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JP6937294B2 - ゲノムターゲットエンリッチメント及び選択的ｄｎａシーケンシングのための方法及び組成物 - Google Patents

ゲノムターゲットエンリッチメント及び選択的ｄｎａシーケンシングのための方法及び組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２１９，３３２号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願は、許容される場合、全体として参照により援用される。
配列表の参照
名称「ＰＥＴＯＭ＿１００＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１６年９月１４日、及びサイズ７，０４７バイトのテキストファイルとして２０１６年９月１６日に提出された配列表が、米国特許法施行規則第１．５２条（ｅ）（５）に従い本明細書によって参照により援用される。
本開示の発明は、概して、断片の混合物又はライブラリから二本鎖ＤＮＡ断片を配列特異的にキャプチャするための、具体的には２キロベース長より長いゲノムＤＮＡ分子の未変性の量、構造、メチル化状態、又はこれらの組み合わせを維持するための方法に関する。
マイクロアレイの表面に結合した何千もの異なるＤＮＡプローブを用いることにより、ヒトゲノムのエクソン配列のほとんど（Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）並びに生物学的に有益な何千もの特異的ゲノムインターバル（Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）を単離することが可能であった。最近になって、単一の純粋な父性又は母性ＤＮＡ鎖に対応する配列アセンブリからなるフェージング化ハプロタイプの構築を可能にする長いＤＮＡリードの単離及びシーケンシングへの関心が高まっている。フェージング化ハプロタイプは、ヒトゲノムの長い距離にわたる遺伝的に決定された変異性の遺伝子連鎖構造に関する価値ある遺伝情報を含む一塩基多型（ＳＮＰ）の秩序付けられた組を含み得る。
多数の文献が、配列特異的ＤＮＡキャプチャ及びゲノムシーケンシング方法の最近の進歩についてまとめている（Ｔｅｗｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：Ｒ１１６（２００９）；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：２１４、（２０１５）；Ｏｒｕｍ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１（２）：１０５−１１０（１９９９））。ゲノム配列キャプチャに最も広く用いられている技術は溶液ＤＮＡキャプチャであり、目的のゲノム領域に相補的なＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブのいずれかが使用される（Ｇｎｉｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔｅｗｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかしながら、標的分子が長い一本鎖ＤＮＡからなる場合、それがほぼ全ての真核生物ゲノムに遍在する相互に相補的な反復配列のハイブリダイゼーションによって急速に分子間再会合を起こし、ＤＮＡキャプチャは実現が困難である。この再会合過程を通じて、長いＤＮＡ分子の大多数に存在する複数の反復的ＤＮＡセグメントとの相互作用から多くの無関係なゲノムドメインがまとまった部分的に二本鎖の複合体が急速に形成される。これらの複数の分子間再会合イベントはＤＮＡポリマーネットワークの形成につながり、長い一本鎖ＤＮＡからの特異的ＤＮＡ標的配列の単離は困難となる。
長いゲノムＤＮＡドメインを選択的にエンリッチすることを目的とした代替的方法は、フォスミドベクターを用いる分子クローニングからなる（Ｂｕｒｇｔｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２００３）。しかしながら、フォスミドクローニングは時間がかかり、且つ目的の細胞のＤＮＡに存在するＤＮＡメチル化情報が削除される点が不利である。
長いＤＮＡの配列キャプチャ及び続くＤＮＡシーケンシングがまた、学術グループとの共同研究を進めるＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）及びＮｉｍｂｌｅｇｅｎ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．の子会社）によって報告されている（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。最終産物は、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ ｂｅｌｌアダプターがインサートの両端にライゲートされた大規模インサートキャプチャライブラリであり、これがロングリード長シーケンシングのＰａｃＢｉｏプラットフォームにロードされる。しかしながら、この方法は時間がかかり、ライゲーション媒介性（ＬＭ）ＰＣＲを利用するため、最終的なＤＮＡライブラリにおける母性アレルと父性アレルとの比が不均衡になる可能性がある。
全ゲノムフェージング化ハプロタイプの構築についてこれまでに報告された最も効率的な方法は、統計的手法を用いたロングリードハプロタイピング（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ Ａｉｄｅｄ Ｌｏｎｇ Ｒｅａｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ：ＳＬＲＨ、Ｋｕｌｅｓｈｏｖ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）である。Ｋｕｌｅｓｈｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ＳＬＲＨを用いて、３つのヒトゲノムにおける一塩基変異の９９％を長いハプロタイプブロック０．２〜１Ｍｂｐ長にフェージングすることを実証した。しかしながら、疾病素因アレルが特定のＳＮＰアレルと同時分離する連鎖不平衡（ＬＤ）の基本原理に基づくゲノムワイド関連分析は、全ゲノムジェノタイピング方法論の欠如が障害となっている。
長いＤＮＡシーケンシングリードのフェージングによってＳＮＰを秩序付けることができるのとまさに同じように、理論上、ヒトゲノムの比較的長い距離にわたるエピジェネティックに決定された変異性のエピジェネティックな遺伝子連鎖構造に関する価値あるエピジェネティック情報を含む、可変的シトシンメチル化状態のポジション（即ちメチル化又は非メチル化）の秩序付けられた組を含むフェージング化「ヘピタイプ（ｈｅｐｉｔｙｐｅ）」をアセンブルすることが可能である。しかしながら、ＤＮＡメチル化シーケンシング技術によっては２５０塩基より長いシーケンシングリードが得られず、フェージング化ハプロタイプの構築には不適である。
従って、生物のシトシンメチル化状態を維持しているフェージング化ハプロタイプを構築するための大型二本鎖ＤＮＡ断片を単離及びシーケンシングする好適な方法が依然として欠如している（Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２３（１２）：２１２６−３５（２０１３））。
従って、長い二本鎖ゲノムＤＮＡ断片を配列特異的にキャプチャ及びシーケンシングする改良された方法が必要である。
Ｔｅｗｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：Ｒ１１６（２００９） Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：２１４、（２０１５） Ｏｒｕｍ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１（２）：１０５−１１０（１９９９） Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ Ａｉｄｅｄ Ｌｏｎｇ Ｒｅａｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ：ＳＬＲＨ、Ｋｕｌｅｓｈｏｖ，ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２３（１２）：２１２６−３５（２０１３）
従って、本発明の目的は、真核細胞のゲノムから選択される１つ以上の長いＤＮＡ配列ドメイン（２，０００塩基より大きいサイズ）をエンリッチするための高感度の及び／又は効率的な方法を提供することである。
また、本発明の目的は、真核細胞のゲノムから選択される高い多様度の長いＤＮＡ配列ドメイン（それぞれ２，０００〜４０，０００塩基のサイズ）をエンリッチするための高感度で効率的な方法を提供することである。
また、本発明の目的は、長いＤＮＡ配列の突然変異、挿入、欠失、メチル化状態、又はこれらの組み合わせを維持しているＤＮＡ断片を生成するためのゲノムターゲットエンリッチメント方法を提供することである。
また、本発明の目的は、長いＤＮＡ断片を生じるゲノムターゲットエンリッチメントによって得られたＤＮＡのシーケンシング方法を提供することであり、それによってＤＮＡシーケンシングデータは、短いＤＮＡ断片を生じる従来の方法によってＤＮＡをエンリッチした場合には同定が極めて困難な短い挿入及び短い欠失の同定を可能にする情報を含む。
また、本発明の目的は、長いＤＮＡ断片を生じるゲノムターゲットエンリッチメントによって得られたＤＮＡのシーケンシング方法を提供することであり、それによってＤＮＡシーケンシングデータは、異なる試料間における長いＤＮＡのメチル化パターンの変異の長いパターンの同定を可能にする塩基修飾情報を含み、前記ＤＮＡメチル化パターンの変異は、短いＤＮＡ断片を生じる従来の方法によってＤＮＡをエンリッチした場合には同定が不可能である。
また、本発明の目的は、大型標的配列ドメインにわたるＤＮＡメチル化リードのフェージングを可能にする大型ゲノムＤＮＡ断片の単離、アクセス、及びプロセシング方法を提供することである。
また、本発明の目的は、大型父性又は母性配列ドメインにわたるＤＮＡメチル化リードのフェージングを可能にする大型ゲノムＤＮＡ断片の単離、アクセス、及び処理方法を提供することである。
また、本発明の目的は、６０，０００〜１，０００，０００塩基の範囲のＤＮＡメチル化リードのフェージングを可能にする大型ゲノムＤＮＡ断片の単離、アクセス、及び処理方法を提供することである。
また、本発明の目的は、配列特異的エンリッチメントの改良に向けた高特異性のプローブを同定するためのプローブの高速スクリーニング方法を提供することである。
また、本発明の目的は、低い特異性で機能するプローブを高速でスクリーニングし、それらを配列特異的エンリッチメントの改良に向けてより高特異性のプローブに置き換える方法を提供することである。
核酸断片の混合物から１つ以上の核酸断片を選択的にエンリッチするための方法及び組成物が開示される。本開示の方法及び組成物の一部の形態は、大型ゲノムＤＮＡ断片の選択的エンリッチメントに特に有用である。それにより、他の方法では実施が困難なメチル化パターンなどのＤＮＡ修飾の連鎖解析が可能になる。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。従って、本方法のこの形態によれば、第１の核酸試料と比較したとき、エンリッチ核酸試料ではＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされていることになり得る。本方法のこの形態において、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中のＰＮＡプローブは、同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なる核酸断片を標的化するように設計され、ＰＮＡプローブはそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップはまた、未結合ＰＮＡプローブもキャプチャする。一部の形態において、本方法はまた、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップも含み得る。一部の形態において、本方法はまた、ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップと同時に、キャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブをキャプチャするステップも含み得る。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップ；（ｄ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｅ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。従って、本方法のこの形態によれば、第１の核酸試料と比較したとき、エンリッチ核酸試料ではＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされていることになり得る。本方法のこの形態において、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中のＰＮＡプローブは、同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なる核酸断片を標的化するように設計され、ＰＮＡプローブはそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含む。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片を、及びキャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブを両方ともにキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。これらの形態において、未結合ＰＮＡプローブは、キャプチャされた未結合ＰＮＡプローブではなく、キャプチャされた核酸断片の溶出によってＰＮＡプローブ結合核酸断片と分離される。キャプチャされた核酸断片の溶出時、未結合ＰＮＡプローブはキャプチャされたまま残る。
本方法の一部の形態において、ＰＮＡプローブはそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含み、ここで、ＰＮＡプローブの少なくとも１つは、アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む。
本方法の一部の形態において、２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブは１８又は１９個のペプチド核酸残基を有し、２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の３個以上５個以下が荷電部分によって誘導体化されており、荷電部分は、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、荷電部分によって誘導体化されていない２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の２個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブのキャプチャタグはビオチンである。
本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。
本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの少なくとも１つは、（ａ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｂ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｃ）これらの組み合わせを含む。一部の形態において、反応混合物は一本鎖結合タンパク質を更に含むことができる。一部の形態において、第１の核酸試料は配列の複雑度が高い。一部の形態において、第１の核酸試料は二本鎖ＤＮＡを含む。一部の形態において、第１の核酸試料はゲノムＤＮＡを含む。
一部の形態において、エンリッチ核酸断片は少なくとも２，０００塩基対の平均長さを有する。一部の形態において、エンリッチ核酸断片は少なくとも１０，０００塩基対の平均長さを有する。一部の形態において、エンリッチ核酸断片は少なくとも１５，０００塩基対の平均長さを有する。一部の形態において、エンリッチ核酸断片の各々は少なくとも２，０００塩基対の長さを有する。一部の形態において、エンリッチ核酸断片の各々は少なくとも１０，０００塩基対の長さを有する。一部の形態において、エンリッチ核酸断片の各々は少なくとも１５，０００塩基対の長さを有する。一部の形態において、ＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片は、エンリッチ核酸試料の少なくとも９０％を占めるまでエンリッチされる。
また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブも開示される。一部の形態において、ＰＮＡプローブは核酸断片内の配列を標的化するように設計される。一部の形態において、ＰＮＡプローブは１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブは核酸断片内の配列を標的化するように設計される。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、（ａ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｂ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｃ）これらの組み合わせを含む。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２〜６個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態において、荷電部分の１つ以上がリジンである。一部の形態において、荷電部分の全てがリジンである。一部の形態において、荷電部分の１つ以上がＬ−リジンである。一部の形態において、荷電部分の全てがＬ−リジンである。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１〜１９個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである。
一部の形態において、キャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。一部の形態において、ＰＮＡプローブは末端ＰＮＡ残基の少なくとも１つで１個以上の荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態において、末端ＰＮＡプローブを誘導体化する荷電部分は１個以上のアミノ酸である。一部の形態において、末端ＰＮＡプローブを誘導体化する荷電部分は２個以上のリジン残基である。
また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブのセットも開示される。一部の形態において、セットには２つ以上のＰＮＡプローブが含まれ、そのセット中のＰＮＡプローブの各々は、同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計される。一部の形態において、複数のこれらのセットが使用される。一部の形態において、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なる核酸断片を標的化するように設計される。一部の形態において、セット中のＰＮＡプローブの１つ以上が１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、セット中のＰＮＡプローブのそれぞれが１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、（ａ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｂ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｃ）これらの組み合わせを含む。一部の形態において、セット中のＰＮＡプローブの各々が、（ａ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｂ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｃ）これらの組み合わせを含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、（ａ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｂ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｃ）これらの組み合わせを含む。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２〜６個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２〜６個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態では、独立に、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。
プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは１０個以上２６個以下のペプチド核酸残基を有する。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは核酸断片内の配列を標的化するように設計される。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは１つ以上のキャプチャタグを含む。
プローブの一部の形態において、プローブは１６個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む。プローブの一部の形態において、プローブは１８又は１９個のペプチド核酸残基を含む。プローブの一部の形態において、ペプチド核酸残基の３個以上５個以下が荷電部分によって誘導体化されており、荷電部分は、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、荷電部分によって誘導体化されていないペプチド核酸残基の２個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、及びキャプチャタグはビオチンである。プローブの一部の形態において、ペプチド核酸残基の４個がガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡであり、ジエチレングリコールによって誘導体化されているペプチド核酸残基の４個であり、キャプチャタグはビオチンである。プローブの一部の形態において、ペプチド核酸残基の４個はガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡであり、ジエチレングリコールによって誘導体化されているペプチド核酸残基の４個であり、キャプチャタグはビオチンである。
プローブの一部の形態では、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態では、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。プローブの一部の形態では、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。プローブの一部の形態では、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。プローブの一部の形態では、あらゆるペプチド核酸残基が部分によって誘導体化されている。
一部の形態において、荷電部分の１つ以上がリジンである。一部の形態において、荷電部分の全てがリジンである。一部の形態において、荷電部分の１つ以上がＬ−リジンである。一部の形態において、荷電部分の全てがＬ−リジンである。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１〜１９個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１〜１９個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態では、独立に、ＰＮＡプローブの１つ以上において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むことができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１〜２２個のペプチド核酸残基を含むことができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１〜２２個のペプチド核酸残基を含むことができる。
一部の形態において、擬似相補的核酸塩基は、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される。
一部の形態において、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むＰＮＡプローブの１つ以上は、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。一部の形態において、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットを含む。一部の形態において、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。
一部の形態において、キャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が末端ＰＮＡ残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が末端ＰＮＡ残基の少なくとも１つで２個以上のリジン残基によって誘導体化されている。
一部の形態において、本方法はまた、エンリッチ核酸試料中の核酸断片の１つ以上を増幅するステップも含み得る。一部の形態において、エンリッチ核酸試料中の実質的に全ての核酸断片が増幅される。一部の形態において、核酸断片は全ゲノム増幅によって増幅される。
長い核酸配列（即ち２，０００〜４０，０００塩基対長、又は４０，０００塩基対長を上回る）の配列特異的キャプチャ方法が、修飾骨格を有する複数のＰＮＡ分子を使用して開発された。かかる修飾は、中性化学基と正の化学基との混合物を含み得る。特に、ＰＮＡ分子は、中性化学基と正の化学基との混合物を含むガンマ修飾キラル骨格を有する。ＰＮＡ分子の一部の形態は、中性化学基と正の化学基との混合物を含むアルファ修飾キラル骨格を有する。
ＤＮＡメチル化シーケンシングを含め、配列キャプチャによってエンリッチされる標的の全てのキャプチャ、単離、及び続くシーケンシング解析のために目的の各核酸を標的化するには、共有結合的に結合したハプテンを有する２つ以上のＰＮＡプローブが用いられる。結合特異性を増進させるため、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を用いることができる。これらの原理を利用して、極めて長い（２〜４０ｋｂ）二本鎖ＤＮＡ分子をキャプチャすることによる複数のゲノムＤＮＡ領域のエンリッチメントに有用な幾つもの方法が開発されている。
核酸試料から核酸を選択的にエンリッチする方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸内の標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。一部の形態において、核酸試料は、核ＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡなど、複数の複雑核酸配列を含む。一部の形態において、キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸をキャプチャするステップはまた、未結合ＰＮＡプローブもキャプチャする。かかる形態について、キャプチャ媒体は、好ましくは、結合及び未結合の両方の、全てのＰＮＡプローブをキャプチャするのに十分なキャプチャ成分（キャプチャドックなど）を含む。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸を形成するステップ；（ｃ）反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップ；（ｄ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｅ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。従って、本方法のこの形態によれば、第１の核酸試料と比較したとき、エンリッチ核酸試料ではＰＮＡプローブの標的とされる核酸がエンリッチされていることになり得る。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸内の標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸を、及びキャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブを両方ともにキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。これらの形態において、未結合ＰＮＡプローブは、キャプチャされた未結合ＰＮＡプローブではなく、キャプチャされた核酸の溶出によってＰＮＡプローブ結合核酸と分離される。未結合ＰＮＡプローブは、キャプチャされた核酸の溶出時にキャプチャされたまま残る。
従って、本方法は、ゲノムＤＮＡ試料から大型ゲノムＤＮＡ断片を選択的にエンリッチするステップを含む。一部の形態において、ゲノムＤＮＡ断片は２，０００〜４０，０００塩基対長の大型二本鎖ゲノムＤＮＡ断片である。
例示的方法において、インベージョンキャプチャ反応物は最長１６時間インキュベートし、次にこの反応混合物を精製マトリックスに２回連続して通過させると、未結合のビオチン化プローブの約９９．７５％、又は９９．７５％超が取り除かれる。溶出した材料を回収し、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズなど、マトリックス上に固定化したアフィニティータグ特異的キャプチャドックと混合することができる。好ましくは、反応物中の未結合（遊離）ビオチン化ＰＮＡプローブの最終濃度は０．５μＭ未満である。最大１．５μＭのビオチンとの結合能を有する常磁性ビーズを使用することができる。典型的には、第１のＤＮＡ試料と比較したとき、エンリッチＤＮＡ試料ではＰＮＡプローブの標的とされるＤＮＡ断片がエンリッチされている。
一部の形態において、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中のＰＮＡプローブは、同じＤＮＡ断片内の異なる配列を標的化するように設計される。２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なるＤＮＡ断片を標的化するように設計され得る。一部の形態においてＰＮＡプローブは、それぞれ荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む。荷電部分は、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素にあってもよい。一部の形態においてＰＮＡプローブは、それぞれ１つ以上のキャプチャタグを含む。
典型的には、第１のＤＮＡ試料は配列の複雑度が高く、例えばゲノムＤＮＡ試料である。エンリッチされたＤＮＡ断片は少なくとも２，０００塩基対の平均長さ、少なくとも１０，０００塩基対の平均長さ、少なくとも１５，０００塩基対の平均長さ、又は４０，０００塩基対を超える平均長さを有し得る。エンリッチされたＤＮＡ配列の各々は、少なくとも２，０００塩基対の長さ、少なくとも１０，０００塩基対の長さ、少なくとも１５，０００塩基対の長さ又は４０，０００塩基対を超える長さを有し得る。一部の形態において、第１の核酸試料及びエンリッチ核酸試料は、完全には変性していない又は実質的に変性していない核酸など、インタクトな二本鎖核酸断片を含む。本方法は標的ＤＮＡの変性は必要ない。従って、一部の形態において、第１の核酸試料が、完全に変性したことがないか又は実質的に変性したことがないインタクトな二本鎖核酸である標的核酸を含むとき、エンリッチ試料も、完全に変性したことがないか又は実質的に変性したことがないインタクトな二本鎖核酸を含むことになる。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２〜６個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２〜６個のペプチド核酸残基を含む。例えば、ＰＮＡプローブの１つ以上が、ガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されているか；アルファ炭素で荷電部分によって誘導体化されているか；又はベータ炭素で荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含むことができる。単一のプローブ分子の範囲内で、骨格修飾の位置は好ましくは常に同じである。例えば、ＰＮＡプローブの１つ以上が、ガンマ炭素でのみ荷電部分によって誘導体化されているか；アルファ炭素でのみ荷電部分によって誘導体化されているか；又はベータ炭素でのみ荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含むことができる。ＰＮＡプローブ分子の範囲内における好ましい化学組成としては単一の種類のキラル修飾、例えば、全ての修飾がガンマ位にあるプローブ、又は全ての修飾がアルファ位にあるプローブが挙げられる。
一部の形態において、荷電部分の１つ以上はリジンであり、例えば全ての荷電部分がリジンであってもよい。一部の形態において、荷電部分の１つ以上はＬ−リジンであり、例えば全ての荷電部分がＬ−リジンであってもよい。Ｌ−リジンを使用する場合、ペプチド核酸残基はガンマ炭素において誘導体化することが好ましい。Ｄ−リジンを使用する場合、ペプチド核酸残基はアルファ炭素において誘導体化することが好ましい。ＰＮＡ骨格に導入される右旋性（Ｄ）及び左旋性（Ｌ）アミノ酸間の選択は、各エナンチオマーがＰＮＡ骨格に右回りのコンホメーションを誘導する能力から情報又は指針を得ることができる。これはペプチド核酸残基の誘導体化の位置の影響を受け、ガンマ炭素における誘導体化は、Ｌアミノ酸と共に使用したときにＰＮＡ骨格の右回りのコンホメーションに有利に作用し、及びアルファ炭素における誘導は、Ｄアミノ酸と共に使用したときにＰＮＡ骨格の右回りのコンホメーションに有利に作用する。同様の理由で及び同じ観点で、ＰＮＡ骨格のガンマ炭素又はアルファ炭素での誘導体化間の選択は、各エナンチオマーがＰＮＡ骨格に右回りのコンホメーションを誘導する能力から情報又は指針を得ることができる。これはアミノ酸のキラル型の影響を受け、右旋性（Ｄ）アミノ酸は、アルファ炭素において誘導体化したときにＰＮＡ骨格の右回りのコンホメーションに有利に作用し、及び左旋性（Ｌ）アミノ酸は、ガンマ炭素において誘導体化したときにＰＮＡ骨格の右回りのコンホメーションに有利に作用する。
一部の形態において、本方法によって利用されるＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む。例えば、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１〜１９個のペプチド核酸残基を含むことができる。従って、詳細な形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１〜１９個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態では、本方法によって利用されるＰＮＡプローブの１つ以上において、ペプチド核酸残基の１個以上はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されており、例えばＰＮＡプローブの全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。
一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上はジエチレングリコールであり、例えば全ての短鎖オリゴエチレン部分がジエチレングリコールであってもよい。ＰＮＡモノマー修飾をガンマ位に置こうとする場合、ジエチレングリコールなどの短鎖オリゴエチレン部分は好ましくはＬ−セリンから出発して合成される。ＰＮＡモノマー修飾をアルファ位に置こうとする場合、ジエチレングリコールなどの短鎖オリゴエチレン部分は好ましくはＤ−セリンから出発して合成される。ＰＮＡモノマーの合成に使用するセリンエナンチオマーの選択は、ＰＮＡプローブの骨格に右回りのコンホメーションを誘導するという意図から情報又は指針を得ることができる。
単一のＰＮＡプローブの骨格の範囲内において、Ｌ−セリンから出発するモノマー合成に基づくジエチレングリコールなどの短鎖オリゴエチレン部分によるガンマ炭素修飾を、ガンマ炭素上の荷電Ｌ−リジンをベースとする追加の骨格修飾と組み合わせることができる。逆に、単一のＰＮＡプローブの骨格の範囲内において、Ｄ−セリンから出発するモノマー合成に基づくジエチレングリコールなどの短鎖オリゴエチレン部分によるアルファ炭素修飾を、アルファ炭素上の荷電Ｄ−リジンをベースとする追加の骨格修飾と組み合わせることができる。適合性のあるエナンチオマーの選択は、ＰＮＡプローブの骨格に右回りのコンホメーションを誘導するという意図から情報又は指針を得ることができる。更なる形態においてキャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。
本開示の方法及び組成物の更なる利点は、一部が以下の説明に示され、及び一部がこの説明から理解されることになるか、又は本開示の方法及び組成物の実施によって知ることができる。本開示の方法及び組成物の利点は、特に添付の特許請求の範囲に指摘される要素及び組み合わせを用いて実現及び達成されるであろう。前述の概要及び以下の詳細な説明は両方ともに例示的且つ説明的なものに過ぎず、特許請求されるとおりの本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸断片の混合物から１つ以上の核酸断片を選択的にエンリッチする方法であって、
（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップであって、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中の前記ＰＮＡプローブが同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中の前記ＰＮＡプローブが異なる核酸断片を標的化するように設計され、前記ＰＮＡプローブがそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含み、前記ＰＮＡプローブの少なくとも１つが、アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、前記アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む、ステップ；
（ｂ）前記ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で前記反応混合物をインキュベートし、それによりインベージョンＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；
（ｃ）前記キャプチャタグによって前記ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つ前記キャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から前記反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；
（ｄ）前記ＰＮＡプローブから前記キャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップであって、前記第１の核酸試料と比較したとき、前記エンリッチ核酸試料では前記ＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされている、ステップ
を含む方法。
（項目２）
前記２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおける前記ＰＮＡプローブが１８又は１９個のペプチド核酸残基を有し、前記２つ以上のＰＮＡプローブのセットの前記少なくとも１つにおける前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の３個以上５個以下が前記荷電部分によって誘導体化されており、前記荷電部分が、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記荷電部分によって誘導体化されていない前記２つ以上のＰＮＡプローブのセットの前記少なくとも１つにおける前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の２個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、前記２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおける前記ＰＮＡプローブの前記キャプチャタグがビオチンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある、項目１又は２に記載の方法。
（項目６）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
１０個以上２６個以下のペプチド核酸残基を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブであって、
核酸断片内の配列を標的化するように設計され、
アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、前記アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含み、
１つ以上のキャプチャタグを含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブ。
（項目１２）
１６個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む、項目１１に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１３）
１８又は１９個のペプチド核酸残基を含む、項目１１又は１２に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１４）
前記ペプチド核酸残基の３個以上５個以下が前記荷電部分によって誘導体化されており、前記荷電部分が、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記荷電部分によって誘導体化されていない前記ペプチド核酸残基の２個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、前記キャプチャタグがビオチンである、項目１１〜１３のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１５）
前記ペプチド核酸残基の４個がガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡであり、ジエチレングリコールによって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の４個であり、前記キャプチャタグがビオチンである、項目１１〜１３のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１６）
前記ペプチド核酸残基の４個がガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡであり、ジエチレングリコールによって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の４個であり、前記キャプチャタグがビオチンである、項目１１〜１３のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１７）
独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間の荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基である、項目１１〜１６のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１８）
荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．８個以上４．０個以下のペプチド核酸残基がある、項目１１〜１７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目１９）
独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある、項目１１〜１８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２０）
部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．４個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある、項目１１〜１９のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２１）
あらゆるペプチド核酸残基が部分によって誘導体化されている、項目１１〜２０のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２２）
（ｉ）前記アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、（ｉｉ）前記アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む、項目１１〜２１のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２３）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１５％以上２８％以下が荷電部分によって誘導体化されている、項目１１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２４）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の２個以上７個以下が荷電部分によって誘導体化されている、項目１１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２５）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の３、４、５、又は６個が荷電部分によって誘導体化されている、項目２４に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２６）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の４又は５個が荷電部分によって誘導体化されている、項目２５に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２７）
荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない少なくとも２個のペプチド核酸残基がある、項目１１〜２６のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２８）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が、独立に、前記アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで前記荷電部分によって誘導体化されている、項目１１〜２７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目２９）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、項目１１〜２８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３０）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、項目１１〜２９のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３１）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である、項目１１〜３０のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３２）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、項目１１〜３１のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３３）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である、項目１１〜３１のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３４）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、項目１１〜３０のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３５）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１つ以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である、項目１１〜３３のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３６）
前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である、項目１１〜３１のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３７）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の４％以上８５％以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３６のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３８）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の４％以上５０％以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目３９）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の４％以上３５％以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４０）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１個以上１９個以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４１）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１個以上１５個以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４２）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１個以上１０個以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４３）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１、２、３、又は４個が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４４）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１又は２個が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜３７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４５）
中性部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で誘導体化されている、項目１１〜４４のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４６）
中性部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で誘導体化されている、項目１１〜４５のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４７）
中性部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で誘導体化されている、項目１１〜４６のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４８）
中性部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記ガンマ炭素で誘導体化されている、項目１１〜４７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目４９）
前記中性部分の１個以上が短鎖オリゴエチレン部分である、項目１１〜４８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５０）
前記中性部分の全てが短鎖オリゴエチレン部分である、項目１１〜４９のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５１）
前記短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである、項目４９又は５０に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５２）
前記短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである、項目４９〜５１のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５３）
前記キャプチャタグがビオチン又はストレプトアビジンである、項目１１〜５２のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５４）
末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている、項目１１〜５３のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５５）
前記末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで２個以上のリジン残基によって誘導体化されている、項目５４に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５６）
前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１個以上１５個以下が中性部分によって誘導体化されている、項目１１〜５５のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５７）
１個以上のペプチド核酸残基が前記ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する、項目１１〜５６のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５８）
前記擬似相補的核酸塩基が、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される、項目５７に記載のＰＮＡプローブ。
（項目５９）
６番染色体のＭＨＣ領域に位置するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６０）
１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化し、前記疾患又は病態が、自己免疫疾患、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、並びに癌からなる群から選択される、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６１）
自己免疫疾患の疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６２）
糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６３）
異なる白血球サブセットの分化に関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６４）
ヒトミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６５）
イヌミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６６）
細菌、古細菌、真菌、原虫、又はこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の寄生虫のゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目１１〜５８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６７）
前記寄生虫が、ヒト口腔、ヒト気道、ヒト泌尿生殖器管、ヒト血液、又はヒト糞便に存在する細菌の１つ以上の種である、項目６６に記載のＰＮＡプローブ。
（項目６８）
２つ以上のＰＮＡプローブのセットであって、前記ＰＮＡプローブの少なくとも１つが項目１１〜６７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブであり、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中の前記ＰＮＡプローブが同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中の前記ＰＮＡプローブが異なる核酸断片を標的化するように設計される、セット。
（項目６９）
前記ＰＮＡプローブの全てが、独立に、項目１１〜４９のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブである、項目６８に記載のセット。
（項目７０）
前記ＰＮＡプローブの少なくとも１つが、（ｉ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｉｉ）前記アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせを含む、項目６８又は６９に記載のセット。
（項目７１）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７０のいずれか一項に記載のセット。
（項目７２）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７１のいずれか一項に記載のセット。
（項目７３）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７２のいずれか一項に記載のセット。
（項目７４）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７３のいずれか一項に記載のセット。
（項目７５）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７４のいずれか一項に記載のセット。
（項目７６）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７５のいずれか一項に記載のセット。
（項目７７）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７６のいずれか一項に記載のセット。
（項目７８）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある、項目６８〜７７のいずれか一項に記載のセット。
（項目７９）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で前記荷電部分によって独立に誘導体化されている２個以上６個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜７８のいずれか一項に記載のセット。
（項目８０）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で前記荷電部分によって独立に誘導体化されている３個以上５個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜７８のいずれか一項に記載のセット。
（項目８１）
前記ＰＮＡプローブの全てが、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で前記荷電部分によって独立に誘導体化されている２個以上６個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜７９のいずれか一項に記載のセット。
（項目８２）
前記ＰＮＡプローブの全てが、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で前記荷電部分によって独立に誘導体化されている３個以上５個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜８１のいずれか一項に記載のセット。
（項目８３）
独立に、前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、項目６８〜８２のいずれか一項に記載のセット。
（項目８４）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、項目６８〜８３のいずれか一項に記載のセット。
（項目８５）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、項目６８〜８４のいずれか一項に記載のセット。
（項目８６）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、項目６８〜８５のいずれか一項に記載のセット。
（項目８７）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６のいずれか一項に記載のセット。
（項目８８）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８７のいずれか一項に記載のセット。
（項目８９）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８７のいずれか一項に記載のセット。
（項目９０）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６のいずれか一項に記載のセット。
（項目９１）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８９のいずれか一項に記載のセット。
（項目９２）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８７、８９、又は９１のいずれか一項に記載のセット。
（項目９３）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６のいずれか一項に記載のセット。
（項目９４）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６又は９３のいずれか一項に記載のセット。
（項目９５）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６又は９３のいずれか一項に記載のセット。
（項目９６）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６のいずれか一項に記載のセット。
（項目９７）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６又は９３〜９５のいずれか一項に記載のセット。
（項目９８）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である、項目６８〜８６、９３、９５、又は９７のいずれか一項に記載のセット。
（項目９９）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜９８のいずれか一項に記載のセット。
（項目１００）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で前記短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１個以上１９個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜９９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０１）
前記ＰＮＡプローブの全てが、独立に、前記アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で前記短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１個以上１９個以下のペプチド核酸残基を含む、項目９９又は１００に記載のセット。
（項目１０２）
独立に、前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている、項目９９〜１０１のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０３）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記ガンマ炭素で前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている、項目９９〜１０２のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０４）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている、項目９９〜１０３のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０５）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てが前記ガンマ炭素で前記短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている、項目９９〜１０４のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０６）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである、項目９９〜１０５のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０７）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上において、前記短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである、項目９９〜１０６のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０８）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである、項目９９〜１０７のいずれか一項に記載のセット。
（項目１０９）
前記ＰＮＡプローブの全てにおいて、前記短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである、項目９９〜１０８のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１０）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜１０９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１１）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記ペプチド核酸残基の前記塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜１１０のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１２）
前記ＰＮＡプローブの全てが、独立に、前記ペプチド核酸残基の前記塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む、項目６８〜１１１のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１３）
前記擬似相補的核酸塩基が、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される、項目１１０〜１１２のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１４）
前記ペプチド核酸残基の前記塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含む前記ＰＮＡプローブの前記１つ以上が、前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブのサブセットである、項目１１０〜１１３のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１５）
前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブの前記サブセットが、前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブのサブセットを含む、項目１１４に記載のセット。
（項目１１６）
前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブの前記サブセットが、前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブのサブセットからなる、項目１１４に記載のセット。
（項目１１７）
前記キャプチャタグがビオチン又はストレプトアビジンである、項目６８〜１１６のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１８）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている、項目６８〜１１７のいずれか一項に記載のセット。
（項目１１９）
前記ＰＮＡプローブの１つ以上が前記末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで２個以上のリジン残基によって誘導体化されている、項目１１８に記載のセット。
（項目１２０）
前記ＰＮＡプローブが、６番染色体のＭＨＣ領域に位置するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２１）
前記ＰＮＡプローブが、１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化し、前記疾患又は病態が、自己免疫疾患、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、並びに癌からなる群から選択される、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２２）
前記ＰＮＡプローブが、自己免疫疾患の疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２３）
前記ＰＮＡプローブが、糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２４）
前記ＰＮＡプローブが、異なる白血球サブセットの分化に関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２５）
前記ＰＮＡプローブがヒトミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２６）
前記ＰＮＡプローブがイヌミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２７）
前記ＰＮＡプローブが、細菌、古細菌、真菌、原虫、又はこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の寄生虫のゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、項目６８〜１１９のいずれか一項に記載のセット。
（項目１２８）
前記寄生虫が、ヒト口腔、ヒト気道、ヒト泌尿生殖器管、ヒト血液、又はヒト糞便に存在する細菌の１つ以上の種である、項目１２７に記載のセット。
（項目１２９）
核酸断片の混合物から１つ以上の核酸断片を選択的にエンリッチする方法であって、
（ａ）項目６８〜１２８のいずれか一項に記載の２つ以上のＰＮＡプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；
（ｂ）前記ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で前記反応混合物をインキュベートし、それによりインベージョンＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；
（ｃ）前記キャプチャタグによって前記ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つ前記キャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から前記反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；
（ｄ）前記ＰＮＡプローブから前記キャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップであって、前記第１の核酸試料と比較したとき、前記エンリッチ核酸試料では前記ＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされている、ステップ
を含む方法。
（項目１３０）
前記反応混合物が一本鎖結合タンパク質を更に含む、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記第１の核酸試料が高い配列複雑度を有する、項目１２９又は１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記第１の核酸試料が二本鎖ＤＮＡを含む、項目１２９〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
前記二本鎖ＤＮＡが完全に変性されたことがないか、又は実質的に変性されたことがない、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記第１の核酸試料がゲノムＤＮＡを含む、項目１２９〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記エンリッチ核酸断片が少なくとも２，０００塩基対の平均長さを有する、項目１２９〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記エンリッチ核酸断片が少なくとも１０，０００塩基対の平均長さを有する、項目１２９〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記エンリッチ核酸断片が少なくとも１５，０００塩基対の平均長さを有する、項目１２９〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記エンリッチ核酸断片の各々が少なくとも２，０００塩基対の長さを有する、項目１２９〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
前記エンリッチ核酸断片の各々が少なくとも１０，０００塩基対の長さを有する、項目１２９〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記エンリッチ核酸断片の各々が少なくとも１５，０００塩基対の長さを有する、項目１２９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記ＰＮＡプローブの標的とされる前記核酸断片が前記エンリッチ核酸試料中の前記核酸断片の少なくとも９０％を占める、項目１２９〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
前記エンリッチ核酸試料が５０：１〜１５０：１の標的対非標的核酸断片のモル比を含む、項目１２９〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に前記反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップを更に含む、項目１２９〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
前記ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップと同時に、前記キャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブをキャプチャするステップを更に含む、項目１２９〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４５）
ステップ（ｄ）において前記結合した核酸断片を溶出させるステップが、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる、項目１２９〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４６）
ステップ（ｄ）において前記結合した核酸断片を溶出させるステップが、ｐＨを上昇させることによる前記荷電部分の脱プロトン化によって行われる、項目１２９〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４７）
前記エンリッチ核酸試料中の前記核酸断片の１つ以上を増幅するステップを更に含む、項目１２９〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記エンリッチ核酸試料中の前記核酸断片の実質的に全てが増幅される、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記核酸断片が全ゲノム増幅によって増幅される、項目１４７又は１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記核酸試料がＩＬＬＵＭＩＮＡ−ＭＯＬＥＣＵＬＯ（登録商標）アダプターがライゲートされた核酸断片を含む、項目１２９〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５１）
前記核酸試料が、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製のための１つ以上のプロトコルに従って末端修復及び精製された核酸断片を含む、項目１２９〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５２）
前記核酸試料がＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターがライゲートされた核酸断片を含む、項目１２９〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターを前記キャプチャされた核酸にライゲートするステップを更に含む、項目１２９〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５４）
（ａ）項目６８〜１２８のいずれか一項に記載のセット；及び
（ｂ）項目１２９〜１５３のいずれか一項に記載の方法の実施に関する説明書
を含むキット。
（項目１５５）
前記方法における１つ以上のステップを実施するための１つ以上の酵素又はタンパク質を更に含む、項目１５４に記載のキット。
本明細書に援用され、且つその一部をなす添付の図面は、本開示の方法及び組成物の幾つかの実施形態を例示すると共に、その説明と併せて本開示の方法及び組成物の原理を解説する役割を果たす。
ＰＮＡオリゴマーの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）との４つの相互作用様式の概略図である。ＰＮＡオリゴマーは太線で示す。図１Ａは、ｄｓＤＮＡの一本鎖を認識して三重鎖ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を形成する単一のＰＮＡオリゴマーを示す。図１Ｂは、２つのＰＮＡオリゴマーが同じＤＮＡ鎖と相互作用して形成された安定三重鎖インベージョン複合体を示し、ここで、未結合のＤＮＡ鎖は鎖置換されている。図１Ｃは、単一のＰＮＡオリゴマーによって形成された二重鎖インベージョン複合体を示し、単一のＤＮＡ鎖の鎖置換が起こっている。図１Ｄは、擬似相補的ＰＮＡオリゴマーによって形成されたダブル二重鎖インベージョン複合体を示す。 ゲノムＤＮＡの４つの異なる領域を標的化するＰＮＡプローブの概略図である。各断片が２つのプローブによって標的化される。各ＰＮＡプローブはハプテン、好ましくはビオチンに共有結合的に付加する。 シーケンシングライブラリからの特異的二本鎖ＤＮＡ断片のストランドインベージョン及びキャプチャ方法論の概略図である。 定量的リアルタイムＰＣＲで分析した４つのゲノムアンプリコンの各々、それぞれ１８Ｓ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ａ）；５Ｓ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ｂ）；ＣＣＲ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ｃ）；及びＡＲ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ｄ）についてのそれぞれＰＮＡなし対照上清（対照ｓｕｐ）、ＰＮＡなし対照溶出（対照ｅｌｕ）、５Ｋ／２ＭＰ ＰＮＡ上清（５Ｋ ｓｕｐ）及び５Ｋ／２ＭＰ ＰＮＡ溶出（５Ｋ ｅｌｕ）の溶液中のＤＮＡ断片のコピー数比較を示すヒストグラムである。各溶液中のＤＮＡ断片のコピー数の値を各バーの上に示す。 定量的リアルタイムＰＣＲで分析した４つのゲノムアンプリコンの各々、それぞれ１８Ｓ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ａ）；５Ｓ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ｂ）；ＣＣＲ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ｃ）；及びＡＲ ５０ｗ／７５ｅ（図４Ｄ）についてのそれぞれＰＮＡなし対照上清（対照ｓｕｐ）、ＰＮＡなし対照溶出（対照ｅｌｕ）、５Ｋ／２ＭＰ ＰＮＡ上清（５Ｋ ｓｕｐ）及び５Ｋ／２ＭＰ ＰＮＡ溶出（５Ｋ ｅｌｕ）の溶液中のＤＮＡ断片のコピー数比較を示すヒストグラムである。各溶液中のＤＮＡ断片のコピー数の値を各バーの上に示す。 対照溶出物（対照）の溶液、及びそれぞれＣＣＲ５及びＡＲ１領域を標的化する５Ｋ／２ＭＰ ＰＮＡセットを使用する溶液中の標的（ＣＣＲ＋ＡＲ）の非標的（１８Ｓ＋５Ｓ）に対するＤＮＡ断片コピー数比較のエンリッチメント比を示すヒストグラムである。各溶液の比の数値を各バーの上に示す。
本開示の方法及び組成物は、それに包含される以下の特定の実施形態の詳細な説明及び実施例並びに図及びそれらの前出の及び後述する説明を参照することによって理解が容易となり得る。
本開示の方法及び組成物は、特記されない限り、特別な合成方法、特別な分析手法、又は特定の試薬に限定されず、従って異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語法は特定の実施形態を説明することを目的としており、限定する意図はないことも理解されるべきである。
２つ以上の配列特異的ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブのセットを使用して核酸断片の混合物から１つ以上の大型核酸断片（それぞれ２，０００塩基対長〜４０，０００塩基対長）を標的化してエンリッチし得ることが発見された。例えば、２つ以上の配列特異的ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブのセットを使用してゲノムＤＮＡ断片混合物から１つ以上の大型二本鎖ＤＮＡ断片を標的化してエンリッチすることができる。
定義
本明細書で使用されるとき、「エンリッチする」及び「エンリッチメント」は、存在する又は当初存在した他の構成成分と比べたある構成成分の比率の増加を指す。核酸に関連して、試料中の核酸のエンリッチメントとは、試料中の他の分子と比べた試料中のその核酸の比率の増加を指す。「選択的エンリッチメント」は、同じタイプの他の構成成分と比べた特定の構成成分のエンリッチメントである。核酸断片に関連して、特定の核酸断片の選択的エンリッチメントとは、試料中に存在する又は当初存在した他の核酸断片と比べた試料中の特定の核酸断片の比率の増加を指す。エンリッチメントの尺度は種々の方法で参照することができる。例えば、エンリッチメントは、全ての構成成分のうち、エンリッチした構成成分が占める割合として記述することができる。例えば、エンリッチ核酸試料中では特定の核酸断片をそのエンリッチ核酸試料の少なくとも９０％にエンリッチすることができる。
本明細書で使用されるとき、「核酸断片」は、大きい核酸分子の一部分を指す。「隣接核酸断片」は、大きい核酸分子の単一の連続的な隣接配列に相当する核酸断片を指す。「天然に存在する核酸断片」は、天然に存在する核酸配列の単一の連続的な隣接配列に相当する核酸断片を指す。
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ断片」は、大きいＤＮＡ分子の一部分を指す。「隣接ＤＮＡ断片」は、大きいＤＮＡ分子の単一の連続的な隣接配列に相当するＤＮＡ断片を指す。「天然に存在するＤＮＡ断片」は、天然に存在するＤＮＡ配列の単一の連続的な隣接配列に相当するＤＮＡ断片を指す。
本明細書で使用されるとき、「変性核酸」又は「変性ＤＮＡ」は、それより前に存在していた「天然」又は「非変性」状態と比べて変性している核酸を指す。例えば、天然に存在するｄｓＤＮＡ鎖などの二本鎖核酸は、２本の対応する一本鎖核酸鎖に分離されているときに完全に変性している。核酸の変性は、塩又はｄｓＤＮＡの融解温度を上回る高温への曝露、又はｄｓＤＮＡと抗体又は酵素などの変性剤分子との相互作用によるなど、化学的又は物理的手段によって生じさせることができる。変性は、例えば部分的に又は実質的に変性したＤＮＡをもたらす部分的変性であってもよく、又は完全に変性したＤＮＡをもたらす完全な変性であってもよい。部分的又は完全な変性を受けたことのない核酸は、変性したことがないｄｓＤＮＡなど、「変性したことがない核酸」と称される。
本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」は、それが自然中に存在するとおりの対応する分子と同じ構造又は配列を有する分子を指す。天然に存在する分子又は配列は、それが別の分子又は配列に結合している又は組み込まれているときでもなお天然に存在すると見なすことができる。
本明細書で使用されるとき、「核酸試料」は、核酸分子を含有するか又は含有すると疑われる溶液などの組成物を指す。「エンリッチ核酸試料」は、核酸、特定の核酸断片、又はこれらの組み合わせがエンリッチされている核酸試料である。
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ試料」は、ＤＮＡ分子を含有するか又は含有すると疑われる溶液などの組成物を指す。「エンリッチＤＮＡ試料」は、ＤＮＡ、特定のＤＮＡ断片、又はこれらの組み合わせがエンリッチされているＤＮＡ試料である。
本明細書及び結末の特許請求の範囲において組成物又は物品中の特定の要素又は構成成分の重量部の表現は、重量部が表される組成物又は物品中におけるその要素又は構成成分と任意の他の要素又は構成成分との間の重量関係を示す。従って、２重量部の構成成分Ｘ及び５重量部の構成成分Ｙを含有する化合物において、Ｘ及びＹは２：５の重量比で存在し、化合物中に更なる構成成分が含まれるかどうかに関わらずかかる比で存在する。
構成成分の重量パーセントは、特に反する旨が明記されない限り、その構成成分が含まれる製剤又は組成物の総重量を基準とする。
本明細書で使用されるとき、化学種の「残基」は、部分が実際にその化学種から得られるかどうかに関わらず、特定の反応スキームにおいて結果として生じたその化学種の生成物又は続く製剤若しくは化学的生成物である部分を指す。従って、ポリマー中のエチレングリコール残基とは、エチレングリコールがポリエステルの調製に用いられたかどうかに関わらず、ポリマー中の１つ以上の−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−単位を指す。別の例として、モノマーサブユニットのポリマーでは、組み込まれているモノマーサブユニットを非重合モノマーの残基と称することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含有する分子を指す。ヌクレオチドはそのリン酸部分及び糖部分を介して互いに連結し、ヌクレオシド間連結を作り出し得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、及びチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分はリボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例としては、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）があり得る。当該技術分野で利用可能且つ本明細書で利用可能なこの種の分子は多岐にわたる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド類似体」は、塩基、糖、又はリン酸部分に対してある種の修飾を含むヌクレオチドを指す。ヌクレオチドに対する修飾は当該技術分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、及び２−アミノアデニン並びに糖又はリン酸部分における修飾が含まれ得る。当該技術分野で利用可能且つ本明細書で利用可能なこの種の分子は多岐にわたる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド代替物」は、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、リン酸部分を含まないヌクレオチド分子を指す。例示的ヌクレオチド代替物はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン−クリック又はフーグスティーン方式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して互いに連結している分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用すると二重ヘリックス型構造に従うことが可能である。当該技術分野で利用可能且つ本明細書で利用可能なこの種の分子は多岐にわたる。また、他の種類の分子（コンジュゲート）をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に連結して、例えばＤＮＡとの相互作用を増進させることも可能である。コンジュゲートはヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学的に連結させることができる。例示的コンジュゲートとしては、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９））。当該技術分野で利用可能且つ本明細書で利用可能なこの種の分子は多岐にわたる。
本明細書で使用されるとき、用語「ワトソン−クリック相互作用」は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用を指す。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１、及びＣ６位並びにピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「フーグスティーン相互作用」は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のフーグスティーン面（二重鎖ＤＮＡの主溝において露出している）で起こる相互作用を指す。フーグスティーン面はプリンヌクレオチドのＮ７位及びＣ６位における反応基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドサブユニットを含む合成又は単離核酸ポリマーである。
本明細書で使用されるとき、用語「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸と同様の構造を有して天然アミノ酸の構造及び反応性を模倣する有機化合物を指す。本明細書に定義するとおりの非天然アミノ酸は、概して、その非天然アミノ酸を天然アミノ酸の代わりに用いるとき又はペプチドに組み込むとき、ペプチドの特性（例えば、選択性、安定性）を増加させるか又は増進する。
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、共に化学的に結合したアミノ酸で構成される化合物のクラスを指す。一般に、アミノ酸はアミド結合（ＣＯＮＨ）で共に化学的に結合している。しかしながら、アミノ酸は、当該技術分野において公知の他の化学結合によって共に結合してもよい。例えば、アミノ酸はアミン連結によって結合してもよい。本明細書で使用されるとおりのペプチドには、アミノ酸のオリゴマー並びにポリペプチドを含めた小さい及び大きいペプチドが含まれる。
用語「修飾された」は、多くの場合に本明細書ではポリマーを記載するために用いられ、典型的には純ポリマーを構成し得る特定のモノマー単位が、置き換えられたモノマー単位と共通の重合能を共有する別のモノマー単位に置き換えられていることを意味する。従って、例えば、ポリ（エチレングリコール）中のグリコールをジオール残基で置換することが可能であり、この場合、ポリ（エチレングリコール）はジオールで「修飾」されることになる。ポリ（エチレングリコール）があるモル百分率のジオールで修飾される場合、次にはかかるモル百分率は、純ポリマー中に存在し得る、但しその修飾についてのグリコールの総モル数を基準とする。従って、５０モル％がジオールで修飾されているポリ（エチレングリコール）において、ジオール残基とグリコール残基と等モル量で存在する。
用語の相同性及び同一性は類似性と同じことを意味する。従って、例えば、２つの非天然配列間に相同性という語句の使用が用いられる場合、それは必ずしもこれらの２つの配列間の進化的関係を指しているのでなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性又は関連性に注目していることが理解される。２つの進化的に関連性のある分子間の相同性を決定する方法の多くは、進化的関連性の有無に関わらず配列類似性を計測する目的で任意の２つ以上の核酸又はタンパク質に常法的に適用される。
一般に、本開示のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそのヌクレオチド代替物及び本明細書に開示されるタンパク質の任意の公知の変異体及び誘導体又は現れる可能性のあるそれらを定義する１つの方法は、特異的な公知の配列との相同性の点でその変異体及び誘導体を定義することによることが理解される。本明細書に開示される特定の配列のこの同一性についてはまた、本明細書の他の部分でも考察される。一般に、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそのヌクレオチド代替物及び本明細書に開示されるタンパク質の変異体は、典型的には、挙げられる配列又は天然配列と少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質又は核酸、例えば遺伝子の相同性をどのように決定すればよいかを容易に理解する。例えば、相同性は、２つの配列を相同性がその最も高いレベルとなるようにアラインメントした後に計算することができる。相同性を計算する別の方法は、既発表のアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によるか（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、又は目視検査によって行うことができる。核酸についても、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（これらは、少なくとも核酸アラインメントに関係する資料について、本明細書において参照により援用される）に開示されるアルゴリズムにより、同じタイプの相同性を得ることができる。これらの方法のいずれも典型的には用い得ること、及び特定の例ではこれらの様々な方法の結果が異なり得ることが理解されるが、しかし、当業者は、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見出された場合、それらの配列が挙げられる同一性を有すると言うことができ、及び本明細書に開示されるであろうことを理解する。例えば、本明細書で使用されるとき、別の配列と特定のパーセント相同性を有すると記載される配列は、上記の計算方法の任意の１つ以上によって計算したとき、記載される相同性を有する配列を指す。例えば、Ｚｕｋｅｒの計算方法を用いて第１の配列が第２の配列と８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、他の計算方法のいずれかによって計算したとき、第１の配列が第２の配列と８０パーセントの相同性を有しない場合であっても、第１の配列は第２の配列と、本明細書において定義するとき、８０パーセントの相同性を有する。別の例として、Ｚｕｋｅｒの計算方法及びＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの計算方法の両方を用いて第１の配列が第２の配列と８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの計算方法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの計算方法、Ｊａｅｇｅｒの計算方法、又は他の計算方法のいずれかによって計算したとき、第１の配列が第２の配列と８０パーセントの相同性を有しない場合であっても、第１の配列は第２の配列と、本明細書において定義するとき、８０パーセントの相同性を有する。更に別の例として、計算方法の各々を用いて第１の配列が第２の配列と８０パーセント相同性を有すると計算される場合、第１の配列は第２の配列と、本明細書において定義するとき、８０パーセントの相同性を有する（しかしながら、実際には、異なる計算方法によって異なる相同性パーセンテージ計算結果となることが多いであろう）。
本明細書で使用されるとき、第２の記述の「あらゆる残基間」（部分によって誘導体化されている残基など）に第１の記述の残基（部分によって誘導体化されていない残基など）が幾つかの数あるという表現は、間にいかなる他の第２の記述の残基も有しないあらゆる２個の第２の記述の残基の間に、指定される数の第１の記述の残基が存在することを意味する。従って、例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）が、異なる位置において、部分によって誘導体化されている残基の間で０、１、又は２個の残基が部分によって誘導体化されていないプローブの例である。ある第２の記述の残基がプローブの末端の前にある最後の第２の記述の残基（これは第２の記述の末端近位残基と称することができる）である場合、あらゆる第２の記述の残基間に第１の記述の残基が幾つかの数あるという表現は、末端近位残基とプローブの末端との間の残基には適用されない。従って、第２の記述の残基間の平均間隔は内部の間隔のみに有効であり、各末端とそのそれぞれの第２の記述の末端近位残基との間の第１の記述の残基は考慮しない。
第２の記述の末端近位残基とプローブの末端との間にある第１の記述の残基は、第１の記述のフランキング残基と称することができる。例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない合計０個の残基を有し、従って部分によって誘導体化されていない０個のフランキング残基を有する。別の例として、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない合計２個の残基を有し、従って部分によって誘導体化されていない２個のフランキング残基を有する。別の例として、プローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない合計２個の残基を有し、従って部分によって誘導体化されていない２個のフランキング残基を有する。
別の例として、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない合計０個の残基を有し、従って荷電部分によって誘導体化されていない０個のフランキング残基を有する。別の例として、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない合計１個の残基を有し、従って荷電部分によって誘導体化されていない１個のフランキング残基を有する。別の例として、プローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない合計４個の残基を有し、従って荷電部分によって誘導体化されていない４個のフランキング残基を有する。
材料
本開示の方法に使用することのできる材料、組成物、及び構成成分が開示される。これら及び他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されるとき、これらの化合物の各種々の個別的及び集合的組み合わせ及び並べ替えの具体的な言及は明示的には開示されないこともあるが、各々が具体的に企図され、及び本明細書に記載されることが理解される。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの対応するセットが開示及び考察され、及びプローブの各々のペプチド核酸を含む幾つもの分子に行うことのできる幾つもの修飾が考察される場合、具体的に反する旨が指示されない限り、可能性のあるペプチド核酸及び修飾のそれぞれの組み合わせ及び並べ替えが具体的に企図される。従って、あるクラスの修飾Ａ、Ｂ、及びＣが開示され、並びにあるクラスの分子Ｄ、Ｅ、及びＦと組み合わせ分子Ａ−Ｄの例とが開示される場合、このとき、各々が個別に記載されていない場合であっても、各々が個別的及び集合的に企図される。従って、この例では、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；及び例示的な組み合わせＡ−Ｄの開示から、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆの各々が具体的に企図され、且つそれが開示されていると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に企図及び開示される。従って、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；及び例示的な組み合わせＡ−Ｄの開示から、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブグループが具体的に企図され、且つそれが開示されていると見なされるべきである。更に、上記のとおり企図及び開示される材料、組成物、構成成分等の各々はまた、具体的に及び独立に、かかる材料の任意のグループ、サブグループ、リスト、セット等に包含し又はそれから除外することもできる。これらの概念は、限定はされないが、本開示の組成物の作製及び使用方法におけるステップを含め、本願の全ての態様に適用される。従って、実施し得る種々の追加的なステップがある場合、これらの追加的なステップの各々は本開示の方法の任意の具体的な実施形態又は実施形態の組み合わせと共に実施し得ること、及びかかる各組み合わせが具体的に企図され、且つそれが開示されていると見なされるべきであることが理解される。
Ａ．化合物
１．ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブ
ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブ（ＰＮＡプローブ）は、少なくとも１つのペプチド核酸残基を含む核酸塩基対合残基のオリゴマーであり、二本鎖ＤＮＡにインベージョンして標的配列とワトソン−クリック塩基対合でハイブリダイズするように設計され、及びその能力を有する。一部の形態において、ＰＮＡプローブは１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブは核酸断片内の配列を標的化するように設計される。一部の形態において、ＰＮＡプローブは１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブは核酸断片内の配列を標的化するように設計される。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、（ａ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｂ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、若しくはこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｃ）これらの組み合わせを含む。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２〜６個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。一部の形態において、荷電部分の１つ以上がリジンである。一部の形態において、荷電部分の全てがリジンである。一部の形態において、荷電部分の１つ以上がＬ−リジンである。一部の形態において、荷電部分の全てがＬ−リジンである。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１〜１９個のペプチド核酸残基を含む。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである。一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むことができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１〜２２個のペプチド核酸残基を含むことができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１〜２２個のペプチド核酸残基を含むことができる。
一部の形態において、擬似相補的核酸塩基は、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される。
一部の形態において、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むＰＮＡプローブの１つ以上は、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。一部の形態において、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットを含む。一部の形態において、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。
一部の形態において、キャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。一部の形態において、ＰＮＡプローブは末端ＰＮＡ残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている。一部の形態において、ＰＮＡプローブは末端ＰＮＡ残基の少なくとも１つで２個以上のリジン残基によって誘導体化されている。
一部の形態においてハイブリダイゼーションプローブは、ガンマ位で中性及び荷電部分によって修飾されたＰＮＡモノマーを組み合わせるペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーを含む。
荷電及び中性ガンマ修飾の組み合わせを含む２つ以上のＰＮＡハイブリダイゼーションプローブのセットは、任意の核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ配列など）を標的化するように設計することができる。例えば、ＰＮＡプローブは、全ゲノムＤＮＡ試料など、高度に複雑な核酸試料からの特定の遺伝子、核酸断片、又はＤＮＡ断片にユニークな標的ヌクレオチド配列と相補的であるように設計することができる。標的核酸配列は任意の好適な長さであってよい。例えば、標的核酸配列は８〜３０ヌクレオチド長、典型的には１５〜２５ヌクレオチドであってもよい。好ましい核酸標的配列は１８〜２２ヌクレオチド長（端点を含む）、例えば２０ヌクレオチド長である。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、最適溶解度、高速のハイブリダイゼーション反応速度、ＤＮＡハイブリダイゼーション後の高い融解温度、並びに良好なミスマッチ識別のため、ガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を有するＰＮＡモノマーとガンマＬ−リジン修飾を有するＰＮＡモノマーとを組み合わせるように設計される。正電荷リジン残基が他のＰＮＡ分子と接触すると電荷斥力が起こる。このため、２つ以上のガンマ−Ｌ−リジン修飾を有するＰＮＡプローブは、種々のＤＮＡ標的をインベージョンするように設計された何千もの異なるＰＮＡ配列を含む混合物中に存在する異なる配列の他のプローブとの分子間ハイブリダイゼーション会合を起こしにくいものと思われる。例示的ＰＮＡプローブを表１に提供する。各ハイブリダイゼーションプローブがビオチン部分などの１つ以上のキャプチャタグを含み、例えばアフィニティークロマトグラフィーによる標的核酸断片の単離が可能である。各ハイブリダイゼーションプローブが任意選択で、水溶解度を増進させるアミノ酸付加物、例えば２つのリジン残基を含む。
ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは、概して合成有機化学者に公知の技法を用いて容易に合成することができる。
ｉ．標的核酸配列
特異的核酸標的配列のエンリッチメント用のキャプチャプローブとして短いＰＮＡプローブを設計して使用することができる。本開示の方法に係る配列特異的核酸キャプチャのハイブリダイゼーションプローブの設計には、各異なる標的核酸断片内にある２つ以上の標的配列の情報が必要である。典型的には、短いＰＮＡハイブリダイゼーションプローブに対する複数の個別の標的配列が、大きい核酸分子によく見られる。
用語「ｋ−ｍｅｒ」は短い核酸配列を指し、ここで、「ｋ」は、ヌクレオチド塩基の短いストリングにおける位置の数を意味する。典型的には、本開示の方法に係る使用向けに設計されたあるプローブのセット中の各プローブは、核酸試料中に存在する配列においてユニークな短い（好ましくは１８〜２２塩基）ヌクレオチド配列と相補的でなければならない。例えば、ゲノムＤＮＡ断片のエンリッチメントについて、プローブは、そのゲノム中に存在する配列においてユニークな短い（好ましくは１８〜２２塩基）ヌクレオチド配列と相補的でなければならない。
典型的には、ハイブリダイゼーションプローブは、同じ所望のＤＮＡ断片内のヌクレオチド配列を標的化する２つ以上のプローブの対応するセットとして設計される。記載される方法によって核酸断片を標的化するように設計された異なるハイブリダイゼーションプローブの最適な数は、標的化する核酸断片のサイズに応じて変わり得る。好ましくは、２０，０００塩基対長以下の断片の標的化には２つ以上のプローブを使用することができ、３０，０００塩基対長以下の断片の標的化には３つ以上のプローブを使用することができ、及び４０，０００塩基対長以下の断片の標的化には４つ以上のプローブを使用することができる。
標的ＤＮＡの各鎖とハイブリダイズすることにより対で機能するＰＮＡプローブを設計することが可能である。従って、好ましくはないが、２つ以上の標的配列は標的核酸断片内の、例えば、重複している、部分的に重複している、又は重複していない隣接又は連続配列であり得る。一部の形態において、重複している、部分的に重複している、又は両方の標的配列は除外され得る。一部の形態において、２つ以上の標的配列は１ヌクレオチド以上隔てられている。一部の形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の二重鎖インベージョン又は三重鎖インベージョンを誘導するように設計される。従って、好ましくはないが、ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸断片上に部分的に重複している、又は重複していない２つ以上の標的配列を含み得る。一部の形態において、標的核酸の三重鎖インベージョンの誘導能を有する、標的核酸の三重鎖インベージョンを誘導するように設計される、又は両方のハイブリダイゼーションプローブは除外され得る。一部の形態において、好ましくはないが、２つのハイブリダイゼーションプローブの対応する対がパリンドローム（自己相補的）配列を含み、標的ＤＮＡ断片のダブル二重鎖インベージョン方法において使用することができる。
ユニークでない標的配列を有するハイブリダイゼーションプローブは、ゲノム中の複数の配列を標的化し、インベージョンし、及びキャプチャすることができる。従って、一部の形態において、本開示の方法に係る使用向けに設計された２つ又はプローブのセットは、１塩基のみ異なるゲノム中のｋ−ｍｅｒの数が０であるＤＮＡ配列とセット中の各プローブが相補的であるときに最も特異的に多重化二本鎖ＤＮＡ配列キャプチャを果たす。プローブセット中の各プローブによるキャプチャは、２塩基のみ異なるゲノム中のｋ−ｍｅｒの数が０であるとき、より特異的である。プローブセット中の各プローブによるキャプチャは、３塩基のみ異なるゲノム中のｋ−ｍｅｒの数が０であるとき、更により特異的である。バイオインフォマティクスツールを使用して、所望のユニークさ要件：１又は２又は更には３個のミスマッチだけ異なる近縁配列が他のゲノム位置にないことを満たす候補プローブ配列をゲノムにおいて同定することができる。
ヒトゲノムの配列情報用のバイオインフォマティクスツールは、複数のソース、例えば、国際ヒトゲノムマッピングコンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）によって開発されたＵＣＳＣデータベース（バージョンｈｇ１２；２００２年６月２８日）（インターネットサイトｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／２８ｊｕｎ２００２）から利用可能である。
好ましくは、プローブ候補は、自己フォールディング能を有して安定二次構造を形成するｋ−ｍｅｒを含まない。これらのｋ−ｍｅｒは、熱力学的に安定した自己フォールディング配置となって動きが取れなくなるため、標的配列と相互作用する可能性が低い。
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望ましくない自己フォールディング性ｋ−ｍｅｒを同定するコンピュータプログラムが利用可能である。ユニークで、またストランドインベージョンによる特異的ターゲティング及びキャプチャに好適でもある、典型的には１８〜２２塩基長の短いｋ−ｍｅｒ配列は、１０，０００塩基対に１，０００個未満の頻度で存在し得る。
典型的には、本開示の方法に係る使用向けに設計されたハイブリダイゼーションプローブのＤＮＡ標的配列は、比較的低い融解温度を有することによって特徴付けられる。例えば、ゲノム中の２０隣接ヌクレオチドの配列について、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５，ｐｐ．１４６０−１４６５（１９９８）によって記載されるとおり、各ジヌクレオチドに特有のエントロピー及びエンタルピーの値を用いて予想融解温度を計算することができる。従って、３０，０００塩基対の例示的ゲノムドメインでは、各２０塩基対の２９，９８０個のｋ−ｍｅｒを数え上げることができる。コンピュータベースのアルゴリズムを使用して、このゲノムインターバルにおける２９，９８０個全てのｋ−ｍｅｒの予測融解温度を計算することができる。
本開示の方法に係る有用な２０塩基ＤＮＡ標的配列は、全ての計算された２０塩基ＤＮＡ融解温度の最も低い半分（５０％）に属する融解温度を有することによって特徴付けられる。特に、本発明に係る２０塩基ＤＮＡ標的配列は、全ての計算された２０塩基ＤＮＡ融解温度の最も低い３分の１（３３％）に属する融解温度を有することによって特徴付けられる。
単一の反応容積中で複数のハイブリダイゼーションプローブを使用するためには、セット中のプローブ配列はいずれも互いにハイブリダイズできないことが好ましい。この要件は、全てのプローブ対の可能なあらゆる組み合わせの間の可能な各ＰＮＡ配列アラインメントが少なくとも３個のミスマッチ塩基、又はより好ましくは少なくとも４個のミスマッチ、又はより好ましくは少なくとも５個のミスマッチ、又は更により好ましくは少なくとも６個のミスマッチを有する場合に満たされる。当該技術分野において公知の任意のコンピュータプログラムを使用して数千個のプローブ候補のセット中の全てのＰＮＡプローブ候補間における交差反応の可能性を調べ、プローブ対がいずれも、プローブ間交差ハイブリダイズしない好ましい条件を満たすことを確かめ得る。
ａ．例示的標的
標的特異的エンリッチメントの例示的標的配列には、特異的ゲノム、例えばヒトゲノムの１つ以上の構成成分が含まれる。標的化してエンリッチすることのできる例示的ヒトゲノムＤＮＡには、ＭＨＣ領域に位置するＤＮＡが含まれる。例えば、詳細な形態において、標的配列には、６番染色体のＭＨＣ領域に位置するヒトゲノムＤＮＡの遺伝要素が含まれる。
一部の形態において、標的特異的エンリッチメントの標的配列には、１つ以上の特異的な免疫学的特徴又は表現型に関連することが知られるＭＨＣのゲノム成分が含まれる。例示的な免疫学的特徴又は表現型としては、自己免疫疾患素因を有すること、又は自己免疫疾患症状を示すことが挙げられる。従って、一部の形態において、標的配列は、ゲノムＤＮＡのうち、配列変異が自己免疫疾患などの免疫学的特徴と関連付けられる領域をエンリッチする。自己免疫疾患に関係する配列変異と関連付けられる例示的遺伝子としては、とりわけ、ＤＲＢ１及びＤＱＡ１遺伝子が挙げられる。従って、一部の形態において、標的ゲノムＤＮＡ断片には、ＤＲＢ１遺伝子、又はＤＲＢ１遺伝子の断片が含まれる。一部の形態において、標的ゲノムＤＮＡ断片には、ＤＱＡ１遺伝子、又はＤＱＡ１遺伝子の断片が含まれる。一部の形態において、標的ＤＮＡ断片としては、ＤＱＡ１遺伝子、又はＤＱＡ１遺伝子の断片及びＤＲＢ１遺伝子、又はＤＲＢ１遺伝子の断片が挙げられる。例示的ゲノム標的領域は９０，０００塩基長であり、ゲノム座標ｃｈｒ６：３２５２２９８１〜３２６１２９８１（ヒトゲノムビルドｈｇ１９を基準とした座標）にわたる。一部の形態において、標的ヒトゲノムＤＮＡは６番染色体の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）領域に位置し、例えば、ＤＲＢ１及びＤＱＡ１遺伝子である。
一部の形態において、標的ゲノムＤＮＡは、ヒトＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３、調節性Ｔ細胞に発現する）プロモーターの−２２，０００塩基上流から始まってＦＯＸＰ３プロモーターの１８，０００塩基下流で終わる領域にわたる４０，０００塩基ウィンドウを含む。従って、一部の形態において標的ゲノムＤＮＡは、ヒトＦＯＸＰ３遺伝子、又はＦＯＸＰ３遺伝子の断片を含む。例示的ゲノム標的領域は、ゲノム座標ｃｈｒＸ：４９１０３２８８〜４９１４３２８８（ヒトゲノムビルドｈｇ１９を基準とした座標）にわたる配列である。この領域からの例示的標的ゲノムＤＮＡには、ゲノム内で互いに平均５，７１４塩基対離れている７つの配列が含まれる。
一部の形態において、標的配列は、１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有する（即ち、疾患リスクと関連付けられる）遺伝要素を含む。例示的疾患は、自己免疫疾患、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、並びに癌である。例えば、詳細な形態において、標的配列には、自己免疫疾患の疾患リスクに関連するエンハンサーエレメント、又は糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連するエンハンサーエレメントの範囲内に位置する４０又は５０メガベースを上回るヒトゲノムＤＮＡからの遺伝要素が含まれる。例えば、一部の形態において、標的ＤＮＡには、ＩＩ型糖尿病などの重大な疾患に関連するエンハンサークラスターが含まれる。強力な膵島エンリッチ発現を有する遺伝子の近くにマッピングされた３，６７７個のエンハンサークラスターが同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ｆｅｂ；４６（２）：１３６−４３（２０１４））。従って、一部の形態において、標的ＤＮＡは３０，０００〜１５０，０００塩基対のゲノムＤＮＡウィンドウを含んでクラスター内の全てのエンハンサーを包含する。例えば、標的配列は、各クラスター内で互いから５，０００〜７，０００塩基の平均距離にあるユニーク配列であってもよい。
他の標的配列には、異なる白血球サブセットの分化に関連するエンハンサーエレメントが含まれる。
一部の形態において、標的配列には、ミトコンドリアＤＮＡなど、単一のゲノムからの、又は同じ若しくは異なる種由来の２つ以上のゲノムの混合物からのゲノムＤＮＡのサブセット全体が含まれる。例えば、詳細な形態において、標的配列には、ヒトミトコンドリアゲノムの構成成分が含まれる。一部の形態において、標的配列には、イヌミトコンドリアゲノム、又はネコミトコンドリアゲノムが含まれる。
更なる形態において、標的配列には、細菌、古細菌、真菌、原虫の１つ以上の種、又はこれらの２つ以上の混合物のゲノムＤＮＡが含まれる。従って、標的配列は、ヒト口腔内に存在する細菌の１つ以上の種、ヒト気道内に存在する又はヒト泌尿生殖器管内に存在する又はヒト血液若しくは糞便中に存在することが知られる細菌の１つ以上の種のゲノムＤＮＡの配列であり得る。
ｉｉ．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、天然の核酸糖−リン酸骨格がＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位に置き換えられている核酸模倣体である。従って、ＤＮＡ及び他のＤＮＡ類似体と異なり、ＰＮＡはリン酸基又は五炭糖部分を含まない。メチルカルボニルリンカーが天然並びに異常（場合により）ヌクレオチド塩基をこの骨格にアミノ窒素で結び付ける。非修飾ＰＮＡは非イオン性でアキラルの中性分子であり、加水分解的（酵素的）切断を受けにくい。用語「非修飾ＰＮＡ残基」は、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン骨格を含むＰＮＡ残基を指す（式ＩＩＩを参照）。用語「誘導体化ＰＮＡ」又は「修飾ＰＮＡ」は、非修飾ＰＮＡ構造の１つ以上の位置に１つ以上の置換又は誘導体化基を有するＰＮＡ残基を指す。
ＰＮＡは、当該技術分野において公知の任意の手段によって合成及び修飾することができる。典型的には、ＰＮＡ合成手順は、標準的な固相手動又は自動合成を用いるペプチド合成に利用されるものと同様である。ＰＮＡ及び修飾ＰＮＡを含めた化合物の作製及び誘導体化に好適な実験方法が、Ｂａｈａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．５（２０１４）；Ｂａｈａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：ＰＮＡ＆ＸＮＡ ４：２，４９−５７（２０１３）；Ｄｅ Ｃｏｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．８，（３）ｅ５８６７０（２０１３）；Ｄｒａｇｕｌｅｓｃｕ−Ａｎｄｒａｓｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８，１０２５８−１０２６７（２００６）；Ｅｎｇｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１６，３４６５−３４６７（２００５）；Ｉｓｈｉｚｕｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．５，１４６４−１４７１（２００８）；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ Ｖｏｌ ３５，Ｎｏ ３，５１７−５２２，（２０１２）；Ｋｕｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：ＰＮＡ＆ＸＮＡ １：１，４５−５３（２０１０）；Ｓｕｇｉｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１８，２８７−３１０（２０１３）；Ｓａｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．１５；７６（１４）：５６１４−５６２７（２０１１）；及びＹｅｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．；１３２（３１）：１０７１７−１０７２７（２０１０）（これらは全体として参照により援用される）に記載されている。
天然核酸と比べて変化しているにも関わらず、ＰＮＡはなおも、ワトソン−クリック水素結合則に従うＤＮＡ並びにＲＮＡへの配列特異的結合能を有する。ＰＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡに対するその高い結合親和性及び選択性に起因して、バイオセンシング及び治療薬を含めた多数の応用に可能性を示す。ＰＮＡは標的ＤＮＡと高度に安定した複合体を形成し、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体は、同じヌクレオチド配列によって形成された対応するＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖と比較したとき、より高い熱融解温度（Ｔｍ）を有する。加えて、ＰＮＡと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは塩濃度と事実上無関係に起こることができ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは概して低イオン強度の影響を受けない。従って、ＰＮＡは、低イオン強度によって不安定化する二次構造に関わるＤＮＡ又はＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができる。
ＤＮＡと対照的に、ＰＮＡは平行又は逆平行のいずれの様式でも結合することができ、ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡのいずれとも結合することになる。
ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは、インビトロでも、並びに生細胞においても、ＤＮＡ二重鎖内の相補的標的配列のインベージョン能を有する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）による二本鎖ＤＮＡのストランドインベージョンについては、文献に広範に記載されている（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２ａ；Ｉｔｏ，Ｓｍｉｔｈ，Ｃａｎｔｏｒ（１９９２ｂ））。初期に発表されたＤＮＡキャプチャへのＰＮＡの使用例は、ホモプリンリッチ配列を含むＤＮＡ配列で容易に形成されるＤＮＡ三重鎖相互作用にＰＮＡ分子が関与する能力に依存するものである。例えば、ＰＮＡを使用してヒトゲノムライブラリから特異的配列リピートが単離され、並びに酵母ゲノムライブラリから単一コピークローンが単離された。しかしながら、ゲノム中の複数の種々の遺伝子座をキャプチャするのに十分に特異的な三重鎖プローブを設計することは困難であるため、ＰＮＡ三重鎖相互作用は好ましくない。
ＰＮＡによるストランドインベージョンはインビトロでは、低塩濃度で効率が高く、生理的塩濃度では減速する。幾つかの方法がＰＮＡベースのキャプチャによるＤＮＡの配列特異的エンリッチメントに適用されている。例えば、ジアミノプリン−チオウラシル塩基対を含有するＰＮＡは、「ダブル二重鎖インベージョン」と呼ばれる機構によって二本鎖ＤＮＡ内の相補的標的に高い特異性及び効率で結合し、ここで、二重鎖が巻き戻され、且つ両方のＤＮＡ鎖が同時に、各々、擬似相補的塩基を含む異なるＰＮＡによって標的化される（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ．ａｌ，１９９９）（図１を参照）。擬似相補的塩基を各々含有する２つのＰＮＡプローブを使用して特異的ＤＮＡ配列を標的化するとき、これらの２つのＰＮＡは擬似相補的塩基の立体的衝突に起因して互いにハイブリダイズすることはできない。対照的に、ＤＮＡ鎖の各々との相互作用は高度に安定している。ダブル二重鎖インベージョンは、サラセミアに関連するβグロビン突然変異の標的化した修正への使用が成功している（Ｌｏｎｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。
ａ．ＰＮＡの修飾
ＰＮＡプローブは、プローブの構造的及び機能的特徴を変化させる当該技術分野において公知の任意の手段により修飾されたＰＮＡを含み得る。一部の形態において、ＰＮＡの化学修飾はＰＮＡの１つ以上の構造特性を変化させる。
本明細書に記載される修飾のいずれかを含むＰＮＡモノマーは、オリゴマーに組み込むことができる。従って、ＰＮＡプローブは、修飾ＰＮＡモノマー、非修飾ＰＮＡモノマー、及びこれらの組み合わせを含むＰＮＡオリゴマーであり得る。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、複数の様々に修飾されたＰＮＡモノマーを含む。例えば、自己相補的ＰＮＡプローブの対応する対を修飾して、各対においてプローブによって形成されるＰＮＡ：ＰＮＡ二重鎖の熱安定性を低下させてもよい。加えて、ＰＮＡプローブは、ＤＮＡ−ＰＮＡ二重鎖の配列特異性及び親和性が増進され；且つ非特異的相互作用が低下するように修飾されたＰＮＡモノマーを含むことができる。
好ましくはないが、ＰＮＡオリゴマーにはビス−ＰＮＡオリゴマーが含まれ得る。ビス−ＰＮＡは特異的標的配列に結合してループアウトした一本鎖及び内部の三重鎖インベージョンされた複合体を形成する。ビス−ＰＮＡは、連続合成法で、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸又は６−アミノヘキサン酸のいずれかの複数単位で構成された可動性リンカーで２つのＰＮＡセグメントをつなぎ合わせることにより調製し得る（Ｒａｙ ａｎｄ Ｎｏｒｄｅｎ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１４ ｎｏ．９ １０４１−１０６０（２０００））。一部の形態において、ビス−ＰＮＡオリゴマーは除外され得る。
（Ａ）擬似相補的塩基
擬似相補的（ＰＣ）核酸塩基は、化学修飾に起因して互いとの二重鎖形成に対する親和性が大幅に低下した、しかし天然ＤＮＡ又はＲＮＡ標的との強力な塩基対は保持しており、非修飾核酸に容易にハイブリダイズすることができる非標準塩基である。従って、ｐｃ核酸の差次的ハイブリダイゼーション特性は、ダブル二重鎖インベージョン戦略による二重鎖ＤＮＡの効率的な配列特異的ターゲティングをもたらす。ＤＮＡ鎖インベージョンに擬似相補的インベージョンＰＮＡ対を利用すると、シングルインベージョンＰＮＡと比較して、ＤＮＡキャプチャに用いられるプローブの総数が事実上二倍になる。
擬似相補的核酸塩基の非限定的なリストとしては、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンが挙げられる（式Ｉを参照）。擬似相補的インベージョンＰＮＡ対は、式ＩＩに示すとおり、天然ＤＮＡ塩基と安定したワトソン：クリック相互作用を形成するが、それらの間では安定した水素結合能を有しない（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ １９９９）。例えば、ジアミノプリンはチミンと追加の水素結合を形成することができ、一方、ジアミノプリンとチオウラシルとの間には立体衝突が起こる。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、擬似相補的インベージョンＰＮＡ対に基づくキャプチャ方法で用いられるように設計される。例えば、ＰＮＡプローブを擬似相補的ＰＮＡによるダブル二重鎖インベージョン用に設計して、真核生物ゲノムからの複数の二本鎖ＤＮＡドメインの配列特異的キャプチャを達成することができる。
Figure 0006937294
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擬似相補的塩基は、単一のキャプチャ反応に多数の異なるＰＮＡプローブがある場合にＰＮＡプローブへの組み込みに有用であり得る。例えば、擬似相補的塩基は、何千ものＰＮＡプローブを共に使用して多数の標的配列をキャプチャする場合に有用であり得る。特定のかかる形態において、擬似相補的塩基は、例えばＰＮＡプローブの特定のサブセットにのみ組み込むことができる。例えば、擬似相補的塩基は、コンピュータ分析によって互いとの相互作用能を有すると予想されるＰＮＡプローブのサブセットに組み込むことができる。かかるＰＮＡプローブを使用すると、望ましくないプローブ間相互作用が減少し又はなくなり得る。一部の形態において、ＰＮＡプローブにおける擬似相補的塩基の使用は除外され得る。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むことができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１〜２２個のペプチド核酸残基を含むことができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１〜２２個のペプチド核酸残基を含むことができる。
一部の形態において、擬似相補的核酸塩基は、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される。
一部の形態において、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むＰＮＡプローブの１つ以上は、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。一部の形態において、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットを含む。一部の形態において、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。
（Ｂ）ＰＮＡのキラル骨格修飾
一部の形態において、ＰＮＡ骨格の構造の化学修飾により、ＰＮＡの機能的特性に変化を生じさせることができる。修飾することのできるＰＮＡの機能的特性には、結合親和性、結合特異性、水溶解度、熱安定性、及びこれらの組み合わせが含まれる。例えば、ＰＮＡ骨格のガンマ位に側鎖を付加すると、結合親和性が増加するように骨格をプレオーガナイズすることができ、アミノ酸構成要素の付加によって様々な化学的機能性を組み込むことが可能になり得る。元のアミノエチルグリシンＰＮＡ骨格の多数の化学修飾が公知である。一部を式ＩＩＩに示す。
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ＰＮＡは、ＰＮＡ骨格のグリシン部分をキラル部分に置換することによって修飾し得る。従って、一部の形態において、修飾されたＰＮＡモノマーはキラルＰＮＡモノマーである。修飾はＰＮＡモノマーのアルファ（α）位、ベータ（β）位又はガンマ（γ）位にあってもよい（式ＩＶを参照）。例えば、ＰＮＡ骨格のグリシン部分をアラニンに置換してもよい（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
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修飾キラルモノマーは、Ｌ型又はＤ型のキラルアミノ酸から合成してオリゴマーに組み込むことができる。従って、キラルＰＮＡモノマーはＬ−ＰＮＡ又はＤ−ＰＮＡモノマーの形態であり得る（Ｓｕｇｉｙａｍａ ａｎｄ Ｋｉｔａｔｔａ，２０１３）。
ＰＮＡモノマーの異なるキラルアイソフォームは別個の機能特性を有し得る。従って、Ｄ型又はＬ型ＰＮＡモノマーを含有するＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の熱安定性は、グリシン骨格を有する元のＰＮＡと同じであるか、同様であるか、又は異なり得る。例えば、Ｄ型モノマーを含有するＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の熱安定性は、グリシン骨格を有する元のＰＮＡと同様であってもよく、一方、Ｌ型モノマーを含有するＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の熱安定性は、元のＰＮＡを含有するＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖と比べて低下していてもよい。
（Ｃ）ＰＮＡ電荷の修飾
ＰＮＡモノマーの骨格における化学的置換は、負電荷又は正電荷を導入してもよい。例えば、正電荷側鎖を有するＰＮＡはＤＮＡとのより高い選択性を示し、一方、負電荷側鎖を有するＰＮＡはＲＮＡとのより高い選択性を示す（Ｄｅ Ｃｏｓｔａ＆Ｈｅｅｍｓｔｒａ，２０１３，２０１４）。
荷電部分は、ＰＮＡプローブの定義付けられた位置に導入することができる。例えば、修飾はＰＮＡモノマーのアルファ（α）位、ベータ（β）位又はガンマ（γ）位にあってもよい（式ＩＶの化学構造を参照）。一部の形態において骨格の正味電荷は、イオン強度の関数として二重鎖安定性に影響を及ぼす支配的因子である。一部の形態において、電荷修飾ＰＮＡ鎖は、観察される選択性の違いを説明付けるのに十分な局所的摂動をもたらす。例えば、アスパラギン酸及びリジンモノマーはやや異なる側鎖長を有し、リジンは荷電原子の２つの炭素がアスパラギン酸と比べてＰＮＡ骨格から更に離れて位置する（Ｄｅ Ｃｏｓｔａ＆Ｈｅｅｍｓｔｒａ，２０１４）。
正電荷を導入する骨格修飾（例えばガンマリジン）を有するキラルＰＮＡを含むＰＮＡプローブは、ポリアミド骨格におけるヘリックスプレオーガニゼーションの誘導、並びに天然ＤＮＡの負電荷骨格との静電相互作用に起因して、向上した二本鎖ＤＮＡインベージョン特性を有する。従って、電荷修飾ＰＮＡを含むように設計されたＰＮＡプローブは、均等な非修飾ＰＮＡ鎖と比較して優れたＤＮＡとの結合選択性を示す。従って、一部の形態において、ＰＮＡプローブは、電荷を導入する骨格修飾を有する１つ以上のＰＮＡモノマーを含む。
ＤＮＡ又はＲＮＡ標的とのＰＮＡ二重鎖の安定性は、塩濃度の変化に伴い変わり得る。低い塩濃度では、正電荷ＰＮＡプローブは負電荷ＰＮＡプローブよりも強力にＤＮＡ及びＲＮＡに結合する。しかしながら、中間乃至高い塩濃度ではこの傾向が逆になり、負電荷ＰＮＡプローブが正電荷ＰＮＡプローブよりも高いＤＮＡ及びＲＮＡ親和性を示す。従って、溶液中での対イオンによる電荷スクリーニングにより、ＤＮＡ及びＲＮＡとの二重鎖安定性を低下させることなく負電荷側鎖をＰＮＡ骨格に組み込むことが可能になる。従って、アスパラギン酸などの負電荷側鎖の導入は、生理的イオン強度ではＰＮＡ結合親和性に著しく有害というわけではなく、ＰＮＡプローブは、結合親和性を低下させることなく負電荷を組み込むように設計することができる。
正電荷又は負電荷ガンマ側鎖を有する電荷修飾ＰＮＡの配列選択性は、当該技術分野において公知の任意の手段を用いて直接比較することができる。例えば、円偏光二色性（ＣＤ）試験は、側鎖修飾がＰＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の全体的な構造を有意に改変するかどうかを明らかにすることができる。
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、ガンマ（γ）位におけるキラル荷電側鎖の付加によって修飾されたＰＮＡモノマー（γ−ＰＮＡ）を含む（式Ｖ）。
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最初のガンマキラルＰＮＡモノマーは１９９４年に報告され、及びγ−キラル単位を有するオリゴマーが２００５年に報告された（Ｔｅｄｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｅｎｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５）。セリンベース又はアラニンベースのγ−ＰＮＡの分光学的研究により、ガンマ骨格修飾が一本鎖ＰＮＡオリゴマーをＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のものと極めて類似した右回りのヘリックス構造にプレオーガナイズすることが確立された（Ｄｒａｇｕｌｅｓｃｕ，ｅｔ ａｌ（２００６））。ヘリックスの誘導は塩基スタッキングによって立体的にドライブされ、安定化する。従って、ガンマＰＮＡはＤＮＡを極めて高い親和性及び高い配列選択性で結合することができる。例えば、完全にガンマ修飾されたデカマーＰＮＡは非常に安定したＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成し、非修飾ＰＮＡと比較して融解温度が１９℃上昇した（Ｄｒａｇｕｌｅｓｃｕ，ｅｔ ａｌ（２００６））。ＰＮＡの完全なガンマ骨格修飾を有するＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の結晶構造は、ガンマＰＮＡがＤＮＡとのハイブリダイゼーション時にＰ−ヘリックスコンホメーションをとるのに十分な構造的完全性を維持しつつコンホメーション上の柔軟性を有することを示す（Ｙｅｈ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）。一本鎖状態のガンマＰＮＡ（ＮＭＲによって決定される）とハイブリッド二重鎖状態のガンマＰＮＡ（Ｘ線結晶学によって決定される）とは、極めて類似したコンホメーションをとる。
従って、キラル骨格を有するＰＮＡ分子を使用して二本鎖ＤＮＡを標的化することにより、ＤＮＡ三重鎖構造の形成に依存しない、ワトソン−クリックベースの対合によって媒介されるストランドインベージョンが可能である。例えば、１５〜２０ヌクレオチドの長さのガンマＰＮＡは、いかなる補助剤もＰＮＡに付加する必要なしに二重鎖ＤＮＡをインベージョンすることが示された（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
中性ｐＨで荷電している例示的ＰＮＡモノマーは、正電荷側鎖ｌｙｓｌ（（ＣＣＨ２）４ＮＨ２）基（即ちリジン側鎖）、又はチアリジン側鎖の付加によって修飾されたＰＮＡモノマーである。一部の形態においてリジン側鎖はＰＮＡ骨格のガンマ位に付加される（ガンマリジン）。最適なＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッド安定性のためのガンマ位における好ましいリジン異性体は、Ｌ−異性体（即ち、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、式ＶＩ）である。
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側鎖部分のキラリティーはＰＮＡの構造に影響を及ぼし得る。例えば、ガンマリジン−ＰＮＡについて、Ｌ配置の側鎖は二重鎖の周囲に沿って配向し、一方、Ｄ配置は二重鎖の内側に向く。
一部の形態において、荷電ＰＮＡモノマーは、アルファリジンで修飾されたＰＮＡモノマーである。アルファ位におけるＤ−リジン異性体は安定したＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを生じさせるが、１ターンにつき１６残基のＰＮＡ様のヘリックス構造を形成する（即ち、アルファ−Ｄ−リジンＰＮＡ；式ＶＩ）。
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アルファ−Ｄ−リジンを利用する形態では、同じＰＮＡプローブ分子におけるキラルＰＮＡモノマーと短鎖オリゴエチレングリコールとの同時使用は、好ましくは、キラルアルファリジンとの適合性のため、ＰＮＡ骨格のアルファ位にこの修飾を使用する。
好ましい荷電アミノ酸側鎖には、ガンマ−Ｌ−リジン及びガンマ−Ｌ−チアリジン（Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン又はチオシン又はアミノエチルシステインとしても知られる）が含まれる。Ｌ−チアリジンはアミノ酸リジンの毒性類似体であり、ここで、アミノ酸Ｒ基（側鎖）の第２炭素が硫黄原子に置換されている。
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Ｌ−チアリジンの重要な特性は、アミノＲ基のｐＫがリジンの約１０．５とは対照的に約９．５であることである。Ｌ−チアリジンのより低いｐＫは、より効率的な溶出方法の考案に有用性があり得る。溶出ステップにおいてｐＨを９．７５に維持することが可能な緩衝液を利用することにより、ｐＨを１０．５以上に維持することが可能な緩衝液を使用してキャプチャされた均等なＤＮＡ分子の放出に必要な温度と比べてより低い温度でキャプチャＤＮＡ分子の放出を達成することが可能である。これは、ＰＮＡプローブ中のＬ−チアリジン部分がｐＨ９．７５で脱プロトン化を起こし、その正電荷が失われ、結果として負電荷ＤＮＡ骨格へのＰＮＡプローブ結合を安定化させるイオン相互作用が弱まるためにそのようになる。
（Ｄ）ＰＮＡのガンマＭｉｎｉＰＥＧ骨格修飾
一部の形態においてＰＮＡプローブは、中性の非荷電ｍｉｎｉ−ポリエチレングリコールを導入する骨格のキラル修飾を有するＰＮＡ（ＰＮＡ−Ｍｉｎｉ−ＰＥＧ）を含む（式ＩＸ）。
典型的には、ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾は短鎖オリゴエチレングリコールを含む。例示的オリゴエチレングリコールには、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール等が含まれる。
Figure 0006937294
ＰＮＡ−Ｍｉｎｉ−ＰＥＧモノマーは、ポリアミド骨格にヘリックスプレオーガニゼーションを誘導する。従って、ＰＮＡ−Ｍｉｎｉ−ＰＥＧモノマーを含むＰＮＡプローブは、向上した二本鎖ＤＮＡインベージョン特性を有する。例えば、１５〜２０ヌクレオチドの長さのガンマＰＮＡプローブは、いかなる補助剤もＰＮＡに付加する必要なしに二重鎖ＤＮＡをインベージョンすることが示された（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。短いポリエチレングリコール（Ｍｉｎｉ−ＰＥＧ）を含有するガンマＰＮＡは、ミスマッチ配列との非特異的結合を減少させることにより更に向上したＤＮＡ結合特性を有することが報告された（Ｂａｈａｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）（式Ｘを参照）。
Figure 0006937294
骨格のガンマ−ＭｉｎｉＰＥＧ修飾を有するキラルＰＮＡプローブの実際的応用が、ＣＣＲ５遺伝子の転写のアンチセンス阻害の分野（Ｂａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）並びに遺伝的欠陥を修正するゲノム編集の分野（Ｂａｈａｌ ｅｔ．ａｌ．，２０１４）で報告されている。これらの進歩にも関わらず、キラルＰＮＡの応用に関する最新のレビューでは（Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、配列キャプチャによるＤＮＡエンリッチメントへのこれらのキラルＰＮＡ分子のいかなる応用可能性についても言及されていない。
典型的には、ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾は短鎖オリゴエチレングリコールを含む。例示的オリゴエチレングリコールとしては、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール等が挙げられる。
有用なＰＮＡプローブは、キラル骨格修飾、例えばガンマ位におけるキラル骨格修飾を含むように修飾されたＰＮＡを含む。一部の形態において修飾は正電荷を導入する。ＰＮＡプローブはまた、短鎖オリゴエチレングリコールなどの中性オリゴマー部分によって修飾された骨格を有する残基も含むことができる。好ましい短鎖オリゴエチレン部分はジエチレングリコールである。
ｉｉｉ．キャプチャタグ
本開示のＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは、１つ以上のキャプチャタグを含むことができる。キャプチャタグは、キャプチャタグを有する化合物又は複合体を、それを有しないものと分離するために使用することのできる任意の化合物である。好ましくは、キャプチャタグは、リガンド結合分子又は抗体などの別の化合物に結合する又はそれと相互作用するリガンド又はハプテンなどの化合物である。また、ハプテンと抗体との間又はリガンドとリガンド結合分子との間など、キャプチャタグとキャプチャする成分との間のかかる相互作用が特異的相互作用であることも好ましい。
核酸プローブに関連して記載される好ましいキャプチャタグが、Ｓｙｖｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：５０３７（１９８６）によって記載されている。好ましいキャプチャタグはビオチンであり、これは核酸に組み込むことができる。
本開示の方法において、アダプターインデクサー又は第２のアダプターに組み込まれるキャプチャタグは、試料断片（アダプターがカップリングしている）の基材によるキャプチャ、それへの付着、又はそれとのカップリングを可能にし得る。かかるキャプチャは断片の洗浄及び取り扱いの簡略化を可能にし、及び本方法の全て又は一部の自動化を可能にする。
基材上への試料断片のキャプチャは幾つかの方法で達成し得る。一部の形態において、基材にキャプチャドックを付着又はカップリングさせる。キャプチャドックは、断片上のキャプチャタグと結合又は相互作用することによって試料断片の付着を媒介する化合物又は部分である。基材上に固定化されたキャプチャドックが基材上への断片のキャプチャを可能にする。かかるキャプチャにより、後続のステップで相互作用する可能性のある反応成分を洗い流す好都合な手段がもたらされる。
本開示の方法で用いられる基材には、アッセイの構成成分が付着又はカップリングすることのできる任意の固体材料が含まれ得る。基材の例としては、限定はされないが、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート類、ポリカーボネート類、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン類、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル類、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカン類、及びポリアミノ酸などの材料が挙げられる。基材は、薄膜又はメンブレン、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、織り繊維、異形ポリマー、粒子及びマイクロパーティクルを含めた任意の有用な形態を有し得る。基材の一部の形態はプレート及びビーズである。ビーズの有用な形態は磁気ビーズである。
一部の形態において、キャプチャドックはオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドを基材に固定化及びカップリングする方法は十分に確立されている。例えば、好適な取り付け方法が、Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）、及びＫｈｒａｐｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）によって記載されている。カゼイン被覆スライド上への３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定化方法が、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６３７９−６３８３（１９９５）によって記載されている。オリゴヌクレオチドを固体基材に取り付ける好ましい方法が、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって記載されている。
一部の形態において、キャプチャドックは抗ハイブリッド抗体である。抗体を基材に固定化する方法は十分に確立されている。固定化は、標準的な固定化化学を用いて例えばアミノ化表面、カルボキシル化表面又はヒドロキシル化表面に取り付けることにより達成し得る。取り付け用薬剤の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン−ビオチン、光架橋性剤、エポキシド類及びマレイミド類である。好ましい取り付け用薬剤はグルタルアルデヒドである。これら及び他の取り付け用薬剤、並びに取り付けにおけるそれらの使用方法が、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，ｅｄ．（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８７）２０９〜２１６頁及び２４１〜２４２頁、及びＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｃｒａｉｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）に記載されている。抗体は、抗体上の遊離アミノ基を基材の範囲内に存在する反応性側基に化学的に架橋結合することによって基材に取り付けることができる。例えば、抗体は、遊離アミノ基又はカルボキシル基を含む基材に架橋剤としてグルタルアルデヒド又はカルボジイミド類を用いて化学的に架橋結合してもよい。この方法では、遊離抗体を含有する水溶液をグルタルアルデヒド又はカルボジイミドの存在下で固体基材と共にインキュベートする。グルタルアルデヒドとの架橋結合については、反応物はｐＨ７．４で０．１Ｍカコジル酸ナトリウムなどの緩衝液中において２体積％のグルタルアルデヒドとインキュベートすることができる。他の標準的な固定化化学が当業者に公知である。
ｉｖ．標識
記載される任意のＰＮＡ分子及びＰＮＡハイブリダイゼーションプローブを常法で標識することができる。ＰＮＡプローブは広範囲のレポーター分子と適合性がある。例えば、ディテクタープローブにカップリングしたライゲーターディテクターの検出及び定量化を助けるため、標識をライゲーターディテクター、ディテクタープローブ、及び／又はアダプターインデクサーに組み込むか、それにカップリングするか、又はそれと会合させることができる。ライゲーターディテクターが標識されることが好ましい。標識は、ライゲーターディテクターと直接又は間接的に会合させることのできる任意の分子であり、直接、或いは間接的に、計測可能な検出可能シグナルをもたらすものである。標識は、それが構成成分と共有結合的に、或いは非共有結合的にカップリング又は結合しているとき、構成成分と会合している。標識は、それが構成成分に共有結合的にカップリングしているとき、構成成分にカップリングしている。核酸への組み込み、それとのカップリング、又はそれとの会合に好適な多くの標識が公知である。本開示の方法における使用に好適な標識の例は、放射性同位元素、蛍光分子、リン光分子、生物発光分子、酵素、抗体、及びリガンドである。
好適な蛍光標識の例としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、及びシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７が挙げられる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）及びローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。同時検出に好ましい蛍光標識は、ＦＩＴＣ及びシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７である。これらの蛍光の吸収及び発光極大は、それぞれＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、従ってその同時検出が可能である。蛍光標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏを含め、種々の商業的供給元から入手することができる。
標識ヌクレオチドは、合成時にライゲーターディテクターに直接組み込むことができるため、有用な形態の標識である。ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込むことのできる標識の例としては、ヌクレオチド類似体、例えば、ＢｒｄＵｒｄ（Ｈｏｙ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９０：２１７−２３０（１９９３））、ＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２２：２８３−２９３（１９９３））及びヌクレオチドであって、ビオチン（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６６３３（１９８１））で修飾されているか又はジゴキシゲニンなどの好適なハプテン（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））で修飾されているヌクレオチドが挙げられる。好適な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセインイソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ及びシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡに好ましいヌクレオチド類似体検出標識はＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）であり、及びＲＮＡに好ましいヌクレオチド類似体検出標識はビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３、及びＣｙ５はｄＵＴＰに連結して直接標識することができる。Ｃｙ３．５及びＣｙ７は、ビオチン標識又はジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジン又は抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用可能である。
ビオチンなど、核酸に組み込まれる標識は、続いて当該技術分野において周知の高感度方法を用いて検出することができる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、これはビオチンに結合し、続いて好適な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム、３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光によって検出されるものである。
他の標識には、分子又は金属バーコード、質量標識、及び核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面増強ラマン散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光、リン光、化学発光、共鳴ラマン、マイクロ波、又は組み合わせによって検出可能な標識が含まれる。質量標識は、質量分析における特徴的な質量シグネチャである標識された成分を有するか、又はそれを与える化合物又は部分である。質量標識は、検出に質量分析が用いられる場合に有用である。好ましい質量標識はペプチド核酸及び炭水化物である。標識の組み合わせも有用であり得る。例えば、多数の構成成分を区別するのに、例えば２６５組の一意に組み合わされた標識を有するカラーコード化されたマイクロビーズが有用である。例えば、２５６個の異なるライゲーターディテクターを一意に標識して検出することができ、本開示の方法の多重化及び自動化が可能となる。
有用な標識が、Ｈａａｓ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，「時間分解顕微鏡法のためのリン光標識としての白金ポルフィリン（Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ ｆｏｒ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５（９）：１２７９−９２（１９９７）；Ｋａｒｇｅｒ ａｎｄ Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，「電荷結合素子カメラを使用したＤＮＡシーケンシングブロットのデジタル化学発光イメージング（Ｄｉｇｉｔａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｌｏｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ ｃａｍｅｒａ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（２４）：６６５７−６５（１９９２）；Ｋｅｙｅｓ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，「５原子テザリング型スピン標識によってモニタするときのＤＮＡの全体的な及び内部のダイナミクス（Ｏｖｅｒａｌｌ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｓ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｂｙ ｆｉｖｅ−ａｔｏｍ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｓｐｉｎ ｌａｂｅｌｓ）」，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７２（１）：２８２−９０（１９９７）；Ｋｉｒｓｃｈｓｔｅｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，「時間分解蛍光法を用いたＣＦＴＲ遺伝子におけるデルタＦ５０８突然変異の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤｅｌｔａＦ５０８ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＣＦＴＲ ｇｅｎｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）」，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．４８（２）：４１５−２１（１９９９）；Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．，「イムノアッセイの感度及び信頼度を向上させるための選択された戦略（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０（３）：３４７−５７（１９９４）；Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．，「化学発光及び生物発光技法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１４７２−８１（１９９１）；Ｋｕｍｋｅ，Ｍ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，「ＤＮＡハイブリダイゼーションの蛍光偏光検出の温度及びクエンチ研究（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９（３）：５００−６（１９９７）；ＭｃＣｒｅｅｒｙ，Ｔ．，「ジゴキシゲニン標識（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ）」，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７（２）：１２１−４（１９９７）；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，「非放射性標識方法を用いた核酸検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ）」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ９（３）：１４５−５６（１９９５）；Ｎｕｒｍｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，「閉鎖チューブで特異的ポリメラーゼ連鎖反応産物を検出するための新規標識技術（Ａ ｎｅｗ ｌａｂｅｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ａ ｃｌｏｓｅｄ ｔｕｂｅ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（８）：２８（２０００）；Ｏｅｔｔｉｎｇ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．「テール付加プライマー及び赤外蛍光検出を用いたＷｅｂｅｒ ８Ａマーカーセットの多重化ショートタンデムリピート多型（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｂｅｒ ８Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｔａｉｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９（１８）：３０７９−８３（１９９８）；Ｒｏｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，「光学顕微鏡−ビデオカメラルミノグラフを用いた酵素標識プローブの化学発光イメージング（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ−ｖｉｄｅｏｃａｍｅｒａ ｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈ）」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７（１）：５３−６２（１９９８）；Ｓｉｄｄｉｑｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，「特異的ＤＮＡを定量化するための電気化学発光ベース及び生物発光ベースのアッセイの評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ− ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ）」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１０（６）：４２３−３１（１９９６）；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，「同期ルミネセンス：ＤＮＡシーケンシングに使用される複数の蛍光プローブのための新規検出技法（Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ａ ｎｅｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（６）：１１０４−１１（１９９４）；Ｖｏ−Ｄｉｎｈ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，「表面増強ラマン遺伝子プローブ（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｂｅｓ）」，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６（２０）：３３７９−８３（１９９４）；Ｖｏｌｋｅｒｓ，Ｈ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，「ＤＮＡインサイチュハイブリダイゼーションのためのマイクロ波標識検出技法（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｌａｂｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２９（１）：５９−６２（１９９１）に記載されている。
分子バーコードの一形態である金属バーコードは、３０〜３００ｎｍ直径×４００〜４０００ｎｍの多層多金属ロッドである。これらのロッドは、アルミナモールドに電着させ、次にアルミナを取り除いてこれらの小さい多層物体を後に残すことにより構築される。このシステムは、最大７種の異なる金属に、最大１２個のコードされたゾーンを有することができ、ここで、金属は異なる反射率を有し、従って金属に応じて光学顕微鏡でより明るく又はより暗く見え、これが事実上無制限の識別コードにつながる。金属バーはガラス又は他の材料でコーティングすることができ、及び当該技術分野で一般に知られる方法を用いてこのガラスにプローブを取り付けることができ、アッセイの読み取りは標的からの蛍光により、及びプローブの識別はバーコードの明暗パターンによる。
標識から発生するシグナルを検出及び計測する方法は公知である。例えば、放射性同位元素はシンチレーション計数又は直接的な可視化によって検出することができ、蛍光分子は蛍光分光光度計で検出することができ、リン光分子は分光光度計又はカメラによる直接的な可視化で検出することができ、酵素は、酵素によって触媒された反応産物の検出又は可視化によって検出することができ、抗体は、抗体にカップリングした二次検出標識の検出によって検出することができる。かかる方法は本開示の増幅及び検出方法において直接用いることができる。本明細書で使用されるとき、検出分子は、増幅された核酸と相互作用する、且つそれに１つ以上の検出標識がカップリングする分子である。検出の一部の形態において、標識は、蛍光、リン光、又は化学発光の発光寿命の違いから時間的に区別することができる。多重化時間依存的検出が、Ｓｑｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １９７（２）：１３６−１４９（２０００）、及び国際公開第００／０８４４３号パンフレットに記載されている。
標識の量又は強度の定量的計測を用いることができる。例えば、所与の標識、従って標識された構成成分が閾値レベル又は閾値量で存在するかどうかを決定するため、定量化を用いることができる。閾値レベル又は閾値量は、シグナルの任意の所望のレベル又は量であり、実施される特定の形態の方法の必要性に合わせて選択することができる。
ｖ．アミノ酸及びペプチド付加物
一部の形態において、ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブの末端にアミノ酸を付加することができる。ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブの末端に１つ以上のアミノ酸残基を付加すると、熱安定性、水溶解度、リガンド結合親和性及びこれらの組み合わせを含めた、構造的及び機能的特徴をＰＮＡプローブに付与することができる。天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及びこれらの組み合わせを当該技術分野において公知の任意の技法を用いてＰＮＡプローブの末端の一方又は両方に組み込むことができる。従って、天然に存在する及び天然に存在しないアミノ酸を含むＰＮＡプローブが記載される。好ましくは、ＰＮＡの末端の一方又は両方にアミノ酸を付加しても、プローブの特異性又は親和性が低下したり、又は他の形でそれに悪影響が及んだりすることはない。
一部の形態では、プローブの親水性又は溶解度を増加させるため、又は望ましくない疎水性相互作用を低減するため、親水性アミノ酸残基が組み込まれる。例えば、ＰＮＡプローブのいずれかの末端に１個、２個又は３個以上のリジン残基を付加すると、均等な非修飾プローブと比べてプローブの水溶解度が増進し得る。従って、一部の形態において、ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは末端ポリリジン付加物を含む。
一部の形態において、アミノ酸付加物を含めることにより、アフィニティーキャプチャを補助することができる。例示的付加物には、ヒスチジン残基の１つ以上のリピートが含まれる。Ｈｉｓ６タグなどのポリヒスチジンモチーフは、効率的な一塩基対識別を維持しつつ極めて高い有効性でニッケルＮＴＡを使用したＰＮＡキャプチャを促進することができる。
ｖｉ．ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブ組成
本発明に係る二本鎖ＤＮＡのインベージョンによるＤＮＡキャプチャ用の代替的ＰＮＡプローブ組成の例を表２に提供する。これは包括的リストではなく、むしろ本発明に係るＰＮＡキャプチャプローブとして使用することのできる可能な設計範囲を抜き出したものである。
プローブの範囲内で複数のＰＮＡ修飾を組み合わせて、二本鎖ＤＮＡのインベージョンによるＤＮＡキャプチャを増進することができる。エンリッチされた標的ＤＮＡの全体的収率によって決定されるとおりの「プローブ性能」は、ハイブリダイゼーション、例えば、特異的核酸配列に対するプローブの特異性及び／又は親和性に関係し得る。従って、プローブと対応する核酸との間の分子間相互作用に影響を与える要因は、プローブコンホメーション、プローブサイズ及び相対的電荷を含め、プローブ性能に影響を与え得る。
ａ．キラリティー
ＰＮＡプローブはキラル及び非キラルの両方のＰＮＡ残基を含み得る。好ましいＰＮＡプローブとしては、ＤＮＡ鎖インベージョンを促進するのに有効な量及び配置のキラルＰＮＡモノマーが挙げられる。例えば、ＰＮＡプローブは、ＰＮＡ／ＰＮＡ二重鎖を不安定化するか、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を安定化させるか、又は両方によってＰＮＡ／ＰＮＡ二重鎖の形成を防ぐキラルの荷電ＰＮＡモノマー単位を含み得る。
プローブは、キラル残基と非キラル残基との交互の単位を含み得る。ＰＮＡプローブ内のＰＮＡ残基のキラリティーがプローブ全体のコンホメーションの変化、又はプローブの１つ以上の領域内における局所的変化をもたらすことがあり得る。従って、一部の形態において、交互のキラル骨格を有するＰＮＡプローブは、プローブ全体にわたって異なる相互作用様式で標的核酸に結合し、均等な非キラルプローブよりも高い性能を提供することができる。好ましいＰＮＡプローブは、少なくとも１つのキラルＰＮＡ残基、より好ましくは２つ以上のキラル残基を含む。
一部の形態において、ＰＮＡプローブの性能は、プローブ内のキラルＰＮＡ残基と非キラルＰＮＡ残基との相対的含有量に依存し得る。本明細書で使用されるとき、キラルＰＮＡ残基は、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素が誘導体化されている（従って誘導体化炭素がキラル中心をなす）残基である。例えば、キラル残基の非キラル残基に対する数は、プローブが記載される方法での使用に適した高い特異性及び適切な親和性で標的に結合する能力に影響を与え得る。従って、一部の形態において、ＰＮＡプローブにおける残基のキラリティーは、アルファ炭素であるか、ベータ炭素であるか、デルタ又はガンマ炭素であるかという点に関して、連続ＰＮＡ残基について同じであっても、又は異なってもよい。交互のキラリティーの隣接残基を有する残基、又は規則的なキラリティーの違いを有する残基群を有するＰＮＡプローブを設計することができる。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、全残基、又は２残基毎、又は３残基毎、４残基毎、５残基毎、６残基毎、７残基毎、８残基毎、又は９残基毎にキラル残基を含む。一部の形態において、ガンマ炭素で部分によって誘導体化されている残基が２残基毎（即ち５０％誘導体化されている）又は３残基毎（即ち３３％誘導体化されている）に交互に現れるＰＮＡプローブを使用すると、最適なストランドインベージョンが達成される。一部の形態において、３残基毎よりも少ない修飾はプローブ性能の低下を招く。典型的には、ガンマ誘導体化残基が骨格において２残基毎に交互に現れるプローブの性能が、あらゆる位置にガンマ誘導体化残基を使用した場合（即ち１００％キラル）と同程度に良好であるか、又はそれより良好である。好ましいキラルＰＮＡ残基は、例えば、アミノ酸側鎖の付加、又はｍｉｎｉＰＥＧ部分の付加によってガンマ炭素で誘導体化されている残基を含む。
ｂ．プローブサイズ及び相対的電荷
概して、ＰＮＡプローブは６〜２６個（端点を含む）の隣接ＰＮＡ残基の線状オリゴマーを含む。典型的には、プローブは、荷電側鎖で修飾された少なくとも２個の残基を有する。例示的荷電基には、リジン、チアリジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、並びにこれらの誘導体及び変異体などのアミノ酸残基の側鎖が含まれる。好ましい荷電アミノ酸には、リジン、チアリジン及びこれらの誘導体が含まれる。一部の形態において、ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは、ＰＮＡ−ＰＮＡ相互作用を低下させるため少なくとも２つのガンマリジン又はチアリジン修飾を含む。好ましいプローブは７個未満の荷電キラルガンマ骨格修飾を含み、２０塩基のＰＮＡプローブに８個以上の正電荷を導入しない。これらのプローブは非特異的ＤＮＡ結合のアーチファクトを生じないため、ＤＮＡキャプチャへの使用が成功し得る。従って、一部の形態において、ＰＮＡプローブは、ガンマ炭素における荷電部分、好ましくは３〜５個のリジンの付加によって修飾された２個の残基を少なくとも含む。一部の形態において、７個以上の荷電残基を有するプローブは、２、３、４、又は５個の荷電残基など、６個未満の荷電残基を有するものと比べて性能が低い。
高度に荷電したプローブ（例えば、２０塩基ＰＮＡプローブに７個以上の正電荷を導入する、７個以上のガンマ−Ｌ−リジン骨格修飾を有するプローブ）は、ＤＮＡキャプチャへの使用が成功し得るものの、時に非特異的ＤＮＡ結合アーチファクトを示すため、あまり好ましくない。従って、一部の形態において、ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブは、２０残基毎に７個未満の正電荷比を含む。一部の形態において、非荷電残基の数は残基総数の約３分の１である。ＰＮＡプローブ内の残基の総数に関わらず、荷電誘導体の相対的比率は概して１０％〜５０％、例えば１０％〜４０％など、例えば１１．５％〜３７．５％、１５％〜４０％、１５％、１５．４％、１８．８％、１９．２％、２０％、２３．１％、２５％、３０％、３１％又は３３．３％である。所与のＰＮＡプローブ内における荷電部分の割合（例えば、％荷電ＰＮＡ残基）の好ましい範囲は、１５％〜４５％、より好ましくは１５％〜３５％、例えば１５％〜２５％（端点を含む）である。
表２に提供するプローブは、ガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾をガンマＬ−リジン修飾と組み合わせる。これらのプローブは、良好な溶解度、高速のハイブリダイゼーション反応速度、及びＤＮＡハイブリダイゼーション後の高い融解温度、並びに良好なミスマッチ識別を有する。
概して、プローブ性能はまた、キャプチャ後の標的ＤＮＡからの放出の有効性によっても変わる。従って、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は相互作用の全体的な強度に比例するため、低い親和性で結合する、キャプチャにおける効率がやや低いプローブの方が放出され易く、標的ＤＮＡ収率が高くなり、及び／又は非変性ｄｓＤＮＡの維持率がより高いエンリッチＤＮＡ試料を生じさせ得る。
正電荷リジン残基が他のＰＮＡ分子と接触すると電荷斥力が起こる。このため、２つ以上のガンマ−Ｌ−リジン修飾を有するＰＮＡプローブは、種々のＤＮＡ標的をインベージョンするように設計された何千もの異なるＰＮＡ配列を含む混合物中に存在する異なる配列の他のプローブとの分子間ハイブリダイゼーション会合を起こしにくいものと思われる。
表２の最後の２つのプローブは、各々が骨格に１９個の連続するガンマ修飾を有し、ＤＮＡキャプチャに良好に機能し得るが、化学合成収率はガンマ修飾が１０個以下のプローブよりも低い。
Figure 0006937294
一部の形態において、ＰＮＡプローブは、他のキラルＰＮＡ残基を有しないアルファ−Ｄ−リジンＰＮＡ残基のみで構成されるのではない。一部の形態において、ＰＮＡプローブは１１個以上のＰＮＡ残基を有する。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、他のキラルＰＮＡ残基を有しないアルファ−Ｄ−リジンＰＮＡ残基のみで構成されるのではなく、且つ１１個以上のＰＮＡ残基を有する。
ｃ．ＰＮＡプローブの最適化
適用に合わせて最適な組成をカスタマイズすることができる。例えば、一部の形態において、目標がキャプチャされたＤＮＡ配列の最大絶対収率を達成することである場合、５個のガンマ−Ｌ−リジン残基を有する１８塩基ＰＮＡプローブが好ましい。一部の形態において、適用上、最も高い収率でなく、代わりに最も高いエンリッチメント（非標的ＤＮＡと比べて可能な限り高い比率の標的ＤＮＡ）が要求される場合、好ましいプローブは、生じる非特異的配列キャプチャのレベルがより低いものである。従って、一部の形態では、４個のみのガンマ−Ｌ−リジン残基を有する１８塩基ＰＮＡプローブが好ましい。
プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは１０個以上２６個以下のペプチド核酸残基を有する。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは核酸断片内の配列を標的化するように設計される。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは、アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは１つ以上のキャプチャタグを含む。
プローブの一部の形態において、プローブは１６個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む。プローブの一部の形態において、プローブは１８又は１９個のペプチド核酸残基を含む。プローブの一部の形態において、ペプチド核酸残基の３個以上５個以下が荷電部分によって誘導体化されており、荷電部分は、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、荷電部分によって誘導体化されていないペプチド核酸残基の２個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、及びキャプチャタグはビオチンである。プローブの一部の形態において、ペプチド核酸残基の４個がガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡであり、ジエチレングリコールによって誘導体化されているペプチド核酸残基の４個であり、キャプチャタグはビオチンである。プローブの一部の形態において、ペプチド核酸残基の４個はガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡであり、ジエチレングリコールによって誘導体化されているペプチド核酸残基の４個であり、キャプチャタグはビオチンである。
プローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。プローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。プローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。プローブの一部の形態において、あらゆるペプチド核酸残基が部分によって誘導体化されている。
プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは、（ｉ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、（ｉｉ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の１５％以上２８％以下が荷電部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の２個以上７個以下が荷電部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の３、４、５、又は６個が荷電部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の４又は５個が荷電部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていないペプチド核酸残基が少なくとも２個ある。
プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。
プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である。プローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である。
プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の４％以上８５％以下が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の４％以上５０％以下が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の４％以上３５％以下が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の１個以上１９個以下が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の１個以上１５個以下が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の１個以上１０個以下が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の１、２、３、又は４個が中性部分によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の１又は２個が中性部分によって誘導体化されている。
プローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がアルファ、ベータ、又はガンマ炭素で誘導体化されている。プローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがアルファ、ベータ、又はガンマ炭素で誘導体化されている。プローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で誘導体化されている。プローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で誘導体化されている。
プローブの一部の形態において、中性部分の１個以上が短鎖オリゴエチレン部分である。プローブの一部の形態において、中性部分の全てが短鎖オリゴエチレン部分である。プローブの一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである。プローブの一部の形態において、短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである。プローブの一部の形態において、キャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。
プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで２個以上のリジン残基によって誘導体化されている。プローブの一部の形態において、１個以上のペプチド核酸残基はペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する。プローブの一部の形態において、擬似相補的核酸塩基は、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される。
ＰＮＡプローブは概して２つ以上のＰＮＡプローブのセットで共に用いられる。セットの一部の形態では、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中のＰＮＡプローブは、同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、ここで、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なる核酸断片を標的化するように設計される。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの少なくとも１つが本明細書に記載されるとおりのＰＮＡプローブである。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、請求項１１〜４９のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブである。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの少なくとも１つが、（ｉ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、（ｉｉ）アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせを含む。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２個以上６個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている３個以上５個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている２個以上６個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で荷電部分によって独立に誘導体化されている３個以上５個以下のペプチド核酸残基を含む。
セットの一部の形態では、独立に、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で荷電部分によって誘導体化されている。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−又はＤ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１個以上１９個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、アルファ、ベータ、又はガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって独立に誘導体化されている１個以上１９個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、独立に、ＰＮＡプローブの１つ以上において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の１個以上がガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されているペプチド核酸残基の全てがガンマ炭素で短鎖オリゴエチレン部分によって誘導体化されている。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、短鎖オリゴエチレン部分の１個以上がジエチレングリコールである。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、短鎖オリゴエチレン部分の全てがジエチレングリコールである。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てが、独立に、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上２２個以下のペプチド核酸残基を含む。セットの一部の形態では、擬似相補的核酸塩基は、プソイドウリジン（５−リボシルウラシル）；７−デアザ−２’−デオキシグアノシン；２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシド；Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン；２−チオチミジン；２−アミノアデニン；２−アミノプリン−リボシド；２，６−ジアミノプリン−リボシド；２’−デオキシイソグアノシン；及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンからなる群から独立に選択される。セットの一部の形態では、ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含むＰＮＡプローブの１つ以上が、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットである。
セットの一部の形態では、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットは、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットを含む。セットの一部の形態では、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットが、１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される１つ以上のＰＮＡプローブのセット中のＰＮＡプローブのサブセットからなる。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、キャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、キャプチャタグはビオチン又はストレプトアビジンである。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上が、末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで２個以上のリジン残基によって誘導体化されている。
セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、６番染色体のＭＨＣ領域に位置するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化し、ここで、疾患又は病態は、自己免疫疾患、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、並びに癌からなる群から選択される。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、自己免疫疾患の疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、異なる白血球サブセットの分化に関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、ヒトミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、イヌミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上又は全てが、細菌、古細菌、真菌、原虫、又はこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の寄生虫のゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する。セットの一部の形態では、寄生虫の１つ以上又は全てが、ヒト口腔、ヒト気道、ヒト泌尿生殖器管、ヒト血液、又はヒト糞便に存在する細菌の１つ以上の種である。
ＰＮＡプローブの任意のセット、群、混合物、又は集合において、そのセット、群、混合物、又は集合中のＰＮＡプローブの全て又は一部が指定される特性を有し得る。即ち、ＰＮＡプローブの特徴又は特性が指定されるとき、セット、群、混合物、又は集合中のプローブの全てが指定される特徴又は特性を有する必要はない。概して、ＰＮＡプローブのあるセット、群、混合物、又は集合について特徴又は特性が指定されるとき、ＰＮＡプローブの全て又は実質的に全てが指定される特徴又は特性を有することになる。しかしながら、ある一部のＰＮＡプローブは指定される特徴又は特性を欠いてもよく、又はそれについて異なる値を有してもよい。例えば、ＰＮＡプローブの任意のセット、群、混合物、又は集合において、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が指定される特徴又は特性を有し得る。かかる多様性は偶然でも、又は意図的でも、いずれであってもよい。これは、ＰＮＡプローブの任意の特徴又は特性、又は特徴及び特性の組み合わせに適用される。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブは、開示される特徴又は特性の２つ以上によって組み合わせで特徴付けることができる。例えば、ＰＮＡプローブは、ＰＮＡプローブにおける残基、部分によって誘導体化されている残基、荷電部分によって誘導体化されている残基、中性部分によって誘導体化されている残基、部分によって誘導体化されていない残基、部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、荷電部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、中性部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、部分によって誘導体化されていないプローブ中の残基の平均、部分によって誘導体化されていないフランキング残基、荷電部分によって誘導体化されていないフランキング残基、中性部分によって誘導体化されていないフランキング残基、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基、中性部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、中性部分によって誘導体化されていない残基、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均、中性部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、中性部分によって誘導体化されていない残基の平均、部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の割合、荷電部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の割合、中性部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の割合、部分によって誘導体化されていないプローブ中の残基の割合、荷電部分によって誘導体化されていないプローブ中の残基の割合、中性部分によって誘導体化されていないプローブ中の残基の割合の任意の２つ以上の特定の値、範囲、又は両方を有するものとして特徴付けることができる。かかる組み合わせは、互いに矛盾しない特性及び値に限定されることが理解される。
例えば、ＰＮＡプローブ又はＰＮＡプローブのセットは、例えば、ＰＮＡプローブ中の残基、荷電部分によって誘導体化されている残基、及び中性部分によって誘導体化されている残基；ＰＮＡプローブ中の残基、荷電部分によって誘導体化されている残基、中性部分によって誘導体化されている残基、及び荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基；ＰＮＡプローブ中の残基、荷電部分によって誘導体化されている残基、中性部分によって誘導体化されている残基、及び荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均；ＰＮＡプローブ中の残基、荷電部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、及び中性部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均；ＰＮＡプローブ中の残基、荷電部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、中性部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、及び荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基；又はＰＮＡプローブ中の残基、荷電部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、中性部分によって誘導体化されているプローブ中の残基の平均、及び荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均の特定の値、範囲、又は両方の組み合わせによって特徴付けることができる。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１６、１７、１８、１９、又は２０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１８又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、ＰＮＡプローブ中には残基が１９個あり得る。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１５、１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１６、１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１７、１８、又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１８又は１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１１又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が９、１０、又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が１０又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されている残基が９又は１０個あり得る。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が８又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が４又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が３又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、又は６個あり得る。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１６又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が４、５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が５又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、中性部分によって誘導体化されている残基が２、３、４、５、又は６個あり得る。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１３、１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１４、１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１５、１６、又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１６又は１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が４、５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５、６、７、８、９、又は１０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が５又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、又は６個あり得る。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２０％以上８０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、又は６６％以上、独立に、及び任意の組み合わせで、３０％、３１％、２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１６％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上９０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１７％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上８５％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１８％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上８０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１９％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上７５％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２０％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上７０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２１％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上６８％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２２％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上６６％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２３％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上６４％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２４％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上６２％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２５％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上６０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２６％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上５８％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２７％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上５６％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２８％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上５４％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２９％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上５２％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３０％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上５０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３１％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上４８％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３２％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上４６％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３３％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上４４％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３４％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上４２％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３５％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上４０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３６％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３８％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３７％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３６％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３８％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３４％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４０％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３２％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４１％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３０％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４２％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２８％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４３％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２６％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４４％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２４％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４５％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２２％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約４６％以上１００％以下が部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２０％以下が部分によって誘導体化されている。
例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）の残基の５２．６％が部分によって誘導体化されており、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）の残基の４７．４％が部分によって誘導体化されており、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）の残基の５２．６％が部分によって誘導体化されている。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上４０％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２０％以上３３％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、又は４０％以上、独立に、及び任意の組み合わせで、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、又は４０％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、又は４０％が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１６％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３４％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１７％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３３％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１８％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３２％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１９％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３１％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２０％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上３０％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２１％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２９％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２２％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２８％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２３％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２７％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２４％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２６％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２５％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２６％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２４％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２７％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２３％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２８％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２２％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２９％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２１％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３０％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上２０％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３１％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上１９％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３２％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上１８％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３３％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上１７％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約３４％以上３５％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約１５％以上１６％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２０％以上３４％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２１％以上３４％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２１％以上３３％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２２％以上３３％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２３％以上３３％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２３％以上３２％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２４％以上３２％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２５％以上３２％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２５％以上３１％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２６％以上３１％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２６％以上３０％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２７％以上３０％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２７％以上２９％以下が荷電部分によって誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プローブ中の残基の平均約２８％以上２９％以下が荷電部分によって誘導体化されている。
例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）の残基の２６．３％が荷電部分によって誘導体化されており、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）の残基の２６．３％が荷電部分によって誘導体化されており、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）の残基の２１．１％が荷電部分によって誘導体化されている。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されていない（即ち、部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０又は１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０個あり得る。例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）合計０個のフランキング残基を有し、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）合計２個のフランキング残基を有し、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において部分によって誘導体化されていない）合計２個のフランキング残基を有する。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が０、１、又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が３又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が２又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が１又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が０又は１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に部分によって誘導体化されていない残基が０個あり得る。
例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）はＮ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に部分によって誘導体化されていない０個の残基を有し、且つＣ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に部分によって誘導体化されていない０個の残基を有し、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）はＮ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に部分によって誘導体化されていない１個の残基を有し、且つＣ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に部分によって誘導体化されていない１個の残基を有し、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）はＮ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に部分によって誘導体化されていない２個の残基を有し、且つＣ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に部分によって誘導体化されていない０個の残基を有する。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、５、６、７、又は８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０、１、又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０又は１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計０個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計８個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）フランキング残基が合計９個あり得る。例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）合計０個のフランキング残基を有し、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）合計２個のフランキング残基を有し、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、荷電部分によって誘導体化されていない（即ち、末端近位誘導体化残基の両方とプローブのそのそれぞれの末端との間において荷電部分によって誘導体化されていない）合計２個のフランキング残基を有する。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、３、４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３、４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４、５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が５、６、又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４、５、又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３、４、又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２、３、又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０、１、又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が６又は７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が５又は６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４又は５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３又は４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２又は３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１又は２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０又は１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が７個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が６個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が５個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１個あり得る。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されている末端近位残基の各々とプローブのそのそれぞれの末端との間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が０個あり得る。
例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、Ｎ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に荷電部分によって誘導体化されていない０個の残基を有し、且つＣ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に荷電部分によって誘導体化されていない０個の残基を有し、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、Ｎ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に荷電部分によって誘導体化されていない１個の残基を有し、且つＣ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に荷電部分によって誘導体化されていない１個の残基を有し、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、Ｎ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に荷電部分によって誘導体化されていない２個の残基を有し、且つＣ端側末端とその末端近位誘導体化残基との間に荷電部分によって誘導体化されていない２個の残基を有する。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が０、１、２、又は３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が０、１、又は２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が３又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が２又は３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が１又は２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が０又は１個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が１個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が０個ある。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１、２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１、２、又は３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１又は２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない１、２、３、又は４個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない１、２、又は３個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない１又は２個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない１個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない２個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない３個以下の残基がある。
例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、異なる位置において、部分によって誘導体化されている残基の間に部分によって誘導体化されていない０、１、又は２個の残基を有し、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、異なる位置において、部分によって誘導体化されている残基の間に部分によって誘導体化されていない０、１、又は２個の残基を有し、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、異なる位置において、部分によって誘導体化されている残基に部分によって誘導体化されていない０又は１個の残基を有する。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、５、又は６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２、３、４、５、又は６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、４、又は５個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３、４、５、又は６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４、５、又は６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、又は、３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４、５、又は６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３、４、又は５個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１、２、又は３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が５又は６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４又は５個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２又は３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１又は２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が６個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が５個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が１個ある。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１、２、３、４、又は５個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１、２、３、又は４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１、２、又は３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１又は２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも１個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも２個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも３個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない残基が少なくとも４個ある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１、２、３、４、５、又は６個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１、２、３、４、又は５個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１、２、３、又は４個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１、２、又は３個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１又は２個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない２個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない３個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない４個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない５個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない６個以下の残基がある。
例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は、異なる位置において、荷電部分によって誘導体化されている残基の間に荷電部分によって誘導体化されていない３又は４個の残基を有し、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は、異なる位置において、荷電部分によって誘導体化されている残基の間に荷電部分によって誘導体化されていない２、３、又は４個の残基を有し、及びプローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は、異なる位置において、荷電部分によって誘導体化されている残基の間に荷電部分によって誘導体化されていない３又は４個の残基を有する。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない平均約０．４個以上１．６個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない平均約０．５個以上１．５個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない平均約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、又は１．５個以上０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、又は１．６個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に部分によって誘導体化されていない平均約０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５０、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１．００、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２０、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３０、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４０、１．４１、０１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、又は１．５９個以上０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５０、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１．００、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２０、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３０、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４０、１．４１、０１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、又は１．６０個以下の残基がある。
あらゆる誘導体化残基（即ち、部分によって誘導体化されている残基）間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、誘導体化残基間の各ギャップにある残基の数（直接隣接する誘導体化残基間のギャップとしての０を含む）を加え合わせてギャップの数（直接隣接する誘導体化残基間の０長さのギャップを含む）で除すことにより計算し得る。従って、例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は１０個の誘導体化残基間に９個のギャップ（隣接する誘導体化Ｔの間の０長さのギャップを含む）を有し、誘導体化残基間のギャップは長さ１、１、１、２、１、１、０、１、及び１である。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、９／９＝１となる。別の例として、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は９個の誘導体化残基間に８個のギャップ（隣接する誘導体化Ｔ及びＣの間の０長さのギャップを含む）を有し、誘導体化残基間のギャップは長さ１、１、０、１、１、１、１、及び２である。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、８／８＝１となる。別の例として、プローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は１０個の誘導体化残基間に９個のギャップ（隣接する誘導体化Ｔ及びＣ間の０長さのギャップを含む）を有し、誘導体化残基間のギャップは長さ０、１、１、１、１、１、０、１、及び１である。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、７／９＝０．７８となる。
或いは、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、非誘導体化フランキング残基（即ち、部分によって誘導体化されていないフランキング残基）の数及び誘導体化残基の数をプローブ中の残基総数から減じ、その結果をプローブ中の誘導体化残基より１少ない数で除すことによって計算し得る。従って、例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は１９個の総残基、０個の非誘導体化フランキング残基、及び１０個の誘導体化残基を有する。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、（１９−０−１０）／（１０−１）＝１となる。別の例として、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は１９個の総残基、２個の非誘導体化フランキング残基、及び９個の誘導体化残基を有する。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、（１９−２−９）／（９−１）＝１となる。別の例として、プローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は１９個の総残基、２個の非誘導体化フランキング残基、及び１０個の誘導体化残基を有する。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、（１９−２−１０）／（１０−１）＝０．７８となる。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均約０．９個以上６．０個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均約１．０個以上５．０個以下の残基がある。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均約０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１．００、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２０、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３０、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４０、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２．００、２．０１、２．０２、２．０３、２．０４、２．０５、２．０６、２．０７、２．０８、２．０９、２．１０、２．１１、２．１２、２．１３、２．１４、２．１５、２．１６、２．１７、２．１８、２．１９、２．２０、２．２１、２．２２、２．２３、２．２４、２．２５、２．２６、２．２７、２．２８、２．２９、２．３０、２．３１、２．３２、２．３３、２．３４、２．３５、２．３６、２．３７、２．３８、２．３９、２．４０、２．４１、２．４２、２．４３、２．４４、２．４５、２．４６、２．４７、２．４８、２．４９、２．５０、２．５１、２．５２、２．５３、２．５４、２．５５、２．５６、２．５７、２．５８、２．５９、２．６０、２．６１、２．６２、２．６３、２．６４、２．６５、２．６６、２．６７、２．６８、２．６９、２．７０、２．７１、２．７２、２．７３、２．７４、２．７５、２．７６、２．７７、２．７８、２．７９、２．８０、２．８１、２．８２、２．８３、２．８４、２．８５、２．８６、２．８７、２．８８、２．８９、２．９０、２．９１、２．９２、２．９３、２．９４、２．９５、２．９６、２．９７、２．９８、２．９９、３．００、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、又は５．９個以上０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１．００、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２０、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３０、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４０、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５０、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７０、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８０、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２．００、２．０１、２．０２、２．０３、２．０４、２．０５、２．０６、２．０７、２．０８、２．０９、２．１０、２．１１、２．１２、２．１３、２．１４、２．１５、２．１６、２．１７、２．１８、２．１９、２．２０、２．２１、２．２２、２．２３、２．２４、２．２５、２．２６、２．２７、２．２８、２．２９、２．３０、２．３１、２．３２、２．３３、２．３４、２．３５、２．３６、２．３７、２．３８、２．３９、２．４０、２．４１、２．４２、２．４３、２．４４、２．４５、２．４６、２．４７、２．４８、２．４９、２．５０、２．５１、２．５２、２．５３、２．５４、２．５５、２．５６、２．５７、２．５８、２．５９、２．６０、２．６１、２．６２、２．６３、２．６４、２．６５、２．６６、２．６７、２．６８、２．６９、２．７０、２．７１、２．７２、２．７３、２．７４、２．７５、２．７６、２．７７、２．７８、２．７９、２．８０、２．８１、２．８２、２．８３、２．８４、２．８５、２．８６、２．８７、２．８８、２．８９、２．９０、２．９１、２．９２、２．９３、２．９４、２．９５、２．９６、２．９７、２．９８、２．９９、３．００、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０個以下の残基がある。
荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均は、荷電部分によって誘導体化されている残基間の各ギャップにある荷電部分によって誘導体化されていない残基の数（直接隣接する荷電部分によって誘導体化されている残基間のギャップとしての０を含む）を加え合わせてギャップの数（直接隣接する荷電部分によって誘導体化されている残基間の０長さのギャップを含む）で除すことにより計算し得る。従って、例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は荷電部分によって誘導体化されている５個の残基間に４個のギャップを有し、誘導体化残基間のギャップは長さ３、４、４、及び３である。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、１４／４＝３．５となる。別の例として、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は荷電部分によって誘導体化されている５個の残基間に４個のギャップを有し、誘導体化残基間のギャップは長さ３、４、３、及び２である。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、１２／４＝３．０となる。別の例として、プローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は荷電部分によって誘導体化されている４個の残基間に３個のギャップを有し、誘導体化残基間のギャップは長さ４、３、及び４である。そのため、あらゆる誘導体化残基間にある、部分によって誘導体化されていない残基の平均は、１１／３＝３．７となる。
或いは、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均は、荷電部分によって誘導体化されていないフランキング残基の数及び荷電部分によって誘導体化されている残基の数をプローブ中の残基総数から減じ、その結果をプローブ中の荷電部分によって誘導体化されている残基より１少ない数で除すことによって計算し得る。従って、例えば、プローブＴ＊ｇＴｇＣ＊ｃＴｃｃＣ＊ｇＴｔＴＴ＊ｇＴｃＣ＊（配列番号６）は１９個の総残基、０個の荷電部分によって誘導体化されていないフランキング残基、及び５個の荷電部分によって誘導体化されている残基を有する。そのため、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均は（１９−０−５）／（５−１）＝３．５となる。別の例として、プローブｃＴ＊ｔＣａＴ＊ＣｔＣｇＴ＊ｃＴａＣ＊ａａＴ＊ａ（配列番号１０）は１９個の総残基、２個の荷電部分によって誘導体化されていないフランキング残基、及び５個の誘導体化残基を有する。そのため、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均は（１９−２−５）／（５−１）＝３．０となる。別の例として、プローブａｇＴ＊ＣｇＴｔＣ＊ｔＴｃＴ＊ａＴＣａＴ＊ｃＴ（配列番号２０）は１９個の総残基、４個の荷電部分によって誘導体化されていないフランキング残基、及び４個の荷電部分によって誘導体化されている残基を有する。そのため、荷電部分によって誘導体化されているあらゆる残基間にある、荷電部分によって誘導体化されていない残基の平均は（１９−４−４）／（４−１）＝３．７となる。
ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、０、１、又は２個のプリン残基が誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、０又は１個のプリン残基が誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、独立に、０個のプリン残基が誘導体化されている。ＰＮＡプローブの一部の形態において、プリン残基は誘導体化されていない。
ＰＮＡプローブの電荷及び長さに加えて、ｍｉｎｉＰＥＧ修飾キラル残基の含有量も任意の所与の適用向けに最適化することができる。一部の形態において、最適な１８−ｍｅｒ ＰＮＡプローブは３、４、又は５個のガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を有し得る。詳細な形態において、４個のガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ残基の使用が収率と選択性との間の最適な妥協である。
例示的な形態において、ＰＮＡプローブは１８又は１９塩基を含む。好ましくは、プローブは、荷電アミノ酸側鎖を有する３又は４又は５個の残基を含有し、最も好ましくは荷電アミノ酸側鎖を有する４又は５個の残基を含有する。好ましくは、プローブは、ｍｉｎｉ−ＰＥＧを有する１又は２又は３又は４又は５又は６又は７又は８又は９又は１０又は１１又は１２又は１３又は１４個の残基を含有する。プローブ性能は、ハイブリダイゼーション、例えば特異的核酸配列に対するプローブの特異性及び／又は親和性に関係し得る。一部の形態において、プローブ性能は荷電アミノ酸残基の含有量に直接関連するか、ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を有する残基の含有量に直接関連するか、又は荷電アミノ酸を有する残基の含有量及びｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を有する残基の含有量に直接関連する。例えば、荷電アミノ酸側鎖を有する残基が多く存在するほど、荷電アミノ酸側鎖を有する残基が少ない均等なＰＮＡプローブと比べてプローブの特異的ハイブリダイゼーションが増加し得る。一部の形態において、荷電アミノ酸側鎖を有する残基の存在は、ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を有する残基の存在と比べてプローブ性能に一層大きい影響を及ぼす。
幾つかのＬ−リジン又は幾つかのＬ−チアリジン残基を含有する１８塩基ＰＮＡプローブの好ましい組成の非限定的な例を以下の表３に示す。
Figure 0006937294
ｄ．例示的ＰＮＡプローブ
各ＰＮＡプローブ内の核酸のプローブ用配列が、各プローブがハイブリダイズすることになる核酸配列を定義する。従って、各プローブのプローブ用配列核酸塩基配列が、記載される方法により定義されるとおりプローブにハイブリダイズするとエンリッチされることになる、プローブ領域によって標的化される相補核酸配列（例えばゲノムＤＮＡ断片）を定義する。
ＰＮＡプローブの例示的核酸塩基プローブ用配列を表４に提供する。
Figure 0006937294
Figure 0006937294
２．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）も記載される。一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブによる二本鎖ＤＮＡインベージョンを促進することができる。
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、二本鎖ＤＮＡ−ＰＮＡ複合体の安定性を増加させることができる。例えば、ＳＳＢは従来の（アキラル）ＰＮＡプローブによるハイブリダイゼーションを促進することができる（Ｉｓｈｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｉｓｈｉｚｕｋａ＆Ｔｅｄｅｓｃｈｉ，２００９）。ＰＮＡ及びＳＳＢは、ＰＮＡに結合していない一本鎖ＤＮＡを安定化させる二本鎖ＤＮＡ−ＰＮＡ−ＳＳＢ複合体を形成する。従って、細菌性一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含有する反応緩衝液を使用すると、標的ＤＮＡの一方の鎖のみとハイブリダイズするＰＮＡプローブによるＰＮＡストランドインベージョンの効率及び特異性が向上する。例示的ＳＳＢタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）を含めた生物に由来する。２Ｍの最終濃度となる一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）。溶液中のＳＳＢ濃度は、実験の必要性に応じて最適化することができる。ＳＳＢは、ＳＩＧＭＡ（カタログ番号：Ｓ３９１７）など、幾つもの供給元から市販されている。典型的には、ＳＳＢは約０．０１μＭ〜１００μＭ（端点を含む）の濃度で存在する。好ましいＳＳＢ濃度は２〜３μＭである。
３．核酸試料
本開示の方法について、試料は、概して、核酸試料が採取及び入手される任意の方法及び方式で採取及び／又は入手されてもよい。
「試料」とは、核酸の任意の抜き取りが意図される。本開示の方法では任意の核酸試料を使用することができる。好適な核酸試料の例としては、ゲノム試料、ｍＲＮＡ試料、ｃＤＮＡ試料、核酸ライブラリ（ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリを含む）、全細胞試料、環境試料、培養試料、組織試料、体液、及び生検試料が挙げられる。多数の他の核酸試料供給源が公知であり、又は開発することができ、及び本開示の方法では任意のものを使用することができる。本開示の方法での使用に好ましい核酸試料は、ゲノムＤＮＡの酵素的又は機械的切断によって作成されるゲノム試料及びｄｓＤＮＡライブラリなど、複雑性の高い核酸試料である。
様々な身体試料又は細胞試料の採取方法及び核酸の抽出方法が当該技術分野において周知である。例えば、核酸は、核酸を含有する細胞、組織、又は体液から入手することができる。身体試料の例としては、限定はされないが、血液、リンパ液、尿、婦人科的体液、及び生検が挙げられる。体液には、血液、尿、唾液、又は任意の他の体分泌又はその派生物が含まれ得る。血液には、全血、血漿、血清、又は任意の血液派生物が含まれ得る。試料には、スワブ及び洗液からの細胞、特に真核細胞又は生検からの組織が含まれ得る。試料は、例えば、針を使用してある範囲を掻き取り、洗浄し、又は拭き取って体液を吸引することによるか、又は組織試料を取り出す（即ち、生検）ことによるのを含め、種々の技法によって対象から入手することができる。
一部の形態において、核酸試料はヒトゲノムＤＮＡなどのゲノムＤＮＡである。ヒトゲノムＤＮＡは複数の商業的供給元（例えば、Ｃｏｒｉｅｌｌ ＃ＮＡ２３２４８）から入手可能である。典型的には、ゲノムＤＮＡ核酸試料は未変性ｄｓＤＮＡを含む。従って、試料は、完全に変性したことがない（即ち、変性したことがないＤＮＡ）か又は実質的又は部分的に変性したことがない（即ち、実質的に変性したことがないＤＮＡ）ｄｓＤＮＡを含めた非変性ＤＮＡ、又は変性ＤＮＡと非変性ＤＮＡとの混合物を含み得る。一部の形態において、核酸試料には、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの混合物を含み得る非天然ＤＮＡ（即ち合成ＤＮＡ）が含まれる。核酸断片は、大型核酸分子のセグメントである。核酸断片とは、本開示の方法において用いられるとき、概して切断されている核酸分子を指す。核酸切断試薬と共にインキュベートされた核酸試料は消化試料と称される。制限酵素を使用して消化した核酸試料は消化試料と称される。従って、核酸試料は、ヒトゲノムＤＮＡ（ヒト核酸及びミトコンドリアＤＮＡを含む混合物を含む）などのゲノムＤＮＡであるか、又はその任意の消化若しくは切断試料であってもよい。一部の形態において、核酸試料は１つ以上の目的のゲノムＤＮＡ断片を含有する。例示的核酸断片は、約２ｋｂ、約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約２５ｋｂ、約３０ｋｂ、約３５ｋｂ、又は約４０ｋｂの長さを有する。
Ｂ．キット
上記に記載される材料並びに他の材料は、本開示の方法の実施、又はその性能の促進に有用なキットとして任意の好適な組み合わせで共にパッケージ化することができる。これは、所与のキットにおけるキット構成要素が本開示の方法において共に使用するように設計され、適合される場合に有用である。例えば、本開示の方法に係る長い二本鎖ＤＮＡ鎖の配列特異的キャプチャ及びエンリッチメント用のキットが開示される。典型的には、キットは、ＤＮＡ配列に特異的なＰＮＡプローブの１つ以上のセットを含む。例えば、あるゲノムについての１つ以上の特異的ＤＮＡ配列の同時キャプチャ用のキットは、各プローブがそのゲノム内の一致する標的配列と相補的な、対応するＰＮＡハイブリダイゼーションプローブの複数の異なるセットを含む。一部の形態において、ゲノムＤＮＡキャプチャ用のキットは、所望のゲノムＤＮＡ断片をキャプチャするようにカスタム設計されたＰＮＡハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを含むようにカスタマイズすることができる。
キットは、ＤＮＡを断片化するための任意の手段を含み得る。ＤＮＡの断片化装置は当該技術分野において公知であり、Ｃｏｖａｒｉｓ集束超音波処理器などの超音波処理器が挙げられる。
キットはまた、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体のキャプチャ及びアフィニティー精製に好適な装置も含み得る。好適な装置にはアフィニティー結合カラムが含まれ得る。アフィニティー結合カラムは、１つ以上のＰＮＡハイブリダイゼーションプローブ上のキャプチャタグに特異的なキャプチャドックとカップリングした好適な基材マトリックスを含み得る。好ましくは、アフィニティー結合カラムは、断片の洗浄及び取り扱いの簡略化を促進し、及び本方法の全て又は一部の自動化を可能にする。キットはまた、標的ＤＮＡ／ＰＮＡ複合体から望ましくない反応成分を洗い流し、又は他の方法で分離する好都合な手段を提供する任意の他の装置も含み得る。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体と未結合ＰＮＡプローブとを分離するための例示的材料は、例えばビーズの形態のポリアクリルアミドである。未結合ＰＮＡプローブの分離に好適なポリアクリルアミドビーズは、複数の商業的供給元から入手可能である（例えば、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ１００、ＢｉｏＲａｄから入手可能、カタログ番号１５０−４１７０）。従って、キットは、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ１００を含有するカラムを含み得る。
キットは、薄膜又はメンブレン、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、織り繊維、異形ポリマー、粒子及びマイクロパーティクルを含めた任意の有用な形態の基材を含有し得る。一部の形態において、キットは磁気ビーズの形態の基材、例えば、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ２８０ストレプトアビジン、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能、カタログ番号１１２．０５Ｄ；１１２．０６Ｄ又は６０２．１０）を含む。キットはまた、核酸のカップリング、結合した複合体の洗浄及び基材からの核酸の溶出に必要な緩衝液及び試薬も含み得る。カップリング及び洗浄用の例示的な緩衝液としては、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌが挙げられる。キットはまた、複数の供給元から市販されている他の緩衝液及び試薬も含み得る（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｋｉｌｏｂａｓｅ ＢＩＮＤＥＲ（商標）キット、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能、カタログ番号６０１０１）。磁気ビーズが用いられる場合、キットはまた、磁石など、磁気ビーズの分離に好適な手段も含み得る。
キットはまた、当該技術分野で確立されている任意の方法に係る基材へのキャプチャドックの固定化及びカップリングに必要な化学的試薬も含み得る。
例示的取り付け用薬剤としては、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド類、塩化トシル、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシド類及びマレイミド類が挙げられる。
本開示のキットはまた、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）も含み得る。ＳＳＢは容器内にアリコートとして提供されてもよく、標的ＤＮＡと配列特異的ＰＮＡとの間の相互作用によって形成される複合体を安定化させるのに十分な量であり得る。
一部の形態において、キットは、特異的ゲノム、例えばヒトゲノムの１つ以上の構成成分の標的特異的エンリッチメントに好適な試薬の１つ以上のセットを含むように設計される。記載されるキットを使用して標的化し、エンリッチすることのできる例示的ヒトゲノムＤＮＡには、ＭＨＣ領域に位置するＤＮＡが含まれる。例えば、詳細な形態において、キットは、６番染色体の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）領域に位置する最大７メガベースのヒトゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。
一部の形態において、キットは、１つ以上の特定の免疫学的特徴又は表現型に関連することが知られているＭＨＣのゲノム成分をキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。例示的な免疫学的特徴又は表現型としては、自己免疫疾患素因を有すること、又は自己免疫疾患症状を示すことが挙げられる。従って、一部の形態において、キットは、配列変異が自己免疫疾患などの免疫学的特徴と関連付けられる領域を含むゲノムＤＮＡを選択的にエンリッチするＰＮＡプローブを含む。自己免疫疾患に関係する配列変異と関連付けられる例示的遺伝子としては、とりわけ、ＤＲＢ１及びＤＱＡ１遺伝子が挙げられる。従って、一部の形態において、キットは、ＤＲＢ１遺伝子、又はＤＲＢ１遺伝子の断片を含むゲノムＤＮＡ断片をエンリッチするＰＮＡプローブを含む。一部の形態において、キットは、ＤＱＡ１遺伝子、又はＤＱＡ１遺伝子の断片を含むゲノムＤＮＡ断片をエンリッチするＰＮＡプローブを含む。一部の形態において、キットは、ＤＱＡ１遺伝子、又はＤＱＡ１遺伝子の断片及びＤＲＢ１遺伝子、又はＤＲＢ１遺伝子の断片を含むゲノムＤＮＡ断片をエンリッチするＰＮＡプローブを含む。例示的ゲノム標的領域は９０，０００塩基長であり、ゲノム座標ｃｈｒ６：３２５２２９８１〜３２６１２９８１（ヒトゲノムビルドｈｇ１９を基準とした座標）にわたる。一部の形態において、６番染色体の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）領域に位置するヒトゲノムＤＮＡをエンリッチするキット、例えば、ＤＲＢ１及びＤＱＡ１遺伝子を標的化するキットは、配列番号６〜２３の核酸塩基プローブ用配列を有する１つ以上のプローブを含む。
一部の形態において、キットは、ヒトＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３、調節性Ｔ細胞に発現する）プロモーターの−２２，０００塩基上流から始まってＦＯＸＰ３プロモーターの１８，０００塩基下流で終わる領域にわたる４０，０００塩基ウィンドウを標的化する。従って、一部の形態においてキットは、ＦＯＸＰ３遺伝子、又はＦＯＸＰ３遺伝子の断片を含むヒトゲノムＤＮＡを標的化する。例示的ゲノム標的領域は、ゲノム座標ｃｈｒＸ：４９１０３２８８〜４９１４３２８８（ヒトゲノムビルドｈｇ１９を基準とした座標）にわたる配列である。この領域からのゲノムＤＮＡをエンリッチするための例示的キットは、ゲノム内で互いに平均５，７１４塩基対離れている合計７個のプローブを使用する。一部の形態において、ヒトＦＯＸＰ３プロモーターの領域に位置するヒトゲノムＤＮＡをエンリッチするキットは、配列番号２４〜３０の核酸塩基プローブ用配列を有する１つ以上のプローブを含む。一部の形態において、ＦＯＸ３遺伝子及びＦＯＸ３遺伝子の成分を標的化するキットは、配列番号２４〜３０の核酸塩基プローブ用配列を有する７つのＰＮＡプローブを含む。
一部の形態において、キットは、１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有する（即ち、疾患リスクと関連付けられる）遺伝要素をキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。例示的疾患は、自己免疫疾患、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、並びに癌である。例えば、詳細な形態において、キットは、異なる位置に位置し、且つ自己免疫疾患の疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる最大４０メガベースのヒトゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。一部の形態において、キットは、異なる位置に位置し、且つ糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる最大４０メガベースのヒトゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。一部の形態において、キットは、異なる位置に位置し、且つ異なる白血球サブセットの分化に関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる最大５０メガベースのヒトゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。例えば、一部の形態において、キットは、ＩＩ型糖尿病などの重大な疾患に関連するエンハンサークラスターをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。膵島でエンリッチされる強力な発現を有する遺伝子の近くにマッピングされた３，６７７個のエンハンサークラスターが同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ｆｅｂ；４６（２）：１３６−４３（２０１４））。従って、一部の形態において、キットは、クラスター内の全てのエンハンサーを包含するように３０，０００〜１５０，０００塩基対のゲノムＤＮＡウィンドウをキャプチャするＰＮＡプローブを含む。例えば、キットは、各クラスター内で互いから５，０００〜７，０００塩基の平均距離にあるユニーク配列のＰＮＡプローブを含み得る。
一部の形態において、キットは、ミトコンドリアＤＮＡなど、単一のゲノムからの、又は同じ若しくは異なる種由来の２つ以上のゲノムの混合物からのゲノムＤＮＡのサブセット全体をキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。例えば、詳細な形態において、キットは、ヒトミトコンドリアゲノム全体をキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。一部の形態において、ヒトミトコンドリアゲノムの一部又は全てに対応するヒトゲノムＤＮＡをエンリッチするキットは、配列番号３１〜３４の核酸塩基プローブ用配列を有する１つ以上のプローブを含む。一部の形態において、ヒトミトコンドリアゲノムの一部又は全てに対応するヒトゲノムＤＮＡをエンリッチするキットは、配列番号３１〜３４の核酸塩基プローブ用配列を有する４つのＰＮＡプローブを含む。
一部の形態において、キットは、イヌミトコンドリアゲノム全体をキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。一部の形態において、キットは、ネコミトコンドリアゲノム全体をキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。更なる形態において、キットは、細菌、古細菌、真菌、原虫、又はこれらの２つ以上の混合物の１つ以上の種のゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。従って、キットは、ヒト口腔内に存在する細菌の１つ以上の種、ヒト気道内に存在する又はヒト泌尿生殖器管内に存在する又はヒト血液若しくは糞便中に存在することが知られる細菌の１つ以上の種のゲノムＤＮＡをキャプチャするためＰＮＡプローブ及び／又は他の試薬を含み得る。例えば、詳細な形態において、キットは、ヒト口腔内に存在する細菌の２０以上の種のゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。更なる形態において、キットは、ヒト糞便中に存在する細菌の２０以上の種のゲノムＤＮＡをキャプチャするように設計されたＰＮＡプローブセットを含む。
Ｃ．混合物
高度な多様性の短いハイブリダイゼーションプローブ分子を使用すると、多くの異なるゲノムＤＮＡドメインの同時キャプチャが可能になることが確立されている。本開示の方法を実施すること又はその実施のため調製することにより形成される混合物が開示される。
１．２つ以上のハイブリダイゼーションプローブの混合物
例えば、特異的ＤＮＡ配列を標的化するように設計されたハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを含む混合物が開示される。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブのセットは、同一でないヌクレオチド配列を標的化する少なくとも２つのプローブを含む。好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブの各々は、ガンマリジンＰＮＡなど、正電荷で修飾された少なくとも１つのＰＮＡと、ガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ ＰＮＡなど、中性短鎖オリゴマーで修飾された少なくとも１つのＰＮＡとを含むＰＮＡプローブである。
少なくとも２つの異なるＰＮＡハイブリダイゼーションプローブを含む混合物が提供される。例えば、この混合物は、単一の目的ゲノムＤＮＡ断片内にある非重複配列と相補的な３つ以上のハイブリダイゼーションプローブを含み得る。例示的ｄｓＤＮＡ断片は、約２ｋｂ、約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約２５ｋｂ、約３０ｋｂ、約３５ｋｂ、又は約４０ｋｂの長さを有する。
詳細な形態において、混合物は、本開示の方法に係る先行のＤＮＡ試料から目的のゲノム領域を選択的にキャプチャするように設計された複数のハイブリダイゼーションプローブを含む。例えば、２つ以上の遺伝子特異的プローブを含む混合物は、ヒトゲノムからの１つ以上の特異的遺伝子を標的化することができる。一部の形態において、混合物は、ヒトゲノムの２０，０００遺伝子のいずれか１つを標的化するように設計されたハイブリダイゼーションプローブのセットを含む。一部の形態において、混合物は、ヒトゲノムの２０，０００遺伝子の２つ以上を標的化するように設計されたハイブリダイゼーションプローブのセットを含む。一部の形態において、混合物は、ヒトゲノムの２０，０００遺伝子の全てを選択的にキャプチャするように設計された約４０，０００のハイブリダイゼーションプローブを含む。一部の形態において、約１８，０００のＰＮＡハイブリダイゼーションプローブのセットが、特定の疾患に関係するエンハンサーを包含するヒトゲノムの６，０００の異なる領域を標的化するように設計される。一部の形態において、約１６の異なるＰＮＡハイブリダイゼーションプローブのセットが、ヒトミトコンドリアＤＮＡを標的化するように設計される。この場合、プローブの高度な多様性を利用することにより、生体試料に複数のミトコンドリアＤＮＡ突然変異が存在する場合であっても１６ｋｂミトコンドリアＤＮＡのキャプチャが確実となる。
単一の混合物中で複数のＰＮＡプローブを使用するためには、セット中の全てのプローブ配列が互いにハイブリダイズ不能であることが好ましい。従って、混合物は、好ましくは、少なくとも３つのミスマッチ塩基、又はより好ましくは少なくとも４つのミスマッチ、又はより好ましくは少なくとも５つのミスマッチ、又は更により好ましくは少なくとも６つのミスマッチを有するＰＮＡプローブ対の組み合わせを含む。
本方法が組成物又は構成成分又は試薬を混合すること又は接触させることを含む場合には常に、本方法の実施によって幾つもの異なる混合物が作り出される。例えば、本方法が３つの混合ステップを含む場合、これらのステップが別々に実施された場合、これらのステップのそれぞれの後にユニークな混合物が形成される。加えて、ステップがどのように実施されたかに関わらず、全てのステップの完了時に混合物が形成される。本開示は、本開示の方法の実施によって得られるこれらの混合物、並びに例えば本明細書に開示される、任意の開示される試薬、組成物、又は構成成分を含有する混合物を企図する。
Ｄ．システム
本開示の方法の実施、又はその性能の促進に有用なシステムが開示される。システムは、概して、構造体、機械、装置などの製品、及び組成物、化合物、材料などの組み合わせを含む。開示される、又は本開示から明らかな、かかる組み合わせが企図される。例えば、核酸試料を処理し、及び配列特異的ｄｓＤＮＡ断片をエンリッチする装置、並びに断片の核酸配列を決定し、任意選択で核酸のメチル化状態を検出するなど二次構造特性を含めて評価する装置を含むシステムが開示及び企図される。別の例として、ゲノム核酸試料を断片化し、並びに特異的核酸断片の配列及び任意選択でメチル化状態を検出する自動装置を含むシステムが開示及び企図される。
１．データ構造及びコンピュータ制御
本開示の方法において用いられる、それによって生成される、又はそれから生成されるデータ構造が開示される。データ構造は、概して、組成物又は媒体において収集、整理、保存、及び／又は具体化された任意の形態のデータ、情報、及び／又はオブジェクトである。例えば、ＲＡＭ又はストレージディスクなどに電子形式で保存された、特異的標的配列又はハイブリダイゼーションプローブ、及びメチル化プロファイル、又は配列と関連メチル化状態とのセットに関連する大型ｄｓＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、一種のデータ構造である。本開示の方法、又はその任意の一部又はその調製は、コンピュータ制御によって制御し、管理し、又は他の形で補助することができる。かかるコンピュータ制御は、コンピュータ制御されたプロセス又は方法によって達成することができ、データ構造を使用及び／又は生成することができ、及びコンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、及びコンピュータプログラムが企図され、及び本明細書に開示されることが理解されなければならない。
用途
本開示の方法及び組成物は、限定はされないが、極めて長い二本鎖ＤＮＡ分子をキャプチャすることによる複数のゲノムＤＮＡ領域のエンリッチメントを含め、数多くの分野に適用可能である。他の用途には、極めて長いＤＮＡ分子のシーケンシング解析及びフェージング化ハプロタイプの作成が含まれる。他の用途には、極めて長いＤＮＡ分子の天然メチル化状態の分析及びフェージング化ヘピタイプの作成が含まれる。他の用途が開示され、本開示から明らかであり、及び／又は当業者によって理解されるであろう。
長いＤＮＡリードの特別な有用性を利用するための長いＤＮＡ分子のキャプチャ方法が提供される。長いＤＮＡ鎖の配列特異的キャプチャは、単一のＤＮＡ鎖、純父性鎖又は代わりに純母性鎖のいずれかに対応する配列アセンブリからなるフェージング化ハプロタイプの構築を可能にする。
従って、本方法は、フェージング化ハプロタイプの作成を含み得る。フェージング化ハプロタイプは、ヒトゲノムの長い距離にわたる遺伝的に決定された変異性の遺伝子連鎖構造に関する価値ある遺伝情報を含む一塩基多型（ＳＮＰ）の秩序付けられたセットを含み得る。
全ゲノムフェージング化ハプロタイプの構築についてこれまでに報告された最も効率的な方法の１つは、統計的手法を用いたロングリードハプロタイピング（ＳＬＲＨ、Ｋｕｌｅｓｈｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４）である。ＳＬＲＨは希釈ハプロタイピングの一形態であり、少数の大きい約７〜１０ｋｂｐ ＤＮＡ断片を別個のプールに入れることを伴う。各プールに、その断片を同定するユニークなバーコードが取り付けられ、次にそれらがフェージングアルゴリズムを用いて短いリード配列から復元され、長いハプロタイプブロックにアセンブルされる。プールされ、バーコードが付加されたＤＮＡ断片のライブラリがシーケンシングされる。シーケンシングされたリードが、次に参照ゲノムとアラインメントされ、バーコードアダプターによって特定されるとおりのその元のウェルにマッピングし戻される。各ウェル内のマッピングされたリードが、同じ断片から来たと考えられるグループにクラスタリングされる。統計的手法による希釈ハプロタイピングの有効性及び精度の向上のため、ハプロタイピングアルゴリズムＰｒｉｓｍが開発された。Ｋｕｌｅｓｈｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ＳＬＲＨを用いて、３つのヒトゲノムにおける一塩基変異の９９％を０．２〜１Ｍｂｐ長の長いハプロタイプブロックにフェージングすることを実証した。
ＳＮＰを長いＤＮＡシーケンシングリードのフェージングによって秩序付けることができるのと全く同じように、理論上、フェージング化「ヘピタイプ」をアセンブルすることが可能である。用語「ヘピタイプ」は、ハプロタイプになぞらえて、ヒトゲノムの比較的長い距離にわたるエピジェネティックに決定された変異性のエピジェネティックな遺伝子連鎖構造に関する価値あるエピジェネティック情報を含む、可変的シトシンメチル化状態のポジション（メチル化又は非メチル化）秩序付けられた組である。ほぼ全ての従来のＤＮＡメチル化シーケンシング技法が、２５０塩基対以下のシーケンシングリードを生じる。
Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）は、Ｒｏｃｈｅ ＦＬＸシステムを利用して一連のＤＮＡメチル化シーケンシング実験を実施し、そこでは平均リード長さが２０４塩基対であったことにより、比較的短い「ヘピタイプ」の構築に十分なフェージングされたメチル化情報を得ることが可能になった。これらのヘピタイプは、結腸癌及び濾胞性リンパ腫における体細胞進化の系統発生トレース研究で有用なデータを提供した。このフェージングされたＤＮＡメチル化情報を用いて、癌細胞でＤＮＡメチル化パターンの改変をもたらした癌発生変化の系統樹が構築された。系統樹は、Ｐｈｙｌｉｐ ３．６９（インターネットサイトｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌ）に実装されているとおりの最大節約法をデフォルトパラメータで用いてフィッティングされた。
最新の研究では、２つの細胞株（ヒト胚性幹細胞及び分化した肺線維芽細胞）からの大規模な短いリードのメチル化データを利用して、ヒトゲノムにわたる何千もの異なるＳＮＰ遺伝子座に関連するフェージング化ヘピタイプが生成された（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。この研究は、亜硫酸水素塩シーケンシングによって得られたデータに基づき、従ってフェージングされたヘピタイプには１００ｂｐより短い距離が含まれた。この研究で見られた最も長いヘピタイプはｃｈｒ１２における８９ｂｐであり、これは、細胞の複製に伴い差次的にメチル化されることも、又はメチル化されないこともある１０個のシトシン位置を含んだ。別の観察されたヘピタイプにはｃｈｒ２の９５塩基対が含まれ、メチル化されることも、又はメチル化されないこともある６個のシトシン位置を含んだ。報告されたヘピタイプは、シーケンシングリードが短いため、従来定義されてきたハプロタイプよりも短い。
記載される本方法に係る長い二本鎖ＤＮＡキャプチャの基本的な特性は、キャプチャ標的配列（及び対応するプローブ）を、典型的には２，０００〜４０，０００塩基対長の範囲の同じ長いＤＮＡゲノムドメイン内に存在する別のものに容易に置換可能であることである。
本開示の方法は、計測、検出、比較、分析、アッセイ、スクリーニング等に基づいた核酸試料、状態等の決定、同定、相関付け等（これらはまとめて「同定」と称することができる）を含む。
例えば、本開示の方法を用いて、ゲノムＤＮＡからのフェージング化ハプロタイプ及びフェージング化ヘピタイプ（エピハプロタイプとも称される）の同定用の核酸配列情報データベースを生成することができる。かかる同定は様々な理由で有用である。例えば、及び詳細には、かかる同定により、行われた特定の同定に基づいた、且つそれと関連性のある具体的な対応を取ることが可能になる。例えば、組織試料中の特定のエピハプロタイプの診断である。特定の例では、特定のエピハプロタイプが、特定の対象における疾患又は病態（及び他の対象におけるその疾患又は病態の診断の欠如）の指標となることができ、その診断に基づいた治療、対応、行為等が有益となり得る対象を同定する極めて有用な効果がある。例えば、同定された対象における特定の疾患又は病態の治療は、かかる同定を行わない（又は同定を考慮しない）あらゆる対象の治療と著しく異なる。治療が必要な、又は治療が有益となり得る対象はそれを受けることになり、治療が必要のない、又は治療が有益でないであろう対象はそれを受けないことになる。
従って、本明細書にはまた、開示される同定に従う、且つそれに基づく特定の対応を取ることを含む方法も開示される。例えば、母性又は父性染色体の長い距離にわたる塩基修飾情報を例えば含む核酸配列情報に基づく同定など、同定のレコードを（物理的な−例えば紙、電子的、又は他の形式などで）作成すること、又は電子データベースなど、データベースを作成することを含む方法が開示される。従って、例えば、本開示の方法に基づき同定のレコードを作成することは、単に計測、検出、比較、分析、アッセイ、スクリーニング等を実施することとは物理的且つ有形的に異なる。かかるレコードは、例えば、他者（編集、処理、カタログ化又は同定に基づく治療、モニタリング、フォローアップ、助言等を行うことができるであろう者など）に伝達すること；後の使用又はレビューのため保持すること；種々の計測、検出、比較、分析、アッセイ、スクリーニング等に基づく対象のセット、治療有効性、同定の精度の評価にデータを使用することなどができる有形の形式で同定を固定することを可能にする点で特に実質的且つ有意である。例えば、同定のレコードのかかる使用は、例えば、同定のレコードを作製した人又は実体と同じ人又は実体によるか、それと異なる人又は実体によるか、又はそれと同じ人又は実体と、異なる人又は実体との組み合わせによってなされてもよい。本開示のレコード作成方法は、本明細書に開示される任意の１つ以上の他の方法、詳細には本開示の同定方法の任意の１つ以上のステップと組み合わせることができる。
別の例として、１つ以上の他の同定に基づき１つ以上の更なる同定を行うことを含む方法が開示される。例えば、特定の診断、治療、モニタリング、フォローアップ、助言等は、他の同定に基づき同定することができる。例えば、試料又は対象が高レベルの特定の成分又は特性を伴う疾患又は病態を有することの指標となり得るＤＮＡメチル化パターンを含め、特定の塩基修飾パターンの同定は、高レベルの成分又は特性に基づく、又はそれに向けられた療法によって治療し得る又は治療すべきである対象として更に同定することができる。かかる更なる同定のレコードを（例えば上記に記載したとおり）作成することができ、及び任意の好適な方法で用いることができる。かかる更なる同定は、例えば、直接他の同定に、かかる他の同定のレコードに、又は組み合わせに基づいてもよい。かかる更なる同定は、例えば、他の同定を行う人又は実体と同じ人又は実体、それと異なる人又は実体、又はそれと同じ人又は実体と、異なる人又は実体との組み合わせによって行われてもよい。更なる同定を行う本開示の方法は、本明細書に開示される任意の１つ以上の他の方法、詳細には本開示の同定方法の任意の１つ以上のステップと組み合わせることができる。
別の例として、本開示の方法による核酸の分析から同定された対象を治療、モニタリング、フォローアップ、助言等することを含む方法が開示される。従って、対象は、対象から採取された核酸試料の本開示の方法のいずれかに従う分析により、治療、モニタリング、フォローアップ、助言等が必要であると同定され得る。例えば、同定に基づき、及び／又は同定のレコードに基づき、特定の治療、モニタリング、フォローアップ、助言等を用いることができる。例えば、高レベルの特定の成分又は特性を伴う疾患又は病態を有すると同定された対象（及び／又はかかる同定のレコードが作製された対象）は、高レベルの成分又は特性に基づく、又はそれに向けられた療法で治療することができる。高レベルの成分の例は、本開示の方法によりキャプチャされ、次にシーケンシングされたミトコンドリアＤＮＡ中の高頻度のヘテロプラスミー（単一の生体試料中における種々の突然変異ＤＮＡ配列の存在）である。高レベルの成分の別の例は、キャプチャされたＤＮＡ断片における高レベルの低メチル化（メチル化の欠損、多くの場合に転写活性化に関連する）である。かかる低メチル化は、例えば、本開示の方法によりキャプチャ及びシーケンシングされることにより塩基修飾が明らかになった特定のヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）配列に対応するキャプチャされたＤＮＡ断片に検出され得る。かかる治療、モニタリング、フォローアップ、助言等は、例えば、直接同定に、かかる同定のレコードに、又は組み合わせに基づくことができる。かかる治療、モニタリング、フォローアップ、助言等は、例えば、同定及び／又は同定のレコードを作製した人又は実体と同じ人又は実体、それと異なる人又は実体、又はそれと同じ人又は実体と、異なる人又は実体との組み合わせによって実施されてもよい。本開示の治療、モニタリング、フォローアップ、助言等の方法は、本明細書に開示される任意の１つ以上の他の方法、詳細には本開示の同定方法の任意の１つ以上のステップと組み合わせることができる。
方法
Ａ．大型配列特異的ｄｓＤＮＡ断片の単離方法
１．ゲノムＤＮＡキャプチャ
ゲノムＤＮＡから、又は同様に良好に、長いＤＮＡ断片で構築されたＤＮＡシーケンシングライブラリから、複数の長い二本鎖ＤＮＡ領域をキャプチャし、単離し、及び特徴付ける方法が開発されている。これらの方法は、ゲノムＤＮＡライブラリなど、ＤＮＡ断片の混合物からの特異的ＤＮＡ配列の精製、又は選択されたＤＮＡ配列クラスの単離を可能にする。これらの方法は、反復ＤＮＡ配列の存在など、ゲノムＤＮＡのマッピング及びシーケンシング上の障害を解消する。
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用されるとおりの用語「モニタリング」は、活性を計測することのできる当該技術分野の任意の方法を指す。
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用されるとおりの用語「提供する」は、当該技術分野において公知の何かに化合物又は分子を加える任意の手段を指す。提供することの例には、ピペット、シリンジ、針、チュービング、銃等の使用が含まれ得る。これは手動であっても、又は自動化されていてもよい。これには、任意の手段によるトランスフェクション又は核酸をディッシュ、細胞、組織、無細胞系に提供する任意の他の手段が含まれてもよく、及びインビトロ又はインビボであってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」には、限定はされないが、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫及び任意の他の生物又は実体が含まれる。対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、雌ウシ、ネコ、モルモット又はげっ歯類）、魚類、鳥類又は爬虫類若しくは両生類であってもよい。対象は、無脊椎動物、より具体的には節足動物（例えば昆虫及び甲殻類）であってもよい。この用語は特定の年齢又は性別を意味しない。従って、雄か雌かに関わらず、成人及び新生児対象、並びに胎児が包含されることが意図される。患者とは、疾患又は障害に罹患している対象を指す。用語「患者」にはヒト及び動物対象が含まれる。
細胞はインビトロであってもよい。或いは、細胞はインビボであってもよく、対象に存在してもよい。「細胞」は、限定はされないが細菌を含めた任意の生物からの細胞であり得る。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。従って、本方法のこの形態によれば、第１の核酸試料と比較したとき、エンリッチ核酸試料ではＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされていることになり得る。本方法のこの形態において、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中のＰＮＡプローブは、同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なる核酸断片を標的化するように設計され、ＰＮＡプローブはそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含む。一部の形態において、キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップはまた、未結合ＰＮＡプローブもキャプチャする。一部の形態において、本方法はまた、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップも含み得る。一部の形態において、本方法はまた、ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップと同時に、キャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブをキャプチャするステップも含み得る。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップ；（ｄ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｅ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。従って、本方法のこの形態によれば、第１の核酸試料と比較したとき、エンリッチ核酸試料ではＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされていることになり得る。本方法のこの形態において、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中のＰＮＡプローブは、同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中のＰＮＡプローブは、異なる核酸断片を標的化するように設計され、ＰＮＡプローブはそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含む。
一部の形態において、本方法は、（ａ）２つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片を、及びキャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブを両方ともにキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；及び（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含む。これらの形態において、未結合ＰＮＡプローブは、キャプチャされた未結合ＰＮＡプローブではなくキャプチャされた核酸断片の溶出によってＰＮＡプローブ結合核酸断片と分離される。キャプチャされた核酸断片の溶出時、未結合ＰＮＡプローブはキャプチャされたまま残る。一部の形態において、ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出するステップは、ＰＮＡプローブからのキャプチャされたｄｓＤＮＡの放出を増進させる１つ以上の薬剤又は条件を加えることにより増進する。
一部の形態において、本方法は、（ａ）請求項６８〜１２８のいずれか一項に記載の２つ以上のＰＮＡプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；（ｂ）ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で反応混合物をインキュベートし、それによりインベージョンＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；（ｃ）キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つキャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；（ｄ）ＰＮＡプローブからキャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップを含むことができ、ここで、ＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片が、第１の核酸試料と比較したとき、エンリッチ核酸試料中でエンリッチされる。
本方法の一部の形態において、ＰＮＡプローブはそれぞれ１つ以上のキャプチャタグを含み、ここで、ＰＮＡプローブの少なくとも１つは、アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基と、アルファ炭素、ベータ炭素、ガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含む。
本方法の一部の形態において、２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブは１８又は１９個のペプチド核酸残基を有し、２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の３個以上５個以下が荷電部分によって誘導体化されており、荷電部分は、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、荷電部分によって誘導体化されていない２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブのペプチド核酸残基の２個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、及び２つ以上のＰＮＡプローブのセットの少なくとも１つにおけるＰＮＡプローブのキャプチャタグはビオチンである。
本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．０個以上５．０個以下のペプチド核酸残基がある。
本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない０個以上２個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの１つ以上において、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。本方法の一部の形態では、ＰＮＡプローブの全てにおいて、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．５個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある。
本方法の一部の形態において、反応混合物は一本鎖結合タンパク質を更に含む。本方法の一部の形態において、第１の核酸試料は配列の複雑度が高い。本方法の一部の形態において、第１の核酸試料は二本鎖ＤＮＡを含む。本方法の一部の形態において、二本鎖ＤＮＡは完全に変性されたことがないか、又は実質的に変性されたことがない。本方法の一部の形態において、第１の核酸試料はゲノムＤＮＡを含む。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸断片は少なくとも２，０００塩基対の平均長さを有する。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸断片は少なくとも１０，０００塩基対の平均長さを有する。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸断片は少なくとも１５，０００塩基対の平均長さを有する。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸断片の各々が少なくとも２，０００塩基対の長さを有する。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸断片の各々が少なくとも１０，０００塩基対の長さを有する。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸断片の各々が少なくとも１５，０００塩基対の長さを有する。
本方法の一部の形態において、ＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片はエンリッチ核酸試料中の核酸断片の少なくとも９０％を占める。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸試料は５０：１〜１５０：１の標的対非標的核酸断片のモル比を含む。一部の形態において、本方法は、ステップ（ｂ）の後及びステップ（ｃ）の前に反応混合物から未結合ＰＮＡプローブを取り除くステップを更に含む。一部の形態において、本方法は、ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップと同時に、キャプチャタグによって未結合ＰＮＡプローブをキャプチャするステップを更に含む。
本方法の一部の形態において、ステップ（ｄ）において結合した核酸断片を溶出させるステップは、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われる。本方法の一部の形態において、ステップ（ｄ）において結合した核酸断片を溶出させるステップは、ｐＨを上昇させることによる荷電部分の脱プロトン化によって行われる。
一部の形態において、本方法は、エンリッチ核酸試料中の核酸断片の１つ以上を増幅するステップを更に含む。本方法の一部の形態において、エンリッチ核酸試料中の実質的に全ての核酸断片が増幅される。本方法の一部の形態において、核酸断片は全ゲノム増幅によって増幅される。
本方法の一部の形態において、核酸試料はＩＬＬＵＭＩＮＡ−ＭＯＬＥＣＵＬＯ（登録商標）アダプターがライゲートされた核酸断片を含む。本方法の一部の形態において、核酸試料は、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製の１つ以上のプロトコルに従い末端修復及び精製された核酸断片を含む。本方法の一部の形態において、核酸試料はＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターがライゲートされた核酸断片を含む。一部の形態において、本方法は、ステップ（ｃ）の後及びステップ（ｄ）の前に、ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターをキャプチャされた核酸にライゲートするステップを更に含む。
また、キットも開示される。一部の形態において、本キットは、本明細書に記載されるとおりのＰＮＡプローブのセットと；本明細書に記載されるとおりの方法の一形態の実施に関する説明書とを含み得る。一部の形態において、本キットは、本方法における１つ以上のステップを実施するための１つ以上の酵素又はタンパク質を更に含み得る。
本方法は、標的核酸を変性させる条件の必要なしに行うことができる。従って、一部の形態において、本方法は、完全に変性されたことがないか又は実質的に若しくは部分的に変性されたことがないＤＮＡを含め、非変性ｄｓＤＮＡである標的ＤＮＡをエンリッチする。標的ＤＮＡがインタクトな二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の長い断片を含むとき、本方法は、エンリッチされたｄｓＤＮＡの天然のメチル化状態及び天然のコンホメーションを含め、ＤＮＡの天然状態を維持しているｄｓＤＮＡをエンリッチする。
配列エンリッチメント方法はスタンドアロン手順として行うことができ、或いは連続的に、又はＤＮＡライブラリのシーケンシング手順及び／又はＤＮＡライブラリの調製手順など、他の手順の範囲内で行われるように実現し、及び適合させることができる。例えば、一部の形態において、記載される配列エンリッチメント方法は、既存のライブラリ調製及び／又は選択的シーケンシング技術のワークフローの範囲内で実現することができる。一部の形態において、標的配列エンリッチメント方法は、標準的なＤＮＡシーケンシング機器におけるシーケンシング用のＤＮＡライブラリ調製のワークフローに組み込まれる。
典型的には、本方法は、核酸試料からの標的配列の少なくとも７５％、例えば、標的配列の８０％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％、最も好ましくは９７％、９８％、９９％又は１００％の特異的エンリッチメントを可能にする。典型的には本方法は、１：５０を上回る、例えば１：７５、１：１００又は１：１００超などの標的対非標的配列比を有するエンリッチ試料を提供する。
方法ステップの各々を以下で更に詳細に考察する。
ｉ．核酸試料の調製
本明細書に記載される方法のいずれも、核酸試料の調製ステップを含み得る。核酸試料の調製方法は当該技術分野において公知である。
核酸試料が細胞、組織又は体液内にある場合、試料からの核酸の調製及び精製には、血中の細胞など、細胞の溶解が含まれ得る。例えば、溶解反応混合物は、最大１００μｌの全血と、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ；使用直前に加える）を含有する１００μｌの溶解緩衝液とを含有し得る。溶解反応混合物をインキュベート（例えば、５５℃で１５分間、次に１００℃で１０分間）して、ゲノムＤＮＡの変性とプロテイナーゼＫの不活性化とを同時に行うことができる。
細胞デブリを取り出すため、反応混合物を好適な速度及び時間で（例えば、１２，０００×ｇで１分〜１時間の間の時間にわたり）遠心して、細胞デブリをペレット化することができる。デブリのペレットからデカントによって核酸試料を取り出すことができる。一部の形態において、混合物を遠心して細胞デブリを取り出すことは不要である（例えば、２５μｌ未満の血液が用いられる場合、このステップは省略することができる）。
ｉｉ．長いゲノムＤＮＡの又はＤＮＡシーケンシングライブラリからの特異的断片のキャプチャ
複数のＰＮＡプローブを用いた長いゲノムＤＮＡの特異的断片のキャプチャ及びシーケンシング方法が提供される。典型的には本方法は、標的ＤＮＡを長い断片に剪断するステップ；ハイブリダイゼーションプローブで断片を標的化するステップ；ＤＮＡ断片のストランドインベージョンステップ；非特異的に結合したＤＮＡの除去ステップ；未結合のプローブの除去ステップ；及びエンリッチ標的ＤＮＡ断片の単離、定量化及び特徴付けステップを含む。ゲノムＤＮＡから、又は同様に良好に長いＤＮＡ断片で構築されたＤＮＡシーケンシングライブラリから複数の長い二本鎖ＤＮＡ領域をキャプチャし及びシーケンシングする方法が開発されている。
ａ．ゲノムＤＮＡの剪断による長い断片の生成と、続くＤＮＡライブラリの構築
剪断されたＤＮＡ断片は、１０，０００塩基対、又は１５，０００塩基対、又は２０，０００塩基対、又は２５，０００塩基対、又は３０，０００塩基対、又は３５，０００塩基対、又は４０，０００塩基対の平均サイズを有し得る。ゲノムＤＮＡの長い断片を含有するシーケンシングライブラリが所望される場合、かかるライブラリは標準的な技法を用いて構築することができる。
ゲノムＤＮＡが用いられる場合、ゲノムＤＮＡは当該技術分野において公知の任意の技法を用いて所望のサイズの断片に剪断することができる。例えば、ゲノムＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓ ｇ−ＴＵＢＥ（商標）遠心装置（Ｃｏｖａｒｉｓ、製品番号：５２００７９）を使用して１０ｋｂの平均サイズの断片に剪断することができる。好ましくは、所望の断片サイズが（例えばゲノムＤＮＡに加える剪断力を調整することにより）選択され得る。
ＤＮＡライブラリ構築に有用なプロトコルが、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５によって記載されている。例示的な手順は、ＤＮＡ末端修復、続く３’末端アデニル化、及びＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）インデックスペアドエンドアダプターのライゲーションを含む。これらのステップの各々について、例示的プロトコルは以下を含む。
（Ａ）ＤＮＡ末端修復
Ａ）以下の成分を試料チューブ内に組み合わせて混合する。
Figure 0006937294
Ｂ）混合物を卓上サーモミキサーにおいて２５℃で３０分間インキュベートする。
Ｃ）０．８×ＳＰＲＩ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、ＤＮＡ試料を５２μｌヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに溶出させる。
（Ｂ）３’末端アデニル化
Ａ）以下の成分を試料チューブ内に組み合わせて混合する。
Figure 0006937294
Ｂ）混合物を３７℃のサーモミキサーで２０分間インキュベートする。
Ｃ）０．８×ＳＰＲＩ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、ＤＮＡ試料を６４μｌヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに溶出させる。
（Ｃ）Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックスペアドエンドアダプターのライゲーション
Ａ）以下の成分を試料チューブ内に組み合わせて混合する。
Figure 0006937294
Ｂ）室温で３０分間インキュベートする。
Ｃ）０．８×ＳＰＲＩ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、ＤＮＡを７２μｌヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに溶出させる。
ｂ．ゲノムＤＮＡ断片のターゲティング
ゲノムＤＮＡ断片又はライブラリのターゲティングは、長いゲノムＤＮＡを複数のＰＮＡプローブ（各プローブがビオチンなどの結合可能なハプテンを含有する）に接触させることから開始し得る。典型的には、プローブは、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、又は２２塩基の長さを有し得る。好ましいハイブリダイゼーションプローブは２０塩基長である。
各標的ゲノムＤＮＡ分子が、２つ以上の異なるＰＮＡプローブによって標的化及びインベージョンされる。従って、ＤＮＡ断片をＰＮＡプローブに接触させることには、ＰＮＡプローブの１つ以上のセットを含有する混合物にＤＮＡ断片の混合物を加えることが含まれ得る。
記載される方法によって核酸断片を標的化するように設計された異なるハイブリダイゼーションプローブの数は、標的化される核酸断片のサイズに応じて変わり得る。例えば、３，５８１塩基対長の断片には、断片の混合物から完全に（約９９％）回収するのに少なくとも２つの特異的ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブが必要であり（実施例１で実証されるとおり）、及び１１，９７０塩基対長の断片には、断片の混合物から完全に（約９９％）回収するのに少なくとも２つ又は３つの特異的ＰＮＡハイブリダイゼーションプローブが必要であった（実施例２に記載されるとおり）。従って、各ゲノムドメイン（３，６００塩基対）は、典型的には、図２の概略図に係る２つの個別的な部位でハイブリダイズする２つ以上の異なるＰＮＡプローブによって標的化される。例えば、２０，０００塩基対長以下の断片の標的化には２つ以上のプローブを使用することができ、３０，０００塩基対長以下の断片の標的化には３つ以上のプローブを使用することができ、及び４０，０００塩基対長以下の断片の標的化には４つ以上のプローブを使用することができる。例えば、各々約３，６００塩基対長の、合計２，５００の異なるゲノムドメインのゲノムＤＮＡキャプチャについての反応では、各ドメインに２つの異なるビオチン化ＰＮＡプローブが使用され、溶液中の異なるＰＮＡプローブの総数は５，０００である。
未結合ＰＮＡプローブがアフィニティーマトリックスへの結合に関して競合し得るため、反応中の全てのプローブの総濃度はＰＮＡ−ＤＮＡ複合体のアフィニティー精製の有効性に影響を及ぼし得る。各プローブが０．２ｎＭ〜２．０μＭの範囲の濃度で存在し得る。各プローブの例示的濃度は０．０８μＭである。例えば、１００μｌの容積で二本鎖キャプチャ反応が行われる場合、プローブの数は５，０００であり、及び各プローブの濃度は０．０８μＭであり、全てのプローブの総濃度は４００μＭである。
一部の形態において長いゲノムＤＮＡと複数のＰＮＡプローブとの接触は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で行われる。
ｃ．ゲノムＤＮＡ断片のストランドインベージョン
二本鎖ゲノムＤＮＡ分子のストランドインベージョンは、ストランドインベージョンが起こるのに好適な条件下でゲノムＤＮＡと複数のＰＮＡプローブとの混合物を共にインキュベートすることによって達成し得る。実験の必要性に応じて変わる、最適化し得る条件としては、標的ＤＮＡの濃度；ハイブリダイゼーションプローブの濃度；反応緩衝液の組成；反応槽の反応容積、サイズ及び形状、温度、並びにインキュベーション時間が挙げられる。
好ましい反応容積は１００μｌである。好ましい標的ＤＮＡの量は１００ｎｇである。好ましくは、各ＤＮＡ断片の標的化に使用するＰＮＡプローブの数は、反応中に存在する５０％より多くの標的断片を単離するのに十分である。各ＤＮＡ断片が２つのビオチン化プローブによって標的化されるとき、未結合プローブの総濃度は０．５μＭ未満であるべきである。好ましい標的ＤＮＡの量は１００ｎｇである。各ハイブリダイゼーションプローブの好ましい濃度は０．０８μＭである。好ましくは、各ＤＮＡ断片を標的化するハイブリダイゼーションプローブの数は、混合物中の９０％より多くの標的ＤＮＡ断片を単離するのに十分である。例示的反応緩衝液は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ（又は２０ｍＭ）ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する。例示的反応温度は３７℃〜４７℃の範囲で、二本鎖ゲノムＤＮＡ分子のストランドインベージョンが実現するのに十分な時間にわたる。一部の形態において、反応は４６℃で４時間の間にわたって行われる。長いインキュベーション時間を用いることができる。例えば、１６時間以上、最長３６時間以下のインキュベーション時間を用いることができる。
一部の形態において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）がストランドインベージョンを可能にし、又はそれを増進させる。ＳＳＢは反応緩衝液中に０．５μＭ〜４μＭの範囲の最終濃度で含まれてもよく、例えば、ＳＳＢは２μＭの最終濃度で含まれる。
ｄ．非特異的に結合したＰＮＡプローブの放出
反応混合物は、任意選択で、高温で更なる時間にわたってインキュベートして、非特異的に結合したＰＮＡプローブの放出を促進することができる。この高いインキュベーション温度は、標的ＤＮＡ及びプローブのＴｍに基づき決定することができる。好ましくは、このステップの温度はＴｍ−１０℃のインターバルにあり得る。正電荷ＰＮＡとＤＮＡ標的との間の１つの塩基対ミスマッチが相互作用のＴｍを約１０℃低下させることが示されている（Ｔｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。例えば、反応物は５５℃で更に５分間インキュベートすることができる。
ｅ．未結合ＰＮＡプローブの分離
未結合ＰＮＡプローブは、任意選択で、当該技術分野において公知の任意の好適な手段によって反応混合物と分離することができる。
好ましい分離方式はサイズ排除クロマトグラフィーである。未結合ＰＮＡプローブは、ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＰＮＡ複合体からサイズに基づき、遊離ビオチン化ＰＮＡプローブをその細孔内に取り込みつつ全ての長いＤＮＡ分子を排除する特性を有する多孔質ビーズを含有するゲルろ過カラムに通過させることにより分離し得る。長いＤＮＡ分子及びＤＮＡ／ＰＮＡ複合体は溶出物中に収集される。例示的ゲルろ過カラムはＰ１００サイズ排除遠心カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。溶出物は、任意選択でＰ１００カラムに更に１回以上通過させてもよい。サイズ排除後、ＤＮＡ及びＰＮＡ−ＤＮＡ断片はカラムからの溶出物中に存在し、好適な容積に希釈することができる。
或いは、未結合ＰＮＡプローブは、ＤＮＡに結合したＰＮＡプローブと共にキャプチャしてもよい。続くＤＮＡが結合したＰＮＡプローブからのＤＮＡの選択的な溶出がまた、ＤＮＡを未結合ＰＮＡプローブと分離する役割も果たし得る。
ｆ．特異的に結合したＰＮＡプローブのキャプチャ
特異的に結合したＰＮＡプローブの単離は、サイズ排除分離マトリックスから排除された材料を、ＰＮＡプローブ上に存在するキャプチャタグに特異的なキャプチャドックを含有する表面に接触させることにより達成し得る。
一部の形態において、キャプチャドックは、ビオチン結合実体、好ましくはストレプトアビジンを有する常磁性ビーズなどの基材に付着又はカップリングされる。例えば、ビオチン化ＰＮＡプローブは、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ２８０ストレプトアビジンの表面にキャプチャすることができる。
特異的に結合したＰＮＡ−ＤＮＡプローブは、ＰＮＡタグ付加ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体によるビーズの飽和が可能となるのに好適な緩衝液中で好適な時間にわたってキャプチャドックと接触させる。例示的インキュベーションは室温で２時間行われる。
一部の形態において、キャプチャタグによってＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャするステップはまた、未結合ＰＮＡプローブもキャプチャする。かかる形態について、キャプチャ媒体は、好ましくは、結合及び未結合の両方の、全てのＰＮＡプローブをキャプチャするのに十分なキャプチャ成分（キャプチャドックなど）を含む。これは、未結合ＰＮＡプローブを分離する別個のステップが実施されない場合に有用である。
ｇ．非結合ＰＮＡプローブ及び非結合ＤＮＡの除去
基材に付着又はカップリングしたキャプチャドックに結合したプローブは、溶液から単離し、１回又は２回以上洗浄して、非結合ＤＮＡ及び非特異的に（弱く）会合したプローブ−ＤＮＡ複合体を除去することができる。例えば、基材として磁気ビーズを使用する場合、ビーズ及び結合したＤＮＡは磁石を使用して混合物から分離することができる。単離されたビーズ及び結合ＤＮＡは、１回、２回、又は３回以上洗浄することができる。
任意の好適な洗浄緩衝液を使用して、表面から非結合ＰＮＡプローブ及びＰＮＡプローブが結合していないＤＮＡを除去することができる。ＤＮＡ−ＰＮＡ−基材複合体の洗浄は、カラムの使用によって促進される。例えば、基材がビーズを含む場合、ビーズをカラムに入れ、カラムに洗浄緩衝液を連続的に通過させて反応混合物を洗い流すことができる。基材に結合した残留材料のみが、好ましくは２つ以上の結合したＰＮＡプローブを含有するゲノムＤＮＡ又はＤＮＡライブラリ断片である。
ｈ．標的の長いＤＮＡ断片の溶出
結合したＰＮＡを有しない標的の長いＤＮＡ断片は、好適な変性緩衝液を使用してキャプチャ表面（例えば磁気ビーズ）から放出させる。好適な緩衝液としては、２０ｍＭトリスｐＨ８．０、４００ｍＭ（又は２００ｍＭ）ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミド、及び０．０１％Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１００、撹拌しながら６５℃で５分間が挙げられる。一部の形態において、結合したＤＮＡを溶出させるステップは、１つ以上の薬剤又は溶液を加えてＰＮＡプローブからの溶出を増進させ、それによりエンリッチＤＮＡの収率を増加させることを含む。
溶出を増進させる例示的方法には、結合した標的ＤＮＡからＰＮＡを鎖置換する方法が含まれる。一部の形態において、ＰＮＡプローブは、酵素及びｄＮＴＰを使用した３’ヘアピンのプライマー伸長によって鎖置換される。３’ヘアピンのプライマー伸長によるＰＮＡプローブの鎖置換に用いられる例示的酵素は、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼＩＩである。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼは、ＧＣリッチ鋳型上でのＤＮＡ重合を促進するように設計されたＰｆｕ ＵｌｔｒａとＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質である。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号６００６７５）を含め、複数の商業的供給元から入手可能である。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素は成功裏にＰＮＡを鎖置換し、制限酵素ＢｃｃＩの消化部位を含有するＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を作り出すが、一方、出発ＤＮＡ−ＰＮＡ二重鎖はＢｃｃＩによって消化されることはできない。従って、一部の形態において、ＰＮＡプローブ溶出のステップがＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む場合、ＰＮＡプローブ鎖置換の完全性はＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ産物の制限消化効率との相関によって決まり得る（Ｂｕｄｎｏ，ｅｔ ａｌ，２０１０）。
エンリッチＤＮＡの収率を増加させる方法にはまた、荷電アミノ酸組成を有するＰＮＡプローブを使用する場合、弱アルカリ性のｐＨにおける結合した標的ＤＮＡからの脱プロトン化により促進されるＰＮＡ放出も含まれ得る。例えば、チアリジン部分による誘導体化によって修飾された残基を含む１つ以上のＰＮＡプローブを使用する場合、弱アルカリ性のｐＨを使用してプローブ／キャプチャされた核酸の解離を助けることができる。
結合したＰＮＡプローブのない、溶出したＤＮＡは、元の標的二本鎖ＤＮＡ断片からなり、各断片が２つ以上の標的ヌクレオチド配列を含む。エンリッチＤＮＡ（並びに上清中に残る未結合ＤＮＡ）は、当該技術分野において公知の方法を用いて特徴付け、定量化することができる。
一部の形態において、エンリッチＤＮＡはごく少量で存在する。例えば、エンリッチＤＮＡは蛍光インターカレート色素で染色した後であっても検出不能であり得る。かかる形態では、エンリッチＤＮＡは好ましくはＤＮＡ増幅が関わる方法によって分析される。一部の形態において、半定量的ＰＣＲを行ってキャプチャＤＮＡ断片を増幅し、及び任意選択で反応混合物中に残る未結合ＤＮＡを増幅して％キャプチャ率を決定することができる。
ｉｉｉ．長いゲノムＤＮＡの配列決定及び分析
記載される配列特異的ＤＮＡキャプチャ方法は、ＰＣＲ増幅の必要なしにエンリッチ二本鎖ＤＮＡ断片をもたらす。従って、本方法は、それが由来した元の生物に存在したのと同じ比率の、且つ同じメチル化状態を有する大型ｄｓＤＮＡ断片をもたらす。キャプチャされたゲノム断片を定量化及びシーケンシングすることにより、変異型、コピー数変異、頻度スペクトル、集団分布及び集団多様性に関する情報が提供され得る。
例えば、ステップｉｉ．ａ．〜ｉｉ．ｈ．（上記）に係る長いゲノムＤＮＡの又はＤＮＡシーケンシングライブラリからの特異的断片のキャプチャ方法の後、放出されたＤＮＡは、キャプチャされた長いＤＮＡ断片の全てを含有するシーケンシングライブラリにパッケージングすることができる。
キャプチャされた長いｄｓＤＮＡの完全なＤＮＡ配列は、当該技術分野において公知の任意の好適なＤＮＡシーケンシング技法及び機器を用いて決定することができる。例えば、ＤＮＡシーケンシングはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって行うことができる。ＤＮＡシーケンシングデータは、多重配列アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて分析することができる（例えば、ウェブサイトｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／を参照）。
ライブラリが配列特異的ＤＮＡキャプチャより前に構築されている場合、キャプチャされた長いＤＮＡライブラリ断片の完全なＤＮＡ配列は、ライブラリと適合性のあるＤＮＡシーケンシング機器を使用することにより直接決定し得る。
当業者は、ライブラリを構築する前に配列特異的ＤＮＡキャプチャを実施するのとは対照的に、配列特異的ＤＮＡキャプチャの前にＤＮＡライブラリを構築することが好ましい場合を判断することが可能であろう。一般に、目的が比較的少数のＤＮＡ断片をキャプチャすることである場合、配列特異的ＤＮＡキャプチャよりも前にライブラリを構築することが好ましい。他方で、キャプチャの標的とされるゲノムＤＮＡ断片の数が多い（１０００を超える異なるＤＮＡ断片がエンリッチメントの標的とされる）場合、配列特異的ＤＮＡキャプチャを実施した後にＤＮＡシーケンシングライブラリを構築する方が好ましいこともあり得る。
一部の形態において、長いＤＮＡ断片をキャプチャする本開示の方法を用いてターゲットエンリッチメントを実施する目的は、ＤＮＡメチル化情報を入手することではなく、単に塩基修飾情報のないＤＮＡ配列情報を入手することに過ぎない。これらのＤＮＡシーケンシング形態については、キャプチャ表面からの放出後、及びＤＮＡシーケンシングライブラリ構築の前に、キャプチャされたＤＮＡ断片を増幅することができる。これらのＤＮＡシーケンシング形態に好ましい増幅方法は、全ゲノム増幅（Ｈａｓｍａｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）である。全ゲノム増幅は任意の好適な技法を用いて実施することができる。例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｗａｕｋｅｓｈａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用することができる。或いは、増幅は、ＱＩＡＧＥＮ ＲＥＰＬＩ−ｇ Ｍｉｎｉキット、カタログ番号１５００２３（ＱＩＡＧＥＮ、２７２２０ Ｔｕｒｎｂｅｒｒｙ Ｌａｎｅ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ ９１３５５）を使用して実施してもよい。ＲＥＰＬＩ−ｇ Ｍｉｎｉキットを使用して増幅したＤＮＡは、次世代シーケンシングを含めた多数の下流分析で試験されており、且つそれらに非常に良く適している。別個のＰＣＲベースの増幅ステップが必要ないため、ＲＥＰＬＩ−ｇ全ゲノム増幅及び続くライブラリ調製ステップは実地時間が少なくて済み、ＰＣＲベースの方法よりもリード長が長くなり得る。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ又はＱＩＡＧＥＮ Ｒｅｐｌｉ−ｇのいずれの増幅方法でも、高い割合の配列カバレッジ及び極めて低いエラー率を示す高品質な同等の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の結果を達成することができる。
ａ．ハプロタイプ解析
長いゲノムｄｓＤＮＡ断片のハプロタイプ解析方法が提供される。例えば、記載される配列特異的ＤＮＡキャプチャ方法は、任意選択で、単一染色体上の１つ以上のＳＮＰのフェーズを決定する追加のステップを含み得る。
一塩基多型（ＳＮＰ）は、全ゲノム連鎖スキャン及び関連研究について登場したマーカーである。ＳＮＰは共通の配列変異タイプであり、その安定性、存在量、及び比較的容易なスコアリングゆえに有用なマーカーである。１０００万を超えるＳＮＰがあると推定され、マイナーなアレル頻度は約５％以上である。４つの地理的に個別のヒト集団にわたってヒトハプロタイプを同定し及び特徴付ける国際的コンソーシアム（ＨａｐＭａｐ計画）が、標準的な共通アレルＳＮＰの組を同定した。
従って、共通アレルＳＮＰは、複雑なヒト疾患、病原体感受性、及び薬物反応差に関する根底にある遺伝的基礎の同定及び特徴付けに使用することができる。
記載される方法によってエンリッチされる大型ゲノムＤＮＡ断片のジェノタイピングは、当該技術分野において公知の任意のシステムを用いて行うことができる。キャプチャＤＮＡ断片の好ましいジェノタイピング方法は、長いリードを生成することが可能なＤＮＡシーケンシングである。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ゲノムワイドヒトＳＮＰ Ｎｓｐ／Ｓｔｙ ６．０及びＩｌｌｕｍｉｎａ １．０ Ｍｉｌｌｉｏｎ ＳＮＰマスアレイなどの他のキャプチャ技術を用いることもできるが、これらは好ましくない。
ｉｖ．複数のＰＮＡプローブを使用したゲノムライブラリからの長いＤＮＡの特異的断片のキャプチャ及びＤＮＡメチル化シーケンシング
試料中の１つ以上の長いｄｓＤＮＡ配列のメチル化状態を決定することを含む方法が開示される。長いＤＮＡ断片で構築されたＤＮＡシーケンシングライブラリから複数の長い二本鎖ＤＮＡ領域をキャプチャして、そのＤＮＡメチル化シーケンシングを達成する方法が提供される。複数のＰＮＡプローブを使用した任意の好適なＤＮＡ試料からのＤＮＡの標的配列特異的断片のキャプチャは、上記に記載される方法ステップｉｉ．ａ〜ｉｉ．ｈ．を用いて達成することができる。ゲノムターゲットエンリッチメントを利用して、ＤＮＡメチル化情報の長いリードを含むＤＮＡ配列を生成することができ、かかる長いリードにより、潜在的に４０，０００〜１，０００，０００塩基対の範囲の大型配列ドメインにわたるＤＮＡメチル化のフェージングが可能となる。
ＤＮＡ断片のメチル化状態の決定は、当該技術分野において公知の任意の手段、例えば亜硫酸水素塩シーケンシングにより行うことができる。亜硫酸水素ナトリウム変換に供されるゲノムＤＮＡのシーケンシング（ＭｅｔｈｙｌＣ−Ｓｅｑ）により、ゲノムの大部分にわたるメチル化シトシンを一塩基分解能で鎖特異的に同定することが可能になる。従って、記載される方法を用いて高いカバレッジの全ゲノム哺乳類ＤＮＡメチロームを生成することができる。個別のアレルに関するリードカバレッジ及び亜硫酸水素塩変換率を用いると、当該技術分野において公知の任意の方法により、例えばフィッシャーの正確確率検定を用いて、アレル特異的ＤＮＡメチル化（ＡＳＭ）を定量化することができる。
キャプチャされた長いＤＮＡライブラリ断片の完全なＤＮＡメチル化配列の決定は、ＤＮＡ配列、並びにＤＮＡ修飾情報を報告することが可能な自動ＤＮＡシーケンシング機器を用いて達成することができる。例示的機器は、Ｔｅｔ１酸化化学を伴い用いられるＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ＲＳＩＩ機器である（Ｃｌａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ｖ．ゲノムＤＮＡドメインのエンリッチメントに最適な特異性でないと疑われるＰＮＡプローブを除外するための二本鎖ＤＮＡキャプチャを用いた反復方法
準最適な特異性であると疑われるＰＮＡプローブを同定及び除去する方法も開発された。本方法は二本鎖ＤＮＡの特異的キャプチャを含み得る。
一部の形態では、ゲノム全体にわたる異なる領域のキャプチャ用にＰＮＡプローブのセットが設計される。例えば、ヒトゲノムの２，５００の異なる領域のキャプチャに、５，０００ＰＮＡプローブのセットを設計することができる。各領域は２０，０００塩基対長であり、各２０，０００塩基領域の中心に位置する３，０００塩基インターバル内の特異的標的配列とハイブリダイズするように向けられた、２つの特異的ＰＮＡプローブによって標的化される。標的ＤＮＡドメインは、合計で、最大５０００万塩基対（５０ＭｂのＤＮＡ）に対応し得る。５，０００プローブのセット（各プローブが分子の一方の末端にビオチン残基を有して合成されている）が、上記に記載される方法ステップｉｉ．ａ．〜ｉｉ．ｈ．を用いたゲノムライブラリからの長いＤＮＡの断片のキャプチャ及びシーケンシングの実施に用いられる。
例えば、シーケンシングは、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ＲＳＩＩシステムなど、長いリードを生成することが可能な好ましいプラットフォームを用いて実施することができ、理論上の配列オーバーサンプリングは、５０メガベースゲノムを基準として１００倍と計算される。
ゲノムＤＮＡドメインのエンリッチメントに最適な特異性でないと疑われるＰＮＡプローブを除外するための反復方法は、続いて以下のとおり行われる。
ａ．シーケンシングしたＤＮＡのマッピング
適切なソフトウェアを用いてシーケンシングリードがヒトゲノムにマッピングされ、スキャフォールドが構築される。８６％を超えるフィルタリング後のリードがヒト参照ゲノムとアラインメントされる。アラインメントされたサブリードスキャフォールドの約８０％が、元のキャプチャ標的であったゲノム領域の５０Ｍｂアグリゲートにマッピングされ、一方、リードの約２０％はそのゲノムの他の非標的領域にマッピングされる。標的ＤＮＡにマッピングされない２０％のリードのうち、バイオインフォマティクス解析によって各約２０，０００塩基対長の３５０のゲノム領域が同定され、ここで、サブリードスキャフォールドは１領域当たり２５の平均オーバーサンプリングを示す。この結果は、５，０００のＰＮＡプローブのうち、３５０の非標的ゲノムドメインを有効にキャプチャするパフォーマンスが低いプローブのサブセットがあることを含意している。
ｂ．非特異的ハイブリダイゼーション相互作用の同定
好適な配列アラインメント及び検索ツール、例えば「ｕｂｌａｓｔ」（ＵＳＥＡＲＣＨシーケンシング解析パッケージの一部、Ｅｄｇａｒ，２０１０）を使用して、５，０００のＰＮＡプローブ配列の完全なセットを、非特異的ハイブリダイゼーション相互作用に起因してキャプチャされた３５０のゲノム領域の配列と順次アラインメントする（５，０００の独立したアラインメントラン）。アラインメント後、２つ以上のミスマッチを伴う非特異的ハイブリダイゼーション相互作用に起因してキャプチャされた３５０のゲノム領域内に位置する特異的２０塩基配列と最も有意なアラインメントスコアを生じた３５０のＰＮＡプローブが同定される。
ｃ．非特異的ＰＮＡプローブの置換
３５０の非特異的にキャプチャされたゲノム領域内に位置する２０塩基配列との有意なアラインメントスコアによって同定された３５０のＰＮＡプローブを３５０の新規ＰＮＡプローブに置換して、ゲノムの元の同じ２，５００の領域を標的化する４，６５０の既存のＰＮＡプローブ＋３５０の新規ＰＮＡプローブ、即ち５，０００のＰＮＡプローブの新規セットを作成する。
ｄ．エンリッチＤＮＡキャプチャの決定
上記に記載したとおりの方法ステップｉｉ．ａ．〜ｉｉ．ｈ．を用いたゲノムライブラリからの長いＤＮＡの断片のキャプチャ及びシーケンシングを反復する。シーケンシングを繰り返し、新規データセットで方法ステップｉ．にあるとおり分析を行う。この実験を３５０の新規プローブで繰り返す目的は、先に非特異的ハイブリダイゼーション相互作用に起因してキャプチャされた３５０ゲノム領域のどれが、非特異的であると疑われた３５０のプローブが新規プローブに置換されたキャプチャ実験の２回目の反復で除去されたものとして同定され得るかを確かめることである。任意選択で、必要に応じてこの除外手順の更なる反復を行うことができる。
一部の形態において、本開示の方法は以下の特徴の１つ以上を有する：（ａ）結合及びキャプチャの前、又はその最中に標的核酸が変性されない；（ｂ）複数の長いｄｓＤＮＡ断片が、各々最低２つのＰＮＡプローブによって標的化される；（ｃ）使用されるＰＮＡプローブが、右回りのヘリックスコンホメーションに有利なキラル骨格を有する（かかるプローブはストランドインベージョン能がより高い）；（ｄ）ＰＮＡプローブが、短鎖オリゴエチレン部分で修飾されたキラルモノマーと、正電荷アミノ酸、好ましくはリジンで修飾されたキラルモノマーとを含む；及び（ｅ）単一のキャプチャ反応において何千ものプローブを使用して何千もの異なる標的核酸をキャプチャすることができる。
一部の形態において、本開示の方法は、各々がＰＮＡプローブに右回りのヘリックスコンホメーションを誘導するように設計された２つの別のタイプのキラルＰＮＡを使用する。ガンマ−Ｌ−リジンモノマーとガンマ−短鎖オリゴエチレンＰＮＡモノマーとの混合物を含むキラルＰＮＡが最も好ましい（後者はガンマ−Ｌ−セリンから出発して合成される）。また、アルファ−Ｄ−リジンとアルファ−短鎖オリゴエチレンＰＮＡモノマーとの混合物を含むキラルＰＮＡプローブも好ましい（後者はアルファ−Ｄ−セリンから出発して合成される）。
一部の形態において、本開示の方法は三重鎖形成を用いず、従ってＤＮＡ中のホモプリン−ホモピリミジン配列のみを標的化する必要が回避される。かかる配列は多くの場合にヒトゲノムにおいてユニークでない。一部の形態において、本開示の方法は重複するプローブも、また部分的に重複するプローブも使用しない。
一部の形態において、本開示の方法は、コスト上の理由からＰＮＡプローブに擬相補的ＰＮＡ塩基を使用しない。しかしながら、本開示の方法は、好ましくは一部の少数のＰＮＡプローブに、偶然に部分的に相補的となる（組み合わせて用いられる何千もの異なるＰＮＡプローブの）特定のＰＮＡプローブの間における相互作用の可能性を低減する目的で、擬相補的ＰＮＡ塩基を使用することができる。換言すれば、擬相補的ＰＮＡ塩基は、ＰＮＡプローブのセットに用いられるＰＮＡプローブ間で相補配列となるあらゆる場合を排除するための選択肢としてＰＮＡプローブに使用することができる。
２．例示的プロトコル
記載される方法に係る長いゲノムＤＮＡの又はＤＮＡシーケンシングライブラリからの特異的断片の例示的キャプチャプロトコルが提供される。長いゲノムＤＮＡの特異的断片のキャプチャ方法はスタンドアロン手順として行ってもよく、又は他の核酸同定及び／又は操作プロトコルに統合してもよい。関連性のある下流適用には、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）シーケンシングライブラリ調製との統合、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）シーケンシングライブラリ調製との統合、ナノポアシーケンシング用のＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅライブラリ調製との統合、全ＤＮＡ（例えば、ヒト組織から得られたＤＮＡ）からのミトコンドリアＤＮＡの単離用キットのプロトコル内への統合、ヒト白血球細胞の特異的サブセット、例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、又は任意の他の白血球サブセットから得られたＤＮＡからのゲノムの特異的領域の配列エンリッチメント用キットのプロトコル内への統合、ヒト糞便から得られたＤＮＡ試料からの特異的微生物ゲノムのエンリッチメント用キットのプロトコル内への統合、非ヒト種（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、雌ウシ、ニワトリ等）からの特異的ＤＮＡ配列のエンリッチメント用キットのプロトコル内への統合、及び重要な植物種からの特異的ＤＮＡ配列のエンリッチメント用キットのキットのプロトコル内への統合が含まれる。
典型的には、これらの方法ステップの各々の実施に用いられる正確な条件及び試薬は、所与の標的配列又は標的配列群の具体的なエンリッチメントに合わせて修正又は最適化することができる。
ｉ．ＰｅｔａＯｍｉｃｓエンリッチメント技術を用いた例示的標的ＤＮＡエンリッチメントプロトコル
一部の形態において、本方法は、ファージラムダＤＮＡの複数の制限酵素断片を含有する混合物からの二本鎖ＤＮＡの所望の断片のエンリッチメント向けに最適化される。例示的ファージラムダＤＮＡ標的断片サイズは８．５Ｋｂである。一部の形態において本方法は、全ヒトゲノムＤＮＡからの二本鎖ゲノムＤＮＡの特異的断片の配列エンリッチメント向けに最適化される。例示的ゲノムＤＮＡ標的断片サイズは８Ｋｂである。
ａ．ＤＮＡライブラリ材料のＰｅｔａＯｍｉｃｓターゲットエンリッチメント
１．６５℃で１０分間加熱することによりプローブを調製し、次にボルテックスし、スピンダウンする。
２．１μｇ標的ＤＮＡ（所望のサイズの断片に剪断したもの）、２０ｐｍｏｌの各プローブ、５×ＳＩ緩衝液、２．６０μＬ ＳＳＢ、７．２μＬホルムアミドを合わせ、Ｈ２Ｏを加えて総容積を５０μＬにする。例示的最終濃度は、４００ｎＭの各プローブ、４１．７ｍＭの総ＮａＣｌ、２μＭのＳＳＢ、１４％ホルムアミドである。
３．プローブ濃度各２００ｎＭ；２つの試料を作り、一方のチューブにはプローブを加えない（「対照」） − １つのプローブなし試料＋１つの全プローブ含有試料。
４．各チューブを短時間ボルテックスし、スピンダウンして全ての液体を底に至らせる。
５．チューブをドライバスに入れ、ストランドインベージョン（ＳＩ）のため５０℃で４時間インキュベートし、次に６０℃で５分間インキュベートする。
６．遊離プローブから（例えば、Ｐ１００サイズ排除カラムを使用して）ＤＮＡを精製する。１００×ｇで４分間スピンする。
７．精製したＳＩ反応物をＢＳＡ不動態化Ｃ１磁気ビーズ＋１００μＬ Ｈ２Ｏと合わせる。
８．キャプチャ反応物を室温でローテータにおいて２時間インキュベートする。
９．ローテータから試料を取り、磁石上に３分間置く。上清を新しいチューブに移す。
１０．１５０μＬ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液（例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）を含有する）をビーズに加え、ピペッティングによって再懸濁し、３０秒間ボルテックスし、磁石上に２分間置く。洗浄緩衝液を捨てる。
１１．洗浄を３回繰り返し、洗浄液を捨てる。
１２．１５０μＬ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液を加え、再懸濁してサーモミキサーで５０℃×７分間インキュベートする。
１３．１００μＬ溶出緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミド）を洗浄したビーズに加え、ボルテックスし、スピンして、サーモミキサーにおいて撹拌しながら７５℃で７分間インキュベートする。
１４．チューブを磁石上に３分間置く。溶出物を新しいチューブに移す。
１５．上清を精製し、ＤＮＡを（例えばＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して）溶出させ、エタノールで２回洗浄し、４０μＬ ｄＨ２Ｏ中に溶出させる。上清を精製し、ＤＮＡを（例えばＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで）溶出させ、エタノールで２回洗浄し、好適な容積（例えば４０μＬ）のｄＨ２０中に溶出させる。
１６．対照上清、対照溶出物、ＰＮＡ上清及びＰＮＡ溶出物を鋳型として使用してｑＰＣＲを調製する。
ｉｉ．ヘアピンアダプターのライゲーションを含めた、ＤＮＡライブラリ調製のためのＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製ワークフローへのＰｅｔａＯｍｉｃｓエンリッチメント技術の援用
以下のプロトコル（ステップａ〜ｃ）は、記載される標的配列エンリッチメント方法を標準的なＤＮＡシーケンシング機器におけるシーケンシング用のＤＮＡライブラリ調製のワークフローにどのように援用することができるかを示す。当然ながら、ターゲットエンリッチメントステップをＤＮＡシーケンシングライブラリ調製の前に実施することが可能であるが、一部の例では、実際には、本発明のターゲットエンリッチメント方法をＤＮＡライブラリ調製ワークフローに統合することが有利である。例示的プロトコルでは、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）シーケンシング機器用のシーケンシングライブラリ調製に組み込まれた配列エンリッチメントステップにおいて、ガンマ−Ｌ−チアリジンで修飾されたＰＮＡ残基を含有するＰＮＡプローブを使用する。一部の形態では、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）シーケンシングに基づく実施例のＰＮＡプローブに、Ｌ−リジンで修飾されたＰＮＡ残基を使用する。
ａ．ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターのライゲーション
１．３〜５μｇの標的ＤＮＡ（例えばヒトゲノムＤＮＡ）を２０ｋｂの平均断片長さに（例えばＣｏｖａｒｉｓ ｇ−ｔｕｂｅを使用して）剪断し、遠心する（例えば４，０００ｒｐｍで６０秒）。
２．剪断したＤＮＡ試料を（例えば０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）濃縮する；
ａ．１容積のＡＭＰｕｒｅ ＰＢビーズを０．４５×容積のＤＮＡ試料に加える；
ｂ．不均一に混合する。ボルテックスミキサーにおいて２，０００ｒｐｍで１０分間振盪する；
ｃ．ビーズがチューブの片側に集まり、溶液が澄明になるまでチューブを磁石上に置く。澄明になった上清をピペットでビーズペレットを乱さないように慎重に吸引する；
ｄ．ＡＭＰｕｒｅ ＰＢビーズを７０％エタノールで２回洗浄する；
ｅ．残留エタノールを除去し、ビーズを３０〜６０秒間風乾する；
ｆ．３８μＬ ＰａｃＢｉｏ溶出緩衝液にビーズを再懸濁し、２，０００ｒｐｍで１分間ボルテックスする。ビーズが集まり、溶液が澄明になるまでチューブを磁石上に置く；及び
ｇ．上清を新しい０．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。
３．剪断したゲノムＤＮＡをエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理してＤＮＡ断片から一本鎖末端を取り除く。
ａ．ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）鋳型調製キットからのＤＮＡ損傷修復緩衝液、ＮＡＤ＋、ＡＴＰ高、ｄＮＴＰ及びＥｘｏＶＩＩ酵素を１倍になるように加える；及び
ｂ．３７℃で１５分間インキュベートする。反応を４℃に戻す。
４．２μＬのＤＮＡ損傷修復酵素ミックスを加えて３７℃で２０分間インキュベートすることによりＤＮＡ損傷を修復する。反応を１〜５分間４℃に戻す。
５．２．５μＬの末端修復酵素ミックスを加えて２５℃で５分間インキュベートすることによりＤＮＡ試料の末端を修復する。反応を４℃に戻す。
６．ステップ＃２にあるとおり０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズでＤＮＡ試料を精製する。２０μＬ ＰａｃＢｉｏ溶出緩衝液に溶出させる。
７．ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターを平滑末端ライゲーションでライゲートする。
ａ．アニーリングした平滑末端ヘアピンアダプターを末端修復したＤＮＡ試料に加え、十分に混合する；
ｂ．鋳型調製緩衝液及びＡＴＰ低を加え、十分に混合する；
ｃ．リガーゼ酵素及びｄＨ２Ｏを加え、ピペッティングによって十分に混合する；及び
ｄ．ライゲーション反応物を２５℃で一晩インキュベートする。
８．反応物を６５℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを不活性化する。反応を４０℃に戻す。
９．ライゲートしたＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ及びエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理してライゲートしなかった産物を取り除く。反応物を３７℃で１時間インキュベートした後、反応を４℃に戻す。
１０．ライゲートしたＤＮＡ試料をステップ＃２にあるとおり（例えば０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）精製する。好適な容積（例えば３０μＬ）のｄＨ２Ｏに溶出させる。
ｂ．ＤＮＡライブラリ材料のＰｅｔａＯｍｉｃｓターゲットエンリッチメント
１１．選択の二本鎖ＤＮＡ標的をキャプチャするためのＰＮＡ媒介ストランドインベージョン
ａ．５×ストランドインベージョン緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を１倍となるように加える；
ｂ．Ｔａｑ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を２μＭの最終濃度となるように加える；
ｃ．標的に向けられたガンマＰＮＡ（例えば、４つのガンマ−Ｌ−チアリジン及び４つのガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含む１８ｍｅｒ ＰＮＡ）のセットをＰＮＡ当たり４００ｎＭの最終濃度となるように加える；
ｄ．ホルムアミドを１４．４％の最終濃度となるように加える；
ｅ．十分に混合し、反応物を５０℃で３時間インキュベートする；及び
ｆ．ストリンジェンシーステップのため反応物を６０℃で５分間インキュベートしてＤＮＡとの不完全なＰＮＡ相互作用物を融解させる。
１２．未結合の遊離ガンマＰＮＡを（例えばＰ１００サイズ排除カラムで）取り除く。
ａ．ストランドインベージョン反応物をカラムに加え、室温において１００×ｇで４分間スピンする。
１３．ビオチン化ＰＮＡ結合標的ＤＮＡを（例えばＢＳＡ不動態化Ｃ１ストレプトアビジン磁気ビーズで）キャプチャする
ａ．洗浄してＢＳＡ不動態化したＣ１ストレプトアビジン磁気ビーズを１．５ｍＬエッペンドルフチューブにおいて５０μＬストランドインベージョン反応物、１００μＬ ｄＨ２Ｏ及び５０μＬ洗浄緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に２００μＬの最終容積となるように再懸濁する；及び
ｂ．キャプチャ反応物を回転プラットフォーム上室温で２時間インキュベートする。
１４．ストレプトアビジンビーズを室温で洗浄緩衝液により３回洗浄する。溶液が澄明になるまで毎回磁石上に置く。上清を捨てる。
１５．ストレプトアビジンビーズをサーモミキサー（撹拌＝８００ｒｐｍ）において５０℃で７分間インキュベートすることにより洗浄緩衝液で１回洗浄する。溶液が澄明になるまで磁石上に置く。上清を捨てる。
１６．ビーズを溶出緩衝液（例えば、１０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ９．７５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミド）に再懸濁してｐＨをガンマ−チアリジン基（ｐＫａ＝９．５）のｐＫａより高く上昇させ、ひいてはＰＮＡ融解温度を低下させることにより、キャプチャされた標的ＤＮＡをストレプトアビジンビーズから溶出させる。サーモミキサー（撹拌＝８００ｒｐｍ）において７５℃で７分間インキュベートする。極めて少量のＤＮＡをキャプチャする場合、担体としてスーパーコイル環状ＤＮＡの添加を加えることができる。
ｃ．ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製、ヘアピンアダプターライゲーション後のステップ
１７．エンリッチ標的ＤＮＡを（例えば、ステップ＃２にあるとおり０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）精製する。３０μＬ ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）溶出緩衝液に溶出させる。
１８．Ｂｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎ機器を使用してエンリッチ標的ＤＮＡをサイズセレクションする。
ａ．ＢＰ開始：８０００；ＢＰ終了：５００００。
１９．サイズセレクションした標的ＤＮＡを（例えば、ステップ＃２にあるとおり１×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）精製し、濃縮する。１０μＬ ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）溶出緩衝液に溶出させる。
２０．ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ＲＳＩＩ機器を使用して標的エンリッチＤＮＡをシーケンシングする。
ｉｉ．オンビーズヘアピンアダプターライゲーションを含めた、ＤＮＡシーケンシング用のＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製ワークフローへのＰｅｔａＯｍｉｃｓエンリッチメント技術の援用
以下のプロトコル（ステップａ〜ｄ）は、記載される標的配列エンリッチメント方法を、オンビーズヘアピンアダプターライゲーションを含めたＤＮＡシーケンシングのワークフローにどのように援用することができるかを示す。当然ながら、ターゲットエンリッチメントステップをＤＮＡシーケンシングの前に実施することが可能であるが、実際には、本発明のターゲットエンリッチメント方法をＤＮＡシーケンシングワークフローに統合することが有利である。
ａ．ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製、ステップ１〜６、アダプターライゲーション前
１．３〜５μｇの標的ＤＮＡ（例えばヒトゲノムＤＮＡ）を２０ｋｂの平均断片長さに（例えばＣｏｖａｒｉｓ ｇ−ｔｕｂｅを使用して）剪断する。４０００ｒｐｍで６０秒間遠心する。
２．剪断したＤＮＡ試料を（例えば０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）濃縮する；
ａ．１容積のＡＭＰｕｒｅ ＰＢビーズを０．４５×容積のＤＮＡ試料に加える
ｂ．不均一に混合する。ボルテックスミキサーにおいて２０００ｒｐｍで１０分間振盪する；
ｃ．ビーズがチューブの片側に集まり、溶液が澄明になるまでチューブを磁石上に置く。澄明になった上清をピペットでビーズペレットを乱さないように慎重に吸引する；
ｄ．ＡＭＰｕｒｅ ＰＢビーズを７０％エタノールで２回洗浄する；
ｅ．残留エタノールを除去し、ビーズを３０〜６０秒間風乾する；
ｆ．３８μＬ ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）溶出緩衝液にビーズを再懸濁する。２０００ｒｐｍで１分間ボルテックスする。ビーズが集まり、溶液が澄明になるまでチューブを磁石上に置く；
ｇ．上清を慎重にピペッティングし、新しい０．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。
３．剪断したゲノムＤＮＡをエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理してＤＮＡ断片から一本鎖末端を取り除く。
ａ．ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）鋳型調製キットからのＤＮＡ損傷修復緩衝液、ＮＡＤ＋、ＡＴＰ高、ｄＮＴＰ及びＥｘｏＶＩＩ酵素を１倍になるように加える；
ｂ．３７℃で１５分間インキュベートする。反応を４℃に戻す。
４．２μＬのＤＮＡ損傷修復酵素ミックスを加えて３７℃で２０分間インキュベートすることによりＤＮＡ損傷を修復する。反応を１〜５分間４℃に戻す。
５．２．５μＬの末端修復酵素ミックスを加えて２５℃で５分間インキュベートすることによりＤＮＡ試料の末端を修復する。反応を４℃に戻す。
６．ＤＮＡ試料をステップ＃２にあるとおり（例えば０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）精製する。３０μＬ ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）溶出緩衝液に溶出させる。
ｂ．ＤＮＡライブラリ材料のＰｅｔａＯｍｉｃｓターゲットエンリッチメント
７．選択の二本鎖ＤＮＡ標的をキャプチャするためのＰＮＡ媒介ストランドインベージョン
ａ．５×ストランドインベージョン緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を１倍となるように加える；
ｂ．Ｔａｑ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を２μＭの最終濃度となるように加える；
ｃ．標的に向けられたガンマＰＮＡ（例えば、４つのガンマ−Ｌ−チアリジン及び４つのガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含む１８ｍｅｒ ＰＮＡ）のセットをＰＮＡ当たり４００ｎＭの最終濃度となるように加える；
ｄ．ホルムアミドを１４．４％の最終濃度となるように加える；
ｅ．十分に混合し、反応物を５０℃で３時間インキュベートする；
ｆ．ストリンジェンシーステップのため反応物を６０℃で５分間インキュベートしてＤＮＡとの不完全なＰＮＡ相互作用物を融解させる。
８．未結合の遊離ガンマＰＮＡを（例えばＰ１００サイズ排除カラムで）取り除く。
ａ．ストランドインベージョン反応物をカラムに加え、室温において１００×ｇで４分間スピンする。
９．ＢＳＡ不動態化Ｃ１ストレプトアビジン磁気ビーズでビオチン化ＰＮＡ結合標的ＤＮＡをキャプチャする。
ａ．洗浄してＢＳＡ不動態化したＣ１ストレプトアビジン磁気ビーズを１．５ｍＬエッペンドルフチューブにおいて５０μＬストランドインベージョン反応物、１００μＬ ｄＨ２Ｏ及び５０μＬ洗浄緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））に２００μＬの最終容積となるように再懸濁する；及び
ｂ．キャプチャ反応物を回転プラットフォーム上室温で２時間インキュベートする。
２１．ストレプトアビジンビーズを室温で洗浄緩衝液により３回洗浄する。溶液が澄明になるまで磁石上に置く。上清を捨てる。
２２．ストレプトアビジンビーズをサーモミキサー（撹拌＝８００ｒｐｍ）において５０℃で７分間インキュベートすることにより洗浄緩衝液で１回洗浄する。溶液が澄明になるまで磁石上に置く。上清を捨てる。
ｃ．オンビーズＰａｃＢｉｏヘアピンアダプターライゲーション
２３．キャプチャされたＤＮＡ分子を含有するストレプトアビジンビーズ上にＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ヘアピンアダプターを平滑末端ライゲーションでライゲートする。
ａ．アニーリングした平滑末端ヘアピンアダプター、鋳型調製緩衝液、ＡＴＰ低、ｄＨ２Ｏ及びリガーゼ酵素を加えることにより、洗浄したストレプトアビジンビーズを再懸濁する。ピペッティングによって十分に混合する；及び
ｂ．オンビーズライゲーション反応物を回転プラットフォーム上２５℃で一晩インキュベートする。
２４．反応物を６５℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを不活性化する。反応を４℃に戻す。
２５．ビーズを溶出緩衝液（例えば、１０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ９．７５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミド）に再懸濁してｐＨをガンマ−チアリジン基（ｐＫａ＝９．５）のｐＫａより高く上昇させ、ひいてはＰＮＡ融解温度を低下させることにより、キャプチャされた、アダプターがライゲートされた標的ＤＮＡをストレプトアビジンビーズから溶出させる。サーモミキサー（撹拌＝８００ｒｐｍ）において７５℃で７分間インキュベートする。極めて少量のＤＮＡをキャプチャする場合、担体としてスーパーコイル環状ＤＮＡの添加を加えることができる。
ｄ．ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ライブラリ調製及びシーケンシング
２６．溶出したＤＮＡ試料をエキソヌクレアーゼＩＩＩ及びエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理してライゲートしなかった産物を取り除く。反応物を３７℃で１時間インキュベートした後、反応を４℃に戻す。
２７．ライゲートしたＤＮＡ試料を（例えば、ステップ＃２にあるとおり０．４５×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）精製する。３０μＬ ｄＨ２Ｏに溶出させる。
２８．Ｂｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎ機器を使用してエンリッチ標的ＤＮＡをサイズセレクションする。
ａ．ＢＰ開始：８０００；ＢＰ終了：５００００
２９．ステップ＃２にあるとおり、サイズセレクションした標的ＤＮＡを（例えば１×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ磁気ビーズで）精製し、濃縮する。１０μＬ ＰＡＣＢＩＯ（登録商標）溶出緩衝液に溶出させる。
３０．ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ＲＳＩＩ機器を使用して標的エンリッチＤＮＡをシーケンシングする。
ｉｉｉ．Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ媒介ＰＮＡ鎖置換及び増幅を含めた、ＤＮＡシーケンシング用のＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ライブラリ調製ワークフローへのＰｅｔａＯｍｉｃｓエンリッチメント技術の援用
以下のプロトコル（ステップａ〜ｄ）は、記載される標的配列エンリッチメント方法をＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ媒介ＰＮＡ鎖置換及び増幅を含めたＤＮＡシーケンシングのワークフローにどのように援用することができるかを示す。当然ながら、ターゲットエンリッチメントステップをＤＮＡシーケンシングの前に実施することが可能であるが、実際には、本発明のターゲットエンリッチメント方法をＤＮＡシーケンシングワークフローに統合することが有利である。
ａ．ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ライブラリ調製
１．３〜５μｇの標的ＤＮＡ（例えばヒトゲノムＤＮＡ）を２０ｋｂの平均断片長さに（例えばＣｏｖａｒｉｓ ｇ−ｔｕｂｅを使用して）剪断する。４０００ｒｐｍで６０秒間遠心する。
２．剪断したＤＮＡ試料を（例えば０．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで）濃縮する：
ａ．１容積のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを０．４５×容積のＤＮＡ試料に加える；
ｂ．不均一に混合する。ボルテックスミキサーにおいて２，０００ｒｐｍで１０分間振盪する；
ｃ．ビーズがチューブの片側に集まり、溶液が澄明になるまでチューブを磁石上に置く。澄明になった上清をピペットでビーズペレットを乱さないように慎重に吸引する；
ｄ．ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを７０％エタノールで２回洗浄する；
ｅ．残留エタノールを除去し、ビーズを３０〜６０秒間風乾する；
ｆ．３４μＬ ＴＥ緩衝液にビーズを再懸濁する。２，０００ｒｐｍで１分間ボルテックスする；ビーズが集まり、溶液が澄明になるまでチューブを磁石上に置く；及び
ｇ．上清を慎重にピペッティングし、新しい０．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。
３．剪断されたＤＮＡ末端を修復する。
ａ．１０×末端修復緩衝液、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ及び末端修復酵素ミックスを加え、十分に混合する；
ｂ．反応物を室温で４５分間インキュベートする；及び
ｃ．７０℃で１０分間インキュベートして酵素を不活性化する。
４．末端修復されたＤＮＡを（例えば、ステップ＃２にあるとおり０．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで）精製する。４２μＬ ＴＥ緩衝液で溶出させる。
５．ＡテールをＤＮＡ末端にライゲートする。
ａ．ＮＥＢ Ｎｅｘｔ ｄＡテール付加緩衝液及びクレノウ断片を５０μＬの最終容積となるように加える。十分に混合し、３７℃で３０分間インキュベートする。
６．Ａテール付加ＤＮＡ断片をステップ＃２にあるとおり０．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製する。８μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
７．ＩＬＬＵＭＩＮＡ−ＭＯＬＥＣＵＬＯ（登録商標）アダプターをＴ４リガーゼでＤＮＡ末端にライゲートする。
ａ．２×迅速ライゲーション緩衝液、５０μＭのアニーリングしたＭｏｌｅｃｕｌｏアダプター及びＴ４リガーゼを２０μＬの最終容積となるように加える。十分に混合し、室温で１０分間インキュベートする。
８．ＩＬＬＵＭＩＮＡ−ＭＯＬＥＣＵＬＯ（登録商標）アダプターをライゲートしたＤＮＡ断片をステップ＃２にあるとおり０．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製する。
９．３０μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
ｂ．Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡライブラリ材料のＰｅｔａＯｍｉｃｓターゲットエンリッチメント
１０．標的ＤＮＡのガンマＰＮＡ媒介ストランドインベージョン
ａ．５×ストランドインベージョン緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）を１倍となるように加える；
ｂ．Ｔａｑ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を２μＭの最終濃度となるように加える；
ｃ．標的に向けられたガンマＰＮＡ（例えば、４つのガンマ−Ｌ−リジン及び４つのガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を有する１８ｍｅｒ ＰＮＡ）のセットをＰＮＡ当たり４００ｎＭの最終濃度となるように加える；
ｄ．ホルムアミドを１４．４％の最終濃度となるように加える；
ｅ．十分に混合し、反応物を５０℃で３時間インキュベートする；及び
ｆ．ストリンジェンシーステップのため反応物を６０℃で５分間インキュベートしてＤＮＡとの不完全なＰＮＡ相互作用物を融解させる。
１１．未結合の遊離ガンマＰＮＡを（例えばＰ１００サイズ排除カラムで）取り除く。
ａ．ストランドインベージョン反応物をカラムに加え、室温において１００×ｇで４分間スピンする。
１２．ＢＳＡ不動態化Ｃ１ストレプトアビジン磁気ビーズでビオチン化ＰＮＡ結合標的ＤＮＡをキャプチャする。
ａ．洗浄してＢＳＡ不動態化したＣ１磁気ビーズを１．５ｍＬエッペンドルフチューブにおいて５０μＬストランドインベージョン反応物、１００μＬ ｄＨ２Ｏ及び５０μＬ洗浄緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））に２００μＬの最終容積となるように再懸濁する；及び
ｂ．キャプチャ反応物を回転プラットフォーム上室温で２時間インキュベートする。
３１．ストレプトアビジンビーズを室温で洗浄緩衝液により３回洗浄する。溶液が澄明になるまで毎回磁石上に置く。上清を捨てる。
３２．ストレプトアビジンビーズをサーモミキサー（撹拌＝８００ｒｐｍ）において４５℃で７分間インキュベートすることにより洗浄緩衝液で１回洗浄する。溶液が澄明になるまで磁石上に置く。上清を捨てる。
ｃ．標的ＤＮＡのオンビーズＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ媒介ＰＮＡ鎖置換及び増幅
３３．ストレプトアビジンビーズからの標的ＤＮＡの溶出及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるその増幅を同時に行う。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ酵素は、ＤＮＡから結合したＰＮＡを鎖置換することが示されている（Ｂｒｕｄｎｏ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；６（２）：ｐｐ．１４８−１５５（２０１０））。
ａ．５×Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ反応緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ−Ｍｏｌｅｃｕｌｏアダプター特異的プライマー、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＨ２Ｏを５０μＬ最終容積となるように加えることにより、洗浄したストレプトアビジンビーズを再懸濁する。ピペッティングによって十分に混合する；及び
ｂ．反応物をＡｇｉｌｅｎｔプロトコルに従うサイクリング条件でサーモサイクラーにかける。
３４．増幅された標的ＤＮＡ断片を（例えば、ステップ＃２にあるとおり０．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで）精製する。２０μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。Ｑｕｂｉｔ機器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）でＤＮＡ濃度を決定する。
ｄ．Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ用のＮＥＢＮｅｘｔライブラリ調製
３５．増幅された標的ＤＮＡを約４００ｂｐに（例えば音波処理で）剪断する。
３６．断片化されたＤＮＡを末端修復する。
ａ．ＮＥＢＮｅｘｔ末端修復反応緩衝液１０×、ＮＥＢＮｅｘｔ末端修復酵素ミックス及びｄＨ２Ｏを１００μＬの最終容積となるように加える；及び
ｂ．２０℃で３０分間インキュベートする。
３７．末端修復されたＤＮＡを（例えば、ステップ＃２にあるとおり１．６×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで）精製する。４７μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
３８．末端修復したＤＮＡのｄＡテール付加
ａ．ＮＥＢＮｅｘｔ ｄＡテール付加反応緩衝液（１０×）及びクレノウ断片を５０μＬの最終容積となるように加える；及び
ｂ．サーマルサイクラーにおいて３７℃で３０分間インキュベートする。
３９．末端修復されたＤＮＡを（例えば、ステップ＃２にあるとおり１．６×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで）精製する。３０μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
４０．ｄＡテール付加ＤＮＡのインデックス付きアダプターライゲーション
ａ．Ｑｕｉｃｋライゲーション反応緩衝液（５×）、ＮＥＢＮｅｘｔアダプター及びＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを５０μＬの最終容積となるように加える；
ｂ．２０℃で１５分間インキュベートする；及び
ｃ．ＵＳＥＲ酵素ミックスを加え、ピペッティングによって混合する。３７℃で１５分間インキュベートする。
４１．末端修復されたＤＮＡを（例えば、ステップ＃２にあるとおり１．６×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで）精製する。１０５μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
４２．アダプターをライゲートしたＤＮＡをＮＥＢＮｅｘｔプロトコルに従いＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用してサイズセレクションする。１７μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
４３．アダプターをライゲートしたＤＮＡのＰＣＲエンリッチメント
ａ．選択のインデックス付加用プライマーミックス及びＮＥＢＮｅｘｔ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ＰＣＲマスターミックスを５０μＬ最終容積となるように加える；及び
ｂ．反応物をＮＥＢＮｅｘｔプロトコルに従うサイクリング条件でサーマルサイクラーにかける。
４４．インデックス付加された、増幅されたＤＮＡをステップ＃２にあるとおり０．９×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製する。３０μＬ ＴＥ緩衝液に溶出させる。
４５．Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ又はＮｅｘｔＳｅｑ機器を使用して標的エンリッチＤＮＡをシーケンシングする。
実施例１：２つのビオチン化ＰＣＲプライマーの使用は長い二本鎖ＰＣＲ産物の９９％のキャプチャを媒介する
共有結合的に結合したビオチンハプテンが極めて長いＤＮＡ分子のキャプチャを媒介する能力を評価した。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの結合能は限られているため、ＤＮＡ分子１つにつき単一のビオチン残基では、遊離ビオチン化プローブとの競合に不十分であり得る。
ビオチン化ＰＣＲ産物のキャプチャを１つ以上のビオチン化ＰＣＲプライマーの使用に基づき評価するため、単一のビオチン化ＰＣＲプライマーを使用して、０．５μＭビオチン化プローブ競合物の存在下で長い二本鎖ＰＣＲ産物３，５８１塩基対長をキャプチャした。この実験はまた、２つのビオチン化ＰＣＲプライマーも使用して行った。ビオチン化ＰＣＲ産物のキャプチャ後に上清中に残ったＤＮＡ材料をアガロースゲル上に可視化し、定量化した。
材料及び方法
フォワード及びリバースビオチン化プライマー（２Ｘビオチン）又はフォワードビオチン化プライマー並びに１００ｎｇのビオチン化ＤＮＡ標的、３７５ｎｇの非ビオチン化ラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ及び指示されるとおりの漸増濃度の競合ビオチン化プローブからなるキャプチャ反応物（「ｃｏｍｐ」）のいずれかを使用したヒトミトコンドリアＤＮＡゲノムの３，５８１ｂｐ領域のＰＣＲ増幅により、２つの異なるビオチン化ＤＮＡ標的を作製した。ＤＮＡ混合物を２５０μｇの常磁性Ｍ２８０ストレプトアビジンＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）にＫｉｌｏｂａｓｅｂｉｎｄｅｒ結合緩衝液と共に加えた。この混合物を回転させながら室温で２時間インキュベートした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）＋任意の結合したビオチン化ＤＮＡを磁石上でインキュベートすることにより混合物から分離した。未結合ＤＮＡ混合物を０．５％アガロースゲル上６０Ｖで１６時間電気泳動した。このゲルを染色し、デジタル画像を取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してデンシトメトリーを実施した。入力に対して正規化したラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩ ９４１６ｂｐバンドに対するビオチン化標的バンドの強度比を可視化した。３５８１ｂｐにおける標的バンドがビオチン化ＰＣＲ産物に相当した。
結果
この単一ビオチンキャプチャ実験では、ゲルバンドの定量化分析によって決定するとき、０．５μＭ競合ビオチン化プローブの存在下でＰＣＲ産物の約５７％が上清中に残る。０．２５μＭ及び０．５μＭの濃度のビオチン化プローブ競合物の存在下でゲルに核酸断片３，５８１ｂｐ長に対応するバンドを観察することができた。対照的に、２つのビオチン化ＰＣＲプライマーの使用は、０．５μＭビオチン化プローブ競合物の存在下であっても、３，５８１塩基対長の長い二本鎖ＰＣＲ産物の高収率キャプチャに十分であった。
ゲルにおいて観察されたとおり、ＰＣＲ産物の僅か１％のみが上清中に残り、これは９９％のキャプチャに相当する。
実施例２：ＰＮＡ骨格のガンマ修飾を有するＰＮＡプローブは長い二本鎖ＤＮＡをキャプチャする
ＰＮＡ骨格のガンマ修飾を含むＰＮＡプローブが極めて長いＤＮＡ分子のキャプチャを媒介する能力を評価した。６つのガンマリジン修飾及び１つのガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含む各２０塩基長の１つ又は２つのビオチン化ＰＮＡプローブによる標的ＤＮＡのストランドインベージョン及びキャプチャ後に上清中に残るＤＮＡ材料をアガロースゲル上に可視化し、定量化した。
材料及び方法
ストランドインベージョン反応物は、１００ｎｇの１１，９７０ｂｐ ＤＮＡ標的（ヒトＣＣＲ５遺伝子を含有するゲノム領域をキャプチャするＰＣＲ産物）、３７５ｎｇのラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩ非標的ＤＮＡ、２μＭ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．４μＭ ＰＮＡからなった。対照（Ｃｏｎｔ．）はＰＮＡ又はＳＳＢを含有しなかった。反応物を４６℃で４時間、次に５５℃で５分間インキュベートした。ＤＮＡを遊離ＰＮＡプローブと分離するため、これらの反応物をＰ１００サイズ排除カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に流した。対照及びＰＮＡ含有実験レーンはデュプリケートでロードした。キャプチャ反応及び未結合ＤＮＡの回収を行った。試料はゲル電気泳動及びデンシトメトリーによって分析した。
キャプチャ効率を評価するため、ゲルにおいて観察されたバンドの強度から３列のデンシトメトリー比を計算した。結合しなかった標的ＤＮＡの割合は、キャプチャ後の溶液中に残る標的ＤＮＡの相対量として計算した。標的ＤＮＡバンドの強度はラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩ ２３２２ｂｐ非標的バンドに対して正規化した。実際のキャプチャは、１−（結合しなかった標的の割合）として計算した。各比はそのセット中の対照の１つに対して決定した。
結合しなかった非標的の割合は、ＰＮＡプローブによるキャプチャの特異性の関数として計算した。この値は、２３２２ｂｐ非標的バンドに対するラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩ ９４１６ｂｐ非標的バンドの比として決定した。非標的正規化回収率は、「結合しなかった非標的の割合」値に対する「結合しなかった標的の割合」値の比率として計算した。この値から、１１，９７０ｂｐの標的バンドに特異的であったキャプチャされた全材料（即ち、ＰＮＡプローブによって特異的に標的化されたＤＮＡ）の割合が得られた。
結果
単一のビオチン化ＰＮＡキャプチャプローブの使用は、１１，９７０塩基対長の標的ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡキャプチャには不十分であった。対照的に、２つ（又はそれを上回る）のビオチン化ＰＮＡキャプチャプローブの使用は、１１，９７０塩基対長の標的ＤＮＡの高収率の二本鎖ＤＮＡキャプチャに十分であった。１１，９７０ｋｂのゲルバンドに可視化された、キャプチャ後に上清中に残った材料は、１．４％〜１４．９％の範囲であった。従って、ＤＮＡ断片内の２つのビオチン化ＰＮＡプローブからのキャプチャ収率は９８．５％〜８５．１％の範囲であった。
実施例３：平均サイズ１０ｋｂのゲノムＤＮＡ調製物から単一の標的遺伝子をキャプチャすることができる
ストランドインベージョン用ＰＮＡプローブによる長い二本鎖ＤＮＡのキャプチャを利用して、全ゲノムＤＮＡから目的のＤＮＡセグメントを単離した。平均サイズ１０ｋｂのゲノムＤＮＡ調製物からＣＣＲ５遺伝子を含有するゲノム領域をキャプチャすることができるかどうかを決定する実験を行った。
材料及び方法
６つのガンマリジン修飾及び１つのガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含む単一のＰＮＡプローブ２０塩基長を使用した。１つのＰＮＡプローブによってキャプチャされた剪断ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して半定量的ＰＣＲを行った。３μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ 番号ＮＡ２３２４８）をＣｏｖａｒｉｓ ｇ−ＴＵＢＥ（商標）を使用して１０ｋｂの平均サイズに剪断した。剪断されたゲノムＤＮＡを２μＭ一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．４μＭ ＣＣＲ ６Ｋ ＰＮＡと合わせ、４６℃で４時間、続いて５５℃で５分間インキュベートした。ＰＮＡを含有しない対照試料も含めた。Ｐ１００カラムでサイズ排除を実施し、Ｍ２８０ストレプトアビジンＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）でビオチン化ＤＮＡをキャプチャした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）及び結合したＤＮＡを磁石で分離し、上清から未結合のＤＮＡを確保しておいた（「上清」）。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）及び結合したＤＮＡを洗浄緩衝液で２回洗浄し、結合したＤＮＡをビーズから２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０％ホルムアミドに、撹拌しながら６５℃で５分間インキュベートすることにより溶出させた（「溶出物」）。
結合ＤＮＡ「溶出物」及び「上清」試料をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで濃縮及び精製し、ｄＨ２Ｏに溶出させた。これらの試料を濃縮及び精製する代替的方法としては、限定はされないが、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４）及び従来のフェノール−クロロホルム抽出が挙げられる。特異的ゲノム標的（ＣＣＲ５遺伝子領域、３番染色体、「ＣＣＲ １１０５５」）及び対照非標的ゲノム領域（ＡＲ遺伝子領域、Ｘ染色体、「ＡＲ ９８２７」）に対するプライマーを使用した半定量的ＰＣＲをＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼで実施した。半定量的ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、染色し、及びデジタル画像を取得した。前述のプライマー及び鋳型として剪断ゲノムＤＮＡ出発物質を使用した半定量的ＰＣＲも行った（「入力」）。
結果
半定量的ＰＣＲ産物の電気泳動に基づけば、「上清」はＣＣＲ５ゲノムＤＮＡの約５０％を含み、単一のＰＮＡプローブを使用したためＰＮＡベースのゲノムＤＮＡ断片キャプチャが不完全であることが示された。
実施例４：ＰＮＡプローブは、ＤＮＡシーケンシングプロトコルを用いて構築したゲノムライブラリから目的のＤＮＡセグメントを単離することができる
ストランドインベージョン用ＰＮＡプローブによる長い二本鎖ＤＮＡのキャプチャを利用して、ＤＮＡシーケンシングプロトコルを用いて構築したゲノムライブラリから目的のＤＮＡセグメントを単離することができる。例えば、この手順は、図３に示す実験ワークフローを用いて行うことができる。
材料及び方法
この実験には単一のＰＮＡプローブを使用した。プローブは２０塩基長であり、６つのガンマリジン修飾及び１つのガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含んだ。１つのＰＮＡプローブによってキャプチャされたゲノムライブラリＤＮＡを鋳型として使用して半定量的ＰＣＲを行った。
簡潔に言えば、３μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ 番号ＮＡ２３２４８）をＣｏｖａｒｉｓ ｇ−ＴＵＢＥ（商標）を使用して１０ｋｂの平均サイズに剪断した。修復されたＤＮＡ末端にＤＮＡアダプターをライゲートした。アダプターをライゲートしたゲノムＤＮＡを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．４μＭ ＰＮＡ中の２μＭ一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）と合わせた。ＰＮＡを含有しない対照試料も含めた。
Ｐ１００カラムでサイズ排除を実施し、Ｍ２８０ストレプトアビジンＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）でビオチン化ＤＮＡをキャプチャした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）及び結合したＤＮＡを磁石で分離し、上清から未結合のＤＮＡを確保しておいた（「上清」）。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）及び結合したＤＮＡを洗浄緩衝液で２回洗浄し、結合したＤＮＡをビーズから２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０％ホルムアミドに、撹拌しながら６５℃で５分間インキュベートすることにより溶出させた（「溶出物」）。
結合ＤＮＡ「溶出物」及び「上清」試料をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで濃縮及び精製し、ｄＨ２Ｏに溶出させた。これらの試料を濃縮及び精製する代替的方法としては、限定はされないが、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４）及び従来のフェノール−クロロホルム抽出が挙げられる。
特異的ゲノム標的（ＣＣＲ５遺伝子領域、３番染色体、「ＣＣＲ １１０５５」）及び対照非標的ゲノム領域（ＡＲ遺伝子領域、Ｘ染色体、「ＡＲ ９８２７」）に対するプライマーを使用した半定量的ＰＣＲをＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで実施した。半定量的ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、染色し、及びデジタル画像を取得した。
結果
ＰＮＡプローブがゲノムライブラリから目的のＤＮＡセグメントを単離できることを実証するため、１０キロベース長の断片で構築したゲノムシーケンシングライブラリからＣＣＲ５遺伝子を含有するゲノム領域を特異的にキャプチャした。
キャプチャされた材料はＣＣＲ５ゲノムＤＮＡを含有するが、単一のＰＮＡプローブのみを使用したためキャプチャは不完全である。「溶出物」画分にはゲノムのＡＲ遺伝子領域からのＤＮＡは存在しなかった。
実施例５：３つのＰＮＡプローブを組み合わせた使用はゲノムライブラリＤＮＡの高度に効率的な配列特異的キャプチャをもたらす
１０キロベース長の断片で構築したゲノムシーケンシングライブラリからアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子を含有するゲノム領域を特異的にキャプチャすることができるかどうかを決定する実験を行った。鋳型としての３つのＰＮＡプローブによってキャプチャされたＤＮＡの量を半定量的ＰＣＲによって決定した。
材料及び方法
３μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ 番号ＮＡ２３２４８）をＣｏｖａｒｉｓ ｇ−ＴＵＢＥ（商標）を使用して１０ｋｂの平均サイズに剪断した。修復されたＤＮＡ末端にＤＮＡアダプターをライゲートした。アダプターをライゲートしたゲノムＤＮＡを２μＭ一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．４μＭの、ヒトＡＲ遺伝子の領域を標的化する３つのＰＮＡの各々と合わせ、４６℃で４時間、次に５５℃で５分間インキュベートした。
この実験で使用した３つのＰＮＡプローブの各々は２０塩基長であり、６つのガンマリジン修飾及び１つのガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含有した。
ＰＮＡを含有しない対照試料も含めた。Ｐ１００カラムでサイズ排除を実施し、Ｍ２８０ストレプトアビジンＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）でビオチン化ＤＮＡをキャプチャした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）及び結合したＤＮＡを磁石で分離し、上清から未結合のＤＮＡを確保しておいた（「上清」）。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）及び結合したＤＮＡを洗浄緩衝液で２回洗浄し、結合したＤＮＡをビーズから２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０％ホルムアミドに、撹拌しながら６５℃で５分間インキュベートすることにより溶出させた（「溶出物」）。結合ＤＮＡ溶出物及び上清試料をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで濃縮及び精製し、ｄＨ２Ｏに溶出させた。これらの試料を濃縮及び精製する代替的方法としては、限定はされないが、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４）及び従来のフェノール−クロロホルム抽出が挙げられる。
特異的ゲノム標的（ＡＲ遺伝子領域、Ｘ染色体、「ＡＲ ９８２７」）及び２つの異なる対照非標的ゲノム領域（ＣＣＲ５遺伝子領域、３番染色体、「ＣＣＲ ８９２５」及びＧＡＰＤＨ遺伝子領域、１２番染色体、「ＧＡＰＤＨ ２８１」）の１つに対するプライマーを使用した半定量的ＰＣＲをＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで実施した。半定量的ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、染色し、及びデジタル画像を取得した。
結果
アガロースゲル上に可視化及び定量化された半定量的ＰＣＲ産物に基づけば、キャプチャされた材料はＡＲゲノムＤＮＡを含有した。上清中にはＡＲゲノム材料のＰＣＲ増幅はなかった。従って、３つのＰＮＡプローブを組み合わせた使用が高度に効率的なキャプチャをもたらす。対照にはゲノムのＣＣＲ領域からのＤＮＡ並びにＧＡＰＤＨ領域からのＤＮＡが含まれ、これらは両方とも溶出物中には存在しなかった。従って、ＤＮＡキャプチャは高度に特異的であった。
実施例６：３つのＰＮＡプローブの組み合わせは、ＤＮＡの元のサイズ及び二本鎖ヘリックスコンホメーションを維持している標的ｄｓＤＮＡをもたらす
２つのビオチン化ＰＮＡプローブＡ９８２７及びＡ２４８６によるストランドインベージョンのプロセスに供し、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズにキャプチャし、及び部分的変性条件下で放出させた後の二本鎖ＤＮＡ分子のサイズ及び構造的完全性を評価する実験を実施した。
材料及び方法
キャプチャ反応物は、ヒトゲノムのＡＲ領域に特異的な２つの異なるビオチン化ＰＮＡプローブからなった。各ＰＮＡプローブは２０塩基長であり、６つのガンマリジン修飾及び１つのガンマＭｉｎｉ−ＰＥＧ修飾を含有した。ストランドインベージョン反応物は、４００ｎｇの１１，９４２ｂｐ ＤＮＡ標的（ヒトＡＲ遺伝子を含有するゲノム領域をキャプチャするＰＣＲ産物）、２μＭ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．４μＭ ＰＮＡからなった。対照はＰＮＡプローブを含有しなかった。反応物を４６℃で４時間、続いて５５℃で５分間インキュベートした。ＤＮＡを遊離ＰＮＡプローブと分離するため、これらの反応物をＰ１００サイズ排除カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に流した。ＤＮＡ混合物を２５０μｇの常磁性ＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）Ｍ２８０ストレプトアビジンにＫｉｌｏｂａｓｅｂｉｎｄｅｒ結合緩衝液と共に加えた。この混合物を回転させながら室温で２時間インキュベートした。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）＋任意の結合したビオチン化ＤＮＡを磁石上でインキュベートすることにより混合物から分離した。
２０ｍＭトリス ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミドからなる変性緩衝液を６５℃で５分間使用して、キャプチャされたＤＮＡを磁気ビーズから放出させた。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）から溶出したＤＮＡ及び上清中に存在するＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）で濃縮及び精製した。これらの試料を濃縮及び精製する代替的方法としては、限定はされないが、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０４）及び従来のフェノール−クロロホルム抽出が挙げられる。ゲル電気泳動分析を用いて、キャプチャされたＤＮＡのサイズを元の長い二本鎖ＤＮＡ材料のサイズと比較した。ＤＮＡ試料を０．７％アガロースゲル上１２５Ｖで３時間電気泳動した。このゲルを染色し、デジタル画像を取得した。
結果
これらの結果から、ＡＲ ＤＮＡ（ＰＣＲによって生成された長い二本鎖ＤＮＡ）が、キャプチャ反応物の上清中になおも存在する元のＤＮＡと非変性アガロースゲルにおいて同じ位置（即ち、１１９４２塩基対のバンド）に移動することが実証された。
従って、複数のＰＮＡプローブによる二本鎖ＤＮＡのストランドインベージョン及びキャプチャに基づくこのＤＮＡエンリッチメント方法は、キャプチャ及び放出後に、ＤＮＡ標的の元のサイズ及び二本鎖ヘリックスコンホメーションを維持している材料をもたらす。
実施例７：ＰＮＡプローブにおけるガンマ修飾されたｍｉｎｉ−Ｐｅｇ残基の比率を短い二本鎖ＤＮＡ標的のストランドインベージョンに最適化することができる
短いＰＣＲ産物をＤＮＡ鎖インベージョン標的として使用して、単純なストランドインベージョンアッセイを考案した。同じ配列を標的化するが、異なる比率のｍｉｎｉ−ｐｅｇ及びｌ−リジン修飾を有するＰＮＡプローブを試験した。
材料及び方法
８ナノモル濃度のＤＮＡ標的を、２０ｍＭトリス ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中に５０μｌ反応容積で入れた。ＰＮＡプローブを０．３μＭの濃度で加えた。これらの試料を５２℃で３０、６０、１２０又は１８０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を冷却し、１％アガロース非変性ゲルにおいて１２５Ｖで３．５時間分離した。第２のゲルシフト実験で使用した１９塩基ＰＮＡプローブは、以下の表５に提供するとおりである。
Figure 0006937294
結果
表２にある１９塩基プローブの各々を使用したゲルシフト分析の結果から、Ｃ４９０２／４Ｋ／１０ＭＰ（２１％リジン）プローブがＣ４９０２／３Ｋ／１１ＭＰ（１６％リジン）プローブと比べてＤＮＡのインベージョン及び二本鎖ＤＮＡバンドのシフトアップにおいてより高効率であることが示された。Ｃ４９０２／２Ｋ／１２ＭＰプローブ（１０．５％リジン）は最も効率が低く、これらの条件下で観察可能なストランドインベージョンを生じなかった。
実施例８：ＰＮＡプローブにおける正電荷ガンマ−Ｌ−リジン残基の含有量をストランドインベージョンに最適化することができる
ガンマリジン対ｍｉｎｉｐｅｇ含有量の影響を決定するため、同じ配列を標的化するが、同じ又はやや異なるｌ−リジン修飾含有量で異なるｍｉｎｉ−ｐｅｇ比率を有するＰＮＡプローブを試験した。
方法
実施例７と同様の実験において、但しやや高いプローブ濃度を利用して、１４ナノモル濃度のＤＮＡ標的を、２０ｍＭトリス ｐＨ８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中に５０μｌ反応容積で入れた。ＰＮＡプローブを０．５μＭの濃度で加えた。これらの試料を５２℃で３０、６０、１２０又は１８０分間インキュベートした。インキュベーション後試料を冷却し、１％アガロース非変性ゲルにおいて１２５Ｖで３．５時間分離した。第２のゲルシフト実験で使用した１９塩基ＰＮＡプローブは、以下の表６に提供するとおりである。
Figure 0006937294
結果
表５の１９塩基プローブによるゲルシフト分析の結果から、５Ｋ／１ＭＰ（２６％リジン）及び５Ｋ／４ＭＰ（２６％リジン）プローブがＤＮＡのインベージョン及び二本鎖ＤＮＡバンドのシフトアップにおいて等しく効率的であることが示された。４Ｋ／１０ＭＰ（２１％リジン）プローブは５Ｋ／１Ｍｐ及び５Ｋ／４ＭＰプローブと比べると幾らか低効率である。
これらの結果は、ＰＮＡ中の正電荷ガンマ−Ｌ−リジン残基の含有量が効率的ストランドインベージョンを生じさせるのに少なくともｍｉｎｉ−ＰＥＧ含有量の含有量と同程度の影響があることを示唆する。インベージョン反応は５２℃で２時間インキュベートすると本質的に完全となる。
実施例９：ファージラムダＤＮＡの複数の制限酵素断片を含有する混合物からの所望の二本鎖ＤＮＡ断片の配列エンリッチメントプロトコル
本方法がファージラムダＤＮＡ塩基対の複数の制限酵素断片を含有するＤＮＡ試料から所望の８５００の断片をエンリッチする能力を実証するため、以下のプロトコルを設計した。
方法
使用したＰＮＡプローブ対には、４つのガンマ−Ｌ−リジン修飾及び３つのガンマ−Ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾（Ｃ５３９１ ４Ｋ／３ＭＰ＋Ｃ８９２５ ４Ｋ／３ＭＰ；４Ｋ対）、又は６つのガンマ−Ｌ−リジン修飾及び１つのガンマ−Ｍｉｎｉ−ＰＥＧ修飾（Ｃ５３９１ ６Ｋ／１ＭＰ＋Ｃ８９２５ ６Ｋ／１ＭＰ；６Ｋ対）のいずれかが含まれた。
１．６５℃で１０分間加熱することによりプローブを調製する。ボルテックスし、スピンダウンする。
２．３７５ｎｇ ラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ、２００ｎｇ ＣＣＲ ８５００標的、２０ｐｍｏｌ／プローブ、５×ＳＩ緩衝液、１．９５μＬ ＳＳＢ、７．２μＬホルムアミド及びＨ２Ｏを合わせて総容積を５０μＬとする；最終濃度は４００ｎＭの各プローブ、４１．７ｍＭ ＮａＣｌ、１．５μＭ Ｍ ＳＳＢ、１４％ホルムアミドである。
３．５つの試料を上記のとおり作製し、但し１つのチューブにはプローブを加えない（「−対照」）。
４．各チューブを短時間ボルテックスし、スピンダウンして全ての液体を底に至らせる。
５．４６℃又は５０℃で４時間インキュベートし、次に５５℃又は６０℃で５分間インキュベートする。
６．遊離プローブからＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによってＤＮＡを精製する。５０μＬ ＴＥに溶出させる。
７．精製した反応物をＢＳＡ不動態化Ｃ１ビーズ＋５０μＬ結合緩衝液＋１００μＬ Ｈ２Ｏと合わせる。
８．キャプチャ反応物を室温でローテータにおいて２時間インキュベートする。
９．ローテータから試料を取り出し、磁石上に３分間置く（上清を新しいチューブに移す）。
１０．１５０μＬ ０．０２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）洗浄緩衝液をビーズに加え、ピペッティングによって再懸濁し、３０秒間混合し、磁石上に２分間置く。洗浄緩衝液を捨てる。
１１．洗浄ステップを４回繰り返し、洗浄液を捨てる。
１２．１００μＬ溶出緩衝液（１０ｍＭトリス ｐＨ８、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミド）を洗浄したビーズに加え、ボルテックスし、スピンして、サーモミキサーにおいて撹拌しながら（８００）６５℃で５分間インキュベートする。
１３．チューブを磁石上に３分間置く。溶出した材料を新しいチューブに移す。
１４．ＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（０．８：１比）で精製し、８０％エタノールで２回洗浄し、４０μＬ ｄＨ２Ｏに溶出させる。
１５．０．２ｍＬプラスチックチューブにおいて２０μＬの上清又は精製溶出物を５μＬローディング色素と混合する。
１６．ＤＮＡ試料を０．５％アガロースゲルにロードし、水冷器を５℃にして６０Ｖで１６時間泳動させる。
１７．ゲルをＤｉａｍｏｎｄ核酸染色剤で（例えば４５分間）染色する。
１８．ゲルをリンスし、（例えばＥｎｄｕｒｏ Ｇｅｌ Ｄｏｃシステムで）可視化する。
結果
４Ｋ／３ＭＰ ＰＮＡプローブで最良のエンリッチメント（８３：１）が得られた。６Ｋ／１ＭＰプローブは標的キャプチャ能力があったが、これらはまたラムダＤＮＡも非特異的にキャプチャし、溶出物にバンドが現れた。この非特異的キャプチャは、ゲル上にはっきりと見ることができる。
実施例１０：全ヒトゲノムＤＮＡからの８Ｋｂ、二本鎖ゲノムＤＮＡの特異的断片の配列エンリッチメントプロトコル
本方法が全ヒトゲノムＤＮＡから所望の８，０００塩基対断片をエンリッチする能力を実証するため、以下のプロトコルを設計した。
方法
使用したＰＮＡプローブ対には、５つのガンマ−Ｌ−リジン修飾及び１つ又は２つのガンマ−Ｍｉｎｉ−Ｐｅｇ修飾（Ｃ４９０２ ５Ｋ／１ＭＰ＋Ｃ５３９１ ５Ｋ／２ＭＰ＋Ａ１７６７ ５Ｋ／１ＭＰ＋Ａ２４８６ ５Ｋ／２ＭＰ；５Ｋ／２ＭＰ対）のいずれかが含まれた。非特異的キャプチャの対照は１８Ｓ及び５ＳリボソームＤＮＡであった。実験は以下の条件に従い行った：
１．６５℃で１０分間加熱することによりプローブを調製し、次にボルテックスし、スピンダウンする。
２．１μｇ ＮＡ２３２４８ｇ ＤＮＡ（１５ｋｂ断片に剪断したもの）、１．５ｎｇ ＣＣＲ８２５０標的ＤＮＡ、１．５ｎｇ ＡＲ９１２７標的、２０ｐｍｏｌｅ各プローブ、５×ＳＩ緩衝液、２．６０μＬ ＳＳＢ、７．２μＬホルムアミドを合わせ、Ｈ２Ｏを加えて総容積を５０μＬにする。最終濃度は４００ｎＭ各プローブ、４１．７ｍＭ総ＮａＣｌ、２μＭ ＳＳＢ、１４％ホルムアミドであった。
３．プローブ濃度各２００ｎＭ；２つの試料を作り、一方のチューブにはプローブを加えない（「対照」） − １つのプローブなし試料＋１つの全プローブ含有試料。
４．各チューブを短時間ボルテックスし、スピンダウンして全ての液体を底に至らせる。
５．チューブをドライバスに入れ、５０℃で４時間インキュベートし、次に６０℃で５分間インキュベートする。
６．遊離プローブから１ｉ ｘＸ Ｐ１００カラムによってＤＮＡを精製する。１００×ｇで４分間スピンする。
７．精製したＳＩ反応物をＢＳＡ不動態化Ｃ１磁気ビーズ＋１００μＬ Ｈ２Ｏと合わせる。
８．キャプチャ反応物を室温でローテータにおいて２時間インキュベートする。
９．ローテータから試料を取り、磁石上に３分間置く。上清を新しいチューブに移す。
１０．１５０μＬ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液をビーズに加え、ピペッティングによって再懸濁し、３０秒間ボルテックスし、磁石上に２分間置く。洗浄緩衝液を捨てる。
１１．洗浄を３回繰り返し、洗浄液を捨てる。
１２．１５０μＬ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液を加え、再懸濁してサーモミキサーで５０℃×７分間インキュベートする。
１３．１００μＬ溶出緩衝液（１０ｍＭトリス ｐＨ８、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ホルムアミド）を洗浄したビーズに加え、ボルテックスし、スピンして、サーモミキサーにおいて撹拌しながら７５℃で７分間インキュベートする。
１４．チューブを磁石上に３分間置く。溶出物を新しいチューブに移す。
１５．上清を精製し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズでＤＮＡを溶出させて、エタノールで２回洗浄し、４０μＬ ｄＨ２Ｏ中に溶出させる。上清を精製し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズでＤＮＡを溶出させて、エタノールで２回洗浄し、４０μＬ ｄＨ２０に溶出させる。
１６．対照上清、対照溶出物、ＰＮＡ上清及びＰＮＡ溶出物を鋳型として使用してｑＰＣＲを調製する。
結果
この実験では、ヒトＤＮＡを標的遺伝子に対する９，０００塩基ＰＣＲ産物でスパイクすることにより、リボソーム遺伝子のコピー数と同じ目標遺伝子コピー数を達成した。
結果は、図４Ａ〜図４Ｄに各試料中のＤＮＡのコピー数の値を示すヒストグラムとして表される。「対照ｓｕｐ」と表示されたヒストグラムバーは上清中に残る材料を指し、一方、「対照ｅｌｕ」は、ＰＮＡプローブを省いた実験の溶出物に検出されたキャプチャされたＤＮＡを指す。
使用した４つの異なるＰＮＡプローブ、２つはアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子を標的とし、別の２つはＣＣＲ５遺伝子を標的とした。全てのプローブが５つのガンマ−Ｌ−リジン残基及び１つ又は２つのいずれかのガンマ−ｍｉｎｉ−ＰＥＧ残基を有する。「５Ｋ ｓｕｐ」と表示されたヒストグラムバーは上清中に残る材料を指し、一方、「５Ｋ ｅｌｕ」は、５Ｋ−ＰＮＡプローブが存在する実験の溶出物に検出されたキャプチャされたＤＮＡを指す。
１８Ｓ及び５ＳリボソームＤＮＡの対照溶出物は、１，０００個未満のキャプチャされた分子を含有した。対照的に、５Ｋ溶出物は、それぞれＣＣＲ５及びＡＲ遺伝子領域について９６，６９４個及び７４，４８４個のキャプチャされた標的分子を含有した。これらの数は、両方の遺伝子とも、１０３．４倍の平均ターゲットエンリッチメントレベルに相当した。
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Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ｔ，Ｔｅｄｅｓｃｈｉ Ｔ，Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ Ｒ，Ｋｏｍｉｙａｍａ Ｍ，Ｓｆｏｒｚａ Ｓ，Ｍａｒｃｈｅｌｌｉ Ｒ．「プレオーガナイズされたＰＮＡの二本鎖ＤＮＡへのＳＳＢ補助二重鎖インベージョン（ＳＳＢ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄ ＰＮＡ ｉｎｔｏ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）」．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００９ Ｎｏｖ ２；１０（１６）：２６０７−１２．
Ｉｔｏ Ｔ，Ｓｍｉｔｈ ＣＬ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ．「三重鎖アフィニティーキャプチャによる配列特異的ＤＮＡ精製（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒｉｐｌｅｘ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ）」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２ａ Ｊａｎ １５；８９（２）：４９５−８．
Ｉｔｏ Ｔ，Ｓｍｉｔｈ ＣＬ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ．「酵母ゲノムライブラリからの単一コピークローンの三重鎖アフィニティーキャプチャ（Ｔｒｉｐｌｅｘ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｃｌｏｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ｂ Ｊｕｌ １１；２０（１３）：３５２４．
Ｋｕｈｎ Ｈ，Ｓａｈｕ Ｂ，Ｒａｐｉｒｅｄｄｙ Ｓ，Ｌｙ ＤＨ，Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ ＭＤ．「グアニジニウムＧ−クランプ核酸塩基で修飾されたγ−ＰＮＡオリゴマーによる二本鎖ＤＮＡのターゲティングにおける配列特異性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ γ−ＰＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｇ−ｃｌａｍｐ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ）」．Ａｒｔｉｆ ＤＮＡ ＰＮＡ ＸＮＡ．２０１０ Ｊｕｌ；１（１）：４５−５３．
Ｋｕｌｅｓｈｏｖ，Ｖ，Ｘｉｅ，Ｄ，Ｃｈｅｎ Ｒ，Ｐｕｓｈｋａｒｅｖ，Ｄ，Ｍａ，Ｚ，Ｂｌａｗｋａｍｐ，Ｔ，Ｋｅｒｔｅｓｚ，Ｍ，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．「長いリード及び統計的方法を使用した全ゲノムハプロタイピング（Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｏｎｇ ｒｅａｄｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ）」．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１４
Ｌｏｈｓｅ Ｊ，Ｄａｈｌ Ｏ，Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ．「ペプチド核酸によるダブル二重鎖インベージョン：二本鎖ＤＮＡの配列特異的ターゲティングの一般的原理（Ｄｏｕｂｌｅ ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９９ Ｏｃｔ １２；９６（２１）：１１８０４−８．
Ｌｏｎｋａｒ Ｐ，Ｋｉｍ ＫＨ，Ｋｕａｎ ＪＹ，Ｃｈｉｎ ＪＹ，Ｒｏｇｅｒｓ ＦＡ，Ｋｎａｕｅｒｔ ＭＰ，Ｋｏｌｅ Ｒ，Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ，Ｇｌａｚｅｒ ＰＭ．「擬似相補的ペプチド核酸によって誘導されるサラセミア関連ベータグロビン突然変異の標的化した修正（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００９ Ｊｕｎ；３７（１１）：３６３５−４４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ２１７．Ｅｐｕｂ ２００９ Ａｐｒ １３．
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｎ．Ｍ．，Ｐｏｕｔｏｎ，Ｃ．Ｗ．，Ｉｒｖｉｎｇ，Ｈ．Ｒ．，「ペプチド核酸プローブを用いたアレル特異的エンリッチメントによるヒト白血球抗原ハプロタイプフェージング（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｐｈａｓｉｎｇ ｂｙ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅｓ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（３）：２４５−２５３（２０１４）．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ，Ａｐｅｌｌａ，Ｄ．，２０１４．「ペプチド核酸、方法及びプロトコル（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄ．（Ｅｄｓ．Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｄ．Ａｐｐｅｌｌａ）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｍｅｄｉａ，２０１４．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．（１９９１）「チミン置換ポリアミドを用いた鎖置換によるＤＮＡの配列選択的認識（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｙｍｉｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７−１５００
φｒｕｍ Ｈ．「アフィニティータグ付加ＰＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによる核酸の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｇｅｄ ＰＮＡ ｐｒｏｂｅｓ）」．Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；１（１−２）：１０５−１０．
Ｒａｙ Ａ，Ｎｏｒｄｅｎ Ｂ．「ペプチド核酸（ＰＮＡ）：その医学的及び生物工学的応用及び将来の展望（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＰＮＡ）：ｉｔｓ ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ）」．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０００ Ｊｕｎ；１４（９）：１０４１−６０．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１８９５−１８９７
Ｓａｈｕ Ｂ，Ｓａｃｕｉ Ｉ，Ｒａｐｉｒｅｄｄｙ Ｓ，Ｚａｎｏｔｔｉ ＫＪ，Ｂａｈａｌ Ｒ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＢＡ，Ｌｙ ＤＨ．「優れたハイブリダイゼーション特性及び水溶性を有するコンホメーションがプレオーガナイズされた（Ｒ）−ジエチレングリコール含有γ−ペプチド核酸の合成及び特徴付け（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄ，（Ｒ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ γ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」．Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２０１１ Ｊｕｌ １５；７６（１４）：５６１４−２７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｏ２００４８２ｄ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ １５．
Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ Ｊ Ｊｒ．「ポリマー、ダンベル、及びオリゴヌクレオチドＤＮＡニアレストネイバー熱力学の統一見解（Ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｖｉｅｗ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ，ｄｕｍｂｂｅｌｌ，ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤＮＡ ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）」．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９８ Ｆｅｂ １７；９５（４）：１４６０−５．
Ｓｃｈｌｅｉｆｍａｎ ＥＢ，Ｇｌａｚｅｒ ＰＭ．「標的ゲノム修復及び修飾のためのペプチド核酸媒介性組換え（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１０５０：２０７−２２．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６２７０３−５５３−８＿１７．
Ｓｃｈｌｅｉｆｍａｎ ＥＢ，ＭｃＮｅｅｒ ＮＡ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ａ，Ｙａｍｔｉｃｈ Ｊ，Ｂｒｅｈｍ ＭＡ，Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ＤＬ，Ｋｕｍａｒ Ｐ，Ｓａｌｔｚｍａｎ ＷＭ，Ｇｌａｚｅｒ ＰＭ．「ＰＬＧＡナノ粒子送達ＰＮＡによるＰＢＭＣの部位特異的ゲノム編集はヒト化マウスにＨＩＶ−１抵抗性を付与する（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＰＢＭＣｓ Ｗｉｔｈ ＰＬＧＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ＰＮＡｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ ＨＩＶ−１ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｉｃｅ）」．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ １９；２：ｅ１３５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．５９．
Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｔ，Ｋｉｔｔａｋａ Ａ．「Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン骨格に置換基を有するキラルペプチド核酸（Ｃｈｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙ）ｇｌｙｃｉｎｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１３ Ｄｅｃ ２７；１８（１）：２８７−３１０．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１８０１０２８７．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｔｅｄｅｓｃｈｉ，Ｔ．；Ｓｆｏｒｚａ，Ｓ．；Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ，Ｒ．；Ｍａｒｃｈｅｌｌｉ，Ｒ．「２つのリジン由来の不斉中心を有するジペプチド模倣モノマーを担持する新規キラルＰＮＡの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｅｗ ｃｈｉｒａｌ ＰＮＡｓ ｂｅａｒｉｎｇ ａ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｉｍｉｃ ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｌｙｓｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｎｔｒｅｓ）」．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２００５，４６，８３９５−８３９９．
Ｔｅｗｈｅｙ Ｒ，Ｎａｋａｎｏ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｐａｂｏｎ−Ｐｅｎｙａ Ｃ，Ｎｏｖａｋ Ｂ，Ｇｉｕｆｆｒｅ Ａ，Ｌｉｎ Ｅ，Ｈａｐｐｅ Ｓ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＤＮ，ＬｅＰｒｏｕｓｔ ＥＭ，Ｔｏｐｏｌ ＥＪ，Ｈａｒｉｓｍｅｎｄｙ Ｏ，Ｆｒａｚｅｒ ＫＡ．「溶液ハイブリダイゼーションによるヒトゲノムからのシーケンシング標的のエンリッチメント（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９；１０（１０）：Ｒ１１６．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２００９−１０−１０−ｒ１１６．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｏｃｔ １６．
Ｔｉｌａｎｉ Ｎ，Ｄｅ Ｃｏｓｔａ Ｓ，Ｈｅｅｍｓｔｒａ Ｊ．「荷電側鎖を有するＰＮＡによる差次的ＤＮＡ及びＲＮＡ配列識別（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＮＡ ｈａｖｉｎｇ ｃｈａｒｇｅｄ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ）」．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ．２０１４，２４，２３６０−２３６３．
Ｔｏｔｓｉｎｇａｎ Ｆ，Ｊａｉｎ Ｖ，Ｇｒｅｅｎ ＭＭ．「ポリマーにおけるヘリックス制御：ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合（Ｈｅｌｉｘ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｓ：ｃａｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＰＮＡｓ））」 Ａｒｔｉｆ ＤＮＡ ＰＮＡ ＸＮＡ．２０１２ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；３（２）：３１−４４．ｄｏｉ：１０．４１６１／ａｄｎａ．２０５７２．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ａｐｒ １．Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｗａｎｇ Ｍ，Ｂｅｃｋ ＣＲ，Ｅｎｇｌｉｓｈ ＡＣ，Ｍｅｎｇ Ｑ，Ｂｕｈａｙ Ｃ，Ｈａｎ Ｙ，Ｄｏｄｄａｐａｎｅｎｉ ＨＶ，Ｙｕ Ｆ，Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ Ｅ，Ｌｕｐｓｋｉ ＪＲ，Ｍｕｚｎｙ ＤＭ，Ｇｉｂｂｓ ＲＡ．「ＰａｃＢｉｏ−ＬＩＴＳ：ヒト疾患関連染色体構造変異の特徴付けのための大型インサート標的化シーケンシング方法（ＰａｃＢｉｏ−ＬＩＴＳ：ａ ｌａｒｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）」．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５ Ｍａｒ １９；１６（１）：２１４．
Ｙｅｈ，Ｊ．Ｉ．；Ｂｏｒｉｓ Ｓｈｉｖａｃｈｅｖ，Ｂ．；Ｒａｐｉｒｅｄｄｙ，Ｓ．；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｍ．Ｊ．；Ｇｉｌ，Ｒ．Ｒ．；Ｄｕ，Ｓ．；Ｍａｄｒｉｄ，Ｍ．；Ｌｙ，Ｄ．Ｈ．「相補ＤＮＡ鎖を有するキラルγＰＮＡの結晶構造：認識及びコンホメーションプレオーガニゼーションの安定性及び特異性に関する洞察（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ γＰＮＡ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１０７１７−１０７２７．
本開示の方法及び組成物は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されず、それらは異なり得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は詳細な実施形態の説明を目的としているに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通じて、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びこの語句の変化形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「限定はされないが、〜が包含される」ことを意味し、例えば他の添加物、構成成分、整数又はステップを除外することは意図されない。同様に、語句「包含する」及びこの語句の変化形、例えば「を包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「限定はされないが、〜が包含される」ことを意味し、例えば他の添加物、構成成分、整数又はステップを除外することは意図されない。
「任意選択の」又は「任意選択で」は、続いて記載される事象、状況、又は材料が起こる又は存在することも、又はそうでないこともあり、及びその記載に事象、状況、又は材料が起こる又は存在する場合と、それが起こらない又は存在しない場合とが包含されることを意味する。
範囲は本明細書において「約」特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までと表され得る。かかる範囲が表され、また特異的に企図及び考慮される場合、文脈上特に具体的に指示されない限り、その特定の値から及び／又はその他の特定の値までの範囲が開示される。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似として表される場合、特定の値が、文脈上特に具体的に指示されない限り開示されていると見なされるべき別の具体的に企図される実施形態を形成することは理解されるであろう。更に、範囲の各々の端点が、文脈上特に具体的に指示されない限り、他方の端点との関係でも、他方の端点と独立でも、両方で有意であることが理解されるであろう。最後に、明示的に開示される範囲に含まれる個々の値及び値の部分的範囲の全ても、文脈上特に具体的に指示されない限り具体的に企図され、且つ開示されていると見なされるべきであることが理解されなければならない。上記は、特定の場合にこれらの実施形態の一部又は全てが明示的に開示されているかどうかに関わらず適用される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示の方法及び組成物が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本方法及び組成物の実施又は試験には、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な任意の方法及び材料を使用することができるが、特に有用な方法、装置、及び材料は記載されるとおりである。本明細書に引用される刊行物及びそれらが引用される材料は、本明細書によって参照により具体的に援用される。本明細書のいかなる事項も、先行発明であることが理由で本発明がかかる開示に先行する権利がないことの承認として解釈されてはならない。任意の参考文献が先行技術をなすという承認はなされない。参考文献の考察は、それらの著者らが主張するものを示し、本出願人らは、引用される文献の正確さ及び適切性を検証する権利を保留する。本明細書では幾つもの刊行物が言及されるが、かかる参考文献がこれらの文献のいずれかが当該技術分野における技術常識の一部を形成するという承認をなすものではないことが明らかに理解されるであろう。
材料、組成物、構成成分、ステップ、技法等の説明には多数の選択肢及び代替法が包含され得るが、これが、かかる選択肢及び代替法が互いの均等物であるか、又は詳細には自明な代替法であると解釈されてはならず、及びその承認ではない。従って、例えば、異なる組成物及びその使用方法の列挙は、挙げられる組成物及び方法が互いに自明であることを示すものでなく、またそれは均等又は自明性の承認でもない。
当業者は、ルーチン程度に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載される方法及び組成物の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、又は確認することができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (17)

  1. １０個以上２６個以下のペプチド核酸残基を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブであって、
    核酸断片内の配列を標的化するように設計され、
    アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで荷電部分によって誘導体化されている２個以上のペプチド核酸残基と、前記アルファ、ベータ、若しくはガンマ炭素、又はこれらの組み合わせで中性部分によって誘導体化されている１個以上のペプチド核酸残基とを含み、
    荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない平均１．８個以上４．０個以下のペプチド核酸残基があり、
    １つ以上のキャプチャタグを含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブ。
  2. １５個以上２５個以下のペプチド核酸残基を含む、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
  3. １８、１９又は２０個のペプチド核酸残基を含む、請求項１又は２に記載のＰＮＡプローブ。
  4. 独立に、荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間の荷電部分によって誘導体化されていない１個以上３個以下のペプチド核酸残基がある、及び／又は 独立に、部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない１、２又は３個のペプチド核酸残基がある、及び／又は
    部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．４個以上１．５個以下のペプチド核酸残基がある、若しくは部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に部分によって誘導体化されていない平均０．８個以上２．０個以下のペプチド核酸残基がある、及び／又は
    前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１５％以上５２％以下が部分によって誘導体化されている、及び／又は
    前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１５％以上３２％以下が荷電部分によって誘導体化されている、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  5. 前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の２個以上７個以下が荷電部分によって誘導体化されている、及び／又は
    荷電部分によって誘導体化されているあらゆるペプチド核酸残基間に荷電部分によって誘導体化されていない少なくとも２個のペプチド核酸残基がある、及び／又は
    前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で前記荷電部分によって誘導体化されている、及び／又は
    前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−リジンペプチド核酸残基である、及び／又は
    前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上がＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、及び／又は
    荷電部分によって誘導体化されている１個以上の前記ペプチド核酸残基が負電荷部分によって誘導体化されている、及び／又は
    前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−リジンペプチド核酸残基である、若しくは前記荷電部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の全てがＬ−チアリジンペプチド核酸残基である、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  6. 前記ペプチド核酸残基の３、４、５又は６個が前記荷電部分によって誘導体化されており、
    １個以上の前記ペプチド核酸残基が、ガンマ−Ｌ−リジンＰＮＡ、ガンマ−Ｌ−チアリジンＰＮＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される前記荷電部分によって誘導体化されており、
    前記荷電部分によって誘導体化されていない前記ペプチド核酸残基の１個以上６個以下がジエチレングリコールによって誘導体化されており、前記キャプチャタグがビオチンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  7. 前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の４％以上８５％以下が中性部分によって誘導体化されている、又は
    前記ＰＮＡプローブの前記ペプチド核酸残基の１個以上１２個以下が中性部分によって誘導体化されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  8. 中性部分によって誘導体化されている前記ペプチド核酸残基の１個以上が前記ガンマ炭素で誘導体化されている、及び／又は
    前記中性部分の１個以上が短鎖オリゴエチレン部分である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  9. 末端ペプチド核酸残基の少なくとも１つで１個以上のアミノ酸によって誘導体化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  10. １個以上のペプチド核酸残基が前記ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  11. 前記ＰＮＡプローブが、（ａ）６番染色体のＭＨＣ領域に位置するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｂ）１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化し、前記疾患又は病態が、自己免疫疾患、糖尿病、メタボリックシンドローム、並びに癌からなる群から選択される；（ｃ）自己免疫疾患の疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｄ）糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｅ）異なる白血球サブセットの分化に関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｆ）ヒトミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｇ）イヌミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する；又は（ｈ）細菌、古細菌、真菌、原虫、又はこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の寄生虫のゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブ。
  12. ２つ以上のＰＮＡプローブのセットであって、前記ＰＮＡプローブの少なくとも１つが請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＰＮＡプローブであり、２つ以上のＰＮＡプローブの同じセット中の前記ＰＮＡプローブが同じ核酸断片内の異なる配列を標的化するように設計され、２つ以上のＰＮＡプローブの異なるセット中の前記ＰＮＡプローブが異なる核酸断片を標的化するように設計される、セット。
  13. 前記ＰＮＡプローブの１つ以上が、独立に、前記ペプチド核酸残基の塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含み、
    前記ペプチド核酸残基の前記塩基部分として擬似相補的核酸塩基を有する１個以上のペプチド核酸残基を含む前記ＰＮＡプローブの前記１つ以上が、前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブのサブセットであり、
    前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブの前記サブセットが、前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の他のＰＮＡプローブの１つ以上との相互作用能を有すると予想される前記１つ以上のＰＮＡプローブのセット中の前記ＰＮＡプローブのサブセットを含む、請求項１２に記載のセット。
  14. 前記ＰＮＡプローブが、（ａ）６番染色体のＭＨＣ領域に位置するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｂ）１つ以上の疾患若しくは病態に関連するか、又は１つ以上の疾患若しくは病態の発症と既知の相関を有するヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化し、前記疾患又は病態が、自己免疫疾患、糖尿病、及びメタボリックシンドローム、並びに癌からなる群から選択される；（ｃ）自己免疫疾患の疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｄ）糖尿病及びメタボリックシンドロームの疾患リスクに関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｅ）異なる白血球サブセットの分化に関連する複数のエンハンサーエレメントにマッピングされる異なる位置にあるヒトゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｆ）ヒトミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する；（ｇ）イヌミトコンドリアＤＮＡ内の配列を標的化する；又は（ｈ）細菌、古細菌、真菌、原虫、又はこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の寄生虫のゲノムＤＮＡ内の配列を標的化する、請求項１２又は１３に記載のセット。
  15. 核酸断片の混合物から１つ以上の核酸断片を選択的にエンリッチする方法であって、
    （ａ）請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の２つ以上のＰＮＡプローブの１つ以上のセットを第１の核酸試料に接触させて反応混合物を形成するステップ；
    （ｂ）前記ＰＮＡプローブによる核酸断片内のその標的配列への標的特異的ストランドインベージョン結合を可能にする条件下で前記反応混合物をインキュベートし、それによりインベージョンＰＮＡプローブ結合核酸断片を形成するステップ；
    （ｃ）前記キャプチャタグによって前記ＰＮＡプローブ結合核酸断片をキャプチャし、且つ前記キャプチャされたＰＮＡプローブ結合核酸断片から前記反応混合物のキャプチャされなかった成分を取り除くステップ；
    （ｄ）前記ＰＮＡプローブから前記キャプチャされた核酸断片を溶出させてエンリッチ核酸試料を形成するステップであって、前記第１の核酸試料と比較したとき、前記エンリッチ核酸試料では前記ＰＮＡプローブの標的とされる核酸断片がエンリッチされている、ステップ
    を含む方法。
  16. 前記反応混合物が一本鎖結合タンパク質を更に含む、及び／又は
    前記第１の核酸試料が高い配列複雑度を有する、及び／又は
    前記第１の核酸試料が二本鎖ＤＮＡを含む、及び／又は
    前記第１の核酸試料がゲノムＤＮＡを含む、及び／又は
    前記エンリッチ核酸断片が少なくとも２，０００塩基対の平均長さを有する、及び／又は
    前記ＰＮＡプローブの標的とされる前記核酸断片が前記エンリッチ核酸試料中の前記核酸断片の少なくとも９０％を占める、及び／又は
    前記エンリッチ核酸試料が５０：１〜１５０：１の標的対非標的核酸断片のモル比を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. （ａ）請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のセット；及び
    （ｂ）請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法の実施に関する説明書
    を含む、キット。
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