができる。

ヒトの骨髄単核球画分は、例えば、ＡＬＬＣＥＬＬＳ社又はＬＯＮＺＡ社から入手することができる。

本発明の一態様において、核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはインジェクションによって細胞に導入される。加えて、細胞は、患者または動物モデルであり得る被験体におけるものであってもよい。この場合において、核酸は、特に治療的適用に対する、当業者にとって周知である投与の様式を使用して、被験体または患者に投与され得る。患者が、ヒトまたは任意のその他の哺乳動物またはｍｉＲＮＡを有する動物であることが特に意図される。

本発明の一態様において、望ましい生理学的結果を達成するのに有効な量で、細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現に影響を与える被験物質を細胞に導入する段階を含む。本発明の一態様において、細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現のレベルにおける上昇または低下は、正常細胞におけるそのｍｉＲ−１４０−３ｐの発現レベルと比較して、疾患状態と相関がある。ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現レベルが、査定される生物学的試料において測定され、次いで正常細胞の発現レベルと比較される場合に、この相関によって以下のスクリーニング方法や診断方法の実施が可能になる。

本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、以下の工程：
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。

本発明の一態様において、ＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、以下の工程：
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞におけるＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c)ＴＧＦβ３の発現量を減少させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。

本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、骨粗鬆症の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、以下の工程：
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量及び／又はＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質及び／又はＴＧＦβ３の発現量を減少させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。

本発明の一態様において、本発明のスクリーニング方法において、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量は当業者に公知の任意の方法で測定することが出来る。例えば、ｍｉＲ−１４０−３ｐに特異的にハイブリダイズするプライマー又はプローブを用いてｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を測定することが出来る。このようなプライマー又はプローブは、当業者であれば、データベースの情報等を参考にして、ｍｉＲ−１４０−３ｐの塩基配列に基づき適宜設計することが可能である。

このようなプライマー又はプローブを用いる測定方法としては、ノーザンブロット法が古典的方法である。ｍｉＲＮＡマイクロアレイ（Liu et al, 2004; Lim et al, 2005）、改良型インベーダー法（Allawi et al, 2004）、ビーズを基にしたフローサイトメータ法（Luetal,2005）などの報告がある。また、定量性のある方法としてリアルタイムPCRがある（Chen et al, 2005）。

ｍｉＲＮＡマイクロアレイは成熟ｍｉＲＮＡの定量することができる方法であり、一般的に用いられている方法を用いればよい。例えば、次のＵＲＬ（https://www.m-chemical.co.jp/genome/products/micro_rna.html）のマイクロＲＮＡチップを利用することができる。

プライマー又はプローブの塩基配列は、鋳型との特異的な結合が可能となるような適当な塩基数、例えば、数十ｂｐ、１０〜３０ｂｐ程度を有することが好ましい。また、塩基配列は、ｍｉＲＮＡマイクロアレイプローブデザインにおいてプライマー内でヘアピン構造をとってもよい。例えば、Ｏｌｉｇｏ（商標） (National Bioscience Inc.)のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを使用することも可能である。

本発明の一態様において、本発明の剤は、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む。

本発明の一態様において、本発明の剤は、オステオカルシン産生促進剤、骨形成促進剤、骨芽細胞分化の促進剤、又は骨粗鬆症の予防治療剤として有用である。骨粗鬆症としては、原発性骨粗鬆症（退行期骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症）、特発性骨粗鬆症）、続発性骨粗鬆症（薬剤性、関節リウマチ、糖尿病、甲状腺機能亢進症、性機能異常、不動性、栄養性、先天性疾患）等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の剤の投与対象は、通常哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）である。

本発明の剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状及び投与経路等に応じて適宜決定されるべきであり、以下に限定されないが、例えば成人一日あたり約０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。製剤の投与は、治療中毎日投与してもよいし、４週間連日投与してもよく、数日間隔、２週間間隔又は１ヶ月間隔等時間間隔をとって投与してもよい。

オステオカルシンは膵臓からのインスリン分泌促進や脂肪組織におけるインスリン感受性を促進することが知られており、ｍｉＲ−１４０−３ｐの投与は全身に好ましい影響を与えうる（図１５）。このことより、ｍｉＲ−１４０−３ｐは単なる骨形成促進剤や骨粗鬆症予防治療剤としてだけでなく、生体内の代謝系全体を改善する代謝機能改善剤又は予防剤として有用であり、健康寿命延伸に寄与すると考えられる。

本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐをマーカーとする診断手段を提供する。例えば、体内のｍｉＲ−１４０−３ｐを測定することにより、健康状態を把握しうるバイオマーカーとして有用と考えられる。体内のｍｉＲ−１４０−３ｐの測定は、測定対象から得られた試料を使用することができる。本明細書において対象から得られた試料は、本発明のｍｉＲ−１４０−３ｐが発現変化する生体組織及びそれら生体組織由来の物質、生体組織と接触する物質を指し、例えば血液試料が挙げられる。試料からトータルＲＮＡを抽出し、その中から目的のｍｉＲ−１４０−３ｐを測定する方法は上述のとおり当業者に公知の任意の方法で測定することが出来る。また、ｍｉＲ−１４０−３ｐをバイオマーカーとして使用する場合、オステオカルシンをバイオマーカーとして測定するよりも早期に、骨形成や骨粗鬆症の治療の効果が判定でき有用と考えられる。

本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現するベクターは、本発明の医薬組成物の有効成分であるｍｉＲ−１４０−３ｐの製造のために使用、又は、ベクター自体を製剤化して医薬組成物として使用することができる。

ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス等を含む。プラスミドの例は、非限定的に、大腸菌由来プラスミド(例えばpRSET、pTZ19R、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草菌由来プラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来プラスミド(例えばYEp13、YEp24、YCp50等)、Tiプラスミド等が挙げられ、ファージの例はλファージ等が挙げられ、さらに、ウイルスベクターの例は、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の動物ウイルスベクター、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。

ベクターは、目的ＤＮＡを組み込むためのポリリンカーもしくはマルチクローニングサイトを含んでもよく、また、ｍｉＲ−１４０−３ｐ遺伝子をコードするＤＮＡを発現するためにいくつかの制御エレメントを含むことができる。制御エレメントには、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合配列、ターミネーター等が含まれる。

選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）、栄養要求性相補遺伝子（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、HIS3遺伝子、LEU2遺伝子、URA3遺伝子等）等である。

宿主細胞の例としては、非限定的に、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属、シュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属、ピキア属等の酵母、CHO、COS、HEK293、NIH3T3、NS0等の動物細胞、Sf9、Sf21等の昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。

本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の薬理学的に許容される担体、添加剤等を含んでいてもよい。

薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられる。具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加剤を用いてもよい。

薬理学的に許容される添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニトール、ソルビトール、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルメロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム-グリコール-スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン酸二アンモニウム、グリシン、オレンジ油等の矯味剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポビドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

本発明の剤は、有効成分であるｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。本発明の剤は、骨疾患用の他の治療のための任意の有効成分を更に含んでいてもよい。そのような治療剤には、以下のものに限定されないが、例えばカルシウム製剤(L-アスパラギン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム等)、活性型ビタミンD3製剤(アルファカルシドール、カルシトリオール等)、女性ホルモン薬(エストリオール、結合型エストロゲン等)、カルシトニン製剤(サケカルシトニン、エルカトニン等)、ビタミンK製剤(メナテトレノン等)、ビスホスホネート製剤(エチドロン酸二ナトリウム、アレンドロン酸ナトリウム水和物、リセドロン酸ナトリウム水和物等)、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(塩酸ラロキシフェン等)、イプリフラボン、又は抗ＲＡＮＫＬ抗体等が含まれる。

投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は、経皮、静脈内等の非経口又は経口で投与される。非経口製剤には、これらに限定されるものではないが、静脈内投与製剤、筋肉内投与製剤、腹腔内投与製剤、皮下投与製剤、局所投与製剤等が含まれる。局所投与は、損傷、骨折、障害を受けた骨部、例えば頭蓋骨、大腿骨、胸骨、椎骨、肋骨等の患部への直接的投与を含み、例えばハイドロキシアパタイト等の人工骨成分に有効成分を含有させた形態の移植用製剤として投与してもよい。非経口投与製剤には、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、リポソーム、ナノ粒子封入製剤等が含まれる。経口製剤には、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、遅延放出製剤、腸溶性製剤等が含まれる。

骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物は、当業者に周知であり、例えば、卵巣摘出非ヒト哺乳動物（Am.J.Pathol.2007, 170(4), 1277-1290等）、関節炎非ヒト哺乳動物（BiochemicalPharmacol.2005,70(12),1744-1755等）、尾部懸垂による重力低下非ヒト哺乳動物（Exp.Cell.Res.2006,312(16), 3075-3083等）等を挙げることができるが、これらに限定されない。

骨粗鬆症の症状の評価は、当業者に周知のパラメーター、例えば、骨密度、骨量、血中アルカリホスファターゼ活性等に基づき行われる。

被検物質を投与した非ヒト哺乳動物における骨粗鬆症の症状が、被検物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における骨粗鬆症の症状よりも有意に軽減されている場合には、当該被検物質を、骨粗鬆症を予防及び／又は治療する活性、骨形成促進活性、及び骨芽細胞分化を促進する活性を有する物質として得ることが出来る。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって限定して解釈されるものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することができる。また、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-ALaboratoryManual,ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 1989;Ausubel, F.M.etal.,CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,NewYork,N.Y,1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。また、キットを使用する場合は、キットの説明書に従って行う。なお、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。

本実施例において、ｍｉＲ−１４０−３ｐがＷｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制されたこと、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現がＴＧＦβ３の発現を抑制してオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を促進したことを示す。
１．Ｗｎｔ３ａの過剰発現
マウス由来骨芽細胞を４ウェルプレート（５ｍｌ）の各ウェルに２．５ｘ１０^４個ずつ及び６ウェルプレート（２ｍｌ）の各ウェルに１ｘ１０^５個ずつ培養した。各ウェル内の培地は、phenol red-free α minimum essentialmedium、10% fetal bovine serum、penicillin、streptomycinを含むものからなる。培養したマウス由来骨芽細胞に、Ｗｎｔ３ａ（NM-009522、開始コドンから1275bp）を発現するベクター(pAd/CMV/V5-DEST)又はｅＧＦＰ(L29345、開始コドンから820bp)を発現するベクター（コントロール）を感染させ（ＭＯＩ：２００）、感染から１、３、７日経過後の細胞からＲＮＡの抽出を行い、感染から３日経過後の細胞を使用してｍｉＲＮＡマイクロアレイ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色、ウェスタンブロットを行った。
ＲＮＡ抽出はmiRNeasy Mini kit又はTRIzolで行い、ウェスタンブロットには抗リン酸化βカテニン抗体(Cell Signaling Technology)、抗ＴＧＦβ３抗体(Abcam)、抗ＲＵＮＸ２抗体(CellSignaling Technology)を使用した。概要を図１に示す。

（１）Ｗｎｔ３ａの過剰発現が骨芽細胞分化に及ぼす影響
図１に示すとおりに、マウス由来骨芽細胞におけるＷｎｔ３ａの過剰発現の解析を行ったところ、骨芽細胞においてリン酸化（Ｓｅｒ６７５）状態のβカテニンの発現が多くみられた（図２）。リン酸化βカテニンは核内に移行し、他の転写因子と複合体を形成して標的遺伝子であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現を促進すると考えられる。

そこで、コントロールであるｅＧＦＰを過剰発現させたマウス由来骨芽細胞と、Ｗｎｔ３ａを過剰発現させたマウス由来骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現について調べた。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色は常法により行った。
その結果、Ｗｎｔ３ａの過剰発現により、マウス由来骨芽細胞においてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性が促進されたことが認められた（図３）。

同様にして、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのＩ型コラーゲン及びオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を調べた。Ｉ型コラーゲンの結果と比較からもわかるように、オステオカルシン（ＯＣＮ）はＷｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が顕著に抑制された（図４）。

（２）ｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析
Ｗｎｔ３ａとｅＧＦＰをそれぞれマウス由来骨芽細胞に導入し、miRNeasy Mini kitを用いてｍｉＲＮＡの精製を行った。マイクロアレイ解析は3D-Gene miRNAMicroarray Platform（東レ）を用いて行った。
Ｗｎｔ３ａの蛍光強度をグローバルノーマライゼーションしたものを縦軸に、コントロールのｅＧＦＰの蛍光強度をグローバルノーマライゼーションしたものを横軸とし、スキャッタープロットが得られた（図５）。
図５に示すとおり、Ｗｎｔ３ａの過剰発現により２倍以上変動したｍｉＲＮＡのうち、発現の上昇したｍｉＲＮＡが１４種、発現の減少したｍｉＲＮＡが２１種得られた。
図５中の矢印で示すスポットはｍｉＲ−１４０−３ｐであり、Ｗｎｔ３ａの過剰発現による発現の変動が大きく、かつ発現量が高いｍｉＲＮＡとして得られた。

（３）ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現解析
図１に示すとおりに、Ｗｎｔ３ａを過剰発現させたマウス由来骨芽細胞の発現解析を行ったところ、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現の抑制が認められた（図６）。

（４）Ｗｎｔ３ａの過剰発現がＴＧＦβ３の発現に及ぼす影響
Ｗｎｔ３ａの発現に関連するｍｉＲＮＡ遺伝子として得られたｍｉＲ−１４０−３ｐの標的遺伝子を公知のデータベース［ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）、ｍｉＲＤＢ(http://www.mirdb.org/)、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ(http://www.microrna.org/microrna/home.do)］を使用して予測した。その結果、ｍｉＲ−１４０−３ｐの標的遺伝子としてＴＧＦβ３が候補に挙がった。そこで、図１に示すとおりに、Ｗｎｔ３ａの過剰発現がＴＧＦβ３の発現に及ぼす影響を調べた。
その結果、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりマウス由来骨芽細胞においてＴＧＦβ３の発現が上昇することがわかった（図７）。

以上の結果をまとめると、マウス由来骨芽細胞におけるＷｎｔ３ａの過剰発現の結果、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性が促進され、（２）ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現が抑制され、（３）ＴＧＦβ３の遺伝子及びタンパクの発現が上昇した（図１４Ａ）。
アルカリホスファターゼは骨芽細胞の初期分化マーカーであり、オステオカルシンは骨芽細胞の後期分化マーカーである。初期分化の段階ではｍｉＲ−１４０−３ｐは弱い発現しか認められないが、分化が進むにつれてｍｉＲ−１４０−３ｐとオステオカルシンの発現促進が認められた。

２．ｍｉＲ−１４０−３ｐ発現のＴＧＦβ３発現への影響
マウス由来骨芽細胞にｍｉＲ−１４０−３ｐと同様の配列を持つｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃ又はコントロールｍｉＲ−ＮＣ（mirVana（商標） miRNA mimic又はmimic negative control、Ambion）を導入したのちに、マウス由来骨芽細胞を３日間培養し、ＴＧＦβ３の遺伝子発現及びタンパク質発現を調べた。
ｍｉＲ−ＮＣを導入した細胞と比較して、ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃを導入した細胞では、ＴＧＦβ３の発現がｍＲＮＡ、タンパク質レベルとも低下した（図８）。

ＰＧＫプロモーターの下流においてルシフェラーゼ遺伝子と野生型ＴＧＦβ３遺伝子の３’ＵＴＲ部分を連結して配置したレポーター発現ベクターコンストラクトを作製し、該レポーター発現ベクターコンストラクトをｍｉＲ−ＮＣ又はｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃと共にマウス由来骨芽細胞に共導入して培養し、ルシフェラーゼアッセイを行った。
ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲ領域とｍｉＲ−１４０−３ｐは相補的な配列を有している（図９）。ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現させた細胞ではルシフェラーゼの発現が抑制された（図９）。よって、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＴＧＦβ３の３’ＵＴＲ領域を介してＴＧＦβ３の転写活性を抑制することが示された。

以上の結果をまとめると、ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃの骨芽細胞への導入により、ＴＧＦβ３の発現が低下し、遺伝子発現の低下はルシフェラーゼ遺伝子の下流に連結されたＴＧＦβ３の３’ＵＴＲを介して行われたことから、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＴＧＦβ３の３’ＵＴＲに作用してＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制することが示された。

３．ｍｉＲ−１４０−３ｐ発現による骨代謝に関連する遺伝子への影響α
マウス由来骨芽細胞を２４ウェルプレート（１ｍｌ）の各ウェルに３ｘ１０^４個ずつ培養した。各ウェル内の培地はphenol red-free α minimum essentialmedium、10% fetal bovine serum、penicillin、streptomycinを含むものからなる。培養したマウス由来骨芽細胞に、ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃ又はnegative control（ＮＣ）のｍｉＲＮＡをトランスフェクションし、１日経過後に培地交換（ＭＣ）を行い、トランスフェクションから２日後の細胞のＲＮＡの抽出を行い、トランスフェクションから３日後の細胞をウェスタンブロットに使用した。概要を図１０に示す。

図１０に示すとおりに、ｍｉＲ−ＮＣ若しくはｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃをマウス由来骨芽細胞に導入し、骨形成マーカーとして知られるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨吸収マーカーとして知られるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、骨芽細胞分化において機能する転写因子Ｒｕｎｘ２、骨形成マーカーとして知られるオステオカルシン（ＯＣＮ）のそれぞれの遺伝子発現及びタンパクの発現を調べた。
その結果、ｍｉＲ−１４０−３ｐｍｉｍｉｃをマウス由来骨芽細胞へ導入することにより、オステオカルシンの発現が促進された（図１１）。

４．ＴＧＦβ３投与によるオステオカルシン（ＯＣＮ）発現への影響
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴＧＦβ３（ｒＴＧＦβ３、Cell Signaling Technologyから購入）を投与する２４時間前に、マウス由来骨芽細胞を２４ウェルプレート（１ｍｌ）の各ウェルに４ｘ１０^４個ずつ培養した。各ウェル内の培地はphenolred-free α minimum essential medium、10% fetal bovineserum、penicillin、streptomycinを含むものからなる。ｒＴＧＦβ３を５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に投与し、ｒＴＧＦβ３の投与から２、５、２４、７２時間後にＲＮＡの抽出を行った。概要を図１２に示す。

ＴＧＦβ３を投与したマウス由来骨芽細胞ではＴＧＦβ３を投与していないマウス由来骨芽細胞（コントロール）と比較してオステオカルシンの発現が抑制された（図１３）。

本実施例に示すとおり、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＷｎｔ３ａ／ＴＧＦβ３シグナル伝達経路に関与して骨芽細胞分化を調節することが明らかになった。また、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＴＧＦβ３シグナル伝達経路を抑制して、オステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を促進させることから（図１４）、オステオカルシン（ＯＣＮ）促進剤として使用することができる。

本発明者らはｍｉＲ−１４０−３ｐがＴＧＦβ３とＷｎｔ３ａ経路を直接結びつける働きをするものであることを見出した。ｍｉＲ−１４０−３ｐを骨芽細胞に遺伝子導入すると骨形成マーカーであるオステオカルシンの発現が促進した。この作用機序はこれまでの骨粗鬆症治療薬とは全く異なっており、骨形成に有効と考えられる。また、ｍｉＲＮＡは生理状態で存在するものであり、ｍｉＲ−１４０−３ｐを有効成分として含む治療薬は、従来の治療薬と比べて副作用が少ないことが期待される。
今後の高齢化社会の進展を考慮すると、骨粗鬆症の発症予防は健康寿命の延伸に重要な役割を果たすと考えられる。従来の骨粗鬆症治療薬の使用は骨粗鬆症と診断されることが必須であり、副作用の発生も懸念される。本発明に係るｍｉＲ−１４０−３ｐは治療だけでなく予防にも活用できると考えられ、病気や介護の予防の促進と、公的保険に依存しない健康産業の創出に貢献し、健康産業を創出できると思われる。

Claims

ｍｉＲ−１４０−３ｐをコードするＤＮＡ構築物を有効成分として含む、骨芽細胞におけるオステオカルシン産生促進剤。
ｍｉＲ−１４０−３ｐをコードするＤＮＡ構築物がＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制するものである、請求項１に記載の剤。
ＴＧＦβ３の遺伝子発現の抑制がＴＧＦβ３の３’ＵＴＲへの結合によるものである、請求項２に記載の剤。
ｍｉＲ−１４０−３ｐをコードするＤＮＡ構築物は、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制されるものである、請求項１に記載の剤。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤をインビトロにおいて骨芽細胞に供給することにより、オステオカルシン産生を促進する方法。
オステオカルシン産生促進がＴＧＦβ３の発現の抑制によるものである、請求項５に記載の方法。
ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質の存在下に骨芽細胞を培養する工程、
(b)該細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質を選択する工程、
を含む、方法。