JP6814474B2 - 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置に関するものである。

検体の分析においては、例えば、それぞれに電極が配された二つのリザーバーと、二つのリザーバーを接続するマイクロ流路とを備える分析チップが用いられる。分析は、例えば、リザーバーを介してマイクロ流路内に導入した検体を計測することにより行われる。

米国特許第５，４８２，６０８号明細書

しかしながら、上述したような従来技術には、以下のような問題が存在する。
二つのリザーバーにおける液位が異なると、静水圧流によってマイクロ流路における検体に流れが生じる可能性がある。検体の計測においては、電極に電圧を印加する前にマイクロ流路における検体が移動すると、高精度の計測に支障を来す可能性がある。

本発明は、以上のような点を考慮してなされたもので、検体の分析を高精度に行える電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様に従えば、基材に設けられた第１リザーバー及び第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し、検体が泳動可能な泳動流路と、前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路と、を備える電気泳動分析チップが提供される。

本発明の第２の態様に従えば、検体を分析する電気泳動分析チップであり、第１リザーバーと、第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し検体が泳動する泳動流路と、を有する泳動部材と、前記泳動部材を支持する基板と、で構成される積層構造であり、前記泳動部材は、前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路を備える電気泳動分析チップが提供される。

本発明の第３の態様に従えば、本発明の第１の態様または第２の態様の電気泳動分析チップと、前記検体のゼータ電位を計測する計測部と、を備える電気泳動分析装置が提供される。

本発明では、検体の分析を短時間で高精度に行うことができる。

実施形態に係る電気泳動分析装置４００を示す（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）におけるＡ−Ａ線視断面図である。 電気泳動部３１０を拡大した斜視図である。 図２におけるＢ−Ｂ線視断面図である。 （ａ）はＨＥＰＥＳに通電した際の電圧と電流との関係を示す図であり、（ｂ）はＰＢＳに通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。 並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 電気泳動分析チップ３００の変形例を示す断面図である。

一実施態様において、本発明は、検体を分析する際に用いられる電気泳動分析チップを提供する。検体としては、細胞、細胞外小胞体、微粒子、ラテックス粒子（抗体で修飾され、さらに細胞で修飾されたラテックス粒子を含む）、高分子ミセル等が挙げられる。本実施形態では、電気泳動分析チップとして、細胞外小胞体を分析するための細胞外小胞体分析チップを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。以下に、エクソソームを分析する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）について説明する。

［エクソソーム］
エクソソーム（エキソソーム）は、直径３０〜１００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。

そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。

エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。

［エクソソームの分析］
細胞外小胞体分析チップを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味し、詳細は後述する。次に、細胞外小胞体分析チップを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。

（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。

また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。

（エクソソームの精製）
本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。

エクソソームを精製する方法としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）デバイスを使用する方法等が挙げられる。

（エクソソームと特異的結合物質との反応）
次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質−エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。詳細については後述する。

（ゼータ電位の計測）
一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。

エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
Ｕ＝（ε／η）ζ …（１）
式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。

エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動し、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４８８ｎｍ、強度５０ｍＷのものが挙げられる。

［電気泳動分析装置］
図１（ａ）は、一実施態様に係る電気泳動分析装置４００を示す平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）におけるＡ−Ａ線視断面図である。
電気泳動分析装置４００は、電気泳動分析チップ３００および計測部４２０を備えている。

［電気泳動分析チップ］
本実施形態の電気泳動分析チップ３００は、同様の構成を有しそれぞれにおいて検体の計測が可能な複数（図１（ａ）では四つ）の電気泳動部３１０がＹ方向に沿って配置されている。

電気泳動分析チップ３００は、順次積み重ねられたリザーバー部材１０、流路部材３０、基板５０および電極１３、１４を備えている。リザーバー部材１０および流路部材３０は、泳動部材を構成する。例えば、本実施形態における電気泳動分析チップ３００は、少なくともリザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０で構成された、積層構造（積層体）である。この場合、電気泳動分析チップ３００の積層構造は三層構造となっている。また、例えば、このような電気泳動分析チップ３００の積層構造は、リザーバー部材１０と、流路部材３０と、基板５０とを互いに貼りあわせて形成される。

なお、以下の説明においては、リザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０が順次積み重ねられる方向をＺ方向（Ｚ軸）、リザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０の長さ方向をＹ方向（Ｙ軸）、Ｚ方向及びＹ方向と直交するリザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０の幅方向をＸ方向（Ｘ軸）として適宜説明する。

リザーバー部材１０を形成する材料としては、特に限定されない。リザーバー部材１０の材料には、一例として、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。

図２は、電気泳動部３１０を拡大した斜視図である。図３は、図２におけるＢ−Ｂ線視断面図である。図３は、後述する第１保持空間３１の中心と第２保持空間３２の中心とを結ぶ線分を含むＹＺ平面と平行な面で断面した図である。

リザーバー部材１０は、第１リザーバー１１、第２リザーバー２１および液位調整流路１５を備えている。第１リザーバー１１及び第２リザーバー２１は、後述する泳動流路３３の流路方向であるＹ方向に間隔をあけて配置されている。一例として、、第１リザーバー１１と第２リザーバー２１との一方は、検体（例、分析対象のエクソソーム）が導入され、第１リザーバー１１と第２リザーバー２１との他方は、緩衝液が導入される。

第１リザーバー１１は、ＸＹ平面と平行な面での断面が円形状でＺ方向に延在する第１保持空間１２を備えている。第１保持空間１２は、リザーバー部材１０をＺ方向に貫通している。第２リザーバー２１は、ＸＹ平面と平行な面での断面が円形状でＺ方向に延在する第２保持空間２２を備えている。第２保持空間２２は、リザーバー部材１０をＺ方向に貫通している。

液位調整流路１５は、第１リザーバー１１に保持された液体と第２リザーバー２１に保持された液体との液位差を調整するための流路である。液位調整流路１５は、Ｙ方向に延びて第１リザーバー１１と第２リザーバー２１とを接続している。ＸＹ平面における液位調整流路１５の位置は、第１保持空間１２の中心位置と第２保持空間２２の中心位置とを結ぶ線上である。液位調整流路１５は、リザーバー部材１０の上面１０ａに開口する断面Ｖ字状に形成されている。上面１０ａにおける液位調整流路１５の幅は、第１保持空間１２および第２保持空間２２の直径よりも小さい。液位調整流路１５は、第１保持空間１２の上端と第２保持空間２２の上端とを接続して連通させている。

電極１３は、Ｚ方向に沿って第１保持空間１２に配置されている。電極１４は、Ｚ方向に沿って第２保持空間２２に配置されている。

流路部材３０は、第１保持空間３１、第２保持空間３２及び泳動流路３３を備えている。第１保持空間３１は、断面円形状に形成されＺ方向に延在している。第１保持空間３１は、流路部材３０をＺ方向に貫通している。第１保持空間３１の直径は、第１保持空間３１の直径よりも小さい。第１保持空間３１は、第１保持空間１２に接続されている。ＸＹ平面における第１保持空間３１の中心位置は、第１保持空間１２の中心位置よりも−Ｘ側に偏って配置されている。第２保持空間３２は、断面円形状でに形成され、Ｚ方向に延在している。第２保持空間３２は、流路部材３０をＺ方向に貫通している。第２保持空間３２の直径は、第２保持空間２２の直径よりも小さい。第２保持空間３２は、第２保持空間２２に接続されている。ＸＹ平面における第２保持空間３２の中心位置は、第２保持空間２２の中心位置よりも−Ｘ側に偏って配置されている。

泳動流路３３は、例えば、ミリ流路やマイクロ流路である。泳動流路３３は、細胞外小胞体、あるいは、細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体（一例として、抗体−エクソソーム複合体）を電気泳動するものである。特異的結合物質の一例として、抗体、アプタマー、またはこれらの組み合わせからなるものが挙げられる。アプタマーは例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどである。特異的結合物質が認識する分子としては、例えば抗原、膜タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質等が挙げられる。

泳動流路３３は、流路部材３０において基板５０と対向する側の面３０ａに第１保持空間３１と第２保持空間３２とを接続するようにＹ方向に沿って設けられている。泳動流路３３は、一例として、幅２００μｍ、高さ５０μｍの断面矩形状で、長さ１０００μｍ程度の大きさに形成されている。泳動流路３３の断面積は、液位調整流路１５の断面積よりも小さい。換言すると、液位調整流路１５の断面積は、泳動流路３３の断面積よりも大きい。従って、液位調整流路１５は、泳動流路３３と比較して、液体の流動に関して高いコンダクタンスを有している。流路部材３０は、一例として、リザーバー部材１０と同様に、ＰＤＭＳで形成されるている。流路部材３０としては、後述する計測部４２０のレーザ光に対して透明であることが好ましい。

基板５０は、流路部材３０を−Ｚ側から支持する。基板５０は、一例として、リザーバー部材１０および流路部材３０と同様に、ＰＤＭＳで形成されるている。基板５０としては、後述する計測部４２０のレーザ光に対して透明であることが好ましい。

リザーバー部材１０、流路部材３０および基板５０は、−Ｘ側の面が面一で重ねられている。流路部材３０は、リザーバー部材１０の端縁に対してＹ方向の両側、および＋Ｘ側に延出する大きさに形成されている。基板５０は、流路部材３０の端縁に対してＹ方向の両側、および＋Ｘ側に延出する大きさに形成されている。

上記のリザーバー部材１０は、一例として、ＰＤＭＳ（東レダウコーニング（株）製 SILPOT 184）主剤と架橋剤を１０：１の割合に混合し脱気させることと、ＰＤＭＳを樹脂製の鋳型に注型することと、８０℃で７時間加熱して固化させることで作製される。上記の流路部材３０は、一例として、リザーバー部材１０の作製で用いたＰＤＭＳと同じ組成のＰＤＭＳを、幅２００μｍ、長さ４０ｍｍの立方体からなる流路モールドを有するガラス材に流して込み加熱硬化させ、硬化後に流路モールドから引き剥がすことにより作製することができる。一例として、リザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０をそれぞれプラズマ照射して貼り合わせることにより、第１リザーバー１１の第１保持空間１２、３１と、第２リザーバー２１の第２保持空間２２、３２とが泳動流路３３を介して接続された電気泳動分析チップ３００が作製される。

なお、図示はしていないが、電気泳動分析チップ３００には第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を覆うカバーが設けられていてもよい。ただし、カバーは、第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を密封するものではなく、第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を大気開放した状態で覆う構成となっている。第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５がカバーで覆われることにより、検体による周囲の汚染又は周囲環境による検体の汚染を防止することができる。

図１に戻り、計測部４２０は、光照射部４２１と検出部４２２と移動度算出部（図示せず）とを含む。光照射部４２１は、貫通孔１６を介して−Ｘ側から泳動流路３３に光を照射する。照射される光は、例えば、レーザー光である。検出部４２２は、例えば、対物レンズおよび受光センサ（例、高感度カメラ）を有している。検出部４２２は、電気泳動分析チップ３００の−Ｚ側に配置されている。検出部４２２は、光照射部４２１から照射され泳動流路３３における検体で反射した光（散乱光）を検出する。移動度算出部は、検出部４２２の検出結果に基づき検体の移動度からゼータ電位を算出する。電気泳動分析チップ３００をＹ方向に移動させて、電気泳動部３１０を光照射部４２１および検出部４２２と対向させることにより、電気泳動部３１０毎にゼータ電位を算出することが可能である。

次に、上記の電気泳動分析チップ３００を用いて検体を計測・分析する手順について説明する。
検体は、エクソソームである。分析対象のエクソソームは、特異的結合物質と反応させたものであってもよい。エクソソームは、例えば培養上清や血清から抽出したものであり、検体液は、緩衝液にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液である。

緩衝液は、導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下であることが好ましい。緩衝液の導電率が上記の上限値を超える場合には、液位調整流路１５に過大な電流が流れ、好ましくない程度のジュール発熱や緩衝液の電気分解が生じる可能性がある。

まず、検体を含む液体（以下、適宜、検体液と称する）を、例えば、第１リザーバー１１の第１保持空間１２に滴下する。このとき、検体液は、上面１０ａにおける第１保持空間１２の開口部（検体導入口）を介して第１保持空間１２に導入される。次に、第２リザーバー２１の第２保持空間２２に、例えばシリンジを挿して検体液を吸引することにより、泳動流路３３に検体液を導入する。

次に、第１リザーバー１１の第１保持空間１２に滴下した検体液と同じ検体液を、第２リザーバー２１の第２保持空間２２に滴下して、泳動流路３３を挟んで第１保持空間１２、３１及び第２保持空間２２、３２が検体液でつながった状態とする。また、検体液については、液位調整流路１５に装填される液位で導入する。より詳細には、液位調整流路１５に導入された検体液の断面積が、泳動流路３３に導入された検体液の断面積よりも大きくなるように液位調整流路１５に検体液を導入する。

ここで、第２保持空間２２、３２に保持された検体液の液位が第１保持空間１２、３１に保持された検体液の液位よりも高いと、泳動流路３３においては静水圧により第２保持空間２２、３２から第１保持空間１２、３１に向けて検体を含む検体液が流動する可能性がある。本実施形態では、第２保持空間２２、３２に保持された検体液の液位と、第１保持空間１２、３１に保持された検体液の液位との間に液位差が生じる場合でも、液位調整流路１５に導入された検体液が液位が低い側の保持空間に流動することにより液位差が解消（調整）される。これにより、泳動流路３３に生じる静水圧流の発生を防ぎ、ゼータ電位測定の精度を向上させることが可能となる。

続いて、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加し、エクソソームを電気泳動する。電気泳動中に、泳動流路３３にレーザー光を照射し、泳動流路３３からの出射光であるエクソソームを介した散乱光を、対物レンズ等を用いて集光し、受光センサを用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体を撮影する。対物レンズの倍率は、一例として６０倍程度である。

続いて、移動度算出部は、撮影した画像をもとに、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体の電気泳動速度Ｓを算出する。そして、移動度算出部は、電気泳動速度Ｓを電界強度で除して、電気泳動移動度Ｕを算出する。続いて、移動度算出部は、上述したスモルコフスキーの式を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を算出する。

上記の電気泳動分析チップ３００を用いて検体を計測・分析を行う際には、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加することでジュール熱が生じる。検体液においては、ジュール熱による電気伝導度の変動（上昇）や渦流の発生により、液位調整流路１５に導入されている検体液を介して泳動流路３３における電気泳動移動度の計測に影響を与える可能性がある。そこで、電気泳動分析チップ３００に液位調整流路１５を設けることによる電気泳動移動度の計測（ゼータ電位の算出）に与える影響を確認した。

平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子（Thermo Fisher Scientific Inc. 3100A）を検体として用い、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；pKa=7.55 (20℃)、0.02μmフィルター済み)を緩衝液として用いた。

図４（ａ）は、ＨＥＰＥＳに通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。図４（ａ）に示される関係から、ＨＥＰＥＳの電気抵抗値は約２４．４ＭΩである。一方、図４（ｂ）は、緩衝液として用いられるリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）に通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。図４（ａ）に示される関係から、ＰＢＳの電気抵抗値は約０．３２ＭΩである。ＨＥＰＥＳの電気抵抗値がＰＢＳの電気抵抗値よりも大きいことから、ＨＥＰＥＳの導電率はＰＢＳの導電率よりも小さいと考えられる。ＨＥＰＥＳの導電率を実測したところ、上記１０ｍＭのＨＥＰＥＳでは、およそ２５０μＳ／ｃｍであった。

上記の液位調整流路１５および泳動流路３３の双方を有する並行流路形式の電気泳動分析チップと、泳動流路３３のみを有する単流路形式の電気泳動分析チップとを用いて電気泳動移動度の計測を行った。まず、並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップに１ｍＬシリンジを用いて平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子を含む検体液をそれぞれ導入した。

次いで、並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップのぞれぞれに対して、シリンドリカルレンズを用いて平面状に加工したレーザー光を光照射部４２１から泳動流路３３に照射し、泳動流路３３からの散乱光を検出部４２２により観察した。検体としての粒子の観察は、電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中、および電界強度２０Ｖ／ｃｍの電場中のそれぞれで行い、各電界強度毎に見掛けの電気泳動移動度を求めた。

図５（ａ）は、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図５（ｂ）は、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度２０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。

図６（ａ）は、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図６（ｂ）は、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度２０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数（分布）との関係を示す図である。

図５および図６に示されるように、並行流路形式と単流路形式の電気泳動分析チップのいずれの計測結果についても、電気泳動移動度に関する平均値の変化は見られなかった。すなわち、本実施形態の電気泳動分析チップ３００のように、液位調整流路１５を設けたことに伴い泳動流路３３における電気泳動移動度の計測結果に影響が及ぶことは観察されなかった。

また、液位調整流路１５を設けることによる電気泳動移動度の計測（ゼータ電位の算出）に与える影響に関して、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加した際の電気浸透流の影響を排除した状態での確認を行った。この確認には、検体として上述の平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子と、無電荷ビーズ（大塚電子製）とを用いた。

まず、並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップに１ｍＬシリンジを用いて平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子を含む検体液をそれぞれ導入した。次いで、両形式の電気泳動分析チップに対して、上述した平面状に加工したレーザー光を光照射部４２１から泳動流路３３に照射し、泳動流路３３からの散乱光を検出部４２２により観察した。検体としての粒子の観察は、電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中で行い、両形式の電気泳動分析チップのそれぞれで見掛けの電気泳動移動度を求めた。

次いで、各形式の電気泳動分析チップにおいて、流路から検体液をシリンジ操作によって取り除き、各流路に対して洗浄液（例えば、上記１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を検体液と同様にシリンジ操作により導入と除去とを複数回（例えば、３〜４回）交互に繰り返し行った。

その後、検体として無電荷ビーズを含む検体液を並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップに１ｍＬシリンジを用いてそれぞれ導入した。そして、検体がポリスチレン製粒子の場合と同様に、平面状に加工したレーザー光を光照射部４２１から泳動流路３３に照射し、泳動流路３３からの散乱光を検出部４２２により観察し両形式の電気泳動分析チップのそれぞれで見掛けの電気泳動移動度を求めた。

ここで、無電荷ビーズを含む検体液を用いて求めた電気泳動移動度の平均値は、電気浸透流の流速と考えられるため、ポリスチレン製粒子を含む検体液を用いて求めた電気泳動移動度から無電荷ビーズを含む検体液を用いて求めた電気泳動移動度を差し引くことで、電気浸透流の影響を排除したポリスチレン製粒子の電気泳動移動度を求めることができる。

図７（ａ）は、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として無電荷ビーズを用いた場合に観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図７（ｂ）は、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として１００ｎｍのポリスチレン製粒子を用いた場合に求められた電気泳動移動度から、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度を差し引いた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。

図８（ａ）は、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として無電荷ビーズを用いた場合に観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図８（ｂ）は、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として１００ｎｍのポリスチレン製粒子を用いた場合に求められた電気泳動移動度から、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度を差し引いた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。

図７および図８に示されるように、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度は、３．１±０．５［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、ポリスチレン製粒子を用いて求められた電気泳動移動度は、−１．７±０．３［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度は、４．２±０．５［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、ポリスチレン製粒子を用いて求められた電気泳動移動度は、−１．８±０．３［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。

これらの結果から、液位調整流路１５を設けることによる電気泳動移動度の計測（ゼータ電位の算出）に与える影響はほぼ無いと考えられる。

本実施形態における電気泳動分析チップ３００を用いることにより、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、特異的結合物質が認識する分子（例えば、抗原等）を有するエクソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、マイナーポピュレーションとして存在する、該抗原を有するエクソソームを検出することができる。

以上、説明したように、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、泳動流路３３の断面積よりも断面積が大きい液位調整流路１５が設けられているため、液位調整流路１５に検体液を導入することにより第１リザーバー１１に保持された検体液と第２リザーバー２１に保持された検体液との液位差を短時間で解消するように調整することが可能となる。そのため、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、第１、第２リザーバー１１、２１に保持された検体液の液位差に起因して生じる電気泳動移動度の測定誤差を最小限に抑えることが可能になり、検体の分析を短時間で高精度に行うことが可能になる。

また、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加することで生じるジュール熱の影響が液位調整流路１５に導入されている検体液を介して泳動流路３３における電気泳動移動度の計測結果に及ぶ可能性があるが、検体液に含まれる緩衝液として導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下で高抵抗のＨＥＰＥＳを用いているため、電極１３及び電極１４への通電に伴って生じる泳動流路３３における電気泳動移動度の計測への悪影響を抑えることが可能になる。

また、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、泳動流路３３が第１リザーバー１１と第２リザーバー２１の中心同士を結ぶ線分よりも光照射部４２１に近い側に配置されているため、泳動流路３３に向けて照射されたレーザー光の光路長を短くできる。そのため、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、レーザー光の出力を低くできるとともに、検体以外から生じる散乱光を抑制することができ、分析精度の向上を図ることができる。

また、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、泳動流路３３と液位調整流路１５とが高さ方向（Ｚ方向）にずれて配置されているため、泳動流路３３を透過したレーザー光の照射により液位調整流路１５の検体液で散乱光が生じノイズとして検出部４２２に検出されることを回避でき、さらに分析精度の向上を図ることができる。

以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。

上記実施形態では、導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下の緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いる構成を例示したが、この構成に限定されない。緩衝液としては、導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下であれば他の液体を用いる構成であってもよい。

また、上記実施形態では、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加することで生じるジュール熱の影響を、電気抵抗が高い緩衝液を用いることで抑える構成としたが、この構成に限定されない。例えば、図９に示されるように、液位調整流路１５において緩衝液ＢＳに挟まれた位置に緩衝液ＢＳの電気抵抗よりも高い電気抵抗を有する第２液体ＯＬを配置する構成であってもよい。なお、図９においては、便宜上、液位調整流路１５と泳動流路３３とを同一断面にて図示している。第２液体ＯＬとしては、シリコン系オイルまたはフッ素系オイル等の油剤を用いることができる。

第２液体ＯＬは、第１リザーバー１１に保持された検体液と第２リザーバー２１に保持された検体液との間の液位差に応じて液位調整流路１５の検体液で生じる圧力によってＹ方向に移動可能な粘度であることが好ましい。第２液体ＯＬの粘度は、液位調整流路１５における流動コンダクタンスと、泳動流路３３における流動コンダクタンスとの比に応じて設定すればよい。具体的には、泳動流路３３の断面積に対する液位調整流路１５の断面積の比をＲとすると、第２液体ＯＬの粘度は、緩衝液の粘度に対する比がＲ未満である液体を用いればよい。この範囲の粘度を有する第２液体ＯＬを用いることにより、液位調整流路１５は、泳動流路３３よりも大きなコンダクタンスで緩衝液が流動することが可能になる。また、液位調整流路１５における緩衝液において高い電気抵抗を有する第２液体ＯＬを介在させることにより、高い電気抵抗を有する緩衝液を用いる必要がなくなる。そのため、例えば、上述したＰＢＳ等の低い電気抵抗を有する緩衝液を用いることが可能となり汎用性が広がる。
なお、液位調整流路１５において緩衝液ＢＳに挟まれた位置に第２液体ＯＬを配置する場合には、１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を覆うカバーは液位調整流路１５を密閉することが好ましい。

また、上記実施形態では、軸状の電極１３、１４を第１リザーバー１１および第２リザーバー２１にそれぞれＺ方向に沿って配置する構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、基板５０における第１保持空間３１の底部および第２保持空間３２の底部にそれ設ける構成であってもよい。電極を液位調整流路１５から離れた位置に配置することにより、電極への通電により液位調整流路１５の検体液におよぶ影響を抑制することが可能になる。

また、上記実施形態では、液位調整流路１５の断面形状がＶ字状である構成を例示したが、この構成に限定されない。液位調整流路１５の断面形状としては、例えば、矩形状等の多角形であってもよい。液位調整流路１５の断面形状としては、検体液の流動コンダクタンスを大きくするために液位調整流路１５との接触面積が小さい形状が好ましく、一例として円弧を含む断面半円形状がより好ましい。

また、上記実施形態では、泳動部材がリザーバー部材１０および流路部材３０が積層された構成を例示したが、この構成に限定されない。泳動部材としては、例えば、第１リザーバー１１、第１保持空間１２、第２リザーバー２１、第２保持空間２２、泳動流路３３及び液位調整流路１５が単一の基材に設けられて基板５０に支持される構成であってもよい。

１０…リザーバー部材、 １１…第１リザーバー、 １２…第１保持空間、 １３、１４…電極、 １５…液位調整流路、 ２１…第２リザーバー、 ２２…第２保持空間、 ３０…流路部材、 ３３…泳動流路、 ５０…基板、 ３００…細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）、 ４００…電気泳動分析装置、 ４２０…計測部、 ＯＬ…第２液体

Claims (13)

1. 基材に設けられた第１リザーバー及び第２リザーバーと、
   前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し、検体が泳動可能な泳動流路と、
   前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路と、
   を備える電気泳動分析チップ。
2. 前記液体の導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下である
   請求項１記載の電気泳動分析チップ。
3. 前記液位調整流路において前記液体に挟まれた位置に、前記液体の電気抵抗よりも大きい電気抵抗を有するとともに、前記液体の粘度に対する比が、前記泳動流路の断面積に対する前記液位調整流路の断面積の比未満の粘度を有する第２液体が配置されている
   請求項１または２記載の電気泳動分析チップ。
4. 前記第２液体は、油剤である
   請求項３記載の電気泳動分析チップ。
5. 平面視において前記泳動流路は、前記第１リザーバーの中心と前記第２リザーバーの中心とを結ぶ線分に対して離間した位置で前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続している
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
6. 前記泳動流路と前記液位調整流路とは、高さ方向に関して重ならない位置にずれて配置されている
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
7. 前記液位調整流路の断面形状は円弧を含む
   請求項１〜６のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
8. 前記検体は、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体を含む
   請求項１〜７のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
9. 検体を分析する電気泳動分析チップであり、
   第１リザーバーと、第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し検体が泳動する泳動流路と、を有する泳動部材と、
   前記泳動部材を支持する基板と、で構成される積層構造であり、
   前記泳動部材は、前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路を備える電気泳動分析チップ。
10. 前記泳動部材は、前記第１リザーバー、前記第２リザーバー及び前記液位調整流路を有するリザーバー部材と、
    前記泳動流路を有し前記基板に支持される流路部材と、で構成される積層構造である請求項９記載の電気泳動分析チップ。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップと、
    前記検体のゼータ電位を計測する計測部と、
    を備える電気泳動分析装置。
12. 前記計測部は、前記泳動流路に光を照射する光照射部を有し、
    前記泳動流路と前記液位調整流路とは、前記光の照射方向で重ならない位置に配置されている
    請求項１１記載の電気泳動分析装置。
13. 前記計測部は、前記泳動流路に光を照射する光照射部を有し、
    前記泳動流路は、前記第１リザーバーの中心と前記第２リザーバーの中心とを結ぶ線分よりも前記光照射部に近い位置で前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続している
    請求項１１記載の電気泳動分析装置。

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