JP6793758B2

JP6793758B2 - 最適化されたミニ−ジストロフィン遺伝子および発現カセットおよびそれらの使用

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Publication number: JP6793758B2
Application number: JP2018566216A
Authority: JP
Inventors: スコットダブリュー．ジェイ．マクフィー; チュンピンチャオ; ジュアンリー; シャオシャオ; マリッツァマッキンタイアー; リチャードジェイ．サミュルスキー
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2020-12-02
Anticipated expiration: 2037-06-20
Also published as: TW201812010A; JP2019525740A; CN116064555A; JP7239540B2; PH12018502645A1; KR20190027358A; US11547765B2; US20200376141A1; MY197846A; JP2021045136A; MX2018015921A; CA2971303A1; RU2019101208A; WO2017221145A1; IL263199B1; US12257321B2; IL305467A; KR102568278B1; SA518400623B1; IL263199B2

Description

連邦支援の研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授けられた助成金番号ＡＲ０５０５９５、ＡＲ０５６３９４、およびＡＲ０５６９５３の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。

本発明の分野
本発明は、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを含むウイルスベクター、および、細胞または対象へのミニ−ジストロフィンの送達のためにそれを用いる方法に関する。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、３，６００〜９２００人の出生男児中およそ１人が冒される重度のＸ連鎖の進行性神経筋疾患である。障害は、ジストロフィンタンパク質の発現をなくさせるジストロフィン遺伝子内のフレームシフト突然変異によって引き起こされる。ジストロフィンタンパク質の損失に起因して、骨格筋、そして最終的には心筋および呼吸筋（例えば、肋間筋および横隔膜）が退化して（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）、早期死亡を引き起こす。進行性の衰弱および筋萎縮は、幼年時代に始まり、上腕へ広がる前に下腿および骨盤において始まる。他の症候は、特定の反射作用の喪失、あひる歩行、頻繁に転ぶこと、座った位置または寝ころんだ位置から起き上がる困難性、階段を登る困難性、姿勢全体の変化、呼吸不全、および心筋症を含む。多くの子どもは、速く走ること、またはジャンプすることができない。萎縮した筋肉、特に腓腹（および、一般的ではないが、臀部、肩、および腕の筋肉）は、脂肪および結合組織の蓄積によって拡大され得て、実際よりも大きく健康に見えるようにさせる（偽肥大と呼ばれる）。骨が細くなること、および脊柱側弯が一般的である。最終的に、独立歩行は失われて、ほとんどのケースで１２〜１５才の間に車椅子が必要となる。疾患が進行するにつれて、呼吸および咳をするのを助ける横隔膜内の筋肉が、より弱くなる。影響を受けた個人は、呼吸困難、呼吸器感染、および嚥下問題を経験する。ほとんど全てのＤＭＤ患者は、心筋症を発症する。心臓病変（ｃａｒｄｉａｃｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）によって悪化される肺炎は、最も頻繁な死亡原因であり、２０代以前に頻繁に生じる。

ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤよりも症候は重度でないが、それでもなお早期死亡をもたらす。ＤＭＤと比較して、ＢＭＤは、後期に発症する骨格筋の衰弱によって特徴付けられる。ＤＭＤ患者は、１３才以前に車椅子依存であるが、ＢＭＤを有する者は、１６才以降に歩行ができなくなって車椅子が必要となる。ＢＭＤ患者は、ＤＭＤとのそれらの対照物とは異なり、首の屈筋強度の保存も示す。より軽度の骨格筋病変（ｓｋｅｌｔａｌｍｕｓｃｌｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）にもかかわらず、ＤＭＤ関連の拡張型心筋症（ＤＣＭ）による心不全は、罹患率の一般的な原因であり、ＢＭＤにおける最も一般的な死亡原因であり、平均して４０代半ばで生じる。

ジストロフィンは、ｄｍｄ遺伝子によってコードされる細胞質タンパク質であり、細胞骨格アクチンフィラメントを膜タンパク質に結び付ける機能がある。通常、ジストロフィンタンパク質は、主に骨格筋および心筋に存在し、脳ではより少量で発現されて、収縮装置のアクチンを、それぞれの筋線維を取り囲む結合組織の層に結び付けることによって、筋線維収縮中の衝撃吸収材として作用する。筋肉において、ジストロフィンは、筋線維鞘膜の細胞質面に局在している。

最初に１９８７年に同定されたｄｍｄ遺伝子は、およそ２．５Ｍｂの最も大きな公知のヒト遺伝子である。その遺伝子は、Ｘ染色体上のＸｐ２１位に位置し、７９個のエクソンを含む。ＤＭＤまたはＢＭＤを引き起こす最も一般的な突然変異は、１つまたは複数のエクソンの大きな欠失突然変異であるが（６０〜７０％）、重複突然変異（５〜１０％）、および単一ヌクレオチド変異（ＤＭＤを有する男性における病原変異のおよそ２５％〜３５％およびＢＭＤを有する男性の約１０％〜２０％を占める、小さな欠失または挿入、単一塩基変化およびスプライス部位変化を含む）も、病原ジストロフィン変異を引き起こし得る。

ＤＭＤでは、突然変異は、未成熟終止コドンおよびトランケートされた非機能性または不安定のタンパク質をもたらすフレームシフトをしばしばもたらす。ナンセンス点突然変異も、同じ結果で未成熟終止コドンをもたらし得る。ＤＭＤを引き起こす突然変異は、任意のエクソンに影響を及ぼし得るが、エクソン２〜２０および４５〜５５が、大きな欠失および重複突然変異に関する一般的なホットスポットである。フレーム欠失では、重度でないベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）をもたらし、患者は、トランケートされた、部分的に機能性のジストロフィンを発現する。

全長ジストロフィンは、その機能に寄与する多くのサブドメインを含む大きな（４２７ｋＤａ）タンパク質である。これらのサブドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順番で、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、中央のいわゆる「ロッド」ドメイン、システインリッチドメイン、および最後にカルボキシ末端ドメインまたは領域を含む。ロッドドメインは、以下の順番：第一のヒンジドメイン（Ｈ１）、３個のスペクトリン様リピート（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）、第二のヒンジドメイン（Ｈ２）、１６個のさらなるスペクトリン様リピート（Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９）、第三のヒンジドメイン（Ｈ３）、５個のさらなるスペクトリン様リピート（Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４）、および、最後に第四のヒンジドメイン（Ｈ４）で、４個のプロリンリッチのヒンジドメイン（Ｈと省略される）および２４個のスペクトリン様のリピート（Ｒと省略される）からなる。タンパク質のカルボキシ末端に向かうサブドメインは、ジストロフィン関連の糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）、大きなタンパク質複合体に対する連結に関与し、それは、細胞骨格と細胞外マトリックスとの間の重大な結合を形成する。

ＤＭＤの進行を最終的に停止または逆行させる治療は存在しない。コルチコステロイドによる治療は、現在の標準的な治療であるが、これは単に１年または２年進行を遅らせるだけである。ＤＭＤのための多くの新たな薬物が、近年、監督機関によって承認されている。これらは、未成熟終止コドンのリードスルーを引き起こすアタルレン、および、エクソン５１のスキッピングを引き起こして、内部欠失した部分的に機能性のジストロフィンを生じさせるエテプリルセンを含む。しかしながら、これらの薬物の作用機構が全てのＤＭＤ患者を助けることは期待されず、ＤＭＤにおけるそれらの臨床有効性を決定的に証明するさらなる証拠が必要である。

様々な奇病を潜在的に治療するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が介在する遺伝子治療の使用における最近の１０〜１５年にわたる進展により、ＡＡＶが、ＤＭＤおよび重度でないジストロフィン異常症（すなわち、ｄｍｄ遺伝子における突然変異と関連する他の筋肉疾患）を治療するために用いられ得るという新たな希望および興味が存在している。ＡＡＶベクターのペイロードサイズに対する制限に起因して、全長タンパク質の機能の少なくとも一部の機能を維持しながら必須でないサブドメインを除去する、ジストロフィンのより小さなバージョンであるマイクロ−またはミニ−ジストロフィンの作製に注目が集中している。ＡＡＶが介在するミニ−ジストロフィン遺伝子治療は、筋肉における広範な発現および改善された筋肉機能の証拠によってＤＭＤに関する動物モデルであるｍｄｘマウスにおいて見込みが示されている（例えば、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２７：４２１（２００９）を参照）。しかしながら、マイクロ−ジストロフィンベクターを用いた関連実験がＧＲＭＤＤＭＤ犬モデルにおいて試みられたときに、強力な免疫抑制剤薬物が、筋肉細胞の有意な形質導入を達成するために必要であった（Ｙｕａｓａｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１４：１２４９（２００７））。同様に、ミニ−ジストロフィンを発現するように設計されたＡＡＶベクターによってヒトＤＭＤ患者を治療した場合、最小タンパク質は、６人の患者のうち２人にのみ検出されて、一方で、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対するＴ細胞応答は、３人で刺激された（Ｂｏｗｌｅｓ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．２０（２）：４４３−４５５（２０１２））。

したがって、当該分野において、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対する免疫応答を最小限にしながら、ＤＭＤを有する対象の形質導入細胞において高レベルで発現され得る、ミニ−ジストロフィンをコードするＡＡＶベクターに関する必要性が存在する。

本明細書において開示および例示されるのは、ミニ−ジストロフィンタンパク質、そのようなミニ−ジストロフィンタンパク質を発現するためのコドン最適化遺伝子、そのような遺伝子によって細胞を形質導入するためのＡＡＶベクター、および、そのようなＡＡＶベクターを用いて予防および治療する方法、特に、それを必要とする対象においてジストロフィン異常症を予防および治療する方法である。これらの実施態様の一部において、本開示のＡＡＶベクターは、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対する免疫応答を引き起こさずまたは単に抑えて、形質導入細胞における有意なレベルのミニ−ジストロフィンの生産をガイドすることが可能である。

本開示の本発明の特定の非限定の実施態様（Ｅ）を以下に示す。これらおよび関連する実施態様は、実施例および図面を含む詳細な説明においてさらに詳細に説明される。

Ｅ１．野生型ヒト筋ジストロフィンタンパク質（配列番号２５）の、Ｎ末端、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ヒンジＨ１、ロッドＲ１およびＲ２、ヒンジＨ３、ロッドＲ２２、Ｒ２３、およびＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、および、カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインの部分を、含む、から本質的になる、またはからなる、ミニ−ジストロフィンタンパク質であって、ＣＴドメインは、野生型ジストロフィンタンパク質のカルボキシ末端の最後の３つのアミノ酸残基を含まない。

Ｅ２．Ｅ１のミニ−ジストロフィンタンパク質であって、Ｎ末端およびアクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）は一緒に、配列番号２５由来のアミノ酸番号１〜２４０を含む、から本質的になる、またはからなる；ヒンジＨ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含む、から本質的になる、またはからなる；ヒンジＨ３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２４２４〜２４７０を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含む、から本質的になる、またはからなる；ヒンジＨ４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含む、から本質的になる、またはからなる；ＣＲドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含む、から本質的になる、またはからなる；および、ＣＴドメインの部分は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、から本質的になる、またはからなる。

Ｅ３．Ｅ１およびＥ２のいずれか１つのミニ−ジストロフィンタンパク質であって、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

Ｅ４．野生型ヒト筋ジストロフィンタンパク質（配列番号２５）の、Ｎ末端、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ヒンジＨ１、ロッドＲ１、Ｒ２、Ｒ２２、Ｒ２３、およびＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、および、カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインの部分を含む、から本質的になる、またはからなる、ミニ−ジストロフィンタンパク質であって、ＣＴドメインは、野生型ジストロフィンタンパク質のカルボキシ末端の最後の３つのアミノ酸残基を含まない。

Ｅ５．Ｅ４のミニ−ジストロフィンタンパク質であって、Ｎ末端およびアクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）は一緒に、配列番号２５由来のアミノ酸番号１〜２４０を含む、から本質的になる、またはからなる；ヒンジＨ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含む、から本質的になる、またはからなる；ロッドＲ２４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含む、から本質的になる、またはからなる；ヒンジＨ４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含む、から本質的になる、またはからなる；ＣＲドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含む、から本質的になる、またはからなる；および、ＣＴドメインの部分は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、から本質的になる、またはからなる。

Ｅ６．Ｅ４およびＥ５のいずれか１つのミニ−ジストロフィンタンパク質であって、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

Ｅ７．Ｅ１〜Ｅ３のミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

Ｅ８．Ｅ４〜Ｅ６のミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

Ｅ９．Ｅ７およびＥ８のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、その核酸塩基配列は、全長ヒト筋ジストロフィンをコードするネイティブの野生型遺伝子のコード配列から組み立てられて、その例は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４００６．２によって提供される。

Ｅ１０．Ｅ９のポリヌクレオチドであって、その核酸塩基配列は、配列番号２６によって提供される。

Ｅ１１．Ｅ７〜Ｅ１０のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、核酸塩基配列は、コドン最適化される。

Ｅ１２．Ｅ１１のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、野生型配列と比較してＧＣ含有量を低減または増大させる。

Ｅ１３．Ｅ１１のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、野生型配列と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの数を低減または増大させる。

Ｅ１４．Ｅ１１のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、１つまたは複数の潜在性のスプライス部位を除去する。

Ｅ１５．Ｅ１１のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、ミニ−ジストロフィンタンパク質に関するコード配列の開始におけるもの以外の１つまたは複数のリボソームエントリー部位を除去する。

Ｅ１６．Ｅ１１のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、１つまたは複数のレアコドンを、ミニ−ジストロフィン遺伝子が発現されることが意図される細胞の型および／または種においてより高い頻度で生じるコドンに関して置換する。

Ｅ１７．Ｅ１２のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、野生型と比較してＧＣ含有量を増大させて、少なくとも５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、９００％、１０００％、またはそれよりも多く、遺伝子発現のレベルを増大させる。

Ｅ１８．Ｅ１２のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれよりも多く、野生型と比較してＧＣ含有量を増大させる。

Ｅ１９．Ｅ１２のポリヌクレオチドであって、ＧＣ含有量は、約または少なくとも４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、またはそれよりも多い。

Ｅ２０．Ｅ１３のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、約または少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、またはそれより多く、野生型と比較してＣｐＧジヌクレオチドの数を低減または増大させる。

Ｅ２１．Ｅ２０のポリヌクレオチドであって、ＣｐＧジヌクレオチドの数は、減少する場合、ＣｐＧモチーフのメチル化に起因して遺伝子発現のサイレンシングを完全または部分的に抑制するのに十分な量で減少される。

Ｅ２２．Ｅ１１のポリヌクレオチドであって、コドン最適化は、高度に発現されたヒト遺伝子に関して、ミニ−ジストロフィン遺伝子のコドン適合指標（ＣＡＩ）を、少なくとも０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９の値まで増大させる。

Ｅ２３．Ｅ１１〜Ｅ２２のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、核酸塩基配列は、ヒトコドン最適化されている。

Ｅ２４．Ｅ１１〜Ｅ２２のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、核酸塩基配列は、イヌコドン最適化されている。

Ｅ２５．Ｅ２３のポリヌクレオチドであって、ヒトコドン最適化配列は、配列番号１、または、それと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一の核酸塩基配列によって提供される。

Ｅ２６．Ｅ２３のポリヌクレオチドであって、ヒトコドン最適化配列は、配列番号２、または、それと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一の核酸塩基配列によって提供される。

Ｅ２７．Ｅ２４のポリヌクレオチドであって、イヌコドン最適化配列は、配列番号３、または、それと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一の核酸塩基配列によって提供される。

Ｅ２８．Ｅ７〜Ｅ２７のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む、ベクター。

Ｅ２９．Ｅ２８のベクターであって、ポリヌクレオチドは、遺伝子制御領域に動作可能に連結される、ベクター。

Ｅ３０．Ｅ２９のベクターであって、遺伝子制御領域は、プロモーターである。

Ｅ３１．Ｅ３０のベクターであって、プロモーターは、筋肉特異的であり、肝臓細胞のような他の細胞型と比較して筋肉細胞においてより活性である。

Ｅ３２．Ｅ３０〜Ｅ３１のいずれか１つのベクターであって、遺伝子制御領域は、エンハンサーをさらに含む。

Ｅ３３．Ｅ３０〜Ｅ３２のいずれか１つのベクターであって、プロモーター、およびエンハンサー（存在する場合）は、筋肉クレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子由来である。

Ｅ３４．Ｅ３３のベクターであって、ＣＫ遺伝子は、マウスまたはヒト由来である。

Ｅ３５．Ｅ３３のベクターであって、遺伝子制御領域は、マウスＣＫ７エンハンサーおよびプロモーターである。

Ｅ３６．Ｅ２９〜Ｅ３６のいずれか１つのベクターであって、遺伝子制御領域は、配列番号４、配列番号５、および配列番号１６の群より選択される核酸塩基配列を含む。

Ｅ３７．Ｅ２８〜Ｅ３６のいずれか１つのベクターであって、ポリヌクレオチドは、転写終結領域に動作可能に連結される。

Ｅ３８．Ｅ３７のベクターであって、転写終結領域は、配列番号６または配列番号１７の核酸塩基配列を含む。

Ｅ３９．Ｅ２８〜Ｅ３８のいずれか１つのベクターであって、ベクターは、ＡＡＶウイルスベクターゲノムであり、隣接ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。

Ｅ４０．Ｅ３９のベクターであって、ＩＴＲは、両方ともＡＡＶ２ＩＴＲである。

Ｅ４１．Ｅ３９およびＥ４０のいずれか１つのベクターであって、ベクターの核酸塩基配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１８の群より選択される核酸塩基配列によって提供される。

Ｅ４２．Ｅ３９〜Ｅ４１のいずれか１つのベクターおよびＡＡＶキャプシドを含む、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子。

Ｅ４３．Ｅ４２のｒＡＡＶ粒子であって、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドである。

Ｅ４４．ｒＡＡＶ粒子であって、横紋筋に関する向性を有するＡＡＶキャプシドおよびヒトミニ−ジストロフィンタンパク質を発現するためのベクターゲノムを含む。

Ｅ４５．Ｅ４４のｒＡＡＶ粒子であって、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９血清型由来である。

Ｅ４６．Ｅ４４およびＥ４５のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化核酸配列を含む。

Ｅ４７．Ｅ４４〜Ｅ４６のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順番で、全長ヒト筋ジストロフィンタンパク質由来の以下のサブドメインまたはその部分：Ｎ末端ドメイン、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ヒンジＨ１、ロッドＲ１、ロッドＲ２、ヒンジＨ３、ロッドＲ２２、ロッドＲ２３、ロッドＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、および、カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインの部分を含み、ここで、ＣＴドメインの部分は、ジストロフィン由来の最後の３アミノ酸を含まない。

Ｅ４８．Ｅ４４〜Ｅ４７のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

Ｅ４９．Ｅ４４〜Ｅ４６のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順番で、全長ヒト筋ジストロフィンタンパク質由来の以下のサブドメインまたはその部分：Ｎ末端ドメイン、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ヒンジＨ１、ロッドＲ１、ロッドＲ２、ロッドＲ２２、ロッドＲ２３、ロッドＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、および、カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインの部分を含み、ここで、ＣＴドメインの部分は、ジストロフィン由来の最後の３アミノ酸を含まない。

Ｅ５０．Ｅ４４〜Ｅ４６、およびＥ４９のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

Ｅ５１．Ｅ４４〜Ｅ４７のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化核酸配列は、配列番号１の核酸配列を含む。

Ｅ５２．Ｅ４４〜Ｅ４６、Ｅ４９、およびＥ５０のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化核酸配列は、配列番号３の核酸配列を含む。

Ｅ５３．Ｅ４４〜Ｅ５２のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、コドン最適化核酸配列に隣接するＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む。

Ｅ５４．Ｅ５３のｒＡＡＶ粒子であって、ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲである。

Ｅ５５．Ｅ４４〜Ｅ５４のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、ヒトコドン最適化核酸配列と動作可能に連結された筋肉特異的な転写調節エレメントをさらに含む。

Ｅ５６．Ｅ５５のｒＡＡＶ粒子であって、筋肉特異的な転写調節エレメントは、５’ＡＡＶ２ＩＴＲとヒトコドン最適化核酸配列との間に配置される。

Ｅ５７．Ｅ５５およびＥ５６のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、筋肉特異的な転写調節エレメントは、ヒトまたはマウスクレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子に由来する。

Ｅ５８．Ｅ５５〜Ｅ５７のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、筋肉特異的な転写調節エレメントは、エンハンサーおよびプロモーターを含む。

Ｅ５９．Ｅ５５〜Ｅ５８のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、筋肉特異的な転写調節エレメントは、マウスＣＫ７エンハンサーおよびプロモーターである。

Ｅ６０．Ｅ５５〜Ｅ５９のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、筋肉特異的な転写調節エレメントは、配列番号１６の核酸配列を含む。

Ｅ６１．Ｅ４４〜Ｅ６０のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、コドン最適化核酸配列と３’ＡＡＶ２ＩＴＲとの間に配置された転写終結配列をさらに含む。

Ｅ６２．Ｅ６１のｒＡＡＶ粒子であって、転写終結配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。

Ｅ６３．Ｅ４４〜Ｅ６２のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、５’から３’の順番で：第一のＡＡＶ２ＩＴＲ、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化核酸配列に動作可能に連結された筋肉特異的な転写調節エレメント、転写終結配列、および、第二のＡＡＶ２ＩＴＲを含む。

Ｅ６４．Ｅ６３のｒＡＡＶ粒子であって、筋肉特異的な転写調節エレメントは、配列番号１６の核酸配列を含む。

Ｅ６５．実施態様Ｅ６３またはＥ６４のｒＡＡＶ粒子であって、ヒトコドン最適化核酸配列は、配列番号１の核酸配列を含む。

Ｅ６６．実施態様Ｅ６３〜Ｅ６５のｒＡＡＶ粒子であって、転写終結配列は、配列番号１７の核酸配列を含む。

Ｅ６７．Ｅ４４〜Ｅ４８、Ｅ５１、およびＥ５３〜Ｅ６６のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、配列番号１８の核酸配列またはその逆相補を含む。

Ｅ６８．Ｅ４４〜Ｅ４８、Ｅ５１、およびＥ５３〜Ｅ６６のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、配列番号１８の核酸配列またはその逆相補から本質的になる。

Ｅ６９．Ｅ４４〜Ｅ４８、Ｅ５１、およびＥ５３〜Ｅ６６のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子であって、ベクターゲノムは、配列番号１８の核酸配列またはその逆相補からなる。

Ｅ７０．ＡＡＶ９キャプシドおよび配列番号１８の核酸配列またはその逆相補を含むベクターゲノムを含む、組み換えＡＡＶ粒子。

Ｅ７１．ＡＡＶ９キャプシドおよび配列番号１８の核酸配列またはその逆相補から本質的になるベクターゲノムを含む、組み換えＡＡＶ粒子。

Ｅ７２．ＡＡＶ９キャプシドおよび配列番号１８の核酸配列またはその逆相補からなるベクターゲノムを含む、組み換えＡＡＶ粒子。

Ｅ７３．Ｅ４２〜Ｅ７２のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。

Ｅ７４．ジストロフィン異常症を治療する方法であって、ジストロフィン異常症のための治療を必要とする対象に、治療的に有効量のＥ７３の組成物を投与するステップを含む。

Ｅ７５．ジストロフィン異常症を有する対象を治療するための薬品の調製における、Ｅ４２〜Ｅ７２のいずれか１つの組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の使用またはＥ７３の組成物の使用。

Ｅ７６．ジストロフィン異常症を有する対象の治療での使用のための、Ｅ４２〜Ｅ７２のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子またはＥ７３の組成物。

Ｅ７７．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、またはＤＭＤ関連の拡張型心筋症である。

Ｅ７８．Ｅ７４〜Ｅ７７のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、男性または女性のヒト対象である。

Ｅ７９．Ｅ７４〜Ｅ７８のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、組成物によって最初に治療されたときまたは投与されたときに、歩行ができる。

Ｅ８０．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、組成物によって最初に治療されたときまたは投与されたときに、約または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６才である。

Ｅ８１．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、未治療コントロールと比較して、筋肉細胞の筋線維鞘におけるジストロフィン関連のタンパク質複合体を復元させるのに効果的である。

Ｅ８２．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、未治療コントロールと比較して、心臓におけるジストロフィー組織病理学を改善するのに効果的である。

Ｅ８３．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、未治療コントロールと比較して、肢筋および横隔膜における線維症を阻害するのに効果的である。

Ｅ８４．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、未治療コントロールと比較して、筋肉病変スコアを減少させるのに効果的である。

Ｅ８５．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、未治療コントロールと比較して、筋肉疲労を減少させるのに効果的である。

Ｅ８６．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、未治療コントロールと比較して、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットの最大絶対または相対前肢握力を増大させるのに効果的である。

Ｅ８７．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、骨格筋、心筋または横隔膜における検出可能なレベルのミニ−ジストロフィンｍＲＮＡまたはタンパク質を増大させるのに効果的である。

Ｅ８８．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、対象の血液中の平均ＭＭＰ−９レベルを、健康なコントロールにおけるものよりも、約１５−、１４−、１３−、１２−、１１−、１０−、９−、８−、７−、６−、５−、４−、３−、または２−倍以内大きく減少させるのに効果的である。

Ｅ８９．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、対象の血液中の平均ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＬＤＨレベルを、健康なコントロールにおけるものよりも、約７−、６−、５−、４−、３−、または２−倍以内大きく減少させるのに効果的である。

Ｅ９０．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、対象の血液中の平均総ＣＫレベルを、健康なコントロールにおけるものよりも、約５０−、４８−、４６−、４４−、４２−、４０−、３８−、３６−、３４−、３２−、３０−、２８−、２６−、２４−、２２−、２０−、１８−、１６−、１４−、１２−、１０−、９−、８−、７−、６−、５−、４−、３−、または２−倍以内大きく減少させるのに効果的である。

Ｅ９１．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、対象の平均６分徒歩距離（６ＭＷＤ）を、未治療コントロール平均６ＭＷＤと比較して、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００メートル増大させるのに効果的である。

Ｅ９２．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、４階段上昇試験を行なうために必要とされる平均時間を、未治療コントロールの平均時間と比較して、少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、または４．０秒減少させるのに効果的である。

Ｅ９３．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、歩行ができなくなった対象の平均比率を、歩行ができなくなった未治療コントロールの平均比率と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％減少させるのに効果的である。

Ｅ９４．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、対象の下肢における平均脂肪画分を、未治療コントロールの下肢における平均脂肪画分と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％減少させるのに効果的である。

Ｅ９５．Ｅ８８〜Ｅ９４のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、コントロールは、対象と年齢および性別が一致している。

Ｅ９６．Ｅ９１〜Ｅ９４のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象および未治療コントロールは、コルチコステロイド治療前の年齢、および／または、６ＭＷＴに対するベースライン能力に従って層化される。

Ｅ９７．Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、対象の骨格筋線維の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％がミニ−ジストロフィンタンパク質を発現するようにさせるのに効果的である。

Ｅ９８．Ｅ９７のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、骨格筋線維は、対象の二頭筋、三角筋または大腿四頭筋から得られた生検内に存在する。

Ｅ９９．Ｅ７４〜Ｅ９８のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ベクターの投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６ヶ月後、対象の約０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％以下において、筋肉炎症またはミニ−ジストロフィンタンパク質に対する細胞性免疫応答を引き起こす。

Ｅ１００．Ｅ７４〜Ｅ９９のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、治療された対象における随伴性免疫抑制を必要とせずに効果的である。

Ｅ１０１．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ、または全クレアチンキナーゼレベルの減少をもたらすのに効果的である。

Ｅ１０２．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、大腿二頭筋、横隔膜、または心筋における線維症の減少をもたらすのに効果的である。

Ｅ１０３．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、前肢把持力の増大をもたらすのに効果的である。

Ｅ１０４．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、前肢把持力を試験する５回の間隔が密接した試験にわたって測定される筋肉疲労の減少をもたらすのに効果的である。

Ｅ１０５．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後６ヶ月において、心エコー検査を用いて測定される左心室駆出率の増大をもたらすのに効果的である。

Ｅ１０６．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、心エコー検査を用いて測定される後期に対する初期の左心室充満の速度比（すなわち、Ｅ／Ａ比）の増大をもたらすのに効果的である。

Ｅ１０７．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）またはピークＥ速度とそのベースライン復帰との間のミリ秒での時間の低減をもたらすのに効果的であり、ここで、Ｅ波の減速時間（ＤＴ）は、心エコー検査を用いて測定される。

Ｅ１０８．Ｅ７４〜Ｅ７６の方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、大腿二頭筋、横隔膜、心筋、または他の横紋筋を形質導入するのに効果的であり、注入後３ヶ月または６ヶ月までに、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対する細胞性免疫応答を誘導せずに、ｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子によってコードされるミニ−ジストロフィンタンパク質を発現する。

Ｅ１０９．Ｅ７４〜Ｅ７６のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットであり、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物は、ビヒクルのみを投与された同年齢のコントロールと比較して、注入後６ヶ月において、左心室拡張終期の直径の増大を部分的または完全に戻すのに効果的である。

Ｅ１１０．Ｅ７４〜Ｅ１００のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、対象は、ジストロフィン異常症を治療するのに効果的な少なくとも第二の薬剤でも治療されて、または、組成物は、ジストロフィン異常症を治療するのに効果的な少なくとも第二の薬剤も含み、その例は、ＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングを引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗−ミオスタチン抗体、ナンセンス突然変異のリボソームのリードスルーを促進する薬剤、未成熟終止コドンを抑制する薬剤、アナボリックステロイド、またはコルチコステロイド（例えば、制限されずに、プレドニゾン、デフラザコート、またはプレドニゾロン）を含む。

Ｅ１１１．Ｅ７４〜Ｅ１１０のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、組成物は、例えば静脈内注入によって全身性に、または、例えば筋肉中に直接的に局所的に投与される。

Ｅ１１２．Ｅ７４〜Ｅ１１１のいずれか１つの方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物であって、方法、使用、使用のためのｒＡＡＶ粒子または組成物において用いられるｒＡＡＶ粒子の投与量は、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および９×１０^１４ｖｇ／ｋｇからなる投与量の群より選択されて、ここで、ｖｇ／ｋｇは、対象の体重のキログラムあたりのベクターゲノムを表わす。

Ｅ１１３．Ｅ７３の組成物であって、同一のＡＡＶ血清型の空のキャプシドをｒＡＡＶ粒子としてさらに含み、ｒＡＡＶ粒子に対する空のキャプシドの濃度比は、約または少なくとも０．５：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、またはそれよりも多い。

Ｅ１１４．細胞においてミニ−ジストロフィンタンパク質を発現する方法であって、細胞を、Ｅ４２〜Ｅ７２のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む。

Ｅ１１５．Ｅ１１４の方法であって、細胞は、筋肉細胞である。

Ｅ１１６．Ｅ１１５の方法であって、筋肉細胞は、骨格筋、横隔膜、または心臓由来である。

Ｅ１１７．Ｅ４２〜Ｅ７２のいずれか１つのｒＡＡＶ粒子を作製する方法であって、プロデューサー細胞中に、Ｅ３９〜Ｅ４１のいずれか１つのベクター、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶｃａｐ遺伝子、および、ヘルパー機能のための遺伝子を導入するステップ、細胞をインキュベートするステップ、および、細胞によって生産されたｒＡＡＶ粒子を精製するステップを含む。

Ｅ１１８．Ｅ１１７の方法であって、プロデューサー細胞は、接着性である。

Ｅ１１９．Ｅ１１７の方法であって、プロデューサー細胞は、非接着性である。

Ｅ１２０．Ｅ１１７〜Ｅ１１９のいずれか１つの方法であって、ベクターは、１つのプラスミド内に含まれて、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、第二のプラスミド内に含まれて、ヘルパー機能遺伝子は、第三のプラスミド内に含まれて、ここで、全ての３つのプラスミドは、パッケージング細胞中に導入される。

Ｅ１２１．Ｅ１１７〜Ｅ１２０のいずれか１つの方法であって、導入するステップは、トランスフェクションによって達成される。

Ｅ１２２．Ｅ１１７〜Ｅ１２１のいずれか１つの方法であって、プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。

Ｅ１２３．Ｅ１１７〜Ｅ１２２のいずれか１つの方法であって、プロデューサー細胞は、血清フリー培地で増殖される。

Ｅ１２４．Ｅ１１７〜Ｅ１２３のいずれか１つの方法であって、ＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質をコードする。

Ｅ１２５．Ｅ１１７〜Ｅ１２４のいずれか１つの方法であって、ｒＡＡＶ粒子は、密度勾配超遠心分離、またはカラムクロマトグラフィーを用いて精製される。

Ｅ１２６．Ｅ１１７〜Ｅ１２５のいずれか１つの方法によって生産される、ｒＡＡＶ粒子。

高度にトランケートされたミニ−ジストロフィン遺伝子の構築を示す。野生型筋ジストロフィンは、４つの主なドメイン：Ｎ末端ドメイン（Ｎ）；２４個のロッドリピート（Ｒ）および４個のヒンジ（Ｈ）を含む中央ロッドドメイン；システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、および、カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインを有する。ミニ−ジストロフィン遺伝子は、中央ロッドおよびヒンジの大部分およびＣＴドメインのほとんどを欠失させることによって構築された。ミニ−ジストロフィン遺伝子は、コドン最適化されて、完全に合成されて、そして続いて、遺伝子の５’末におけるＣＭＶプロモーターまたは筋肉特異的な合成の複合プロモーター、および、遺伝子の３’末における小さなポリ（Ａ）配列の間にクローニングされた。プロモーター、コドン最適化ミニ−ジストロフィン遺伝子、およびポリＡシグナルを含む、この遺伝子セグメントは、それから、左および右ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含むプラスミド中に、遺伝子セグメントがＩＴＲによって隣接されるようにクローニングされた。コドン最適化が、ミニ−ジストロフィン遺伝子発現を効果的に高めることを示す。上パネルは、（Ａ）トランスフェクトされていない２９３細胞またはオリジナルの非最適化のトランスフェクト後（Ｂ）、または最適化された（Ｃ）ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８ベクタープラスミドにおける、ミニ−ジストロフィンタンパク質の免疫蛍光（ＩＦ）染色を示す。下パネルは、トランスフェクトされた２９３細胞におけるミニ−ジストロフィンのウエスタンブロットを示す。左のブロットは、等量の細胞溶解物を用いて、最適化ｃＤＮＡによって圧倒的な発現を示す。右のブロットは、最適化ミニ−ジストロフィンｃＤＮＡによってトランスフェクトされた２９３細胞由来の細胞溶解物の１００×希釈を用いて、一方で、非最適化サンプルは、希釈されなかった。最適化されたもののシグナルは、１００×希釈後でさえ、より強いことに注意する。ＡＡＶ９ベクターによって処置されたジストロフィン／ユートロフィン二重ノックアウト（ｄＫＯ）マウスにおけるヒトミニ−ジストロフィン発現のＩＦ染色を示す。野生型コントロールマウスＣ５７ＢＬ／１０（Ｃ５７）、未処置ｄＫＯマウス、および、ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８によって処置されたｄＫＯマウス（Ｔ−ｄＫＯ）由来の筋肉および心臓サンプルを薄片化して、マウス野生型ジストロフィンおよびヒトミニ−ジストロフィンタンパク質の両方ともを認識する抗体を用いて染色した。試験された全てのサンプルにおいて、非常に効率的な発現が達成された。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８処置の結果としてのｄＫＯマウスの体重の標準化を示す。データは、野生型コントロールＢ１０マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０）、未処置ｍｄｘマウス、未処置ｄＫＯマウス、およびベクターによって処置されたｄＫＯマウスから、４月齢に得られた。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８処置の結果としての、ｄＫＯマウスの把持力およびトレッドミル走の改善を示す。データは、野生型コントロールＢ１０マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０）、未処置ｍｄｘマウス、未処置ｄＫＯマウス、および、ベクターによって処置されたｄＫＯマウス（Ｔ−ｄＫＯ）から、３月齢に得られた。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８治療の結果としての、ｄＫＯマウスのジストロフィー病理の寛解を示す。（図６Ａ）野生型コントロールＣ５７ＢＬ／１０マウス、未処置ｄＫＯマウス、およびベクターによって処置されたｄＫＯ（Ｔ−ｄＫＯ）マウス由来の前脛骨筋の凍結切片（８μｍ）を、組織病理学のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に供した（１０×倍率）。（図６Ｂ）筋量、心臓質量、中央に局在化された核のパーセンテージ、および、血清クレアチンキナーゼ活性の定量分析。未処置ｄＫＯマウスおよび野生型マウスと比較した、ヒトコドン最適化ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８ベクター（ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８）によって処置されたｄＫＯマウスの生存曲線を示す。処置されたｄＫＯマウスの５０％よりも多くが、８０週よりも長く生存した（実験の持続時間）。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８処置の結果としての、ｄＫＯマウスの心機能の改善を示す。血行力学分析を、野生型コントロールＣ５７ＢＬ／１０マウス、未処置ｍｄｘマウス、および、ＡＡＶ９ベクターによって処置されたｄＫＯマウスに対して行なった。未処置ｄＫＯマウスは、具合が悪すぎて手順を維持できなかった。データは、ドブタミンチャレンジ無しまたは有りのマウスの３つの群から集められた。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８処置の結果としてのｄＫＯマウスの心電図検査（ＥＣＧ）における改善を示す。（図９Ａ）ＥＣＧのＰＲ間隔は、ベクターによって処置されたｄＫＯマウスにおいて改善された。（図９Ｂ）分析の定量データ。実験は、ＥＣＧが心拍数の変動によって影響を受けないように、３つの群の心拍数を注意深く監視して行なわれた。^＊ｐ＜０．０５。ＣＭＶまたはｈＣＫプロモーターを含むＡＡＶ９−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターの尾静脈注入後のｍｄｘマウスにおける、ヒトコドン最適化ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８を駆動する組織非特異的ＣＭＶプロモーターおよび筋肉特異的ｈＣＫプロモーターの比較を示す。ＩＦ染色を用いて、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８は、肢筋および心筋において同様にロバストな発現を示した。ｈＣＫプロモーターは、ＣＭＶプロモーターよりも効果的であることが判明した。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターの肢静脈灌流を単離した後の、ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」の後肢の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）画像を示す。ベクターは、鼠径部領域にきつい止血帯がされた右後足内に、圧力によって注入された。白っぽいシグナルは、灌流された肢におけるベクター溶液保持を示した。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における、ベクター注入後２ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８発現のＩＦ染色を示す。右と左の両方の後足における５つの異なる筋肉群の生検サンプルを試験した。注入されていない左足も、検出可能なｄｙｓ３９７８を有し、ＡＡＶ９ベクターが注入部位から対側の足へ移動したことを示した。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における、ベクター注入後７ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８発現のＩＦ染色を示す。右と左の両方の後足における４つの異なる筋肉群の生検サンプルを試験した。注入されていない左足も、検出可能なＤｙｓ３９７８を有し、ＡＡＶ９ベクターが注入部位から対側の足へ移動したことを示した。Ｄｙｓ３９７８のウエスタンブロット分析を、同一サンプルに対して行なった。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における、ベクター注入後１２ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８発現のＩＦ染色を示す。右と左の両方の後足における４つの異なる筋肉群の生検サンプルおよび前肢における１サンプルを試験した。注入されていない左足も、検出可能なＤｙｓ３９７８を有し、ＡＡＶ９ベクターが注入部位から対側の足へ移動したことを示した。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における、ベクター注入後２年における、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８発現のＩＦ染色を示す。右と左の両方の後足における２つの異なる筋肉群の生検サンプルを試験した。注入されていない左足が、注入された足よりも多くの検出可能なＤｙｓ３９７８を有することが判明したことは注目に値する。ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８のＩＦ染色を示す。右と左の両方の後足における２つのさらなる（図１５と比較して）筋肉群の生検サンプルおよび前肢における１サンプルを、ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」から試験した。また、サンプルは、ベクター注入後２年に集められた。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」由来の注入されていない左後足における、ベクター注入後４年における、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８のＩＦ染色を示す。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における、ベクター注入後８年よりも長い、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８のＩＦ染色を示す。５つの異なる筋肉群および心臓の剖検筋肉サンプルを試験した。ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における、ベクター注入後８年よりも長い、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８および内因性復帰突然変異体ジストロフィンのＩＦ染色を示す。３つの異なる筋肉群の剖検筋肉サンプルを、ヒトおよびイヌの両方のジストロフィンを認識する抗体（上パネル）またはイヌ復帰突然変異体ジストロフィンのみを認識する抗体（下パネル）によって染色した。復帰突然変異体ジストロフィン陽性筋線維を、矢印によって強調した。復帰突然変異体線維は、ヒトＤＭＤ患者、ならびに、ｍｄｘマウスおよびＧＲＭＤ犬において生じる、ジストロフィンタンパク質に関して陽性に染色する珍しい筋線維である。復帰突然変異体線維が生じる正確なメカニズムは完全に理解されていないが、抗体プローブによって認識されるエピトープを有する短縮されたジストロフィンを生産する珍しい筋肉細胞におけるエクソンスキッピングを伴い得る。例えば、Ｌｕ，ＱＬ，ｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１４８：９８５−９６（２０００）を参照。ＡＡＶ９ベクター注入後８年を超える剖検における、ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」の筋肉サンプル内に存在するヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８のウエスタンブロット分析を示す。ウエスタンブロットは、ヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８が、試験された全ての骨格筋内に存在することを示した。「Ｍｏｌｌｙ」と名付けられた年齢と性別が一致した正常な犬由来の筋肉を、一連の２倍希釈でポジティブコントロールとして用いて、ジストロフィンタンパク質の定量化を示した。野生型全長ジストロフィンの分子量は、約４００ｋＤａであるが、一方で、ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８タンパク質は、約１５０ｋＤａである。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターの注入後のＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」における筋収縮力の改善および体全体の遺伝子発現を示す。上の曲線は、正常な犬の筋力を表わし、一方で、下の曲線は、未処置のＧＲＭＤ犬の筋力を表わす。より多くのタイムポイントに伸長された２つの曲線は、犬「Ｊｅｌｌｙ」の筋力を表わす。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−イヌ−ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３８４９ベクターによって処置された２つのさらなるＧＲＭＤ犬（Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９７（２５）：１３７１４−９（２０００））も、筋力について試験されて、改善を示した（「Ｊａｓｐｅｒ」および「Ｐｅｒｉｄｏｔ」）。ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」におけるＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター注入後４ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィン発現の筋肉生検ＩＦ染色を示す。ベクターは、体全体の遺伝子発現を達成するために静脈内注入によって送達された。後肢における４つの異なる筋肉群の生検サンプルを試験した。ほぼ均一なミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８が、全ての筋肉群において検出されたことは注目に値する。ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」におけるＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター注入後１４ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィン発現のＩＦ染色を示す。剖検サンプルを採取して試験した。広範でロバストなレベルのミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８が、心臓および全ての筋肉群において検出されたことは注目に値する。倍率４×。ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」におけるＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター注入後１４ヶ月において検出されたロバストなレベルのヒトミニ−ジストロフィンによる横隔膜筋のＩＦ染色を示す。ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」におけるＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター注入後１４ヶ月において検出されたロバストなレベルのヒトミニ−ジストロフィンによる長腓骨筋のＩＦ染色を示す。ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」におけるＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター注入後１４ヶ月において検出されたロバストなレベルのヒトミニ−ジストロフィンによる半膜様筋のＩＦ染色を示す。ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」におけるＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター注入後１４ヶ月において検出されたロバストなレベルのヒトミニ−ジストロフィンによる左心室（ＬＶ）筋のＩＦ染色を示す。ベクター注入後４ヶ月および１４ヶ月における、ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」の筋肉サンプルにおけるヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８のウエスタンブロットによる検出を示す。同年齢の正常な犬由来の筋肉を一連の２倍希釈でポジティブコントロールとして用いて、ジストロフィンタンパク質の定量化を示した。野生型全長ジストロフィンの分子量は約４００ｋＤａであり、一方で、ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８は、約１５０ｋＤａである。肝臓においてミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８は検出されなかったことは注目に値する。ベクター注入後１４ヶ月における、ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」の心臓（ＬＶ）サンプルにおけるヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８発現のウエスタンブロットによる検出を示す。同年齢の正常な犬由来の心臓サンプルを一連の２倍希釈でポジティブコントロールとして用いて、ジストロフィンタンパク質の定量化を示した。様々な筋肉群のγ−サルコグリカン（ｒ−ＳＧ）ならびにヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８の、ＩＦ染色によって示される、ジストロフィン関連タンパク質複合体の復元を示す。様々な筋肉および組織におけるＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターＤＮＡコピーの分析を示す。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行なってＡＡＶベクターＤＮＡゲノムコピー数を決定して、二倍体細胞基準に対して標準化した。同年齢の正常で未処置のＧＲＭＤ犬と比較した、ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」の心臓におけるジストロフィー組織病理学の改善を示す。ＨＥ染色。ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」の横隔膜筋におけるジストロフィー組織病理学の改善を示す。同年齢の正常かつ未処置のＧＲＭＤ犬と比較した。ＨＥ染色。同年齢の未処置のＧＲＭＤ犬と比較した、ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」の肢筋におけるジストロフィー組織病理学の改善を示す。ＨＥ染色。同年齢の未処置のＧＲＭＤ犬と比較した、ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」の肢筋および横隔膜における線維症の阻害を示す。マッソントリクロームブルー染色。ＰＢＳによって処置されたＷＴラットモック（左パネル）、モック処置ＤＭＤラット（中央パネル）、および、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（右パネル）から得られた、大腿二頭筋の抗−ジストロフィンＤＹＳＢ抗体による免疫標識を示す顕微鏡写真を提供する。線維の周りの濃い輪郭は、ＷＴラットにおけるジストロフィンおよびベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおけるミニ−ジストロフィンの筋細胞膜下の局在を示す。モック処置ＷＴラット（左パネル）、モック処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット（中央パネル）、および、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤＭＤラット（右パネル）から得られた、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥＳ）によって染色された大腿二頭筋を示す顕微鏡写真を提供する。壊死性線維（^＊）および筋内膜の軽度の線維症（黒い矢頭）のクラスターを示す。モック処置ＷＴラット（左パネル）、モック処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット（中央パネル）、および、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（右パネル）から得られた、心筋の抗−ジストロフィンＤＹＳＢ抗体による免疫標識を示す顕微鏡写真を提供する。線維の周りの濃い輪郭は、ＷＴラットにおけるジストロフィンおよびベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおけるミニ−ジストロフィンの筋細胞膜下の局在を示す。モック処置ＷＴラット（左パネル）、モック処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット（中央パネル）、および、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（右パネル）から得られた、ＨＥＳ染色された心筋を示す顕微鏡写真を提供する。線維症の病巣（塗りつぶされていない矢頭）を中央パネルに示し、単核細胞の侵入の病巣を右パネルに示す。投与後２５週までの時間にわたる、ビヒクル（バッファー）によって処置されたＷＴラット、および、ビヒクルおよび増加する量の投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの、平均体重（グラム）を示す。「ＷＴ」は、野生型ラットを指し；「ＤＭＤ」はＤｍｄ^ｍｄｘラットを指し；「ｎ」はサンプルサイズを指し；「Ｄ」は投与以来の日数を指し；「Ｗ」は投与以来の週数を指し；「Ｅ」は、規定の指数の規定の係数１０倍乗数の表記であり（したがって、「１Ｅ１３」は１×１０^１３を表わし、「３Ｅ１３」は３×１０^１３を表わし、「１Ｅ１４」は１×１０^１４を表わし、「３Ｅ１４」は３×１０^１４を表わす）；「ｖｇ／ｋｇ」は、体重（キログラム）あたりのベクターゲノムを表わし；「ｗ／ｏＨＡＳ」は、ヒト血清アルブミンを含まずにＰＢＳにおいてベクターが投与された場合の処置アーム（ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｒｍ）を指す。グラフの右側の、２５週における、上から下への平均体重データの順番は、説明文に挙げられた治療アームの上から下の順番と同一である（ＨＳＡを含まないビヒクルにおいて投与された１×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターによるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置を除く、そのデータについては、試験開始から１３週に収集が終わった）。これらの同一の略称は、本明細書において他の図で用いられる。ジストロフィンの不存在に起因する筋肉病変の重度度を評価するために用いられる半定量的スコアスキームを示す、組織学的試験のために染色されたＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の骨格筋の例示的な顕微鏡写真を提供する。骨格筋では、示されるように、スコア０は、病変の不存在に相当して；１は、中心核線維および再生の小病巣によって証明される一部の再生活性の存在に相当して；２は、単離された、または小さなクラスターでの変性線維の存在に相当して；３は、線維化または脂肪組織による組織再構築および線維置換に相当した。心臓に関するスコアは、本文に説明されるように異なる基準を用いた。注入後３ヶ月における、ラットに関する合計のＤＭＤ病変スコア（すなわち、大腿二頭筋、胸筋、横隔膜および心筋に関する病変サブスコアの平均）が、個々ならびにそれぞれの処置アームにおける全てのラット間の平均で示されて、ベクター投与量に応じた病変スコアの減少を示すために比較された。「ＷＴモック」は、ビヒクルによって処置されたＷＴラットを指し、「ＫＯモック」は、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを指し、「ＫＯ１Ｅ１３」、「３Ｅ１３」、および「１Ｅ１４」は、示された投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクター（ｖｇ／ｋｇ）によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを指す。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓおよびＤｕｎｎの検定を用いて計算した。増加する投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、大腿二頭筋サンプル由来の代表的な断面を提供する。サンプルは、全長ラットジストロフィンおよびヒトミニ−ジストロフィンに特異的に結合する抗体、および結合組織を染色する小麦胚芽アグルチニンコンジュゲートによって二重標識された。上パネルは、注入後３ヶ月において屠殺された動物からの顕微鏡写真である。下パネルは、注入後６ヶ月において屠殺された動物からの顕微鏡写真である。ジストロフィンタンパク質の存在に関して陽性に染色された、増加する投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、大腿二頭筋サンプル由来の無作為の断面内の線維パーセントを提供する。注入後３ヶ月および６ヶ月に関するデータが含まれる。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定を用いて計算された。結合組織の存在に関して陽性に染色された、増加する投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、大腿二頭筋サンプル由来の無作為の断面内の領域パーセントを提供する。注入後３ヶ月および６ヶ月に関するデータが含まれる。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定を用いて計算された。注入後３ヶ月において屠殺された、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、横隔膜筋サンプル由来の代表的な断面を提供する。サンプルは、全長ラットジストロフィンおよびヒトミニ−ジストロフィンに特異的に結合する抗体、および、結合組織を染色する小麦胚芽アグルチニンコンジュゲートによって二重標識された。ジストロフィンの存在に関して陽性に染色された、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、横隔膜筋サンプル由来の無作為の断面内の線維パーセントを提供する。注入後３ヶ月および６ヶ月に関するデータが含まれる。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定を用いて計算された。結合組織の存在に関して陽性に染色された、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、横隔膜筋サンプルの無作為の断面内の領域パーセントを提供する。注入後３ヶ月および６ヶ月に関するデータが含まれる。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定を用いて計算された。注入後３ヶ月および６ヶ月において屠殺された、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（上パネル）およびネガティブコントロール（下パネル）から得られた、頂部から３分の１における心臓の代表的な横断面を示す。組織学断面は、結合組織の可視化を可能にするためにピクロシリウスレッドによって染色された。中央パネルは、全長ラットジストロフィンおよびヒトミニ−ジストロフィンに特異的に結合する抗体、および、結合組織を染色する小麦胚芽アグルチニンコンジュゲートによって二重標識された、ベクターおよびビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットから得られた心筋の代表的な断面を含む。ジストロフィンタンパク質の存在に関して染色された、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、心筋サンプル由来の無作為の断面内の線維パーセントを提供する。注入後３ヶ月および６ヶ月に関するデータが含まれる。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定を用いて計算された。結合組織の存在に関して染色された、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびネガティブコントロールからの、心筋サンプルの無作為の断面内の領域パーセントを提供する。注入後３ヶ月および６ヶ月に関するデータが含まれる。バーの上の文字は、下にあるデータが、同じ文字が上に現れる他のバーと統計的に異ならないことを示す。反対に、異なる文字が上に現れるバーは、互いに統計的に異なる。統計は、ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定を用いて計算された。繰り返しの５回の間隔が密接した握力試験によって測定された、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較した、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける、筋肉疲労に関するデータを提供する。試験は、７〜９週齢において注入されたラットにおいて、注入後３ヶ月、またはラットがおよそ４．５月齢のときに、行われた。グラフは、試験１および５の間で測定された前肢把持力の低減を示す（試験１の力のパーセンテージとして表される）。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計は、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを、ビヒクルを受け取っているＷＴラット（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１）、およびビヒクルを受け取っているＤｍｄ^ｍｄｘラット（^□□ｐ＜０．０１；^□□□ｐ＜０．００１）に対して、両方ともネガティブコントロールとして比較する。繰り返しの５回の間隔が密接した握力試験によって測定された、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較した、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける、筋肉疲労に関するデータを提供する。試験は、７〜９週齢において注入されたラットにおいて、注入後６ヶ月、またはラットがおよそ７．５月齢のときに、行われた。グラフは、試験１および５の間で測定された前肢把持力の低減を示す（試験１の力のパーセンテージとして表される）。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後６ヶ月にＭモード心エコー検査によって得られた長軸画像から拡張期中に測定された左心室（ＬＶ）拡張終期の直径を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭである。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後６ヶ月にＭモード心エコー検査によって得られた長軸画像から拡張期中に測定された駆出率を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭであり、「＄」記号は、それが上に置かれたデータと、ビヒクル（バッファー）によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに関するデータとの間の、統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０５）。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後３ヶ月に心尖部四腔配向（ａｐｉｃａｌｆｏｕｒ−ｃｈａｍｂｅｒｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）でパルスドップラーを用いて測定されたＥ／Ａ比を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭであり、「^＊」記号は、それが上に置かれたデータと、ビヒクル（バッファー）によって処置されたＷＴラットに関するデータとの間の、統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０５）。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後６ヶ月に心尖部四腔配向でパルスドップラーを用いて測定されたＥ／Ａ比を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭであり、「^＊＊」記号は、それが上に置かれたデータと、ビヒクル（バッファー）によって処置されたＷＴラットに関するデータとの間の、統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０１）。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後３ヶ月に心尖部四腔配向でパルスドップラーを用いて測定された等容弛緩時間を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭである。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後６ヶ月に心尖部四腔配向でパルスドップラーを用いて測定された等容弛緩時間を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭであり、「＄」記号は、それが上に置かれたデータと、ビヒクル（バッファー）によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに関するデータとの間の、統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０５）。ビヒクルまたはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターが投与されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて注入後６ヶ月に心尖部四腔配向でパルスドップラーを用いて測定された減速時間を提供する。示される記述統計は、平均±ＳＥＭであり、「^＊」記号は、それが上に置かれたデータと、ビヒクル（バッファー）によって処置されたＷＴラットに関するデータとの間の、統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０５）。注入後３ヶ月の、血中ＡＳＴレベルに対する、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとしてバッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５）。注入後６ヶ月の、血中ＡＳＴレベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとしてバッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１）。注入後３ヶ月の、血中ＡＬＴレベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとして、バッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して（^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊ｐ＜０．０５）、または、バッファーを受け取ったＤｍｄ^ｍｄｘラットに対して（^＃＃ｐ＜０．０１、^＃ｐ＜０．０５）、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する。注入後６ヶ月の、血中ＡＬＴレベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとしてバッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊＊ｐ＜０．０１）。注入後３ヶ月の、血中ＬＤＨレベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとして、バッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して（^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１）、または、バッファーを受け取ったＤｍｄ^ｍｄｘラットに対して（^＃ｐ＜０．０５）、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する。注入後６ヶ月の、血中ＬＤＨレベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとしてバッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊＊ｐ＜０．０１）。注入後３ヶ月の、血中総クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、バッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較し（^＊＊ｐ＜０．０１）、または、バッファーまたは１×１０^１３ｖｇ／ｋｇベクターを受け取ったＤｍｄ^ｍｄｘラットに対して、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターが投与されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＃＃ｐ＜０．０１）。注入後６ヶ月の、血中総クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルに対する、異なる投与量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける効果を示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、ノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および事後のＤｕｎｎの多重比較検定を用いて行なった。統計は、ネガティブコントロールとしてバッファー（ビヒクル）を受け取ったＷＴラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較し（^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５）、または、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇベクターを受け取ったＤｍｄ^ｍｄｘラットに対して、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターが投与されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（＄ｐ＜０．０５）。ベクターのビヒクルの注入日（Ｄ０）と、注入後３ヶ月の屠殺との間の、総クレアチンキナーゼ（ＣＫ）進化を提供する。ソリッドバーは、Ｄ０からのデータを示し、一方で、陰影が付けられたバーは、３ヶ月におけるデータを示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。ベクターのビヒクルの注入日（Ｄ０）と、注入後６ヶ月の屠殺との間の、総クレアチンキナーゼ（ＣＫ）進化を提供する。ソリッドバーは、Ｄ０からのデータを示し、一方で、陰影が付けられたバーは、６ヶ月におけるデータを示す。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較して、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットの平均絶対最大前肢握力を提供する。試験は、４月齢で注入されたラットにおいて注入後３ヶ月、または、ラットがおよそ７月齢であるときに行なわれた。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計は、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊ｐ＜０．０１）。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較して、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットの体重に対する平均最大前肢握力を提供する。試験は、４月齢で注入されたラットにおいて注入後３ヶ月、または、ラットがおよそ７月齢であるときに行なわれた。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計は、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊ｐ＜０．０１）。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較して、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける、筋肉疲労の尺度として前肢把持力の進化を示す。試験は、平均最大把持力を、それぞれの試験のあいだの間隔を短くして５回測定することによって行なわれた。試験は、４月齢で注入されたラットにおいて注入後３ヶ月、または、ラットがおよそ７月齢であるときに行なわれた。結果は、体重に対して、平均±ＳＥＭとして提供される。統計は、ビヒクルを受け取っているＷＴラット（^＊ｐ＜０．０５）およびビヒクルを受け取っているＤｍｄ^ｍｄｘラット（^□□ｐ＜０．０１）に対して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較し、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける試験１に対して後の試験を比較する（§§ｐ＜０．０１、§§§ｐ＜０．００１）。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較して、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットの平均絶対最大前肢握力を提供する。試験は、６月齢で注入されたラットにおいて注入後３ヶ月、または、ラットがおよそ９月齢であるときに行なわれた。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計は、ビヒクルによって処置されたＷＴラットに対して、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを比較する（^＊＊ｐ＜０．０１）。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較して、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットの体重に対する平均最大前肢握力を提供する。試験は、６月齢で注入されたラットにおいて注入後３ヶ月、または、ラットがおよそ９月齢であるときに行なわれた。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計は、ビヒクルによって処置されたＷＴラットに対してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（^＊ｐ＜０．０５）、または、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに対してベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（^□ｐ＜０．０５）を比較する。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットと比較して、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける、筋肉疲労の尺度として前肢把持力の進化を示す。試験は、平均最大把持力を、それぞれの試験のあいだの間隔を短くして５回測定することによって行なった。試験は、６月齢で注入されたラットにおいて注入後３ヶ月、または、ラットがおよそ９月齢であるときに行なわれた。結果は、体重に対して、平均±ＳＥＭとして提供される。統計は、ビヒクルを受け取っているＤｍｄ^ｍｄｘラットに対してベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（^□ｐ＜０．０５）、ビヒクルを受け取っているＷＴラットに対してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）、および、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける試験１に対して試験５（§§ｐ＜０．０１）を比較する。ミニ−ジストロフィンタンパク質Δ３９９０（配列番号２７）およびミニ−ジストロフィンタンパク質Ｄｙｓ３９７８（配列番号７）のアミノ酸配列間のアライメントを提供する。ミニ−ジストロフィンΔ３９９０（配列番号２８）をコードする核酸配列間のアライメントを提供し、ヒトジストロフィンタンパク質をコードする野生型核酸配列、および、ミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８（Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８と呼ばれる；配列番号１）をコードするヒトコドン最適化核酸配列に由来する。

本発明はここで、本発明の好ましい実施態様が示される付随する図面に関して説明される。しかしながら、本発明は異なる形態で実現され得て、本明細書中に示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように、そして、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。

別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書において、本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の制限を意図しない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。

ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、本明細書において、一本鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ＣＦＲ §１．８２２および確立された使用に従って表される。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎＵｓｅｒＭａｎｕａｌ，９９−１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（米国特許商標庁）を参照。

別段の指示がされる場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えパルボウイルスおよびＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現しているパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために、用いられ得る。そのような技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫｅｔａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ２ｎｄＥｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬｅｔａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照。

さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書中に示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討する。

さらに説明すると、仮に、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択され得ることを示す場合、この言い回しは、あたかもそれぞれのそのようなサブコンビネーションが本明細書中に明示的に示されるかのように、アミノ酸は、これらのアミノ酸（単数または複数）の任意のサブセット、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから選択され得ることも示す。さらに、そのような言い回しは、規定のアミノ酸の１つまたは複数が否認され得ることも示す。例えば、特定の実施態様では、アミノ酸は、あたかもそれぞれのそのようなあり得る否認が本明細書中に明示的に示されるかのように、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない；などである。

定義
以下の用語は、本明細書中の説明および添付される特許請求の範囲において用いられる。

単数形「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形も同様に含むことが意図される。

さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、投与量、時間、温度などの量のような測定可能な値を指す場合は、規定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または実に０．１％の変動を包含することを意味する。

また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられた項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、代替（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。

本明細書において用いられる用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶタイプ２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶタイプ３（ＡＡＶ３、タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶタイプ５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶタイプ６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶタイプ７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶタイプ８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶタイプ９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶタイプ１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶタイプ１１（ＡＡＶ１１）、ＡＡＶタイプ１２（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶタイプ１３（ＡＡＶ１３）、鳥類ＡＡＶＡＴＣＣＶＲ−８６５、鳥類ＡＡＶ株ＤＡ−１、Ｂｂ１、Ｂｂ２、Ｃｈ５、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃｙ５、Ｃｙ６、Ｈｕ１、Ｈｕ１０、Ｈｕ１１、Ｈｕ１３、Ｈｕ１５、Ｈｕ１６、Ｈｕ１７、Ｈｕ１８、Ｈｕ１９、Ｈｕ２、Ｈｕ２０、Ｈｕ２１、Ｈｕ２２、Ｈｕ２３、Ｈｕ２４、Ｈｕ２５、Ｈｕ２６、Ｈｕ２７、Ｈｕ２８、Ｈｕ２９、Ｈｕ３、Ｈｕ３１、Ｈｕ３２、Ｈｕ３４、Ｈｕ３５、Ｈｕ３７、Ｈｕ３９、Ｈｕ４、Ｈｕ４０、Ｈｕ４１、Ｈｕ４２、Ｈｕ４３、Ｈｕ４４、Ｈｕ４５、Ｈｕ４６、Ｈｕ４７、Ｈｕ４８、Ｈｕ４９、Ｈｕ５１、Ｈｕ５２、Ｈｕ５３、Ｈｕ５４、Ｈｕ５５、Ｈｕ５６、Ｈｕ５７、Ｈｕ５８、Ｈｕ６、Ｈｕ６０、Ｈｕ６１、Ｈｕ６３、Ｈｕ６４、Ｈｕ６６、Ｈｕ６７、Ｈｕ７、Ｈｕ９、ＨｕＬＧ１５、ＨｕＳ１７、ＨｕＴ１７、ＨｕＴ３２、ＨｕＴ４０、ＨｕＴ４１、ＨｕＴ７０、ＨｕＴ７１、ＨｕＴ８８、Ｐｉ１、Ｐｉ２、Ｐｉ３、Ｒｈ１、Ｒｈ１０、Ｒｈ１３、Ｒｈ２、Ｒｈ２５、Ｒｈ３２、Ｒｈ３３、Ｒｈ３４、Ｒｈ３５、Ｒｈ３６、Ｒｈ３７、Ｒｈ３８、Ｒｈ４０、Ｒｈ４３、Ｒｈ４８、Ｒｈ４９、Ｒｈ５０、Ｒｈ５１、Ｒｈ５２、Ｒｈ５３、Ｒｈ５４、Ｒｈ５５、Ｒｈ５７、Ｒｈ５８、Ｒｈ６１、Ｒｈ６２、Ｒｈ６４、Ｒｈ７４、Ｒｈ８、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４−１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＡＡＶ２−ＴＴ、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ−ＬＫ０３、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。キャプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号；Ｇａｏｅｔａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｉｓｅｔａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２に開示される多くのＡＡＶ血清型に由来してよく；ＷＯ２０１５／１２１５０１に開示される真正タイプＡＡＶ（ＡＡＶ−ＴＴ）変異体、および、ＷＯ２０１５／０１３３１３に開示されるＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１からＲＨＭ１５−６、およびそれらの変異体を含み、当業者は、同一または同様の機能を発揮する未だ同定されていない他の変異体が存在するかもしれないことを知っていて、または２以上のＡＡＶキャプシド由来の構成要素を含んでよい。ＡＡＶｃａｐタンパク質の完全相補は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームは、完全未満の相補ＡＡＶｃａｐタンパク質を含んでよく、または、ＡＡＶｃａｐタンパク質の完全相補が提供されてよい。

および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ。例えば、Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くの相対的に新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏｅｔａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｉｓｅｔａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３−：３７５を参照）。

ＡＡＶは、直径が約２０〜３０ｎｍの二十面体のキャプシドを有する小さな非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、他のウイルス（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびヒト乳頭腫ウイルス）からの、いわゆるヘルパータンパク質の寄与がないと複製することができず、したがって、パルボウイルスのファミリー内のディペンドウイルスと呼ばれる特別な属に入れられた（それらは複製のために他のウイルスに依存するので）。多くの異なる血清型のＡＡＶが発見されていて、多くのヒトが１つまたは複数のＡＡＶ血清型に対する抗体を産生するが（ＡＡＶ感染の広範な履歴を示す）、ＡＡＶに起因することが知られる疾患は存在せず、ＡＡＶがヒトにおいて非病原であることを示唆する

多くの異なるＡＡＶ血清型が発見されているが、最も特徴付けられているものはＡＡＶ２であり、以下のＡＡＶ生物学の議論は、ＡＡＶ２に関して習得されているものの一部に焦点を当てる。他のＡＡＶ血清型のライフサイクルは、細部は異なり得るが同様であると考えられる。ＡＡＶ２または任意の他のＡＡＶ血清型が細胞の内側で感染および複製する特定の詳細は、単に、本明細書に開示される発明を理解するのを助けるために提供されるだけであり、それらの範囲をいかなる方法においても制限することを意図しない。仮に、この情報の一部が正しくないまたは完全でないことが後に分かったとしても、本明細書において開示されて特許請求の範囲に記載される発明の有用性または実施可能性を減じると解釈されるべきでない。ＡＡＶライフサイクルに関するさらなる情報は、Ｍ．Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，ＶｉｒｏｌＪ２：４３（２００５），ＭＤＷｅｉｔｚｍａｎａｎｄＲＭＬｉｎｄｅｎ，Ａｄｅｎｏ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１，ｐｐ．１−２３，Ａｄｅｎｏ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ．ＲＯＳｎｙｄｅｒａｎｄＰＭｏｕｌｌｉｅｒ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２０１１），ＧＥＢｅｒｒｙａｎｄＡＡｓｏｋａｎ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＶｉｒｏｌ２１：５４−６０（２０１６）、およびその中で引用される参考文献に見ることができる。

ＡＡＶ２の野生型ゲノムは、線状ＤＮＡであり、およそ４．７キロ塩基の長さである。ほとんどが一本鎖であるが、ゲノムの５’および３’末は、いわゆる逆位末端配列（ＩＴＲ）からなり、それぞれ１４５塩基対の長さであり、古典的なワトソンクリック塩基対合を通して自己アニールする回文配列を含み、Ｔ型ヘアピン構造を形成する。これらの構造の１つは、細胞のＤＮＡポリメラーゼに依拠して自己プライミングの鎖置換メカニズムを通したウイルスＤＮＡ複製の開始を可能にするフリーの３’ヒドロキシル基を含む。例えば、Ｍ．Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ：ｆｒｏｍｄｅｆｅｃｔｉｖｅｖｉｒｕｓｔｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒ，ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ２：４３（２００５）を参照。一本鎖ウイルスゲノムが複製されて、それから感染細胞においてキャプシド中にパッケージされるメカニズムに起因して、プラス（センスまたはコード）およびマイナス（アンチセンスまたは非コード）鎖が、別個の粒子中に等しい効率でパッケージされる。

隣接するＩＴＲに加えて、野生型ＡＡＶ２ゲノムは、代替のプロモーターおよびスプライシングの効率的な使用を通して、４つの複製タンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）および３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）をそれぞれコードする、２つの遺伝子、ｒｅｐおよびｃａｐを含む。大きい複製タンパク質である、Ｒｅｐ７８および６８は多機能であり、ＡＡＶ転写、ウイルスＤＮＡ複製、および、ヒト染色体１９へのウイルスゲノムの部位特異的な組込みに関与する。より小さなＲｅｐタンパク質は、感染された細胞核において、ウイルスゲノムをウイルスキャプシド中にパッケージングすることに関与している。３つのキャプシドタンパク質は、３つのタンパク質が全てそれらのカルボキシ末端に向かって配列を共有するが、ＶＰ２はＶＰ３には存在しないさらなるアミノ末端配列を含み、ＶＰ１はＶＰ２およびＶＰ３の両方に存在しないさらなるアミノ末端配列を含むように、選択的スプライシングおよび選択的翻訳開始部位の使用の組み合わせを通して生産される。キャプシドは、およそ１：１：１０のＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３化学量論で合計６０個のキャプシドタンパク質を含むと推定されるが、これらの比は明らかに変化し得る。

その相対的に小さなサイズ、したがって異種遺伝子を保有する能力にもかかわらず、ＡＡＶは、遺伝子治療のための主要なウイルスベクターとして同定されている。遺伝子治療ベクターとして提唱されている他のウイルスと比較してＡＡＶを用いる利点は、形質導入細胞における長期の遺伝子発現をサポートするＡＡＶの能力、分裂および非分裂細胞の両方を形質導入する能力、血清型に応じて多種多様の異なるタイプの細胞を形質導入する能力、ヘルパーウイルスが無いと複製することができないこと、および、野生型感染と関連する病原性が明らかにないことを含む。

それらの小さなサイズのため、ＡＡＶキャプシドは、せいぜい約４．７〜５．０キロ塩基の長さである一本鎖ＤＮＡゲノムを物理的に蓄積することができる。ゲノムを改変しなければ、治療的タンパク質に関するコード配列のような異種遺伝子、および、プロモーターおよび任意選択でエンハンサーのような遺伝子調節エレメントを含む十分な余地がないであろう。より多くの余地を作るためには、隣接するＩＴＲが維持される限り、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は除去され得て、所望の異種配列によって置き換えられ得る。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の機能は、ＤＮＡの異なる断片上にトランスで提供され得る。対照的に、ＩＴＲは、異種配列とシスで維持しなければならない唯一のＡＡＶウイルスエレメントである。ＩＴＲが無い異なるプラスミドに対して、ＩＴＲと異種遺伝子を組み合わせ、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を除去することもまた、遺伝子治療のためのＡＡＶベクターが生産されるのと同時に、感染性野生型ＡＡＶの生産を防止する。ｒｅｐおよびｃａｐを除去することは、遺伝子治療のためのＡＡＶベクターが、それらが形質導入する細胞において複製することができないことも意味する。

一部の実施態様では、ＡＡＶベクターのゲノムは、ＡＡＶＩＴＲが隣接した線状の一本鎖ＤＮＡである。異種遺伝子の転写および翻訳をサポートすることができる前に、一本鎖ＤＮＡゲノムは、二本鎖合成を開始するために自己プライミングＩＴＲの１つのフリーの３’−ＯＨを利用する細胞ＤＮＡポリメラーゼによって、二本鎖形態に変換されなければならない。代替の実施態様では、逆の極性の全長一本鎖ゲノムがアニールして全長二本鎖ゲノムを生産することができて、逆の極性のゲノムを保有する複数のＡＡＶベクターが同一の細胞を同時に形質導入する場合に生じることができる。何らかのメカニズムによって二本鎖ベクターゲノムが形成した後に、細胞の遺伝子転写機構が二本鎖ＤＮＡに対して作用して、異種遺伝子を発現することができる。

他の実施態様では、ベクターゲノムは、自己相補（ｓｃＡＡＶ）であるように設計され得て、両末端に野生型ＩＴＲおよび中央に突然変異したＩＴＲを有する。例えば、ＭｃＣａｒｔｙ、ＤＭ，ｅｔａｌ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ（ＴＲ）ｍｕｔａｎｔｇｅｎｅｒａｔｅｓｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｔｏｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇｓｔｅｐｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１０：２１１２−１８（２００３）を参照。細胞に侵入した後に、自己相補ＡＡＶゲノムは、中央のＩＴＲで始まる自己アニールをして、デノボＤＮＡ複製を必要とせずに二本鎖ゲノムを形成することができると提唱されている。この手法は、より効率的な形質導入および異種遺伝子のより迅速な発現をもたらすことが示されたが、用いられ得る異種遺伝子のサイズを約半分減少させる。

遺伝子治療のためのＡＡＶベクターを生産するための異なるストラテジーが開発されているが、最も一般的なものは三重トランスフェクション技術であり、それは、３つの異なるプラスミドがプロデューサー細胞中にトランスフェクトされる。例えば、Ｎ．ＣｌｅｍｅｎｔａｎｄＪ．Ｇｒｉｅｇｅｒ，ＭｏｌＴｈｅｒＭｅｔｈｄｓＣｌｉｎＤｅｖ，３：１６００２（２０１６），Ｇｒｉｅｇｅｒ，ＪＣ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ２４（２）：２８７−９７（２０１６）、およびその中で引用される参考文献を参照。この技術では、左右のＩＴＲによって隣接された、所望のＲＮＡまたはタンパク質を発現するために、例えば異種プロモーターおよび任意選択でエンハンサー、および異種遺伝子を含む、ベクターゲノムの配列を含むプラスミドが作成される。ベクタープラスミドは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む第二のプラスミド、および、ベクターゲノムをＡＡＶキャプシド中に複製およびパッケージするために必要なアデノウイルス（または他のウイルス）ヘルパー遺伝子を含む第三のプラスミドとともに、ＨＥＫ２９３細胞のようなプロデューサー細胞中に共トランスフェクトされる。この技術の代替の実施態様では、ｒｅｐ、ｃａｐおよびアデノウイルスヘルパー遺伝子は、全て同一のプラスミド上に存在して、２つのプラスミドがプロデューサー細胞中に共トランスフェクトされる。アデノウイルスヘルパー遺伝子の例は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡＲＮＡ遺伝子を含む。多くのＡＡＶ血清型に関して、ＡＡＶ２ＩＴＲは、ベクターゲノムが非ＡＡＶ２キャプシド内で複製およびパッケージされる能力を著しく損なわずに、ネイティブのＩＴＲに関して置換され得る。この手法は、シュードタイピングとして知られ、他の血清型由来のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを使用することを必要とするだけである。したがって、例えば、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ９キャプシド、および異種遺伝子、例えばミニ−ジストロフィンに隣接しているＡＡＶ２ＩＴＲ（「ＡＡＶ２／９」と指定され得る）を含む、ベクターゲノムを用いることができる。ＡＡＶ粒子が細胞によって生産された後に、それらは集められ得て、ＣｓＣｌグラジエントにおける超遠心分離のような当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、または、様々なタイプのクロマトグラフィーカラムを用いて精製され得る。

本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、限定されないがＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブのＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースにおいて見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照；それらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌｅｔａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏｅｔａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓｅｔａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３−：３７５−３８３；Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕｅｔａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅｅｔａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔｅｔａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅｅｔａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏｅｔａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照；それらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３由来のＩＴＲ配列は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６）「ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡによって提供される（その全体で本明細書中に援用される）。

本明細書において用いられる、ＡＡＶによる細胞の「形質導入」は、ＡＡＶが介在した、細胞への遺伝物質の移行を指す。例えば、Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９章（第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。

用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。

本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」は、それぞれの単量体ユニットの３’位が隣の単量体ユニットの５’位にリン酸基を介して連結されているヌクレオチドの線状配列である。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（ＲＮＡヌクレオチドのみを含む）、ＤＮＡ（ＤＮＡヌクレオチドのみを含む）、ＲＮＡおよびＤＮＡハイブリダイズ（ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドを含む）、ならびに、天然起源および／または非天然起源ヌクレオチドを含む他のハイブリダイズであってよい。ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの塩基の線状の順番は、ポリヌクレオチドの、「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸塩基配列」、または時には、単に「配列」と呼ばれる。典型的に、塩基の順番は、ポリヌクレオチドの５’末から始まってポリヌクレオチドの３’末で終わって提供される。当技術分野で知られるように、ポリヌクレオチドは、自己相補の領域のような二次構造を採用することができる。ポリヌクレオチドは、古典的なワトソンクリック塩基対合、または当業者に馴染みのある他のメカニズムを通して完全または部分的に相補のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることもできる。

本明細書において用いられる「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、必ずしもではないが典型的にＤＮＡの部分である。一部の実施態様では、遺伝子は、イントロンによって中断され得る。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、選択的スプライシングのようなメカニズム、選択的開始コドンの使用、または当業者に馴染みのある他の生物学的メカニズムに起因して、１よりも多いポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる。用語「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と省略されて、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分を指す。

本明細書において用いられる用語「コドン最適化」は、コード配列（例えば、ジストロフィンまたはミニ−ジストロフィンに関するコード配列などを含む野生型配列）に通常存在する１つまたは複数のコドンを、同一（同義）アミノ酸に関するコドンで置換することによって、発現を増大させるように最適化されている遺伝子コード配列を指す。この様式において、遺伝子によってコードされるタンパク質は同一であるが、根底となる遺伝子の核酸塩基配列または対応するｍＲＮＡは異なる。一部の実施態様では、最適化は、１つまたは複数のレアコドン（すなわち、特定の種由来の細胞において相対的に稀に生じるｔＲＮＡに関するコドン）を、翻訳の効率を改善するために、より頻繁に生じる同義コドンによって置換する。例えば、ヒトコドン最適化では、コード配列内の１つまたは複数のコドンは、同一アミノ酸に関してヒト細胞においてより頻繁に生じるコドンによって置換される。コドン最適化は、転写および／または翻訳の効率を改善し得る他のメカニズムを通して遺伝子発現を増大することもできる。ストラテジーは、制限されずに、合計ＧＣ含有量（すなわち、コード配列全体におけるグアニンおよびシトシンのパーセント）の増大、ＣｐＧ含有量（すなわち、コード配列におけるＣＧまたはＧＣジヌクレオチドの数）の低減、潜在性のスプライスのドナーまたはアクセプター部位の除去、および／または、コザック配列のようなリボソーム侵入部位の付加または除去を含む。望ましくは、コドン最適化遺伝子は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、他の点で同様の細胞において野生型遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において、検出可能により大きなレベルで発現される。

本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔＦｉｔ配列プログラムによって、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。

有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブ・アライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。

さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。

アミノ酸配列同一性パーセンテージの値は、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視する）。

同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。

アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性パーセントの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な兆候に割り当てられない。

一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。

「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）による適切なヌクレオチドの挿入または欠失と適切に並べられた場合に、配列の少なくとも約９５〜９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示すことを意味する。

本明細書において用いられる「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、または、ポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリヌクレオチドを意味する。

同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、または、ポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。

「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象におけるタンパク質の不存在または欠損に起因する症候を緩和または減少させ得るポリペプチドである。あるいは、「治療的ポリペプチド」は、他の方法で対象に利益、例えば、抗癌効果または移植残存可能性の改善を与えるものである。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される、本明細書において用いられる用語「改変型」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。

本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法的等価物）によって、ウイルスベクターが、出発原料における他の構成要素の少なくとも一部から、少なくとも部分的に分離されることを意味する。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「〜の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ）」（およびその文法上の変形）によって、対象の状態の重度度が低減されること、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候における何らかの軽減、緩和、低減または安定化が達成される、および／または、疾患または障害の進行に遅延があることを意味する。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびその文法上の変形）は、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の予防および／または遅延、および／または、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の重度度の減少を指す。予防は、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の全体的な不存在のような、完全であってよい。また、予防は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発生および／または発症の重度度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも少ないというような、部分的であってもよい。

本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの症候において何らかの軽減、緩和、低減、または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治療的である必要はないことを理解している。

本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延するのに十分な、および／または、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重度度を低減および／または遅延するのに十分な、量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。

用語「異種」または「外因性」ヌクレオチドまたは核酸配列は、本明細書において相互交換可能に用いられて、ウイルスまたは細胞において天然起源でない核酸配列を指す。一部の実施態様では、異種核酸は、目的の非翻訳ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞または対象への送達のため）。

本明細書において用いられる用語「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ）」、「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）」、「遺伝子送達ベクター」または時には単に「ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するビリオンまたはウイルス粒子を指し、ビリオンまたはウイルス粒子内にパッケージされたベクターゲノムを含む。ベクターは、感染性または非感染性であってよい。非感染性ベクターは、外因的に加えられた因子がないとそれら自体を複製することができない。ベクターは、ＡＡＶベクターゲノムが中にパッケージされたＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶ粒子またはビリオンであってよい。これらのベクターは、本明細書において、「組み換えＡＡＶ」（「ｒＡＡＶ」と省略される）ベクター、粒子またはビリオンと呼ばれてもよい。

ベクターゲノムは、細胞への送達のために、ベクター粒子またはビリオン内にパッケージするための、ポリヌクレオチドである（その細胞は「標的細胞」と呼ばれ得る）。典型的に、ベクターゲノムは、標的細胞への送達のために、遺伝子のような異種核酸配列を含むように改変される。ベクターゲノムは、標的細胞における異種遺伝子の発現を制御するための調節エレメントとして機能する１つまたは複数の核酸配列を含んでもよい。ベクターゲノムは、ベクターの生産および／または機能、例えば、制限されずに、宿主におけるベクターゲノムの複製およびベクター粒子へのパッケージングに必要な野生型または改変型のウイルス核酸配列（単数または複数）を含んでもよい。一部の実施態様では、ベクターゲノムは、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされることが可能な「ＡＡＶベクターゲノム」である。一部の実施態様では、ＡＡＶベクターゲノムは、複製およびパッケージングをサポートするために、異種遺伝子とシスで１つまたは２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶベクター生産に必要な全ての他の構造および非構造タンパク質コード配列は、（例えば、プラスミドから、または、宿主細胞内に配列を安定して組み込むことによって）トランスで提供され得る。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ（例えばＡＡＶＩＴＲ）、任意選択で２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶＩＴＲ）を含み、それは、典型的にベクターゲノムの５’および３’末にあり異種核酸配列と隣接するが、それに隣接する必要はない。ＩＴＲは、同一または互いに異なってよく、同一または異なるＡＡＶ血清型由来であってよい。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」は、相互交換可能に用いられて、外因性の核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」、「形質転換された細胞」および「形質導入細胞」を含み、一次の形質転換された細胞および継代培養数に関係なくそれから生じた子孫を含む。ＡＡＶベクターを生産する目的のために、特定の宿主細胞が、キャプシドおよびベクターゲノムを含む機能性ウイルス粒子を組み立てるのに必要な全ての遺伝子を含む、「プロデューサー」または「パッケージング」細胞として用いられ得る。当業者によって理解されるように、異なる宿主細胞は、プロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰｒｏ１０細胞株として有用に役割を果たし得るが、その他もあり得る。ビリオンの組み立てに必要な遺伝子は、本明細書中の他のどこかに記載のベクターゲノム、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、および、制限されずにアデノウイルスを含む他のウイルス由来の特定のヘルパー遺伝子を含む。当業者によって理解されるように、ＡＡＶ生産に必要な遺伝子は、制限されずに１つまたは複数のプラスミドのトランスフェクションを含む様々な方法でプロデューサー細胞中に導入され得るが、特定の遺伝子は、ゲノム内に組み込まれてまたはエピソーム上に保有されて、プロデューサー細胞内に既に存在し得る。

用語「逆位末端配列」または「ＩＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して、逆位末端配列として機能する（すなわち、特定のウイルス機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどを仲介する）、任意の回文ウイルス末端反復または合成配列を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶＩＴＲまたは非ＡＡＶＩＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のもののような非ＡＡＶＩＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起源としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピンを、ＩＴＲとして用いることができ、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＩＴＲは、部分的または完全に合成、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「ダブル−Ｄ配列」であってよい。ＦＩＥＬＤＳｅｔａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）も参照。

「ＡＡＶ逆位末端配列」または「ＡＡＶＩＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む、任意のＡＡＶ由来であってよい。ＡＡＶＩＴＲは、末端反復が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、存続、および／またはプロウイルスレスキューなどを仲介する限り、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって改変され得る）。ＡＡＶ２ＩＴＲの配列は１４５塩基対の長さであり、本明細書において、配列番号１４および配列番号１５として提供される。

「シス−モチーフ」は、ゲノム配列の末端またはその付近に見られる、複製開始に関して認識されるような、保存された配列；転写開始、スプライシング、または、終結に用いられる可能性のある内部の位置の潜在性なプロモーターまたは配列を含む。

他のエレメントによって隣接される配列に関して、「隣接される」とは、配列に対して、上流および／または下流、すなわち、５’および／または３’である、１つまたは複数の隣接するエレメントの存在を示す。用語「隣接される」は、その配列が必ずしも連続することを示すことを意図しない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接するエレメントとの間に介在する配列があってよい。２つの他のエレメント（例えば、ＴＲ）によって「隣接される」配列（例えば、導入遺伝子）は、一方のエレメントが配列に対して５’に位置して、他方が配列に対して３’に位置することを示すが；その間に介在する配列があってもよい。

細胞の「トランスフェクション」は、細胞を遺伝学的に改変する目的のために遺伝物質が細胞内に導入されることを意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン、エレクトロポレーションなどのような当技術分野で知られている様々な手段によって達成され得る。

「遺伝子導入」または「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡを宿主細胞内に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。そのような方法は、組み込まれない移行されたＤＮＡの一過性発現、移行されたレプリコン（例えばエピソーム）の染色体外複製および発現、または、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移行された遺伝物質の組込みをもたらし得る。

「導入遺伝子」は、標的細胞（本明細書において「宿主細胞」とも呼ばれる）への送達（発現を含む）のための、ウイルスベクターを含むベクターに組み込まれた任意の異種ヌクレオチド配列、および関係がある発現制御配列、例えばプロモーターを意味するために用いられる。発現制御配列は、標的細胞において導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択されることが、当業者によって理解される。導入遺伝子の例は、治療的ポリペプチドをコードする核酸である。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏｅｔａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ２：６１９に記載される、「複合型」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスキャプシドは、異なるパルボウイルス由来である）、および／または、「標的化」ウイルスベクター（例えば、定方向の向性を有する）であってよい。

さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。

本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶの複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳｅｔａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。

「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶＲｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、少なくともウイルスまたはベクターゲノムの複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶＲｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、または、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。

本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。

ネイティブのＡＡＶゲノムにおいて、異なるＲｅｐタンパク質は、２つの異なるプロモーターおよび選択的スプライシングの使用を通して、単一の遺伝子によってコードされる。ＡＡＶベクター生産の目的のために、Ｒｅｐタンパク質は、単一の遺伝子からまたは別個のポリヌクレオチドからプロデューサー細胞において発現され得るが、発現されるそれぞれのＲｅｐタンパク質に関して、１つの配列である。したがって、例えば、Ｒｅｐをコードする遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質の小さい方のみまたは大きい方のみがそれぞれの改変された遺伝子によって発現されるように、ｐ５またはｐ１９プロモーターを不活化するように改変され得る。異なる遺伝子からの、大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質の発現は、ウイルスプロモーターの１つが宿主細胞において不活性である場合（その場合、構造的に活性のプロモーターがその代わりに用いられ得る）、または、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で、異なるレベルでＲｅｐタンパク質を発現することが所望の場合に、有利であり得る。例えば、一部の実施態様では、宿主細胞に対する毒性を避けるために、小さなＲｅｐタンパク質と比較して大きなＲｅｐタンパク質の発現（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅｅｔａｌ．，（２００２）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１３：１９３５を参照）。

本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージして標的細胞を感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。

自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤＮ．ＦＩＥＬＤＳｅｔａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に、より詳細に説明される。

「マイクロ−ジストロフィン」または「ミニ−ジストロフィン」は、筋肉細胞において発現された場合に、全長の筋ジストロフィン、またはジストロフィンの機能性の少なくとも一部を保有するそのアイソフォーム内に存在する特定のサブドメインまたはサブドメインの部分を含む、改変されたタンパク質である。マイクロ−ジストロフィンおよびミニ−ジストロフィンは、全長の筋ジストロフィン（Ｄｐ４２７ｍ）よりも小さい。全長の筋ジストロフィンと比較して、マイクロ−ジストロフィンおよびミニ−ジストロフィンは、Ｎ末端、Ｃ末端、内部、またはそれらの任意の組み合わせにおいて欠失を含んでよい。

本明細書において用いられる「ジストロフィン異常症」は、タンパク質ジストロフィンをコードする遺伝子であるＤＭＤにおける病原変異に起因する筋肉疾患である。ジストロフィン異常症は、根底にある遺伝子病変の性質に応じた表現型の範囲として現れる。範囲の軽度の端は、制限されずに、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＫ）の血清濃度の無症状の増加およびミオグロビン尿症を伴う筋痙攣の表現型を含む。範囲の重度の端は、制限されずに、進行性の筋肉疾患デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）（骨格筋が主に影響を受けて、心臓はより低い程度である）、および、ＤＭＤ関連の拡張型心筋症（ＤＣＭ）（心臓が主に影響を受ける）を含む。

ミニ−ジストロフィンポリヌクレオチド、発現カセットおよびベクター
本開示は、コドン最適化ミニ−ジストロフィン遺伝子配列およびそれを含む発現カセットを提供する。そのような遺伝子および発現カセットは、他の適用の中でも、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を、それを必要とする対象において予防または治療するための遺伝子治療に有用である。形質導入された筋肉細胞におけるミニ−ジストロフィンタンパク質の発現は、細胞外マトリックスと細胞骨格との間の機械的に強力な連結をサポートするなど、通常は全長ジストロフィンに帰することができる機能の少なくとも一部を複製および置換することができる。

コドン最適化配列は、パルボウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターのサイズ制限内に合うように設計されて、ならびに、非最適化配列と比較してミニ−ジストロフィンの高い発現を与える。一部の実施態様では、最適化ミニ−ジストロフィン配列は、非コドン最適化配列が、参照により援用されるＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４００６．２によって例示される野生型ヒト全長筋ジストロフィンをコードするｍＲＮＡに基づく場合、非コドン最適化ジストロフィン配列の発現よりも少なくとも約５％多い、例えば、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００％またはそれよりも多い、動物内の筋肉細胞または筋肉におけるミニ−ジストロフィンタンパク質の増大された発現を与える。

したがって、本発明の一態様は、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関し、ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列；（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列；または（ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜３のうちの１つのヌクレオチド配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えばパルボウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターの収容能力内の長さを有する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、約５０００、４９００、４８００、４７００、４６００、４５００、４４００、４３００、４２００、４１００、または約４０００ヌクレオチドであり、またはそれよりも少ない。

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドによってコードされるミニ−ジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンタンパク質の、Ｎ末端、ヒンジＨ１、ロッドＲ１およびＲ２、ヒンジＨ３、ロッドＲ２２、Ｒ２３、およびＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチドメイン（ＣＲドメイン）、および、一部の実施態様では、カルボキシ末端ドメイン（ＣＴドメイン）の全てまたは一部を含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施態様では、ポリヌクレオチドによってコードされるミニ−ジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンタンパク質の、Ｎ末端、アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ヒンジＨ１、ロッドＲ１およびＲ２、ロッドＲ２２、Ｒ２３、およびＲ２４、ヒンジＨ４、ＣＲドメイン、および、一部の実施態様では、ＣＴドメインの全てまたは一部を含む、から本質的になる、またはからなる。さらなる実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンタンパク質（配列番号２５）のＣ末端の最後の３つのアミノ酸を含まない。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を、含む、から本質的になる、またはからなる、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする。

ジストロフィンのヌクレオチド配列は当技術分野で知られていて、ＧｅｎＢａｎｋのような配列データベースに見られ得る。例えば、ヒトジストロフィンｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＭ１８５３３またはＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４００６．２に見られ得て、それらの全体で本明細書中に参照により援用される。

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ジストロフィンタンパク質の生産のための発現カセットの部分である。発現カセットは、ジストロフィンの発現を増大させるのに有用な発現エレメントをさらに含んでよい。

一部の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される。プロモーターは、構成的プロモーターまたは組織特異的または組織好適プロモーター、例えば、筋肉特異的または筋肉好適プロモーターであってよい。一部の実施態様では、プロモーターは、クレアチニンキナーゼプロモーター、例えば、配列番号４または配列番号５のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなるプロモーターである。

一部の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリアデニル化エレメントに動作可能に連結される。一部の実施態様では、ポリアデニル化エレメントは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーターおよびポリアデニル化エレメントに動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる、発現カセットの部分である。特定の実施態様では、遺伝子発現カセットは、配列番号９〜１２のいずれか１つのヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。適切なベクターは、限定されないが、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルス、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを含んでよい、からなってよい、またはから本質的になってよい。一部の実施態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、パルボウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ９ベクターである。ウイルスベクターは、組み換えウイルステンプレートを含む核酸をさらに含んでよく、ここで核酸は、パルボウイルスキャプシドによってカプセル化される。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えパルボウイルス粒子（例えば、組み換えＡＡＶ粒子）をさらに提供する。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、以下にさらに議論される。

特定の実施態様では、ウイルスベクターは、改変されたベクターが由来するベクターと比較して、改変された組織向性を示す。一実施態様では、パルボウイルスベクターは、骨格筋、心筋、および／または横隔膜筋に関する全身性向性を示す。他の実施態様では、パルボウイルスベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、肝臓に関する向性が低い。組織向性は、当業者の知識に従って、特定のウイルスキャプシドアミノ酸、例えば、ＡＡＶキャプシドＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質内に存在するものを変更することによって改変され得る。

一部の実施態様では、ベクターゲノムは、自己相補または二重であり、そのようなベクターゲノムを含むＡＡＶビリオンは、ｓｃＡＡＶベクターとして知られる。ｓｃＡＡＶベクターは、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される（その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される）。ミニ−ジストロフィンを発現するためのｓｃＡＡＶの使用は、形質導入された細胞の数、形質導入細胞あたりのコピー数、または両方の増大を提供し得る。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む形質転換された細胞に関する。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ細胞であってよい。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または形質転換された細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物に関する。一部の実施態様では、トランスジェニック動物は、実験動物、例えば疾患の動物モデル、例えば筋ジストロフィーの動物モデルである。

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるミニ−ジストロフィンタンパク質に関する。ミニ−ジストロフィンタンパク質は、機能性ジストロフィンタンパク質に必要な全ての配列を含む。ジストロフィンのドメインは当技術分野でよく知られていて、配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような配列データベースに見られ得る。例えば、ヒトジストロフィンアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３９９７．１およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＡＡ５３１８９に見られ得て、それらは、それらの全体で本明細書中に参照により援用される。

一部の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、Ｎ末端、ヒンジＨ１、ロッドＲ１およびＲ２、ヒンジＨ３、ロッドＲ２２、Ｒ２３、およびＲ２４、ヒンジＨ４、ＣＲドメイン、および、一部の実施態様では、ＣＴドメインの全てまたは一部を含み、から本質的になり、またはからなり、ここでミニ−ジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンタンパク質（配列番号２５）のＣ末端の最後の３つのアミノ酸を含まない。これらの実施態様の一部によれば、Ｎ末端アクチン結合ドメインは、配列番号２５（全長ヒトジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列）由来のアミノ酸番号１〜２４０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２４２４〜２４７０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含み、から本質的になり、またはからなり；ＣＲドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含み、から本質的になり、またはからなり；ＣＴドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。この構築物および関連する構築物のさらなる説明は、本明細書において実施例１に含まれる。

一部の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、Ｎ末端、ヒンジＨ１、ロッドＲ１およびＲ２、ロッドＲ２２、Ｒ２３、およびＲ２４、ヒンジＨ４、ＣＲドメイン、および一部の実施態様では、ＣＴドメインの全てまたは一部を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンタンパク質のＣ末端の最後の３つのアミノ酸を含まない。これらの実施態様の一部によれば、Ｎ末端アクチン結合ドメインは、配列番号２５（全長ヒトジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列）由来のアミノ酸番号１〜２４０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含み、から本質的になり、またはからな；Ｈ４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含み、から本質的になり、またはからなり；システインリッチドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含み、から本質的になり、またはからなり；カルボキシ末端ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

本発明のさらなる態様は、細胞においてミニ−ジストロフィンタンパク質を生産する方法に関し、細胞を、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターと接触させるステップを含み、それにより、細胞においてミニ−ジストロフィンを生産する。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ細胞、例えば、細胞株または一次細胞であってよい。タンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入によって細胞においてタンパク質を生産する方法は、当技術分野でよく知られている。

本発明の別の態様は、対象においてミニ−ジストロフィンタンパク質を生産する方法に関し、対象に、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、対象においてミニ−ジストロフィンタンパク質を生産する。

本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法に関し、対象に、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および／または形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、対象において筋ジストロフィーを治療する。筋ジストロフィーは、筋ジストロフィーの任意の形態、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーであってよい。

組み換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを、インビトロ、エクスビボで、およびインビボで細胞へ送達するのに有用である。特に、ウイルスベクターは、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを、哺乳類を含む動物の細胞へ送達または移行するために有利に用いられ得る。

ウイルスベクターは、宿主の染色体上の遺伝子座と相同性を共有してそれと組み換える異種核酸を含んでもよい。この手法は、例えば、宿主細胞における遺伝子欠陥を修正するために使用され得る。

さらなる代替として、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞においてミニ−ジストロフィンタンパク質を生産するために用いられ得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞内に導入され得て、発現されたミニ−ジストロフィンタンパク質は、それから単離される。

ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドは、適切な制御配列と動作可能に関連され得ることが当業者によって理解される。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御エレメント、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどと動作可能に関連され得る。

当業者は、様々なプロモーターおよび任意選択でエンハンサーエレメントが、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて用いられ得ることを理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が導入された野生型宿主には、転写開始領域が見られないことを意図する。エンハンサーは、用いられる場合は、プロモーターと同一の遺伝子および種から、プロモーターと異なる種内のオルソロガス遺伝子から、プロモーターと同一の種内の異なる遺伝子から、または、プロモーターと異なる種内の異なる遺伝子から、選択され得る。

特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にネイティブであってよい。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。

誘導性の発現制御エレメントは、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して制御を提供することが望ましい適用において典型的に有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。

ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドが転写されて、それから標的細胞内で翻訳される実施態様において、特異的な開始シグナルは、一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であってよい。

本発明に係るウイルスベクターは、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞へ送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、ミニ−ジストロフィンをインビトロで生産するため、または、エクスビボでの遺伝子治療のために、ポリヌクレオチドを細胞にインビトロで送達するために用いられ得る。ウイルスベクターは、例えばミニ−ジストロフィンを発現するために、ポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に送達する方法においてさらに有用である。この様式では、タンパク質は、対象においてインビボで生産され得る。対象は、機能性ジストロフィンが不足しているので、ミニ−ジストロフィンを必要とし得る。さらに、当該方法は、対象におけるミニ−ジストロフィンの生産が何らかの有益な効果を与え得るので実施され得る。

ウイルスベクターは、培養細胞または対象において、ミニ−ジストロフィンを生産するために用いられてもよい（例えば、タンパク質を生産するための、または、例えばスクリーニング方法と合わせて対象に対するタンパク質の効果を観察するための、バイオリアクターとして対象を用いる）。

一般に、本発明のウイルスベクターは、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを送達して、ミニ−ジストロフィンを送達することが有益である任意の病状を治療および／または予防するために用いられ得る。例示的な病状は、限定されないが、ＤｕｃｈｅｎｎｅおよびＢｅｃｋｅｒを含む筋ジストロフィーを含む。

本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法における使用を見いだし、それによって、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドが、細胞培養系、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて、一時的または安定的に発現される。

また、本発明のウイルスベクターは、制限されないが、当業者に明らかなように、遺伝子ターゲッティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含む、様々な非治療的目的のためにも用いられ得る。また、ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも用いられ得る。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価の前に規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するためのＡＡＶベクターまたは粒子の本開示の特定の実施態様によれば、本開示は、制限されずに、横隔膜を含む骨格筋を含む、横紋筋、および心筋に関して向性を有するＡＡＶ血清型由来のＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶベクターまたは粒子を提供する。横紋筋に関する向性を有する天然起源のＡＡＶキャプシドの非限定的な例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９である。しかしながら、他の実施態様は、天然起源であるとは知られていないが、むしろ、他の組織と比較して横紋筋を優先的に形質導入する新規のＡＡＶキャプシドを作製するために特に（ｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｐｕｒｐｏｓｅｏｆ）改変されているＡＡＶキャプシドを含む。そのような改変されたキャプシドは、当技術分野で知られているが、本開示は、未だ開発されていない新たな筋肉特異的ＡＡＶキャプシドを包含する。筋肉特異的な改変ＡＡＶキャプシドの非限定的な例は、Ｙｕ，ＣＹ，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ１６（８）：９５３−６２（２００９），Ａｓｏｋａｎ，Ａ，ｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２８（１）：７９−８２（２０１０（ＡＡＶ２ｉ８を記載）、Ｂｏｗｌｅｓ，ＤＥ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒａｐｙ２０（２）：４４３−４５５（２０１２）（ＡＡＶ２．５を記載）、および、Ａｓｏｋａｎ，Ａ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ２０（４）：６９９−７０８（２０１２）において報告された。多くの天然および非天然起源ＡＡＶ血清型に関する、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質を含むキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で知られている。非限定黄な例では、ＡＡＶ９血清型に関するアミノ酸配列は、配列番号１３のアミノ酸配列として提供される。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するための本開示のＡＡＶ粒子は、形質導入された筋肉細胞において、欠失した全長ジストロフィンタンパク質によって与えられる機能を少なくとも部分的に復元するために選択されるジストロフィンサブドメインを有するミニ−ジストロフィンタンパク質を発現するためのベクターゲノムを含む。一部の実施態様によれば、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、全長の野生型ヒトジストロフィンタンパク質由来のサブドメインから構築される。一部の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への以下の順番で、ヒトジストロフィンタンパク質由来の以下のサブドメインを含む：Ｎ末端アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）；Ｈ１ヒンジドメイン；Ｒ１およびＲ２スペクトリン様リピートドメイン；Ｈ３ヒンジドメイン；Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４スペクトリン様リピートドメイン；Ｈ４ヒンジドメイン；システインリッチ（ＣＲ）ドメイン；およびカルボキシ末端（ＣＴ）ドメイン。これらの実施態様の一部によれば、Ｎ末端アクチン結合ドメインは、配列番号２５（全長ヒトジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列）由来のアミノ酸番号１〜２４０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ１は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２４２４〜２４７０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２２は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２３は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｒ２４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含み、から本質的になり、またはからなり；Ｈ４は、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含み、から本質的になり、またはからなり；ＣＲドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含み、から本質的になり、またはからなり；ＣＴドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様によれば、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するための本開示のＡＡＶ粒子のベクターゲノムは、ミニ−ジストロフィンを発現するための遺伝子を含む。典型的に、ベクターゲノムは、ミニ−ジストロフィンを発現する遺伝子のための余地を提供するために、野生型ＡＡＶ内に通常は存在するｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が欠失している。一部の実施態様では、遺伝子は、全長ヒトジストロフィンタンパク質由来の以下のサブドメインを含むミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする：ＡＢＤ−Ｈ１−Ｒ１−Ｒ２−Ｈ３−Ｒ２２−Ｒ２３−Ｒ２４−Ｈ４−ＣＲＤ−ＣＴＤ。一部の実施態様では、ＣＴＤは、野生型筋ジストロフィンに見られるＣＴＤのほんの一部であり、一部の実施態様では、野生型筋ジストロフィン（配列番号２５）に存在する最後の３つのアミノ酸を含まない。特定の実施態様では、遺伝子は、配列番号７のアミノ酸配列を有するヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする。

一部の実施態様によれば、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子治療の効果をもたらすために、本開示のＡＡＶ粒子が投与される対象の種に関してコドン最適化される。理論によって拘束されることを望まずに、コドン最適化は、形質導入細胞が遺伝子をｍＲＮＡに転写および／またはｍＲＮＡをタンパク質に翻訳することが可能な効率を改善して、それにより、コドン最適化されていない遺伝子をコードするミニ−ジストロフィンの発現と比較して、生産されるミニ−ジストロフィンタンパク質の量を増大させると考えられる。一部の非限定的な実施態様では、コドン最適化はヒトコドン最適化であるが、コドン最適化は、イヌを含む他の種に関して行なわれ得る。

一部の実施態様では、コドン最適化は、ヒトのような種内に存在する相対的にレアなｔＲＮＡと対になる１つまたは複数のコドンを、同一アミノ酸に関するより普及しているｔＲＮＡと対になる同義コドンで置換する。この手法は、翻訳効率を高めることができる。他の実施態様では、コドン最適化は、転写または翻訳の効率に影響を及ぼし得る特定のシス作用性モチーフを除去する。コドン最適化の非限定的な例は、コード配列の意図されたスタートに強力なコザック配列を付加すること、または、意図された開始コドンの下流の内部リボソームエントリー部位を除去することを含む。コドン最適化を通して除去され得る他のシス作用性モチーフは、内部ＴＡＴＡボックス；ｃｈｉ−部位；ＡＲＥ、ＩＮＳ、および／またはＣＲＳ配列エレメント；リピート配列および／またはＲＮＡ二次構造；潜在性のスプライスのドナーおよび／またはアクセプター部位、分岐点；およびＳａｌＩ部位を含む。

特定の実施態様では、コドン最適化は、ミニ−ジストロフィン遺伝子が組み立てられた野生型配列と比較して、ＧＣ含有量（すなわち、核酸配列内に存在するＧおよびＣ核酸塩基の数、通常はパーセンテージとして表される）を増大させる。一部の実施態様では、ＧＣ含有量は、対応する野生型遺伝子のＧＣ含有量よりも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれよりも多い。関連する実施態様では、コドン最適化遺伝子のＧＣ含有量は、約または少なくとも４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、またはそれよりも多い。

一部の実施態様では、コドン最適化は、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子のコドン適合指標（ＣＡＩ）を増大させる。ＣＡＩは、特定の種における同義コドンの使用傾向の尺度である。特定の種におけるＣＡＩ値（０〜１の範囲である）は、遺伝子発現レベルと正に相関する。例えば、Ｓｈａｒｐ，ＰＭａｎｄＷ−ＨＬｉｅ，ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１５（３）：１２８１−９５（１９８７）を参照。特定の実施態様によれば、コドン最適化は、高度に発現されたヒト遺伝子に関して、ミニ−ジストロフィン遺伝子のＣＡＩを、少なくとも０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９である値まで増大させる。

他の実施態様では、コドン最適化は、ミニ−ジストロフィンのコード配列内のＣｐＧジヌクレオチドの数を減少させる。操作の特定の理論によって拘束されることを望まずに、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるメチル化は、遺伝子転写をサイレンシングすることができるので、遺伝子配列内のＣｐＧジヌクレオチドの数の減少は、メチル化のレベルを減少させることができ、それにより、高い転写効率をもたらすと考えられる。したがって、コドン最適化ミニ−ジストロフィン遺伝子の一部の実施態様では、ＣｐＧジヌクレオチドの数は、ミニ−ジストロフィン遺伝子が組み立てられた野生型配列と比較して、約または少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、またはそれよりも多く、低減される。

ヒトコドン最適化ヒトミニ−ジストロフィン遺伝子の非限定的な例は、配列番号１のＤＮＡ配列によって提供される。３９７８核酸塩基の長さである（終止コドンを含む）このＤＮＡ配列は、本明細書において、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８と呼ばれるが、特定の専門用語が単に便利性のために用いられ、制限されることを意図しない。Ｄｙｓ３９７８と呼ばれる配列番号１によってコードされるミニ−ジストロフィンタンパク質配列は、配列番号７によって提供される。イヌコドン最適化ヒトミニ−ジストロフィン遺伝子の例は、配列番号３によって与えられて、それはＤｙｓ３９７８もコードする。本明細書にさらに詳細に説明されるように、配列番号７のミニ−ジストロフィンに関するコード配列は、ジストロフィンタンパク質（配列番号２５）内に存在する特定のサブドメインに対応する野生型全長ヒト筋ジストロフィン遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４００６．２に例示され、参照により援用される）のサブシーケンスから組み立てられた。生じる遺伝子配列は、本明細書において配列番号２６として提供されて、それから、ヒトコドン最適化されて、配列番号１のＤＮＡ配列をもたらした。制限されずに、コドン最適化は、コドン最適化前の遺伝子配列と比較して、ＧＣ含有量を増大させて、稀なコドンの使用を低減させて（すなわち、コドン適合指標（ＣＡＩ）を増大させた）、強力な翻訳開始部位（コザックコンセンサス配列など）を含んだ。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するための本開示のＡＡＶ粒子のベクターゲノムは、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするコドン最適化遺伝子に隣接するＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む。一部の実施態様では、ＩＴＲは、キャプシドと同一のＡＡＶ血清型由来であるが（例えば、制限されずに、ＡＡＶ９ＩＴＲはＡＡＶ９キャプシドとともに用いられる）、他の実施態様では、異なる血清型由来のＡＡＶＩＴＲが用いられ得る。例えば、ＡＡＶ２血清型由来のＩＴＲは、異なる、ＡＡＶ２血清型由来でないＡＡＶキャプシドと組み合わせてベクターゲノムにおいて用いられ得る。非限定的な例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型または異なる天然または非天然起源ＡＡＶ血清型由来のキャプシドとＡＡＶ２ＩＴＲの使用を含む。特定の非限定的な例では、ＡＡＶ２ＩＴＲは、ＡＡＶ９血清型由来のキャプシドと組み合わせて用いられ得る。ベクターゲノムのプラスまたはセンスＤＮＡ鎖の観点から、ＡＡＶ２ＩＴＲの左、５’、または上流の配列は、配列番号１４のＤＮＡ配列として提供されて、ＡＡＶ２ＩＴＲの右、３’、または下流の配列は、配列番号１５のＤＮＡ配列として提供される。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するための本開示のＡＡＶベクターのベクターゲノムは、ベクターゲノムが、その二本鎖形態に転換された時点で、形質導入細胞においてミニ−ジストロフィン遺伝子を発現し得るように、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子と動作可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む。転写調節エレメントは、典型的にプロモーターを含むが、任意選択で、プロモーターからの転写開始率を増大させるように作用することのできる１つまたは複数のエンハンサーエレメントを含む。

ミニ−ジストロフィンコード配列に関する、転写調節エレメントの動作可能な連結は、転写調節エレメントが、遺伝子の転写および発現を制御するように機能することができることを意味するが、任意の特定の構造的または空間的関係を必ずしも必要としない。本開示のベクターゲノムは、典型的に、ＡＡＶキャプシド内に一本鎖ＤＮＡ分子としてパッケージされるので、動作可能な連結は、ベクターゲノムが二本鎖形態に転換されるまで、機能性でなくてよいことが理解されるべきである。通常、プロモーターは、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子配列の５’または上流に位置するが、エンハンサーのような他の転写調節エレメントが、遺伝子の５’または他のどこか、例えば３’に位置してよい。

一部の実施態様では、転写調節エレメントは、真核生物細胞に感染する特定のウイルスに見られるもののような、強力な構成的に活性のプロモーターであってよい。当該分野からよく知られた例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターを含むが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーターのような他のものも同様に知られる。ＣＭＶまたはＲＳＶのような強力なウイルスプロモーターは、典型的に組織特異的でないので、用いられる場合、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、筋肉細胞だけでなく、本開示のＡＡＶ粒子によって形質導入された任意の他の細胞型、例えば肝臓において発現される。それ故に、他の実施態様では、筋肉特異的な転写調節エレメントは、本開示のＡＡＶ粒子によって形質導入され得る肝臓細胞のような非筋肉細胞において発現されるミニ−ジストロフィンタンパク質の量を減少させるために用いられ得る。

筋肉特異的な転写調節エレメントは、制限せずにヒトまたはマウス筋肉遺伝子のような哺乳類の種を含む、任意の種由来の筋肉特異的遺伝子に由来し得る。筋肉特異的な転写調節エレメントは、最低でも、筋肉特異的遺伝子由来のプロモーターならびに同一または異なる筋肉特異的遺伝子由来の１つまたは複数のエンハンサーを典型的に含む。そのようなエンハンサーは、ネイティブの遺伝子の多くの部分、例えば、遺伝子の５’または３’に位置する、またはイントロン内にさえ存在するエンハンサー由来であってよい。筋肉特異的な転写調節エレメントは、筋肉特異的遺伝子から一体的に除去され得て、本開示のＡＡＶベクターゲノムを生産するためにプラスミド内に挿入されて、または、それらの活性を適合させて、それらのサイズを出来るだけ減少させるように改変され得る。

筋肉特異的な転写調節エレメントが由来し得る筋肉特異的遺伝子の非限定的な例は、筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子、ミオシン重鎖遺伝子、またはミオシン軽鎖遺伝子、または、骨格筋由来のα１アクチン遺伝子を含むが、他のものも可能である。これらの遺伝子は、ヒト、マウス、または他の種由来であってよい。

遺伝子治療適用での使用のために作られている筋肉特異的な転写調節エレメントは、当該分野において説明されて、筋ジストロフィーを治療するために本開示のＡＡＶベクターにおいて用いられ得る。非限定的な例では、Ｈａｕｓｅｒは、マウスクレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）遺伝子に由来するＣＫ４、ＣＫ５、およびＣＫ６として知られる筋肉特異的な転写調節エレメントを記載し（Ｈａｕｓｅｒ，ＭＡ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒａｐｙ２（１）：１６−２５（２０００））、Ｓａｌｖａは、ＭＣＫ遺伝子に由来するＣＫ１およびＣＫ７として知られる筋肉特異的な転写調節エレメント、および、マウスα−ＭＨＣ遺伝子由来のエンハンサーを追加で含むＭＨＣＫ１およびＭＨＣＫ７を記載し（Ｓａｌｖａ，ＭＺ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒａｐｙ１５（２）：３２０−９（２００７））、Ｗａｎｇは、ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、ｄＭＣＫおよびｔＭＣＫとして知られる筋肉特異的な転写調節エレメントを記載した（Ｗａｎｇ，Ｂ，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１５：１４８９−９（２００８））。筋ジストロフィーを治療するための本開示のＡＡＶベクターにおける他の筋肉特異的な転写調節エレメントの使用も可能である。

筋ジストロフィーを治療するための本開示のＡＡＶベクターにおいて用いられ得る筋肉特異的な転写調節エレメントの非限定的な例は、ＣＫ４、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ１、ＣＫ７、ＭＨＣＫ１、ＭＨＣＫ７、ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、ｄＭＣＫおよびｔＭＣＫ（当該分野においてそれぞれ説明される）、または、配列番号４、配列番号５、および配列番号１６のＤＮＡ配列を有する本明細書において開示されるものを含む。他の筋肉特異的な転写調節エレメントも同様に用いられ得る。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するための本開示のＡＡＶベクターのベクターゲノムは、ミニ−ジストロフィン遺伝子に関するコード配列の３’に位置する転写終結配列をさらに含む。転写終結配列を含むことは、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物が、形質導入細胞によって適切にポリアデニル化されるのを確実にして、それにより、タンパク質へのメッセージの効率的な翻訳を確実にさせる。操作の任意の特定の理論によって制限されることを意図せずに、哺乳類の転写終結配列に対する研究は、転写の終結および伸長している転写産物のシグナルポリアデニル化の役割を果たす遺伝子の３’ＵＴＲ内のコンセンサス配列を同定した。具体的には、これらの配列は、典型的に、モチーフＡＡＴＡＡＡ、その後に１５〜３０個のヌクレオチドが続き、それから、ＣＡを含む。例えば、Ｎ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，ＧｅｎｅｓＤｅｖ２５：１７７０−８２（２０１１）を参照。他のモチーフ、例えば上流エレメント（ＵＳＥ）および下流エレメント（ＤＳＥ）は、一部の遺伝子において転写終結に寄与し得る。多くの転写終結配列が当技術分野で知られていて、本開示のＡＡＶベクターにおいて用いられ得る。非限定的な例は、ＳＶ４０ウイルス早期または後期遺伝子由来のポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０早期または後期ポリＡ）またはウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）を含む。任意の種の他の遺伝子由来の転写終結配列が、本開示のＡＡＶベクターにおいて用いられ得る。あるいは、合成の転写終結配列が設計され得て、シグナル転写終結およびポリアデニル化に用いられ得る。本開示のＡＡＶベクターにおいて使用され得る転写終結配列のさらなる非限定的な例は、配列番号６および配列番号１７のＤＮＡ配列を有する本明細書において開示されるものを含む。

特定の非限定的な実施態様によれば、本開示は、ＡＡＶキャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするベクターゲノムを含む、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するためのＡＡＶウイルス粒子またはベクターを提供する。一部の実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、全長ヒトジストロフィンタンパク質由来の以下のサブドメイン：ＡＢＤ−Ｈ１−Ｒ１−Ｒ２−Ｈ３−Ｒ２２−Ｒ２３−Ｒ２４−Ｈ４−ＣＲＤ−ＣＴＤを含む。一部の実施態様では、ＣＴＤは、野生型筋ジストロフィンに見られるＣＴＤのほんの一部であり、一部の実施態様では、野生型筋ジストロフィン（配列番号２５）内に存在する最後の３つのアミノ酸を含まない。特定の実施態様によれば、配列番号７のミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドン最適化されて、配列番号１のＤＮＡ配列を有する。一部の実施態様では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９血清型由来である。

本明細書中の他のどこかに示されるように、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムは、ほぼ等しい比率でプラス鎖またはマイナス鎖としてキャプシド内にパッケージされる。その結果として、ベクターまたは粒子の実施態様は、ベクターゲノムがプラス鎖極性であるＡＡＶ粒子（すなわち、センスまたはコードＤＮＡ鎖の核酸塩基配列を有する）、ならびに、ベクターゲノムがマイナス鎖極性であるＡＡＶ粒子（すなわち、アンチセンスまたはテンプレートＤＮＡ鎖の核酸塩基配列を有する）を含む。プラス鎖の核酸塩基配列がその通常の５’から３’の順番で提供されれば、マイナス鎖のその５’から３’の順番での核酸塩基配列は、プラス鎖の核酸塩基配列の逆相補として決定され得る。

ベクターの一部の実施態様では、ベクターゲノムは、プラス極性である場合は、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子のＤＮＡ配列である配列番号１の５’に位置してそれと動作可能に連結された配列番号１６のＤＮＡ配列を有するクレアチンキナーゼ遺伝子に由来する筋肉特異的な転写調節エレメントを含む。その５’末由来の核酸塩基の配列が前述のプラス鎖の配列の逆相補である場合、対応するマイナス鎖を含む粒子もあり得る。他の実施態様では、ベクターゲノムは、プラス極性である場合は、第一のＡＡＶ２ＩＴＲの後に、配列番号１のＤＮＡ配列の５’に位置してそれと動作可能に連結された配列番号１６のＤＮＡ配列、および、ミニ−ジストロフィン遺伝子の３’に位置する配列番号１７のＤＮＡ配列を含む転写終結配列、その後に、第二のＡＡＶ２ＩＴＲを含む。その５’末由来の核酸塩基の配列が前述のプラス鎖の配列の逆相補である場合、対応するマイナス鎖を含む粒子もあり得る。

ベクターの特定の他の実施態様では、ベクターゲノムは、プラス極性である場合、５’から３’の順番で、第一のＡＡＶ２ＩＴＲ、配列番号１６のＤＮＡ配列によって定義される転写調節エレメント配列、ミニ−ジストロフィンを発現するためのヒトコドン最適化遺伝子配列、転写調節エレメントと動作可能に連結された配列番号１のＤＮＡ配列によって定義される遺伝子配列、配列番号１７のＤＮＡ配列によって定義される転写終結配列、および、第二のＡＡＶ２ＩＴＲを含む。その５’末由来の核酸塩基の配列が前述のプラス鎖の配列の逆相補である場合、対応するマイナス鎖を含む粒子もあり得る。

特定の非限定的な実施態様によれば、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するためのＡＡＶベクターは、本明細書においてＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと呼ばれてよく、ＡＡＶ９血清型由来のキャプシド、および、ベクターゲノムを含み、そのベクターゲノムは、本明細書においてｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと呼ばれてよく、ゲノムがプラス極性である場合、配列番号１８のＤＮＡ配列を含み、から本質的になり、またはからなり、または、ゲノムがマイナス極性である場合は、配列番号１８のＤＮＡ配列の逆相補を含む、から本質的になる、またはからなる（すなわち、ベクターゲノム配列が５’から３’に読まれる場合）。

ウイルスベクターを生産する方法
本開示は、ＡＡＶベクターを生産する方法をさらに提供する。１つの特定の実施態様では、本開示は、組み換えパルボウイルス粒子を生産する方法を提供し、ＡＡＶ複製およびパッケージングを許容する細胞に、ミニ−ジストロフィン遺伝子、関係がある遺伝子制御エレメントおよび隣接するＡＡＶＩＴＲを含む組み換えＡＡＶベクターゲノム、および、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子によって提供されるもののようなＡＡＶ複製およびパッケージング機能を、組み換えＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングに十分な条件下で提供するステップを含み、それにより、ｒＡＡＶ粒子が細胞によって生産される。ｒＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングに十分な条件は、制限されずに、ヘルパー機能、例えば、アデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のものを含む。ＡＡＶ複製およびパッケージングを許容する細胞は、パッケージング細胞またはプロデューサー細胞（より広範な用語「宿主細胞」によって包含される用語）として本明細書において知られている。ｒＡＡＶ粒子ベクターゲノム、複製およびパッケージング機能、および、必要な場合は、ヘルパー機能は、ウイルスまたは非ウイルスベクター、例えばプラスミドを介して提供され得て、エピソーム内または細胞のゲノム中に組み込まれてパッケージング細胞内に安定的または一時的に存在し得る。

本開示の組み換えＡＡＶベクターは、当業者に公知のいくつかの方法によって作られ得る（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３７９を参照）。例示的な方法は、Ｇｒｉｅｇｅｒ，ｅｔａｌ．２０１５，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２４（２）：２８７−２９７に記載されて、その内容は、参照により援用される。手短には、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションは、開始点として用いられて、ここで、適した臨床マスター細胞バンク由来の接着性ＨＥＫ２９３細胞株は、迅速かつスケーラブルなｒＡＡＶ粒子の生産を可能にする振とうフラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクター内において動物成分フリーの懸濁液状態で増殖するために用いられる。三重トランスフェクション方法を用いて（例えば、ＷＯ９６／４０２４０）、懸濁液ＨＥＫ２９３細胞株は、一部の実施態様では、トランスフェクション後４８時間に採取された場合、細胞あたり１×１０^５ベクターゲノム（ｖｇ）よりも多くを含む粒子、または、１×１０^１４ｖｇ／Ｌよりも多くの細胞培養を生じることが可能である。三重トランスフェクションは、パッケージング細胞が３つのプラスミドによってトランスフェクトされるという事実を指し：一方のプラスミドはＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードし、他方のプラスミドは、様々なヘルパー機能（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡＲＮＡをコードし、他方のプラスミドは、ベクターゲノム、すなわち、ミニ−ジストロフィン遺伝子およびＡＡＶＩＴＲが隣接するその様々な制御エレメントをコードする。所望の収率を達成するために、増殖およびトランスフェクションの両方をサポートする適合性の血清フリー懸濁液培地の選択、トランスフェクション試薬の選択、トランスフェクション条件および細胞密度のような多くの変数が最適化される。ベクターは、培地から、および／または、細胞を溶解させることによって集められ得て、それから、古典的な密度勾配超遠心分離技術を用いて、または、カラムクロマトグラフィーまたは他の技術を用いて精製される。

パッケージング機能は、ウイルスベクター複製およびパッケージングのための遺伝子を含む。したがって、例えば、パッケージング機能は、必要に応じて、ウイルス遺伝子発現、ウイルスベクター複製、組み込まれた状態からのウイルスベクターのレスキュー、ウイルス遺伝子発現、および、ウイルス粒子へのウイルスベクターのパッケージングに必要な機能を含んでよい。パッケージング機能は、プラスミドまたはアンプリコンのような遺伝子構築物、バキュロウイルス、またはＨＳＶヘルパー構築物を用いて、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に与えられ得る。パッケージング機能は、パッケージ細胞内の染色体外に存在してよいが、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。例は、ＡＡＶＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含む。Ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、同一のウイルスまたは非ウイルスベクターの部分として一緒にパッケージング細胞に提供され得る。例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、複合型アデノウイルスベクター（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）、または、ＥＢＶベクターのようなヘルペスウイルスベクターによって提供され得る。あるいは、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、別々に提供され得る。Ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、パッケージング細胞のゲノムに安定的に組み込まれてもよく、または、エピソーム上に存在してもよい。典型的に、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ｒＡＡＶベクター粒子中へのこれらの配列のパッケージングを避けるために、ＩＴＲによって隣接されない。

ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するのに必要なパッケージング細胞の活性の感染を達成するために必要とされるヘルパーウイルスエレメントを含む。例は、ウイルスベクターのパッケージングをもたらすのに十分なアデノウイルス、バキュロウイルスおよび／またはヘルペスウイルスに由来する機能を含む。例えば、アデノウイルスヘルパー機能は、典型的に、アデノウイルス構成要素Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡＲＮＡを含む。パッケージング機能は、必要なウイルスによるパッケージング細胞の感染によって供給され得る。あるいは、感染性ウイルスの使用を避けることができ、それによって、パッケージング機能は、プラスミドまたはアンプリコンのような非ウイルスベクターを用いてパッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１に記載のｐＸＲヘルパープラスミド、および、Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．，１９９８，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ９：２７４５−２７６０に記載のｐＤＧプラスミドを参照。パッケージング機能は、パッケージング細胞内の染色体外に存在してよいが、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい（例えば、ＨＥＫ２９３細胞内のＥ１またはＥ３）。

ヘルパー機能を保有するヌクレオチド配列を複製およびパッケージングのために細胞宿主内に導入する任意の方法が用いられてよく、制限されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、および、核局在化シグナルと組み合わせたリポソームを含む。ヘルパー機能が、ウイルスベクターを用いたトランスフェクションまたはヘルパーウイルスを用いた感染によって提供される実施態様では；ウイルス感染を生産する標準的な方法が用いられ得る。

当技術分野で知られている任意の適切な許容的またはパッケージング細胞が、パッケージされたウイルスベクターの生産において用いられ得る。哺乳類細胞または昆虫細胞が好ましい。本発明の実施におけるパッケージング細胞の生産に有用な細胞の例は、例えば、ヒト細胞株、例えばＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３細胞（構成的プロモーターの制御下で機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ−５０または任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞株を含む。一態様では、パッケージング細胞は、懸濁液培養、特に血清フリーの増殖培地中での増殖が可能である。一実施態様では、パッケージング細胞は、血清フリー培地中の懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３である。別の実施態様では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載されてＡＴＣＣＮｏ．ＰＴＡ１３２７４として寄託されるＨＥＫ２９３細胞である。非常に多くのｒＡＡＶ粒子パッケージング細胞株が、当技術分野で知られていて、制限されないが、ＷＯ２００２／４６３５９に開示されるものを含む。

パッケージング細胞としての使用のための細胞株は、特に、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子生産のために必要な遺伝子を導入するためにバキュロウイルスベクターが用いられる場合、昆虫細胞株を含む。ＡＡＶの複製を可能にして培地中に維持され得る任意の昆虫細胞は、本開示に従って用いられ得る。例は、スポドプテラ・フルギペルダ、例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１株、ショウジョウバエ属の細胞株、または蚊の細胞株、例えば、ヒトスジシマカ由来の細胞株を含む。

本開示のＡＡＶベクター粒子が生産および精製された後に、それらは、筋ジストロフィーを有するヒト対象のような対象への投与のための組成物を調製するために滴定され得る。ＡＡＶベクターの滴定は、当技術分野で知られている方法を用いて達成され得る。特定の実施態様では、ＡＡＶベクター粒子は、ベクターゲノム内の配列、例えば、存在するならばＡＡＶ２ＩＴＲ配列、またはベクターゲノム内の他の配列に対するプライマーを用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて滴定され得る。ベクターゲノムの配列を含むプラスミドのような公知濃度の標準の希釈と並行してｑＰＣＲを行なうことによって、ＡＡＶベクターの濃度がマイクロリットルまたはミリリットルのような単位容量あたりのベクターゲノムの数（ｖｇ）として計算されるのを可能にする検量線が生成され得る。あるいは、ゲノムを含むＡＡＶベクター粒子の数は、ベクターゲノムに関して適切なプローブを用いたドットブロットを用いて決定され得る。これらの技術は、Ｇｒａｙ，ＳＪ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｕｓｅｉｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｅｕｒｏｓｃｉ（２０１１）、および、ＷｅｒｌｉｎｇＮＪ，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒＭｅｔｈ２６：８２−９２（２０１５）にさらに記載される。ストック内のＡＡＶベクターゲノムの濃度が決定された時点で、対象への投与のための組成物を調製するのに用いるための適切なバッファー中に希釈され得て、またはそれに対して透析され得る。

治療方法
本開示は、ジストロフィン異常症のための治療を必要とする対象に、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクター、例えば制限されずに、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡとして知られるベクターを投与することにより、ジストロフィン異常症を治療するための方法を提供する。一部の実施態様では、ジストロフィン異常症は、制限されずに、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ＤＭＤ関連の拡張型心筋症（ＤＣＭ）、および、女性での症候性キャリア状態を含む、筋ジストロフィーである。したがって、一部の実施態様では、本開示は、筋ジストロフィーのための治療を必要とする対象に、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクター、例えば制限されずに、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡとして知られるベクターを投与することにより、筋ジストロフィーを治療するための方法を提供する。関連する実施態様では、本開示は、したがって、治療を必要とする対象において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ＤＭＤ関連の拡張型心筋症（ＤＣＭ）、および女性での症候性キャリア状態を治療するための方法を提供する。

また、本明細書において開示される治療の方法での使用のための薬品の製造における、本開示のＡＡＶベクターまたは医薬組成物の使用も提供される。加えて、本明細書において開示される治療の方法での使用のための本開示のＡＡＶベクターまたは医薬組成物が提供される。

ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象の治療は、効果的であると考えられる治癒をもたらす必要はなく、ここで治癒とは、疾患進行を停止させる、または対象の筋肉機能を部分的または完全に回復させるものとして定義される。むしろ、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象の症候を減少または寛解させる、進行を遅延させる、または、生活の質を改善する役割を果たすものである。特定の非限定的な実施態様によれば、ジストロフィン異常症を有する対象の治療は、彼らの可動性を改善させることができ、彼らの歩行または他の可動性の喪失までの時間を遅らせることができ、ＤＭＤのような重度のジストロフィン異常症の場合は、障害を有する対象の寿命を延ばすことができる。

本開示の治療の方法は、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する男性または女性対象を治療するために用いられ得る。女性の場合は、治療は、症候性キャリアに、または末期の疾患を有する稀な女性対象に提供され得る。本開示の方法は、１才未満、または、約または少なくとも１才、または、約または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０才またはそれよりも上の対象を含む、ジストロフィン異常症を有する任意の年齢の対象を治療するために用いられてもよい。対象は治療時に歩行可能であってよく、または歩行不可能であってよい。

本開示の治療の方法は、病変がネイティブのヒトジストロフィン遺伝子の機能の減少または喪失をもたらす限り、根底にある遺伝子病変（例えば、ジストロフィン遺伝子における欠失、重複、スプライス部位変異、またはナンセンス突然変異）にかかわらず、ジストロフィン異常症を有する対象を治療するために用いられ得る。

本開示の特定の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターによる対象の治療は、筋ジストロフィーの存在または進行と関連する１つまたは複数のバイオマーカーの組織濃度を減少させる。

特定の実施態様によれば、バイオマーカーは、損傷した骨格筋または心筋細胞から血液（血清または血漿を含む）へ放出される特定の酵素である。非限定的な例は、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）、トランスアミナーゼアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、および、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を含み、それらの平均レベルは、全て、ＤＭＤを有する対象において上昇することが知られている。

一部の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、ＤＭＤ患者の血液中の上昇されたＡＬＴレベルを、同様の年齢および性別の健康な対象において典型的に見られるものよりも、約７−、６−、５−、４−、３−、または２倍以内大きく減少させるのに効果的である。他の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、ＤＭＤ患者の血液中の上昇されたＡＳＴレベルを、同様の年齢および性別の健康な対象において典型的に見られるものよりも、約７−、６−、５−、４−、３−、または２倍以内大きく減少させるのに効果的である。一部の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、ＤＭＤ患者の血液中の上昇されたＬＤＨレベルを、同様の年齢および性別の健康な対象において典型的に見られるものよりも、約７−、６−、５−、４−、３−、または２倍以内大きく減少させるのに効果的である。一部の他の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、ＤＭＤ患者の血液中の上昇された総ＣＫレベルを、同様の年齢および性別の健康な対象において典型的に見られるものよりも、約５０−、４８−、４６−、４４−、４２−、４０−、３８−、３６、３４−、３２−、３０−、２８−、２６−、２４−、２２−、２０−、１８−、１６−、１４−、１２−、１０−、９−、８−、７−、６−、５−、４−、３−、または２倍以内大きく減少させるのに効果的である。細胞外マトリックスの分解または再構築と関連する酵素であるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）は、ＤＭＤ患者の血液中で上昇されることも見いだされている。例えば、Ｎａｄａｒａｊａ，ＶＤ，ｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ２１：５６９−５７８（２０１１）を参照。したがって、一部の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、ＤＭＤ患者の血液中の上昇されたＭＭＰ−９レベルを、同様の年齢および性別の健康な対象において典型的に見られるものよりも、約１５−、１４−、１３−、１２−、１１−、１０−、９−、８−、７−、６−、５−、４−、３−、または２倍以内大きく減少させるのに効果的である。

他の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、上記のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ、ＣＫおよびＭＭＰ−９のレベルを単独またはこれらの同一または他のバイオマーカーの１つまたは複数と組み合わせて、変更するのに効果的である。したがって、例示的な非限定的な実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶミニ−ジストロフィンベクターは、ＡＬＴおよびＡＳＴ、ＡＬＴおよびＬＤＨ、ＡＳＴおよびＣＫ、またはＡＳＴおよびＭＭＰ−９などを減少させるのに効果的である。

本開示の一部の治療方法では、効果的な投与量または量のＡＡＶベクターは、６分徒歩試験（６ＭＷＴ）での平均的な対象の能力を改善するものである。６ＭＷＴは、筋ジストロフィー、特に、ＤＭＤを有するヒト対象の筋肉機能および可動性の再現可能かつ迅速な測定として確立されている。例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＣＭ，ｅｔａｌ．，ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ４１（４）：５００−１０（２０１０）；Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ，Ｅ，ｅｔａｌ．，ＰＬＯＳＣｕｒｒｅｎｔｓＭｕｓｃＤｙｓ，８Ｊｕｌｙ２０１３；ＭｃＤｏｎａｌｄ，ＣＭ，ｅｔａｌ．，ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ４８：３４３−５６（２０１３）を参照。試験では、対象が、休憩から始めて、継続的かつ補助なしに６分の期間のあいだに歩くことができる距離（メートル）が記録される。この距離は、６分徒歩距離（６ＭＷＤ）としても知られる。試験の一部の適用では、個々の対象は、数日の期間にわたって１回よりも多く試験されてよく、結果は平均される。その利点に起因して、６ＭＷＴは、歩行できるＤＭＤ患者に関する薬物試験における主な臨床エンドポイントとして採用されている。例えば、Ｂｕｓｈｂｙ，Ｋ，ｅｔａｌ．，ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ５０：４７７−８７（２０１４）；Ｍｅｎｄｅｌｌ，ＪＲ，ｅｔａｌ．，ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ７９：２５７−７１（２０１６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃ，ｅｔａｌ．，ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ５５（４）：４５８−６４（２０１７）を参照。通常、これらの試験では、治療群内のそれぞれの対象は、数ヶ月または数年の期間にわたる６ＭＷＴを用いて彼らの歩行試験がされて、治療効果が存在するかどうか決定する。

本開示の治療方法の一部の実施態様によれば、治療的有効性は、ＤＭＤを有する者のような治療された対象の、ＤＭＤのような同じタイプのジストロフィン異常症を有する未治療のコントロール対象の平均６ＭＷＴ能力と比較した、平均６ＭＷＴ能力に対する本開示のＡＡＶベクターの治療効果を比較することによって統計的に決定される。そのようなコントロールは、本開示のＡＡＶベクターの治療的有効性を評価するために用いられる同一の試験に含まれていてよく、または、ＤＭＤまたは他のジストロフィン異常症の進行の自然経過試験から引き出された同様の対象であってよい。コントロールは、同年齢であってよく（または、例えば制限されずに、一部の閾値年齢、例えば６、７、８、９、または１０才よりも若いまたは高齢の対象に階層化される）、以前のコルチコステロイド治療の状態に関して一致していてよく（すなわち、イエスまたはノー、または、以前の治療の時間の長さ）、任意の治療前（コルチコステロイドによるものを除くかもしれない）の６ＭＷＴのベースライン能力に関して一致していてよく（または、例えば制限されずに、ベースライン能力が、一部の閾値、例えば２００ｍ、２５０ｍ、３００ｍ、３５０ｍ、４００ｍ、４５０ｍ、または５００ｍよりも下および上である対象に階層化される）、または、臨床的に関連のあると判定される一部の他の属性であってよい。

本開示の治療方法の特定の実施態様によれば、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象の平均６ＭＷＤを、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、同様の一致または階層化されたコントロールと比較して、約または少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００メートルまたはそれよりも多く、増大させるのに効果的である。これらの実施態様の一部では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

本開示の治療方法の特定の実施態様によれば、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象の平均６ＭＷＤを、ベクターの投与の３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、３６０、３９０、４２０、４５０、４８０、５１０、５４０、５７０、６００、６３０、６６０、６９０または７２０日後、同様の一致または階層化されたコントロールと比較して、約または少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００メートルまたはそれよりも多く、増大させるのに効果的である。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

６ＭＷＴに対する代替として、治療的有効性は、対象が４つの標準的なサイズの階段を登るのにかかる時間の減少として表わすことができ、４階段上昇試験として知られる試験である。この試験は、ＤＭＤ患者におけるコルチコステロイド治療の有効性を評価するために用いられている。Ｇｒｉｇｇｓ，ＲＣ，ｅｔａｌ．，ＡｒｃｈＮｅｕｒｏｌ４８（４）：３８３−８（１９９１）。したがって、本開示の治療方法の特定の実施態様によれば、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象が４階段上昇試験を行なうのにかかる平均時間を、ベクターの投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、同様の一致または階層化されたコントロールと比較して、約または少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、または４．０秒またはそれよりも多く、減少させるのに効果的である。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

本開示の治療方法の関連する実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象が４階段上昇試験を行なうのにかかる平均時間を、ベクターの投与の３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、３６０、３９０、４２０、４５０、４８０、５１０、５４０、５７０、６００、６３０、６６０、６９０または７２０日後、同様の一致または階層化されたコントロールと比較して、約または少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、または４．０秒またはそれよりも多く、減少させるのに効果的である。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

治療的有効性は、コントロールと比較して、治療の規定時間後に歩行の喪失を経験する対象のパーセンテージにおける経時的な減少としても表わすことができる。歩行の喪失は、車椅子使用に対する連続的な依存の開始として定義される。したがって、本開示の治療方法のさらに他の実施態様によれば、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象への投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、歩行ができなくなった対象の平均数を、同様の一致または階層化されたコントロールと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％またはそれよりも多く、減少させる。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

本開示の治療方法の一部の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象における１つまたは複数の症候の発症を遅らせるのに効果的である。症候の発症前の診断は、ＤＭＤ遺伝子内の突然変異に関する出生前、出産前後期または出生後の遺伝子試験を通して達成され得る。特定の実施態様によれば、本開示のＡＡＶベクターによる治療は、ＤＭＤの症候の１つまたは複数の発症を、同様の一致または階層化されたコントロールと比較して、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４５、４６、４８、５０、５２、５４、５５、５６、２８、６０、６２、６４、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７６、７８、または８０ヶ月、またはそれよりも多く、遅らせるのに効果的である。当業者によって理解されるように、ＤＭＤの初期症候は、制限されずに、歩行能力の遅延（ＤＭＤを有さない赤ちゃんでの平均１２〜１５ヶ月と比較して、約１８か月の平均年齢まで）；飛ぶこと、走ること、または階段を登ることの困難性；転びやすさ；近位筋の弱さ（例えば、床から起き上がるときのＧｏｗｅｒｓの演習（ｍａｎｅｕｖｅｒ）を示すことによって証明される）；偽肥大に起因した拡大された腓腹；つま先および／または母指球での対象の歩行に起因したあひる歩行；腹を突きだして肩を後ろに引くことによりバランスを維持する傾向；および、認識機能障害、例えば、減少された受容言語、表出言語、視空間能力、優秀な運動能力、注意力、および記憶力を含む。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

治療的有効性は、未治療コントロールと比較して、細い筋組織を置き換える脂肪組織の量の増大を経験するベクター治療された対象のパーセンテージにおける経時的な減少としても表わすことができる。一部の実施態様では、脂肪症の増大に向かうこの進行は、ＤＭＤ患者の足の筋肉のＭＲＩ分析を用いて判定することができ、Ｗｉｌｌｃｏｃｋｓ，ＲＪ，ｅｔａｌ．，ＭｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｉｎａｌａｒｇｅＤｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙｃｏｈｏｒｔ，ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ７９：５３５−４７（２０１６）においてさらに説明されるように、脂肪画分（ＦＦ）として表される。関連する実施態様では、本開示のＡＡＶベクターによるＤＭＤ対象の治療は、一致したコントロールと比較して、治療の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、ＭＲＩによって決定される彼らの下肢における平均ＦＦを、約または少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれよりも多く、減少させるのに効果的である。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

一部の実施態様では、治療的に効果的な投与量または量の本開示のＡＡＶベクターは、治療の３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月後、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれよりも多くのミニ−ジストロフィンタンパク質を発現している骨格筋線維をもたらすものである。ミニ−ジストロフィンタンパク質発現に関してポジティブである筋線維のパーセンテージは、ミニ−ジストロフィンタンパク質に特異的に結合することが可能な抗−ジストロフィン抗体によって、治療された対象由来の生検された筋肉の断面を免疫標識することによって決定され得る。適切な免疫標識技術は、実施例に記載されていて、当業者に馴染みがある。生検が取られ得る治療された対象の例示的な筋肉は、二頭筋、三角筋、および四頭筋を含むが、他の筋肉も同様に、生検され得る。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

一部の実施態様では、ＤＭＤのような筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症の治療に関する本開示のＡＡＶベクターの投与量または量は、治療的に効果的であり、同時に、治療された対象において、またはそのような対象のほんの低いパーセンテージにおいて、ミニ−ジストロフィンタンパク質に関して特異的な細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を引き起こさないように決定される。ミニ−ジストロフィンタンパク質に対するＴ細胞応答の存在または程度は、ミニ−ジストロフィンタンパク質アミノ酸配列をカバーする重複ペプチドライブラリーに対する曝露に応答してγインターフェロン（ＩＦＮγ）を産生する対象血液から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定され得る。特定の実施態様では、ポジティブＩＦＮγ応答に関する閾値は、試験された百万のＰＢＭＣあたり５０スポットよりも多くを形成する細胞として設定され得る。制限されずに、ベクター治療された対象から得られたミニ−ジストロフィンタンパク質を発現している筋肉または他の組織の生検内のＴ細胞浸潤物の検出を含む、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対するＴ細胞応答を検出するための他のアッセイの使用も可能である。対象は、ヒト対象または動物対象、例えばＤＭＤの動物モデル、例えば、ｍｄｘマウス、ｍｄｘラット、またはＧＲＭＤ犬モデルであってよい。他の実施態様では、ＤＭＤのような筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症の治療のための本開示のＡＡＶベクターの投与量または量は、治療的に効果的であり、同時に、キャプシド、ベクターゲノム（またはその任意の構成要素）、または形質導入細胞によって発現されるミニ−ジストロフィンタンパク質に対して、または、そのような対象のほんの低いパーセンテージにおいて、炎症性応答を引き起こさないように決定される。操作の任意の特定の理論によって拘束されることを望まずに、ＡＡＶベクターに応答した炎症は、先天性の免疫応答に起因し得る。ベクター治療された対象の筋肉における炎症は、存在するならば、磁気共鳴イメージングを用いて検出され得る。、例えば、ＪＧａｒｃｉａ，ＳｋｅｌｅｔａｌＲａｄｉｏｌ２９：４２５−３８（２０００）およびＳｃｈｕｌｚｅ，Ｍ，ｅｔａｌ．，ＡｍＪＲａｄｉｏｌ１９２：１７０８−１６（２００９）を参照。対象は、ヒト対象または動物対象、例えば、ＤＭＤの動物モデル、例えば、ｍｄｘマウス、ｍｄｘラット、またはＧＲＭＤ犬モデルであってよい。上述の一部の実施態様では、細胞性免疫応答または炎症の存在または不存在は、治療の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６ヶ月後、または治療後の一部の他のときに決定される。関連する実施態様では、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対して細胞性免疫応答を示す対象の低いパーセンテージは、ベクターが投与された対象の約０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％以下である。これらの一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含み、例えば制限されずに、ベクターはＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定される。

関連する実施態様では、ＤＭＤのような筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症の治療のための本開示のＡＡＶベクターの投与量または量は、治療された対象における随伴性免疫抑制を必要とせずに治療的に効果的である。したがって、特定の実施態様では、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を有する対象の治療は、ＡＡＶベクターによる治療前、治療中、または治療後に、１つまたは複数の免疫抑制薬物を（現在の標準的な治療であるステロイド治療とは別に）対象へ投与することを必要とせずに、効果的である。例示的な免疫抑制薬物は、限定されないが、カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムスおよびシクロスポリン、抗増殖剤、例えば、ミコフェノール酸、レフルノミド、およびアザチオプリン、または、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばシロリムスおよびエベロリムスを含む。

実施例においてより詳細に探求されるように、制限されずにＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定されるベクターを含む本開示のＡＡＶベクターの有効性は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの動物モデルにおいて試験され得て、結果は、ヒトＤＭＤ患者におけるそのようなベクターの有効な投与量を予測するために用いられる。様々な動物モデルが当技術分野で知られていて、ｍｄｘマウスモデル、ゴールデンレトリバー筋ジストロフィーモデル、および最近では、実施例においてより詳細に説明されるＤｍｄ^ｍｄｘラットモデルを含む。

Ｄｍｄ^ｍｄｘラットモデルに基づいて、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定されるベクターを含む効果的な投与量の本開示のＡＡＶベクターは、様々な生物学的パラメーターおよびラットにおける疾患経過の態様に関して確立され得る。

したがって、本開示の特定の実施態様によれば、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ、または全クレアチンキナーゼレベルを減少させるのに効果的である。

他の実施態様では、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、大腿二頭筋、横隔膜、または心筋における線維症を減少させるのに効果的である。

さらに別の実施態様では、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、前肢把持力を増大させるのに効果的である。

他の実施態様によれば、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、前肢把持力を試験する５回の間隔が密接した試験にわたって測定される筋肉疲労を減少させるのに効果的である。

一部の他の実施態様では、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後６ヶ月において、心エコー検査を用いて測定される左心室駆出率を増大させるのに効果的である。

他の実施態様では、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、心エコー検査を用いて測定される後期に対する初期の左心室充満の速度比（すなわち、Ｅ／Ａ比）を増大させるのに効果的である。

一部の実施態様によれば、少なくとも１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、コントロールと比較して、注入後３ヶ月または６ヶ月において、心エコー検査を用いて測定される等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）またはピークＥ速度とそのベースライン復帰との間のミリ秒での時間（すなわち、Ｅ波の減速時間（ＤＴ））を低減させるのに効果的である。

前述の実施態様のそれぞれにおいて、コントロール動物と比較して、ベクターによって処置された動物における生理学の測定の増大または低減は、一部の実施態様では、統計的有意性に関して試験され得る。どの統計試験を用いるかの選択は、当業者の知識内である。統計的有意性を評価するための方法としてｐ値が採用される場合は、そのようなｐ値は、計算された時点で、事前に定義された有意水準と比較され得て、ｐ値が有意水準よりも小さい場合は、治療効果は、統計的に有意であると判定され得る。一部の実施態様では、有意水準は、０．２５、０．２０、０．１５、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、または一部の他の有意水準として事前に定義され得る。したがって、有意水準が０．０５として事前に定義される例示的な非限定的な実施態様では、その結果、ｐ値＜０．０５の計算は、ベクターによって治療された群とコントロール群との間の統計的有意差を表わすと解釈される。

前述の実施態様のそれぞれにおいて、コントロールは、未処置の、または、ビヒクルのみおよび非ベクターによって処置された、同一の性別および遺伝的背景の同年齢の動物であってよい。しかしながら、他のコントロールでも可能である。

一部の他の実施態様では、少なくとも３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの投与量によるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、大腿二頭筋、横隔膜、心筋、または他の横紋筋を形質転換して、注入後３ヶ月または６ヶ月までに、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対して細胞性免疫応答を誘導せずに、ｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子によってコードされるミニ−ジストロフィンタンパク質を発現するのに効果的である。ミニ−ジストロフィンタンパク質に対する細胞性免疫応答は、脾細胞、または血液リンパ球、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、試験動物から単離するステップ、プール（例えば、５プール）内のミニ−ジストロフィンタンパク質アミノ酸配列をカバーしている重複ペプチドライブラリー（例えば、それぞれ１０アミノ酸によって重複する１５アミノ酸長のペプチド）からのペプチドと細胞をインキュベートするステップ、および、ペプチドに曝露されるのに応答して細胞がγインターフェロン（ＩＦＮγ）を産生するかどうか判定するステップによって評価され得る。ＩＦＮγの産生は、当業者の知識に従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて判定され得る。例えば、Ｓｍｉｔｈ，ＪＧ，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌ８（５）：８７１−９（２００１），ＳｃｈｍｉｔｔｅｌＡ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２４７：１７−２４（２００１）、および、Ｍａｒｉｎｏ，ＡＴ，ｅｔａｌ．，ＭｅａｓｕｒｉｎｇｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡＡＶｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｃｈ．１１，ｐｐ．２５９−７２，Ａｄｅｎｏ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ．ＲＯＳｎｙｄｅｒａｎｄＰＭｏｕｌｌｉｅｒ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２０１１）を参照。特定の実施態様では、ポジティブのＩＦＮγ応答に関する閾値は、試験された百万の細胞あたり５０スポットよりも多くを形成する細胞として、または他の実施態様では、ネガティブの応答がこれらの閾値よりも下に考慮されるように、ネガティブコントロール（例えば、ペプチドを加えず培地のみ）を用いて検出されるスポット形成細胞の数の少なくとも３倍として設定され得る。

本開示の治療方法の一部の実施態様では、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症を治療するためのＡＡＶベクターは、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症のための治療を必要とする対象に、ＤＭＤのようなジストロフィン異常症の治療に効果的であることが実証された、またはそのように考えられる、少なくとも第二の薬剤と共同して投与される。ＡＡＶベクターの共同投与は、第二の薬剤の治療の前、同時、または後に、対象を治療することを意味する。特定の実施態様によれば、ＡＡＶベクターは、例えばジストロフィン遺伝子のエクソン５１、または、ジストロフィン遺伝子のいくつかの他のエクソンの、ＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングを引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒に投与される。ジストロフィン遺伝子のエクソン５１のスキッピングを引き起こす薬剤は、ドリサペルセンおよびエテプリルセンを含むが、他のものもあり得る。他の実施態様では、ＡＡＶベクターは、対象におけるミオスタチン機能を阻害する薬剤、例えば、抗−ミオスタチン抗体と一緒に投与されて、その例は、米国特許第７，８８８，４８６号、第８，９９２，９１３号、および第８，４１５，４５９号に提供される。他の実施態様では、対象のジストロフィン異常症がジストロフィン遺伝子内のナンセンス突然変異に起因し得る場合、ＡＡＶベクターは、ナンセンス突然変異のリボソームのリードスルーを促進する薬剤、例えばアタルレンと一緒に、または、未成熟終止コドンを抑制する薬剤、例えばアミノグリコシド、例えばゲンタマイシンと一緒に投与される。他の実施態様では、ＡＡＶベクターは、アナボリックステロイド、例えばオキサンドロロンと一緒に投与される。さらに他の実施態様では、ＡＡＶベクターは、コルチコステロイド、例えば制限されずに、プレドニゾン、デフラザコート、またはプレドニゾロンと一緒に投与される。これらの方法の一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含むＡＡＶ９ベクター、例えば制限されずに、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定されるベクターである。

医薬製剤および投与モード
本発明に係るウイルスベクターおよびキャプシドは、獣医およびヒト医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコなどを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、未成年および成人を含む。任意選択で、例えば対象が本明細書に記載されるものを含む障害を有するまたはそのリスクがあると考えられる、または本明細書に記載されるものを含むポリヌクレオチドの送達から恩恵を受けるため、対象は本発明の方法を「必要とする」。さらなる選択肢として、対象は、疾患の実験動物および／または動物モデルであってよい

特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明のウイルスベクター（例えばｒＡＡＶ粒子）および／またはキャプシド、および任意選択で、他の医療薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注入のために、担体は典型的に液体である。投与の他の方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体微粒子形態であってよい。

「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。

本発明の一態様は、ミニ−ジストロフィンをコードするポリヌクレオチドを細胞にインビトロで移行する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切である標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞内に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および特定のウイルスベクターに応じて変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約１０^３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０^５感染単位が細胞に導入される。

ウイルスベクターが導入される細胞（単数または複数）は、制限されないが、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、幹細胞、生殖細胞などを含む任意のタイプであってよい。代表的な実施態様では、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、筋肉幹細胞）であってよい。さらに、細胞は、前記の任意の起源種由来であってよい。

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞は元の対象内に投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、ドナー対象から細胞内に、培養細胞内に、または、任意の他の適切な由来から細胞内に導入され得て、細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。

エクスビボでの遺伝子送達に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約１０^２〜約１０^８細胞または少なくとも約１０^３〜約１０^６細胞が、薬学的に許容できる担体における投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて治療有効量または予防有効量で対象に投与される。

本発明のさらなる態様は、対象にウイルスベクターを投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に係るウイルスベクターおよび／またはキャプシドの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、薬学的に許容できる担体において治療効果的または予防効果的な投与量で送達される。

対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはキャプシドの用量は、投与モード、治療および／または予防されるべき疾患または症状、個々の対象の症状、特定のウイルスベクターまたはキャプシド、および、送達されるべき核酸などに依存し、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５形質導入単位、任意選択で、約１０^８〜１０^１３形質導入単位の力価である。

特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）が、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。

特定の実施態様では、本開示のＡＡＶベクターまたは粒子は、同一または異なる血清型の空のＡＡＶキャプシドを含む組成物において、対象に投与され得る。空のキャプシドは、典型的な配列および比率のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３キャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドであるが、ベクターゲノムを含まない。操作の任意の特定の理論によって拘束されることを望まずに、空のキャプシドの存在は、ＡＡＶベクターのキャプシドに対する免疫応答を減少させることができ、それにより、形質導入効率を増大させると仮定される。空のキャプシドは、ＡＡＶベクターの調製において自然に生じることができ、または、ＡＡＶベクター（すなわち、ベクターゲノムを含むキャプシド）に対して公知の比率の空のキャプシドを得るために公知の量で加えられる。空のキャプシドの調製、精製および定量は、当業者の知識の範囲内である。空のキャプシドおよび本開示のＡＡＶベクターを含む組成物は、ＡＡＶベクターと比較して過剰の空のキャプシド、または、空のキャプシドと比較して過剰のゲノム含有ＡＡＶベクターを用いて処方され得る。したがって、一部の実施態様では、本開示の組成物は、本開示のＡＡＶベクターおよび同一または異なる血清型の空のキャプシドを含み、ここで、ＡＡＶベクターに対する空のキャプシドの比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０対１、または一部の他の比である。

他の実施態様では、本開示は、ＤＭＤのような筋ジストロフィーのようなジストロフィン異常症を治療するためのＡＡＶベクター粒子の例示的な有効な投与量を提供し、対象の体重（ｋｇ）のキログラムあたりベクターゲノム（ｖｇ）として定量化されて、ｖｇ／ｋｇと省略される。特定の実施態様によれば、ＡＡＶ９キャプシドおよびミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドン最適化遺伝子を含むゲノムを含むものを含む本開示のＡＡＶベクター、例えば制限されずに、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡと指定されるベクターの、有効な投与量は、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または９×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または一部の他の投与量である。任意のこれらの実施態様では、ＡＡＶベクターは、薬学的に許容できる組成物単独で、または、ベクターに対する空のペプチドの比が約０．５：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、または一部の他の比で同一のキャプシド血清型の空のキャプシドとともに、対象に投与され得る。

例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、内皮内、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内（骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む）、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面の両方、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、骨格筋、心筋、または横隔膜筋へ）を含む。

投与は、制限されずに、骨格筋、平滑筋、心臓、および横隔膜からなる群より選択される部位を含む対象内の任意の部位に対するものであってよい。

本発明に係る骨格筋への投与は、制限されないが、四肢（例えば、上腕、前腕、上肢、および／または下肢）、背中、首、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指における骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、限定されないが、小指外転筋小指外転筋（手）、小指外転筋小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手）、短小指屈筋（足）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、眼窩下筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第３腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および小頬骨筋、および当技術分野で知られている任意の他の適切な骨格筋を含む。

ウイルスベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、（任意選択で、足および／または腕の単離された四肢灌流；例えばＡｒｒｕｄａｅｔａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ１０５：３４５８−３４６４を参照）、および／または、直接的な筋肉内注入によって、骨格筋に送達され得る。特定の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、四肢灌流によって、任意選択で、単離された四肢灌流（例えば、静脈内または関節内投与によって、対象（例えば、ＤＭＤのような筋ジストロフィーを有する対象）の四肢（腕および／または足）に投与される。本発明の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、「流体力学」技術を用いずに有利に投与され得る。従来技術ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、血管系内の圧力を増大させてベクターが内皮細胞バリアを横切る能力を促進する流体力学技術（例えば、大量の静脈内／静脈内投与）によって、しばしば高められる。特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、大量インフュージョンおよび／または高められた血管内圧力（例えば、正常の収縮期圧よりも高い、例えば、正常の収縮期圧よりも、血管内圧が５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）のような流体力学技術の不存在下で投与され得る。そのような方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群のような、流体力学技術と関連する副作用を低減または防止し得る。

心筋への投与は、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与を含む。ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、静脈内投与、動脈内投与、例えば、大動脈内投与、直接的な心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室へ）、および／または冠動脈灌流によって、心筋に送達され得る。

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。

平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。一実施態様では、投与は、平滑筋内、付近および／または上に存在する内皮細胞に対するものであってよい。

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的な実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーは、骨格筋、平滑筋、心筋および／または横隔膜筋組織へ移植されて、または、組織は、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。そのような移植可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載される。

特定の実施態様では、本発明に係るウイルスベクターは、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーを治療および／または予防するため）。

代表的な実施態様では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を治療および／または予防するために用いられる。

代表的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを治療および／または予防する方法を提供し、その方法は、治療的または予防的有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類の対象に投与するステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニ−ジストロフィン、またはマイクロ−ジストロフィンをコードする異種核酸を含む。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、本明細書中の他のどこかに記載されるように、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与され得る。

注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液として、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態として、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、全身性よりむしろ局所的に、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、外科的に移植可能なマトリックス（例えば、米国特許公報番号２００４−００１３６４５に記載）に付着されて送達され得る。

本発明を説明したので、同一のものが、以下の実施例においてより詳細に説明され、それは説明目的のみのために本明細書中に含められて、本発明に対する限定を意図しない。

実施例１
コドン最適化ヒトミニ−ジストロフィン遺伝子の合成
以前に我々は、ヒトジストロフィン遺伝子の多くのミニチュア版をヒト筋ジストロフィンｃＤＮＡのＰＣＲクローニングによって生産して、ジストロフィンコード配列のＣ末領域のほぼ完全な欠失および中央ロッドドメインの大きな欠失を有するミニ−ジストロフィン遺伝子を作製した（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９７：１３７１４（２０００）；米国特許第７，００１，７６１号および第７，５１０，８６７号）。これらのミニ−ジストロフィン遺伝子は、Ｄｍｄｍｄｘマウスモデルにおいてインビボで非常に機能性であることが試験された（Ｗａｔｃｈｋｏｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１３：１４５１（２００２））。これらのミニ−ジストロフィンタンパク質の１つはΔ３９９０と名付けられて、米国特許第７，５１０，８６７号に配列番号６で記載された。Δ３９９０のタンパク質配列およびそれをコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号２７および配列番号２８によって本明細書において提供される。

Δ３９９０ミニ−ジストロフィンの改変も設計して、コドン最適化して、活性について試験した。この新規のヒトミニ−ジストロフィンは、Ｄｙｓ３９７８と呼ばれ、１３２５アミノ酸の長さであり、野生型全長ヒト筋ジストロフィン（配列番号２５）由来の以下の部分またはサブドメインを含む：Ｎ末端およびアクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ヒンジＨ１、ロッドＲ１およびＲ２、ヒンジＨ３、ロッドＲ２２、Ｒ２３およびＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチドメイン（ＣＲドメイン）、および、カルボキシ末端ドメインの部分（ＣＴドメイン）。このタンパク質のアミノ酸配列は配列番号７によって提供されて、図１に模式的に示される。潜在的免疫原性を減少させるために、Δ３９９０タンパク質のＣ末端における最後の４つのアミノ酸を欠失させた。Δ３９９０の作製において、この配列は、ジストロフィンの最後の３つのアミノ酸（３６８３〜３６８５、またはＤＴＭ）とジストロフィンカルボキシ末端ドメインのアミノ末端（Ｐ３４０９で終わる）の部分を接合することによって形成されている。この一続きの４つのアミノ酸は公知の機能が無く、その配列は野生型ジストロフィンにおいて生じないので、新規のエピトープとして機能し得る。加えて、Δ３９９０内のアミノ酸２位のバリンは、野生型ジストロフィンには存在しないが、Δ３９９０の開始コドンの周りのコンセンサスコザック開始配列の作製から生じて、ジストロフィンに通常存在するロイシンに変更された。したがって、Δ３９９０とＤｙｓ３９７８との間には５アミノ酸の違いが存在する。Δ３９９０とＤｙｓ３９７８との間のアミノ酸配列アライメントを、図５５Ａ〜５５Ｃに提供する。

Ｄｙｓ３９７８をコードする遺伝子を、上述のタンパク質サブドメインに対応する野生型ジストロフィンコード配列由来のサブシーケンスを組み合わせることによって構築した。生じた遺伝子は配列番号２６によって提供される。Ｄｙｓ３９７８の発現を増大させるために、遺伝子配列は、ヒトコドンアルゴリズムを用いてコドン最適化された。生じたヒトコドン最適化遺伝子は、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８と呼ばれ、配列番号１として提供される。Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８と呼ばれる、Ｄｙｓ３９７８をコードするイヌコドン最適化遺伝子も生産されて、その配列は配列番号３として提供される。Δ３９９０をコードする非コドン最適化遺伝子およびＨｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８のＤＮＡ配列を比較するアライメントを図５６Ａ〜５６Ｉに提供する。

他の変更の中でも、Ｄｙｓ３９７８をコードする遺伝子のコドン最適化は、合計ＧＣ含有量を非コドン最適化遺伝子での約４６％から、ヒトコドン最適化遺伝子（すなわち、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８）での約６１％まで増大させた。ＧＣ含有量の増大は、哺乳類の細胞におけるｍＲＮＡレベルの増大をもたらし得る。例えば、Ｇｒｚｅｇｏｒｚ，Ｋ，ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＢｉｏｌ，４（６）：ｅ１８０（２００６）；およびＮｅｗｍａｎ，ＺＲ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｅ１３６２−７１（２０１６）を参照。コドン最適化は、コドン適合指標（ＣＡＩ）も増大させて、コード配列の始めのコザックコンセンサス転写開始認識部位の付加を含んだ。

ヒトコドン最適化が遺伝子発現を高めることができるかどうか調べるために、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子を、構成的に活性のＣＭＶプロモーターおよび小さな合成ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（配列番号６）を含むＡＡＶベクター発現カセット中にクローニングした。ヒトＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション後に、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子を含むベクタープラスミドは、ジストロフィンタンパク質に対するウエスタンブロットおよび免疫蛍光染色を用いて定量的に決定されるように、Ｄｙｓ３９７８をコードする非最適化遺伝子よりも、驚くほど多いタンパク質発現を示した（図２）。

ヒンジＨ３が存在しないことを除き構造がＤｙｓ３９７８と似ている、ヒトミニ−ジストロフィンをコードする遺伝子も生産して、コドン最適化した。Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３８３７（配列番号２）と呼ばれるこの遺伝子は、Ｄｙｓ３８３７（配列番号８）と呼ばれる１２７８アミノ酸のヒトミニ−ジストロフィンタンパク質（図１にも模式的に示される）をコードする。

本明細書に記載される他の実験について、ヒトおよびイヌコドン最適化Ｄｙｓ３９７８遺伝子を、以下に特定される筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子に由来する２つの異なる合成の筋肉特異的プロモーターおよびエンハンサーの組み合わせの１つの制御下に置いた：
１）合成の複合型筋肉特異的プロモーター（ｈＣＫ）（配列番号４）；および
２）合成の複合型筋肉特異的プロモータープラス（ｈＣＫｐｌｕｓ）（配列番号５）；

実験での使用のために、標準的な分子クローニング技術を用いて以下のベクターを構築した。規定のプロモーター、ミニ−ジストロフィン遺伝子およびポリＡ配列の遺伝子発現カセットを、発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶベクタープラスミド主鎖にクローニングした。
１）ＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８
２）ＡＡＶ−ｈＣＫ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８（配列番号９）
３）ＡＡＶ−ｈＣＫ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３８３７（配列番号１０）
４）ＡＡＶ−ｈＣＫｐｌｕｓ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３８３７（配列番号１１）
５）ＡＡＶ−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８（配列番号１２）

実施例２
ジストロフィン／ユートロフィン二重ノックアウトマウスにおけるＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の患者におけるジストロフィンの喪失は、ひどい骨格筋変性および心筋症をもたらす。ジストロフィンのみを欠失しているＭｄｘマウスは、よりいっそう軽度の表現型を有するが、一方で、ジストロフィンおよびそのホモログユートロフィンの両方を欠失している二重ノックアウト（ｄＫＯ）マウスは、ＤＭＤ患者に見られる同様に重度のジストロフィー臨床の症候を示す。ＡＡＶ１−ＣＭＶ−Δ３９９０（非コドン最適化）の３×１０^１１ｖｇ／マウスによる、新生児ホモ接合型ｄＫＯマウスにおける腹腔内注入が、生育、機能を部分的に復元させて寿命を数ヶ月延長する（２２週において５０％生存率）ことが可能であることが以前に示された（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ，２７：４２１（２００９）による図６Ｂを参照）。ここで、ヒトコドン最適化Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子の全身性送達の治療的効果は、ＡＡＶ９をキャプシドとして用いて評価された。結果は、１週齢新生児ｄＫＯマウスに対する約２×１０^１３ｖｇ／ｋｇでのＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８の単一の全身投与（ＩＰ）が、骨格筋において、および心筋全体において、ミニ−ジストロフィン遺伝子の広範な発現をもたらしたことを示す（図３）。ＡＡＶ９によって処置されたｄＫＯマウスは、ほぼ正常な生育曲線および体重（図４）を示し、把持力およびトレッドミル走試験によって評価される筋肉機能を有意に改善させた（図５）。処置されたｄＫＯマウスは、ジストロフィー病理の寛解（図６Ａ〜６Ｂ）および健康全般の大きな改善も示した。非コドン最適化Δ３９９０を発現しているＡＡＶ１ベクターによって処置されたｄＫＯマウスと比較すると、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子によって処置されたｄＫＯマウスは、よりいっそう長い寿命を示した（５０％生存率：２２週、対、８０週を超える）（図７）。予期せずに、雄および雌のｄＫＯマウスの生殖能力は両方とも復元されて（表１）、全般的な機能改善と、おそらく平滑筋機能の改善も同様に示唆した。

未処置ｄＫＯマウスは、完全に生殖能力が無い。しかしながら、生殖能力は、処置されたｄＫＯ（Ｔ−ｄＫＯ）マウスの雄および雌の両方において、ＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８によって復元された。

上述の結果は、コドン最適化Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子の全身性送達が、非コドン最適化Δ３９９０遺伝子よりも有効であったことを示す。

重要なことに、心機能の大きな改善も観察された。心臓における治療的効果は、Ｍｉｌｌａｒ圧容積システムを用いて血行力学分析によって４月齢において評価された。未処置ｄＫＯマウスは、かろうじて４ヶ月にわたって生き延びた。非常に小さな体のサイズ、後弯症および重度の筋肉および心機能不全のせいで、ｄＫＯマウスは具合が悪化して血行力学分析の手順に耐えられなかった。したがって、ＡＡＶ９によって処置されたｄＫＯマウスを、無傷のユートロフィン遺伝子（このモデルにおいてジストロフィンの欠失を補うことが知られている）に起因してよりいっそう軽度の表現型を有する未処置の同年齢のｍｄｘマウスと比較した。心エコー検査による測定は、Ｃ５７／Ｂ１０野生型マウスと比較した場合にベースライン条件下でｍｄｘマウスが明らかな心臓の欠陥を有さないことを示したが、それらは、ベースラインにおいて、血行力学によって測定されるように明らかな欠陥を示した（図８、塗りつぶされていないバー）。本明細書における結果は、ＡＡＶ９によって処置されたｄＫＯマウスが、収縮終期圧、拡張終期容積、等容性収縮の最大速度（ｄｐ／ｄｔ_ｍａｘ）および等容性弛緩の最大速度（ｄｐ／ｄｔ_ｍｉｎ）を含んで、ｍｄｘマウスのものに対して同様のベースラインの心臓の血行力学を示したことを示す。しかしながら、ドブタミンによる曝露後、処置されたｄＫＯマウスは、収縮終期圧、拡張終期容積、等容性収縮の最大速度（ｄｐ／ｄｔ_ｍａｘおよびｄｐ／ｄｔ_ｍｉｎ）を含んで、ｍｄｘマウスのものに対して同様のベースラインの心臓の血行力学を示し、一方で、ＡＡＶ９によって処置されたｄＫＯマウスは、試験された全てのパラメーターにおいてｍｄｘマウスよりも有意に良好に発揮した（図８、塗りつぶされたバー）。さらに、ｍｄｘマウスの５０％よりも多くが、３０分ドブタミン曝露ウインドウ内で死亡して、我々の以前の報告と一致した（Ｗｕｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５：１４８１４（２００８））。顕著な対照では、ＡＡＶ９によって処置されたｄＫＯマウスにおけるミニ−ジストロフィン導入遺伝子の心臓発現に起因して、ドブタミンによって誘導される心不全が大いに防止された。ＡＡＶ９によって処置されたｄＫＯマウスの９０％よりも多くが、３０分ウインドウ内でドブタミンストレス試験を生き延びた。最後に、心電図（ＥＣＧ）に示される、一般にみられるＰＲ間隔の不足も改善された（図９Ａ〜９Ｂ）。ＰＲ間隔は、Ｐ波の発生からＱＲＳ群の始まりまでの時間である。合わせると、これらの結果は、重度のＤＭＤマウスモデルにおける心筋症のためのＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子治療の有効性を示す。

実施例３
ｍｄｘマウスにおけるｈＣＫ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８
複合型の合成の筋肉特異的プロモーターｈＣＫがＤｙｓ３９７８遺伝子発現を効果的に駆動することが可能であったかどうか調べるために、強力な非特異的ＣＭＶプロモーターによって駆動される同一の構築物と比較した。それぞれのベクターの尾静脈注入後のｍｄｘマウスにおけるミニ−ジストロフィン発現の免疫蛍光染色は、２つのプロモーター、すなわち、ｈＣＫおよびＣＭＶが、筋肉および心臓において同等の発現レベルを送達することを示した（図１０）。

実施例４
ＤＭＤイヌモデルゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）犬におけるＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８
ｍｄｘマウスおよびジストロフィン／ユートロフィン二重ＫＯ（ｄＫＯ）マウスにおける研究に基づいて、同一のベクター、ＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８を、大きな動物ＤＭＤモデルであるゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）犬において試験した。具体的には、ベクターを２．５月齢ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」に投与して、それから、注入後８年よりも長くフォローした。

実験手順：ＧＲＭＤ犬「Ｊｅｌｌｙ」（２．５月齢の雌；６．３ｋｇ；血清ＣＫ：２０２６２ユニット／Ｌ、処置前）に、右後肢を介してＡＡＶ９−ＣＭＶ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターを１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの投与量で注入した。全身麻酔下で、ゴム止血帯を近位骨盤先端（鼠径部領域）に配置して、右後肢の筋肉の大部分をカバーした。ＡＡＶ９ベクターを、注入速度１ｍｌ／ｓｅｃでＨａｒｖａｒｄポンプセットを用いて大伏在静脈を介して注入した。ベクター容量は、２０ｍｌ／ｋｇ体重（１３０ｍｌ合計）であった。止血帯は、注入の開始から１０分アカウンティング（ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ）後に取り外された。注入された肢の筋肉は、触診によって判明したように、より硬くなった。後肢に関するＭＲＩ画像が、注入の約１時間後に集められて、注入された肢におけるベクター流動性が確認された（図１１）。ステロイドのような免疫抑制剤は、８年を超える観察全体を通じていかなる時点においても用いられなかった。筋肉生検手順は、ベクター注入後４年まで、５回の時点で行なわれた。最後の剖検は、８才４ヶ月に行なわれて、そのときに「Ｊｅｌｌｙ」はまだ歩行可能であったが、以前よりもいっそう活動的でなかった。

結果：免疫蛍光（ＩＦ）染色は、最後の剖検までに試験された筋肉サンプルの大部分において、長期のミニ−ジストロフィン発現を示した。興味深いことに、注入された肢は、最初（注入後２ヶ月における生検）は、注入されていない肢よりも発現が低く、手順に関連する炎症およびＣＭＶプロモーターの部分的不活性化を示唆した（図１２）。それにもかかわらず、ヒトミニ−ジストロフィン発現は、注入された肢における最初の炎症にもかかわらず、「Ｊｅｌｌｙ」において８年持続した。その後の時点（ベクター注入後７ヶ月、１年、２年、および４年）における筋肉生検およびヒトミニ−ジストロフィンの免疫蛍光染色およびウエスタンブロットは、持続的な遺伝子発現を示した（図１３〜１７）。ミニ−ジストロフィン陽性筋線維のパーセンテージは異なる筋肉の間で異なったが、特定の筋肉が、剖検の際に陽性である筋線維を９０％よりも多く有した（図１８）。ミニ−ジストロフィンおよび復帰突然変異体筋線維の共染色（抗−Ｃ末端抗体）は、両方の共存を示した（図１９）。また、ミニ−ジストロフィンは、心筋細胞のおよそ２０％においても観察された（図１８）。全体的な遺伝子発現は、大部分が安定であった。例えば、頭蓋縫工筋内の陽性筋線維は、２および７ヶ月から１、４および８年までの６回の時点の全体を通じて同程度に残った（図１２、１３、１４、１７および１８を比較）。ウエスタンブロットは、ＩＦ染色結果を確証した（図２０）。

収縮力測定は、未処置のイヌと比較した場合に部分的改善を示した（図２１）。「Ｊｅｌｌｙ」は、観察の処置期間後８年よりも長く、全体を通じて歩行可能のままであり、最後の年に心筋症に起因して安楽死させた。病理学者による試験および剖検の際、いかなる組織においても腫瘍は見られなかった。ＤＮＡシーケンシングは、「Ｊｅｌｌｙ」が、最近報告された２匹の表現型的に軽度のＧＲＭＤ犬（Ｖｉｅｉｒａｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６３：１２０４（２０１５））に見られる疾患改変のＪａｇｇｅｄ１突然変異を保有していないことを示した。

実施例５
ＧＲＭＤ犬におけるｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８
この試験では、ＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクター（イヌコドン最適化ヒトミニ−ジストロフィン３９７８を駆動する改変されたクレアチンキナーゼプロモーター）を、「Ｄｕｎｋｉｎ」と名付けられたＧＲＭＤ犬において用いた。遺伝子は、他の試験で用いられた同一のヒトミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８タンパク質をコードするが、イヌコドン最適化された。ＤＮＡ配列は、ヒトコドン最適化遺伝子と９４％同一である。ＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８（イヌコドン最適化）およびＣＫ−Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８（ヒトコドン最適化）を比較するヒトＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクション実験は、本質的に同一レベルの発現を明らかにした。ｍｄｘマウスにおいて両方の構築物を比較する多数の実験もまた、本質的に同一の発現レベルを示した。

実験手順：ＧＲＭＤ犬「Ｄｕｎｋｉｎ」（雌、２．５ｍ齢、６．５ｋｇ）に、大伏在静脈を介して４×１０^１３ｖｇ／ｋｇの投与量でＡＡＶ９−ｈＣＫ−Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８ベクターを静脈内注入した。イヌは、注入中に鎮静されなかった。著しい有害反応または行動変容はなかった。筋肉生検は、ベクター注入後４ヶ月に行なわれて、剖検は、注入後１４ヶ月に行なわれた。

結果：非常に高いレベルでほぼ均一なミニ−ジストロフィン発現が、注入後４ヶ月の生検（図２２）から注入後１４ヶ月の剖検まで、骨格筋サンプルに対するミニ−ジストロフィン３９７８の免疫蛍光染色によって観察された（剖検について図２３〜２６）。

有意に高いレベルの心筋におけるミニ−ジストロフィンもＩＦ染色によって観察された（図２７）。ＣＫプロモーターからの発現は、ＣＭＶプロモーターからのものよりも強力で均一であるようだった。

ウエスタンブロット分析は、ＩＦ染色の結果を確証した。骨格筋では、ミニ−ジストロフィンレベルは、正常な犬コントロールからの野生型ジストロフィンの正常なレベルよりも、ほとんどが高かった（図２８）。心臓におけるＤｙｓ３９７８のレベルは、野生型ジストロフィンのレベルのだいたい半分だった（図２９）。

イヌコドン最適化遺伝子Ｃｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８からのＤｙｓ３９７８の発現は、γ−サルコグリカンを含む、ジストロフィンと関係があるタンパク質複合体を効果的に復元した（図３０）。

ベクターＤＮＡコピー数の定量ＰＣＲは、ミニ−ジストロフィンタンパク質発現レベルに対する一貫した傾向を示した（図３１）。

試験された全てのサンプルにおいて、先天性または細胞性免疫応答は見られなかった。このことは、ＡＡＶ９−ＣＭＶ−ｏｐＨ−ｄｙｓ３９７８の結果とは非常に異なり、筋肉特異的ｈＣＫプロモーターが強力なだけでなくＣＭＶプロモーターよりも安全であることを示唆した。

ジストロフィー病理学は、心筋（図３２）、横隔膜筋（図３３）および肢筋（図３４）の組織学に関して、Ｈ＆Ｅ染色によって示されるように大いに改善された。トリクロームマッソンブルー染色もまた、肢筋および横隔膜における線維症の有意な減少を示した（図３５）。

実施例６
インビボ実験のためのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの調製
実施例７、８および９にさらに記載されるＤｍｄ^ｍｄｘラット試験において用いられるＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターは、全長ヒトＤｐ４２７ｍジストロフィンタンパク質（配列番号２５）由来の、Ｎ末端領域、ヒンジ１（Ｈ１）、ロッド１（Ｒ１）、ロッド２（Ｒ２）、ヒンジ３（Ｈ３）、ロッド２２（Ｒ２２）、ロッド２３（Ｒ２３）、ロッド２４（Ｒ２４）、ヒンジ４（Ｈ４）、システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、および、カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインの部分（それらは、機能のために最小限必要とされるドメインである）を含むヒトジストロフィンタンパク質のミニチュア版を発現するように設計された発現カセットおよびＡＡＶ９キャプシドを含む。ミニ−ジストロフィンタンパク質のタンパク質配列は、配列番号７のアミノ酸配列として提供されて、配列番号１の核酸配列として提供されるヒトコドン最適化ＤＮＡ配列によってコードされる。ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターのベクターゲノムは、配列番号１８の核酸配列として、または、一本鎖ゲノムがそのマイナス極性においてパッケージされる場合はその逆相補が提供される。

ベクターゲノムは、５’および３’隣接ＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）（それぞれ、配列番号１４または配列番号１５のＤＮＡ配列を有する）、筋肉特異的な転写調節エレメントとして作用するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子に由来する合成の複合型エンハンサーおよびプロモーター（ｈＣＫ；配列番号１６のＤＮＡ配列を有する）、上述のヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする３９７８塩基対の長さのヒトコドン最適化遺伝子（すなわち、Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８遺伝子）、および、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む小さな合成の転写終結配列（ｓｐＡ；配列番号１７のＤＮＡ配列を有する）を含む。

ベクターは、三重トランスフェクション技術およびＨＥＫ２９３細胞に由来する血清フリーの非接着細胞株を用いて製造された。用いられたプラスミドは、ベクターの効率的な複製およびパッケージングに必要なアデノウイルスヘルパータンパク質を発現するためのヘルパープラスミド、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９キャプシドタンパク質を発現しているパッケージングプラスミド、および、上述の発現カセットの配列を含む第三のプラスミドを含んだ。

細胞を、実際の細胞バンクサンプルから増殖させて拡大して、十分な容量および細胞密度が到達された時点で、細胞は、トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞からのベクター生産を可能にするためのインキュベーション後、ベクターを放出させるために細胞を溶解して、溶解物を浄化して、汚染している核酸を除去するためにヌクレアーゼ処理ステップを用いてベクターを精製して、その後に、イオジキサノールステップグラジエント遠心分離、アニオン交換クロマトグラフィー、製剤バッファーに対する透析、滅菌濾過を続けて、それから、２〜８℃で保管した。

実施例７
ＤＭＤのラットモデルにおけるＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの単回投与の効果
この実施例は、古典的なｍｄｘマウスおよびＧＲＭＤ犬モデルと比較して特定の利点を有する、最近開発されたＤｍｄ^ｍｄｘラットモデルにおけるＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの試験を記載する。Ｌａｒｃｈｅｒ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｄｅｆｉｃｉｅｎｔｒａｔｓ：ａｎｅｗｍｏｄｅｌｆｏｒＤｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１４；９（１０）：ｅ１１０３７１。具体的には、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットモデルでは、骨格および心臓疾患の両方とも早期段階に存在して、ヒトで見られる疾患進行と似た様式で順々に進行する。

これらの試験では、雄Ｄｍｄ^ｍｄｘラット５〜６週齢は、ＰＢＳ中に懸濁されたＤｙｓ３９７８ベクターの単回投与（１×１０^１４ベクターゲノム／キログラム体重、またはｖｇ／ｋｇ）を尾静脈へＩＶ注入によって全身性に投与された。コントロールとして、同一の遺伝的背景（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）由来の野生型（「ＷＴ」）ラットも、この方法で処置した。全ての手順は、先入観を避けるために、ラット遺伝子型または処置コホートを隠して行なわれた。３匹のＤｍｄ^ｍｄｘラットおよび４匹のＷＴラットは、ベクターによって処置されて、一方で、３匹のＤｍｄ^ｍｄｘラットおよび２匹のＷＴラットは、ネガティブコントロールとしてＰＢＳのみ投与された（モック処置）。注入後３ヶ月に、動物は安楽死されて、組織学による組織分析に関して剖検が行なわれて、ジストロフィンタンパク質発現に関して免疫細胞化学が行なわれた。

病理組織学的評価のために、組織サンプルを、１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定して、パラフィンワックス中に包埋して、ヘマトキシリンエオシンサフラン（ＨＥＳ）による染色の前に５μｍの厚さに切片化した。ジストロフィン免疫標識のために、さらなるサンプル（肝臓、心臓、大腿二頭筋、胸筋および横隔膜筋）を凍らせて、８μｍの厚さに切片化した。ジストロフィンに関するマウスモノクローナル抗体ＮＣＬ−ＤＹＳＢ（ＮｏｖｏｃａｓｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮｅｗｃａｓｔｌｅｏｎＴｙｎｅ，ＵＫ）を、この抗体は、全長野生型ジストロフィンおよび改変されたミニ−ジストロフィンの間を区別しないので、ジストロフィンおよびミニ−ジストロフィンタンパク質検出の両方に用いた（１：５０）。全ての剖検および組織学的観察は、盲検様式で行なわれた。

組織学的試験によって、ＰＢＳおよびベクターによって処置されたＷＴラットの骨格筋または心筋における病変は観察されなかった。全てのＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて、個々の壊死を示す骨格筋線維病変、再生小線維のクラスター、散在する巨大ヒアリン線維、赤血球大小不同、中心核形成（ｃｅｎｔｒｏｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）、筋内膜線維症および孤発性脂肪症が存在して、ＤＭＤ骨格筋の特徴であった。これらの病変の発生率および強度は、ＰＢＳのみで処置されたものと比較して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて、全体的に低減された。心臓においては、多巣性壊死、単核細胞の病巣浸潤および軽度の病巣の広範囲な線維症の病変は、ＰＢＳによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの１匹（ラット４９）に存在した（ＤＭＤ心筋の特徴である）。ベクターによって処置された全てのＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて、心筋の表現は同様であり、ＰＢＳを受け取っているＤｍｄ^ｍｄｘラットに見られるように軽度の単核細胞の病巣浸潤を示したが、対照的に、線維化病巣は、ベクター処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの心臓において観察されなかった。

免疫細胞化学を用いて、ＷＴラットは、骨格筋、横隔膜筋および心筋線維において検出された筋細胞膜下のジストロフィンを示し、検出されたジストロフィンの局在は、ＰＢＳのみと比較してベクターによって処置されたラット間で異ならなかった。しかしながら、用いられた抗−ジストロフィン抗体は、野生型ジストロフィンおよびミニ−ジストロフィンタンパク質の間を区別することができないので、ベクター処置されたＷＴラットにおけるミニ−ジストロフィン検出は、このアッセイを用いて確証することができなかった。対照的に、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットの１匹（ラット４９）は、稀な骨格筋線維（約５％〜１０％）を示し、筋細胞膜下のジストロフィンが検出可能であり、それは、約５％の頻度での、このモデルにおける散在した復帰突然変異体線維の存在の以前の説明（Ｌａｒｃｈｅｒｅｔａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１４）と一致している。しかしながら、ジストロフィンは、このラット由来の横隔膜または心筋線維において検出されなかった。Ｄｙｓ３９７８ベクター処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの全てにおいて、筋細胞膜下のジストロフィンは、骨格筋線維の約８０％〜９５％、横隔膜筋線維の約３０％〜５０％、および、心筋線維の約７０％〜８０％においても観察されたが、体系的な集計は行なわれなかった。これらのラットでは、非常に稀な骨格筋線維（筋肉断面あたり１または２）が、少しの細胞質原線維間ジストロフィンを示した。ベクター処置されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットの両方において、ミニ−ジストロフィンの生産、または、ベクター形質導入によって細胞性免疫応答が刺激されたことを示し得る増大したネクローシスまたは炎症性細胞浸潤物の証拠は無かった。

要するに、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．ｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターの全身投与の３ヶ月後に、筋組織の組織学的変更は、ＰＢＳと比較して、ベクターによって処置されたＷＴラットにおいて観察されず、ミニ−ジストロフィンタンパク質の発現が、健康な動物において十分の許容されることを示した。さらに、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットのベクター処置は、ＷＴラットの筋肉におけるものと同様の筋細胞膜下の局在のパターンでの、試験された全ての筋肉（大腿二頭筋、胸筋、横隔膜筋および心筋）の線維におけるミニ−ジストロフィンの有意かつ一般化された検出をもたらした。ベクターからのミニ−ジストロフィンＤｙｓ３９７８の発現は、線維症および壊死の減少と関連した（図３６Ａ〜３６Ｄ）。

実施例８
注入後３ヶ月および６ヶ月に判定された、Ｄｍｄ ^ｍｄｘラットにおける増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡの効果
この実施例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関する動物モデルであるＤｍｄ^ｍｄｘラットの、増加する量のＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡによる処置、および、投与後３ヶ月および６ヶ月での効果の測定の結果を記載する。

ラットは、７〜８週齢に、背側陰茎静脈へＩＶ注入によって投与されて、それは、試験品目の全身投与をもたらした。４つの異なるベクター投与量が、１０〜１２匹のＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて試験された：１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（３ヶ月の時点で５匹のラット、および、６ヶ月の時点で６匹のラット）、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（３ヶ月の時点で６匹のラット、および、６ヶ月の時点で５匹のラット）、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ（３ヶ月の時点で７匹のラット、および、６ヶ月の時点で６匹のラット）、および、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ（３ヶ月の時点で５匹のラット、および、６ヶ月の時点で５匹のラット）。加えて、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットおよびＷＴラットは、それぞれ、ビヒクルのみ（１×ＰＢＳ、２１５ｍＭＮａＣｌ、１．２５％ヒト血清アルブミン、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール）を、ネガティブコントロールとして受け取った（３ヶ月の時点で６匹のＤｍｄ^ｍｄｘラット、６ヶ月の時点で４匹のＤｍｄ^ｍｄｘラット、３ヶ月の時点で５匹のＷＴラット、および、６ヶ月の時点で７匹のＷＴラット）。５匹の未処置（すなわち、ベクターなし、および、ビヒクルなしの、いずれか）Ｄｍｄ^ｍｄｘラットもまた、さらなるネガティブコントロールとして含められた。注入後３ヶ月および６ヶ月に、それぞれの試験アーム由来のラットを安楽死させて、さらなる分析のための組織サンプルを取るために剖検した。屠殺の前に、試験動物において心機能および握力試験を行なって、ＤＭＤ疾患進行に対するベクター処置の効果を評価した。

ベクター投与量は、文字と図面において、２つの異なる、数値的には同等の方法で表され得ることに注意する。したがって、「１×１０^１３」は「１Ｅ１３」と同等であり、「３×１０^１３」は「３Ｅ１３」と同等であり、「１×１０^１４」は「１Ｅ１４」と同等であり、「３×１０^１４」は「３Ｅ１４」と同等である。

体重
処置後および屠殺前に、それぞれの処置アーム内のラットは、最初の週の間は毎日計量されて、その後は屠殺するまで毎週計量された。それぞれの処置アーム内の全てのラットの平均重量を表２（注入前から注入後９週まで）および表３（注入後１０〜２５週）に挙げて、図３７において時間に対してグラフ化する。グラフでは、エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表わし、表においても報告される。全ての時点で、ＷＴラットの平均重量は、ベクターによって処置されたものを含んでＤｍｄ^ｍｄｘラットのものを超えた。Ｄｍｄ^ｍｄｘラット間の年齢の違いおよび体質量（ｂｏｄｙｍａｓｓ）の自然な可変性に起因して、注入後４週まで投与量と体重との間に一貫した相関は無かった（そのとき、最も高い投与量アームを除き、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット全ての重量は、未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラットよりも多いがＷＴラットよりも少なかった）。注入後１２週までに、全ての処置アームにおける投与量効果が明らかであり、体重は、試験の終わりまで通して、試験された全ての投与量において、ベクター投与量に比例した。

ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ ^ｍｄｘラットにおける、ベクター形質導入およびＲＮＡおよびタンパク質発現の定量化
材料および方法
標準的な分子生物学技術を用いて、導入遺伝子コピー数を定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量化して、ミニ−ジストロフィンｍＲＮＡ転写の相対的発現レベルを逆転写酵素ｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって定量化して、ミニ−ジストロフィンタンパク質発現の量をウエスタンブロット分析によって定性的に定量化した。

ｑＰＣＲのために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ由来のＧｅｎｔｒａＰｕｒｅｇｅｎｅキットを用いて組織から精製した。それから、５０ｎｇのｇＤＮＡを用いてデュプリケートで、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてサンプルを分析した。全ての反応は、テンプレートＤＮＡ、ＰｒｅｍｉｘＥｘｔａｑ（Ｏｚｙｍｅ）、０．３μＬのＲＯＸ参照色素（Ｏｚｙｍｅ）、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマーおよび０．１μｍｏｌ／ＬのＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含む２０μＬの最終容量で、二重で行なわれた。

ベクターコピー数を、ミニ−ジストロフィン導入遺伝子の領域を増幅するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて決定した：
フォワード：５’−ＣＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣ−３’ 配列番号１９
リバース：５’−ＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＴ−３’ 配列番号２０
プローブ：５’−ＦＡＭ−ＣＣＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’ 配列番号２１

内因性ｇＤＮＡコピー数を、ラットＨＰＲＴ１遺伝子を増幅するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて決定した：
フォワード：５’−ＧＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴ−３’ 配列番号２２
リバース：５’−ＧＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧ−３’ 配列番号２３
プローブ：５’−ＪＯＥ−ＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＴＴＧＡＡＴ−ＴＡＭＲＡ−３’ 配列番号２４

それぞれのサンプルについて、閾値サイクル（Ｃｔ）値を、異なる希釈の直線化された標準プラスミド（ミニ−ジストロフィン発現カセットまたはラットＨＰＲＴ１遺伝子のいずれかを含む）によって得られたものと比較した。ｇＤＮＡ存在下でのｑＰＣＲ阻害の不存在は、異なる希釈の標準プラスミドによってスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄｗｉｔｈ）、コントロール動物由来の組織サンプルから抽出された５０ｎｇのｇＤＮＡを分析することによって確認された。二重のｑＰＣＲ（同一の反応における２列の増幅）を用いて、結果を二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムで表わした（ｖｇ／ｄｇ）。試験の感度は０．００３ｖｇ／ｄｇであった。

ＲＴ−ｑＰＣＲのために、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって組織サンプルから全ＲＮＡを抽出して、それから、ＴＵＲＢＯＤＮＡフリーキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）由来のＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅＩを用いて処理した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を、２５μＬの最終容量でランダムプライマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。それから、二重ｑＰＣＲ分析は、１／１５希釈されたｃＤＮＡを、ｑＰＣＲによって、導入遺伝子コピー数の定量化に関して、ラットＨＰＲＴ１特異的なプライマーおよびプローブおよび同一のミニ−ジストロフィンを用いて行なった。ｃＤＮＡ存在下でのｑＰＣＲ阻害の不存在は、異なる希釈の標準プラスミドによってスパイクされた、コントロール動物由来の組織サンプルから得られたｃＤＮＡを分析することによって確認された。各ＲＮＡサンプルについて、Ｃｔ値を、異なる希釈の標準プラスミド（ミニ−ジストロフィン発現カセットまたはラットＨＰＲＴ１遺伝子のいずれかを含む）によって得られたものと比較した。結果を相対量（ＲＱ）で表した：
ＲＱ＝２^−ΔＣｔ＝２^{−（Ｃｔ標的−Ｃｔ内因性コントロール）}

各ＲＮＡサンプルについて、ＤＮＡ汚染の不存在もまた、反応ミックス中に逆転写酵素を追加せずに得られた「ｃＤＮＡ様サンプル」の分析によって確認された。

発現されたタンパク質レベルのウエスタンブロット分析のために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＩＰＡバッファーを用いて、全タンパク質が組織サンプルから抽出された。タンパク質抽出物（大腿二頭筋、心臓および横隔膜に関して５０μｇ、または肝臓に関して１００μｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ３〜８％トリス酢酸ゲル上にローディングして、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）巨大タンパク質ブロッティングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した。２００ｍＭＤＴＴの最終濃度を用いて、ローディング前にタンパク質を減少させた。膜をそれから、ＴＢＳＴ（トリス緩衝化生理食塩水、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中の、５％スキムミルク、１％ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）においてブロッキングして、ジストロフィンタンパク質のエクソン１０および１１に特異的な抗−ジストロフィン抗体（１：１００、ＭＡＮＥＸ１０１１Ｃモノクローナル抗体）および二次抗−マウスＩｇＧＨＲＰ−コンジュゲート抗体（１：２０００、Ｄａｋｏ）によってハイブリダイズさせた。タンパク質ローディングコントロールのために、同一の膜を、抗−ラットα−チューブリン抗体（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）および二次抗−マウスＩｇＧＨＲＰ−コンジュゲート抗体（１：２０００、Ｄａｋｏ）によってもハイブリダイズさせた。免疫ブロットを、ＥＣＬ化学発光分析システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって可視化した。

注入後３ヶ月および６ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィン導入遺伝子コピー数
ベクターおよびビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、ビヒクルのみを投与されたＷＴラットにおける、全血、脾臓、心臓、大腿二頭筋、胸筋、横隔膜、および肝臓内の導入遺伝子コピー数（ベクターゲノム／二倍体ゲノム（ｖｇ／ｄｇ）として）に関する試験の結果を、以下の表に記載する。注入後３ヶ月におけるデータを表４に提供し、注入後６ヶ月におけるデータを表５に提供する。データは、個々の試験動物からの結果の平均である。

ビヒクルのみを注入されたＤｍｄ^ｍｄｘまたはＷＴラットにおいてｑＰＣＲシグナルは検出されず、これらの動物がいかなるベクターも受け取っていないことを確証して、ｑＰＣＲシグナルは、注入後３ヶ月および６ヶ月において全血中に検出されなかった。

ミニ−ジストロフィンＤＮＡは、注入後３ヶ月および６ヶ月の両方において、ベクターを注入されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて検出された。試験された組織における導入遺伝子コピー数は、肝臓＞心臓＞大腿二頭筋≒横隔膜≒胸筋＞脾臓の分布率パターンに従った。分析された組織のうち、肝臓は、群を抜いて最も効率的に形質導入して、ベクターコピー数は、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターを投与されたラットにおいて平均８０〜１１０ｖｇ／ｄｇまで到達した。肝臓におけるベクターコピー数は、心臓よりも７〜４５倍高く、大腿二頭筋、横隔膜、または胸筋よりも４０〜３００倍高かった。心臓では、ベクターコピー数は、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターを投与されたラットにおいて約１．０ｖｇ／ｄｇ、および、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターを投与されたラットにおいて約５．０ｖｇ／ｄｇの平均であった。１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの投与量では、大腿二頭筋および胸筋における導入遺伝子コピー数は同様であり、約０．５ｖｇ／ｄｇを決して越えなかった。ベクター投与量が３×１０^１４ｖｇ／ｋｇまで増加すると、平均導入遺伝子コピー数は、約１．２ｖｇ／ｄｇまで増加した。データは、２つの最も高い投与量レベルのベクターを受け取った４動物の間で、特定の異常に高い結果に起因して、横隔膜に関して特に可変であり、そこでは、導入遺伝子コピー数は約９〜１５ｖｇ／ｄｇの範囲であった。これらの離れたデータポイントが除外される場合は、その結果、横隔膜の形質導入効率は３ヶ月および６ヶ月の両方の時点において相対的に低く、導入遺伝子コピー数は、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの投与量で約０．２〜０．４ｖｇ／ｄｇ、および、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの投与量で約１．０５〜１．３ｖｇ／ｄｇの平均である。

注入後３ヶ月および６ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィンｍＲＮＡ発現
処置アームあたり２〜４匹の動物を、ＲＴ−ｑＰＣＲによる分析のために無作為に選択して、屠殺の際に得られた大腿二頭筋、横隔膜、心臓、脾臓、および肝臓のサンプルにおけるヒトミニ−ジストロフィンｍＲＮＡ転写のレベルを定量化した。注入後３ヶ月および６ヶ月において屠殺された試験動物から得られた結果をそれぞれ表６および表７に提供する。データは、ラットＨＰＲＴ１遺伝子由来のｍＲＮＡと比較したミニ−ジストロフィンｍＲＮＡの相対量（ＲＱ）で表される。

転写は、ネガティブコントロールアーム（ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット）における動物由来の任意の組織において、または、投与量にかかわらずベクターによって処置された動物の脾臓において、検出されなかった。試験された他の組織の全てにおいて、ベクター由来の転写が検出されて、そのレベルは、投与量に応答する様式で増大する傾向であったが、データには少しの変動があった。組織における転写レベルは、大腿二頭筋＞心臓≒横隔膜＞肝臓のパターンに従った。上述のように、肝臓は、サンプリングされたものの中で最も形質導入された組織であり、ベクターコピー数は、大腿二頭筋よりも約６０〜１３０倍高く変化した。これにもかかわらず、肝臓におけるミニ−ジストロフィンｍＲＮＡのレベルは、大腿二頭筋よりも約５〜１５倍低く、ベクターにおいて用いられたプロモーターの高い筋肉特異的な活性の証拠であった。

注入後３ヶ月および６ヶ月における、ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質発現
ヒトミニ−ジストロフィンｍＲＮＡレベルを決定するための分析のために無作為に選択された同一動物も分析して、ウエスタンブロットを用いてミニ−ジストロフィンタンパク質レベルを決定した。ミニ−ジストロフィンタンパク質は、ネガティブコントロールアーム（ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット）における動物由来のいかなる組織においても検出されなかった。３ヶ月および６ヶ月の両方の時点において、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、ベクターを投与されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの大腿二頭筋、心臓および横隔膜において検出された。試験された最も少ない投与量では（１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、より高いレベルでベクターを投与されたラットと比較して、組織サンプルにおいては低頻度で検出された。これらの結果を表８において定性的に要約する。

ウエスタンブロットによって検出されたタンパク質の量および投与量、ならびに、同一組織サンプル中のミニ−ジストロフィンｍＲＮＡの量の間には、正の相関があった。およそ１．５のＲＱのミニ−ジストロフィンｍＲＮＡが、タンパク質の検出を可能にするのに必要であった。肝臓において測定されたミニ−ジストロフィン転写の低いレベルと一致して、ミニ−ジストロフィンタンパク質は、用いられた最も高いベクター投与量であっても、この組織において検出されなかった。

病理組織学的評価
ＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットの屠殺の直後に、病理組織学的および免疫細胞化学的な分析のために組織サンプルを得た。

材料および方法
組織サンプルビヒクルによって処置されたＷＴラット、ビヒクルおよびベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、注入後３ヶ月および６ヶ月において、全体的な剖検評価中に得られた。ベースライン比較としての役割を果たすために、サンプルは、７〜９週齢において屠殺された未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラットからも得られた。組織は、組織病理学のために直ちにホルマリン固定されて、または、免疫組織化学（免疫標識）のためにスナップ凍結（ｓｎａｐｆｒｏｚｅｎ）されて、処理まで保管された。組織病理学のために、組織サンプルを１０％中性緩衝化ホルマリン中に固定して、パラフィンワックス内に包埋して、ヘマトキシリンエオシンサフラン（ＨＥＳ）染色による染色前に切片化した（５μｍ）。パラフィン包埋された心臓組織のさらなる断面を染色して、ピクロシリウスレッドＦ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｉｍｉｅＳＡＲＬ，Ｌｙｏｎ，ＦＲ）を用いてコラーゲンを可視化した。免疫標識によってジストロフィンおよび結合組織を同定するために、サンプルを凍結させて、切片化した（８μｍ）。ラットジストロフィンならびにヒトミニ−ジストロフィンｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８に特異的に結合する、マウスモノクローナル抗体、ＮＣＬ−ＤＹＳＢ（１：５０、ＮｏｖｏｃａｓｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮｅｗｃａｓｔｌｅｏｎＴｙｎｅ，ＵＫ）を免疫標識試験において用いて、ジストロフィンタンパク質を可視化した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）コンジュゲート（１：５００、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて結合組織を可視化した。ＤＲＡＱ５（１：１０００、ＢｉｏＳｔａｔｕｓＬｔｄ，Ｓｈｅｐｓｈｅｄ，ＵＫ）を用いて核を染色した。剖検および組織学的試験は、盲検で行なわれた。

心臓断面におけるピクロシリウス陽性領域の定量化を、ＮｉｋｏｎＩｍａｇｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ，ＣｈａｍｐｉｇｎｙｓｕｒＭａｒｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて行なった。ＤＹＳＢ陽性線維およびＷＧＡ陽性領域の定量化を、ＩｍａｇｅＪオープンソース画像処理ソフトウェア（ｖ２．０．０−ｒｃ−４９／１．５１ａ）を用いて行なった。

結果
注入後３ヶ月および６ヶ月における、筋肉におけるＤＭＤ病変の病理組織学的分析
組織学のために染色された組織サンプルを顕微鏡で試験して、ＤＭＤ表現型と関連する病変を体系的に記録した。骨格筋および心筋における病変は、図３８Ａに示されるように半定量的にスコアされた。骨格筋（大腿二頭筋、胸筋および横隔膜）では、スコア０は、有意な病変の不存在に相当して；スコア１は、中心有核（ｃｅｎｔｒｏ−ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）線維および再生病巣によって証明される何らかの再生活性の存在に相当し；スコア２は、単離された、または小さなクラスターにおける、退行性線維に相当し；スコア３は、線維化または脂肪組織による線維置換および組織再構築に相当した。心臓では、スコアは線維症の強度（スコア１がより低く、スコア２がより高い）、および、退行性線維の存在（スコア３）に基づいた。それぞれのラットに関する合計の病変スコアは、大腿二頭筋、胸筋、横隔膜筋および心筋に関する動物のスコアの平均として計算された。それぞれの処置アーム内の個々のラットに関する病変スコアも平均された。

注入後３ヶ月における処置アームによってグループ化された平均および個々のラットの合計の病変スコアを図３８Ｂに示し、ここで、ＷＴモックは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットを指し、それに関して、病変スコアは０であった。ＫＯモックは、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを指し、一方で、ＫＯ１Ｅ１３、３Ｅ１３、および１Ｅ１４は、指示された投与量（すなわち、それぞれ、１×１０^１３、３×１０^１３、および１×１０^１４）のベクター（ｖｇ／ｋｇ）によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットを指す。見られ得るように、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおいて、ジストロフィー表現型と関連する筋肉病変の分布率は、投与量に応答する様式で、ベクター処置によって減少した。

病変スコアの統計分析（Ｄｕｎｎの検定を用いた多重対比較による）は、処置アーム間の以下の違いを明らかにした。注入後３ヶ月における大腿二頭筋のサンプルでは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよび２つの最も高い投与量（１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）でベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間で病変スコアに有意差はなく、注入後６ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＷＴおよび試験された任意の４つの投与量でベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間に有意差はなかった。注入後３ヶ月における胸筋および横隔膜のサンプルでは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよび試験された３つの最も高いベクター投与量（３×１０^１３、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の病変スコアに有意差はなく、注入後６ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよび全ての４つのベクター投与量によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間のスコアに有意差はなかった。最後に、心筋では、両方の時点で、ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよびベクターの４つ全ての投与量によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の病変スコアに有意差はなかった。

注入後３ヶ月および６ヶ月における、組織形態計測
ベクターから発現されるヒトミニ−ジストロフィンおよびラットジストロフィンの両方に特異的に結合するＤＹＳＢ抗体で組織サンプルを標識した後に、それぞれのラット由来の３つの無作為に選択された顕微鏡的フィールドにおける陽性に染色された筋線維のパーセンテージを、大腿二頭筋、横隔膜、および心筋に関して計算した。加えて、ＷＧＡコンジュゲートによって陽性に染色した３つの無作為に選択された顕微鏡的フィールドにおける領域を計算して、大腿二頭筋および横隔膜由来の凍結組織サンプルにおける結合組織線維症の程度を決定した。関連した分析において、心臓の横断面における結合組織（コラーゲン）の量を、組織学的製剤内のピクロシリウスレッドによって陽性に染色する領域を定量化することによって決定した。これらの試験からの結果を、図３９Ａ〜３９Ｃ、図４０Ａ〜４０Ｃ、および図４１Ａ〜４１Ｃに提供する。

図３９Ａは、ビヒクルによって処置されたＷＴラット（ＷＴ＋バッファー）、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（ＤＭＤ＋バッファー）、および、増加する量の１×１０^１３、３×１０^１３、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（それぞれ、ＤＭＤ＋１Ｅ１３、３Ｅ１３、１Ｅ１４、および３Ｅ１４）からの大腿二頭筋サンプル由来の染色された組織切片の代表的な顕微鏡写真を示す。写真の上パネルは、注入後３ヶ月に取られたサンプル由来であり、下パネルは、注入後６ヶ月において得られたサンプル由来である。図３９Ｂは、３ヶ月および６ヶ月の時点における、ビヒクルによってそれぞれ処置されたＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、増加する量のベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の、大腿二頭筋サンプルにおけるジストロフィン陽性線維のパーセンテージを示すグラフである。未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット７〜９週齢（「ＤＭＤ病理学状態」）からの結果も含まれる。図３９Ｃは、３ヶ月および６ヶ月の時点における同様に処置されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット７〜９週齢由来の、大腿二頭筋サンプルにおける結合組織によって占められる領域パーセンテージ（線維症の尺度として）を示すグラフである。グラフにおいて、エラーバーの上の同一文字は、データの間に統計的に有意な違いがないことを示し、一方で、共通する文字がないことは、有意差があることを示す（例えば、２つのバーが両方ともそれらの上に「ａ」を有することは、互いに有意差がない）。

図４０Ａは、ビヒクルによって処置されたＷＴラット（ＷＴ＋バッファー）、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（ＤＭＤ＋バッファー）、および、増加する量の１×１０^１３、３×１０^１３、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（それぞれ、ＤＭＤ＋１Ｅ１３、３Ｅ１３、１Ｅ１４、および３Ｅ１４）からの横隔膜サンプル由来の染色された組織切片の代表的な顕微鏡写真を示し、全て注入後３ヶ月に得られた。図４０Ｂは、３ヶ月および６ヶ月の時点における、それぞれビヒクルによって処置されたＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、増加する量のベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の、横隔膜サンプルにおけるジストロフィン陽性線維のパーセンテージを示すグラフである。未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット７〜９週齢（「ＤＭＤ病理学状態」）からの結果も含まれる。図４０Ｃは、３ヶ月および６ヶ月の時点における同様に処置されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット７〜９週齢由来の、横隔膜サンプルにおける結合組織によって占められる領域パーセンテージ（線維症の尺度として）を示すグラフである。グラフにおいて、エラーバーの上の同一文字は、データの間に統計的に有意な違いがないことを示し、一方で、共通する文字がないことは、有意差があることを示す（例えば、２つのバーが両方ともそれらの上に「ａ」を有することは、互いに有意差がない）。

図４１Ａは、ビヒクルによって処置されたＷＴラット（ＷＴ＋バッファー）、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（ＤＭＤ＋バッファー）、および、増加する量の１×１０^１３、３×１０^１３、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット（それぞれ、ＤＭＤ＋１Ｅ１３、３Ｅ１３、１Ｅ１４、および３Ｅ１４）からの心筋サンプル由来の染色された組織切片の代表的な顕微鏡写真を示す。上および下パネルは、それぞれ、注入後３ヶ月および６ヶ月に屠殺された試験動物から得られた、組織学的に調製されてピクロシリウスレッドによって染色された、頂部の３番目（ｔｈｅｔｈｉｒｄｏｆｔｈｅａｐｅｘ）由来の心臓の横断面を示す。黒いバーは、２ｍｍの長さを示す。中央パネルは、３ヶ月の時点に得られた心筋サンプルにおける、抗−ジストロフィン抗体およびＷＧＡコンジュゲートによる免疫標識を示す。図４１Ｂは、３ヶ月および６ヶ月の時点における、それぞれビヒクルによって処置されたＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、増加する量のベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の、心筋サンプルにおけるジストロフィン陽性線維のパーセンテージを示すグラフである。未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット７〜９週齢（「ＤＭＤ病理学状態」）からの結果も含まれる。図４１Ｃは、３ヶ月および６ヶ月の時点における同様に処置されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラット７〜９週齢由来の、心筋サンプルにおける結合組織によって占められる領域パーセンテージ（線維症の尺度として）を示すグラフである。グラフにおいて、エラーバーの上の同一文字は、データの間に統計的に有意な違いがないことを示し、一方で、共通する文字がないことは、有意差があることを示す（例えば、２つのバーが両方ともそれらの上に「ａ」を有することは、互いに有意差がない）。

データの統計分析（ＡＮＯＶＡ分析およびＦｉｓｈｅｒの事後両側検定）は、注入後３ヶ月および６ヶ月の両方において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよび全てのベクター投与量で処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間に、大腿二頭筋および心臓におけるジストロフィン標識に有意差があることを示した。横隔膜では、注入後３ヶ月における違いは、試験された２つの最も高い投与量で有意であり、一方で、注入後６ヶ月における違いは、試験された３つの最も高い投与量で有意であった。ビヒクルによって処置されたＷＴラットおよび３×１０^１４ｖｇ／ｋｇによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の比較は、注入後３ヶ月における大腿二頭筋または注入後６ヶ月における心筋において、有意差を示さなかった。

ビヒクルによって処置されたＷＴラット由来の筋肉では、全ての筋線維は、ＤＹＳＢ抗体による強い均質な筋細胞膜下の標識を示した。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の筋肉では、散在した復帰突然変異体線維のわずかなパーセンテージが同様の標識を示した（注入後３ヶ月および６ヶ月において、それぞれ：大腿二頭筋、３．７±２．４％および７．３±２．３％；横隔膜、０．７±１．５％および５．８±１．３％；心筋、０．０±０．０％および０．１±０．１％）。ベクターを投与されたＤｍｄ^ｍｄｘラットでは、ジストロフィンに関して陽性に染色する線維のパーセンテージは、全ての観察された筋肉において増加して、線維は、弱〜強の筋細胞膜下の標識を示した。線維の３分の２の標識は、陽性であると考えられる必要があった。３ヶ月および６ヶ月の時点の両方において、ジストロフィン陽性線維のパーセンテージは、大腿二頭筋および心筋の間で同様であり、横隔膜よりも高かった。ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットでは、結合組織によって占められる領域によって測定される線維化病巣の数およびサイズは骨格筋において減少して、線維症の強度は心筋において低減した。

７〜９週齢で屠殺された未処置Ｄｍｄ^ｍｄｘラットでは、大腿二頭筋または心筋において線維症は明らかでなかったが、横隔膜において重大な結合組織の拡大が既に存在した。ＷＴラットと比較して、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、限局性または全身性の骨格筋における筋内膜および筋周囲スペースの肥大を示した（線維症の指標である）。心臓では、これらのラットは、心室および中隔心外膜下領域における散在および広範囲の線維化病巣を示した。重度の症例では、心臓の形状を変える壁内線維症が観察された。ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットと比較して、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇベクターおよびそれよりも高い投与量によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの大腿二頭筋では注入後３ヶ月において、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの横隔膜では注入後６ヶ月において、線維化病巣の数およびサイズに有意な減少があった。心臓では、線維症における有意差が、両方の時点において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよび全てのベクター投与量で処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間に見られた。注入後３ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＷＴラット、および、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇおよびそれよりも高い投与量でベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間で、線維症における有意差は観察されなかった。観察された線維症の量およびベクター投与量は、負に相関した（大腿二頭筋に関してｐ＝０．０１９；横隔膜に関してｐ＝０．００４；心筋に関してｐ＝０．００３、全て線形回帰による）。

Ｄｍｄ^ｍｄｘラットでは、ベクターによる処置は、分析された全ての筋肉（大腿二頭筋、横隔膜、および心筋）においてミニ−ジストロフィン発現を誘導して、ミニ−ジストロフィンを発現している線維のパーセンテージは、ベクター投与量と正に相関した（線形回帰によってｐ＜０．００１）。ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおけるミニ−ジストロフィン陽性線維の数は、横隔膜よりも大腿二頭筋および心臓において多く、生体内分布または発現有効性における少しの不均一性を示した。ミニ−ジストロフィン発現は、投与量にかかわらず、その筋細胞膜下の局在の観点から類似していて、異常な局在は、分析された最も高い投与量である３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでさえも検出されなかった。一部の線維では、非連続的なジストロフィン染色が筋線維鞘に沿って検出されたが、この観察の頻度は、ベクター投与量の増加に伴って低減した。

注入後３ヶ月と６ヶ月との間の、ミニ−ジストロフィン陽性筋線維の数の比較は、大腿二頭筋に関して処置アーム間で有意差を示さなかった。横隔膜では、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ投与量において、注入後３ヶ月と６ヶ月との間に有意な増大があったが、心筋では、投与量１×１０^１３、３×１０^１３、および１×１０^１４ｖｇ／ｋｇにおいて、２つの時点の間に有意な増大があった。

特定の古典的なＤＭＤ関連の筋肉病変の発生率および程度は、処置群の間で異なる。例えば、ビヒクルのみを受け取ったものと比較して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、壊死性または退行性線維がより少なく、そして、新たに再生された線維が全てのＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて観察されたが、それらの数は、ベクター投与量が増大するにつれて低減する傾向であった。

把持力および筋肉疲労の測定
ビヒクルまたは増加する量のベクターを注入されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの前肢把持力を、注入後３ヶ月および６ヶ月に試験した。ビヒクルが注入されたＷＴラットが、ネガティブコントロールとして含まれた。ラットは、約４．５および７．５月齢であるときに把持力テストが行なわれるように、７〜９週齢のときに注入された。最大把持力および疲労の示度としての繰り返し試験後の把持力の両方を測定した。

材料および方法
力変換器に取り付けられたグリップメーター（Ｂｉｏ−ＧＴ３，ＢＩＯＳＥＢ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ラットがそれらの前足をＴバーの上に置かれて、それらがグリップを放すまで後方に優しく引っ張られたときに生じるピークの力を測定した。５回の試験をそれぞれの試験の間を短潜時（２０〜４０秒）にして順々に行ない、最初と最後の決定の間の強度の減少は、疲労の指標として取られた。結果はグラム（ｇ）で表されて、体重（ｇ／ｇＢＷ）に標準化される。把持テストの測定は、遺伝子型および処置アームが見えない実験者によって行なわれた。データは、平均±ＳＥＭとして表されて、グループ間の違いを分析するためにノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて統計的に評価される。有意な全体的効果が検出された場合は、Ｄｕｎｎの事後検定を用いてグループ間の違いを評価した。把持力の発達をＦｒｉｅｄｍａｎ検定の後にＤｕｎｎの事後検定を用いて分析した。全てのデータ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行なわれた。図において、９５％、９９％、および９９．９％の信頼水準での有意差は、１つ、２つ、および３つの記号でそれぞれ表わされる。

結果
注入後３ヶ月に屠殺されたラットに関する把持力テストの結果を、表９および表１０に提供する。表９に示されるように、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットと比較して、絶対握力（すなわち、体質量の違いに関して補正されない）の減少を示した（２４±２％の低減）。対照的に、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットコントロールと比較した絶対握力の用量依存的な増大を示した。２つの最も低い投与量、１×１０^１３および３×１０^１３ｖｇ／ｋｇでは、把持力は、それぞれ１３±７％および２４±８％増大したが、統計的有意性には届かず、一方で、２つの最も高い投与量、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでは、把持力は、それぞれ４０±９％および５５±６％増大し、統計的有意性に到達した（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。また、表９に示されるように、前肢把持力を体質量の違いに関して補正すると、ＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットの把持力の間には、両方ともビヒクルによって処置された場合、統計的有意差はなかった。しかしながら、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットと比較して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの相対的把持力において投与量応答性の増大があり、試験された２つの最も高い投与量、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇで統計的有意性に到達した（それぞれ、２７±８％増大、ｐ＜０．０５、および３９±６％増大、ｐ＜０．００１）。

また、前肢把持力も、５回の間隔が密接した繰り返し試験中に測定されて、ベクター処置が、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットモデルにおいて生じることが知られる筋肉疲労に影響を及ぼす程度を決定した。図４２Ａに示されるように、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、１回目と５回目の試験の間で前肢強度の著しい低減を示したが（６３±５％の減少）、一方で、ビヒクルによって処置されたＷＴラットは、５回目の試験後に、１回目の後とちょうど同じ強さであり、このモデルにおいて以前に見られた効果であった（Ｌａｒｃｈｅｒ，ｅｔａｌ．，２０１４）。

対照的に、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて、ビヒクルのみによって処置された同様のラットと比較して、用量依存的な改善が観察された。表１０に前述したとおり、試験された２つの最も低い投与量（１×１０^１３および３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）では、明らかにされた握力における低減前に遅れがあり、少なくとも試験の初期における疲労の減少を示した。しかしながら、より低い投与量では、５回目の試験までに、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットとビヒクルのみによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットとの間の握力の間に、統計的に有意な違いはまだなかった。それにもかかわらず、握力の漸減する減少に向かう強い傾向が、これらのより低い投与量でさえ明らかであった。２つの最も高い投与量、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでは、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットと比較して、疲労の程度に統計的に有意な違いを示さなかった。換言すれば、５回の試験の後に、これらのベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、野生型から区別できなかった。実際に、全ての試験において、最も高いベクター投与量によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの平均把持力は、ＷＴコントロールのものよりも高かったが、違いは統計的に有意ではなかった。

注入後６ヶ月に屠殺されたラットに関する把持力テストの結果を、表１１および表１２に提供する。表１１に示されるように、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットと比較して、握力の減少を示した（すなわち、体質量の違いに関して補正されない）（完全把持力で３８±３％の低減）。この違いは、絶対的に測定した場合は統計的に有意であったが、相対的に測定した場合は有意でなかった。対照的に、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットコントロールと比較して、絶対握力の用量依存的な増大を示した。２つの最も低い投与量、１×１０^１３および３×１０^１３ｖｇ／ｋｇでは、把持力は、それぞれ２０±５％および２１±６％増大したが、統計的有意性には到達せず、一方で、２つの最も高い投与量、１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇでは、把持力は、それぞれ３９±９％および４１±５％増大し、統計的有意性に到達した（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。

注入後３ヶ月に屠殺されたＤｍｄ^ｍｄｘラットと同様に、注入後６ヶ月に屠殺された、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットもまた、１回目と５回目の試験の間で前肢強度の実質的な低減を示したが（５７±３％の減少）（図４２Ｂ）、この違いは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットで見られた５回の試験にわたる把持力のわずかな減少と比較して統計的に有意でなく、主に、これらの試験に関与する小さなサンプルサイズのせいであると考えられた。

対照的に、用量依存的な改善が、ビヒクルのみによって処置された同様のラットと比較して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて観察された。表１２に示したように、２つの最も低い投与量（１×１０^１３および３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）は、多数の試験にわたって握力の減退に有意に影響を及ぼさなかったが、２つの最も高い投与量（１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）では、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットは、ビヒクルによって処置されたＷＴラットと比較した疲労の程度において統計的に有意な違いを示さなかった。さらに、最も高い投与量では、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの把持力は、全ての試験において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットよりも統計的に有意に高かった。換言すれば、５回の試験後、これらのベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、野生型から区別できなかった。実際に、全ての試験において、最も高いベクター投与量によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの平均把持力は、違いは統計的に有意でなかったがＷＴコントロールのものよりも高かった。

これらの試験に基づき、注入後３ヶ月および６ヶ月の両方において、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのベクター投与量は、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットによって示された把持力の減少および多数の間隔が密接した把持力テストに起因する筋肉疲労を戻すのに十分であったことが明らかである。さらに、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇのベクター投与量は実際に、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおける把持力および疲労耐性を、同一の遺伝的背景のＷＴラットを超えるレベルまで改善させた。

心機能
Ｄｍｄ^ｍｄｘラットおよびＷＴコントロールの心機能を、注入後３ヶ月および６ヶ月に試験して（それぞれ、約５月齢および８月齢）、ベクター処置が、ラットＤＭＤモデルにおける筋ジストロフィー疾患の過程の心臓に対する構造上または機能上の効果を改善することができるかどうか決定した。二次元の心エコー検査を用いて、自由壁拡張期の厚さ、ＬＶ拡張終期の直径、ＬＶ駆出率、およびＥ／Ａ比を、注入後３ヶ月および６ヶ月に測定した。

材料および方法
心エコー測定は、遺伝子型および処置アームが見えない実験者によって行われた。１４−ＭＨｚ変換器を備えるＶｉｖｉｄ７Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ超音波（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、二次元（２Ｄ）心エコー検査を試験動物に対して行なった。有り得る構造上の再構築を観察するために、左心室拡張終期の直径および自由壁拡張終期の厚さを、Ｍモード心エコー検査によって得られた長軸および短軸画像から、拡張期中に測定した。駆出率によって収縮機能を評価して、心尖部四腔断層方位でパルスドップラーを用いて、心室充満速度の経僧帽弁流量測定を得ることによって拡張機能を決定して、Ｅ／Ａ比、等容弛緩時間、およびＥ波の減速時間（以下にさらに説明される拡張期機能障害の指標）を決定した。

Ｅ／Ａ比は、心房排出および心室充満の２つのステージ中の左心房から左心室への血液の移動のピーク速度の比である。血液は、左心房から左心室へ２つのステップで移動される。最初に、左心房内の血液は、弛緩している心室によって作られる陰圧に起因して僧帽弁が開くときに下の心室へ受動的に移動する。この最初の作用の間に血液が移動する速度は、初期に関して、「Ｅ」、心室充満速度と呼ばれる。より後において、左心房は収縮して、心房内の任意の残っている血液を排出して、このステージにおいて血液が移動する速度は、心房に関して、「Ａ」、心室充満速度と呼ばれる。Ｅ／Ａ比は、後期（Ａ）心室充満速度に対する初期（Ｅ）の比である。健康な心臓では、Ｅ／Ａ比は、１よりも大きい。しかしながら、デュシェンヌ筋障害では、左心室壁は硬くなり心室弛緩を減少させて、心房血液を吸引して、それにより、初期（Ｅ）充填速度を遅くさせて、Ｅ／Ａ比を下げる。等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）は、大動脈弁の閉鎖から、僧帽弁の開放による心室充満の開始までの間の間隔、または、弛緩が始まった後に心室充満が開始するまでの時間である。正常よりも長いＩＶＲＴは、心室弛緩が少ないことを示し、ヒトＤＭＤ患者（ＲＣＢａｈｌｅｒｅｔａｌ．，ＪＡｍＳｏｃＥｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒ１８（６），６６６−７３（２００５）；ＬＷＭａｒｋｈａｍｅｔａｌ．，ＪＡｍＳｏｃＥｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒ１９（７），８６５−７１（２００６））およびＤＭＤ犬モデル（ＶＣｈｅｔｂｏｕｌｅｔａｌ．，ＥｕｒＨｅａｒｔＪ２５（２１），１９３４−３９（２００４）；ＶＣｈｅｔｂｏｕｌｅｔａｌ．，ＡｍＪＶｅｔＲｅｓ６５（１０），１３３５−４１（２００４））の両方において説明されていて、ＤＭＤと関連する拡張型心筋症に先行する。最後に、Ｅ波の減速時間（ＤＴ）は、ピークＥ速度とそのベースライン復帰との間のミリ秒での時間に相当し、その増大は、拡張期の機能障害を示す。

結果
注入後３ヶ月および６ヶ月の両方において、ＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット（両方ともビヒクルによって処置された）の間で自由壁拡張期の厚さに有意差はなく、この測定が、試験された年齢においてこのモデルにおける疾患過程に関して情報を与えないことを示した。注入後３ヶ月ではないが６ヶ月においては、しかしながら、ＷＴコントロールと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて左心室拡張終期の直径を増大させる傾向があったが（Ｄｍｄ^ｍｄｘラットがベクターによって処置された場合は戻る）、統計的有意性には到達しなかった（図４３）。

収縮機能を評価するために、左心室（ＬＶ）駆出率を測定した。注入後３ヶ月には、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットにおいて違いが見られず、しかしながら、注入後６ヶ月には、ビヒクルを投与されたＤｍｄ^ｍｄｘラットのみがＬＶ駆出率の減少を示したが（ベクターによる処置によって防止される）、違いは、より低い投与量の１つである３×１０^１３ｖｇ／ｋｇにおいてのみ統計的に有意であった（図４４）。

拡張期機能障害を評価するために、ドップラー心エコー検査を用いて、初期（Ｅ）および後期拡張期（Ａ）速度、Ｅ／Ａ比、等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）、および減速時間（ＤＴ）を測定した。注入後３ヶ月において、ＷＴコントロールと比較して、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに関してＥ／Ａ比の統計的に有意な減少、および、最も高いベクター投与量である３×１０^１４ｖｇ／ｋｇによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて正常なＥ／Ａ比へ戻ることを示す傾向があったが、違いは、統計的有意性に到達しなかった（図４５Ａ）。注入後６ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットのＥ／Ａ比もまた、ＷＴコントロールと比較して有意に減少して、より早い時点と同様に、ベクターの何らかの処置効果を示す傾向があったが、データはかなり変動があり、統計的有意性に到達しなかった（図４５Ｂ）。

注入後３ヶ月において、ＩＶＲＴは、ＷＴコントロールと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて上昇して、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいてＩＶＲＴの投与量応答性の減少を示すわずかな傾向があったが、データにおける違いのいずれも統計的有意性に到達しなかった（図４６Ａ）。注入後６ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ＷＴコントロールと比較して有意により高いＩＶＲＴを有したが、一方で、ベクター処置は、正常レベルにＩＶＲＴが戻るのを示唆する強い傾向をもたらし、最も低いベクター投与量である１×１０^１３ｖｇ／ｋｇで統計的有意性に到達した（図４６Ｂ）。

最後に、ＤＴは、麻酔プロトコルでの技術的困難性に起因して、より高齢のラットでのみ測定することができた。しかしながら、注入後６ヶ月において試験された場合、ＤＴは、ＷＴコントロールと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて有意に上昇して、試験された全ての投与量においてベクター処置後に正常値への復元に向かう強い傾向があった（図４７）。

データの変動にもかかわらず、これらの試験の結果は、５月齢および８月齢Ｄｍｄ^ｍｄｘラットの心臓における拡張期機能障害の存在を強く示唆し、それは、ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによる処置によって少なくとも部分的に戻され得る。

血液化学
処置の前および屠殺の時点に、ラット由来の血液サンプルを取って、最終的な分析のために保管した。尿素、クレアチニン、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＫ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、トロポニンＩ、および、ミニ−ジストロフィンタンパク質およびＡＡＶ９キャプシドに対する抗体の血清濃度を決定するための試験を行なった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＫ、およびＬＤＨは、全て、損傷した筋肉細胞から血中に放出される酵素であり、ヒトＤＭＤ患者において上昇することが知られている。

注入後３ヶ月および６ヶ月において、尿素、クレアチニン、ＡＬＫ、全血清タンパク質、全ビリルビンおよびトロポニンＩのレベルは、異なる実験グループ間で有意に異ならなかった。対照的に、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨおよび全ＣＫレベルは全て、ＷＴラットと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて上昇して、様々な程度でベクター処置に応答した。

注入後３ヶ月および６ヶ月の両方において、ＡＳＴレベルは、ＷＴラットと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて上昇したが、データの変動に起因して、有意性は６ヶ月の時点においてのみ存在した。Ｄｍｄ^ｍｄｘラットがベクターによって処置された場合、より低いＡＳＴレベルに向かう傾向が（幅広い個体相互の変動があるにもかかわらず）、注入後３ヶ月において１×１０^１４および３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ投与量のグループ、および、注入後６ヶ月において３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ投与量のグループにおいて観察された。再度、データの変動に起因して、これらの違いは統計的有意性に到達しなかった。これらの結果を図４８Ａおよび図４８Ｂに示し、それぞれ、注入後３ヶ月および６ヶ月の時点に関するデータを報告する。

ＡＬＴ、ＬＤＨ、および全ＣＫレベルのパターンは全て、同様の方法で年齢およびベクター処置に応答した。注入後３ヶ月において、ＡＬＴ、ＬＤＨおよび全ＣＫレベルは全て、ＷＴラットと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて有意に上昇した。ミニ−ジストロフィンベクターによるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットと比較してＡＬＴ、ＬＤＨおよび全ＣＫレベルにおける投与量応答性の減少を示唆する傾向をもたらし、場合によっては、統計的有意性を達成した。これらの結果を図４９Ａ、図５０Ａ、および図５１Ａにそれぞれ示す。注入後６ヶ月において、ＷＴラットと比較してビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおけるＡＬＴおよびＬＤＨの上昇したレベルを示唆する傾向がデータに存在し、それは、試験された最も高いベクター投与量において戻ったが、違いのいずれも統計的に有意でなかった。これらの結果を図４９Ｂおよび図５０Ｂにそれぞれ示す。対照的に、注入後３ヶ月に見られたパターンと同様に、全ＣＫは、ＷＴラットと比較して、注入後６ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて有意に上昇して、ベクター処置は、減少したレベルに向かう傾向をもたらし、試験された最も高いベクター投与量において統計的有意性を達成した（図５１Ｂ）。

処置アーム内の全ＣＫレベルもまた、注入の日と、３ヶ月および６ヶ月後に比較された。図５２Ａおよび図５２Ｂに示されるように、血中の全ＣＫレベルは、ビヒクルを投与されたＷＴラットにおいて一貫して低かったが、一方で、ＣＫレベルは、ビヒクルのみおよび最も低いベクター投与量によって処置されたものを含む全てのＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて減退した。対照的に、３ヶ月および６ヶ月後のＣＫレベルの減少は、３つの最も高い投与量のベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットに関してよりいっそう大きかった。これらの観察は、ヒトにおけるＤＭＤの自然な過程（ＣＫレベルは、コントロールと比較して上昇するが、脂肪および線維化組織によって筋肉が置換されることに起因して、疾患が進行するにつれて減退する）と一致するが、試験されたより高いベクター投与量においては、投与量応答性の治療的効果も有する。

ＣＫアイソザイムにおける違いも観察された。投与の前に、ＣＫ−ＭＭアイソフォームがＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて優位を占めて（平均＞９０％）、一方で、ＣＫ−ＭＭおよびＣＫ−ＢＢアイソフォームは、ＷＴラットにおいて同程度であり（平均４０〜６０％）、ＣＫ−ＭＢレベルは、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットよりもＷＴにおいて高かった（４〜６％対、約１％）。注入後３ヶ月および６ヶ月において、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇよりも多いベクター投与量によって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ＣＫ−ＢＢアイソフォームの比率におけるわずかな増大およびＣＫ−ＭＭアイソフォームの比率におけるわずかな低減を示し、投与量に関連する効果に向かう傾向があった。ＣＫ−ＭＢアイソフォームの比率における明確な変更は、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいて観察されなかった。

免疫学
ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットにおける体液性および細胞性免疫応答を、処置前と注入後３ヶ月および６ヶ月において測定して、ネガティブおよびポジティブコントロールに対して比較した。血清サンプルは、ビヒクルまたはベクターの注入前と、注入後３ヶ月の安楽死の際に得られた。Ｔ細胞応答の分析のための脾細胞は、注入後３ヶ月および６ヶ月の安楽死の際に採取された。

ミニ−ジストロフィンタンパク質の発現に対する体液性応答を、試験動物から得られて１：５００に希釈された血清のウエスタンブロット分析によって定性的に評価した。ＷＴまたはＤｍｄ^ｍｄｘであろうと全てのラット由来の血清は、ビヒクルが投与された場合、またはベクターを受け取る前は、ミニ−ジストロフィンタンパク質に対する抗体に関してネガティブであった。対照的に、ベクターによって処置されたほとんどのＤｍｄ^ｍｄｘラットは、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの最も低い投与量でさえ、ウエスタンブロットにおいてミニ−ジストロフィンと結合するＩｇＧ抗体を産生した。注入後３ヶ月において屠殺されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの８０％〜１００％、および、注入後６ヶ月において屠殺されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの６０％〜１００％は、投与量に応じてミニ−ジストロフィンタンパク質に特異的なＩｇＧを産生した。

ＡＡＶ９ベクターキャプシドに対する抗体の存在を、ＥＬＩＳＡによって試験した。ビヒクルによって処置されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の血清は、ＡＡＶ９と反応する検出可能なＩｇＧを含まなかった。対照的に、ベクターによって処置された全てのラットは、投与量にかかわらず、または、注入後３ヶ月または６ヶ月のいずれにおいて屠殺されたのかにもかかわらず、１：１０２４０よりも高い力価で（試験された最も高い希釈）、抗−ＡＡＶ９ＩｇＧを生産した。ＡＡＶ９に対する中和抗体もまた、ルミノメーターを用いて検出されるＬａｃＺレポーター遺伝子を発現する組み換えＡＡＶ９ベクターを用いた細胞形質導入阻害アッセイによって試験された。力価は、形質導入を＞５０％阻害する最も低い希釈として定義された。ＡＡＶ９に対する中和抗体は、投与量にかかわらず、または、注入後３ヶ月または６ヶ月のいずれにおいて屠殺されたのかにもかかわらず、ベクターを受け取った全てのＤｍｄ^ｍｄｘラット由来の血清において検出されたが、注入前の同一動物、またはビヒクルのみを受け取ったＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットにおいては、検出されなかった。力価は、１：５０００〜≧１：５０００００の範囲であり、明らかな投与量効果はなかった。

ベクターに対する細胞性免疫応答の存在を、ビヒクルによって処置されたＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット、および、ベクターを受け取ったＤｍｄ^ｍｄｘラットから単離された脾細胞に対するＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて評価した。ベクターゲノムによって発現されたヒトミニ−ジストロフィンタンパク質に対するＴ細胞応答を、ｏｐｔｉ−ｄｙｓ３９７８タンパク質（１５アミノ酸の長さ、１０アミノ酸の重複、合計２６３ペプチド）の全配列をカバーする重複ペプチドバンクおよびラット特異的ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔ^{ＢＡＳＩＣ}キット（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いて試験した。ネガティブコントロールは、刺激されていない脾細胞から構成されて、ポジティブコントロールは、分裂促進因子コンカナバリンＡによって刺激された細胞から構成された。ＩＦＮγ分泌物を、１０^６細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として定量化して、ポジティブ応答を、＞５０ＳＦＣ／１０^６細胞またはネガティブオントロールに関して得られた値の少なくとも３倍として定義した。最も高いベクター投与量の３×１０^１４ｖｇ／ｋｇで処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラット由来を含み、注入後３ヶ月または６ヶ月のいずれにおいても、ミニ−ジストロフィンタンパク質に由来する任意のペプチド配列に対する特異的なＴ細胞応答は、任意の試験動物から得られた脾細胞において見られなかった。

また、ＡＡＶ９キャプシドに対するＴ細胞応答も、ＡＡＶ９に由来するペプチド配列に対してスクリーニングされたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて試験された（３つのプールに分けられた、１０アミノ酸によって重複している１５マー）。注入後３ヶ月に屠殺されたベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの１６％〜６０％、および、注入後６ヶ月に屠殺されたベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの１６％〜６６％において、ポジティブのＩＦＮγ応答が存在し、それは、ベクター投与量と正に相関した。対照的に、ビヒクルによって処置された全てのＷＴおよびＤｍｄ^ｍｄｘラットは、ＡＡＶ９キャプシドに対するＴ細胞応答に関してネガティブであった。

実施例９
ＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡによって処置された、より高齢のＤｍｄ ^ｍｄｘラットにおける握力
上記の実施例８に記載される試験は、若いラット７〜９週齢において開始された。この実施例は、それぞれ４月齢および６月齢だったときにＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって最初に処置された、より高齢のＤｍｄ^ｍｄｘラットの筋肉機能分析を説明する。ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットの平均寿命は２４〜３６ヶ月である。これらの実験のゴールは、Ｄｍｄ^ｍｄｘラットの一生の後期にベクターによって処置することが効果的であるかどうか決定することであった。ポジティブな結果は、より高齢のヒトＤＭＤ患者、例えば、より年が上の子ども、青年、または若い成人でさえ、ベクターによる処置が、それらの筋肉機能を改善し得ることも示唆するであろう。

この実施例において記載される実験は、実施例８に記載されるものと同様の材料および方法を用いて行なわれた。より具体的には、４月齢および６月齢におけるＤｍｄ^ｍｄｘラット（それぞれの年齢グループに関してｎ＝６）は、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ｈＣＫ．Ｈｏｐｔｉ−Ｄｙｓ３９７８．ｓｐＡベクターによって別個に処置された。ネガティブコントロールとして、４月齢および６月齢のＷＴラットおよびＤｍｄ^ｍｄｘラット（それぞれの年齢グループに関してｎ＝６）は、ビヒクルのみによって別個に処置された。注入後３ヶ月において、ラットは、以前に説明されるとおりに握力に関して試験された。より若いラットと同様に、最大前肢握力、および、各試験の間の待ち時間が短い多数の繰り返し試験にわたる握力を試験した。後者の試験は、筋肉疲労を測定することが意図された。

図５３Ａに示されるように、注入後３ヶ月において、４月齢においてビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの最大前肢握力は、平均して、ビヒクルによって処置された４月齢ＷＴラットと比較してわずかにより低かったが、違いは統計的有意性に到達しなかった。対照的に、４月齢において、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターを注入されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、同じ月齢における、ビヒクルのみによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットよりも大きな平均最大前肢握力を有し、その違いは統計的有意性に到達した。ベクターによって処置されたラットの強度は、ＷＴラットよりもさらに大きかったが、その違いは統計的に有意でなかった。結果は、図５３Ｂに示されるように、データが体重に関して標準化された場合、同様であった。図５３Ａおよび図５３Ｂでは、記号「^□□」は、ベクター対ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０１）。

筋肉疲労に関して、図５３Ｃに示されるように、４ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、２回目の把持テスト後に疲労を示したが、一方で、ＷＴラットは、４回の試験後でさえも疲労を示さなかった。対照的に、ベクターによって処置された４月齢Ｄｍｄ^ｍｄｘラットは、１回目と５回目の把持テストの間に、あったとしても最小限の筋肉疲労示した。ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットもまた、ビヒクルによって処置されたＷＴラットと比較して全体的により強いようであった。図５３Ｃでは、記号「^＊」は、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットとビヒクルによって処置されたＷＴラットとの間の統計的に有意な違いを示し（ｐ＜０．０５）；「^□□」は、ベクター対ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の統計的に有意な違いを示し（ｐ＜０．０１）；「§§」および「§§§」は、１回目の把持テストと比較して、それぞれ４回目および５回目の把持テストにおける、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の統計的に有意な違いを示す（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。

図５４Ａに示されるように、注入後３ヶ月において、６月齢においてビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの最大前肢握力は、ビヒクルによって処置された６月齢ＷＴラットと比較して有意により低かった。この効果は、図５４Ｂに示されるように、結果が体重に関して標準化された場合でさえも維持された。６月齢において、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇベクターによるＤｍｄ^ｍｄｘラットの処置は、ビヒクルのみによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットと比較して平均最大前肢握力を増大させて、その違いは、体重に関して標準化された場合、統計的有意性に到達した（図５４Ｂ）。図５４Ａおよび図５４Ｂでは、記号「^＊」および「^＊＊」は、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘおよびＷＴラットの間の統計的に有意な違いを示し（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）；「^□」は、ベクター対ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０５）。

筋肉疲労に関して、図５４Ｃに示されるように、６ヶ月において、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットは、２回目の把持テスト後に疲労を示したが、一方で、ＷＴラットは、４回のテスト後でさえ疲労を示さなかった。対照的に、４ヶ月において、処置されたラットでは、ベクターによって処置された６月齢Ｄｍｄ^ｍｄｘラットは、多数の把持テストにわたって少し減少した強度を示したが、ビヒクルによって処置されたコントロールＤｍｄ^ｍｄｘラットで見られるものと同程度ではなかった。また、４月齢において処置されたラットで行なわれた試験とは対照的に、ＷＴラットの強度は、実験工程にわたって、６ヶ月においてベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットのものよりも大きいようであった。図５４Ｃでは、記号「^＊＊」および「^＊＊＊」は、ベクターによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットおよびビヒクルによって処置されたＷＴラットの間の統計的に有意な違いを示し（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）；「^□」は、ベクター対ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の統計的に有意な違いを示し（ｐ＜０．０５）；「§§」は、ビヒクルによって処置されたＤｍｄ^ｍｄｘラットの間の、１回目の把持テストと比較した５回目の把持テストにおける統計的に有意な違いを示す（ｐ＜０．０１）。

前述は本発明の例示であり、その制限と解釈されるべきでない。本発明は以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物は、その中に含まれるべきである。

Claims

ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端への順番で、全長ヒト野生型筋ジストロフィンタンパク質由来の以下のドメイン：Ｎ末端アクチン結合ドメイン、ヒンジＨ１、ロッドＲ１、ロッドＲ２、ヒンジＨ３、ロッドＲ２２、ロッドＲ２３、ロッドＲ２４、ヒンジＨ４、システインリッチドメイン、および、野生型ヒト筋ジストロフィンにおける最後の３アミノ酸を含まないカルボキシ末端ドメインを含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＮ末端アクチン結合ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号１〜２４０を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＨ１ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ１ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＨ３ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２４２４〜２４７０を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２２ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２３ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２４ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＨ４ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のシステインリッチドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のカルボキシ末端ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＨ１ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２５３〜３２７を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１３のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ１ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３７〜４４７を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１４のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号４４８〜５５６を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１５のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＨ３ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２４２４〜２４７０を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１６のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２２ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２６８７〜２８０２を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１７のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２３ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２８０３〜２９３１を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１８のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＲ２４ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号２９３２〜３０４０を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項１９のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のＨ４ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３０４１〜３１１２を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２０のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のシステインリッチドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３１１３〜３２９９を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２１のポリヌクレオチドであって、
前記ミニ−ジストロフィンタンパク質のカルボキシ末端ドメインは、配列番号２５由来のアミノ酸番号３３００〜３４０８を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２２のポリヌクレオチドであって、
前記ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２２のポリヌクレオチドであって、
前記ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなる、
ポリヌクレオチド。
請求項２３のポリヌクレオチドであって、
前記ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする前記核酸配列と動作可能に連結された筋肉特異的な転写調節エレメントをさらに含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２５のポリヌクレオチドであって、
前記の筋肉特異的な転写調節エレメントは、ヒトまたはマウスクレアチンキナーゼ遺伝子に由来する、
ポリヌクレオチド。
請求項２６のポリヌクレオチドであって、
前記の筋肉特異的な転写調節エレメントは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２５のポリヌクレオチドであって、
転写終結配列をさらに含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２８のポリヌクレオチドであって、
前記転写終結配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２３のポリヌクレオチドであって、
イントロンをさらに含む、
ポリヌクレオチド。
請求項２３のポリヌクレオチドであって、
前記ヒトミニ−ジストロフィンをコードする前記核酸配列はコドンが最適化されている、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９１％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９２％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９３％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９４％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９６％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９７％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９８％同一である、
ポリヌクレオチド。
請求項３１のポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９９％同一である、
ポリヌクレオチド。
ＡＡＶベクターゲノムであって、
請求項２８のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む、
ＡＡＶベクターゲノム。
請求項４２のＡＡＶベクターゲノムであって、
第二のＡＡＶＩＴＲをさらに含む、
ＡＡＶベクターゲノム。
請求項４３のＡＡＶベクターゲノムであって、
前記の各ＩＴＲはＡＡＶ２に由来する、
ＡＡＶベクターゲノム。
組み換えＡＡＶ粒子であって、
ＡＡＶキャプシドおよび請求項４２のベクターゲノムを含む、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項４５の組み換えＡＡＶ粒子であって、
前記キャプシドは、ＡＡＶ９由来である、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項４６の組み換えＡＡＶ粒子および薬学的に許容できる担体を含む、
医薬組成物。
組み換えＡＡＶ粒子であって、
ＡＡＶ９キャプシド、および
一本鎖ＤＮＡベクターゲノムであって、ＡＡＶ２由来の第一のＩＴＲ、配列番号７のアミノ酸配列からなるヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードするヒトコドンに最適化された核酸配列と動作可能に連結された筋肉および心臓における組織特異的な発現を与える遺伝子制御領域、ポリアデニル化シグナル転写終結配列、およびＡＡＶ２由来の第二のＩＴＲを含む一本鎖ＤＮＡベクターゲノム、
を含む、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項４８の組み換えＡＡＶ粒子であって、
前記ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一である、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項４８の組み換えＡＡＶ粒子であって、
前記ポリアデニル化シグナル配列は配列番号１７の核酸配列を含む、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項４８の組み換えＡＡＶ粒子であって、
前記ヒトミニ−ジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項４８の組み換えＡＡＶ粒子であって、
前記遺伝子制御領域は、筋肉クレアチニンキナーゼ遺伝子に由来する合成のエンハンサーおよびプロモーターである、
組み換えＡＡＶ粒子。
請求項５２の組み換えＡＡＶ粒子であって、
前記合成のエンハンサーおよびプロモーターは、配列番号１６の核酸配列を含む、
組み換えＡＡＶ粒子。
ＡＡＶ９キャプシドおよびベクターゲノムを含む組み換えＡＡＶ粒子を作成する方法であって、
細胞中に、請求項４２のＡＡＶベクターゲノムを含むポリヌクレオチド、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むポリヌクレオチド、およびＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入するステップ、
前記細胞をインキュベートするステップ；および
それによって生産される組み換えＡＡＶ粒子を精製するステップ、
を含む、
方法。
請求項５４の方法であって、
細胞中に、１つまたは複数のウイルスヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップをさらに含む、
方法。
請求項５４または５５の方法によって生産される、
組み換えＡＡＶ粒子。
組み換えＡＡＶ粒子であって、
ＡＡＶ９キャプシド、および配列番号１８のヌクレオチド配列またはその逆相補を含むベクターゲノムを含む、
組み換えＡＡＶ粒子。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用するための、請求項４７の医薬組成物。
請求項５８の医薬組成物であって、
前記組成物は、ＤＭＤを治療するのに効果的な少なくとも１つの第二の薬剤と共に投与される、
医薬組成物。
請求項５９の医薬組成物であって、
前記の第二の薬剤は、ＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングを引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗−ミオスタチン抗体、ナンセンス突然変異のリボソームのリードスルーを促進する薬剤、未成熟終止コドンを抑制する薬剤、アナボリックステロイド、および、コルチコステロイドからなる群より選択される、
医薬組成物。
請求項５８の医薬組成物であって、
前記組み換えＡＡＶ粒子は、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、４．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、６．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、８．５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および９×１０^１４ｖｇ／ｋｇからなる群より選択される用量で投与される、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、対象の血液中のＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＬＤＨレベルのうちの少なくとも１つの平均を、健康なコントロールの血液中のＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＬＤＨの平均レベルよりも、７−、６−、５−、４−、３−、または２−倍内に大きく減少させるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、対象の血液中の総ＣＫレベルを、健康なコントロールの血液中の平均総ＣＫレベルよりも、５０−、４８−、４６−、４４−、４２−、４０−、３８−、３６−、３４−、３２−、３０−、２８−、２６−、２４−、２２−、２０−、１８−、１６−、１４−、１２−、１０−、９−、８−、７−、６−、５−、４−、３−、または２−倍以内に大きく減少させるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、対象の平均６分徒歩距離（６ＭＷＤ）を、未治療ＤＭＤコントロールまたは治療前の前記対象の平均６ＭＷＤと比較して、少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００メートル増大させるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、対象が４階段上昇試験を行なうのに必要とする平均時間を、未治療ＤＭＤコントロールまたは治療前の前記対象の平均時間と比較して、少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、または４．０秒減少させるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、歩行ができなくなった治療対象の平均比率を、歩行ができなくなった未治療ＤＭＤコントロールの平均比率と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％減少させるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、対象の下肢における脂肪画分を、未治療ＤＭＤコントロールまたは治療前の前記対象の下肢における平均脂肪画分と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％減少させるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、検出可能なレベルの前記ミニ−ジストロフィンタンパク質を産生させるために、対象由来の骨格筋生検中の筋線維の、少なくとも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％のパーセンテージを生じさせるのに効果的である、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において使用され、
前記使用は、治療対象の０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のパーセンテージ以下において、筋肉炎症または前記ミニ−ジストロフィンタンパク質に対する細胞性免疫応答を引き起こす、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
対象における筋量または筋力の増加に使用するための、
医薬組成物。
請求項４７の医薬組成物であって、
対象における筋量または筋力の損失の予防に使用するための、
医薬組成物。